BG61700B1

BG61700B1 - Нвv повърхностни протеини с редуциран гостоприемниковкарбохидрат

Info

Publication number: BG61700B1
Application number: BG98187A
Authority: BG
Inventors: Peter J. Kniskern; Arpi Hagopian
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1991-04-29
Filing date: 1993-10-29
Publication date: 1998-03-31
Also published as: IL101651A0; NO933897L; SG55152A1; NZ242487A; DE69232541D1; CN1067680A; AU650530B2; MX9201970A; HUT69149A; CZ227193A3; US5614384A; LTIP462A; ATE215987T1; FI934650A; EP0516286A1; YU45492A; CA2067290A1; AU1522292A; JPH06141872A; PL171485B1

Description

Хепатит В вирусът /HBV/ е инфекциозен агент, отговорен за различни видове заболявания на черния дроб у човека. Хората, инфектирани от HBV, страдат като преминават през остра фаза на заболяването, след което следва възстановяване. Известен процент от тях обаче не успяват да се освободят напълно от инфекцията, поради което се превръщат в нейни хронични носители. HBV е ендемична за много части на света, с широк обхват на случаите на перинателно пренасяне на инфекцията от майки, хронични носителки на инфекцията, към новородените, които често също остават хронично инфектирани. Изследвани са над триста милиона носители по света, от които стотици хиляди умират всяка година поради продължителните заболявания, вследствие на хроничния хепатит /цироза/ и/или хепатоцелуларен карцином/.

Вирусът на хепатит В делта е агент, който по време на съвместна с HBV инфекция е отговорен за остър взрив на заболяването с предимно фатален край. Делта вирусът не кодира /от своя собствен генетичен материал/ протеини, които да служат като обвивка за вириона; нещо повече, вирусът капсулира с повърхностните протеини, кодирани от коинфектиращия HBV /причиняващ инфекция успоредно с делта вируса/, поради което споделящ тесни структурни и имунологични взаимовръзки с HBV протеините, които са описани по-долу. Не е известно дали други агенти на инфекцията споделят аналогични взаимовръзки с HBV. Ясно е обаче, че протеини с широка експанзия на серологична реактивност или повишена имунологична потенциалност могат да бъдат приложими в система и за диагностика или предотвратяване /или лечение/ на заболявания /или инфекции/ от клас от агенти с дори слаба или частична антигенна кръстосана реактивност с HBV.

НВ вирионът е съставен от две групи структурни протеини, същински протеини и повърхностни протеини. В допълнение в качеството си на голяма повърхност на протеините, повърхностните протеини също са голяма съставна част на Австралийския антиген, или 22 nm частици. Тези повърхностни проте ини са транслационни продукти от дългата отворена четяща рамка на вириона /ORF/, кодираща най-малко 389 аминокиселини /аа/. Тази ORF е разделена на три области, всяка от които започва с ATG кодон, способен да функционира като транслационен инициаторен сайт ин виво. Тези области се отнасят като preSl /108 аа/, preS2 /55 аа/ и S /226 аа/ в техния съответен 5' - 3' ред в гена. Тези области определят три полипептида, отнасящи се като S или HBsAg /226 аа/, preS2 + S / 281 аа/и preSl + preS2 + S /389 аа/, също отнасящи се съответно като p24/gp27, рЗО/ gp33/gp36 и p39/gp42 (също като главния, средния и големия протеини).

Повърхностните протеини на HBV са гликопротеини с карбохидратни странични вериги /гликани/, присъединени чрез N-гликозидни линкери към дефинирани сайтове, разпознаваеми от пептида /1/. Така HBV полипептидите, продуцирани по време на инфекцията, включват видовете p24/gp27 (S полипептида и неговите гликозилирани производни) gp33/gp36 (preS2 + S полипептида, гликозилиран само в preS2 областта, и същия полипептид, гликозилиран в S, както и preS2 областта), и p39/gp42 (preSl + preS2 + S пептид и неговите производни, гликозилирани в preSl областта).

Напоследък подходящи получени от плазмата ваксини се съставят от протеини, съдържащи фактически само S областта (включваща р24 мономер и неговите гликозилирани производни gp27), докато получените от дрожди ваксини, развити успешно към днешна дата, са съставени изключително от полипептида (включващ изключително негликозилирани р24 видове).

Частичките с големина 22 nm от HBsAg са пречистени от плазмата на постоянните носители. Бидейки частично позитивни в условията на тяхната плазма, тези постоянни носители се отнасят като HBs*. Ако инфектираните индивиди са показали задоволителен имунен отговор, те могат да отстранят инфекцията и да станат HBs‘. В условията на тяхното формиране на антителата към HBs, тези индивиди са отбелязани като анти HBs⁺. По този начин, анти HBs⁺ е свързан с възстановяване от заболяване и с имунитет спрямо повторна инфекция с HBV. Поради това, стимулирането или формирането на анти HBs чрез НВ вак2 сини се очаква да осигури защита против HBV инфекция.

Тази хипотеза е тестувана експериментално. Освен човека, шимпанзето е един от малкото видове, който е напълно податлив на HBV инфекцията, което се отразява с количествено определими маркери като HBs⁺ и повишени нива на чернодробните ензими. Шимпанзетата се ваксинират с три дози от пречистените HBsAg частици и след това се провокират интравенозно с инфекциозен HBV. Докато раздразнените с ваксината животни показват белези на остра HBV инфекция, HBsAg - ваксинираните животни са предпазени напълно от инфекция. Поради това, в тази експериментална система HBsAg частиците, съставени от р24 /или р24 и р27/, са достатъчни за индуциране на защитен имунитет. Стимулирани от тези наблюдения, няколко производителя са произвели НВ ваксини, съставени от HBsAg частици.

За да се увеличи снабдяването с подходящи ваксини, производителите се обръщат към рекомбинантната ДНК технология, която да посредничи при получаване на повърхностни протеини. Сред микробиалните системи найшироко използвани са E.coli и S.cerevisiae с оглед експресия на получените по рекомбинантен път протеини. Много опити за експресия на имунологично активни HBsAg частици в E.coli са неуспешни. S.cerevisiae показва изключителна многостранност в способността си да експресира имунологично активни HBsAg частици. Тези частици /съставени изключително от р24/, когато са формирани във ваксина, са доказали способност за пълно протектиране на шимпанзетата от провокациите на живи HBV от различни серотипове. Нещо повече, получените от дрожди частици са също имунологично активни и като ефективни при предпазване от заболяване или инфекция при клинични изпитания на хора като получени от плазма HBsAg /2/. Поради това, полезността на S.cerevisiae като гостоприемников вид за насочена синтеза на рекомбинантни HBsAg е твърдо установена. В допълнение, експресията на терапевтични агенти за хора и ваксини в дрожди може да бъде много полезна за получаването на продукта, доколкото дрождите са свободни от ендотоксини, непатогенни са за хората, могат да бъдат култивирани в индустриален мащаб и няма необхо димост от многото действия, които съпътстват използването на култивирани клетки от бозайници /много от които са трансформирани с вирус, вероятно туморогенни за мишки и всички от тях съдържат протоонкогени/.

S.cerevisiae /хлебните дрожди/ са еукариоти, които са способни да синтезират гликопротеини. Протеиновата гликозилация в дрождите напоследък е обект на множество обзорни статии /3, 4/. Тази гликозилация или допълването на гликаните към подходящ рецептор на аминокиселините /аа/ в полипептидната верига става както при специфични серинови /Ser/ или треонинови /ТЬг/ остатъци /О-свързани/ или при специфичен аспарагинов /Asn/ остатък /N-свързан/. Специфичността на О-свързания допълнителен елемент при Ser или Thr остатъци е установена емпирично на базата на сравнението.

Сигналната последователност за N-свързаната гликозилация е добре дефинирана както като аминокиселинната последователност Asn-X-Thr, така и като Asn-X-Ser (където X е която и да е аминокиселина). В допълнение към много синтезирани автоложни, нативни, гликозилирани протеини или маннопептиди, дрождите също са способни да гликозилират хетероложни или чужди протеини, експресирани чрез рекомбинантна технология (ако хетероложният протеин съдържа подходяща сигнална последователност за гликозилиране за която и да е N-свързана или О-свързана гликозилация) .

PreS2 + S полипептидите, които са получени по време на природно инфектиране, съдържат не повече от 2 “същински” /са 3 килодалтона /kD/ по размер/ N-свързани гликани, един в S-областта и втори - при Asn при аминокиселинния остатък от preS2 областта. Сайтът на разпознаване в областта не е гликозилиран нито в Recombivax HB^R, нито в рекомбинантните preS2 + S синтезирани в дрожди. Обаче сайтът при аминокиселинен остатък 4 от preS2 областта се разпознава и гликозилира от дрожди.

Областта preSl съдържа N-свързан гликозилационен сайт при аминокиселинен остатък 4 от preSl областта и потенциален сайт при /аа/ остатък 26 за серотип adw. Ясно е за специалиста от областта, че аргументите, изложени по-рано за preS2 гликозилация, също ще важат за различни последователности в preS2 областта, както и за онези в preSl и S областите.

Дрождите, синтезиращи рекомбинантни preS2 + S, прибавят “същински гликан, който е аналогичен на добавения към природния полипептид по време на вирусната инфекция. Ако дрождевата клетка гостоприемник е “див тип” /т.е. съдържа пълния комплемент от ензими, необходими за природната гликозилация, какъвто е случая за фактически всички широко използвани дрождеви щамове/, значителен брой от тези гликани са удължени с голям брой от допълнителни манозни остатъци по начин, идентичен на използвания от дрождите при създаване на техните собствени манопротеини. Допълнението на гликана, когато това се случва на чужд генен продукт като preS2 + S полипептид, се счита за хипергликозилация. Очевидно е за специалиста в областта, че аргументите, важащи за дрождите, могат да се приложат и за други гостоприемникови клетки /например инсекти, гъби и др./, които могат да бъдат обект на разделяне на гликозилационните образци.

Демонстрирано е, че рекомбинантните форми от 22 nm частици на HBV повърхностни протеини, експресирани в дивия тип дрождеви клетки гостоприемник, присъединяват съществени количества от карбохидратите на дрождевите клетки /получавайки най-малко част от структурните монопротеини от дрождевата клетка гостоприемник/ в рамките на 22 nm частичка. Този карбохидрат може да предизвика потенциални проблеми в смисъл, че може да причини продуциране на антитела срещу дрождевия карбохидрат в гликозилираните протеини, и ваксиналният имуноген, съдържащ включения дрождев карбохидрат, ще реагира с антидрождеви антитела, представени у повечето видове бозайници, и поради това потенциално намаляващ ефективността като имуноген и ваксина.

Хипергликозилацията и хващането на пълни манопротеини и манопептиди могат да бъдат елиминирани или гликозилацията - ограничена в HBV preS и S полипептиди и техните кореспондиращи частици, посредством който и да е от следните подходи.

Най-напред, N-свързана хипергликозилация може да бъде предотвратена или ограничена по време на растежа на рекомбинантния гостоприемник в присъствие на екзогенен агент в култивационната среда /например ту никамицин/. Второ, полипептиди с рекомбинантен или природен произход могат да бъдат дегликозилирани както химично /например с безводна трифлуорметан-сулфонова киселина или безводен флуороводород/, така и по ензимен път. Трето, разпознаваемият сайт за гликозилация може да бъде променен или делегиран чрез мутагенезис на ниво ДНК, така че да бъде предотвратена същинската гликозилация и поради това и хипергликозилацията. Такива модифицирани preS + S ORF, в които разпознаваемите последователности за гликозилация са изменени /насочени от подходящи промотори, активни в дрождите/, са трансформирани в дрождеви клетки гостоприемници. Получените в резултат preS + S полипептиди не са гликозилирани. Четвърто, клетките гостоприемници могат да бъдат идентифицирани по това дали са носители на критичното ниво ензими, необходими за гликозилация, което илюстрира настоящото изобретение без каквото и да е ограничение на това. Такъв щам дрожди е идентифициран /тпп9‘ мутант /5/ по отсъствие на клиничното ниво на ензимите в гликозилационния обмен, необходим за елонгиране /хипергликозилиране/ на N-свързани гликани; химични изследвания доказват, че този мутант изгражда манопротеини без манозни остатъци, външни за веригата и съдържа само “същински” карбохидрат /6, 7/. ORF за S или preS + S полипептида / транскрибция, насочена от подходящи промотори, активни в дрождите/ е използван за трансформиране на такива mnn9 мутантни дрожди. Полученият в резултат preS + S полипептид съдържа само “същинска” гликозилация и не съдържа хипергликозилати.

Макар полипептидите да не са нито гликозилирани, нито хипергликозилирани, когато се експресират в дрождите, съставените от тях частички съдържат значително ниво от хванатия карбохидрат, получен от дрождев манопептид. Поради това експресията на полипептидите като preS съдържащи полипептиди в дрождеви клетки, които не могат да се хипергликозилират, резултира в повишено ниво на карбохидрата в експресираните 22 nm частички.

S.cerevisiae показва значителна многостранност в своята способност да експресира имунологично активни 22 nm частички. Тези частички, когато са включени във ваксинална форма, доказват способност напълно да предпазват шимпанзетата срещу провокация с живи HBV. Нещо повече, получените от дрожди HBsAg са имунологично ефективни при клинични изпитвания на хора, както получените от плазма HBsAg. Ето защо, приложимостта на S.cerevisiae като видове гостоприемници за насочена синтеза на рекомбинантен HBsAg е твърдо установена.

В различни рекомбинантни микробиални експресионни системи е показано, че синтезата на много различни полипептиди е унищожителна за клетката гостоприемник. Като последствие от това налице е селективно потискане срещу експресията на такива полипептиди, така че само клетки, които акумулират в голям мащаб, преустановяват експресията на чуждия полипептид или експресират толкова малко от чуждия полипептид, че културата става неикономичен източник на този полипептид. В някои случаи унищожителният ефект е толкова силен, че когато експресията се води от строго конститутивен промотор, новотрансформираните клетки не могат да се размножават и формират колонии върху селективните среди. Тези унищожителни ефекти могат да бъдат преодолени с използването на индуктивен промотор за насочване синтезата на такива полипептиди. Много индуктивни гени съществуват в S.cerevisiae. Четири добре характеризирани индуктивни генетични системи са галактозо /GAL/ използващите гени, алкохол дехидрогеназния 2 /ADH₂/ ген, генът на алфа кръстосване и pho5 гена.

S.cerevisiae има 5 гена, които кодират ензими, отговорни за използване на галактозата като карбоноизточник на растеж. GAL1, GAL2, GAL5, GAL7 и GAL10 гените респективно кодират галактокиназа, галактозопермеаза, големия изозим на фосфоглюкомутаза, а-0-галактозо-1-фосфат уридилтрансфераза и уридин дифосфо-галактозо-4-епимераза. В отсъствие на галактоза е открита много малка степен на експресия на тези ензими. Ако клетките са расли на глюкоза и след това се добави галактоза към културата, трите ензима се индуцират координирано, най-малко 1000кратно /с изключение на GAL5, който се индуцира около 5-кратно/ на нивото на РНК транскрибцията. GALI, GAL2, GAL5, GAL7 и GAL10 гените са клонирани молекулярно и са съгласувани. Регулаторните и промоторни последователности при 5-сайтовете от кодираните респективно области се поставят съседно на кодиращите области от lacZ гена. Тези експерименти са дефинирали онези промотори и регулаторни последователности, които са необходими и достатъчни за галактозната индукция.

S.cerevisiae има също 3 гена, всеки от които кодира един изоензим на алкохол дехидрогеназата /ADH/. Един от тези ензими е отговорен за способността на S.cerevisiae да използва етанол като карбонов източник по време на окислителния процес при растежа. Това е ензимът ADHII. Експресията на ADH2 гена, който кодира ADHII изозим, се потиска катаболитно от глюкоза, така че фактически няма транскрибция на ADH2 гена по време на култивирането в присъствие на глюкоза в количество 0,1 % Му/. При изчерпване на глюкозния източник и в присъствие на карбонови източници, които не потискат развитието на микроорганизма, транскрибцията на ADE2 гена се индуцира 100 до 1000 кратно. Този ген е молекулярно клониран и съгласуван, като са завършени онези промоторни и регулаторни последователности, които са необходими и достатъчни за отстраняване репресията на транскрибцията.

Факторът на кръстосването алфа е полов феромон на S.cerevisiae, който е необходим за кръстосване между МАТ и МАТа клетките. Този тридекапептид се експресира като препроферомон, който е насочен към ендоплазматичния ретикулум, гликозилиран и протеолитично/образуван/ насочен към неговата финална зряла форма, която се секретира от клетките. Този биохимичен път на обмяната е използван като експресионна стратегия за външни полипептиди. Факторът на алфа кръстосването е клониран молекулярно и неговият промотор с пре-про-лидерна последователност е използван да експресира и секретира различни полипептиди. Като че pho5 генният промотор е показано, че е индуцируем при ниски концентрации на фосфата и това също има приложимост при физиологично регулирана експресия на чуждите протеини в дрожди.

Както това се очаква от тяхното пресичане в ендоплазматичния ретикулум и апарата на Голджи, чуждите протеини могат да претърпят и N- и О-свързани гликозилационни събития. Промоторът за фактора на кръстосва не алфа е активен само в клетки, които са фенотипично а. Налице са 4 генетични локуса в S.cerevisiae,известни като SIR, които синтезират протеини, необходими за репресия на други нормално слаби копия на а и а информация.

Чувствителните на температура /ts/ увреждания, които пречат на това събитие на репресия, съществуват в генния продукт поне на едно място. В този мутант развитието при 35° отменя репресията, резултираща в клетки, фенотипично а/а, в които промоторът на фактора за кръстосване а е неактивен. При повишена температура до 23°С клетките фенотипично ревертират до а, така че този промотор става активен. Използването на щамове с ts SIR увреждания е демонстрирано за контролирана експресия на няколко различни чужди пептиди.

Задача на настоящото изобретение е да осигури HBV повърхностен протеин, който формира частици със съществено редуцирано карбохидратно съдържимо. Друга задача на настоящото изобретение е да осигури метод за получаване на дрождев гостоприемник, чиито HBV повърхностни протеини формират частички и който съдържа съществено редуцирано карбохидратно съдържимо. Допълнителна задача на изобретението е да осигури ваксина срещу HBV, включваща HBV повърхностни протеинови частици със съществено редуцирано карбохидратно съдържимо както за пасивна, така и за активна профилактика или лечение на заболяването и/или инфекции, причинени от HBV или други инфекции, причинени от HBV или други агенти, серологично свързани /сродни/ на HBV. Изобретението трябва също да осигури условия за широк обхват от рекомбинантни гостоприемникови клетки и за пречистване на HBV повърхностни протеини.

Тези и други задачи на настоящото изобретение са разкрити по-нататък.

Същност на изобретението

HBV повърхностните протеини са експресирани в рекомбинантен дрождев гостоприемник, който е генетически дефицитен по способността си да гликозилира протеините. Експресията на HBV повърхностните протеини в дрождевите клетки резултира във формиране на характерни частици. Формирането на тези частици в дрождевите клетки резултира в улавяне на клетъчните субстанции вътре в частиците. Използвайки “див тип” дрождеви гостоприемници, съществена част от клетъчните карбохидрати могат да бъдат уловени в 5 рамките на HBsAg частиците. С оглед цикличност на продукцията на HBV ваксина, състояща се от частици, съдържащи съществени количества карбохидрат, HBV повърхностните протеини са получени и пречистени от ре10 комбинантни дрождеви гостоприемници, които са генетично дефицитни по отношение на способността да гликозилират протеини. HBV повърхностните протеини, продуцирани от такъв гостоприемник, формират частици, съдър15 жащи значително по-малко карбохидрати от тези, продуцирани от дивия тип дрождеви клетки. Тези HBV повърхностни протеини са приложими като ваксини за лечение и/или предотвратяване на HBV свързани инфекции, 20 и като антиген за имунологична диагностика с редуцирана реактивност с природно срещани антидрождеви антитела.

Описание на фигурите

Фигура 1 показва схематично плазмида pCl/lpGALlOHBsAg-tADH-1, който съдържа pGALlO промотор, водещ транскрибцията на HBsAg ORF, последвано от tADHl терми30 натор и селективен маркер LEU2+.

Подробно описание на изобретението

Изобретението е насочено към метод за 35 получаване на HBV повърхностни протеинови частици със съществено редуцирано съдържание на включените карбохидрати за използване като ваксини срещу HBV.

Частици серотип adw са използвани ка40 то източник на HBV нуклеинова киселина за изолиране на вирусни ORF. Очевидно е за специалиста в областта, че изобретението се разпростира до използване на нуклеинови киселини от HBV щамове или е свързано с други 45 серологични активности, които произтичат от генетичните различия. Ендогенната полимеразна реакция се използва за продуциране на ковалентно затворена циклична двойно верижна ДНК от HBV генома, формираща природ50 но съществуващата в НВ вириона. ДНК е изолирана, разградена до съставките си с EcoRI и клонирана в EcoRI сайта на рВР322, ка то по този начин продуцира pHBV/ADW-1. Подбират се рекомбинантните плазмиди, съдържащи HBV генома в циклични размествания, формирани при EcoRI сайта от preS областта. Пълният ORF, кодиращ 55 аминокиселини от preS2 областта и 226 аминокиселини от S областта, най-напред се конструира чрез пречистване на 0,8 килобази фрагмент /кЬр/, получен следвайки разграждане с pHBV/ADW1 с EcoRI и Accl. Този фрагмент кодира preS2 + S полипептида, който няма единствено иницииращия кодон, аминокрайни 3 аминокиселини, карбоксикрайни 3 аминокиселини и транслиращия терминаторен кодон.

Олигонуклеотидите се синтезират и свързват към този фрагмент, конвертирайки го до Hind III фрагмент, съдържащ 10 Ьр нетранслирана 5’ фланкираща последователност, получена от дрожди и пълната preS2 + S ORF е избрана така, че терминиращият кодон да бъде директно присъединен към природния Hind III сайт в ADH1 транскрибтивния терминатор, като по този начин създава пълното природно, получено от дрождите съединяване, без каквито и да са допълнителни бази. Очевидно е за специалиста в областта, че за експресия на HBV повърхностни и сродни протеини, може да бъде използван всеки подходящ активен в дрожди транскрибтивен терминатор, който да бъде заместен в ADH1.

5' фланкиращата последователност за конструиране на АСААААСААА /SEQIDNC : 1/ е избрана да кореспондира на тази за нетранслирана лидерна последователност /NTL/ от дрождевия ген GAP63 /GAP/ /8/ и е също решение за GAP генното семейство. Конструирането е проведено по същия начин, така че да бъде присъединен NTL директно към иницииращия кодон на preS2 + S ORF без интервенция на която и да е допълнителна база. Поради това, очевидно е за специалиста в областта, че за експресия на HBV повърхностни протеини, подбора на NTL последователности се простира до други последователности, което става на подходящи експресионни нива.

ДНК секвенционният анализ изявява 2 замествания на базите, което резултира в аминокиселинни различия от preS2 + S последователност, кодирана от ДНК на pHBpre GAP347 /19Т/ /9/. За да се установят идентичните полипептида за двете конструкции, тези нуклеотидни замествания, които са Т вместо С при база 64 от 846 bp ORF на HBV рге2⁺ / кодиращ Phe вместо Leu/ и С вместо А при база 352 /кодиращ His вместо Gin/ са променени чрез сайтнасочена мутагенеза /10/. Кодираните аминокиселинни последователности за оптимизираната конструкция след това се проверяват. Очевидно е за специалиста в областта, че изобретението не ограничава обхвата си до тази последователност и се простира до която и да е последователност, където ДНК кодира полипептид с HBV - свързана антигенност.

Големият ДНК фрагмент от 3,3 kbp, който съдържа pUC19 и HBsAg кодиращата област, се разделят от preS2 кодиращия ДНК фрагмент след препаративна агарозна гел електрофореза. Синтетичен ДНК олигонуклеотид след това се лигатира с pLJC19 - HBsAg фрагмента. Този синтетичен ДНК олигонуклеотид съдържа 5' EcoRI и 3' Styl лепливи краища, така че да осигури Hindlll сайт, следващ веднага след 5' EcoRI сайта. В допълнение, синтетичният ДНК олигонуклеотид съдържа HBsAg ATG кодон плюс деветте следващи нуклеотида и 21 предходни нуклеотида, включително Styl сайта.

Този олигонуклеотид изгражда отново пълния кодиращ регион от HBsAg и позволява неговото последващо отстраняване в цялост, от pUC19 базовия вектор чрез разграждане с Hindlll.

pUC19 - HBsAg фрагментът с лигатирания синтетичен ДНК олигонуклеотид, описан по-горе, се използва за трансформация на E.coli. Подбрани са рекомбинантни плазмиди, които постигат пълната реконструирана HBsAg кодираща област. Пълната HBsAg отворена четяща рамка /ORF/ се отстранява от рекомбинантния плазмид чрез разграждане с Hindlll, последвано от пречистване и изолиране на 0,7 kbp HBsAg ДНК чрез препаративна агарозна гел електрофореза за клониране в GAL10 промоторен експресионен вектор.

Експресионният блок /pGALlO - tADHl/ води експресията за външни гени, инсертирани в уникалния Hindlll сайт надолу от галактозоиндуктивния GAL10 промотор. HBsAg ORF /с Hindlll край/, описан по-горе, се лигатира в Hindlll сайта на вектора. Тази експресионна касета се инсертира между SphI сайтовете на E.coli совалковия вектор рС1 /1 /Beggs, по-горе/ и този вектор се въвежда в щам на S.cerevisiae GF52 или GF54 и трансформираните кло нове се подбират.

Следвайки мутагенезиса, фрагментът кодиращ както S, така и preS + S описани погоре, се използва за конструиране на експресионен блок, както е описано по-рано /11/, който е съставен от а/ 1,1 kbp от GAP491 промотор, Ь/ 10 Ьр получена от дрожди фланкираща последователност, с/ 1230 Ьр от вирусната ORF за preSl + preS2 + S или 846 двойки бази от вирусния ORF за preS2 + S или 681 Ьр от вирусния ORF за S, и d/ 0,4 kbp от дрождевия ADH1 терминатор.

За конструиране на HBsAg експресионния блок са използвани 3 различни експресионни вектора. GAP491 промоторен експресионен блок, описан по-рано /11/, е съставен от около 1,1 kbp от глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназен /GAPDH/ промотор и около 350 Ьр от дрождевия алкохол дехидрогеназен I /ADH1/ терминатор в рВР322 като основа, с уникален Hindlll сайт между промотора и терминатора. HBsAg ORF от пример 2 се лигатира в уникалния Hindlll сайт и неговото присъствие и ориентация е определено чрез рестрикционен ендонуклеазен анализ и Southern блот.

Обратно, GAL10 промоторът /12/ се замества с 1,1 kbp GAP промотора в горната конструкция, или ADH2 /1,25 kbp/ промотора / 13/ се замества с GAP промотор /вж. фиг. 1/.

Във всеки случай експресионният блок, съдържащ специфични промотор, HBsAg ORF и ADH терминатор, се клонира в совалковия вектор pGl/1 /Beggs по-горе/, за създаване на дрождев експресионен вектор, който след това се използва за трансформация на S.cerevisiae, както е описано по-долу. Тези трансформанти са установени като замразен резерв за оценка и последващо експериментиране.

Парентален щам CF52 се получава както следва: щам с 2 тип кръстосване CZ5 / LB347-1C/ mnn9‘, SUCZ / се смесва с щам 2150-2-3 а-тип /1еи2’, adel / върху пълна среда на YEHD. За подбор на диплоиди смесените щамове повторно се посяват върху leu' минимална среда, съдържаща 2 % захароза като единствен карбонов източник. След изолиране на единични колонии диплоидите се спорулират и асцитите се разрязват по стандартни техники. KHY107 щамът се изолира като единствена спора и се характеризира като cir⁺, adel⁺, Leu2‘ и mnn9 /чрез техника на Шифт/.

Щамът KHY107 /cir-о/ е получен от щам

KHY107 /са*/, както е описано от Broach /14/. Съхраненият щам е трансформиран в игаЗ' чрез интегриране на разрушения игаЗ ген. Полученият в резултат щам KHY107 игаЗ Δ се култивира в богата среда, за да позволи акумулиране на спонтанни мутации, и се подбира резистентен на канаванин мутант. Мутантният щам GF55 се доказва, че е сапГ с помощта на комплементационен тест. GALlOpGAL4 експресионният блок се интегрира в HIS3 гена от CF55 /15/ за получаване на крайния гостоприемников щам CF52 /Mata 1еи2-2, 112 игаЗ Δ canl his3A : GAL10pGAL4игаЗ, cir/. Тези трансформанти се установяват като замразен резерв за изпитване и последващо експериментиране.

Рекомбинантните дрожди от замразените резерви се култивират в среда на YEHD /16/. След култивиране в стационарна фаза дрождевите клетки се събират. Приготвят се лизати, подлагат се на натриево-додецилсулфат-полиакриламинна гел електрофореза /SDSPAGE/ и се въздейства с антитела до HBsAg. Намерен е един полипептид с молекулярно тегло около 24 kD в съответствие с предсказаното молекулно тегло на транслационния продукт от S ORF. Нещо повече, лизатите на рекомбинантни, но не парентални дрожди, са позитивни за S чрез радиоимунни изпитвания /Austria¹¹/. Електронно микроскопско изследване на частично пречистени дрождеви лизати показва висока плътност на типичните HBsAg частици.

Полученият от дрождите промотор инициира транскрибцията на HBsAg и свързаните с него гени. Поради това, очевидно е за специалиста в областта, че всяка активна промоторна последователност в дрожди /т.е. включително от нелимитираните за GALI, GAL10, ADH2, Pho5 и др. /може да бъде заместена за GAP491 промотора. Освен това, очевидно е за специалиста в областта, че подходяща система за изпитване, т.е. имуноблот или RIA или ензимсвързана имунопроба /ELA/ може да бъде приложена с оглед изпитване експресията на HBsAg и свързаните полипептиди в тази система, така че времето за съзряване на културата с оглед получаване на максимален добив да може да бъде оптимизирано.

Промоторът GAP491 е използван за експресия на няколко чужди протеина в дрожди, включително HBsAg /Bitter, 17, 18/. На осно вата на нашите предишни резултати от експресията на HBsAg до около 40 % от разтворимия дрождев протеин /11/, ние използвахме този промотор за водене на експресията на HBsAg и свързаните протеини в подходящи дрождеви гостоприемникови клетки.

Очевидно е за специалиста в областта, че подборът на подходящи щамове дрожди за експресия на HBV повърхностни протеини обхваща широк кръг от тях. Подходящи дрождеви щамове включват, но не се ограничават, до онези с генетични и фенотипични характеристики като протеазни недостатъчности и променена способност за гликозилация.

С оглед контрол и определяне гликозилацията на рекомбинантните експресирани в дрожди HBV протеини, щамът S.cerevisiae CF52 /Mata leu2-2, 112 игаЗА canl his3A : GALlOpGAL4-ura3, cirA / се използва така, както е конструиран по-горе.

Експресионният плазмид pCl/lpGAL10HBsAg-tADHl се използва за трансформация на CF52 /Mata 1еи2-2, 112 игаЗД canl his3 A: GAL10pGAL4-ura3, cirA/. Трансформираните клонове се подбират от минимална среда /1еи /, съдържаща 1М сорбитол. Тези клонирани трансформанти са установени като замразен резерв в 17 % глицерол за последваща оценка и понататъшни експерименти.

За да се осигури контрол на гликозилацията на дивия тип, експресионният плазмид също е използван да трансформира дрождевия щам CF54, който е изолиран по установени техники от щам CF52 и е спонтанен ревертант към тпп9⁺/ и това е див тип за гликозилация, но иначе е с идентичен генотип с щам CF52/.

Трансформираните клонални изолати се оставят като замразен резерв в 17 % глицерол за последваща оценка и по-нататъшно експериментиране .

Клоновете от трансформираните дрожди, съдържащи експресионните плазмиди, се посяват в leu' селективна агарна среда /съдържаща 1М сорбитол за mnn9 - трансформанти/ и се инкубират на 30°С за 2 дни. Тези дрожди се инокулират в 5 - 7 ml култура в комплексна YEHD среда /съдържаща 0,1 - 1М сорбитол/ плюс 2 % галактоза за GAL10 плазмиди и културите се инкубират на 30°С с аерация за 12 до 18 h. Колбите, съдържащи 50 ml комплексна YEHD среда с 1М сорбитол /от тук нататък наричана YEHDS/, се инокулират от гор ната култура /до начално А^ = 0,1/ и се инкубират на 30°С с разклащане /350 грт/ за 48 до 72 h до крайно Α_ωο от 10 - 16. Пробите от 10 А₆₀₀ единици се диспергират в епруветки и дрождевите клетки се утаяват чрез центрофугиране при 2 000 xg за 10 min. Пробите се изпитват както директно, така и след замразяване при -70°С. По време на изпитването, утаените клетки се ресуспендират в 0,4 ml от фосфатбуферирана сол /PBS/, съдържаща 2мМ фенилметил сулфонилфлуорид /PMSF/ и се прехвърлят в 1,5 м1 епруветки на Епендорф.

Дрождевите клетки се разрушават чрез: добавяне на 200 - 300 mg промити стъклени топчета /0,45 mm/ и разбъркването им в миксер за 15 min, добавяне на TRITON X - 100 до 0,5 %, разбъркване в миксер за 2 min и инкубиране на 4®С за 10 min. Клетъчните остатъци и стъклените топчета се отстраняват и супернатантите се изпитват за протеин /по метода на Лоури /19/ и RIA, специфична за preS2 + S /20, 21/ или S /Ausria’/.

Клоновете от трансформираните дрожди mnn9’, съдържащи експресионните плазмиди, се поставят в селективни агарни пластинки, съдържащи сорбитол, и се инкубират на 30°С за 2 - 3 дни. Тези дрожди се инокулират в 5 7 ml култури от комплексна YEHDS среда / плюс 2 % галактоза за GAL10 промоторен плазмид/ и културите се инкубират при 30°С с разклащане /350 грт/ за 48 до 72 h от начално А^, равно на 0,1, до Α^θ от 10 до 16. Утроените проби от 10 Α^θ единици се прехвърлят в епруветки и дрождевите клетки се утаяват чрез центрофугиране при 2000 xg за 10 min. Пробите или се изпитват директно или се съхраняват замразени при -70®С.

Имуноблотинговият анализ на полипептида, получен от всички клонове в гостоприемници с тпп9‘ фенотип и описан по-горе, показва ивица с размер на молекулите от около 24 kD.

За рекомбинантните протеини пробите на гликозилация за качество и количество са функция от и са в огромна зависимост от вида на гостоприемниковата клетка и в рамките на вида - от клетъчната линия. По този начин, очевидно е за специалиста в областта, че подборът на щама гостоприемник се разширява до видовете и клетъчните линии, различни от S.cerevisiae, за които мутациите на ензимите в метаболитния път на гликозилиране могат да бъдат идентифицирани. Очевидно е също за специалиста в областта, че подборът на гостоприемниковите щамове от S.cerevisiae се разширява до всички щамове, в които мутациите на ензимите от метаболитния път на гликозилиране могат да бъдат идентифицирани.

След това трансформираните клонове се скринират за присъствие на HBsAg ДНК и експресия на р24 HBsAg. Клетките се култивират в YEHDS среда /също съдържаща галактоза за GAL10 промоторен плазмид за индуциране експресията, последвано от глюкозно изчерпване/. Приготвят се лизатите, разделят се в натриев додецилсулфат-полиакриламид гел електрофорезис /SDS - PAGE/ и Western блот до нитроцелулоза. Продуктът р24 се установява, че е специфичен за протеин поради присъствието му само в индуцираните трансформанти и тяхната реактивност с анти -р24 серум. Един от тези клонове се подбира за по-нататъшно анализиране. Нещо повече, лизатите на трансформантите, но не родителски S.cerevisiae, са позитивни за HBsAg чрез радиоимуноизследване.

Това подчертава приложимостта на експресионния вектор, който използва GAL10 промотор за насочване на експресията на HBsAg и съответните протеини на S.cerevisiae. Очевидно е за специалиста в областта, че регулируемият GAL10 промотор, или GALI, GAL2, GAL7 или MEL1 промотори, които функционират по един незабележителен начин, позволяват растежа на рекомбинантните S.cerevisiae култури да нарастне до такъв обем на продукцията преди синтезата на рекомбинантния протеин да бъде инициирана, така че да бъдат сведени до минимум негативните ефекти от гостоприемниковата клетка. Нещо повече, очевидно е за специалиста в областта, че експресионен вектор, съдържащ друг регулаторен промотор, включващ, но не лимитиран до ADH2 и фактора на кръстосване а, физиологично индуцируем или депресивен от други средства, може да бъде използван за насочена експресия на S и preS - съдържащи пептиди.

Нещо повече, очевидно е за специалиста в областта, че конститутивният промотор по-лесно потенцира от CAPDH, включвайки, но без да е ограничен до CYC1, води експресия на S и pre-S-съдържащ полипептиди до понисък процент от клетъчни протеини, така че негативните физиологични ефекти на суперекспресия са задължителни. Очевидно е за специалиста в областта, че подходящи системи за изпитване, като например Western блот радиомунопроба, могат да се приложат за изследване експресията на S е pre-S-съдържащите полипептиди в тази система, така че времето за събиране на узрялата култура за получаване на максимален добив може да бъде оптимизирано.

Имуноафинитетна колона, свързана с кози антитела, които разпознават частичната форма на HBsAg, се използва за пречистване на S и S-свързаните протеини от трансформирани S.cerevisiae. Елуираният продукт е позитивен за HBsAg чрез радиоимунопроба и е специална форма, когато се наблюдава под електронен микроскоп. Такава специална форма, която съдържа както HBsAg и preS антигени или HBsAg самостоятелно, е ефективна като HBV ваксина и диагностичен агент.

Дрождевите клетки, трансформирани с експресионни вектори, кодиращи хепатит В вирусни повърхностни протеини или техни варианти, се култивират и се събират след това. Клетките могат да бъдат съхранявани след това по желание чрез промиването им в буферен разтвор като PBS, и формирането на клетъчна паста, която обикновено се съхранява замразена при -70°С.

Пречистването на HBsAg и сродните протеини обикновено започва както следва. Парче от прясна или замразена клетъчна паста се суспендира в буфер за предпочитане TRIS, при висока стойност на pH, достигаща между 8,5 и около 11,0, за предпочитане около 10,5 /буферът може също да съдържа подходящи протеазни инхибитори/. След това клетките се разрушават за предпочитане с механични средства. Методът на внимателното разрушаване е установен, че не е подходящ за използване в голям мащаб. Разрушаването в хомогенизатор с високо налягане /около 10 000 до 20 000 psi, с помощта на хомогенизатор на Gaulin или Stansted/ се предпочита поради ефикасността му.

Разрушаването на дрождевите клетки води до получаване на суров екстракт. Последният се довежда до подходящо pH 8,0 - 11,0, като за предпочитане е 10,5.

Желателно е в тази точка да се добави детергент, което ще улесни разделянето на клетъчните мембрани на дрождите от нежеланите клетъчни разрушения /парченца/. Показано е, че preS + S протеин, както и други форми на повърхностни протеини, може да се асоциира с клетъчните дрождеви мембрани. Различни неутрални или нейонни детергенти могат да бъдат използвани, включително, но не ограничено до детергенти от TRITON-N серията, TRITON-Х серия, BRIJ серия, TWEEN или EMASOL сериите, дезоксихолат, октилглюкопиранозид или NONIDET-Np-40. Двойно натоварените в йонно отношение детергенти като CRAPS или CHAPSO също са приложими и подходящи агенти.

Ако се употреби детергент, за предпочитане е Х-100 при концентрация около 0,5 %. Методът съгласно изобретението не изисква детергент на този етап и добавянето му не е задължително.

Екстрактите след това могат да бъдат третирани на горещо, ако по време на лизиса не присъстват протеазни инхибитори. Третирането на горещо е ефективно над температурния обхват и за целия интервал на третиране. Обикновено температурният интервал е 45 до 60°С, за предпочитане 50°С. Продължителността на горещото третиране обикновено е от 20 до 40 min, с 30 min предпочитано време. Екстрактът се третира на горещо в подходящи съдове, като съдовете се потапят в гореща баня или се използва топлообменник. След това материалът се охлажда до около 10°С, за предпочитане чрез прехвърляне в ледено студена баня или чрез използване на топлообменник. Очевидно е за специалиста в областта, че по метода съгласно изобретението редът, по който се провежда температурното третиране и отстраняване на клетъчните остатъци, може да бъде разменен без значителен ефект като резултат от тази процедура. Обратно, целите дрождеви клетки могат да бъдат нагрети в неутрален pH буфер, разрушени и към тях да се добави детергент, както е описано по-горе.

Отстраняването на клетъчните останки от горещо третирания суров екстракт е необходимо, за да се предотврати физическото запушване по време на последващия етап на пречистване. Останките могат да бъдат отстранени чрез центрофугиране, микрофилтрация или филтрационно получаване на пречистен екстракт. Центрофугирането и микрофилтрацията са по-предпочитани методи. Центрофугирането може да бъде проведено за различно по продължителност време при различни условия. Подходящо е центрофугиране при око20 ло 3000 xg за 15 min при 4°С. Важно е също преди това да се разреди екстрактът за редуциране на типично вискозната природа на суровия екстракт. Разреждането не изисква как5 вато и да е последваща процедура в цялостния процес.

Микрофилтрацията има преимущество, което филтрацията и диализата могат да предоставят едновременно. Няколко типа микро10 филтрационни единици са подходящи за приложение в този етап, като KPOSFLO от Microgon Inc. или който и да е вид от празни фиброзни пакети на Amicon или A/G Technology. Предпочитаният метод на микрофилтрация е про15 карването на екстракта през Prostak Durapor / Millipore/ мембрана, да се постави микрофилтрационната единица с размер на порите 0,1 0,2 μ при налягане около 2 до 7 psi, с помощта на буфер, състоящ се от около 0,1М TRIS, pH около 10,4 и около 0,1 % TRITON Х-100.

Супернатантата от центрофугирането или филтратът от микрофилтрацията може да бъде концентриран преди следващата стъпка от цялостната процедура. Концентрирането се постига по няколко метода, включително, но без да се ограничава от, диализа, филтрация, лиофилизация, ултрафилтрация и диафилтрация. Предпочитаният метод на концентриране от настоящото изобретение е да се пропусне прочистеният екстракт през 10⁵ мол. тегло фиброзна ултрафилтрационна система. Обемът на пречистения екстракт е типично редуциран около 6,5-кратно за микрофилтрационния продукт и около 2-кратно за разредения, центрофугиран продукт, като се получава концентриран продукт. След концентрирането, продуктът се диафилтрира до по-нататъшно отстраняване на контаминантите с ниско молекулно тегло. Диафилтрацията се провежда с помощта на фиброзна система с молекулно тегло на фибрите около 10⁵.

Ако е добавен TRITON Х-100, той може да бъде отстранен по няколко обичайни метода, включително, но без да се ограничава от диализа, добавяне на същински органични разтворители, хроматографско отделяне и контакт с гел или каучук, специфично свързващи детергенти като Extractogel /Pierce/ и XAD каучук /Romicon/. Предпочитаният метод по това изобретение за отстраняване на TRITON Х-100 е този, при който третираният на горещо екстракт, съдържащ TRITON Х-100 циркулира през пакет от i

XAD-2 или XAD-4 каучук /полистирен дивинилбензен/. Третираният на горещо екстракт циркулира през XAD пакета за около 10 h при 4°С и след това се събира в подходящ съд, например, стъклена бутилка, която може да се запечатва.

Ако клетките са разрушени в буфер с високо ниво на PH, pH на горещо третирания екстракт, или екстрактът, съдържащ протеазни инхибитори, след това се довежда до стойност на pH 7,0 - 7,9, за предпочитане около 7,7. Довеждането на pH до около 7,7 с последващо горещо третиране при високи стойности на pH съгласно метода на изобретението улеснява абсорбцията на повърхностните протеини към широките пори на силиция, използван в следващия етап. Регулирането на pH на третирания на горещо екстракт може да бъде проведено преди етапа на отстраняване на TRITON Х-100, без да се предизвика страничен нежелан ефект. Съгласно метода на изобретението редът, по който е дадено регулирането на pH и отстраняването на TRITON Х-100, може да бъде разместен без забележим ефект върху резултата от процедурата.

След това е лесно да се отстранят контаминантите, като се получават съществено пречистени HBsAg. Предпочитаният метод за елиминиране на контаминантите е да се адсорбира HBsAg върху широко порест силиций. Найпредпочитан метод от това изобретение е да се адсорбира HBsAg върху широкопорест силиций с размер на порите около 100 до 1500 ангстрьома и размер на частичките на силиция от около 30 до 130 μ /Amicon/. Повърхностният протеин влиза в порите и се задържа там. Поради това клетъчните контаминанти лесно могат да бъдат отмити.

Адсорбцията на повърхностните протеини върху широко порест силиций може да бъде проведена хроматографски или нехроматографски, по маниера на еднократното /batch/ адсорбиране и отстраняване на продукта. При първия вариант процесът протича чрез прекарване на екстракта с регулирано pH през легло от широкопорест силиций в апарат за колонна хроматография. Обикновено, 1 1 от третирания на горещо екстракт се прилага за 5 cm запълнена колона, съдържаща около 300 ml / около 100 g сухо тегло/ широкопорест силиций при скорост на протока около 200 ml/h.

При нехроматографска адсорбция върху широкопорест силиций се смесва третираният на горещо екстракт със силиций в подходящи съдове, например стъклени колби, които могат да се затварят плътно. Предпочитан начин е добавянето на 300 ml широкопорест силиций към около 1 1 третиран на горещо екстракт в стъклената колба и инкубация при непрекъснато бъркане. Адсорбцията завършва около 1,5 h при 4 - 8°С, макар че е възможно да се използват различни температури при различна продължителност на инкубиране.

Промиването на абсорбирания с повърхностен протеин силиций от неабсорбирания материал също може да стане нехроматографски или силицият може да бъде поставен в колона, както е описано по-горе, за хроматографска абсорбция. Цикличното промиване се осъществява чрез изсушаване на третирания на горещо екстракт от широкопорестия силиций и добавяне на няколко обема от буфера, което няма да причини освобождаването на HBsAg, адсорбиран върху силиция. Предпочитаният буфер е PBS. Изсушаването и промиването се повтарят трикратно до петкратно.

Хроматографското промиване на адсорбиралия повърхностен протеин силиций се провежда чрез прекарване на PBS през силиция при ниска скорост от около 200 ml/h, докато екстинцията при 200 шп е константна величина.

HBsAg се елуира от промития широкопорест силиций с помощта на буферен разтвор с pH между около 8,5 до 9,0. Повърхностните протеини се десорбират с помощта /за предпочитане/ на буферен разтвор, състоящ се от около 0,05 М борат при pH около 8,7. Десорбцията на HBsAg може да бъде улеснена при повишена температура в широк обхват. Десорбцията при около 55°С се предпочита.

Нехроматографската десорбция се провежда чрез смесване на 1200 ml от 0,05 М боратен буфер при pH 8,7 с около 700 ml от промития широкопорест силиций, върху който е адсорбиран HBsAg. Десорбцията продължава около 25 min. След това елуатът се събира, етапите на десорбция се повтарят двукратно и елуатът се охлажда.

Хроматографската десорбция се провежда чрез затопляне на заредената колона с промития силиций до около 55°С. 0,05 М боратен буфер при pH 8,7 се затопля до 55°С и се прилага към колоната при скорост на протока от около 500 ml/h. След това елуатът се събира и охлажда. Обемът му обикновено е грубо еквивалентен на обема на горещо третирания екстракт, приложен към широкопорестия силиций.

Концентрацията на елуирания HBsAg е обикновено желана. Предпочитаният метод на концентриране е да се прекара елуатът през диафилтрационна фиброзна система с молекулно тегло на фибрите 10⁵ с помощта на боратен буфер и при pH 8,7. Обемът на елуирания повърхностен протеин може да бъде редуциран до 16 пъти с помощта на тази система. Диафилтрационният остатък може да бъде стерилизиран чрез микрофилтрация, ако това е необходимо.

Карбохидратното съдържимо на HBsAg е определено по метода на Dubois, М. et al. /22/. Основният принцип на тази процедура е, че прости захари, алигозахариди, полизахариди и техни производни, включително метилови естери със свободни или потенциално свободни редукционни групи, дават оранжево-жълт цвят, когато се третират с фенол и концентрирана сярна киселина. Количеството на цветния продукт при константна фенолна концентрация е пропорционално на количеството на присъстващата захар.

За да се определи карбохидратното съдържание на проба от HBV повърхностни протеини, 1 ml от разтвор, съдържащ между 10 до 70 gg протеин, се поставя в епруветка за тестуване. Приготвя се серия от карбохидратни стандарти и празна проба. 1 ml от 5 % фенолен разтвор се добавя към всяка проба, епруветките се разбъркват и се добавят 5 ml 96 % -ен разтвор на сярна киселина с последващо разбъркване. Епруветките се инкубират на стайна температура за 10 min, разбъркват се и се инкубират на 25 до 30°С за 20 min. Пробите се поставят на спектрофотометър / А₄₉₀ за хексози и метилирани хексози, и A_<g0за пентози, урониева киселина и нейните метилирани производни/ и количеството на карбохидрата в HBsAg пробите се определя чрез сравняване с карбохидратни стандарти.

HBsAg, продуциран в “дивия тип” рекомбинантни дрождеви клетки /CF54/, и HBsAg, продуциран в CF52 рекомбинантни дрождеви клетки, се анализират за карбохидратно съдържимо, както е описано по-горе. На базата на тези резултати съотношението на количеството на карбохидрата спрямо протеина, присъстващ във всяка проба, се изчислява чрез делене на микрограмовете от карбохидрата на микрограмовете на протеина в пробите. Това изчислено съотношение показва, че HBsAg, получен в рекомбинантните дрождеви клетки mnn9 , постоянно съдържа една десета от карбохидратното съдържимо на HBsAg, получено от рекомбинантните “див тип” дрождеви клетки. Тези резултати показват, че HBsAg, получен в mnn9‘ мутантни дрождеви клетки, съдържа съществено редуцирано количество карбохидрат, когато се сравнява с HBsAg, получен от “дивия тип” дрождеви клетки.

Средните примери илюстрират настоящото изобретение, без обаче да го ограничават. Намиращите се в примерите литературни препратки са дадени в приложената справка.

Пример 1. Клониране на HBV ДНК в PBR322.

HBV Dane частици /серотип adw/ се изолират и пречистват от човешка плазма /като носител/ и двойноверижна ДНК се синтезира в Dane частичките от ендогенната полимераза съгласно метода на Ландирс и кол. /23/ и Хруска и кол. /24/. ДНК се изолира след разграждане с протеиназа К в SDS, последвано от екстракция с фенол/хлороформ и етанолна преципитация. HBV геномната ДНК се разгражда с EcoRl, като в резултат се получава 3,2 kbp фрагмент, който се клонира в EcoRl сайт от рВР322 за формиране на pHBV/ADW-1. Присъствието на HBV ДНК се потвърждава след разграждане с EcoRl Southern блот трансфер до нитроцелулоза и хибридизация с /³²Р/ - белязани специфични олигонуклеотидни проби.

Пример 2. Клониране на preS2 + S гена в pGAP - tADH-2 експресионен вектор.

Плазмидът pHBV/ADW-Ι /описан в пример 1/ се разгражда с EcoRl и AccI, и фрагментът с размер 0,8 kbp се пречиства чрез препаративна агарозна гел електрофореза. Също така, плазмидът pUC се разгражда с EcoRl и BamHl и линеарният вектор се пречиства чрез препаративна агарозна гел електрофореза.

За реконструиране на 5' частта от preS2 + S ORF, двойка от олигонуклеотидите се синтезира специално, които възстановяват ORF от EcoRl сайта нагоре към ATG през 10 Ьр NTL последователността през сайта Hindlll към EcoRl края. Последователността на тези олигонуклеотиди е следната:

AATTCAAGCT

10

GTTCGAATGT

10

TACAAAACAA AATGCACTGG /SEQIDNO : 4/

30

TTTGTTTTAC GTCACCTTAA /SEQIDNO : 3/

За реконструиране на 3' част от preS2 + S ORF втора двойка олигонуклеотиди се синтезира, които реконструират ORF от Асс!

сайта през транслационния терминатор през Hindlll сайт към BamHI края. Последователността на тези олигонуклеотиди е:

AGCTTG /SEQIDNO : 4/

GAACCTAG /SEQIDNO : 5/

АТАСАТТТА

10

TGTAAATTTC 10 10

Олигонуклеотидните двойки се линеализират, след това се лигатират към pUC EcoRI BamHI разграден вектор. Полученият в резултат вектор /2,8 кЬр/ се пречиства с препаративна агарозна гел електрофореза. Фрагментът EcoRI - AccI от 0,8 kbp от горните последователности се лигатира с този вектор. Присъствието и ориентацията на preS2 + ORF се потвърждава от рестрикционен ендонуклеазен анализ и Southern блот. ДНК секвенционният анализ /25/ изявява две замествания на базите, което резултира в аминокиселинни различия от последователността, кодирана от ДНК на плазмида HBpreSGAP347/19T. За изпитване на идентичните полипептиди от двете конструкции,

AATTCAAGCT TACAAAACAA

10 20

GATTC /SEQIDNO : 6/

GTTCGAATGT TTTGTTTTAC

10 20

GGATC /SEQIDNO : 7/ тези замествания, които са Т вместо С при база 64 /кодиращи Phe вместо Leu/ и С вместо 15 А при база 352 /кодиращ His вместо Gin/ се променят чрез сайтнасочена мутагенеза /26/.

Плазмид, съдържащ HBsAg кодиращ регион без preS2 кодираща област, се конструира както следва. Плазмидът pUCHBpreS2 + S /описан по-горе/ се разгражда с EcoRI и Styl рестрикционни ендонуклеази. Големият ДНК фрагмент /3,3 кЬр/, който съдържа pUC и HBsAg кодираща област, се отделя от preS2 кодиращия ДНК фрагмент и се пречиства чрез препара25 тивна агарозна гел електрофореза. След това синтетичните ДНК олигонуклеотидни двойки:

AATGGAGAAC ATCACATCAG

40

CTCTTGTAGT GTAGTCCTAA

40 се лигатират с pUCHBsAg фрагмент. Тази синтетична олигонуклеотидна двойка съдържа 5' EcoRI и 3' Styl лепливи краища, така че да осигури Hindlll сайт непосредствено след 5' EcoRI сайта. В допълнение, синтетичната ДНК олигонуклеотидна двойка съдържа HBsAg ATG кодон, нагоре - 10 Ьр нетранслирана лидерна последователност и 21 нуклеотида надолу, включително и Styl сайта.

Тази олигонуклеотидна двойка възстановява пълния кодиращ регион на HBsAg и позволява неговото последващо интактно отстраняване от pUC вектора чрез разграждане с Hindlll.

ДНК векторът pUC-HBsAg с лигатирана ДНК олигонуклеотидна двойка, описана по40 горе, се използва за трансформиране на E.coli. Рекомбинантните плазмиди се подбират така, че да имат пълния реконструиран HBsAg кодиращ регион. Пълната HBsAg отворена четяща рамка /ORF/ се отстранява от рекомбинантния плазмид чрез разграждане с Hindlll, последвано от изолиране и пречистване на / 0,7 kbp/ HBsAg ДНК чрез препаративна агарозна гел електрофореза за клониране в експресионен вектор.

Пример 3. Клониране на HBsAg ORF в три различни експресионни вектора.

За конструиране на експресионен блок се използват три различни експресионни вектора. GAP491 промоторен експресионен блок, описан по-рано /11/, е съставен от около 1,1 kbp глицералдехид дехидрогеназен промотор / GAPDH/ и около 350 Ьр от дрождев алкохол дехидрогеназен¹ /ADH1/ терминатор в рВР322 основа, с уникален Hindlll сайт между промотора и терминатора. HBsAg ORF от пример 2 се лигатира в уникален Hindlll сайт, и неговото присъствие и ориентация се потвърждават с рестрикционен ендонуклеазен анализ и Southern блот.

Обратно, GAL10 /0,5 kbp/ промоторът /12/ се замества в горната конструкция, и ADH2 /1,25 kbp/ промоторът /13/ се замества с GAP промотора /вж. фиг. 1/. Във всеки случай експресионният блок, съдържащ специфичен промотор HBsAg и ADH1 терминатор, се клонира в совалков вектор рС1/1 /Beggs, по-горе и Rosenberg, по-горе/, за създаване на дрождев експресионен вектор, който след това се използва за трансформация на S.cerevisiae, както е описано по-долу.

Пример 4. Коструиране на дрождев

S.cerevisiae CF52 /шпп9 / мутантен щам.

Щам S.cerevisiae KHY107 /cir⁺, adel⁺, 1еи2' и mnn9/ се конструира както следва:

Щамът С/5/ IB347-1C с кръстосване тип /mnn9', UCZ7 се разбърква с щама 2150-2-3 с кръстосване от а тип /1еи2', adel/, чрез размесването на щамовете върху пълна среда на YEHD. За подбор на диплоидите размесените щамове се препосяват върху минимална среда, съдържаща 2 % захароза като единствен карбонов източник. След изолиране на единични колонии диплоидите спорулират и асците се разрязват по стандартни техники. Щамът KHY107 се изолира като единична спора и се характеризира като cir*, adel*, 1еи2‘ и mnn9‘ /по техниката на Шиф/.

KHY107 /cir о/ е получен от щам KHY107 /ей*/, както е описано от Вгоасп /26/. Съхраненият щам е превърнат в игаЗ' чрез интегриране на разградения игаЗ ген. Полученият в резултат щам KHY107 игаЗ’ се култивира върху богата среда, за да позволи акумулиране на спонтанни мутации, и се подбира устойчив на канаванин мутант. Мутантният щам CF55, всъщност е сапГ, потвърдено чрез комплементен анализ. GAL10pGAL4 експресионният блок се интегрира в гена HIS3 от CF55/26/ за получаване на крайния гостоприемников щам

CF52 /Mata 1еи2-2, 112 игаЗД canl, his3A: GAL10pGAL4 - URA3, cir»/.

Пример 5. Трансформация на дрождите и установяване на посявката за HBsAg в CF52 шпп9' мутантни дрожди.

Плазмидът рС 1 /1 pGALlOHBsAg - tADH, описан в пример 3, се използва за трансформиране на щам S.cerevisiae CF52. Клоновете се подбират върху минимална хранителна среда /leu - съдържаща 1М сорбитол/, установени като замразен резерв /в 17 % глицерол/ и изпитани, както е описано по-долу.

Пример 6. Култивиране и експресия на HBsAg гена след промотора GAL10 в дрожди CF52 /шпп9/.

Клоновете от дрожди, съдържащи експресионен плазмид, описан в пример 5 по-горе, се посяват на 1еш селективна агарна среда, съдържаща 1М сорбитол и инкубирана на 30°С за 2 - 3 дни. Тези дрожди се инокулират с 5 - 7 ml от комплексна YEHDS /YEHD + 1М сорбитол/ и културите се инкубират на 30°С с аерация за 12 до 18 h. Колбите, съдържащи 50 ml YEHDS + 2 % галактозна среда, се инокулират от горната култура /до начално Α^θ 0,1/ и се инкубират на 30°С при разклащане /350 грт/ за 72 h до крайно Α^θ от 10 до 16. Пробите от единици се диспергират в епруветки и дрождевите клетки се центрофугират на 2000 xg за 10 min. Центрофугатите се изпитват директно или се оставят на -70°С за бъдещи изследвания. По време на изпитването пробите се ресуспендират в 0,4 ml фосфатно буферен разтвор, съдържащ 2мМ PMSF. Дрождевите клетки се разрушават чрез:

/ добавянето на 200 - 300 mg стъклени топчета /0,45 mm/;

2/ разбъркване в миксер за 15 min;

3/ добавяне на TRITON Х-100 до 0,5 % /v/v/;

4/ разбъркване в миксер за 2 min и 5/ инкубиране на 4°С за 10 - 15 min. Клетъчните останки и стъклените топчета се отстраняват чрез центрофугиране при 13000 xg за 10 min. Прояснената супернатанта се отстранява и анализира за протеин /по метода на Лоури/ и за HBsAg чрез Ausria^Rпробата / Abbott/. Типичните резултати от изпитването са показани по-долу.

Таблица I.

Описание на пробата	Ausria,UG/MG протеин	Р24 ниво
Разрушаване	Имуноблот
Шейкерни колби mnn9‘ - мутант див тип /тпп9*/	/0,55, 0,61, 0,53/	стъклени топчета ст.топчета	+++ +

Пример 7. Широкомащабно култивиране на S.cerevisiae /тпп9 /, продуциращ HBsAg във ферментори

Замразените рекомбинантни дрождеви култури се инокулират в leu^- среда, съдържаща 1М сорбитол. Паничките с културите се инкубират обратимо на 29°С за 2 - 3 дни. Културите се ресуспендират в YEHDS и ресуспендираните клетки се прехвърлят в 2L ерленмайерови колби, съдържащи 500 ml YEHD и 2 % галактоза. Колбите се инкубират на 28°С и 350 rpm в контролиран шейкерен инкубатор за 18 - 22 h. Получените култури след това се използват за инокулиране на съдовете за производство в промишлен мащаб.

Около 1 - 5 % v/v инокулум от една или повече колби се прехвърля в 16L или 250L ферментори, съдържащи 10L или 200L от YEHDS, съответно. 16L ферменторите работят при режим 160 RPM, 60 Ι/min въздух и 28°С. Ферменторите са готови за събиране на продукцията след 40 до 46 h след инокулирането със семенната култура. Степента на оптичната плътност възлиза на 15,0 Α^θ единици. Събирането на клетките се състои от концентрирането им с помощта на филтриране през фиброзен филтър, последвано от промиване на клетките в буфериран солен разтвор. Клетъчните промивки /заедно с клетките/ се изпитват както е описано по-долу или се съхраняват на студено при -70°С за по-нататъшно използване в процеса или за анализ.

Малки проби /0,6 м1/ от 20 % промити клетъчни разтвори се подлагат на разрушаване със стъклени топчета /0,45 - 0,52 тт/ в 1,5 ml епруветки на Епендорф/. PMSF /6,5 μΐ от 200 мМ резерв/ се добавя като протеазен инхибитор. Еднакви количества се отстраняват от епруветките сред разрушаване и замразяване на

-70°С за по-нататъшно използване в имуно15 блот анализ.

Добавя се TRITON Х-100 към останалите проби до крайна концентрация от 0,5 % и пробите се смесват бързо и инкубират при 4°С за 20 до 40 min. Клетъчните остатъци се отстраняват чрез центрофугиране и прояснения клетъчен екстракт се изпитва за антиген /Ausria^R/ и протеин /Лоури/.

Пример 8. Пречистване на протеина в специална форма посредством имуноафинитетна хроматография.

Рекомбинантни щамове S.cerevisiae, конструирани както е описано в пример 5, се култивират или в колби или във ферментор. Дрождевите клетки се събират посредством микрофилтрация в Amicon-DC-10 единица, суспендират се в 30 ml буфер А /0,1М Na₂HPO₄, pH 7,2, 0,5М NaCl/ и се разрушават с налягане по Stansted за седем пасажа при 75 - 85 паунда за квадратен инч. Разрушените клетки се суспендират /31 gm сухо тегло/ и суспензията се разрежда със 120 ml буфер A, Triton Х-100 се добавя до крайна концентрация 0,5 % /w/v/ и суспензията се прояснява чрез центрофугиране на 10 000 xg за 20 min при 4°С. Проясненият бульон се декантира и инкубира със Сефароза 4В, присъединява се с антитела към HBsAg /27/ за 19 h при 4°С за адсорбиране на антигена върху каучука. След периода на инкубация промивката се затопля до стайна температура за всички останали последващи етапи и се дегазира под вакуум за 15 min. Обезгазената промивна суспензия се отлива върху 2,5 х 40 cm колона. След като колоната се запълни окончателно, несвързаният протеин се промива с буфер А. Антигенът се елуира с ЗМ KSCN в буфер А. Фракциите, съдържащи антиген, се диализи20 рат срещу 0,007М Na₂HPO₄, pH 7,2, 0,15М NaCl при 4°С и се отлива до формиране на диализна афинитетна проба, съдържаща 1,08 mg протеин в 20 ml. 16 ml от тази проба се разреждат до 40 mcg/ml с 5,6 ml 0,006М 5

Na₂HPO₄, pH 7,2, 0,15М NaCl. Продуктът се стерилизира чрез филтриране през Millex - GV 0,22 μ мембрана. Идентичността на продукта в диализната афинитетна проба се доказва чрез откриване на HBsAg с реактива Ausria^R.

Таблица II

Описание на пробата	Ausria, UG/MG/Protein	Разрушаване
Ферментори mnn9'	/1,13, 1,10, 1,06/	Стъклени топчета
тпп9'	/3,1, 4,4/	Manton - Gaulin
див тип	/3,3/	Manton - Gaulin

Пример 9. Широкомащабно пречистване на рекомбинантни HBsAg.

Около 250 g от замразена клетъчна паста /продуцираща рекомбинантен протеин/ се ресуспендира до 17 % сухо тегло/обем /около 1500 ml/ във фосфат буфериран солен разтвор /PBS/. Клетките се нагряват до 45°С чрез потапяне във водна баня. Температурата се довежда до 45°С за 15 min и след това се охлажда постепенно до 10°С. След това клетките се разрушават чрез двукратно прекарване през хомогенизатор на Gaulin.

Следвайки хомогенизирането, 10 % Triton Х-100 се добавя до крайна концентрация 0,3 % и се размесва за около 15 min. Клетъчните екстракти след това се центрофугират при 3,6 xg за 20 min на 4°С и супернатантата се събира.

След това супернатантата се провежда над колона, съдържаща около 200 g от XAD-2 каучук за отстраняване на Triton Х-100. Елуентът след това се провежда над колона, съдържаща около 150 g широко порест силиций с размер на порите около 1500 ангстрьома и размер на частичките около 50 μ. Използваните колони са 5 cm в диаметър /Pharmacia/ и работят при ниска скорост около 200 ml/h.

Силициевата колона след това се промива с PBS, докато A_2g0 се превърне в основна.

S протеинът се елуира от силициевата колона с помощта най-напред на студен боратен буфер /50 мМ, pH 8,7, 4°С/ при ниска скорост от около 500 ml/h, докато се види нарастване на A_2g0. След като вече Α^θ е започнало да нараства, колоната се загрява на 55°С и боратен буфер с 55°С температура се прокарва през колоната при скорост около 500 ml/min. Елуатът, съдържащ протеин, /около 1 1/ се събира върху лед. След това елуатът се концентрира до около 200 ml чрез диафилтрация срещу 50 мМ боратен буфер на pH 8,7 с помощта на фиброзен филтър с молекулно тегло на отделните фибри 10^s. S протеинът след това се филтрира през 0,2-микронен филтър и се съхранява. Продуктът е стабилен, без забележителна деградация, установено с помощта на Western блот анализ.

Пример 10. Изпитване на карбохидратното съдържимо на карбохидратни повърхностни протеини.

Карбохидратното съдържимо на рекомбинантни HBV повърхностни протеини се определя по метода на Dubois /22/. Основният принцип на тази процедура е, че проба от захари, олигозахариди, полизахариди и техни производни, включително метилови естери със свободни или потенциално свободни редуциращи групи, дава оранжево-жълто оцветяване, когато се третира с фенол и концентрирана сярна киселина. Количеството на цвета, получен при константна фенолна концентрация, е пропорционално на количеството на присъстващите захари.

За определяне на карбохидратното присъствие на HBsAg у дивия тип дрождеви щамове и у дрождевия щам mnn9^_, 1 ml от разтвор, съдържащ между 10 до 70 mg протеин, се поставя в епруветка за тестуване. Серии от карбохидратни стандарти и празни проби се изготвят така, че да съдържат различни количества карбохидрати. 1 ml от 5 % фенолен разтвор се добавя към всяка проба, епруветките се разбъркват и се добавят 5 ml 96 % разтвор на сярна киселина с последващо разбъркване. Епруветките се инкубират на стайна температура за 10 min, разбъркват се и се инкубират при 25 до 30°С за 20 min. Пробите се разчитат на спектрофотометър /А₄₉₀ за пентози, уронова киселина и нейни метилирани производни/ и количеството на карбохидратите в HBV повърхностните протеинови проби се определя чрез сравняване на карбохидратните стандарти.

На базата на тези резултати съотношението на количеството на карбохидратите към протеина, съдържащ се във всяка проба, се изчислява чрез разделяне на микрограмовете карбохидрат на микрограмовете протеин в пробата, което е показано по-долу.

Съотношение на карбохидрати към протеин в HBsAg

Дрождев щам	Карбохидрат/ Протеин
шпп9'	0,05
див тип за
гликозилиране	0,56
/ тпп9⁺/

Така изчислено съотношението показва, че HBsAg, продуциран в mnn9' рекомбинантни дрождеви клетки последователно, съдържа една десета от карбохидратното съдържимо на HBsAg, продуциран в рекомбинантни “див тип” дрождеви клетки. Тези резултати показват, че HBsAg, продуцирани в mnn9‘ мутантни дрождеви клетки, съдържат съществено редуцирани количества карбохидрати в сравнение с HBsAg, продуцирани в “дивия тип” дрождеви клетки.

Информация за SEQ ID NO : 1 Секвснционна характеристика а/ дължина : 10 двойки бази; б/ тип : нуклеинова киселина; в/ вид на веригата : едноверижна; г/ топология : линеарна;

Молекулен тип : ДНК /геномна/ Описание на последователността : SEQ ID NO : 1

ACAAAACAAA

Информация за SEQ ID NO : 2 Секвенционна характеристика а/ дължина : 30 двойки бази; б/ тип : нуклеинова киселина; в/ вид на веригата : едноверижна; г/ топология : линеарна;

Молекулен тип : ДНК /геномна/ Описание на последователността : SEQ

ID N0 : 2

AATTCAAGCT ТАСААААСАА ААТ GCAGTGG

Информация за SEQ ID NO : 3

Секвенционна характеристика а/ дължина : 30 двойки бази; б/ тип : нуклеинова киселина; в/ вид на веригата : едноверижна; г/ топология : линеарна;

Молекулен тип : ДНК /геномна/

Описание на последователността : SEQ ID N0 : 3

GTTCGAATGT TTTGTTTTAC GTCA ССТТАА

Информация за SEQ ID NO : 4

Секвенционна характеристика а/ дължина : 15 двойки бази; б/ тип : нуклеинова киселина; в/ вид на веригата : едноверижна; г/ топология : ДНК /геномна/;

Описание на последователността : SEQ ID N0 : 4

ATACATTTAA GCTTG

Информация за SEQ ID N0 : 5 Секвенционна характеристика а/ дължина : 18 двойки бази; б/ тип : нуклеинова киселина; в/ вид на веригата : едноверижна; г/ топология : линеарна;

Молекулен тип : ДНК /геномна/

Описание на последователността : SEQ ID N0 : 5

TGTAAATTTC GAACCTAG

Информация за SEQ ID N0 : 6 Секвенционна характеристика а/ дължина : 45 двойки бази; б/ тип : нуклеинова киселина; в/ вид на веригата : едноверижна; г/ топология : линеарна;

Молекулен тип : геномна ДНК

Описание на последователността : SEQ ID NO : 6

AATTCAAGCT ТАСААААСАА AATG GAGAAC ATCACATCAG GATTC

Информация за SEQ ID NO : 7 Секвенционна характеристика а/ дължина : 45 двойки бази; б/ тип : нуклеинови киселини; в/ вид на веригата : единична; г/ топология : линеарна;

Молекулен тип : ДНК /геномна/

Описание на последователността SEQ

ID NO : 7

GTTCGAATGT TTTGTTTTAC CTCTTGTAGT GTAGTCCTAA GGATC

Информация за SEQ ID NO : 8 Секвенционна характеристика а/ дължина : 29 двойки бази; б/ тип : нуклеинова киселина; в/ вид на веригата : едноверижна; г/ топология : линеарна;

Молекулен тип : ДНК /геномна/ Описание на последователността : SEQ ID NO : 8

AATTGTCGAC AGCTAGCTGA ATTCCCGGG

Информация за SEQ ID NO : 9 Секвенционна характеристика а/ дължина : 29 двойки бази; б/ тип : нуклеинова киселина; в/ вид на веригата : едноверижна; г/ топология : линеарна;

Молекулен тип : ДНК /геномна/ Описание на последователността : SEQ ID NO : 9

AGCTCCCGGG AATTCAGCTA GCTGTCGAC

Claims

Патентни претенции

1. Еукариотична експресионна система за получаване на рекомбинантни полипептиди и протеини, съдържащи редуцирани нива на гостоприемникови карбохидрати и гликопротеини.
2. Експресионна система съгласно претенция 1, където еукариотичният гостоприемник е дрожди.
3. Експресионна система съгласно претенция 2, където дрождевият гостоприемник е Saccharomyces cerevisiae.
4. Експресионна система съгласно претенция 1, където рекомбинантният полипептид или протеин е хепатит В вирусен полипептид или протеин.
5. Експресионна система съгласно претенция 4, където хепатит В вирусният полипептид или протеин е повърхностен полипептид или протеин.
6. Експресионна система съгласно претенция 5, където хепатит В вирусният полипептид или протеин е HBsAg.
7. Хепатит В вирусен повърхностен протеин, който формира частички със съществено редуцирано повърхностно карбохидратно или гликопротеиново съдържание.
8. Хепатит В вирусен повърхностен протеин съгласно претенция 7, продуциран в рекомбинантни дрождеви клетки, които са генетично дефицитни на протеиново гликозилиране.
9. Хепатит В вирусен повърхностен протеин съгласно претенция 8, където генетичната недостатъчност на дрождевите клетки е в тпп9 гена.
10. Хепатит В вирусен повърхностен протеин съгласно претенция 7, където карбохидратът към протеиновото съотношение от пречистения повърхностен протеин е по-малко от 0,5.
11. Ваксина срещу хапатит В вирус за приложение при хора, която включва хепатит В вирусен повърхностен протеин, който формира частички със съществено редуцирано количество на включения карбохидрат или гликопротеин.
12. Ваксина съгласно претенция 5, продуцирана в рекомбинантни дрождеви клетки, които са генетично дефицитни за протеинова гликозилация.
13. Ваксина съгласно претенция 12, където генетичният дефицит е в mnn9 гена.
14. Ваксина съгласно претенция 11, където карбохидратното към протеиновото съотношение от повърхностния протеин е по-малко от 0,5.
15. Имунологично диагностичен реагент, който включва хепатит В вирусен протеин, формиращ частици със съществено редуцирано количество на включения гостоприемников карбохидрат или гликопротеин, който има редуцирана реактивност с природно срещаните антидрождеви антитела.
16. Имунологично диагностичен реагент съгласно претенция 15, където карбохидратното към протеиновото съотношение от пречистения повърхностен протеин е по-малко от 0,5.