PL171485B1 - Sposób wytwarzania czastek HBsAg o zasadniczo zmniejszonej zawartosci uwiezionegoweglowodanu PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania czastek HBsAg o zasadniczo zmniejszonej zawartosci uwie- zionego weglowodanu, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle komórek drozdzy-go- spodarza pozbawionych zdolnosci glikozylacji, zawierajacych sekwencje DNA kodujaca polipeptyd S wprowadzona przez transfekcje lub transformacje wektorem ekspresyjnym kodujacym S-sekwencje polipeptydu ewentualnie wydziela sie wytworzone w wyniku ekspresji S-sekwencji zadane czastki HBsAg. PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania cząstek HBsAg o zasadniczo zmniejszonej zawartości uwięzionego węglowodanu.

Wirus zapalenia wątroby B (HBV) jest czynnikiem infekcyjnym odpowiedzialnym za wiele chorób wątroby u ludzi. Wielu osobników zainfekowanych HBV przechodzi ostrą fazę choroby, po której następuje wyzdrowienie. Jednakże znaczna liczba zainfekowanych osobników nie stwierdza u siebie objawów zainfekowania i w związku z tym stają się oni chronicznymi nosicielami infekcji. Infekcja HBV jest endemiczna w wielu rejonach świata, przy czym w wielu przypadkach następuje zakażenie okołoporodowe przez przewlekle zainfekowane matki noworodków, które często same stają się chronicznie zainfekowane. Liczbę osób zainfekowanych na świecie ocenia się, na ponad 300 milionów. Z tej grupy nosicieli setki tysięcy ludzi umiera corocznie z powodu długotrwałych skutków chronicznego zapalenia wątroby B (marskość wątroby i/lub rak wątrobowo-kornórkowy).

Wirus δ zapalenia wątroby typu B jest czynnikiem, który w czasie współinfekowania wraz z HBV jest odpowiedzialny za wywołanie ostrej i piorunującej choroby, zazwyczaj z tragicznym końcem. Wirus 8 nie koduje (z wykorzystaniem własnego materiału genetycznego) białek służących jako otoczka wirionu; wirus ten raczej tworzy kapsułę z białek otoczkowych kodowanych przez współinfekujący HBV, będąc w ten sposób w bliskim strukturalnym i immunologicznym pokrewieństwie z białkami HBV, opisanymi poniżej. Obecnie nie wiadomo, czy inne czynniki infekcyjne mają podobne pokrewieństwom HBV. Wiadomo jednak, że białka o poszerzonym zakresie reaktywności serologicznej lub o zwiększonej immunogenności mogą być przydatne w układach do diagnozowania lub zapobiegania (albo leczenia) chorób (lub infekcji) poprzez grupę czynników z nawet niewielką lub częściową reaktywnością krzyżową z HBV.

Wirion HB składa się z dwóch grup białek strukturalnych, białek rdzeniowych oraz białek otoczkowych lub białek powierzchniowych. Będąc głównymi białkami powierzchniowymi wirionu czyli cząsteczkami Dane'a białka otoczki stanowią również główne składniki antygenu Australia lub cząsteczek 22 nm. Takie białka powierzchniowe są produktami translacji wielkiej wirusowej otwartej ramki odczytu (ORF) kodującej co najmniej 389 aminokwasów (aa). Ta ORF jest podzielona na 3 domeny, z których każda zaczyna się kodonem ATG zdolnym do działania lub działającym jako miejsce inicjowania translacji in vivo. Domeny takie określa się jako preS 1 (108 aa), preS2 (55 aa) oraz S (226 aa) odpowiednio w kierunku 5'-3' w genie. Domeny te definiują zatem 3 polipeptydy określane jako S lub HBsAg (226 aa), preS2+S (281 aa) oraz preSl+preS2+S (389 aa), określane również odpowiednio jako p24/gp27, p30/gp33/gp36 i p39/gp42 (a także jako białko główne, pośrednie i wielkie).

171 485

Białka otoczkowe HBV są glikoproteinami z bocznymi łańcuchami węglowodanowymi (glikanami) przyłączonymi za pomocą wiązań N-glikozydowych w określonych miejscach rozpoznawania peptydu. [Heermann i inni, J.Virol.52, 396 (1984) oraz Stibbe i inni, J. Virol., 46, 626 (1983). I tak, do pohpeptydów HBV wytworzonych w czasie naturalnej infekcji należą rodzaje p24/gp27 (polipeptyd S i jego glikozylowana pochodna), gp33/gp36 (polipeptyd preS2+S glikozylowany tylko w domenie preS2 oraz ten sam polipeptyd glikozylowany zarówno w domenie S jak i preS2) oraz p39/gp42 (peptyd preS 1 +preS2+S i jego pochodna glikozylowana w domenie preS1)). Obecnie dostępne szczepionki uzyskane z osocza składają się z białek zawierających zasadniczo wyłącznie domenę S (obejmującą monomer p24 i jego ghkozylowaną pochodną gp27), podczas gdy szczepionki pochodzenia drożdżowego, z powodzeniem opracowane do tej pory składają się wyłącznie z polipeptydu S (zawierającego wyłącznie nieglikozylowany p24).

Cząstki HBsAg o 22 nm wyodrębniono z osocza nosicieli przewlekłych. W związku z tym, że ich osocze jest dodatnie w odniesieniu do cząstek, takich nosicieli przewlekłych określa się jako HBs+. Jeśli u zainfekowanych osób występuje odpowiednia reakcja odpornościowa, mogą one zwalczyć infekcję i stać się osobnikami HBs-. W odniesieniu do wytwarzanych przez nich przeciwciał względem HBs, osobników takich określa się jako anty-HBs+. W ten sposób anty-HBs+ jest skorelowany z wyzdrowieniem, z odpornością na ponowne zainfekowanie chorobowe oraz z odpornością na ponowne zainfekowanie HBV. W związku z tym oczekuje się, że stymulowanie lub wytwarzanie anty-HBs przez szczepionki HB zapewnia ochronę przed infekcją HBV.

Hipotezę tę można sprawdzić doświadczalnie. Oprócz ludzi szympansy stanowią jeden z niewielu gatunków całkowicie podatnych na infekcję HBV, o czym świadczą dające się oznaczyć ilościowo markery takie jak HBs+ oraz zwiększone poziomy enzymu wątrobowego w surowicy. Szympansy zaszczepiono trzema dawkami oczyszczonych cząstek HBsAg, po czym poddano dożylnej ekspozycji na infekcyjny HBV. Podczas gdy u pseudozaszczepionych zwierząt wystąpiły oznaki ostrej infekcji HBV, to zwierzęta zaszczepione HBsAg były w całości chronione przed objawami infekcji. Wynika stąd, ze w badanym układzie doświadczalnym cząstki HBsAg złożone z p24 (lub p24 i pg27) wystarczają do zaindukowania ochronnej odporności. W oparciu o takie obserwacje szereg producentów wytworzyło szczepionki HB złożone z cząstek HBsAg.

W celu rozszerzenia dostępnych źródeł szczepionek HB producenci zastosowali technikę rekombinantowego DNA, aby wpłynąć na ekspresję wirusowych białek otoczki. Spośród wielu układów opartych na drobnoustrojach najczęściej do ekspresji różnych białek pochodzenia rekombinantowego wykorzystuje się Escherichia coli i S. cerevisiae. Liczne próby ekspresji immunologicznie aktywnych cząstek HBsAg w E. coli zakończyły się niepowodzeniem. Natomiast S. cerevisiae wykazała znaczną uniwersalność w odniesieniu do zdolności ekspresji immunologicznie czynnych cząstek HBsAg. Stwierdzono, że cząstki te (złożone wyłącznie z p24), po wykonaniu z nich szczepionek, są zdolne do całkowitego chronienia szympansów przed ekspozycją za pomocą żywych HBV różnych serotypów. Ponadto cząstki S pochodzenia drożdżowego są również immunologicznie aktywne, a próby kliniczne wykazały, że są one podobnie skuteczne w zapobieganiu chorobie lub infekcji u ludzi jak HBsAg uzyskane z osocza [Stevens i inni, JAMA, 257:2612-2616 (1987)]. Potwierdza to zdecydowanie przydatność S. cerevisiae jako organizmów-gospodarzy do prowadzenia syntezy rekombinowanego HBsAg. Na dodatek ekspresja środków terapeutycznych i szczepionek dla ludzi w drożdżach może być bardzo przydatna przy uruchomieniu produkcji, gdyż drożdże są wolne od endotoksyny, nie są patogenami w stosunku do ludzi, można prowadzić ich fermentację w skali przemysłowej, oraz nie występują w ich przypadku problemy związane ze stosowaniem ciągłych linii komórkowych ssaków (spośród których wiele ulega transformacji wirusowej, może być rakotwórcze dla myszy, a wszystkie zawierają protoonkogeny).

S. cerevisiae (drożdże piekarskie) są eukariontem zdolnym do syntetyzowania glikoprotein. Glikozylowame białek w drożdżach jest przedmiotem wielu ostatnio opublikowanych artykułów przeglądowych (przede wszystkim Kukuruzinska i inni, Ann. Rev. Biochem., (1987), 56, 915-44; Tannen i inni, BBA (1987), 906,81 -99]. Takie glikozylowanie lub addycja glikanów do odpowiednich receptorowych aminokwasów (aa) w polipeptydzie zachodzi przy odpowied4

171 485 nich resztach seryny (Ser) lub treoniny (Thr) (połączenie przez O) albo tez przy odpowiednich resztach asparaginy (Ans) (połączenie przez N). Specyficzność addycji w przypadku O-wiązania przy resztach Ser i Thr nie jest w pełni wyjaśniona i określa się ją empirycznie w każdym przypadku.

Ustalono, że sekwencję sygnałową glikozylowania z połączeniem przez N stanowi sekwencja aminokwasów Asn-X-Thr lub Asn-X-Ser (gdzie X oznacza dowolny aminokwas). Oprócz syntetyzowania wielu autologicznych, rodzimych glikozylowanych białek (do których należą białka określane jako mannoproteiny lub mannopeptydy) drożdże są również zdolne do glikozylowania białek heterologicznych lub obcych uzyskanych technikami rekombmacyjnymi w wyniku ekspresji (jeśli heterologiczne białko zawiera odpowiednią sekwencję sygnałową glikozylowania dla glikozylowania z połączeniem przez N lub połączeniem przez O).

Polipeptydy preS2+S wytwarzane w czasie naturalnej infekcji zawierają nie więcej niż dwa rdzeniowe [o wielkości około 3 kilodaltonów (kD)] glikany z połączeniem przez N, jeden w obszarze S, a drugi przy Asn jako reszcie aminokwasowej 4 w domenie preS2. Miejsce rozpoznawania w domenie S nie ulega glikozylowaniu ani w Recombivax HB® ani w rekombinantowym preS2+S syntetyzowanym w drożdżach. Jednakże miejsce reszty aminokwasowej 4 w domenie preS2 jest rozpoznawane i ulega glikozylowaniu przez drożdże.

Domena preS1 zawiera miejsce glikozylowania z połączeniem przez N w reszcie aminokwasowej 4 regionu preS 1 oraz potencjalne miejsce przy reszcie aa 26 w przypadku serotypu adw. Dla specjalistów zrozumiałe jest, że informacje podane wyżej w odniesieniu do glikozylowania preS2 odnoszą się również do rozmaitych sekwencji w regionie preS2 oraz do sekwencji w domenach preSl i S.

Drożdże syntetyzujące rekombinantowy preS2+S dodają rdzeniowy glikan podobny do glikanu dodawanego do rodzimego polipeptydu w czasie infekcji wirusowej. Jeśli jednak drożdżowa komórka-gospodarz jest typu dzikiego w odniesieniu do glikozylacji (to znaczy jeśli zawiera pełny komplet enzymów niezbędnych dla natywnej glikozylacji, j ak to jest w przypadku praktycznie wszystkich powszechnie wykorzystywanych szczepów drożdży), znaczna liczba takich glikanów zostanie wydłużona o wiele dodatkowych reszt mannozy w sposób identycznych do stosowanego przez drożdże przy wytwarzaniu własnych strukturalnych mannoprotein. Takie dodawanie glikanu występujące w odniesieniu do produktu obcego genu, takiego jak polipeptyd preS2+S, określa się jako hiperglikozylacja. Dla specjalistów zrozumiałe jest, ze informacje podane wyżej w odniesieniu do drożdży dotyczą również innych komórek-gospodarzy (np. owadów, grzybów, itp.), w przypadku których przebieg glikozylacji może być odmienny.

Wykazano również, że w rekombinantowych formach cząstek o 22 nm białka powierzchniowego HBV, powstałych w wyniku ekspresji w dzikich drożdżowych komórkach-gospodarzach, uwięzione są znaczne ilości komórkowego węglowodanu drożdży (pochodzącego co najmniej częściowo ze strukturalnych mannoprotein i mannopeptydów drożdżowej komórki-gospodarza). Taki uwięziony węglowodan może stwarzać potencjalne problemy związane z tym, iż może powodować powstawanie przeciwciał przeciw resztom drożdżowego węglowodanu na glikozylowanych białkach, a szczepionkowy immunogen zawierający uwięziony węglowodan drożdżowy może reagować z przeciwciałami przeciw-drożdżowymi obecnymi w większości gatunków ssaków, co może spowodować zmniejszenie jego skuteczności jako immunogenu i szczepionki.

Hiperglikozylację i uwięzienie pełnych mannoprotein i mannopeptydów można wyeliminować, albo tez glikozylację można ograniczyć w polipeptydach preS i S z HBV oraz w ich odpowiednich cząstkach, jednym z następujących sposobów.

Po pierwsze można zapobiec albo ograniczyć hiperglikozylację z połączeniem przez N w czasie wzrostu rekombinantowego gospodarza dzięki obecności w pożywce hodowlanej czynnika egzogennego (np. tunikamycyny). Po drugie polipeptydy wytworzone techniką rekombinacji lub ze źródeł naturalnych można odglikozylować chemicznie (np. bezwodnym kwasem trifluorometanosulfonowym lub bezwodnym fluorowodorem), enzymatycznie (np. za pomocą N-glikanazy, Endo-F lub Endo-H) lub na drodze fizycznej (np. przez sonikację ultradźwiękami). Po trzecie miejsce rozpoznawania dla glikozylacji można zmienić lub wyciąć na drodze muta171 485 genezy na poziomie DNA, zapobiegając w ten sposób glikozylacji rdzenia, a więc również i hiperglikozylacji. Takie zmodyfikowane otwarte ramki odczytu preS+S, w których sekwencja rozpoznawania glikozylacji została zmieniona (pod kierunkiem odpowiednich promotorów obecnych w drożdżach) transformuje się do drożdżowych komórek-gospodarzy. Uzyskane polipeptydy preS+S nie wykazują glikozylacji. Po czwarte zidentyfikować można komórki-gospodarzy pozbawionych enzymów niezbędnych do glikozylacji, co przykładowo, ale nie wyłącznie ilustruje sposób według niniejszego wynalazku. Zidentyfikowano jeden z takich szczepów drożdży (mutant mnn9) [L.Ballou i inni (1980), J.Biol. Chem. 255, 5986-5991] nie zawierający kluczowego enzymu na szlaku glikozylacji, niezbędnego do wydłużenia (hiperglikozylacji) glikanów z połączeniem przez N; badania chemiczne wykazały, że mutant ten wytwarza mannoproteiny bez zewnątrz-łańcuchowych reszt mannozy, zawierające jedynie węglowodan rdzeniowy [C.E.Ballou i inni (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,3081-3085; P.Tsai i inni, (1984), J.Biol. Chem·., 259,3805-3811]. ORF polipeptydu S lub preS+S (transkrypcjakierowana przez odpowiednie promotory aktywne w drożdżach) zastosowana została do transformowania takich drożdżowych mutantów mnn9. Uzyskany polipeptyd preS+S wykazuje jedynie glikozylację rdzeniową i pozbawiony jest hiperglikozylacji.

Jakkolwiek polipeptydy S powstałe w wyniku ekspresji w drożdżach nie wykazują ani glikozylacji ani hiperglikozylacji, to cząstki z nich złożone zawierają znaczne ilości uwięzionego węglowodanu pochodzącego z mannopeptydu drożdżowego. W związku z tym w wyniku ekspresji polipeptydów S oraz polipeptydów preS w komórkach drożdży, w których nie może zajść hiperglikozylacja, uzyskuje się zmniejszoną zawartość węglowodanu w cząstkach o 22 nm powstałych w wyniku ekspresji.

Stwierdzono, ze S. cerevisiae wykazują znaczną uniwersalność w odniesieniu do zdolności ekspresji immunologicznie aktywnych cząstek o 22 nm. Cząstki te, po wykonaniu z nich szczepionek, są zdolne do całkowitego chronienia szympansów przed zakażeniem żywym HB V. Ponadto próby kliniczne wykazały, że HBsAg pochodzenia drożdżowego jest immunologicznie aktywny w podobnym stopniu jak HBsAg pochodzący z osocza. Potwierdza to zdecydowanie przydatność S. cerevisiae jako organizmów-gospodarzy dla syntezy rekombinantowego HBsAg.

W przypadku wielu rekombinowanych układów ekspresji opartych na drobnoustrojach stwierdzono, że synteza wielu różnych polipeptydów jest szkodliwa dla komórki-gospodarza. W efekcie istnieje silne przeciwdziałanie ekspresji takich polipeptydów, tak że jedynymi komórkami nagromadzającymi się przy powiększaniu skali takiej rekombinantowej hodowli są te komórki, w których ekspresja obcego białka nie zachodzi lub zachodzi w tak małym stopniu, że hodowla staje się nieopłacalna jako źródło polipeptydu. W pewnych przypadkach szkodliwe działanie jest tak silne, że w przypadku gdy ekspresja napędzana jest przez silny konstytutywny promotor, nowo stransformowane komórki nie rozmnażają się i nie tworzą kolonii na płytkach do selekcji. Takiemu szkodliwemu wpływowi można przeciwdziałać stosując indukowalny promotor kierujący syntezą takich polipeptydów. W S. cerevisiae występuje szereg genów indukowalnych. Do czterech dobrze poznanych genetycznych układów indukowalnych należą geny wykorzystania galaktozy (GAL), gen dehydrogenazy alkoholowej 2 (ADH2), gen czynnika koniugacji a oraz gen pho 5.

S. cerevisiae zawiera 5 genów kodujących enzymy odpowiedzialne za wykorzystanie galaktozy jako źródła węgla do wzrostu. Geny GALI, GAL2, GAL5, GAL7 i GALIO kodują odpowiednio galaktokinazę, premeazę galaktozową, główny izozym fosfoglukomutazy, urydylotransferazę α-D-galaktozo-1 -fosforanową oraz difosfogalaktozo-4-epimerazę urydynową. Przy braku galaktozy wykrywa się bardzo słabą ekspresję tych enzymów. Gdy komórki hoduje się na glikozie, po czym do hodowli doda się galaktozę, nastąpi równoczesna co najmniej 1000-krotna indukcja trzech enzymów (z wyjątkiem GAL5, który indukuje się około 5-krotnie) na poziomie transkrypcji RNA. Geny GAL1, GAL2, GAL5, GAL7 i GAL10 klonowano molekularnie i sekwencjonowano. Sekwencje regulatorowe i promotorowe od strony 5' odpowiednich kodujących regionów umieszczono w sąsiedztwie regionów kodujących genu lacZ. Doświadczenia te pozwoliły ustalić te sekwencje promotorowe i regulatorowe, które są niezbędne i wystarczające do zaindukowania przyswajania galaktozy.

S. cerevisiae zawiera również 3 geny, z których każdy koduje izoenzym dehydrogenazy alkoholowej (ADH). Jeden z tych enzymów ADHII, odpowiedzialany jest za zdolność S. cerevisiae do wykorzystywania etanolu jako źródła węgla w czasie wzrostu w warunkach tlenowych. Ekspresja genu ADH2 kodującego izoenzym ADHII jest represjonowana przez katabolit, glikozę, tak że transkrypcja genu ADH2 praktycznie nie zachodzi w czasie fermentacyjnego wzrostu w obecności glikozy w ilości 0,1% (wag./obj.). Przy wyczerpywaniu się glikozy oraz w obecności nierepresjonującego źródła węgla, następuje 100-1000-krotna indukcja transkrypcji genu ADH2. Gen ten molekularnie klonowano i sekwencjonowano, po czym zidentyfikowano te sekwencje regulatorowe i promotorowe, które są niezbędne i wystarczające do derepresji i transkrypcji.

Czynnik koniugacji a jest foromonem płciowym S. cerevisiae, niezbędnym do koniugacji między komórkami MATa i MATa. Ten tridekapeptyd powstaje w wyniku ekspresji jako preproferomon, który kierowany jest do szorstkiej siateczki śródplazmatycznej, ulega glikozylacji i proteolitycznej obróbce do ostatecznej formy dojrzałej, która jest wydzielana z komórki. Taka droga przemian biochemicznych została wykorzystana jako strategia ekspresji dla obcych polipeptydów. Gen czynnika koniugacji a klonowano molekularnie i jego promotor z sekwencją pre-pro-lidera wykorzystano do ekspresji i wydzielania szeregu polipeptydów. Stwiedzono również, że promotor genu pho5 ulega indukowaniu przy niskich stężeniach fosforanu, co wykorzystano do fizjologicznie regulowanej ekspresji obcych białek w drożdżach.

Oczekuje się, że podczas przejścia przez szorstką siateczkę śródplazmatyczną i aparat Golgiego w obcych białkach może zajść glikozylacja z połączeniem zarówno przez N jak i przez O. Promotor czynnika koniugacji a jest aktywny tylko w komórkach będących fenotypowo komórkami α. W S. cerevisiae występują 4 loci genetyczne znane jako SIR, które syntetyzują białka niezbędne do represji innych zazwyczaj niemych kopii informacji a oraz a. Wrażliwe na temperaturę (ts) uszkodzenia, które zakłócają takie zjawiska represji, występują w produkcie genowym co najmniej jednego z tych loci. W mutancie takim wzrost prowadzony w 35°C znosi represję co powoduje powstanie komórek będących fenotypowo komórkach a/a. w których promotor czynnika koniugacji a jest nieaktywny. Po obniżeniu temperatury do 23°C komórki stają się fenotypowo komórkami a, tak że promotor uaktywnia się. Wykazano, że zastosowanie szczepów z uszkodzeniem SIR umożliwia kontrolowaną ekspresję szeregu obcych polipeptydów.

Gdy do wytwarzania rekombinantowych białek powierzchniowych HBV wykorzystuje się jako gospodarza, komórki drożdży typu dzikiego, w wyniku ekspresji tworzą się charakterystyczne cząstki, w których uwięzione są substancje pochodzące z tych komórek, w tym znaczne ilości węglowodanu drożdżowego. W konsekwencji szczepionka przeciwko HBV oparta na takich cząstkach zawierałaby także znaczne ilości węglowodanów wytwarzanych przez drożdże, co stanowi poważny problem, bowiem uwięzione węglowodany mogą powodować powstawanie swoistych wobec nich przeciwciał i zmniejszenie skuteczności szczepionki.

Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania cząstek białka powierzchniowego HBsAg o zasadniczo zmniejszonej zawartości uwięzionego węglowodoru.

Sposób według wynalazku polega na tym, że prowadzi się hodowlę komórek drożdży-gospodarza pozbawionych zdolności glikozylacji, zawierających sekwencję DNA kodującą polipeptyd S wprowadzoną przez transfekcję lub transformację wektorem ekspresyjnym kodującym S-sekwencję polipeptydu i ewentualnie wydziela się wytworzone w wyniku ekspresji S-sekwencji żądane cząstki HBsAg.

Korzystnie hoduje się komórki drożdży z defektem genetycznym w genie mnn 9

Białko HBsAg wytworzne przez takiego gospodarza tworzy cząstki zawierające zasadniczo mniej węglowodanu niż cząstki wytworzone przez dzikie komórki drożdży. Takie białka powierzchniowe HBsAg są przydatne jako szczepionki w leczeniu i/lub zapobieganiu infekcjom związanym z HBV, a także w diagnostyce immunologicznej jako antygen o zmniejszonej reaktywności z występującymi naturalnie przeciwciałami przeciwdrozdżowymi.

Krótki opis rysunku.

N a figurze 1 przedstawiono schematycznie plazmid pC1/1 pGAL 1 OHBs Ag-t ADH-1, który zawiera promotor pGAL 10 kierujący transkrypcją ORF HBsAg, po którym następuje terminator tADHl oraz selektywny marker LEU2+.

Szczegółowy opis wynalazku.

Wynalazek niniejszy dotyczy sposobu wytwarzania cząstek białka powierzchniowego HBV - HBsAg zawierających znacznie zmniejszone ilości uwięzionego węglowodanu, do stosowania jako szczepionka przeciw HBV.

Cząsteczki Dane'a (serotyp adw) zastosowano jako źródło kwasu nukleinowego HBV do wydzielania wirusowych ORF. Dla specjalistów zrozumiałe jest, że wynalazek rozciąga się również na zastosowanie kwasu nukleinowego, ze szczepów HBV lub pokrewnych wirusów z innymi reaktywnościami serologicznymi, wynikającymi z odmienności genetycznej wirusów. Reakcję endogennej polimerazy zastosowano do wytwarzania kowalencyjnie zamkniętego kolistego dwuniciowego DNA genomu HBV z formy nicked and gapped kwasu nukleinowego, która występuje natywnie w wirionie HB. DNA wydzielono, strawiono całkowicie za pomocą EcoRI i klonowano w miejsce EcoRI w pBR322, uzyskując w ten sposób pHBV/ADW-1. Wyselekcjonowano rekombinantowe plazmidy zawierające genom HBV w formie kolistej zamkniętej w miejscu EcoRI regionu preS. Skonstruowano pełną ORF kodującą 55 aminokwasów regionu preS2 oraz 226 aminokwasów regionu S najpierw oczyszczając fragment o 0,8 kiloparach zasad (kbp) uzyskany po trawieniu pHBV/ADW-1 za pomocą EcoRl i AccI; fragment len koduje polipeptyd preS2+S pozbawiony jedynie kodonu inicjowania, 3 aminokwasów od końca aminowego, 3 aminokwasów od końca karboksylowego oraz kodonu terminatora translacyjnego.

Zsyntetyzowano oligonukleotydy i zligowano je z tym fragmentem przekształcając go we fragment Hindlll zawierający nie ulegającą translacji 5' sekwencję otaczającą o 10 bp, pochodzącą z drożdży, przy czym pełną ORF preS2+S dobrano tak, że kodon terminacji był bezpośrednio połączony z naturalnym miejscem IHndUl w transkrypcyjnym terminatorze ADH1, uzyskując w ten sposób pełne połączenie pochodzące od natywnych drożdży, bez jakichkolwiek dodatkowych zakłócających zasad. Dla specjalistów zrozumiałe jest, że przy ekspresji białek powierzchniowych HBV oraz białek pokrewnych, ADH 1 zastąpić można dow olnym odpowiednim transkrypcyjnym terminatorem aktywnym w drożdżach.

Wybrano sekwencję otaczającą 5' dla konstrukcji

ACAAAAVCAAA (Ident.Sekw.Nr: 1)

10 odpowiadającą sekwencji w nie ulegającym translacji liderze (NTL) genu drożdżowego GAP63 (GAP) [Holland, J.Biol.Chem. 225, 2596 (1980)], który jest również sekwencją zgodności dla grupy genów GAP. Konstrukcję wykonano w taki sposób, aby przyłączyć NTL bezpośrednio do kodonu inicjowania ORF preS2+S bez udziału jakichkolwiek dodatkowych zasad. Dla specjalistów zrozumiałe jest, że w odniesieniu do ekspresji białek powierzchniowych HB V dobór sekwencji NTL rozciąga się na inne sekwencje zapewniające odpowiednie poziomy ekspresji.

Analiza sekwencji DNA wykazała 2 substytucje zasad, co w efekcie spowodowało różnice w aminokwasach w stosunku do sekwencji preS2+S kodowanej przez DNA z pHBpreSGAP347/19T [Valenzuela i inni, Biotechnology, 3(4), 317-320 (1985)]. W celu ocenienia identyczności polipeptydów w obydwu konstrukcjach te substancje nukleotydowe, w których T zastępowała C jako zasada 64 w ORF HBV preS2+S o 846 pb (kodując Phe zamiast Leu), a C zastępowała A jako zasada 352 (kodując His zamiast Gln) zmieniono na drodze ukierunkowanej mutagenezy [Zoller i inni, Nucleic Acids Research 10: 6487-6500 (1982)]. Następnie zweryfikowano kodowaną sekwencję aminokwasów dla zoptymalizowanej konstrukcji. Dla specjalistów zrozumiałe jest, że wynalazek niniejszy nie ogranicza się do tej sekwencji i obejmuje dowolną sekwencję, w której DNA koduje polipeptydy o antygenowości spokrewnionej z HB V.

Wielki fragment, DNA o 3,3 kbp, zawierający pUC19 i region kodujący HBsAg, oddzielono od fragmentu DNA kodującego preS2 po strawieniu za pomocą EcoRI i Sty! i oczyszczono metodą preparatywnej elektroforezy na żelu agarozowym. Syntetyczny oligonukleotyd DNA

171 485 zligowano następnie z fragmentem pUC19-HBsAg. Taki syntetyczny oligonukleotyd DNA zawiera lepkie końce 5' EcoRI oraz 3'StyI, a także miejsce Hindlll bezpośrednio po miejscu 5' EcoRI. Na dodatek syntetyczny oligonukleotyd DNA zawiera kodon ATG HBsAg oraz 9 nukleotydów w górę i 21 nukleotydów w dół, obejmujących miejsce Styl. Ten oligonukleotyd odtwarza pełny region kodujący HBsAg i umożliwia jego usunięcie w stanie nienaruszonym z wektora opartego na pUC19 na drodze trawienia za pomocą Hindlll.

Fragment DNA pUC19-HBsAg ze zligowanym syntetycznym oligonukleotydem DNA opisanym powyżej zastosowano następnie do transformowania E. coli. Wybrano rekombinantowe plazmidy zawierające pełny zrekonstruowany region kodujący HBsAg. Otwartą ramkę odczytu (ORF) pełnego HBsAg usunięto z rekombinantowego plazmidu na drodze trawienia za pomocą Hindlll, po czym wydzielono i oczyszczono DNA HBsAg o wielkości 0,7 kbp na drodze preparatywnej elektroforezy na żelu agarozowym, w celu przeprowadzenia klonowania w wektorze ekspresyjnym promotora GAL10.

Kaseta ekspresji (pGAL10-tADH1) napędza ekspresję obcych genów wstawionych w unikatowe miejsce Hindlll w dół od indukowanego galaktozą promotora GAL10. ORF HBsAg (z końcami HindIII) opisaną powyżej zligowano w miejscu HindIII wektora. Taką kasetę ekspresji wstawiono między miejsca SphI wektora wahadłowego pC1/1 E . coli (Beggs. supra) i wektor ten wprowadzono do szczepów S. cerevisiae CF52 lub CF54, po czym wyselekcjonowano stransformowane klony.

Po mutagenezie opisany powyżej fragment kodujący S lub preS+S zastosowano do konstrukcji kaset ekspresji w sposób opisany uprzednio [Kniskern i in., Gene 46: 135-141 (1986)], zawierającej (a) promotor GAP491 o około 1,1 kbp (b) sekwencję flankującą o 10 bp, pochodzącą z drożdży, (c) wirusową ORF o 1230 bp w przypadku preS1+preS2+S, wirusową ORF o 846 parach zasad w przypadku preS2+S albo wirusową ORF o 681 bp w przypadku S, oraz (d) terminator drożdżowy ADH1 o wielkości około 0,4 kbp.

Trzy różne wektory ekspresyjne wykorzystano w konstrukcji kaset ekspresji HBsAg. Kaseta ekspresji promotora GAP 491 opisana uprzednio [Kniskern i inni, 1986, Gene 46, 135-141], zawiera promotor dehydrogenazy gliceryloaldehydo-3-fosforanowej (GAPDH) o wielkości około 1,1 kbp oraz terminator drożdżowej dehydrogenazy alkoholowej I (ADH1) o wielkości około 350 bp, w szkielecie pBR322, z unikatowym miejscem Hindlll między promotorem i terminatorem. Przeprowadzono ligację ORF HBsAg z przykładu 2 w unikatowym miejscu Hindlll, ajej obecność i orientację potwierdzono na podstawie analizy z wykorzystaniem endonukleaz restrykcyjnych metodą blottingu Southem'a.

Alternatywnie, w powyższej konstrukcji zamiast promotora GAP o 1,1 kbp zastosowano promotor GALIO o 0,5 kbp (Schultz i inni, 1987, Gene, 54, 113-123), albo też promotor GAP zastąpiono promotorem ADH2 o 1,25 kbp (Kniskern i inni, 1988, Hepatology, 82-87) (patrz Fig. 1).

W każdym przypadku kasetę ekspresji zawierającą określony promotor, ORF HBsAg i terminator ADH1 klonowano do wektora wahadłowego pC 1/1 (Beggs, supra; Rosenberg i inni, supra) w celu wytworzenia drożdżowego wektora ekspresyjnego, który wykorzystano następnie do transformowania S. cerevisiae w sposób opisany poniżej. Transformanty te zestalono w postaci zamrożonych bulionów przed dokonaniem oceny i późniejszych doświadczeń.

Szczep rodzicielski CF52 otrzymano w sposób następujący: Szczep typu koniugacyjnego a CZ5/LB347-1C (mnn9, SUCZ. ) skoniugowano ze szczepem typu a 2150-2-3 (leu2’, adel') przez zmieszanie szczepów na płytce z kompletnym podłożem YEHD. W celu wyselekcjonowania diploidów wykonano dwukrotny posiew skoniugowanych szczepów na minimalnym podłożu leu‘zawierającym 2% sacharozy jako jedyne źródło węgla. Po wydzieleniu pojedynczych kolonii diploidy zarodnikowano i worki nasienne odcięto standardowymi sposobami. Szczep KHY-107 wydzielono jako pojedynczą sporę i scharakteryzowano jako cir+, adel+, leu2- i mnn9- (technika barwienia Schiffa).

KHY107 (cir 0) otrzymano ze szczepu KHY107 (cir+) w sposób opisany przez Broacha [Methods in Enzymology, 101, Part C, 307-325 (1983)]. Zmieniony szczep przekształcono w ura3’ na drodze integracji z rozerwanym genem ura3. Uzyskany szczep KHY-107ura3A hodowano w bogatym podłożu, aby umożliwić nagromadzenie się spontanicznych mutacji i wyselekcjonowano

171 485 mutand odporny na kanawaninę. Badania komplementacyjne wykazały, że uzyskany szczep mutantowy CF55 jest szczepem canl·. Kasetę ekspresji GAL10pGAL4 wstawiono w gen HIS3 CF55 (Methods in Enzymology, 1990,185, 297-309) uzyskując ostatecznie szczep-gospodarza CF52 (Mata ieu-2-2,112, ura3A canl his3A: GAL10pGAL4-URA3, cir°). iransformanty te zestalono w postaci zamrożonych bulionów przed dokonaniem oceny i późniejszych doświadczeń.

Rekombinantowane drożdże z zamrożonych bulionów hodowano w pożywce YEHD [Carty i inni, J. Industrial Micro., 2, 117-121 (1987)]. Po prowadzeniu hodowli w fazie stacjonarnej komórki drożdży zebrano. Wykonano lizaty, rozdzielono je metodą elektroforezy z wykorzystaniem dodecylosiarczanu sodu/żelu poliakrylamidowego (SDS-PAGE) i wykonano immunoblotting z przeciwciałami dla HBsAg. Znaleziono jeden polipeptyd o ciężarze cząsteczkowym około 24 kD, odpowiadającym przewidywanemu ciężarowi cząsteczkowemu produktu translacji ORF S. Test radioimmunologiczny (Ausria®® wykazał ponadto, że lizaty rekombinantowych drożdży, w przeciwieństwie do macierzystych, były dodatnie względem S. Mikroskopia elektronowa częściowo oczyszczonych lizatów drożdżowych wykazała dużą gęstość typowych cząstek HBsAg.

Promotor pochodzenia drożdżowego inicjuje transkrypcję HBsAg i genów pokrewnych.

W związku z tym dla specjalistów zrozumiałe jest, że promotor GAP491 zastąpić można dowolną sekwencją promotora aktywnego w drożdżach (takąjak przykładowo, ale nie wyłącznie GAL1, GAL10, ADH2, Pho5 itp.). Dla specjalistów zrozumiałe jest również, że odpowiedni układ analityczny taki jak immunoblotting, RIA lub enzymatyczny test immunosorpcyjny (EIA) należy wykorzystać w celu dokonania oceny ekspresji HBsAg i pokrewnych polipeptydów w takim układzie, tak aby zoptymalizować czas zbioru hodowli w celu uzyskania maksymalnej wydajności.

Okazało się, że promotor GAP491 jest przydatny w ekspresji w drożdżach kilku obcych białek, w tym HBsAg [Bitter i inni, Gene, 32: 263-274 (1984); Wampler i inni, Proc.Natl. Acad.Sci.USA, 82:6830-6834 (1985)]. Na podstawie wcześniejszych wyników, wytwarzania przez ekspresję HBsAg do około 40% rozpuszczalnego białka drożdżowego (Kniskner i inni, supra), zastosowano ten promotor do napędzania ekspresji HbsAg i pokrewnych białek w odpowiednich komórkach-gospodarzaeh drożdży.

Dla specjalistów zrozumiałe jest, że odpowiedni szczep drożdży do ekspresji białek powierzchniowych HBV wybrać można spośród wielu różnych szczepów-kandydatów. Do odpowiednich szczepów drożdży należą przykładowo, ale nie wyłącznie te, które wykazują taką genetyczną i fenotypową charakterystykę jak niedobór protezy i zmieniona zdolność do glikozylowania.

W celu regulowania i uzyskania określonego stopnia glikozylowania białek HBV powstałych w wyniku ekspresji w rekombinantowych drożdżach, zastosowano szczep S. cerevisiae CF52 (Mata leu2-2,112, ura3A can1 his3ń::GAL10pGAL4-ura3, cir°), skonstruowany w sposób opisany powyżej.

Plazmid ekspresji pC1/1 pGAL10HBsAg-tAGH-1 zastosowano do transformowania CF52.

(Mata leu-2-2,112, ura3A can1 his3A::GAL10pGAL4-URA3, cir°). Transformowane klony wyselekcjonowano na minimalnej pożywce (leu-) zawierającej 1M sorbit. Te klonowane transformanly zestalono w postaci zamrożonych bulionów w 17% glicerynie przed dokonaniem oceny i późniejszymi doświadczeniami.

W celu zapewnienia glikozylowania dzikich szczepów kontrolnych plazmid ekspresji zastosowano również do transformowania szczepu drożdży CF54, który wydzielono znanymi sposobami ze szczepu CF52 i który jest spontanicznym rewertantem MNN9+ (i w związku z tym jest szczepem dzikim w odniesieniu do glikozylowania, ale pod innymi względami wykazuje identyczny genotyp jak szczep CF52). Transformowane izolaty klonalne zestalono w postaci zamrożonych bylionów w 17% glicerynie przed dokonaniem oceny i późniejszych doświadczeń.

Wykonano posiew klonów transformowanych drożdży zawierających plazmidy ekspresji na leu -selektywnych płytkach agarowych (zawierających 1M sorbit dla transformąntów mnn9-) i prowadzono inkubację w 30°C przez 2-3 dni. Drożdżami tymi zaszczepiono 5-7 ml hodowle

171 485 złożonej pożywki YEHD (Carty i inni, supra) (zawierającej 0,1-1M sorbit) z 2% galaktozą dla plazmidów opartych na gAl10, po czym hodowle inkubowano w 30°C z napowietrzaniem przez 12-18 godzin. Kolby zawierające 50 ml złożonej pożywki EHD z 1M sorbitem (poniżej określanej jako YEHDS) zaszczepiono powyższymi hodowlami (do wyjściowego A600 = 0,1) i inkubowano w 30°C z wytrząsaniem (350 obrotów/minutę) przez 48-72 godziny, do uzyskania ostatecznego Aóoo =10-16. Próbki o 10 jednostkach A_f,o() wprowadzono do probówek i komórki drożdży zbito w pastylki w wyniku wirowanlaprzy 2000 x g przez 10 minut. Próbki analizowano bezpośrednio lub przechowywano w stanie zamrożonym w -70°C. Przy wykonywaniu analizy pastylki ponownie zawieszano w 0,4 ml roztworu soli buforowanego fosforanem (PBS) zawierającego 2 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i przenoszono do 1,5 ml probówek Eppendorfa. Komórki drożdży rozbijano 1) dodając 200-300 mg przemytych perełek szklanych (0,45 mm) i wytrząsając całość w homogenizatorze przez 15 minut, 2) dodając TRITON Χ-100 do uzyskania stężenia 0,5%; 3) wytrząsając w homogenizatorze przez 2 minuty oraz 4) prowadząc inkubację w 4°C przez 10 minut. Resztki komórkowe i perełki szklane usunięto, a zawartość białek w supernatantach osadu oceniano metodą Lowry'ego i innych, [J.Biol.Chem., 193, 265 (1951)] oraz metodą RIA specyficzną dla preS2+S [Hansson i inni, Infect. Immunol., 26: 125-130 (1979), Machida i inni, Gastroenterology 86: 910-918 (1984)] lub dla S (AUSRIA®).

Z klonów transformowanych drożdży mnn9- zawierających plazmidy ekspresji wykonano posiew klonów na (leu')-selektywnych płytkach agarowych zawierających 1M sorbit i prowadzono inkubację w 30°C przez 2-3 dni. Drożdżami tymi zaszczepiono 5-7 ml hodowle złożonej pożywki YEHDS (zawierającej 2% galaktozy dla plazmidów promotora GALIO), po czym hodowle inkubowano w 30°C (do wyjściowego Aóoo = 0,1) i inkubowano w 30°C z wytrząsaniem (350 obrotów/minutę) przez 48-72 godziny, do uzyskania ostatecznego A600 = 10-16. Po 3 próbki o 10 jednostkach Agoo wprowadzono do probówek i komórek drożdży zbito w pastylki w wyniku wirowania przy 2000 x g przez 10 minut. Próbki analizowano bezpośrednio lub przechowywano w stanie zamrożonym w -70°C.

Analiza metodą immunoblottingu polipeptydu pochodzącego ze wszystkich rekombinantowych klonów opisanych powyżej w komórkach-gospodarzach fenotypu mnn9- wykazała obecność jednego pasma o pozornej wielkości cząsteczki około 24 kD.

W przypadku białek rekombinantowych ilościowe i jakościowe formy glikozylowania stanowią funkcję i są w znacznym stopniu uzależnione od gatunku komórek-gospodarzy, a w obrębie danego gatunku od linii komórkowej. W związku z tym dla specjalistów zrozumiałe jest, że szczep gospodarza można wybrać spośród gatunków i linii innych niż S. cerevisiae, w przypadku których zidentyfikować można mutacje enzymów uczestniczących w glikozylowaniu. Dla specjalistów zrozumiałe jest także, że szczepy gospodarze można wybrać spośród wszystkich szczepów S. cerevisiae, w przypadku których zidentyfikować można mutacje enzymów uczestniczących w glikozylowaniu.

Następnie przeprowadzono selekcję transformowanych klonów pod względem obecności DNA HBsAg i ekspresji p24 HBsAg. Komórki hodowano w pożywce YEHDS (zawierającej również galaktozę dla plazmidów promotora GALIO w celu indukowania ekspresji po wyczerpaniu glikozy). Wykonano lizaty, które rozdzielono metodą elektroforezy z wykorzystaniem dodecylosiarczanu sodowego-żelu poliakrylamidowego (SDS-PAGE) i wykonano metodą western blotting na nitrocelulozie. Okazało się, że produkt p24 jest specyficzny dla białka S, gdyż stwierdzono jego obecność tylko w indukowanych transformantach oraz jego reaktywność z surowicą anty-p24. Jeden z klonów wybrano do dalszej analizy. Analiza radioimmunologiczna wykazała również, ze lizaty transformantów w przeciwieństwie do macierzystego S. cerevisiae są dodatnie względem HbsAg.

Wyjaśnia to przydatność wektora ekspresyjnego, który wykorzystuje promotor GAL10 do kierowania ekspresją HBsAg i pokrewnych białek powierzchniowych w S. cerevisiae. Dla specjalistów zrozumiałe jest, że ulegający regulacji promotor GALIO lub promotory GAL1, GAL2, GAL7 lub MEL1, które działają w nierozróżnialny sposób, umożliwiają zwiększenie skali hodowli rekombinantowego S. cerevisiae do objętości odpowiadającej skali produkcyjnej, przed zainicjowaniem syntezy białka rekombinantowego, dzięki czemu ogranicza się niekorzy171485 stnie oddziaływania na komórki gospodarza. Ponadto dla specjalistów zrozumiałe jest, że do kierowania ekspresją peptydów zawierających S i preS można wykorzystywać wektor ekspresyjny zawierający inny promotor regulatorowy, taki jak przykładowo, ale me wyłącznie ADH2 i czynnik koniugacji a, których indukcję lub derepresję osiąga się innymi środkami. Dla specjalistów jest także zrozumiałe, że promotor konstytutywny słabszy niż GAPDH, taki jak przykładowo, ale nie wyłącznie CYC1, napędza ekspresję polipeptydów zawierających S i preS tak, że uzyskuje się mniejszą zawartość białka komórkowego, dzięki czemu uniknąć można negatywnych efektów fizjologicznych związanych z nadmierną ekspresją. Dla specjalistów zrozumiałe jest również, że odpowiedni układ analityczny taki jak metoda western blotting lub test radioimmunologiczny należy wykorzystać w celu dokonania oceny ekspresji polipeptydów zawierających S i preS w takim układzie, aby zoptymalizować czas zbioru hodowli w celu uzyskania maksymalnej wydajności.

Kolumnę działającą na zasadzie powinowactwa immunologicznego, ze związanymi przeciwciałami kozimi, które rozpoznająHBsAg w postaci cząstek, wykorzystanego do oczyszczania białek S i pokrewnych z S z transformowanego S. cerevisiae. Test radioimmunologiczny względem HBsAg eluowanego produktu dał wynik pozytywny, a mikroskopia elektronowa potwierdziła, ze jest on w postaci cząstek. Taka postać cząstek zawierających zarówno HBsAg jak i antygeny pre-S lubsam HBsAg, jest przydatna jako szczepionka HBV lub jako odczynnik diagnostyczny.

Komórki drożdży transformowane wektorami ekspresyjnymi kodującymi białko powierzchniowe wirusa zapalenia wątroby B hoduje się, po czym przeprowadza się ich zbiór. W razie potrzeby komórki można przechowywać przemywając je roztworem buforowym, np. PBS, przy czym uzyskaną pastę komórek przechowuje się zazwyczaj w stanie zamrożonym w -70°C.

Oczyszczanie HBsAg i pokrewnych białek rozpoczyna się zazwyczaj w sposób następujący. Partię pasty świeżych lub zamrożonych komórek zawiesza się w buforze, korzystnie w TRIS przy wysokim pH w zakresie od około 8,5 do około 11,0, korzystnie około 10,5 (przy czym bufor może również zawierać odpowiednie inhibitory proteazy). Komórki rozbija się następnie, korzystnie na drodze mechanicznej. Stwierdzono, że w większej skali sposób łagodnego rozbijania za pomocą perełek nie jest przydatny. Korzystnie wykorzystuje się rozbijanie za pomocą wysokociśnieniowego homogenizatora (około 69 - 140 MPa, homogenizator Gaulin lub Stanstein), z uwagi na jego szybkie i wydajne działanie.

W wyniku rozbicia komórek drożdży uzyskuje się surowy ekstrakt, którego pH doprowadza się do wartości od 8,0 do 11,0 a korzystnie 10,5.

W tym momencie pożądane może okazać się dodanie detergentu do surowego ekstraktu. Dodatek detergentu ułatwia oddzielenie błon komórek drożdży od niepożądanych resztek komórkowych. Stwierdzono, że może nastąpić asocjacja białka preS2+S oraz innych form białek powierzchniowych z błonami komórkowymi drożdży. Stosować można różne obojętne lub niejonowe detergenty, takie jak przykładowo, ale nie wyłącznie, detergenty z serii TRITON-N, z serii TRITON-X, z serii BRIJ, z serii TWEEN lub z serii EMASOL, dezoksycholan, oktylogłikopiranozyd lub NONIDET-Np-40. Do przydatnych i odpowiednich detergentów należą również środki obojnacze takie jak CHAPS lub CHAPSO.

Jeśli detergent ma być stosowany, to korzystnie wykorzystuje się detergent TRITON Χ-100 w stężeniu około 0,5%. Należy wyraźnie podkreślić, że sposób według niniejszego wynalazku nie wymaga stosowania detergentu w tym etapie oraz że takie zastosowanie detergentu jest ewentualne.

Jeśli w czasie prowadzenia lizy nie zastosowano inhibitorów proteazy, to ekstrakt można następnie poddać obróbce cieplnej. Skuteczną obróbkę cieplną przeprowadza się w określonym zakresie temperatur i w określonym przedziale czasowym. Zazwyczaj obróbkę przeprowadza się w temperaturze od 45 do 60°C, a korzystnie w temperaturze 50°C. Czas trwania obróbki wynosi zazwyczaj od 20 do 40 minut, a korzystnie 30 minut. Ekstrakt poddaje się obróbce cieplnej w odpowiednim naczyniu, przy czym naczynie to zanurza się w ogrzewanej kąpieli albo stosuje się wymiennik ciepła. Materiał chłodzi się następnie do około 10°C, korzystnie umieszczając naczynie w kąpieli z wody z lodem lub stosując wymiennik ciepła. Dla specjalistów zrozumiałe jest, że zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku kolejność etapów obróbki cieplnej i usuwania resztek komórkowych można odwrócić bez żadnego wpływu na wyniktych operacji. Można także ogrzewać całe komórki drożdży w buforze o obojętnym pH, a następnie rozbijać je i dodać detergent’ w sposób opisany powyżej.

Usuwanie resztek komórkowych z surowego ekstraktu po obróbce cieplnej jest niezbędne, aby zapobiec fizycznej okluzji w następujących potem etapach oczyszczania. Resztki komórkowe usunąć można na drodze wirowania, mikrofiltracji lub filtracji uzyskując wyklarowany ekstrakt Do najkorzystniejszych sposobów należy wirowania i mikrofiltracja. Parametry wirowania, czas i wielkość siły odśrodkowej, mogą zmieniać się w pewnych zakresach. Stwierdzono, ze odpowiednie jest wirowanie przy około 3 000 x g w ciągu 15 minut w 4°C. Korzystne może okazać się rozcieńczanie ekstraktu przed wirowaniem, tak aby zmniejszyć lepkość surowego ekstraktu komórek drożdży, która jest zazwyczaj z natury wysoka. Rozcieńczanie nie wpływa na kolejne etapy obróbki.

Zaletą mikrofiltracji jest to, że filtrację i dializę można przeprowadzić równocześnie. W etapie tym wykorzystać można kilka typów zestawów do mikrofiltracji, np. zestaw KROSFLO z Microgon Inc., albo dowolny z wkładów z pustymi włóknami produkowanych przez Amicon lub A/G Technology. Korzystny sposób mikrofiltracji obejmuje przepuszczenie ekstraktu przez zestaw do mikrofiltracji zawierający membranę Prostak Durapore (Millipore), płytę i ramę, o wielkości porów od 0,1 do 0,2 μ, przy ciśnieniu na wlocie od około 13,8 do 48,3 kPa, stosując bufor zawierający około 0,1 M tRiS o pH około 10,4 oraz około 0,1% TRITON Χ-100.

Supernatant po wirowaniu lub przesącz z mikrofiltracji można zatężyć przed następnym etapem. Zatężanie przeprowadzić można różnymi sposobami takimi jak przykładowo, ale nie wyłącznie, dializa, filtracja, liofilizacja, ultrafilitracja i diafiltracja. Korzystny sposób zatężania według niniejszego wynalazku obejmuje przepuszczanie wyklarowanego ekstraktu przez układ ultrafiltracji z pustymi włóknami odcinający składniki o ciężarze cząsteczkowym 10⁵. Objętość wyklarowanego ekstraktu zmniejsza się zazwyczaj około 6,5 razy w przypadku produktu mikrofiltracji oraz około 2 razy w przypadku produktu rozcieńczonego i odwirowanego; uzyskuje’ się w ten sposób zatężony retentat. Po zatężeniu retentat poddaje się diafiltracji w celu usunięcia zanieczyszczeń o mniejszym ciężarze cząsteczkowym. Diafiltrację przeprowadza się stosując układ pustych włókien odcinający ciężar cząsteczkowy 10⁵.

W przypadku, gdy dodano TRITON Χ-100, można go usunąć różnymi znanymi sposobami, do których przykładowo, ale nie wyłącznie należy dializa, dodawanie pewnych rozpuszczalników organicznych, wymrażanie, rozdzielanie chromatograficzne oraz kontaktowanie z żelem lub żywicą, które specyficznie wiążą detergenty, takimi jak Extractogel (Pierce) lub żywica XAD (Romicon). Korzystny sposób usuwania detergentu TRITON Χ-100 według niniejszego wynalazku obejmuje cyrkulowanic poddanego obróbce cieplnej ekstraktu zawierającego TRITON Χ-100 przez wkład z żywicy XAD-2 lub XAD-4 (polistyren usieciowany diwinylobenzenem). Poddany obróbce cieplnej ekstrakt cyrkuluje się przez wkład XAD przez około 10 godzin w 4°C, po czym zbiera się go w odpowiednim naczyniu, np. w zamykanej butelce szklanej.

Jeśli komórki rozbijane były w buforze o wysokim pH, to pH ekstraktu poddanego obróbce cieplnej lub ekstraktu zawierającego inhibitory proteazy doprowadza się do wartości od około 7,0 do około 7,9, korzystnie około 7,7. Nastawianie pH po obróbce cieplnej prowadzonej przy wysokim pH zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku znacznie ułatwia adsorpcję białek otoczki na krzemionce o szerokich porach stosowanej w następnym etapie. Nastawianie pH ekstraktu poddanego obróbce cieplnej przeprowadzić można przed etapem usuwania detergentu Triton X-100, przy czym nie wpływa to na wynik procedury. Z tego względu dla specjalistów zrozumiałe jest, że zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku kolejność etapów nastawiania pH i usuwania detergentu Triton X-100 można odwrócić bez znacznego wpływu na wynik tych operacji.

Następnie HBsAg łatwo oddziela się od zanieczyszczeń uzyskując zasadniczo oczyszczony HBsAg. Korzystny sposób usuwania zanieczyszczeń obejmuje adsorpcję HBsAg na krzemionce o szerokich porach. Najkorzystniejszy sposób według niniejszego wynalazku obejmuje adsorpcję HBsAg na krzemionce zawierającej pory o wielkości w zakresie około 1000-1500 A

171 485 oraz o wielkości cząstek w zakresie 30-130 μ (Amicon). Białko powierzchniowe łatwo wchodzi w pory krzemionki i zatrzymuje się w nich. W ten sposób łatwo można odmyć białkowe zanieczyszczenia z komórek drożdży.

Adsorpcję białka powierzchniowego na krzemionce o szerokich porach można przeprowadzić chromatograficznie lub niechromatograficznie, w sposób periodyczny. Adsorpcję chromatograficzną przeprowadza się przepuszcając ekstrakt o nastawionym pH przez złoże krzemionki o szerokich porach w aparacie do chromatografii kolumnowej. Zazwyczaj około 1 litr ekstraktu poddanego obróbce cieplnej wprowadza się do kolumny wyposażonej w płaszcz i zawierającej około 300 ml (około 100 g suchej wagi) perełek krzemionki o dużych porach, przy szybkości przepływu około 200 ml/godzinę.

Adsorpcję mechromatograficzną na krzemionce o dużych porach przeprowadza się zazwyczaj przez wymieszanie ekstraktu poddanego obróbce cieplnej z krzemionką w odpowiednim naczyniu, np. w zamykanej butelce szklanej. Korzystny sposób obejmuje dodanie 300 ml krzemionki o dużych porach do około 1 litra ekstraktu poddanego obróbce cieplnej w butelce szklanej i prowadzenie inkubacji przy stałym mieszaniu. Adsorpcja korzystnie trwa okołol,5 godziny w temperaturze od około 4-8°C, choć odpowiednie czasy i temperatury adsorpcji mogą być również inne.

Obmywanie krzemionki z zaadsorbowanym białkiem powierzchniowym od niezaadsorbowanego materiału przeprowadzić można niechromatograficznie, albo też krzemionkę wprowadzić można do opisanego powyżej aparatu kolumnowego do adsorpcji chromatograficznej. Przemywanie periodyczne przeprowadzić można odciągając ekstrakt poddany obróbce cieplnej z krzemionki o dużych porach i dodając kilka objętości buforu nie powodującego uwolnienia HBsAg zaadsorbowanego na krzemionce. Korzystnym buforem jest PBS. Z krzemionki odprowadza się ciecz, a etap przemywania powtarza się 3-5 razy.

Chromatograficzne przemywanie krzemionki z zaadsorbowanym białkiem powierzchniowym przeprowadza się przepuszczając PBS przez krzemionkę z szybkością około 200 ml/godzinę aż do osiągnięcia stałej ekstynkcji przy 280 nm.

HBsAg eluuje się z przemytej krzemionki o szerokich porach za pomocą roztworu buforowego o pH około 8,5-9,0. Białka powierzchniowe korzystnie desorbuje się stosując roztwór buforowy zawierający około 0.05 M boran przy pH około 8,7. Desorpcję HBsAg można ułatwić prowadząc ją w szerokim zakresie podwyższonych temperatur. Korzystna jest desorpcja w około 55°C.

Desorpcję niechromatograficzną można przeprowadzić w wyniku zmieszania 1200 ml 0,05 M buforu boranowego o pH 8,7 z około 700 ml przemytej krzemionki o szerokich porach z zaadsorbowanym HBsAg. Desorpcję prowadzi się przez około 25 minut. Eluat zbiera się, z tym że etapy desorpcji powtarza się dwukrotnie, po czym eluat chłodzi się.

Desorpcję chromatograficzną przeprowadza się ogrzewając wyposażoną w płaszcz kolumnę z przemytą krzemionką do około 55°C. 0,05 M bufor boranowy o pH 8,7 ogrzewa się do 55°C i przepuszcza się przez kolumnę z szybkością 500 ml/godzinę. Eluat zbiera się i chłodzi. Objętość eluatu jest zazwyczaj w przybliżeniu równa objętości poddanego obróbce cieplnej ekstraktu, który przepuszczono przez krzemionkę o szerokich porach.

Zazwyczaj konieczne jest zatężenie eluowanego HBsAg. Korzystny sposób zatężania obejmuje przepuszczanie eluatu przez układ diafiltracji z pustymi włóknami odcinającymi ciężar cząsteczkowy 10⁵, przy wykorzystaniu 0,05 M buforu boranowego o pH 8,7. Stosując taki układ objętość eluatu białka powierzchniowego można zmniejszyć nawet 16-krotnie. W razie potrzeby retentat z diafiltracji można sterylizować na drodze mikrofiltracji.

Zawartość węglowodanu w HBsAg oznacza się metodą M.Dubois i innych, Anal.Chem., 28, 350 (1956). Ogólna zasada tej metody polega na tym, że proste cukry, oligosacharydy, polisacharydy i ich pochodne, w tym również etery metylowe z wolnymi lub potencjalnie wolnymi grupami redukującymi, dają pomarańczowo-żółte zabarwienie, jeśli działa się na nie fenolem i stężonym kwasem siarkowym. Intensywność zabarwienia uzyskanego przy stałym stężeniu fenolu jest proporcjonalna do zawartości cukru.

171 485

W celu oznaczenia zawartości węglowodanu w próbce białek powierzchniowych HBV 1 ml roztworu zawierającego 1-70 pg białka umieszcza się w probówce. Przygotowuje się serię wzorców węglowodanowych i ślepych próbek. Do każdej probówki dodaje się 1 ml 5% roztworu fenolu, zawartość probówek miesza się, dodaje 5 mi 96% roztworu kwasu siatkowego i zawartość probówek ponownie miesza się. Probówki przetrzymuje się w temperaturze pokojowej przez 10 minut, miesza się ich zawartość i przetrzymuje się w 25-30°C przez 20 minut. Pomiary próbek wykonuje się w spektrofotometrze (A.wo w przypadku heksoz i metylowanych heksoz oraz A480 w przypadku pentoz, kwasu uronowego i ich pochodnych metylowanych), po czym zawartość węglowodanu w próbkach HBsAg oznacza się przez porównanie z wzorcami węglowodanowymi.

Opisaną wyżej metodę zastosowano do oznaczania zawartości węglowodanu w HBsAg wytworzonym w dzikich rekombinantowych komórkach drożdży (CF54) oraz w HBsAg wytworzonym w rekombinantowych komórkach drożdży CF52. Na podstawie tych wyników wyliczono stosunek ilości węglowodanu do białka w każdej próbce dzieląc mikrogramy węglowodanu przez mikrogramy białka w próbce. Ten wyliczony stosunek wykazuje, że HBsAg wytworzony w rekombinantowych komórkach drożdży mnn9‘ zawiera zasadniczo 1/10 węglowodanu w porównaniu z HBsAg wytworzonym w rekombinantowych dzikich komórkach drożdży. Wyniki te wskazują, że HBsAg wytworzony w komórkach drożdży mutanta mnn9‘ zawiera również znacznie zmniejszone ilości węglowodanu w porównaniu z HBsAg wytworzonym w komórkach drożdży typu dzikiego.

Poniższe przykłady ilustrują niniejszy wynalazek nie ograniczając jednak jego istoty. Każdą z pozycji literaturowych wspomnianą w przykładach wprowadza się tu jako źródło literaturowe.

Przykład 1. Klonowanie DNA HBV w pBR322

Cząsteczki HBV Dane'a (serotyp adw) wyizolowano i oczyszczono z ludzkiej plazmy (nośnika) i zsyntetyzowano dwuniciowy DNA za pomocą endogennej polimerazy w cząsteczkach Dane'a zgodnie z metodami Landersa i wsp., [J.Virology, 23, 368-376, (1977)] i Hruska i wsp. [J. Virology, 21, (1977)]. DNA wyizolowano po trawieniu proteinaząK w SDS i następnie przez ekstrakcję mieszaniną fenol/chloroform i wytrącenie etanolem. Genomowy DNA z HBV trawiono EcoRI i otrzymano pojedynczy fragment o długości 3,2 kz, który klonowano w miejsce przecięcia pBR322 za pomocą EcoRI i otrzymano pHBV/ADW-1. Obecność DNA HBV potwierdzono przez trawienie EcoRI, przeniesienie biotu Southerna na nitrocelulozę i hybrydyzację ze specyficzną sondą oligonukleotydową znakowaną [³²P].

Przykład 2. Klonowanie genu preS2+S w wektorze ekspresyjnym pGAP-tADH-2

Plazmid pHBV/ADW-l (opisany w Przykładzie 1) trawiono za pomocą EcoRI i AccI i oczyszczono fragment 0,8 kz metodą preparatywnej elektroforezy na żelu agarozowym. Plazmid pUC także trawiono za pomocą EcoRI i BamHI 1 wektor liniowy oczyszczono metodą preparatywnej elektroforezy na żelu agarozowym.

W celu zrekonstruowania części 5' preS2+S ORF zsyntetyzowano parę oligonukleotydów, które odtwarzały ORF od miejsca przecięcia za pomocą EcoRI w górę do aTg przez sekwencję NTL o 10 pz przez miejsce dla HindIII do końca EcoRI.

Sekwencje tych nukleotydów są następujące:

AATTCAAGCT TACAAAACAA AATGCAGTGG (Identyf. Sekwencji nr: 4)

10 20 30

GTTCGAATGT TTTGTTTTAC GTCACCTTAA (Identyf; Sekwencji nr: 3)

10 20 30

W celu zrekonstruowania części 3' preS2+S ORF zsyntetyzowano drugą parę oligonukleotydów, która odtwarzała ORF od miejsca przecięcia za pomocą AccI przez terminator translacji i miejsce HindIII do końca BamHI. Sekwencje tych nukleotydów są następujące:

ATACATTTA AGCTTG (Identyf. Sekwencji nr: 4)

10 15

TGTAAATTTC GAACCTAG (Identyf. Sekwencji nr: 5)

10 18

171 485

Pary tych oligonukleotydów połączono, po czym zligowano z wektorem pUC trawionym EcoRI-BamHI. Uzyskany wektor (2,8 kz) oczyszczono metodą preparatywnej elektroforezy na żelu agarozowym. Z wektorem tym zligowano fragment uzyskany z powyższego przez przecięcie EcoRI-AccI o długości 0,8 kz. Obecność i orientację preS2+S ORF potwierdzono metodą analizy z użyciem endonukleazy restrykcyjnej i biotu Southerna. Analiza sekwencji DNA [Sanger i wsp., 1977) ujawniła substancję dwóch zasad, co dało w rezultacie różnice w aminokwasach w stosunku do sekwencji kodowanych przez DNA plazmidu HBpreSGAP347/19T. W celu oceny identyczności polipeptydów kodowanych przez obie konstrukcje, te substytucje, w których T występuje zamiast C w pozycji 64 (kodując Phe a nie Leu) i C zamiast A w pozycji 352 (kodując His a nie Gln), zmieniono przez mutagenezę ukierunkowaną [Zoller i Smith 1982, Nucleic Acid Research. 10, str. 6487-6500],

Plazmid zawierający region kodujący HBsAg bez regionu kodującego preS2 skonstruowano następującym sposobem: Plazmid pUCHBpreS2+S (opisany powyżej) trawiono endonukleazami restrykcyjnymi EcoRI i Styl. Od fragmentu DNA kodującego preS2 oddzielono duży fragment DNA (3,3 kpz), który zawiera pUC i region kodujący HBsAg i oczyszczono metodą preparatywnej elektroforezy na żelu agarozowym.

Następnie parę syntetycznych nukleotydów:

AATTCAAGCT TACAAAACAA AATGGAGAAC ATCACATCAG

10 20 30 40

GATTC (Identyl. Sekwencji nr: 6)

GTTCGAATGT TTTGTTTTAC CTCTTGTAGT GTAGTCCTAA

10 20 30 40

GGATC (Identyf. Sekwencji nr: 7) zligowano z fragmentem pUCHBsAg. Ta para syntetycznych oligonukleotydów zawiera lepkie końce: 5' uzyskany przez przecięcie EcoRI i 3' przez przecięcie Styl, jak również miejsce rozpoznawane przez HindIII bezpośrednio po 5' miejscu rozpoznawanym przez EcoRI. Ponadto, para syntetycznych oligonukleotydów zawiera kodon ATG dla HBsAg, przed nim (upstream) sekwencję lidera nie ulegającą translacji o długości 10pz i zanim (downstream) 21 nukleotydów zawierających miejsce rozpoznawane przez Styl.

Ta para nukleotydów odbudowuje kompletny region kodujący HBsAg, który następnie można usunąć w stanie nieuszkodzonym z wektora opartego na pUC przez trawienie HindIII.

Wektora DNA pUC-HBsAg ze zligowaną parą oligonukleotydów opisaną powyżej użyto do transformowania E.coli. Wybrano zrekombinowane plazmidy, które posiadały kompletny zrekonstuowany region kodujący HBsAg. Ze zrekombinowanego plazmidu usunięto kompletną otwartą ramkę odczytu HBsAg (ORF) przez trawienie HindIII i następnie wydzielenie i oczyszczenie DNA HBsAg (0.7 kpz) metodą preparatywnej elektroforezy na żelu agarozowym w celu klonowania go do wektora ekspresji.

Przykład 3. Klonowanie HBsAg ORF do 3 różnych wektorów ekspresji·.

Do skonstruowania kasety ekspresji HBsAg użyto trzech różnych wektorów ekspresji. Opisana już [Kniskern i wsp., 1986 Gene 46, str. 135-141] kaseta ekspresji z promotorem GAP 491, składa się z promotora dehydrogenazy 3-fosforanu aldehydu glicerynowego o długości około 1,1 kpz i z drożdżowego terminatora dehydrogenazy alkoholowej 1 (ADH1) o długości około 350 pz pBR 322 backbone” z jedynym miejscem rozpoznawanym przez HindIII pomiędzy promotorem i terminatorem.

HBsAg ORF z Przykładu 2 zligowano w tym jedynym miejscu cięcia przez HindIII i przez analizę za pomocą endonukleazy restrykcyjnej i metodą Southerna potwierdzono jej obecność i orientację.

Alternatywnie, w powyższej konstrukcji promotor GAP o długości 1,1 kpz zastąpiono promotorem GAL10 (0,5 pkz) (Schultz i wsp., 1987, Gene, 54, str. 113-123) i promotorem ADH2 (1,25 kpz) (Kniskern i wsp., 1988, Hepatology, 8, 82-87) (patrz Figura 1).

171 485

W każdym przypadku kasetę ekspresji zawierającą określony promotor, HBsAg ORF i terminator ADH1 klonowano do wektora wahadłowego pC1/1 (Beggs, j.w. Rosenberg i wsp, j.w.) aby utworzyć drożdżowy wektor ekspresji, który następnie został użyty do transformowania S. cerevisiae jak opisano poniżej.

Przykład 4. Konstrukcja szczepu mutanta drożdży S. cerevisiae CF52 (mnn9-).

Szczepy KHY 107 (cir⁺, ade 1⁺, leu 2' i mnn 9‘) drożdży S. ccrevisiac. skonstruowano w następujący sposób:

Szczep CZ5/LB347-1C (mnn 9', SUCZ) α kopulujący skopulowano ze szczepem 21502-3 (leu 2', adel ) przez zmieszanie szczepów na płytce z kompletnym podłożem YEHD. W celu wyselekcjonowania diploidów skojarzone szczepy ponownie umieszczono na płytce na podłożu minimalnym leu' zawierającym 2% sacharozy jako jedynego źródła węgla. Po wyizolowaniu pojedynczych kolonii, diploidy poddano sporulacji i worek nasienny pocięto na części standardowymi metodami. Szczep KHY-107 wyizolowano jako pojedynczy zarodnik i scharakteryzowano następująco: cir+, ade1+, leu2' i mnn9~ (metodą Schiffa, ang. Schiff stain technigue).

KHY107 (cir 0) pochodził od szczepu KHY107 (cir+) jak opisano w publikacji Broach [Methods in Enzymology, 101, część C, str. 307-325, (1983)]. Szczep, w którym rozerwany był gen ura3 poprawiono przez połączenie rozerwanego genu i otrzymano szczep ura3 '. Uzyskany szczep KHY-107ura3A hodowano w bogatym podłożu, aby dopuścić do akumulacji spontanicznych mutacji i wybrano mutanta opornego na kanawaninę. Za pomocą testów komplementacji wykazano, ze zmutowany szczep CF55 (Mata leu2-2, 112 ura3A canl cir°) jest canl'. Kasetę ekspresyjną GAL10pGAL4 zintegrowano z genem HIS3 CF55 (Methods in Enzymology, 1990, 185, str. 297-309)i otrzymano końcowy szczep gospodarza CF52 (Mata leu2 2,112 ura3 can1 his3A::GAL10pGAL4-URA3,cir°).

Przykład 5. Transformacja drożdży i założenie hodowli zaszczepiającej dla HBsAg w mutancie drożdży CF52 mnn9-.

Plazmid pC1/1pGAL10HBsAg-tADH-1 opisany w Przykładzie 3 zastosowano do transformacji S. cerevisiae szczepu CF52. Klony selekcjonowano na podłożu minimalnym (leu-, zawierającym 1M sorbitol), zamrożono jako hodowle wyjściowe (w 17% glicerynie) i oceniano jak opisano poniżej.

Przykład 6. Wzrost i ekspresja genu HBsAg za promotorem GAL10 w drożdżach CF52 (mnn9-)

Klony drożdży zawierające plazmid ekspresyjny opisany w Przykładzie 5 powyżej umieszczono na płytkach selekcyjnych agarowych leu- zawierających 1M sorbitol i inkubowano w 30°C przez 2-3 dni. Drożdże zaszczepiono 5-7 ml kompleksu YEHDS (YEHD + 1M sorbitol) i inkubowano hodowle w 30°C z napowietrzaniem przez 12-18 godzin. Kolby zawierające 50 ml YEHDS + 2% podłoże galaktozowe zaszczepiono powyższą hodowlą (do początkowej wartości A600 = 0,1) i inkubowano w 30°C z wytrząsaniem (350 obr./min) przez 72 godziny do końcowej wartości A600 10-16. Próbki 10 jednostek A600 umieszczono w probówkach i zbierano osad komórek drożdży przy 2 000 x g przez 10 minut. Osad albo odrazu badano albo przechowywano w -70°C do dalszych prób. W czasie prób osad zawieszono w 0,4 ml solanki buforowanej fosforanem, zawierającej 2 mM PMSF. Komórki drożdży rozerwano przez: 1)dodanie 200-300 mg przemytych szklanych kuleczek (0,45 mm), 2)mieszanie mieszadłem wirowym przez 15 minut, 3)dodanie TritonuX-100 so stężenia 0,5% (obj./obj.), 4) mieszanie mieszadłem wirowym przez 2 min. 15) inkubację w 4°C przez 10-15 min. Komórkowe debris i szklane kuleczki usunięto przez odwirowanie przy 13 000 x g przez 10 minut. Usunięto klarowny supernatant i analizowano go na białko [metodą Lowry'ego i wsp., J.Biol.Chem., 193, 265 (1951)] i naHBsAg za pomocą próby (AUSRIA ) (Abbott). Typowe wyniki próby są przedstawione w tabeli 1.

171 485

Tabela 1

Opis próbki kolby z wytrząsaniem	AUSRIA	Białko gg/mg	Rozrywanie
mutant mnn9	(0.55,0.61,0 53)	Szklane kulki	+++
typ dziki (MNN9+)	(1 8)	Szklane kulki	+

Przykład 7. Hodowla w fermentorach w wielkiej skali S. cerevisiae (mn9‘ wytwarzających HBsAg).

Zamrożoną zrekombinowaną hodowlę drożdży zaszczepiono na płytkach leu-zawierających 1M sorbitol. Inkubowano odwrócone płytki w 28°C przez 2-3 dni. Hodowlę na płytkach zawieszono w YEHDS i w takim stanie przeniesiono do 21 kolby Erlenmeyera zawierającej 500 ml YEHDS i 2% galaktozy. Kolbę inkubowano w 28°C i przy 350 obr./min. w wytrząsarce inkubatorze w kontrolowanym środowisku przez 18-22 godziny. Te zaszczepiające hodowle zostały następnie wykorzystane do zaszczepienia zbiorników w stadium produkcyjnym.

Inokulum (1-5% obj./obj/) z jednej lub więcej kolb przeniesiono do 16 l lub 250 l fermentorów zawierających 10 l lub 200 l YEHDS, odpowiednio. 16 l fermentory pracowały przy 500 obr./min, przy przypływie powietrza 51/min i w 28°C. 25(01 fermentory pracowały przy 160 obr./min, przy przepływie powietrza 60 l/min. i w 28°C. Zawartość fermentorów zebrano po 40-46 godzinach po inokulacji hodowlą zaszczepiającą. Gęstość optyczna dla jednostek A66o zwykle wynosiła 15,0. Zbieranie zawartości fermentora obejmowało zatężanie komórek przy użyciu urządzenia filtrującego z pustymi włóknami i następnie przemywanie komórek w buforowanych roztworach soli. Zawiesiny komórek badano jak opisano poniżej lub przechowywano w stanie zamrożonym w -70°C do dalszej obróbki i analizy.

Małe próbki (0,6 ml) 20% zawiesin przemytych komórek poddano rozrywaniu przy użyciu szklanych kulek (0,45-0,52 mm) w 1,5 ml probówkach Eppendorfa. Dodano PMSF (6,5 ul 200 mM hodowli wyjściowej) jako inhibitor proteazy. Po rozerwaniu z probówek pobrano próbki i zamrożono w -70°C do analizy typu immunoblot. Do pozostałej próbki w probówkach dodano TRITON Χ-100 do końcowego stężenia 0,5%, próbki krótko mieszano i inkubowano w 4°C przez 20-40 minut. Debris komórkowe usunięto przez odwirowanie i badano klarowny ekstrakt komórkowy na antygen stosując (Ausria) i na białko (Lowry).

Przykład 8. Oczyszczanie białka S w postaci rozdrobnionej za pomocą chromatografu immunopowinowactwa.

Zrekombinowane S. cerevisiae, skonstruowane jak opisano w Przykładzie 5, hodowano w kolbach albo w fermentorach. Komórki drożdżowe zebrano przez mikrofiltrację w aparacie Amicon DC-10, zawieszono w 30 ml buforu A [0.1 M Na2HPO4, pH 7,2, 0,5 M NaCl] i rozerwano w komorze ciśnieniowej Stansteda stosując 7 pasaży przy 75-85 funtach na cal kwadratowy. Zawiesinę rozerwanych komórek (31 g mokrych komórek) rozcieńczono 120 ml buforu A, dodano Triton X- 100 do końcowego stężenia 0,5% (wag./obj.) i wyklarowano zawiesinę przez wirowanie przy 10 000 x g przez 20 minut w 4°C. Klarowną brzeczkę zdekantowano i inkubowano z Sefarozą 4B sprzężoną z przeciwciałami przeciw HBsAg [McAleer i wsp., Nature 307: 178 (1984)] przez 19 godzin w 4°C w celu zaadsorbowania antygenu na żywicy. Po okresie inkubacji zawiesinę ogrzano do temperatury pokojowej dla wszystkich dalszych etapów i odgazowano pod zmniejszonym ciśnieniem przez 15 minut. Odgazowaną zawiesinę przelano do 2,5 x 40 cm kolumny. Gdy kolumnę całkowicie wypełniono, niezwiązane białko odmyto buforem A. Antygen eluowano 3 M KSCN w buforze A. Frakcje zawierające antygen dializowano wobec 0,007 M Na2HPO4, pH 7,2, 0,15 M NaCl w 4°C i połączono tworząc Dializowaną Pulę Powinowactwa zawierającą 1,08 mg białka w 20 ml. 16 ml tej Pulo rozcieńczono do 40 mcg/ml za pomocą 5,6 ml 0,006 M Na2HPO4, pH 7,2, 0,15 M NaCl. Produkt sterylizowano przez przesączenie przez 0,22 u błonę Millex-GV. Identyfikację produktu w Dializowanej Puli Powinowactwa zweryfikowano przez wykrycie HBsAg z użyciem reaktywności Ausria®.

171 485

Tabela 2

Opis próbki Fermentory	Austria, Białko ąg/mg	Rozrywanie
mnn9	11 10 1 1A i γχζ·\ (1.13, 1 .IV, 1 .υυ)	Szklane kulki
mnn9	(3 14 4)	Manton-Gaulin
typ dziki	(3 3)	Manton-Gaulm

Przykład 9. Oczyszczanie zrekombinowanego HBsAg w dużej skali.

Około 250 g zamrożonej pasty komórek (wytwarzających białko S na drodze rekombinacji) zawieszono do stężenia 17% wilgotnej wagi/objętość (około 1500 ml) w roztworze solanki buforowanym fosforanem (PBS). Komórki ogrzano do 45°C przez zanurzenie w kąpieli wodnej. Komórki utrzymywano w 45°C przez 15 minut, po czym oziębiono na lodzie do około 10°C. Następnie komórki rozerwano przeprowadzając je dwukrotnie przez homogenizator Gaulina.

Po homogenizacji dodano 10% Triton Χ-100 do stężenia końcowego 0,3% i mieszano przez około 15 minut. Następnie ekstrakt komórkowy odwirowano przy 3 600 x g przez 20 minut przy 4°C i zebrano supernatant.

Następnie supernatant przeprowadzono przez kolumnę zawierającą około 200 g żywicy XAD-2 w celu usunięcia Tritonu Χ-100. Następnie wyciek przepuszczono bezpośrednio przez kolumnę zawierającą około 150 g krzemionki o wielkości porów około 1 500 A i wielkości cząstek około 50 mikronów. Stosowane kolumny miały średnicę 5 cm (Pharmacia) i pracowały przy szybkości przepływu około 200 ml/godz. Kolumnę krzemionkową przemywano PBS aż wartość A280 wróciła do poziomu podstawowego.

Białko S eluowano z kolumny krzemionkowej stosując najpierw zimny bufor boranowy (50 mM, pH 8,7,4°C) przy szybkości przepływu około 500 ml/godz., aż zaobserwowano wzrost A280- Gdy A280 zaczęło wzrastać, kolumnę ogrzano do 55°C i przez kolumnę przepuszczono bufor boranowy o temperaturze 55°C z prędkością około 500 ml/godz. Eluat zawierający białko S (około 1 1) zebrano na lodzie. Następnie eluat zatężono do około 200 ml przez diafiltrację wobec 50 mM buforu boranowego przy pH 8,7, stosując element diafiltracyjny z pustymi włóknami odcinający ciężar cząsteczkowy 10⁵. Następnie białko S przesączono przez 0,2 mikronowy filtr i przechowywano. Okazało się, że produkt jest trwały i nie zaobserwowano znaczącej degradacji metodą analizy Westerna.

Przykład 10. Próba na zawartość węglowodanów w białkach powierzchni HBV wytworzonych techniką rekombinacji.

Zawartość węglowodanów w białkach powierzchni HBV wytworzonych techniką rekombinacji określono metodą M.Dubois i wsp., Anal. Chem., 28, str. 350. 1956. Ogólna zasada tej procedury jest oparta na tym, ze proste cukry, oligosacharydy i ich pochodne, włącznie z eterami metylowymi z wolnymi lub potencjalnie wolnymi grupami redukującymi, dają pomarańczowo-żółte zabarwienie po potraktowaniu fenolem i stężonym kwasem siarkowym. Intensywność zabarwienia przy stałym stężeniu fenolu jest proporcjonalna do ilości obecnego cukru.

W celu określenia zawartości węglowodanów w HBsAg wytworzonym w dzikim szczepie drożdży i w szczepie mnn9 w probówce umieszczono 1 ml roztworu zawierającego 10-70 pg białka. Przygotowano serię wzorcowych i ślepych próbek węglowodanów zawierających różne ilości węglowodanu. Do każdej probówki dodano 1 ml 5% roztworu fenolu, probówki mieszano, dodano 5 ml 96% roztworu kwasu siarkowego i mieszano. Probówki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut, mieszano 1 inkubowano w 25-30°C przez 20 minut. Próbki badano w spektrofotometrze (A490 dla heksozy i metylowanej heksozy i A.<so dla pentozy, kwasu uranowego i ich metylowanych pochodnych) i przez porównanie z wzorcami węglowodanowymi określono ilość węglowodanu w próbce białka powierzchni HBV.

Na podstawie tych wyników obliczono stosunek ilości węglowodanu do białka obecnego w każdej próbce przez podzielenie mikrogramów węglowodanu przez mikrogramy białka w próbce, co jest przedstawionej poniżej.

171 485

Stosunek węglowodanu do białka w HBsAg

Szczep drożdży	Węglowodan/białko
mnn9	0.05
typ dziki z uwagi na glikozylację (MNN9+)	0.56

Obliczony stosunek wykazał, że HBsAg wytworzony w komórkach drożdży mnn9 uzyskanych metodą rekombinacji zawierał jedną dziesiątą węglowodanu zawartego w HBsAg wytworzonego w komórkach rekombinowanych typu dzikiego. Wyniki te wykazują, że HBsAg wytworzony w zmutowanych komórkach drożdży mnn9‘ zawierał zasadniczo mniejszą ilość węglowodanów w porównaniu z HBsAg wytworzonym w komórkach drożdży typu dzikiego.

ZESTAWIENIE SEKWENCJI (1) OGÓLNA INFORMACJA;

(i) ZGŁASZAJĄCY; P. J. Kniskern, A. Hagopian (ii) TYTUŁ WYNALAZKU; Białka powierzchni wirusa zapalenia wątroby typu B, o zmniejszonej zawartości węglowodanów gospodarza (iii) LICZBA SEKWENCJI; 9 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI;

(A) Adresat: Merck a. Co., Inc.

(B) Ulica: P.O. Box 2000 (C) Miasto: Rahway (D) Stan: New Jersey (E) Kraj: USA (F) Kod: 07065-0900 (v) Postać do odczytania przez komputer:

(A) Rodzaj nośnika: miękki dysk (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release nr 1.0, Wersja nr 1.25 (vi) Bieżące dane zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia: niedostępny (B) Data zgłoszenia: niedostępna (C) Klasyfikacja: niedostępna (viii) Informacja o rzeczniku/pełnomocniku:

(A) Imię i nazwisko: Hesna J. Pfeiffer (B) Numer rejestracji: 22,640 (C) Numer sprawy: 1834650 (ix) Informacja do telekomunikacji:

(A) Telefon: (908) 594-4251 (B) Telefax: (908)594-4720 (2) Informacja dla Identyfikacji Sekwencji nr 1:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 10 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Ópis sekwencji: Identyf. Sekwencji nr 1:

ACAAAACAAA (2) Informacja dla Identyfikacji Sekwencji nr 2:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy

171 485 (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji. Identyf. Sekwencji nr 2:

AATTCAAGCT TACAAAACAA AATGCAGTGG (2) Informacja dla Identyf. Sekwencji nr 3:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyf. Sekwencji nr 3:

GTTCGAATGT TTTGTTTTAC GTCACCTTAA (2) Informacja dla Identyf. Sekwencji nr 4:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 15 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia:liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyf: Sekwencji nr 4:

ATACATTTAA AGCTTG (2) Informacja dla Identyf. Sekwencji nr 5:

(i) Charakterystyka Sekwencji:

(A) Długość: 18 par zasad (B) Typ. kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyf. Sekwencji nr 5:

TGTAAATTTC GAACCTAG (2) Informacja dla Identyf. Sekwencji nr 6:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 45 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyf. Sekwencji nr 6:

AATTCAAGCT TACAAAACAA AATGGAGAAC ATCACATCAG GATTC (2) Informacja dla Identyf. Sekwencji nr 7:

(i) Charaktery styka sekwencji.

(A) Długość: 45 par zasad (B) Typ kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici- pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyf. Sekwencji nr 7:

GTTCGAATGT TTTGTTTTAC CTCTTGTAGT GTAGTCCTAA GGATC (2) Informacja dla Identyf. Sekwencji nr 8:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 29 par zasad

171 485 (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (u) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyf. Sekwencji nr 8 AATTGTCGAC AGCTAGCTGA ATTCCCGGG (2) Informacja dla Identyf. Sekwencji nr 9:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 29 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj mci: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyf. Sekwencji nr 9: AGCTCCCGGG AATTCAGCTA GCTGTCGAC

171 485

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz Cena 4,00 zł

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania cząstek HBsAg o zasadniczo zmniejszonej zawartości uwięzionego węglowodanu, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórek drożdży-gospodarza pozbawionych zdolności glikozylacji, zawierających sekwencję DNA kodującą polipeptyd S wprowadzoną przez transfekcję lub transformację wektorem ekspresyjnym kodującym S-sekwencję polipeptydu ewentualnie wydziela się wytworzone w wyniku ekspresji S-sekwencji żądane cząstki HBsAg.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się komórki drożdży z defektem genetycznym w genie mnn 9.