BG98187A - Нвv повърхностни протеини с редуциран гостоприемников карбохидрат - Google Patents

Abstract

За продуциране на хепатит в вирусни (нвv) повърхностни протеини във формата на частици със съществено редуцирано карбохидратно съдържимо, днк, кодираща нвv повърхностни протеини, се експресира в рекомбинантен дрождев гостоприемник, който е несъвършен в способността си да гликозилира протеини. Тези нвv повърхностни протеини показват антигенни сайтове, генетично кодирани от областта на отворена четяща рамка на нвv вирионната обвивка, и съдържат съществено редуцирано ниво на включения карбохидрат в сравнение с нвsаg частици, продуцирани от "дивиятип" дрождеви клетки. Тези частици са приложими като ваксини както за пасивно, така и за активно третиране или за предотвратяване на заболяване и/илиинфекция, причинена от нвv или други агенти, серологично свързани с нвv.

Description

Хепатит В вируса/HBV/ θ инфекциозен агент, отговорен за различни видове заболявания на черния дроб у човекаАого индивиди, които са инжектирани от HBV, страдат като преминават през остра фаза на заболяването, което е последвано от възстановяване. Обаче, известен процент от инфектираните не успяват да се освободят напълно от инфекцията,порада което се превръщат в хронични носители на тази инФекция. HBV е ендемична за много ^ттасти на света. с широк обхват на случаите на пеоинатаино поенасяне на инфекцията от майки,хронични носителки на инфекцията към новорелените, които често остават хронично инфектирани.Изследвани са над тепета милиона от носителите по света,ката -стотици хиляда от тях умират всяка година поради продължителните заболявания,следствие от хроничния хепатит / цироза и/или хепатонелуларен карцином /.

_ ρ _ ·· · · · ·· ······ ···· ···· ··· ··· · · · · ·· • ···· ·· · · ···· • · ······ η Π ...... “ΐ, ·· ”** вирусът на хепатит ^ΰ делта е агент,които по време на съвместна с HBV инфекция,е отговорен за остър взрив на заболяването с предимно фатален край.Делта вирнеа не кодира /от своя собствен генетичен материал/ протеини, които да служат като обвивка за вириона^нещо повече,вирусът капсулира с повърхностните протеини, кодирани от коинфектирашият HBV /причиняваш инжекция успоредно с делта вируса /,поради което споделящ тесни структурни и имунологич ни взаимовръзки с HBV протеините,които са описани по-долу.^е е известно дали други агенти на инфекцията споделят аналогични взаимовръзки с НВУ.Обаче е ясно,че протеини с широка експанзия на серологична реактивност или повишена имунологична потенциалност могат да бъдат приложими в систем и за диагностика или предотвратяване /или лечение/ на заболявания /или инфекции/ от клас от агенти с доли слаба или частична антигенна кръстосана реактивност с HEV.

НВ вирионът е съставен от две групи структуони ттоотеини, същински протеини и повърхностни ппотеини, В допълнение в качест вото си на голяма повърхност на протеините.повърхностните ттоотеини също са голяма съставна част на Австралийския антиген, или 22нм частици Дези повърхностни протеини са транслационни продукти от дългата отворена четяща рамка на вириона /OPF/ .кодираща най-малко 389 амино киселини /аа/Дази ОДР е разделена на три области.всяка от които започва с ATG кодонрпособен да Функционира като тоанслационен инициаторен сайт ин вивоЛези области се отнасят като pre^l /108 аа/, рге^2 /55 аа/ и ^/226 аа/ в техният съответен 5 -3 ред в гена. 1ака тези области определят три полипептида,отнасящи се като или ΗΒζΑ^ /226 aa/,preS2 + £/?81 аа/ и pre 81 рге$2 + й /389 аа/ .също отнасящи се като р24 /jp27 .рЗО/^рЗЗ/^рЗб и р39/^р 42 съответно /също като големият, среден и го.лям протеини/.

·· · « · ·· ······ ···· · · · · ·· · • ·· · · · · · · • ···· ·· ·· ··· · • · ··· ··· _.-»··· * · ····· ·· ··

Повърхностните протеини на HBV _Са гликопротеини с карбохидратни странични вериги /гликани/,присъединени ^Т7рез tl-гликозидни линкери към дефинирани сайтове, разпознаваеми от пептида /1/Д'аке

HBV полипептидите,продуциранк по време на инфекцията включват видовете р24Лр?7 / полипептид? и неговите гликозилирани производни/ cjp33/cjp36 / pre 62 +-5 по липепти да. гликозилиран в pre S2 областта само и същия полипептид. гликозилиран в така както и pre S? областт та /, и p39/(jp42 / pre S1 +рге$2 + S пептид и неговите производни, гликозилирани в pre S1 об^ласттаЛ

Напоследък чодхо.шглг поллчечи от п^аз^ата ваксини се съставят

от протеини, съдържащи фактически само S областта /включваща р?4 мономер и неговите гликозилирани производни ^р27 /.докато получените от дрожди ваксини,развити успешно към днешна дата,са съставени изключително от полипептида /включващ изключително негликозилирани р24 видове Λ

Частичките с големина 22пм от НВ₅А^ _{f С0} пречистени от плазма! та на постоянните носители. Бидейки частично позитивни в условията ь на тяхната плазма, тези постоянни носители се отнасят като 4¾⁴%

Адо инфектираните индивиди са показали задоволителен изгонен отговор, те могат да отстранят инфекцията и да станат НВ_{5 4}В условията на тяхното формиране на антителата към НВ^ ._тези индивиди са отбелязани като анти Н_В5 ⁺„По този начин, анти НВ^ θ свързан с възстановя ване от заболяване и с имунитет спрямо повторна инфекция с HBV, Поради това, стимулирането или Нормирането на анти НВ₅цр_ез НВ ваксини се очаква да осигури защита против HBV инфекция.

Тази хипотеза е била тестувана експериментално.^свен човека, шимпанзето е един от малкото видове,който е напълно податлив на

HBV инфекцията, което се отразява с количествено определими маркери като НВ -ни повишени нива на чернодробните ензимиДимпанзетате са • · • · • · · ·

ваксинират с три дози от •Й3$^’^т*^титти и*след това се се провокират интревенозно с инфекциозен HBV, Докато раздразнените с ваксината животни показват белези на остра HBV инФекчия, НВ<А^ -ваксинираните животни са запазени напълно от инфекция, поради това,в тази експериментална система, HBsA^ ^ттаетиките.съставени от р.24 /или р24 и р27/ се достатъчни за индуциране на протективен имунитет«Подтикнати от тези небдадения,няколко производителя са произвели НБ ваксини, съставени от НВ$Ап против.

За да се увеличи снаб,диването с подходящи ваксини,производителите са се обърнали към рекомбинантната ДНК технология.която да посредничи при получаване на повърхностни протеини.Сред микроби алните системи, най-широко използвани са Е,_с01ί и S.cene^iSise с оглед експресия на получените по чекомбинантен път протеини Лого опити за експресия на имунополично активни НВ$Д) частици в Е.соЬ са били неуспешни,Обаче, ^,cere/isi«e. показва изключителна много странност в способността си да експресира имунологично активни частици Д'ези частици /съставени изключително от р?б /.когато

ране на шимпанзетата от провокациите ча живи HBV _от различни серотипове.Нещо повече,получените от дролтди честипи се също имунология но активни и като ефективни при предпазване от заболяване или инфекция при клинични изпитания на хора като получени от плазма /з/. Поради това,полезността на S.cerei/ιί ic<e като гостоприемников вид за насочена синтеза на рекомбинантни твърдо установена.

В допълнение,експресията на терапевтични агенти за хора и ваксини в дрожди може да бъде много полезна за получаненето не продукта, доколкото дрождите са свободни от^ЦЧЖини.непа то гении са за хората могат да бъдат култивирани в индустриален машаб и няма необходимост от многото действия, които съпътстват използването на култивирани клетки от бозайници/много от които са трансформирани с вирус.веро-

ятно туморогенни за • · • · ·· · · · ·· ·

мишки и всички от тях съдържат протоонкогеш £ .cere/хлебните дрожди / са еукариоти,които са епос ни да синтезират гликопротеини.Протеиновата гликозилация в дрождите е била обект на множество обзорни статии напоследък f Зф!.

i#*·

Тази гликозилация или допълването на пликаните да към подходяш ι цептор на аминокиселините /а а/ в полипептидната верига става ка1 то при специфични серинови / Ser/ или треонинови /Т^г/ остатъци /0 -свързани / или при спеиитшч ен аспарагинов / Мп/ остатък / TS свързан /.Специфичността на О-свързания допълнителен елемент πρι Ser или Т&г остатъци не е добре разбрано и е установено емпирично на базата на сравнението.

Сигналната последователност за М_свъгзаната гликозилат.тия

е добре дефинирана като както аминокиселинната последователност Αςπ -X-Tfir , така и като А$п -X-Ser /където X е която и да е амино киселина/. В допълнение към много синтезирани автоложни, нативни, гликозилирани протеини или маннопептипи /. дрожчите съп са способни да гликозилапират хетероложни или чужди протеини.ет пресирани чрез рекомбинентна технология /ако хетероложния протет съ,държа подходящасигнална последователност за гликозилиране аа която и да е -^-свързана или О-свързана гликозилация /.

Пре $2 полипептидите,които са получени по време на природно инфектиране съдържат не повече от ? “същински“ /са. 3 кг. лодалтона /кД/ по размер / BL-свързани гликани, един в област и втори - при Арп при аминокиселинният остатък от pre !?2 областт Сайта на разпознаване в областта не е гликозилиран нито в ^есс в!йах НВ®_ИИЕИг инуо _в рекомбинантните preSs +S синтезирани в дрожди.Сбаче, сайта при амино киселинен остатък 4 от рге^Р облас та се разпознава при и гликозилира от дрожди.

Областта pre S1 съдържа

Ь^е^ързан^рл^козилепнонен сайт πρι

аминокиселинен остатък 4 от рге^.1 областта и потенциален сайт при аа остатък 26' за серотип adv/. Я_Сно е за специалиста от областта, че доводите, изложени по-рано за pre £2 глико зила пия също ще следват различни последователности в preS2 областта,както и за онези в pre 91 и? областите.

Дрождите, синтезиращи рекочбинантни preS2 + S прибавят същински гликан,който е аналогичен на онзи, лобавян къч природния полипептид по врече на вирусната инжекция.Обаче,ако лрождевата клетка- гостоприечник е див тип /т, е. съдържа пълния ко^1тпле· мент от ензими, необходими за ггоипопната гликозилапия. какъвто е случая за фактически всички широко използвани доождеви щамове Λ значителен брой от тези плика ни са удължени с голям брой от допълнителни манозни остатъци по начин, идентичен на този.използван от дрождите при създаване на тяхните собствени манопротеини.Това тлт4ПТ)П ТТРТ4 допълнение от г лика на, когато това се слугува на генен продукт като pre£2 + S полипептид, се отнася както хипергликозилация,- Очевидно е за специалиста в областта, че аргументите,важащи за дрождите,могат да се приложат и за други гостоприемникови клет ки / напр. инсекти,гъби и др, /.които могат да бъдат обект за разделяне на гликозилационните образци,

Нещо повече,демонстрирано е,че реко^бинентните форми от 22 пм частици на HBV повърхностни протеини, експресирвни в дивия тип дрождеви клетки-госто приемник, поисъецинявет съществени количества от карбохидратите на дрождевите клетки /получавайки най-малко част от структурните маночротеини от дрождевата клетка-гостопоием ник / в рамките на 22пм частичка, Т₀₃и карбохидрат може да предиз вика потенциални проблеми в с'тисъл, че карбохидрата може да причини продуциране на антитела срещу дрождевия карбохидрат в глико• · · · w - зилираните протеини, и ваксинапниЯТ’ й*д/но?6н’съдържаш включеният дрождев карбохи.црвт ще пеагирар с анти-дрождеви антитела.ттрекотавени у ловенето видове бозайници и пооади това потенциално намаляващ ефективността като имуноген и ваксина.

Хиперглико зидащият е и хвашането на пълни манопротеини и манопептиди може да бъде елиминирано или гликозиданията ограничена _в HBV рге^и$ полипептиди и техните кореспондиращи настини, посредством който и да е от следните подходи.

Най-напред, N-свързана хипергликозилация може да бъде предотвратена или ограничена по поеме на растежа на оекомбинантния гостоприеиник в присъствие на екзогенен агент в култиваттионната среда /напр. туникамицинЛВторо, полипептиди с рекомбинантен или природен произход може да 'ъде дегликозилиран както химично / напр с безводна трифлуорметан-сулФонова киселина или безводен Флуоротака и водород~7уижГпо ензимен път. Врето,разпознаваемия сайт за глико зила ция може да бъде променен или делетиран чрез мутагенезис на ниво ДНК, _така ие да бъде предотвратена същинската гликозилация и поради това и хипергликозиданията. Nb-ива мо.диФиттиоани pre ξ+3 ОК? , в които разпознаваемите последователности за гликозилация са изменени /насочени хем от подходящи промотори,активни в дрождите/, са трансформирани в дрождеви клетки-гостоприемници.Получените в резултат pre Sполипептиди не са гликозилирани.Четвърто, клетките-гостоприемници могат да бъдат идентифицирани по това пали са носители на критичното ниво ензиг®.необходими за гликозилация, което илюстрира настоящето изобретение без каквото и да е ограничение на товаДакъв един щам дрожди е идентифициран /мпп9мутант /5/ по отсъствие на критичното ниво на ензимите в гликозилационния обмен, необходим за елонгиране /хипергликозилиране / на

,, ·· · ·· ······ ···· · · · ♦ · · · ··· ······ • ···· ·· ·· ··· ·

Ж- свързани гликани? хюптчни изо»<едве*ния^иб«азват,че този wtbht изгражда манопротеини без манозни остатъци, външни за веригата и съдържа само същински кагбохидрат /б ,7/. ORP за или pre^ + S полипептида /транскрибция,н8сочена от подходящи ттоомотори.активни в дрождите / е използван за транспониране на такива маттп2. мутантни ,дрожди. Слученият в резултат pre £+5полипептид съдържа само същинска глико^илашия и не съдържа хипергликозилати.

b'igKap полипептидите да ^ке са нито гликозилирани,нито хипергликозилирани,когато се експресират в дрождите,съставените от тях частички съдържат значително ниво от хванатия карбохидрат, получен от дрождев манопептидЛЬради това ексчгесията на полипеп тидите както pre съдържащи полипептиди в црождеви клетки.които не могат да се хипергликозилират, резултират в повишено ниво на карбохидрата в едепресираните Р?пм частички,

Srcere/iS'^ показва значителна много странност в своята способност да експресира имунологично активни ^тт _есТипки Дези частички,когато са включени във ваксинална (Форма, доказват способ ност напълно да предпазват шимпанзетата срещу ттповокация с живи НВУ.Лещо повече,получените от дрожди _с& имунологично ефективни в клинични изпитания на хора както полудените от плазма

Его защо, приложимостта на S«cerev>Vo£ като видове гостоприемници занасочена синтеза на ^еком^инантнен твърдо

В различни рекомбинантни микробнални експпесионни системи синтезата на много различни полипептиди е покачено. че е унищожителна за клетката-гостоприемния Като последствие от това.налице е селективно подтискане срещу ексггоесията на такива полипептиди така че само клетки, които акумулират в голям 'т^тяб са онези.коит са преустановили експресията на ^тту?кдия полипептид или експресират толкова малко от яи-дия полипептид.че културата става чеикономич• · чен източник на този полипептид, Е някои случаи унищожителния ей® ефект е толкова силен,че когато експресията се води от строго конститутивен промотор,новотрансфоруганите клетки не могат ца се па размножават и формират колонии върху селективните среди.Тези унищожителни ефекти могат ца бъдат преодоляни с използването на индуктивен промотор за насочване синтезата на такива полипептиди. Много индуктивни гени съществуват в S.cerel/ίЧетири добре охарактеризирани индуктивни генетични системи са галактозоЙЩ* използващите гени ,алкохол дехидрогеназния ⁹ /АДНр/ ген,генът на алфа, кръстосване и

cereviS/oQ притежава 5 гена,които кодират ензими,отговор ни за използване на галактозата като карбоно източник на растеж. GALi ,Q®, QAJg ,QAIp и GALio гените респективно кодират галактокиназа, галактозо пермеаза, големият изозим на фосфоглюкомутаза, а-Д-галактоза-1-фосфат уридилтрансфераза и уоидин дийосФо-галактозо-4-епимераза.Д отсъствие на галактоза е открита много малка степен на експресия на. тези ензими.Ако клетките са расли на глюкоза и след това .мх галактоза се добавя къч културата.тези три ензима се индуцират координирано, от най- малко ¹000-нратно / с изключение на θ·А1б,който се индуиира около 5-кратно / на нивото на РНК транскрибцията, GAEi, GAI?, G-Al5,GAI? и GAP)ο гените са клонирани молекулярно и car съгласувани .-Регулаторните и промоторни последователности при 5 -сайтовете от кодираните респективно области се поставят ст>седно на кодиращите области от ^acZ гена.Тези експерименти са дефинирали онези промотори и регулаторни последователности, които са необходими и достатъчни за галактозната индукция.

cereVi^cit притежава съшо 3 гена,всеки от които кодира един изоензим на алкохол дехидрогеназата I АДН /, Един от тези

- 10 ., ., . .. ·· ···· ···· ·· · » · · · • · · ··· · · · • ···· ·· ·· ··· · • · ··· ··· • ·· ·.··· ·· ·· ензими е отговорен за способността на Ь, cerei/i$ia^p- да използва етанол като карболов източник по booms на окислителния поохтос при растека. Това е езимът ДДЩ. Експресията на АДН2 гена,които кодира АДНП изозим,се подтиска катаболитно от гкоза,така че фактически няма транскрибиия на .АДН 2 гена по воеие на култивирането в присъствие на гликоза в количество 0,1;ό /^/.При изчерпване наглюкозния източник и в присъствие на каобонови източници,които не подтискат развитието на микроорганизма,тоанскрибнията на АДЕ2 гена се инцуцира 100 до 1000 коатно.Този ген е бил молекулярно клониран и съгласуван, като онези псомоторни и регулаторни последователности,които санеобход иг-ти и достатъчни за отстраняване репресията на теанскрибцията.

са завършени.

Факторът на кръстосването атба е полов феромон на . cerel/iVae който е необходим за кръстосване мехцу МАТ и МАТа клетките.Този тридекапептид се експресира като поепроферомон,конто е насочен към ендоплазматичния ретикулум,гликозилиран и протеолитично/образуван/ насочен към неговата финалназряла форма,която сесекретиоа от клиите. Този биохимичен път на обмяната е използван като експресионна стратегия за външни полипептиди. Факторът на алфа кръстосването е клониран молекулярно и неговият промотор с пре-про-лидерна последователност е използвана да експресира и секретира различни полипептиди. Като че pfco-5 ценният промотор е показано че е индуцируеи при ниски концентрации на фосфата и това също има приложимост¹ при физиологично регулирана експресия на чудците протеини в дродеи.

Както това се очаква от тяхното пресичане в ендоплазмаичния ретикулум и апарата на Годели,чудехте протеини могат да претърпят и Фф- и 0-свързани глггкозилаиионни събития.

·· ··· ·

-ромоторът за срактора на

КОНГО са ψΘΗ0ΤΗίΗ4η0 cL.

«··· · · · · · · · ··· ··· ··· • ···· · · · · ··· · ’<ръигоина:-1н«е>Л(Ш е -активен -само в клеягИ*/ шьхЦс са 4 генетични лок^са в ^.сегеиЬ·⁰^ известни като SIP.които синтезпоат протеини,необходими за репресия на на други нормално слаби копия на а и <£ инспормацгхЯ,

Чувствителните на температура / ^9 / увреждания,които пречат на това сьоит^е на репресия,сън^ств^ватв гзнния продукт поне а едно място. В този мутант,развитието при 35° отменя репресията,резултираща в клетки,денотипично a/ct ,в които поомотора на фактора за кръстосване алфа е неактивен, при тешепатура,повишена до 23 С , клетките фенотипично ревертират до ,така че този промотор става активен.Използването на щамове с tsувреждания е демонстрирано s за контролирана експресия на няколко различни чужди пептиди.

Обект на настоящето изобретение е да осигури HBV повърхностен протеини,който формира частипи със съществено редуцирано карбохидратно съдържимо.Друг обект на настоящето изобрететенне е да осигури метод за получаване на деождев гостоприемник,чиито HBV повърхностни протеини формират частички и които съдържа съществено редуцирано карбохидратно съдъркимо.Здин допълни^лен^бект на настоящето изобретение е да осигури ваксина срещу HBV,включваща HBV повърхностни протеинови частици със съществено еедуипрано карбохпдратно съдържимо както за пасивна,така и за активна профилактика или лечение на заболяването и/или инфекции,причинени от HBV или други инфекции,причинени от HBV или други агенти,сепологично свързани /сродни / на НБУ. Друг обект на настоящето изобретение е да обезпечи условия за ж.моон обхват от пекомбинантни гостоприемникови клетки и за пречистване на НБУ повърхностни ппотеини.Тези и други обекти на настоящето изобретение са/шиз биха станали очевщгпи от

ОБЩО ЗА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

HBV. повърхностните протеини се експресирани в рекомбинантен дрождев гостоприемник,който е генетически дефицитен по своята способност да гликозилира протеините,Експресията на HBV повърхностните протеини в дрождевите клетки резултира във формиране на характерни частици«Формирането на тези частици в дрождевите клетки резултира в улавяне ншхихраиа на клетъчните субстанции вътре в частиците, Използвайки див тип црождеви гостоприемници.съществена част от клетъчните карбохицрати могат да бъдат уловени в рамките на НВ\,А^ частиците, С оглед тдикли^ттност на продукцията на HBV ваксина, състояща се от частиц и.съцьржатпи съществени количества карбохидрат, НБУ повърхностните ггоотеиниса по лучени и пречистени от рекомбинанти дрождеви гостоприемници, които са генетично дефи? цитни по отношение на тяхната способност да гликозилират протеини? HBV повърхностните протеини,продуцирани от такъв гостоприемник, формира частици, които съдържат значително по-малко карбохицрати от частиците, продуцирани от дивият тип лреждеви клетки,Тези повърхностни протеини са приложими като ваксини за лечение и/или предотвратяване на HBV свързани инжекции,и като антиген за имунологична .диагностика с редуцирана реактивност с природно срещани анти-дрождеви антитела.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТИТЕ

ФИГУРА 1, показва схематично плазмида p^l/ipGALiоНВ^А^-тАДГ.^ който с©двржа pGALio промотор, водещ транс кри бцията на НВдА^ О^Г ·· ·· • · · · • · · последвано от фАДЖ • ··· · · · · · ··· тер^,тин8тор и ееяе^тивем» маркер’ *

ЙИ.2+

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящето изобретение е насочено към метод за получаване чс

HBV повърхностни протеинови частици,чието съдържание на включените карбохидрати е съществено редуцирано, за използване като ваксиГ ни срещу HBV,

Частици серотип ad ία/ са използвани като източник на HBV нуклеинова киселина за изолиране на вирусни ORP,Очевидно е за специалиста в областта,че това изобретение се разпростира до използване на нуклеинови киселини от HBV щамове или е свързано с други серологични активности, които произтичат от генетичните раз личия.Ендогенната полимеразна реакция се използва за гтоолучиране на ковалентно затворена циклична ,двойно верижна ДНК _от HBV геномг формираща природно съществуващата в НВ вириона.ДНК θ изолирана., разградена до съставките си с ^οοψ и клочирана в ад! сайта , ι У-Ъдбират се, на рВН322,като по този начин продуцирайки pHBV/ АД ^-п^екомбина.нтните плазмиди, съдържащи HBV генома в циклични размествания,Ферш сайта от Pre So бластта.Пълният ОДД¹,кодиращ 55 аминокиселини от пре$2 областта и 226 амино киселини от $ област¹ най-напред се конструира рррез пречистване на 0.8 кило бази Фпагме /кЬр/, получен следвайки разграждане с рНВУ/АДУ7-.ф е EqqRI и А_пп Този фрагмент кодира пре£2 +S подапептида,който не притежава еди ствено иницииращия кодон, амино-крайни 3 ам^ино киселини ,карбон ки-крайни 3 амино кис елини и транслиращият тецминаторен кодон.

Олигонуклеотидите се синтезират и свързват към този Фрагмент, конвертирайки го до Жnd ΠΙ фрагмент, съ,държащ 10 вр пое- 1.4 ·· ·· · ·· ·»···· ···· ···· ·· · ··· · · · · · · нетранслирана 5 Фланкираща последоватеятост/чодттенаг^^Ао^тги и пълната preζ2+£ θΚ? е избрвна така.и е теоминираптият кодон да бъде директно присъединен към природния Hi пс|П1 сайт в AW транскрибтивния терминатор, като по този наиин съзпава пълното природно, получено от дрождите съединяване без каквито и да са допълнителни бази,Очевидно е за специалиста в областта.че за експресия на HBV повърхностни и сродни гпзотеини. може да бъде използван всеки подходящ активен в дрожди трансрибтивен терминатор.който да бъде заместен хякарж® в AW ..

5* фланкиращата последователност за конструиране на АСААААСААА /6ВД±ДМС :1 / е избрана да кореспондира на тази за не-транслирана^ лидерна последователност / HTL / от дрождевия ген ОАР^з /GAP / /8/ и е също решение за GAP генното семейство. Конструирането е проведено по същия начин, така пе ла бъде присъединен AJTL· да-пектно към иницииращия кодон на рге^РЛБ ОЦР без интервенция на която и да е допълнителна база Аради това, очевидно е за специалиста в областта, че за експресия на KBV повърхностни протеини.подбора на МЗТК последователности се простира до други последователности,което става на подходящи експресионни нива.

ДНК секвенционният анализ изявява 2 замествания на базите, което резултира в амино киселинни различия от preS2 +£ после,цователк ностг, кодирана от ДНК на рНВр_Ге GAP347/19T /9/, 3_{ε Д0 С}е установят идентичните полипептиди за двете конструкции,тези нуклеотидни замествания, които са '1 вместо С при база 64 от 846вр ORF _На HBV pre 2+ /кодиращ Р^е вм^есто Феи / и G вместо А их при база 352 /кодиращ Ндс, вместо G-fn / са променени през сайт-насоиена мутагенеза /10/.Кодираните амино киселинни последователности за оптимизи15 -

раната конструкция след това се плове’^ява*,Омевйдно е’за’специалиста в областта,че това изобретение не ограничава обхвата си до тази последователност и се простира до която и да е поелелователност, където ДНК кодира полипептид с HBV- свързана антигенност,

Големият ДНК фрагмент от 3,3 квр, който съдържа pLLCip _и НВ$А^ кодиращата област, се разделят от preS? кодиращият ДНК фрагмент след препаративна агарозна гел електрофореза.Синтетичен ДНК олигонуклеотид след това се лигатира с р-ВТСдд -HBsAg Фрагмента. 1'ози синтетичен ДНК олигонуклеотид съдържа 5’ Дсо^В и 3* $ту1 лепливи краища, така че да обезпечи Hi nd III сайт следваш веднага след 5 сайта. В допълнение, синтетичният ДНК олигонуклеотид съдържа HBsAo ATG-кодон плюс деветте следващи нуклеотида и 91 ггоед9 ’ ходни нуклеотида,включително StvJ сайта.

1ози олигонуклеотид изгражда отново пълният кодираш легион от и позволява неговотопоследващо отстраняване в цялост, от рПС19 базовия вектор чрез разграждане с Hi пНШ.

pllCig - фрагмента с лигатирания синтетичен ДНК олигонуклеотид, описан по-горе,се използва за трансформация на Ε_<Οο(ί.

Подбрани са рекомбинантни плазчилц. които постигат пълната рекон кодираща област. Пълната НВ отворена четяща рамка /ОКР/ _Се отстранява от рекомбинантния плазмид чрез разграждане с Н1д£Ш , последвано от пречистване и изолиране на 0,7 квр ΗΒςΑ^ ДНК чрез препаративна агарозна гел електрофореза за илониеане в САП· 10 промоторен експресионен вектор,

Експресионният блок / pGAIio - ^АДЕИ / води експресията за външни гени, инсертирани в уникалния HindIII сайт надолу от галактозо-индуктивния &АДю промотор, НВ^ О^Р / _с Щп₀Ш край/ описан по-горе, се лигатира в Hindlll сайта на вектора,Тази екс ггоесио нна касета се инсертира между рС1/1 /Ведо5 , по-горе/ и по-горе/ и този вектор се въвежда в щам на y>.cere//>'q£ •· ·· · ·· ······ • · · · ···· · · · ··· ··· ·· · • ···· ·· · · ··· ·

G£52 или СЛз4 и трансформираните ’клонове ’б 0 ’ Под бира Ф’,

Следвайки мутагенезиса фрагментът поливаш както така pre + описани по-горе, се използва за конструиране на експресноне блок, както е описано по-рано / 11/ , който е съставен от а/

1,1 квр от CAP 491 промотор , в/ 10 вр полудена от .дрожди Фланкираща последователност , с/ 1230 вр от вирусната за preSl ⁺ pre ^1+Вили 846 двойки бази от вирусния ОЬ?Р за pre Аз +5 или 681 вр от вирусния за 6, и d/ 0,4 квр от црожцевия ΔΜ1 тео^натор.

WA..·

За конструиране на НВ^ ексттоесионния блок са използвани различни експресионни вектора,GAP блок ,опи-

сан по-рано /11/ е съставен от около 1.¹ квр от гличералцехид-Зфосфат дехидрогеназан/ САРДН / промотор и около 350 вр от дрождевия алкохол дехидрогеназен ι /да / терминнтор в рВР322 като основа, с уникален Н1по|Ш- сайт между пвомотора и терминатора, HBsAq OPP от Пример 2 се лигатира в уникалния Н1поШ· сайт и неговото присъствие и ориентация,^еопределено чрез рестрикпионен ендонуклеазен анализ и Соутерн блот.

Обратно, GM10 пвомотора /12/ се замества за 1,1 квр GAP промотора в горната конструкция, или АДНр /1,?5^вр/ промотора /13 / се замества за GAP промотор /вж, ^г^ра 1 /,

Във всеки случай, експвесионният блок, съдържащ спепиФимни промотор,HBgAj О^Р _и АДН тер^,тинатор. се клонир? в совалковия вектор pGl/1 /В_е^ S по-горе/ М за създаване на двожцев експвесионен вектор, който след това се използва за трансформация на «сеге както е описано по-долу,Тези трансФорманти са установени казо за мразен резерв за оценка и последващо експериментиране.

Парентален щам се получава както следва · щам _{с тип} кръстосване C/5 / -bB347*i^·/ мпп , SLICZ / се смесва с щам 2150-Р-З а-тип /{еи?. , sde{ / ирез с'1_осв8не на щамовете върху пълна среда на </ВД, Зд подбор на диплоиди.смесените ^алтове повторно се посяват

GT52 или ···· ___ __ -и трансформираните клонове се подбират

Следвайки мутагенезиса«Фрагментът кодипаш лакто така pre + описани по-горе, се използва за констоуипане на експресионе: блок, както е описано по-рано / 11./ , който е съставен от а/

1,1 квр от GAP 491 промотор , в/ 10 вр полмттена от .дрожди Фланкираща последователност , с/ 1230 вр от вирусната за рге$1 + pre 11+^или 846 двойки бази от вирусния за pre 12+5 или 681 вр < от вирусния за 6, и 6/ 0,4 квр от цооклевия АДЙ1 тепана тор.

За конструиране на ексггоесионния блок са използвани различни експреснонни вектора. GAP' 491р1?8Ж^$§§еиящ блок дописан по-рано /11/ е съставен от около 1.¹ квр от глипералдехид-3фосфат дехидрогеназен/ ФАРДН / промотор и около 250 вр от дрождевия алкохол дехидрогеназен Р /.АДЕН/ терминнгор в рЗР$22 като основа, с уникален HlndJIP сайт между промотора и терминатора. HBsAo OPP от Пример 2 се лигатира в уникалния ЖпоШ· сайт и неговото присъствие и ориентация,^еопределено чрез рестрикпионен ендонуклеазен

анализ и Соутерн блот.

Обратно, GAL1Q ппомотора /12/ се замества за 1,1 квр ЗАР промотора в горната конструкция, или АДЕЕр /1,?5т(вр/ промотора /'13 /' се замества за GAP промотор /вж, ^г^ра 1 /.

Ььв всеки случай, експпесионният блок, съдържаш спепиФични промотор,HBsAj ОДР и АДН тер^шнатор. се тотонира в совалковия вектор pGl/1 /Bg^c, по-горе/ ±4: за създаване на дпождев ексгтоесионен вектор, който след това се използва за трансформация на .cere както е описано по-долу.Тези трансФорманти са установени казо замразен резерв за оценка и последвало експериментиране_г

Парентален щам СЛЗ? се получава както следва · щам с тип кръстосване С/δ / W347-i^/ мпто. SlICZ / се смесва с щам ^150-Р-З а-тип /fen2 , adei ί чрез смесване на щамовете върху пълна сведа на 3₈ подбор на диплоиди.смесените чамове повтовно се посяват върху 1еи снимачна среда, съ.дьп-аща 2м захароса като единствен карбонов източник,След изолкпаче на едини^ттчи колонии.диплоидите се спорулират и асцитите се оасрясват по стандартни техники. КНУ» 107 щамът се изолира като единствена спора и се характеризира като ade1 , 1еи2~ и мпп9~ / чрез техника, на ^иФт I.

Щамът КНУ107 /с1г-0/ е получен от щам ЬНУют /cir*/ както е описано от

чрез интегриране на разрушения игаЗ ген. Счупеният в резултат щам, КНУ-107игаЗ ,се култивира в богата среда, за да позволи акумулиране на спонтанни мутации и се подбира резистентен на. канавани: мутантЩ^утантният щам , GH55, се доказва, че е сап! с помошта на. комплементационен тест, G-AIiiOpGAId експресиончия блок се интегрира в HI&3 гена от CFB5 Мза получаване на крайния го сто приемнико в щам СБЬз /Мета Геи2-2, 112 игаЗд с?п1 &ls3zs^{: :} СА1,1 ОрСАД-ИРДз.ciг* Тези трансформенти се установяват като запазен резерв за изпитван' и последващи експериментиране,

Рекомбинантните .дрожди от замразените оезерви се култивират в среда на УЕНД / 16/, След култивиране в статтионаона. Фа за,, дрож девите клетки се събират, Приготвят се лизали. се на натриево-додецилсулфат-полиакриламине гел електрофореза / S^S-PAGE / и се въздейства с антитела до HBsA^ _t Намерен е един полипептид с молекулярно тегло около 24 кД в съответствие с предсказаното молекулно тегло на транслац ионния продукт otS ORP, Нещо повече , лизатите на рекомбинантни, но не парентални дрожди, са позитивни за чрез радиоимунни изпитвания / ^и$г!а ' /.Електронно микроскопскс изследване на ч_астИино пречистени дрождеви лизати показва висока плътност на типичните тта_СТици,>8

• ··«· · · · · ··· ♦ • · · · · ··· ···· ·· ··· ·· ·· ··

Полученият от дрождите поомотор ини^тшира транскрипцията, на НВ Aq и свързаните с него гени. ^Ьоади това,очевидно е за специалиста в областта,че всяка активна поомоторна последователност в дрожди / т.е включително от че лимитираните за GAL· I. GAI 10 _? АДН 2, -Н|то 5, и др. / може да *ъце заместена за GAP 491 поомотор. Освен това,очевидно е за специалиста в обтастта.че подходяща систе ма за изпитване, т.е, имуноблшт или ЩА или ензим-сварзана имунопроба/ ЕВА / би била поиложииа с оглед изпитване експресията на НВ Ао и свързаните полипептиди в тази система.така.че виенето за съзряване на културата с оглед получаване ча максимален добив да може да бъде оптимизирано,

Промотора GAP 491 е използван за експресия ча няколко чужди протеина в дрожди, включително HBsA$ / В}фф_ег /,1Я/. На основата на нашите предишни резултати от експресията на HBsAj до около 40^ от разтворимия дрождев протеин /¹¹Лние използвахме този промотор за водене на експресията на HBsAj _и свързаните протеини в подходящи дрождеви гостоприемникови клетки.

Очевидно е за специалиста в областта.че подбора на подходящи щамове дрожди за експресия на HBV повърхностни протеини обхваща широк кръг от тях. Подходящи дрождеви щамове включват.но че се ограничават до онези с генетични и Фенотипични характеристики като протеазни недостатъчности. и променена способност за гликози лация.

С оглед контрол и определяне гликозилашята на пекомбинантните експресирани в дрожди HBV протеини, щамът S.cereVibioe CJV52 /Мата {еи2-2,112 ига.ЗА сап{ fcs3A : ί GALj.OpGALi -ига 3,ctr° / се използва така,както е конструиран по-горе.

_ 1 P _

Експресно нният плаз^лтид pCi / ΐρβλι^Β Ой*. Ле използва за трансформация на /Ертр игаЗД carff Ιιΐ8·8Δ ^: : GALiOpGAH -игаЗ , cJ г /, Ле нсгор⁵ играни те клонове се подбират от минимална среда Леи -/, съдържаш 1.М сорбитол. Т_ези клонирани трансформанти са установени като замразен резерв в глиперол за последваща оценка и по-нататъшни експерименти.

За да се осигури кнотрол на гликозилацията на ,дивия тип, експреснонният плазмид съто бе използван да трансФормира дрождевия щам СП54 ,който бе изолиран по установени техники от щам ЕГ 52,_и който е спонтанен ревертант към МД-БЕръ/ и това е див тип за гликозилация, но иначе е с идентичен генотип с шам θϊ^2 /,

Трансформираните клонални изолати се оставят като замразен резерв в 17% г.лицерол за последваща оценка и по-нататъшно експериментиране .

Клоновете от трансформираните .дрожди.съдъвчащи експоесиончите плазмиди,се посяват в 1еи ” селективна агарна среда /съдържала 1^ сорбитол за мпп9- - трансформанти / и се инкубират на 30°С за 2 дни. Тези дрожди се инокулират в 5-7 мл култура в комплексна 7ЕНД среда /съдържаща 0,1- 1М сорбитол / плюс 2% галактоза за GALio плазмиди и културите се инкубират на 30°С с аевация за 12-18 часа. Колбите, съдържащи 50 мл комплексна «УЕНД среда с 1^ сорбитол /от тук нататък наричана УЕНД$/_{? С}е инокулират от горната култура / до начално Αθθθ =0,1 / и се инкубират на 20°С с разклащане /-850 грм / за 48-72 часа до крайно Α^θθ _От 10-16. Цзобите от 10 к единици се диспергират в туб епруветки и дрождевите клетки се утаяват през центрофугиране при 2 ОООхо за ¹0 минути.Пробите се изпитват както директно, така и след замразяване пои -70⁰^.¾ време на изпитването, утаените клетки се оесуспендират в 0,4 мл от фосфат-буферирана сол / РВ?> / съдържаща 2мМ Фенилметил сулФонил флуорид / PMSF / и се прехвърлят в 1,5 м^ епруветки на ЕпендорФ.

- 20 Дрождевите клетки се чазрушавад^ч^в’ ’ не 900300 мс| промити стъклени топчета /0,45 мм/ и разбъркването им в миксер за 15 чин 2/ добавяне на TRITON Х-Ю0 до 0.5^ ,

3/ разбъркване в миксер за 2 чин и 4/ инкубиране на 4°0 за Ю чин. Клетъчните остатъци и стъклените топчета се отстраняват и супернатантите се изпитват за протеин/по метода на ^Ъури /1^Q/ и RIA . специфична за pre $2+? /20/21 / или £ /ΑΗ^Τ^ΙΑ^ /,

Клоновете от трансформираните дрожди мпттР“ ,съдържащи експресионните плазми,пи, се поставят в селективни агавни пластинки, съ държащи сорбитол и се инкубират на 30°С за 2-2 дни. '1'ези прожди се инонулират в 5-7 мл култури от комплексна УЕВД$ среда /плюс 2^ галактоза за ОА^ 10 промоторен плазмид / и културите се инкубират при 30°С с разклащане /250 грм / за 48-72 гт_{9С9 от} начално = 0,1 до от 10-16. Утроените ппоби от 10 Αθθθ епинипи се прехвърлят в епруветки и дрождевите клетки се утаяват чрез центрофугиране при 2000 xcj за W ”ин. дробите или се изпитват директно или се съхраняват замразени при -70°С,

Имуноблотинчовия анализ на полипептида. получен от всички к у* клонове, описан по-горе, в гостоприемчици с мш9” Генотип,показват ивица с размер на молекулите от около 24 кД.

За рекомбинантните протеини,пробите на гликозилапия за качество и количество са функция от и в огромна зависимост от вида на гостоприемниковата клетка, и в рамките на вида -от клетъчната линия, Ко този начин,очевидно е за специалиста в областта,че подбора на щама гостоприемник се разширява до видовете и клетъчните .пинии различни от 5.cereyi схе , зз които мутациите на ензимите в метаболитния път на гликозилиране може па бъде идентифициран. Очевидно е също за специалиста в областта, ч е подбора, на гостоприемчиковите щамове от A. cerei/is'iQcce разширява до всички щамове, в които

- 21.

• · · · · • · · · · ·· • ·· • ·· • ·· • · · ♦ · • · · · · · • · · • · · · * · · • · · · мутациите на ензимите от метаболитния път ча гликозилиране може да бъдат идентифицирани.

След това трансформираните клонове се скринират за присъствие на HBsA^ ДНК и експресия ча р?4 HB;Aj, Клетките се култивират в YEHflS среда /също съдържаща гала^тоза за GALip поомоторен плазмид за индуц иране експресията.неследвано от глюкозно изчерпване/. Приготвят се лизатите,разтделят се в натриев цодетти сулФат-полиакриламид целулоза.

гел електроФорезис / ^Д$ -FACE / и v/esWn блот до нитроНродуктът р?4 се установява. ^тте е спемФипен за протеин поради присъствието му само в индипипаните трансФорманти и

тяхната реактивност с анти -р⁹4 серум. Бдин от тези клонове се подбира за по-нататъшна анализиране. Нешо повече,.лизатите на транс формантите,но не родителски 5 .cerevis’iae ^са позитивни за чрез радиоимуноизследване.

Това подчертава приложимостта на експпесиончия вектор.който използва CAL· р промотор за насочване ча експресията, ча НВ Aq _и съответните протеини на S. cerev'FiQC. θ*^τθ_Ρ7π_Η0 θ спечиалиста в областта, че регулируеми GALip промотор . или С-А]ц . GAIp . САТщ или MEL1 промотори , които Фунтпт ионират по един нез?бележите лен начин, позволяват растежа на реком^инантните S.ceneiMifle култури ,ца нарастне до та^т’ъв обем на продякмята преди синтезата на рекомбинантия протеин да. бъде инициирана., така че да бъдат сведеш до минимум негативните ефекти от гостоприе^лтиковата клетка «Нещо повече,очевидно е за специалиста в областта.че експресионеч вектор, съ,държащ друг регулаторен промотор, включващ,.но не лимтирац до АДН2 и фактора, не кръстосване елфа.Физиологично интпппгоуем или депресивен sa от други средства .по.же да бъде използван за насочеш експресия на 5' И' prej-съ,държащи пептипу.

·· ·· · ·· ······ • · · · ···· · · · • · · · ♦ · · · · • ···· ·· · · ··· ·

Нещо човече, очевидно е зе спщпиялиста^в^юбластта.че конститутивния промотор по-лесно потенцира от САРДН. включвайки.но без да е ограничен до _СУС1 , води експресия на Си pre-S-съдържащ полипептиди до по-нисък процент от клетъчни протеини»така че негативните физиологични ефекти на суперекспресия се задължителни. Очевидно е за специалист^^ев^п8^^с^§^^иЧ^г^^^|^^П]^^^-'_гг( блот радиоимунопроба, би било подходходяшо да се приложат за изследване експресията наби pre-S - съдържащите полипептиди в тази сис тема, така че времето за събиране на узрялата култура за гглуча ване на максимален добив 'юже па бъде оптимизирано.

Ицуно-аФинитетна колона,свързана с кози антитела.които оазн познават частичната Форма на ΗΒςΑ^, _Се използва за пречистване на %и ^-свързаните протеини . от трансформирани cere РЧ’em . Елуираният продукт е позитивен за НВ^А^ црез радиоимунопроба. и е специална форма, киенихе когато се наблюдава под електронен 'микроскоп, Такава специална Форма, която съдържа както S антигени или

HB$Ag и ргеΗΒςΑ$ самостоятелно, е ефективна като HBV ваксина агент.

и диагностичен

Дрож,девите клетки.транс^опчипани с експресионни вектори, кодиращи хепатит В вирусни повърхностни протеини или техни взри анти, се култивират и се събират спец ^ова.Клетките могат да.

бъдат съхранявани след това по желание чрез промиването ич в бдФерен разтвор, като PBQ, , _и не клетъчна паста.която обикновено се съхранява замразена при -70°0,

Пречистването на HB_SA^ и сродните протеини обикновено започва както следва ‘ Парче от пресна или замразена клетъчна паста се суспендира в буфер,за предпочитане Τψ^,πρπ висока стойност на pH, достигаща между 8,5 и около 11,0, за предпочитане около 10.5 /буферът може също така да съдържа подходящи протеазчи инхибитори^

След това клетките се разрушават за предпочитане с механични средства.В1ето,цът на внимателното разрушаване е установено,ч_е не е подходящ за използване в голям мащаб. Разрушаването в хомогенизатор с високо на .лягане /около W 000 до 00 000 psi ,с помощта на f·' хомогенизатор на Q αυίί η или Mcml-fed/ се предпо^тгита поради ефикасността му.

Разрушаването на дрождевите -плетки води до получаване на суров екстракт,Последния се довежда до подходящо ρΗ,ρΗ се довежда w др 8,0 -11,0, като за предпочитане е W.5, желателно е в тази точка да се добави детергент.което ще улесни разделянето на клетъчните мембрани на дрождите от нежеланите клетъчни разрушения/парченпа/. Показано е.че preS?. + $ протеин, както и други Форми на повърхностни протеини,може да се асоциира с клетъчните дрождеви мембрани. Различни неутрални или нейонни детергенти могат да бъдат използвани,включително, но не ограничено до детергенти от Τ^ΙΤΟΝ-ΓΙ серията, ΊΤΙΤΟΓΊ-.Χ серия,BRICI серия, ТДДОЕЕИ или BEiASOLсериите,дезоксихолет, октилглюкопиранозид или НОШДЕГ -Кр-40. Двойно натоварените в йонно отношение детергенти като С^АРЗ или СНАР$О _СЪщо _се приложими и подходящи агенти.

Ако- се употреби детергент, за предпочитане е А-Ю0 при концентрация от около 0,5%, С_ледва да се подчертае,че методът по настоящето изобретение не изисква детергент на този етап и добавянето му е незадължително.

Екстрактите след това могат да бъдат третирани на горещо.яко по време на лизиса не присъстват протеазни инхибитори Дретирането на горещо е ефективно над температурния обхват и за ' целия интервал на третиране, Обикновено температурния интервал е 4-5 до 60°С, за предпочитане 50°С, Продължителността на горещото третиране обикновено е от 2Q до 40 мин с 30 ”ин предпочитано време. Екстракта се третира, на горещо в подходящи съдове.като съдовете

- 24 ·· ·· · ·· ······ ···· ···· ·· · се потапят в гореша баня или се използладеоплзойяеннц^ртец това материала се охлажда до около 1О°С,за предпочитане през прехвър ляне в ледено студена баня или чеез използване на топлообменник.

Очевидно е за специалиста в областта. ^ττθ съгласно мето па по изо бретението, ре да, по който се провежда температурното третиране и отстраняване на клетъчните остатъци може да бъде разменен без значителен ефект като резултат от тази процедура,Обратно,целите д дрождеви клетки могат да бъдат нагряти в неутрален pH буфер,разрушени и към тях да се добави детергент както е описано по-горе.

Отстраняването на клетъчните останки от горещо третирания cvров екстракт е необходимо за да се предотврати Физическото запушване по време на последващия етап на предаственв,Останките могат да бъдат отстранени чрез центрофугиране.миироФилтрапия ида Филтрационно получаване на пречистен екстракт,Центрофугирането и микроФилтраттият? са. по-предпочитани метода.Центрофугирането може па бъде проведено за различно по продължителност време при различни условия на центрофугиране.Центрофугиране при около 3000 х за минути при 4°С е намерено за подходящо,Важно е също така да се

РРЗ-

реда екстракта преди центрофугирането за редударане на типично вискозната природа на суровия екстракт.Разреждането не изисква каквато и да е последвала процедура, в цялостния процес,

Микрофилтрацията притежава преимущество,което Филтрадаята и диализата могат да предоставят едаювременно,Няколко типа дажроФилтрационни уданида са подходящи за приложение в този етап.като KIOSFK) от Н.сго^оп ^пс. ида дайто и да е вид от плавни Фиброзни пакети на ΑμΪοοπ или А/С· Techno^о^у.Преппо^тп^ттаният метод на микроФилтрация е прокарването на екстракта през /Μΐ^ΐроге /мембрана,да се постави минроФиптрачионната единица с размер на порите около 0,1 микрона до О,п микрона при то^ттка на налагането около 2 до 7 ρ^Ι,ο помощта на буфер. състоят се от около 0, 1Μ ΤίφΕ3, • · · · pH около 10,4 и около 0,1$ ΤΡΙΤΟII.X’-lQJ?/ • · · ·

Супернатантата от центрофугирането или Филтрата от микро филтрацията чоже да бъде концентрирана преда следващата стъпка от цялостната процедура.Концентриоането мо.же да бъде постигнато по няколко метода, включително, но без да се ограничава от, даализ, Филтрация,лиоФилизация, ултраФилтрация и даафилтрация.Предпочита ният метод на концентриране от настоящето изобретение е да се пропусне прочистеният екстракт през 10 мол. тегло Фиброзна ултра.Ф Филтрационна система.Обема на прелистения екстракт е типично ре дуциран около 6,5 кратно за микроФилтрационния продукт и около 2 кратно за разредения,центрофугиран поо.дукт,получавайки концентриран продуктАед концентрирането, продукта се дааФилтрира до по-нататъшно отстраняване на контаминантите с ниско молекулно тегло.Диа филтрацията се провежда с помошта на Фиброзна система с молекулно тегло на Фибрите около 10 ,

Ако е добавен ΤξΙΤΟΜ Х-ЮО,. той М_р“.е да бъде отстранен по няколко обичайни метода,, включително,но без ца се ограничава от диализ,добавяне на същински органични разтворители, хроматограФски отделяне и контакт с гел или квучук,спе^тгиФи^ттно свързващи датарганти като Ехтгахйо^е! /Pierce / и ХАД каучук / ^ом1соп /.Предпочитаният метод по това изобгетение за отстраняване на Τ^ΙΤΟΙΙ Х-ЮО е дахкЕХЦИКЛИЗиря третираният на горешо екстракт, съ,държащ ТЕЦТОДГ Х-ЮО да циркулира през пакет от ХАД-2 или ХАД-4 кау^дак /полистирен давинилбензен /.Третираният на горещо екстракт циркулира, през ад пакета за около 10 ж часа при 4°С и след това се събира в подходящ съд, например,стъклена бутилка,която 'ό-’έ да се запечатва.

Ако клетките са разрушени в буфер с високо ниво на ΤΉ,ρΗ на горещо третираният екстракт . или екстракта съдържащ протеазни инхибитори, след това се довежда до стойност на pH 7,0 -7,9 за

- 26 ··· ··· · · · • ···· ·· ·· ··· · • · · · · ··· ···· ·· ··· ·· ·· · · предпочитане около 7,7 .Довеждайки pH до около 7.7 следващо горещото третиране при високи стойности на pH съгласно метода по изобретението, това удвснява абсорбцияте на повърхностните протеини към широките пори на силиция,използван в следващия етап.Регулирането на pH на третирания на горещо екстракт може да бъде процедено преди етапа на отстраняване на TRITON Х-иоо без да се предизвика страничен нежелан е^ект, ^Ьради това.би било задължително

за специалиста в областта, ч е съгласно метода по изобретението, реда по който е дадено регуписането на 'ΡφίΑοπ Х-100 могат да бъдат разместени

pH и отстраняването не без забележим еФект върху кочтаминантите.получавайки

Предпочитаният метод за елиминиране резултата от процедурата.

След това е лесно да се отстранят съществено пречистени на контаминантите е да се адсорбира върху щироко порест силиций, йай-предпочитан метод от това изобсетение е да се адсорбира НВ^ върху широко порест силиции с сазмер на порите около 100 до 1500 ангстрьома и размер на частичките на силиция от оизло 30 до 130 микрона /Ал1соп/. 'Ьвърхностния поотеин влиза в порите и се за,държа там. Поради това клетъчните кочтаминанти лесно могат да бъдат отмити.

Дцсорбцията на повърхностните поотеини върху широко порест силиций може да бъде проведена хроматограФски и,пи не-хрома то графски, по маниера на еднократното /баtcli / адсообиране и отстраняване на продукта. Хрома тографски, процеса протича чрез прекарване на екстракта с регулирано pH през легло от широко порест силиций в апарат за колонна хроматография.Обикновено, един литър от третирания на горещо екстракт се прилага за 5 см запълнена колона.съдържаща околоЗОО мл /около 100 сухо телло / широко порест силитдтй при скорост на протока около 200 мл/час.

*· · · ο «· ····«· • · · · · · · · ·· · • ··· · · · · · ··· · • · ··· ···

Не хроматографска адсорбиия върху”шир0копорест силиций се осъществява посредством смесване не. третирания на горещо екстракт със силиций в подходящи съдове, като напр.стъклени колби,които могат· да се затварят плътно, Предпочитан начин' е добавянето на 300 мл широкопорест силиций към около един литър третиран на горещо екстракт в стъклената колба и инкубация при непрекъснато бъркане. Адсорбцията завършва около 1,5 чеса при 4 - 8°^.макар че е възмож но да се използват различни температури при различна, ппоцължите.тгнос на иннубиране.

Промиването на абсорбирания с повърхностен протеин силиций от неабсорбирания материал съшо може да стане нехроматограФски, или силиция може да бъде поставен в колона,както е описало по-горе, за хроматографска абсорбция.Цикличното промиване се осъществява ч чрез изсушаване на третирания на горещо екстракт от широкопорестия силиций и добавяне на няколко обема от буфера,което няма да причини освобождаването на адсорбиран върху силиция.Предпочитаният буФер е Изсушаването и прорязването се повтарят тпикратно до петкратно,

Хромато градското прорязване на адсорбиралия повърхностен протеин силиций се провежда чрез прекарване на РП8 през силиция при ниска скорост от около 200 мл/час докато екстинпията при 200 пм е константна величина.

НВ$А^ се елуира от промития широко порест силиций с помощта на буферен разтвор с pH между около 8,5 до 9,0.Повърхностните протеини се десорбират с помощта /за предпочитане / на буферен разтво] състоящ се от около 0,05 И Взрат при pH около 8,7, Дзсорбцията на HB^Ag може да бъде улеснена при повишена температура в широк обхва; Десорбцията при около 55°0 се предпочита.

Не хроматографеката десорбция се провежда чрез смесване на

1200 мл от 0,05 М Бо ратен буфер при pH 8,7 с около 700 мл от про- 94 • · ·· ···· мития широко порест силиций.

• · · · · · върху’ДРйтъ е ’2ДсТ5обир#н*НВ5А^ _t Десорб цията продължава около 25 ^ънути, След това елуата, се събира,ета пите на десорбция се повтарят .двукратно и елуат8 се охлажда.

Хроматографската десорбция се провежда чрез затопляне на заредената колона с промития силиций до около 55°С, 0,05 М Бор_дтен буфер при pH 8,7 се затопля до 55°С и след това се прилага към колоната при скорост на протока от около 500 мл/час. След това елуата се събира и охлажда.Обема на елуата обикновено е грубо ек вивалентен на обема на горещо третирания екстракт,приложен към широкопорестия силиций.

Концентрацията на елуирания θ обикновено желана. Предпочитаният метод на концентриране е да се прекара елуата през диафилтрационна фиброзна система с молекулно тегло на Фибрите 10 с помощта на боратен буфер и при pH 8,7.Обема на елуирания повърхностен протеин може да бъде редуциран до 16 пъти с помощта на тази система.Диайилтрационния остатък може да бъде стерилизиран чрез микрофилтрация,ако това е необходимо.

Карбохидратното съдържимо на HB$Aj е определено по метода на

Диво1£ ,М,. ei, al./22/ Основният принцип на тази ппотте.дура е. че прости захари,алигозахариди, полизахариди и техни произво.дни.включително метилови естери със свободни или потенциално свободни редукционни групи,дават оранжево жълт цвят когато се третират с фенол и концентрирана сярна киселина.Количеството на цветният продукт при константна фенолна къдъжяник концентрация е пропорционално на количеството на присъстващата захар.

За да се определи карбохидратното съдържание на проба от ΗΒΨ повърхностни протеини, 1мл от разтвор,съдържащ между 10 до 70jwj>

протеин се поставя в епруветка за тестуване.Приготвя се серия от

·· ·· · ·· ······ ···· · · · ··· · • ···· · · · · ··· · • · ······ • · · · ·· · · · ···· карбохидратни стандарти и празна проба, Еци_Н мл от 5% фенолен разтвор се добавя към всяка проба,епруветките се разбъркват и се добавят 5 мл 95^ -ен разтвор на сярна киселина с последвало разбъркване. Епруветките се инкубират на стайна температура за 10 мин, разбъркват се и се инкубират на 25 до 30°С за 20 мин.Пробите се поставят на спектрофото^лтетър ί за хексози и метиливани хексози , и Α^θθ за пентози,урониева киселина и нейнитЕ метилирани производни/ и количеството на карбохидрата в НВ$А^ пробите се опре деля чрез сравняване с карбохидратни стандарти.

HBs^ ,продуциран в диявия тип рекомбинентни дрождеви клетки / CF54 / , и HB-SAg ггродуциран в CFfep рекомбинантни дрождеви клетки,се анализират за карбохи кратно съдържимо както е описано по-горе.На базата на тези везултети,съотношението на количеството на карбохидрата спрямо протеина присъстващ във всяка проба,се изчислява чрез делене на микрограмовете от кзвбохидрата на грамовете на протеина в пробите. Това ичислено съотношение показва че HBsA^ получен в гекомбинантиите .дрождеви клетки мшг 9' янно съдържат една десета от карбохидратното съдържимо на НВуА^, получено от векомбинантиите див тип .дрождеви клетки.Тези резултати показват ,че получен в мпп 9 мутантни .дрождеви клетки микропостокарбохидрат,когато се дрождеви клетки.

съ,държа съществено редуцирано количество сравнява с нВс,^ получен от дивия тип

Средните примери илюстрират настоящето изобретение.без обаче да го ограничават ..Намиралите се в прилепите литературни препратки са дадени в приложената справка.

- 30 ПРИМЕР 1

Кдониране__на...HBV ДНК _в_ рВ^.рз

HBV Ддпе частици /сецотип асЬР се изолират и пречистват от човешка плазма /като носител/ и двойно верижна ДНК _Се синтезира в Дапе частич ките от ендогенната полимераза съгласно метода на Дандирс и кол. /23/ и Хруска и кол./34/. ДНК _Се иволира след разграждане с протеиназа Kg Д .последвано от екстракция с Фенол/ хлороформ и етанолна преципитапия. HBV гечо^-гчата ДНК се разгражда С , като в резултат се получава 3,3 квр Фрагмент,който се клонира в Bco-Hl сайт от рВВззЗ за Формиране на pHBV/АДШ -1.Присъствието на HBV ДНК се потвърждава след разграждане с Ec.qPI блот трансфер до нитроцелулоза и хибридизация с /^Р /белязани специфични олигонуклеотидни проби.

ПРИМЕР ?

Кдониране на pre $3+9 гена в р&АР - <£АДН _р експресионен вектор

Плазмидът pHBV /АДМ-4 /описан в Пример 1 / се разгражда с ЕсоЩ и АссД , и фрагмента с размер 0,8 квр се пречиства чрез препаративна агарозна гел електрофореза.Също така. , плазми,дьт рМС се разгражда с и ВамН! и линеарният вектор се пречист ва чрез препаративна агарозна гел електрофореза.

За реконструиране на 5^<т-астта от ргеДЗ. +S θΡΡ. ®8Йк олигонуклеотидит се синтезират спе^тгиално. които възстановяват

9 9 9 9999

9 9 9 9 • · · · · · · • · · · · от jcoRI сайта нагоре към ATG през 10вр КТЪпоследователността през сайта Ηΐπέ III към ^соД! края, олигонуклеотида е следната ^:

Дзследователността на тези

AATTCAAGCT ТАСААААСАА AATGCACTGG /ЗВДЖ) : 4 /

GTTCGAATGT TTTGTTTTAC GTCACCTTAA /ЖДН0 : з /

За. реконструиране на З¹ pre S2+S OFF _? втора част от които реконструират ОДР от /ЬсД сайта през транслапионния тетгтнатор през Hi nd III сайт към ВдмН! края, ^Ьследователността на тези олигонуклеотиди е ^: олигонуклеотида се синтезира, двойка

АТАСАТТТА AGCTTG . / $ВДДН0 : 4 /

10 15

TGTAAATTTC GAACCTAG / £Ш1ДН0 : 5 /

10 18

Олигонуклеотидните двойки се линеалипират,след това се лигатират към рПС ЕсоД! - Вам HI разграден вектор. Полуденият в резултат вектор /2,8 квр / се прелиства с поепаративна агарозна гел електрофореза, фрагментът от 0,8 квр от горните последователности се лигатира с този вектор, Пои_СЪСТвието и ориентацията на Pre$2 + ОДР се потвърждава от рестрикпионЕН ендонуклеазин анализ и So\4^£n блот, ДНК секвенционният анализ / 25 / изявява две замествания на базите, което резултира в амино киселинни различия от последователността, кодирана от ДНК ц_а плазмида HBp_reSSAF347/19T. . З_а изпитване на идентичните полипептиди от двет( конструкции,тези замествания, които са Т вместо 0 при база 64 /кодиращи Pfie вместо 1еи / и С вместо А цр_И база 352 /копират Жб вместо / се променят през сайт-насочена мутагенеза./?бЛ

Плазмид, съдържаш HBsAq кодиращ регион без preS?. кодираща област_?се конструира както следва · Плез^дьт рЦСНВр_Ге5? + Q /описан по-горе/ се разгражда с ЖоЩ и Бту! рестрикционни ендонуклеази,- Големият ДНК фрагмент /3,3 квр / който съдържа ρΓϊΟ и кодираща област се отделя от рге$2 кодиращият ДНК фрагмент и се пречиства чрез препаративна агарозне гел електрофореза.След това синтетичните ДНК олигонуклеотидни двойки ^:

AATTCAAGCT	ТАСААААСАА	AATGGAGAAC	ATCACATCAG
1 10	20	30	40
GATTC /8ВДДМ0 : б	/
45
GTTCGAATGT	TTTGTTTTAG	CTCTTGTAGT	GTAGTCCTAA
1 10	20	30	40

GGATG / $ВДДН0 : 7 / се на лигатират с pLICHBsA^ фрагмент. 'Гази двойка съдържа 5⁷ ГсрЩ и Ж £>ту I синтетична олигонуклеотидлепливи транша. така пе да обезпечи Ж n<jIII сайт непосредствено след

5^/ Гс.рЩ сайта. В нуклеодита надолу,включително и допълнение,синтетичната ДЖ олигонуклеотидна двойка съдържа НВ^А^

ATG кодон, нагоре -10 вр нетранслирана лидерна последователност и $ту! сайта .

'Гази олигонуклеотипна двойка възстановява пълният копиращ per й5§?(и^пр9в о ля в а неговото последващо ичтактно отстраняване от рПС вектора ^т;оез оазгоаъцаче с Hi по|Ш.

ДНК векторът pLIC-HBsAg _с лигатирача ЖК олигониклеотилна двойка, описана по-горе се използва зз торнсФолмилане на Е,со/1.

«о отволена четяща

Еекомбинантните плаз”иди се подбират сека. ч_е па притежават пълнт реконструиран HBsAg кодиращ регион.Пълната HBs рамка /оу/ се отстранява от лекомбинантния плазжд чрез разграждане с Н1 пс1Ш, последвано от изолиране и пречистване на /0,7квр/ НВзА^ ДНК чрез препаративна агарозна гел електрофореза за клониране в експресионеч вектор.

ПРИМЕР 3

Клониране на

ORF в спи паз.литтни екепрроипччи врлтпрл

За конструиране на експоесионен блок се използват три различни експресионни вектора, GAP 491 промоторен експресионен блок,описан по-рано / .1.1/ е съставен от около 1,1 квр глицералдехид дехидрогеназен промотор / йАРДН / и около 350 вр от дрождева алкохол дехидрогеназен! /АДН I/ тер^нзтор в рВКЗЗЗ основа, с уникален сайт между промотора и терминатора .

НВс.А^ ΟξΡ от Пример 2 се лигатира в уникален Шд^ИДзайт , и неговото присъствие и ориентация се потвърждават с рестрикционен ендонуклеазен анализ блот.

Обратно, GAI10 /о,5 квр/ промотора/W се замества в горната конструктдея, и АДНр /1,25 квр / пломотора /13 / се замества с GAP промотора /вж. ^гура 1 /.

• · · · · ···· ···· ·· ·

Ьъв всеки случай,експреснонният блок^садъргжж ’специфичен про^отор НВзД^ и ДДН 1 терминатор,се ^т'лонира в совалков вектор pCl/l / Ве^ср ,по-горе и ^оШ-Легс , по-горе /, за съзнаване на прожцев ΘΚΟΠΡβο сионен вектор, който след това се използва за трансформация на

S . cerey'i^Ut както е описано по-долу.

ПРИМЕР д

Конструиране на дрождрв J. cere v CF^g /мпп9”/ мутентен щам

Щам S.cere^Mic*^ КНУ ι07 /cir⁴/_ta3el⁺. феи?** и мпп9“ / се конструира както следва ·

Щамът C/5 / IB347-1C с кръстосване тип / мппО , се разбърква с щамът 2150-2-3 с кръстосване от а тип /^Аи2'^, ₎яс!е1 чрез размесването на шаловете върху пълна среда на УЕВД, За подбор на диплоидите,размесените щамове се препосяват върху минимална среда, съдържаща захарозе ^т'ато единствен каобонов източник . След изолиране на единични колонии, диплоипите спорулират и аспите се разрязват по стандартни ^езгники. Щамът КНУ-107 се изолира като единична спора и се характеризира като с!_е⁺, arjel^еи2 и мпп9~/ по техниката на Шиф /,

КНУю7 /с1г 0 / е получен о^ щам КНУ107 /с1г⁺/ както е описано от Вгоасп /2б/, Съхраненият щам е превърнат в игаЗ ирез интегриране на разградения игаЗ ген, Полученият в резултат щам КНУ-Ю7игаЗ_ , се култивира въпху богата среда за ка позволи акумулиране на спонтанни мутации и се подбира устойчив на канаванин мутант,Щутантният там .CFb5.всъщност е сап1Г потвърдено грез кочплементен ана.лиз«САД]_0р&АВ1_ егспресиончият блок се интегрира в гена • ·

- 35 Н1$з от CF55/26/ за получаване на крайния гостоприемников там

СГ52 / Шта еи?.-2 , 112 игаЗ\ сзп1. Fris За» · GALjOpGAI^ - ЖАр ₇ с.1г /

ПРИМЕР 5

Транспортния на дрождите и мстачовяврне на посявката за r HB_sAo в СГ52 мпп9^₽ мутантни дрожди

Ш»·' ___________Л' ....... ...... — - -I ..............---Плазми,рът pCl/ pGAIk[oHB$Aj -тАДН _} описан в Пр_Имер 3 _се използва за трансформиране на щам S .cere visile 0¾ .Клоновете се подбират върху у.птнимална хранителна среда / {еи- съ.дьржагаа 1М сорбитол / ,установени като замразен резерв / в 17% г.пицерол% и изпитани както е описано по-долу.

ПРИМЕР 6 с

Култивиране и експресия на НВ$А<^ гена след промотора iAS.O в дрожди 0^52 / мпп9~/

Клоновете от дрожди,съдържащи експресионен плззмид,описан в Пример 5 по-горе,се посяват на {еиселективна агарна среда,съдържаща 1М сорбитол и инкубирана на 30°С за 2-3 ,дни.Тези .дрожди се инонулират с 5-7 м! от комплексна УЕНД S / УЕНД -ь сорбитол % и културите се инкубират на 30°С с аерапия за 1.2-18 часа .Колбите, съ държащи 50 млУЕНД5 -ь 2% галактозна среда,се инокулират от горната култура / до начално ⁼ 0,1. / и се инкубират ня 20°С при раз клащане /350 грм/ за 72 часа до чрайно Αθθθ _от 1П-16 • · · · · · • · ·· · · · · • · · · · · ··· ·· ·· ··

Пробите от Aggg единици се циспергират в епруветки и црожпевите клетки се центрофугират на ?000 х за 10 мин, ЧентроФугатите се изпитват директно или се оставят на -70°С за бъдещи изследвания.

По врама на изпитването, пробите се ресуспендират в 0,4 мл Фосфатно буферен разтвор,съдържащ 2мР HiSP , Дрожцевите клетки се разрушават чрез ί

1/ добавянето на 200-300 м^ стъклени топчета /0,45 мм/

2/ разбъркване в ^ликсер за ^и5 ήη

3/ добавяне на Тритон X—100 до 0.5% / /// /.

4/разбъркване в миксер за 2 минути, и

5/ инкубиране на 4°С за 10-15 минути.

Клетъчните останки и стъклените топчета се отстраняват чрез пентпофугиране при 13000 х о за 10 дин, Пояснената супепнатанта се отстранява и анализира за протеин Е чрез АИ5Ц1А пробата / ΑββοΉ / по метода на Лоури / и за HB^Aj /, Типичните резултати от изпитвачето са показани по-долу.

ТАБЛИЦА I

Описание на пробата

АИБПА _?

Р24 ниво

LIG/M& протеин Разруша- Лгноблот

------------- ване --------^ейкорни колби мпп9~ -мутант / 0,55, 0,61,0,53 / див тип ί МТШд⁺/ стъклени топчета ст.топчета

- 37 • ···· ·· ·· ··· · • · ··· · · · ···· · · · · · ·· ·· ··

ПРИМЕР 7

Широкомащабно култивиране на S. сегеу^ще /млп9~/ ,процупиращ

във Ферментори

Замразените рекомбинантни дрождеви култури се инокулират в 121Λ среда,съдържаща 1М сорбитол, Ианизките с културите се инкубират обратимо на 29°С за 7-3 дни. Културите се оесуспен,пират в УЕНД9 и ресуспендираните клетки се прехвърлят в 2^ Ер_Ленмайерови колби,съдържащи 500 мл «уЕНД и 2^ галактоза.Колбите се инкубират на 28°С и 350 грм в контролиран шейкерен инкубатор за 18-22 часа.Полудените култури след ^ова се изгглзват за инокулиране на съдовете за производство в промишлен мащаб.

Около 1- 5 $ V /1/ инокулум от една или ^ЛПРПЛеколби се прехвърля в 1.6 -Пили ⁹50 Ь Ферментори.съдържащи 10 Ь или 700 от «уЕНДЗ, съответно. 16-6 Фер^л,енторите работят при режим 160 60 1/мин въздух и 28°С, Ферменторите са готови за събипане на ппо дукцията след 40-46 паса след инокулирането със семенната култура. Степента на оптичната плъЖф^ 15,0 е,циници .Събирането на клетките се състои от концентрирането им с помощта на Филтруване прец фиброзен филтър,последвано от промиване на клетките в буфериран солен разтвор. Клетъчните промивки/даедно с клетките/ се изпитват както е описано по-долу или се съхраняват на студено при -70°С за по-нататъшно използване в процеса иши за анализ.

Малки проби /0,6 м^ / от 70% промити клетъчни разтвори се подлагат на ишххкаж разрушаване със стъклени топчета /о,45 0,52 мм/ в 1,5 мл епруветки на Ипендорф / PMSP /5,5 _от ощд мМ резерв / се добавя като протеазеч инхибитор. Еднакви количества се отстраняват от епруветките сред разрушаване и замразяване на -

• ·

• ·· · · · · · · • · · · · · ·

-70°С за по-нататъшно използване в имнобдот анализ.

Добавя се TRIT0H Х-100 към останалите проби ло крайна концентрация от 0,5%, и пробите се смесват бързо и инкубират на 4°С за 20-40 мин .Клетъчните останки се отстраняват през центрофугиране и прояснения клетъчен е^т'етг>якт се изпитва ва антиген % Awsrla и протеин / Доури/.

ΠΕΙΦΕΡ 8 ши»·

Пречистване на протеина в специална Форма посредством

ХНЖАТОГРАФЖ

Рекомбинантни ^7т,амове ^.cereEsicie , конетулпапи както е описано

в Пример 5, се култивират или в колби, или във Ферментор. Дрождевите клетки се събират посредством мкро^илтряттия в Ау1соп-ДС-¹0 единица,суспендират се в 2.Q мл буфер А / 0,1Μ Νθ^ΗΡΟ ,рН 7,?, 0,5М Н_аС? /, и се разрушават с налягане по седем пасажа при 75-85 паунда за квадратен инч.Разрушените клетки се суспендират /31 cjm сухо тегло / и суспенсията се разрежда със 120 мл буфер A_fTriton X—100 се добавя до крайна чончентрация 0,5% / ι////' и суспенсията се прояснява през центрофугиране на 10 000 х j за мин. на 4°С. Прояснения бульон се декантира и инкубира със СеФароза 4В,присъединява се с антитела към Ηβ₅^ / ?7/ зя 19 пяса при 4°С за адсорбиране на антигена върху каучука.Сдец периода на инкубация, промивката се затопля го стайна температура за всички останали последващи етапи и се дегазира под вакуум за 15 ”инути.Обезга• ···· ·· ·· ··· · • » · · · ··· •··· ·· ··· ·· ·· ·· зената промивна суспенсия се отдава върху ^?,5 х 40 см колона,След като колоната се запълни окончателно,несвързания протеин се промива с буфер А, Антигенът се елуира е ЗМ KCGM _в буфер А, Фракциите, съдържащи антиген се диализират срещу 0,007 М E^a^HPO^ , pH 7,2 , 0,15 М М?аС( при 4°С и се отдава до Формиране на диализна афинитетна про ба, съдържаща 1,08 му протеин в 20 мл. 16 мл от тази проба се разреждат по ^0 мс^/мл с 5,6 мл 0,006^ , pH 7,2, 0,15И N_aC{, Продукта се стерилизира чрез Филтруване през ^1{(ех 0.22 р небрана. Идентичността на продукта в диализната аФинитетна проба се показва чрез откриване на НВ$Д^ _с реактива Аи$^г1а^.

II

ОПИСАНИЕ	РАЗРУШАВАНЕ
НА ПРОБАТА	AUSTRIA . UG/i'S/PTOTEIN
Фермешщж.
	/ 1,13 , 1,Ю, 1,06 /	Стъклени топчета
мпп9~	/з,1 , 4,4 /	Manion - Genltn
див тип	/ 2,3 /	Manion-Cantin

- tjo • · · · · · • · • · · · · • · ··· · ··

ПРИМЕР 9

Широко мащабно пречистване на оекомбинантни KBsA^

Около 250 о от заигра пена клетъчна паста /пподмципаща рекомбинантен протеин / се ресуспендира до 17% сухо тегло /обем /о^оло 1500 мл / във фосфат бутериран солен па отвор /РВ5/₁ К_{летките се} нагряват до 45°С ирез имерсия във водна баня. Температура та се повея да до 45°С за 15 мин и след това се охлажда постехенно цо Ю⁰С. След това клетките се разрушават през двукратно прекарване ппез хомогенизатор на ОаиНп,

Следвайки хомогенизирането,¹0% Tri ion X-¹ 00 се по бавя по крайна концентрация 0,3% и се разчесва за около 15 мин. К_летъините екстракти след това се печтпотупипат ппи 3,6 х за 20 мин на 4°С и супепнатантата се събира.

След това супернатантаие се провежда над колона,съдържаща около 200о от

ента след това се прове.жда над колона, съдържаща около 150 широко порест силиций с размер на попите около 1500 ангстрьома и размер на настинките около 50 микрона, Използваните колони са 5 см в .диаметър / Р(тагмас1а / и иехпешгиихи работят при ниска скорост около 200 мл за час.

Силициевата колона слей нова се промива с докато се превърне в основна,

S протеина се елуира от силип иевата и_{ОЛОН8 с} помощта найнапред на студен боратен бмФер /50 мК pH 8,7 ,4°С / при ниска скорост от около 500 мл за пас, докато се види нарастване на . След като вече е започнало да нараства,колоната се загрява на 55°С и боратен буфер с 55°С температура се прокарва през колоната • · • · при скорост около 500 мл за минута, Елу?та,съдържащ поотеин /около 11 / се събира върху лед,След това елката се концентрира де около 200 мл чрез диатилтрапия срещу 50 боратен буФер на pH

8,7 , с помощта на ти Грозен Филтър с^люлекм.пча тегло на отделните Фибри Ю⁵. S протеинът след това се Филтрува през 0,2 микронен Филтър и се съхранява, .продуктът е стабилен, без забележителна деградаций^ВДВДт^ на блот анализ.

11РЖЕР

10.

Изпитване на карбо хидрат но то съдържимо на карбохилпатни повърх· ностни протеини

Карбохидратното съдържимо на рекожбичантни повърхностни протеини се определя по метода на I^boIS /22/, Основният принцип на тази процедура е, че проба от захари, олигозахарици.по.пизахариди и техни производни, вълккп-^е^но 'ъ^и.пови естери със свободни или потенциално свободни редуциращи груп.дават оранжево жълто оцветяване когато се третират с Фенол и конвент-пир?на сярн? киселина, количеството на цвета, получен при константна ^енолна концет трация е пропорционално на количеството на присъстващите захари.

За определяне на кар^охидратното поисъствие на _v дивт тип дрождеви щамове и у .дрождевия щем мпп9~_т 1 мл от разтвор, съдържащ между 10 до 70 мс| протеин се поставя в епруветка за тестуване.Серии от карбохидратни стандарти и празни проби се изготвя¹: така,че да съдържат различни количества карбохидрати.Един мл от 5$ фенолен разтвор се добавя към всяка проба,епруветките се разбъркват и се добавят 5 мл 96/ разтвоп н? сярн? киселина.с последващо разбъркване.Епруветките се инкубират на стайна температура • · · · · ·· ·· ··· · • · · · · ···

.... .. ... ·· ·· ··

СЕКВЕНЦИОНЕН ЛИСТИНГ

1/ ОСНОВНА ИНФОРМАЦИЯ

1/ ЗАЯВИТЕЛ : Κ_πί. SKern,B, J,

Hgcjopian, A,

11/ ЗАГЛАВИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО : Хепатит В вирусни повърхностни протеини с редуцирано съ,държание на гостоприечникови карбохидрати

Ш/ БРОЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ : 9 iv/ АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ :

А/ АДРЕСАТ х Мегск ,, Inc,

В/ УЛИЦА : P.O. Bq_X poOO

С/ ГРАД х ?_aUy

Д/ ЩАТ х NeJ Jersey

Е/ ДЪРЖАВА : IIS

Г / /IF : 07065 - 0900

V/ КОМПЮТЪРНО ЧЙТАЕМА ΦΟΒΙΑ

А/ СРЕДЕН ТИП Длопи диск

В/ КОМПЮТЪР х IBM PC сомрат1в{е

С/ ОПЕРАТИВНА СИСТЕМА : РС-Д0$/ М$_Д0$

Д/ СОФТУЕР : РайепДп ^e^eaSe.^ 1,0 . Version 1,⁹5

VI/ ПОСЛЕДНИ ДАТИ ЗА ЗАЯВЯВАНЕ х

А/ НОМЕР НА ЗАЯБЯБАНЕ х несе зачита

В/ ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ : не се зачита

С/ КЛАСИФИКАЦИЯ х не се зачита

VHI/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПАТЕНТНИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛ :

А/ ИИЕ : Pj’eij'jet , Utsnct I.

• · • · • · • · · · • · · • · · · • ·

В/ РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР*’*: 22640 •· • · • · ·· • ·· ·· ··

С/ БРОИ НА РЕФЕРЕНЦИИТЕ /НАДПИСИТЕ : 18346

1х/ ТЕЛЕКОМУНИКАЦИОННА ИНФОРМАЦИЯ :

А/ ТЕЛЕТОН : /908/ 594 - 4251

В/ ТЕЛЕФАКС : /908/ 594 - 4720

2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА SB? 1Д N0:1:

1/ секвенционна характеристика ί

А/ ДЪЛЖИНА : ю двойки бази

С* В / ТИП нуклеинова киселина

С/ ВИД НА ВЕРИГАТА : едноверижна

Д / ТОПОЛОГИЯ : линеарна

11/ МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДНК /геномна /

И / ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SB? ^ТД ^{но :} 1 ^:

АСААААСААА

2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА SBO 1Д N0 : р :

1/ СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :

А/ ДЪЛЖИНА : 30 двойки ^ази

В/ ТИП : нуклеинова киселина

С/ ВИД НА ВЕРИГАТА : едноверижна

Д/ ТОПОЛОГИЯ : линеарна

11/ МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДНК / геномна/ х1/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SB? 1Д N0 : :

AATTCAAGCT TACAAAACAA AAT6CAGTG6

2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА 5 И? 1Д N0:3:

1/ СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :

А/ ДЪЛЖИНА : 30 двойки ^ази

В/ ТИП : нуклеинова киселина • · • · · · • · · • · · ·

С/ ВИД НА ВЕРИГАТА : е.цновеиижна

Д/ ТОПОЛОГИЯ : линеарна ц/ МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДНК / геномна ί

ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : ГД НО :з:

GTTCGAATGT TTTGTTTTAC GTCACCTTAA

2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ЗЩ ГД НО : 4 :

/ СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :

А/ ДЪЛЖИНА : 15 двойки Нззи

В/ ТИП : нуклеинова киселина

С / ВИД НА ВЕРИГАТА : едноверижна

Д/ ТОПОЛОГИЯ : ДНК /геномна / х1/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ 1Д МО :4:

АТАСАГТТАА GCTTG

2/ ИНФОРМАЦИЯ- ЗА СМ 1Д N0:5:

1/ СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :

А/ ДЪЕЖНА : 1Θ двойки бази

В/ ТИП : нуклеинова киселина

С/ ВИД НА ВЕРИГАТА : едноверижна

Д/ ТОПОЛОГИЯ : линеарна

Й/ МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДНК / геномна /

Х1/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ГД МО :5:

TGTAAATTTC GAACCTAG

-46··· ······ • ···· · · · · ··· · • · ··· · · · ···· ·· ··· · · ·· · ·

2/ ИНФОРМАЦИЯ ВА ЗД 1Д Μθ:ρ:

1/ СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА

А/ ДЪЛЖИНА : 45 двойки бази ь/ ТИП : нуклеинова киселина

С/ ВИД НА ВЕРИГАТА : е.цноверижна

Д/ ТОПОЛОГИЯ : линеарна

Ц/ МОЛЕКУЛЕН ТИП : геномна ДОК _xi/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : ЗД 1Д К0:б:

AATTCAAGCT ТАСААААСАА AATGGAGAAC ATCACATCAG GATTC

2/ ИНФОРМАЦИИ ЗА ад 1Д МО:?:

$/ СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :

<**

А/ ДЪЛЖИНА : 45 двойки бази

Б/ ТИП : нуклеинови киселини

С/ ВИД НА ВЕЙКАТА : единична

Д/ ТОПОЛОГИЯ : линеарна н/ МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДОК / геномна / xi/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА S0O ГД КО:?:

GTTCGAATGT TTTGTTTTAC CTCTTGTAGT GTAGTCCTAA GGATC

2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ДЕЦ 1Д Ц0:8:

А/ ДгЛ.мпЯА. ί 29 двойки 4₀зи

В/ ТИП : нуклеинова киселина

С/ ВИД НА ВЕРИГАТА :

едноверижна

Д/ ТОПОЛОГИЯ : линеарна

Й/ МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДНК /геномна / _х1/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : 1Д W:g:

AATTGTCGAG AGCTAGCTGA ATTCCCGGG

2/ ИНФОРМАЦИЯ. ЗА SEQ 1Д NO :д:

1/ СЕКВЕНЦИОННА ИЛРАКТЕЖТЙКА :

*** А/ ДЪЛЖИНА : 29 двойки бази

В/ ТИП : нуклеинови киселина

С/ ВИД НА ВЕРИГАТА : е,цновери?кна

Д/ ТОПОЛОГИЯ : линеарна

И/ МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДНК / геномна/ х1/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : ГД ГДО:д:

AGCTCCCGGG AATTCAGCTA GCTGTCGAC

Claims (13)

1, Еукариотична ексгтпесионча система яа получаване на рекомбинантни полипептиди и протеини,съдържащи редуцирани нива на гостоприе'!никови карбо хидрати и гликопротеини.

2 .- Експресионна система съгласно претенция 1,където еукари- отичният гостоприемник е дрот 3. Експреснонна систе-ъ съгласно претенция 3,където дрождеви- ят гостоприемник е 6аЛаъот^се5сегеи%'ле · 4.. Експресйонна система съгласно претенция 1,където реком-

бинантният полипептид или протеин е хепатит В вирусен полипептид или протеин.

5. Експресионна система съгласно Пр_етеНция 4,където хепатит В вирусния полипептид или протеин е повърхностен полипептид или протеин.

6. Едспресионна система съгласно Пр_еТенция 5,където хепатит В вирусния полипептид или протеин е HBs4j .

7. · Хепатит В вирусен повърхностен поотеин,който Формира частички със съществено ре.пуциряно^овррхностно карбохидратно или съдържание.

протеин съгласно претенция рекомбинантни дрождеви клетки,които са генетично гликопротеиново

8. Хепатит В вирусен повърхностен

7, продуциран в дефицитни на протеиново гликозилиране.

9. Хепатит В вирусен повърхностен

8, където генетичната недостатъчност на мпп9 гена.

протеин съгласно претенция прождевите клетки е в ··· ··· · · · • ···· · · · · ··· · • · ··· · · * ···· 9 · · · · ·· ·· · ·

10. Хепатит В вирусен повърхностен протеин съгласно претенция 7,където карбохидрата към протеиновото съотношение от пречистения повърхностен протеин е по-малко от 0,5.

11. Ваксина срещу хепатит В вирус за приложение на хора,която включва хепатит В вирусен повърхностен протеин,който Фор^тира паст тички със съществено редуцирано количество на включения карбохидрат или гликопротеин.

12,. Ваксина съгласно претенция 5. продупиоана в рекомбинантни дрождеви клетки, които са генетично дефицитни за протеинова гликозилация.

13. Ваксина съглесно претенция 12,където генетичния деФицит е в мпп9 гена.

14. Ваксина съгласно претенция И. където карбохи.прзтното към протеиново съотношение зт повърхностния протеин е по-малко от 0,5..

15.. Имунологично .диагностичен реагент, който включва хепатит В вирусен протеин,който Фор'пра частици със съществено редуцирано количество на включения гостоприемчиков карбохидрат или гликопротеин, който притежава редуцирана реактивност с природно срещаните анти-дрождеви антитела.

16'.. Имунологично диагностичен реагент съгласно претенция 15, където карбохидратното към протеиновото съотношение от пречистения повърхностен протеин е по-малко от 0,5.