SK118193A3 - Hbv surface proteins with reduced host cabohydrate - Google Patents

Description

Povrchové proteíny HBV so zníženým obsahom uhľohydrátov z hostitela

Oblasľ techniky

Vynález sa týka súboru povrchových proteínov vírusu Hepatitis B, tvoriacich častice, tých.to častíc a očkovacích Látok, ktoré tieto častice obsahujú.

* Doterajší stav techniky

Vírus Hepatitis B(HBV} je infekčné činidlo, ktoré je zodpovedné za niekoľko druhov chorôb pečene u človeka. Mnohí pacienti, ktorí sú infikovaní HBV, sú postihnutí akútnou fázou choroby, po ktorej nasleduje uzdravenie. Určité percento infikovaných jednotlivcov sa však infekcie nezbaví a stávajú S8 chronickými nosičmi tejto infekcie. HBV infekcia je v mnohých Častiach sveta endemická, pričom v mnohých prípadoch prechádza infekcia perinatálne z chronicky infikovaných matiek na narodené deti, a tiež u nich zostáva často chronická. Celkový počet postihnutých osôb vo svete je odhadovaný na viac ako 300 miliónov. Z tohoto súboru nosičov každý rok niekoľko $totisíc ľudí umiera za rok pôsobením dlhodobých dôsledkov chronickej Hepatitis B fcirrhóza a/alebo hepatocelulárny karcinóm).

Vírus Hepatitis B delta je Činidlo, ktoré je pri súčasnej infekci HBV zodpovedné za akútne prepukajúcu chorobu,ktorá je obvykle fatálna. Delta vírus nakóduje (na základe svojho pôvodného genetického materiálu ) proteíny, ktoré slúžia ako obal viriónu; tento vírus skôr enkapsiduje s obalovými proteínami kódovanými koinfekčným HBV, čím má blízky štruktúrny a imunologický vztah k HBV proteínom, ktoré sú popísané Óalej. V súčasnej dobe nie je známe, či iné infekčné činidlá majú podobný vztah k HBV. Je však zrejmé, že proteíny s väčšou šírkou serologickej reaktivity alebo zvýšenou imunogénnou potenciou by boli užitočné v systémoch pre cliagnozu alebo prevenciu (alebo tiež liečenie) chorôb (alebo infekcií.), založených na triede činidiel, ktoré majú len malú alebo čiastočnú antigénnu krížovú reaktivitu voči HBV<,

HB virion sa skladá z dvoch skupín štruktúrnych proteínov, jadrových proteínov a obalových či povrchových proteínov. Okrem toho, že sú obalové proteíny hlavnými povrchovými proteínami viriónu, t.j.Dánske Častice, sú tiež hlavnými zložkami Autrálskeho antigénu alebo 22 nm častíc.

v

Tieto obalové proteíny sú tranzlačnými produktami velkého otvoreného čítacieho rámca vírusu (ORF·), kódujúceho prinajmenšom 389 aminokyselín (aa ). ORF je rozdelený do troch domén, z ktorých každá začína kodónom ATG, ktorý je schopný fungovať ako iniciačné miesto tranzlácie in vivo. Tieto domény sú označené symbolmi preSl (108aa), preS2 ( 55aa ), a S (226aa ) v zodpovedajúcom poradí 5J v géne. Tieto domény teda definujú 3 polypeptidy označené' symbolmi S alebo HBsAg (226aa.), preS2+S (281aa ) a preSl+preS2+S (389aaJ. Tieto polypeptidy bývajú tiež označované symbolmi p24/gp27, p3O/gp33/ gp36 a p39/gp42 ( a niekedy tiež ako hlavný, stredný a velký proteín).

Obalové proteíny HBV sú glykoproteíny s uhlohydrátovýnii bočnými reťazcami (glykanyj pripojenými N-glykozidickými väzbami k definovaným rozpoznávacím miestam peptidov [Heermann a äalší, J. Virol. 52, 396 f 1984 / a Stibbe a äalší J.Virol. 48, 626 (1983 ) ] · HBV polypeptidy produkované v priebehu prirodzenej infekcie teda obsahujú-druh p24/gp27 /polypeptid S a jeho glykozylovaný derivát/, gp33/gp36 /polypeptid preS2+S glykozylovaný len v doméne preS2 a rovnaký polypetid glykozylovaný ako v doméne S, tak v doméne preS2/ e p39/gp42 (peptid preSl+preS2+S a jeho derivát glykozylovaný v doméne preSl,). Vakcíny, získané z plazmy, ktoré sú v súčasnej dobe dostupné, sú zložené z proteínov, ktoré zrejme obsahujú len doménu S /zahŕňajúcu monomér p24 a jeho glykolyzovoný derivát gp27/,zatiaľ čo až doposiaľ úspešne vyvinuté vakcíny z kvasiniek sa skladajú výlučne z polypeptidu S, ktorý obsahuj len neglykolyzovaný druh p24/.

22nm častice HBsAg boli purifikované z plazmy chronických nosičov. Pretože plazma týchto nosičov je označovaná ako pozitívna vzhladom k časticiam, tiež samotní títo nosiči sú označovaní HBs⁺ . Pokiaí sú infikované osoby schopné vyvinúl dostatočnú imunitnú odpoveď, zbavia sa infekcie a stávajú sa HBs . Vzhladom k tomu, že si vytvoria protilátky proti HBs, sú títo jednotlivci označovaní ako anti-HBs⁺ . Týmto spôsobom dochádza ku korelácii anti-HBs s vyliečením choroby, s imunitou voči reinfekcii touto chorobou a s imunitou voči reinfekcii HBV. Od stimulácie tvorby anti-HBs pomocou HB vakcín sa teda očakáva dodanie ochrany proti HBV infekcii.

Túto hypotézu bolo možné preverit experimentálne. Okrem človeka je jedným z mála živočíšnych druhov,ktoré sú plne susceptibilné voči HBV infekcii, šimpanz, ako to reflektujú kvantifikovateľné markery, ako je HBs a zvýšená hladina pečeňového enzýmu v sére. Šimpanzi boli očkovaní tromi dávkami purifikovaných častíc HBsAg a potom boli provokovaní intravenóznym podaním infekčného HBV. Zatial čo u zvierat očkovaných kontrolnou vakcínou sa dostavili známky akútnej HBV infekcie, zvieratá očkované; HBsAg boli úplne chránené pred prejavmi infekcie. V tomto experimentálnom systéme teda častice HBsAg (zložené z p24 alebo z p24 o gp27) úplne postačovali pre indukciu ochrannej imunity. Bod vplyvom týchto pozorovaní začalo niekoľko výrobcov vyrábal HB vakcíny zložené z častíc HBsAg.

Nedávno vznikol na základe niekoľkých nezávislých sérií dôkazov predpoklad, že sekvencie preS môžu byt do— ležité pri udeľovaní imunity voči HBV. Imunitná eliminácia antigénov preS v priebehu vírusovej infekcie sa zdá byt prognostická pre zbavenie sa vírusu a elimináciu infekcie [Budkowska a ďalší, Ann. Inst. Past./Imunn., 136:56 až 65, /1985/J. V priebehu akútnej infekcie Hepatitis B vznikajú protilátky proti doméne preS často skôr ako protilátky proti S [Petit a ďalší, Mol. Immun., 23: 511 až 523, /1986/J. U inbredných myší sa zdá byt imunitná odpoveď voči S a preS regulovaná nezávisle a prítomnosť domény preS môže ovplyvnil imunitnú odpoveď voči S [Millich a ďalší, Froc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 8168 až 8172, /1985/, J. Imunol., 137: 315 až 322/1986; Neurath a ďalší, J. Med. Virol., 17: 119 až 125, /1985/J . Okrem toho, protilátky voči doméne preS neutralizujú vírusovú neúčinnosť in vitro [Neurath a ďalší, Vaccine, 4: 35 až J7, /1986/J a antigény preS chránia imunizované šimpanzy proti infekcii HBV [Itoh a ďalší, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83: 9174 až 9178, /1986/J . Vo svetle týchto pozorovaní a vďaka užitočnosti rekorabinantných kvasiniek /ako je podrobne uvedené ďalej/, pre výrobu IIB vakcín z rekombinantnej kvasinky Saccharomyces cerevisi® boli experimentálne HB vakcíny podlá tohoto vynálezu vytvorené na bázi rekombinantného kmeňa S. cerevisiae.

Z dovodu zvýšenia dodávok HB vakcín sa výrobci obrátili í k rekombinantnej DNA technológii pre sprostredkovanie expresie i vírusových obalových proteínov. Z mikrobiálnych systémov boli

I pre expersiu mnohých proteínov získavaných rekombinantnou technológiou najčastejšie používané kmene Escherichie coli a S. cerevisiae. Mnoho pokusov exprimovat imunologický účinné častice HBsAg v E. coli bolo neúspešných. Naproti tomu S. cerevisiae sa ukázal byť velmi vhodným vďaka svojej schopnosti > exprimoval imunologický účinné častice UBsAg. Ukázalo sa, že ked su tieto častice /výlučne zložené z p24/ spracované na vakcínu, sú schopné úplne ochrániť šimpanzy pri provokácii živým HBV alebo rôznych serotypov. Okrem toho častice S získané z kvasiniek sú tiež imunologický účinné a rovnako účinné ako HBsAg získaný z plazmy pri ,prevencii choroby alebo infekcie pri klinických skúškach na luďoch [ Stevens a ďalší, JAMA, 257: 2612 až 2616 /1987/J. Z toho dôvodu je užitočnosť S. cerevisiae ako hostiteľského druhu pre riadenie syntézy rekombinantného HBsAg zistená nad akúkoľvek pochybnosť. Okrem toho, expresia humánnych terapeutických činidiel a očkovacích látok v Kvasinkách môže byť veími užitočná pre vývoj produktu, pretože kvasinky neobsahujú endoUoxíny , nie sú patogénne voči človeku, je možne ich fermentovať v priemyslovom merítku a pri

V ich využívaní je možnď upustit od mnohých bezpečnostných opatrení, ktoré doprevádzajú využitie kontinuálnych línií buniek cicavcov /mnohé z nich sú vírusovo transformované, môžu byt tumorigenické u myší a všetky obsahujú protoonkogény/.

S. cerevieiae /pekárske kvasnice/ je eukaryot, ktorý je schopný syntetizovať giykoproteíny. Glykozylácia proteínu na kvasnice je predmetom mnohých nedávno publikovaných prehľadných článkov [ hlavne:Kukuruzinska a ďalší, Ann.Rev. Biochem.,/1987/, 56, 915 až 944; Tannen a ďalší, BBA, /1987/, 906, 8L až 99J· K tejto glykozylácii či adícii glykanov na vhodné receptorové aminokyseliny (aa)v polypeptide dochádza buď na špecifických serínových (Ser) alebo treonínovýchfThrJ zvyškoch (väzba cez kyslík), alebo na špecifických asparagínových^Asn?zvyškoch (väzba cez dusík). Špecifičnosť vzhľadom k väzbe cez kyslík na zvyškoch Ser alebo Thr nie je jasne vysvetlená a stanovuje sa empiricky prípad od prípadu.

Signálna sekvencia pre glykozyláciu cez dusík je dobre definovaná, ako buď amínokyselinová sekvencia Asn-X-Thr alebo Asn-X-Ser (kde X predstavuje lubovolnú aminokyselinu). Okrem toho, že sú kvasinky schopné syntetizovať mnohé autologné, natívne, giykozylované proteíny /okrem iného mannoproteíny alebo mannopeptidy/, sú tiež schopné glykozylovat heterologné alebo cudzie proteíny exprimované rekombinantnou technológiou /pokial heterologný proteín obsahuje vhodnú glykozylačnú signálnu sekvenciu buď pre N- alebo O-glykozyláciu/.

Polypeptidy preS2+2, ktoré sú produkované v priebehu prirodzenej infekcie, neobsahujú viac ako dva jadrové N-viazané glykany / o veíkosti približne 3 kilodaltony(kD)/, jeden v oblasti S a druhý na zvyšku na Asn, na amínokyselinovom zvyšku 4 domény preS2. Rozpoznávacie miesto v doméne S nie je giykozylované ani v Recombivax HB^\ ani v rekombinantnom preS2+2, syntetizovanom na kvasnice. Miesto predstavované amínokyselinovým zvyškom 4 domény preS2 je však kvasinkou rozpoznané a giykozylované.

Doména preSl obsahuje N-viazané glykozylačné miesto na amínokyselinovom zvyšku 4 oblasti preSl a potenciálne miesto na amínokyselinovom zvyšku 26 v prípade serotypu adw. Odborníkom v tomto odbore je zrejmé, že argumenty uvedené pre preS2 glykozyláciu sú platné tiež pre rôzne sekvencie v oblasti preS2 a tiež pre sekvencie v doméne preSl a S.

Kvasinka syntetizujúca rekombinantné preSl+preS2+S alebo preS2+S pridáva jadrový glykan, ktorý sa podobá na glykan, pridávaný k natívnemu polypeptidu v priebehu vírusovej infekcie. Keď však je kvasinková hostiteľská bunka divokého typu vzhľadom ku glykozylácii (t.j. keď obsahuje úplný komplement enzýmov požadovaných pre natívnu glykozyláciu, čo je prípad prakticky všetkých obvykle používaných kmeňov kvasiniek,?, značný počet týchto glykanov je predĺžený veľkým počtom prídavných manozových zvyškov rovnakým sposobom, aký kvasinKy používajú pri tvorbe svojich vlastných štruktúrnych manoproteínov. Táto rozšírená adícia glykanu, pokiaľ prebieha na cudzom génovom produkte, ako je polypeptid preS2+2, je označovaná termínom hyperglykozylácia. Odborníkom v tomto odbore je zrejmé, že argumenty, uvedené pre kvasinky sa tiež · vzťahujú na iné hostiteľské bunky (napríklad, bunky hmyzu alebo hubové bunky atď.), ktoré môžu byť podrobené rôznym typom glykozylačného postupu.

Ďalej bolo ukázané, že rekombinantné formy 22nm, častíc povrchových proteínov HBV, ktoré sú exprimované v kvasinkových hostiteľských bunkách divokého typu, môžu strhávať značné množstvá kvasinkového bunkového uhľohydrátu ( ktorý prinajmenr šom zčasti pochádza zo štruktúrnych manoproteínov a manopeptidov kvasinkovej hostiteľskej bunky?. Tento strhnutý uhľohydrát by mohol spôsobovať potenciálne problémy v tom, že by mohol vyvolávať tvorbu protilátok proti kvasinkovým uhlohydrátovým zvyškom glykozylovaných proteínov a imunogén očkovacej látky, obsahujúci strhnutý kvasinkový uhľohydrát by reagoval s anti-kvasinkovými protilátkami, prítomnými u u väčšiny cicavcov a tým by potenciálne znižoval svoju účinnosť ako imunogén a očkovacia látka.

Hyperglykozyláciu a strhávanie úplných manoproteínov a manopeptidov je možne eliminovať alebo je možné glykozyláciu obmedziť v polypeptidoch preS a S HBV a ich zodpovedajúcich časticiach, ktorýmkoľvek z nasledujúcich prístupov.

Najskôr . je možné hypergxykozylácii cez dusík zabrániť alebo ju obmedziť v priebehu rastu rekombinantného hostiteľa tým, že v rastovom médiu je prítomné exogenné činidlo (napríklad tunikamycín ) . Po druhé, polypeptidy z rekombinantných alebo prírodných zdrojov je možné deglykozylovať buá chemicky ( napríklad bezvodou trifluormetensulfónovou kyselinou alebo bezvodým fluorovodíkom? alebo enzymaticky (napríklad N-glykanázou, Endo-F alebo Endo-H? alebo fyzikálne (napríklad pôsobením ultrazvuku). Po tretie, rozpoznáva cie miesto pre giykozyláciu môže byt zmenené alebo vypustené mutagenézou na úrovni ĽNA, aby sa tak zabránilo glykozylácii a tým tiež hyperglykozylácii. Takéto modifikované preS+S otvorené čítacie rámce (OR?) , v ktorých bola zmenená glykozylačná rozpoznávacia sekvencia (pri riadení vhodnými promótormi aktívnymi v kvasinkách^ boli transformované do v

hostitelských kvasinkovitých buniek. Výsledné polypeptidy preS+S nie sú glykozylované. Po štvrté, je možné identifikoval Hostiteľské bunky, ktoré neobsahujú kritické enzýmy potrebné pre giykozyláciu. Posledne uvedený prístup je ilustrovaný v tomto vynáleze bez toho,' aby sa vynález na neho obmedzoval. Jeden takýto kvasinkový kmeň bol identifikovaný (mnn^-mutant)jBallou L. a ďalší, /1980/, J. Biol. Chem., 255, str. 5986 až 5991J. Tento kmeň postráda kritický enzým na glykozylačnej dráhe, ktorý je potrebný pre predĺženie (hyperglykozyláciu) N-viazaných glykanov; chemické štúdie ukazujú, že tento mutant vytvára manoproteíny bez vonkajšieho retazca manozových zvyškov, pričom obsahuje len jadrový uhlohydrát ^Ballou C.E. a ďalší /1986/ Proc. Mati, Acad. Sci. USA, 83, str. 3081 až 3085; Tsai P. a ďalší /1984/, J. Bio , Chem., 259, str. 3805 až 3811J . Pre tranformáciu . 9 takéhoto mutantného kvasinkového kmeňa mnn bol použitý otvorený čítací rámec (ORF) pre polypeptid S a preS+S (pričom transkripcia je riadená vhodnými promótormi aktívnymi v kvasinkách^. Výsledný polypeptid preS+S (obsahujúci preSi+preS2+S, preS2+S, preSl, preS2 alebo preSl+preS2)obsahuje len jadrovú giykozyláciu a nie hyperglykozyláciu.

v

I ked polypeptidy S nie sú pri expresii v kvasinkách ani glykozylované a ani hyperglykozylované, Častice, ktoré sa z nich skladajú, obsahujú podstatnú koncentráciu strhnutého uhľohydrátu, ktorý pochádza z kvasinkového manopeptidu. Expresia polypeptidov, ktoré obsahujú polypeptidy S a polypeptidy preS v kvasinkových bunkách, ktoré nie sú schopné hyperglykozylácie, má preto za následok zníženie obsahu uhľohydrátu v exprinovaných 22nm časticiach.

S. cerevisiae je velmi vhodný kmeň, vďaka schopnosti exprimovat imunologický aktívne 22nm častice. Tieto častice po zapracovaní do očkovacej látky, sú schopné plne ochránit šimpanzy proti provokačnej infekcii živým HBV. Okrem toho, HBsAg získaný z kvasiniek sa ukázal byí imunologický rovnako účinný pri klinických skúškach na ludoch ako HBsAg získaný z plazmy. Užitočnosť S. cerevisiae, ako hostiteľa pre riadenie syntézy rekombinantného HBsAg je teda nad všetku pochybnosť.

U radu rekombinantných mikrobiálnych expresných systémov sa ukázalo,žo syntéza mnohých rôznych polypeptidov je škodlivá pre hostitelskú bunku. V dôsledku toho existuje selektívny tlak proti expresii takých polypeptidov, takže jedinými bunkami, ktoré sa akumulujú pri prenesení rekombinantnej kultúry do väčšieho merítka, sú tieto bunky,ktoré prestali exprimovat cudzí polypeptid alebo ho exprimujú tak málo, že sa kultúra stáva neekonomickou ako zdroj tohoto polypeptidu. V niektorých prípadoch je tento škodlivý účinok tak silný, že keď je expresia vyvolaná silným konštitutívnym promótorom, nové transformované bunky nie sú schopné propagácie a nevytvárajú kolónie na selektívnych médiách. Tieto škodlivé účinky je možné prekonal za použitia indukovatelného promótora pre riadenie syntézy takých polypeptidov. V S. cerevisiae existuje rad indukovateíných génov. Štyrmi dobre charakterizovanými indukovatelnými genetickými systémami sú gény pre utilizáciu galaktózy /GAL/, gén pre alkohol dehydrogenázu 2 /ADH2/, gén pre faktor Z-párovania a gén pho5.

S. cerevisiae obsahuje 5 génov, ktoré kódujú enzýmy zodpovedné za utilizáciu galaktózy ako zdroja uhlíka pre rast. Gény GALI, GAL2, GAL5, GAL7 a GA.L10 kódujú (v uvedenom poradí) galaktokinázu, galaktóza. permeázu, hlavný isozým fosfoglukomutázy, </-D-galaktóza-I-fosfát uridyltransferázu a uridín difosfogalaktdza-4-epimerázu. Za neprítomnosti galaktózy je detegovaná len veími ma±á expresia týchto enzýmov. Pokial sa bunky nechajú rast na glukóze a potom, sa ku kultúre pridá galaktóza, sú tieto tri enzýmy indukované koordinovane, prinajmenšom tisíckrát ( s výnimkou GAL5, kde dochádza k päťnásobnej indukcii) na úrovni transkripcie RNA. Gény GALI, GAL2, GAL5, GAL7 a GAL10 boli molekulárne klonované a sekvenované. Regulačné a promótorové sekvencie na 5'strane príslušnej kódovacej oblasti boli

V z umiestnené vedia kódovacej oblasti pre gén lacZ. Tieto experimenty definovali promótorové a regulačné sekvencie, ktoré sú potrebné a ktoré postačujú pre indukciu galaktózy.

S. cerevisiae obsahuje tiež tri gény, z ktorých každý kóduje isozým ADH. Jeden z týchto enzýmov ADHII je zodpovedný za schopnosť S. cerevisiae utilizovať etanol ako zdroj uhlíka v priebehu oxidačného rastu. Expresia génu ADH2, ktorý kóduje isozým ADHII je katabolicky potlačená glukózou, takže v podstate nedochádza k žiadnej transkripcii génu ADH2 v priebehu fermentačného rastu za prítomnosti konŕcentrácie glukózy lg/1. Po vyčerpaní glukózy a za prítomnosti nerepresívnych zdrojov uhlíka je transkripcia génu ADH2 indukovaná stonásobne až tisícnásobne. Tento gén bol molekulárne klonovaný a sekvenovaný a boli definované regulačné a promótorové sekvencie, ktoré sú potrebné a ktoré postačujú pre depresiu transkripcie.

Faktor ^(-párovania je sexuálny feromo'h S. cerevisiae, ktorý je potrebný pre párovanie medzi bunkami ΜΑΊΚ a M'ATa.

✓ Tento tridekapeptid sa exprimuje ako preproferomon orientovaný do hrubého endoplazmického retikula a potom sa glykozyluje a proteolyticky spracováva na svoju konečnú matúrovanú li formu, ktorá je sekretovaná bunkami. Táto biochemická dráha sa používa ako stratégia pre expresiu cudzích polypeptidov. Gén faktora pre Λ-párovanie bol molekulárne kionovaný a jeho promótor s pre-pro-vedúcawsekvencioubol využitý pre expresiu a sekréciu rôznych polypeptidov. Podobne sa ukázalo, že promótor génu pho5 je indukovateíný nízkymi koncentráciami fosfátu a to je tiež možne využil pre fyziologickú reguláciu expresie cudzích proteínov v kvasinkách.

Ako je možné očakával na základe ich traverze hrubého endoplazmového retikula a Golgiho aparátu, cudzie proteíny sú schopné glykozylácie ako cez atóm dusíka, tak cez atóm kyslíka. Promótor párovacieho faktoru <X. je účinný len v tých bunkách, ktoré majú fenotyp^. V S. cerevisiae existujú štyri genetické miesta, známe ako SIR, ktoré syntetizujú proteíny potrebné pre represiu iných normálne tichých kópií a- a Λ-informácie.

Lézi'c, ktoré sú citlivé voči teplote (ts^ 8 ktoré interferujú s touto represiou, existujú v génovom produkte prinajmenšom v jedno z týchto miest. V tomto mutante rast pri 35° O ukončuje represiu, čo vedie ku vzniku buniek s fenotypom a/<K, v ktorých je promótor faktora Λ-párovania inaktívny. Po úprave teploty na 23^-Csa''fenotypicky bunky vracajú na typ/,takže promótor sa stáva aktívnym . Pot.’í'itie kmeňov s léziou ts SIR bolo demonštrované pre regulovanú expresiu niekolkých cudzích polypeptidov.

Úlohou tohoto vynálezu je získal povrchový proteín HBV, ktorý vytvára častice, s podstatne zníženým obsahom strhnutého uhlohydrátu. Ďalšou úlohou vynálezu je vyvinul spôsob produkcie povrchových proteínov HBV, ktoré vytvárajú častice a ktoré majú podstane znížený obsah strhnutého uhľohydrátu, expresiou v kvasinkovom hostiteloví . Ďalšou úlohou vynálezu je vyvinúť očkovaciu látku proti HBV s obsahom častíc proteínu HBV, s podstatne zníženým obsahom strhnutého uhľohydrátu, pričom táto očkovacia látka by bola vhodná pre aktívnu a pasívnu liečbu alebo prevenciu chorôb a/alebo infekcií spôsobených HBV alebo inými činidlami, ktoré sú serologicky príbuzné HBV. Ešte ďaläou úlohou tohoto vynálezu je vyvinúť podmienky pre pestovanie rekombinantných hostiteľských buniek, vo veľkom merítku a pre purifikáciu rekombinantných povrchových proteínov HBV. Tieto a ďalšie úlohy vynálezu sú zrejmé z ďalšieho popisu.

Podstata vynálezu ✓

Podie vynálezu boli povrchové proteíny HBV exprimované vo vysokom vytažku v rekombinantnom kvasinkovom hostiteľovi, ktorý je geneticky deficientný, čo sa týka jeho schopnosti glykozylovať proteíny. Expresia povrchových proteínov HBV v kvasinkových bunkách má za následok tvorbu charakteristických častíc. Tvorba týchto častíc v hostiteľskej kvasinkovej bunke má za následok strhávanie kvasinkových bunečných látok do týchto častíc. Ak sa použijú hostiteľské kvasinkové bunky divokého typu, môže byť v časticiach HBsAg strhnuté značné množstvo uhľohydrátu kvasinkových buniek. Aby sa obišla tvorba očkovacej látky proti HBV s obsahom častíc s podstatným množstvom uhľohydrátu, je možné povrchové proteíny HBV vyrábať a purifikovať za použitia rekombinantného kvasinkového hostiteľa, ktorý je geneticky nedostatočný, čo sa týka jeho schopnosti glykozylovať proteíny. Povrchové proteíny HBV, ktoré sú produkované v takomto hostiteľovi, vytvárajú častice obsahujúce podstatne menej uhľohydrátu v porovnaní s časticami produkovanými v kvasinkových bunkách divokého typu. Tieto častice na bázi povrchových proteínov HBV sú užitočné ako očkovacia látka a/alebo prevenciu infekcií majúcich vzíah k HBV a ako antigén pre imunologickú diagnostiku vykazujúcu zníženú reaktivitu s prírodnými anti-kvasinkovými protilátkami .

ťrehíad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1. je schematicky znázornený diagram plazmidu pcl/lpGALlOHBsAg-tADH-1, ktorý obsahuje promótor pGALlO vyvolávajúci transkripciu otvoreného čítacieho rámca HBsAg, po ktorom nasleduje terminátor tADHl a selekČný marker Leu2+.

Ako už bolo uvedené vyššie, vynález je zameraný na spôsob výroby častíc povrchového proteínu HBV, ktoré obsahujú podstatne znížené množstvo strhnutého uhľohydrátu a ktoré sa hodia pre použitie ako očkovacia látka proti HBV.

AKO' zdroje nukleovej kyseliny HBV pre izoláciu vírusových otvorených čítacích rámcov boli použité '‘Dánske častice /serotypu adw/. Odborníkom v tomto odbore je zrejmé, že vynález sa vzťahuje na použitie nukleovej kyseliny z kmeňov HBV alebo príbuzných vírusov s inými serologickými reaktivitami, ktoré vyplývajú z genetickej rozdielnosti vírusov. Pre tvorbu kovalentne uzavretej kruhovitej dvojreíazcovej DNA genómu HBV z nukleovej kyseliny obsahujúcej zlomy a medzery, ktorá sa natívne vyskytuje vo virióne HB, bola použitá endogénna reakcia s polymerázou. DNA bola izolovaná, úplne rozštiepená EcoRI a klonovaná do miesta EcoRI v pBR322, za vzniku pHBV/ADW-1. Selekciou boli získané rekombinantné plazmldy, obsahujúce genóm HBV v kruhovité permutovanej forme v mieste EcoRI oblasti preS. Bol skonštruovaný úplný otvorený čítací rámec kódujúci 55 aminokyselín z oblasti preS2 a 22b aminokyselín z oblasti S postupom, ktorý zahrnoval najprv purifikáciu fragmentu dĺžky 0,8 tisíc bázových párov /kpb/, získaného po štie14 pení pHBV/ADW-1 pomocou EcoRI a AccI. Tento fragment kóduje polypeptid preS2+S, len bez iniciačného kodonu, amínotermináinych troch aminokyselín, karboxyterminálnych troch aminokyselín a translačného terminátorového kodonu.

Boli syntetizované oligonukleotidy a potom ligované k tomuto fragmentu, čím bol tento fragment konvertovaný na fragment HindlII, obsahujúci desat bázových párov neprelomenej 5'lemujúcej sekvencie, pochádzajúcej z kvasinky a bol zvolený úplný otvorený Čítací rámec (0R?/pres2+S tak, aby bol terminačný kodon priamo pripojený k prírodnému miestu HindlII v transkripčnom terminátore ADH1, pri vzniku spojovníka kompletne odvodeného z natívnej kvasinky bez obsahu akýchkoľvek prídavných intervenujúcich báz. Odborníkom v tomto odbore je jasné, že pre expresiu povrchových proteínov HBV a podobných proteínov sa môže namiesto ΑΏΗ1 použit akýkoľvek vhodný terminátor transkripcie, ktorý je aktívny v kvasinkách.

5'lemujúci oblast pre konštrukciu

ACAAAACAAA (SEQIDNO: lj

10 bola zvolená tak, aby zodpovedala sekvencii nepreloženej vedúcej sekvencie ( NTL· ) kvasinkového génu GAP63 (GKP) ^Kolland J. Biol. Chem., 225, 2596 /1980/J a rovnako vykazovala súhlas s génovou rodinu GAP. Konštrukcia bola zhotovená takým spôsobom, aby bola sekvencia NTL priamo pripojená k iniciačnému kodonu otvoreného čítacieho rámca ( ORF) preS2+S, bez intervencie akýchkoľvek prídavných báz. Odborníkom v tomto odbore je zrejmé, že pre expresiu povrchových proteínov HBV sa selekcie sekvencii NTL vztahuje i na iné sekvencie, ktoré vznikajú vo vhodnej exprimovanej koncentrácii.

Pri analýze sekvencie DNA boli odhalené dve substitúcie báz, ktoré majú za následok rozdielnosť v aminokyselinách v porovnaní so sekvenciami preS2+2 kódovanou DNA pBH preSGAP347/197 [Valenzuela a ďalší, Biotechnology 3 (4}, 317 až 320 /1985//. Pre vyhodnotenie identických polypeptidov u oboch konštrukcií boli miestne orientovanou mutagenézou zmenené tieto nukleotidové substitúcie, ktoré boli T miesto C v bázi 64 846bp ORF HBV preS2+S ^kodujúcaú Ehe miesto Leu) a G miesto A v bázi 352 kódujúcou Hls miesto Gin [ Zolier a ďalší, Nucleic Acids nesearch 10: 6487 až 6500 /1982/J. Potom bola otvorená kódovaná sekvencia aminokyselín pre optimálnu konštrukciu. Odborníkom v tomto odbore je zrejmé, že sa vynález meobmedzuje na túto sekvenciu, ale sa vzťahuje na všetky sekvencie, v ktorých DNA kóduje polypeptidy s antigenicitou majúcou vzťah k HBV.

Z DNA fragmentu kódujúceho PreS2 bol po štiepení ecoRI a Styl a purifikácii preparaxívnou eiekxroforézou na agarovom gele oddelený veíký fragment DNA (3,3 kbp ) , ktorý obsahuje pUC19 a oblasť kódujúc. HBsAg. Syntetický oligonukleotid DNA bol potom ligovaný s fragmentom pUC19HBsAg. Tento syntetický oligonukleotid DNA obsahuje lepivé miesta 5*Ec.oRI a 3 'styl a poskytuje miesto HindlII bezprostredne nasledujúce za miestom 5*EcoRI. Okrem toho obsahuje syntetický oligonukleotid DNA HBsAg ATG kodon, 9- nukleotidov pred ním a 21 nukleotidov za ním, vrátane miesta Styl.

Tento oligonukleotid znovu vystavia úplnú kódujúcu oblasť HBsAg a umožňuje jej nasledujúce odstránenie v neporušenom stave z vektora na báze pUC19 štiepením HindlII.

DNA fragment pUC19-HBsAg s ligovaným syntetickým oligonukleotidom DNA popísaným vyššie bol použitý pre transformáciu E. coli. Selekciou boli oddelené rekombinantné plazmidy, ktoré obsahujú úplné rekonštruovanú

- U kódujúcu oblast pre HBsAg. Z rekombinantného plazmidu bol Štiepením HindlII a nasledujúcou izoláciou a purifikáciou 0,7 kbp HBsAg DNA preparatívnou elektroforézou na agarovom gele odstránený úplný otvorený čítací rámec HBsAg, s účelom klonovania do expresného vektora promotora GAL10.

Expresná kazeta pGALlO-tADHl vyvoláva expresiu cudzích génov vložených do jediného miesta HindlII za galaktozou indukovatelným promotorom GAL10. Otvorený čítací rámec HBsAg s koncovými miestami HindlII popísaný vyššie bol ligovaný do miesta HindlII tohoto vektora. Táto expresná kazeta bola vložená medzi miesta Sphl shuttle vektora E. coli/S. cerevisiae, pCl/1, Beggs, vid vyššie uvedená citácia a tento vektor bol zavedený do kmeňov S. cerevisiae CF52 alebo CF55 a transformované klony boli selektovaní .

/ v po mutagenése bol fragment kódujúci bud S alebo preS+S popísaného vyššie, použitý pre konštrukciu expresnej kazety, ktorá bola nedávno popísaná [Kniskern a daiší, Gene 46: 135 až 141 /1986/J, ktorá sa skladá z a/ asi 1,1 kbp promotora GAr49i, b/ lObp lemujúcej sekvencie, ktorá pochádza z kvasinky, c/ 12J0 bp vírusového otvoreného Čítacieho rámca pre preSl+preS2+S alebo 846 bp vírusového otvoreného čítacieho rámca pre preS2+S alebo 681 bp vírusového otvoreného čítacieho rámca pre Sa d/ 0,4 kbp kvasinkového terminátora ADH1.

Pre konštrukciu expresných kaziet HBsAg boli použité tri rôzne expresné vektory. Expresná kazeta promotora GAP 491 popísaná vyššie [Kniskern a další, 1986, Gene 46, str. 135 až 141J sa skladá z asi 1,1 kbp promotora glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH) a asi 350 bp terminátora kvasinkovéj alkohol dehydrogenázy 1 (ADH1? v hlavnom reťazci pBR322, s jedným miestom HindlII medzi promotorom a i

i i I terminátorom. Otvorený čítací rámec HBsAg z príkladu 2 bol ligovaný do jediného miesta HindlII a jeho prítomnosť a οι rientácia boli potvrdené analýzami reštrikčnou endonukleáí f zou a metodou Southern Blot.

i |

i Alternatívne bolo v hore uvedenej konštrukcii použité

0,5 kbp promotora GAL10 [Schultz a ďalší, 1987, Gene 54,

I . str. 113 až +123] miesto 1,1 kbp promotora GAP alebo 1,25 kbp promotora ADH2 [Kniskern a ďalší, 1988 Hepatology 8, . 82 až 87 J miesto promotora GAP /viď obr.l/<, V každom z týchto prípadov bola expresná kazeta obsahujúca špecifický promotor, otvorený čítací rámec HBsAg a terminátor ADH1 klonovaná do shuttle vektora PCL/1 [Beggs, viď vyššie uvedená citácia; Rosenberg a ďalší, viď vyššie uvedená citácia J , za vzniku kvasinkového expresného vektora, ktorý bol potom použitý pre transformáciu S. cerevisiae, ako je to popísané ďalej. Pre ďalšie vyhodnocovanie a ďalšie experimenty boli tieto transformanty uchovávané vo forme zmrazených zásobných vzoriek.

Rodičovské kmene CF52 bol získané takto: párovací kmeň c/^_typu, CZ5/LB347-1C mnn9 , SUC-Z bol párovaný s .kmeňom a-typu, 2150-2-3 ieu2~, adel” zmiešaním oboch kmeňov v miske s úplným médiom YEHD. Z dôvodu selekcie diploidov boli párovacie kmene repiikované na misky s leu minimálnym médiom obsahujúcim 2 % sacharózy ako jediný zdroj uhlíka. Po izolácii jednotlivých kolónií boli dipioidy sporulované a ich asci boli štandardnou technikou rozrezané. Kmeň KHY-107 bol izolovaný ako jediná spóra a ““ charakterizovaný ako cir , adel , leu2 a mnn9 (technikou Schiffovho farbenia) · Kmeň KHY107 (cir o) boí odvodený od kmeňa κΉΥ-107 (cir⁺) spôsobom popísaným v Broach, Methods in Ľnzymoiogy 1U1, časť G, str. 307 až 325 /1983/. Opravený kmeň bol prevedený na ura3 inxegráciou rozštiepeného génu ura3. Výsledný kmeň KHY-107ura3delta bol pestovaný na bohatých médiách, aby sa umožnila akumulácia spontánnych mutácií.

Bol selektovaný kanavanín-rezistentný niutant. Komplementačnými testami sa potvrdilo, že mutantný kmeň CF55 má povahu canl . Expresná kazeta GAL10pGAL4 bola integrovaná do génu Hisj CF55 [Methods in Enzymology, 1990, 185, str. 297 až J09 J , za vzniku finálneho hostitelského kmeňa CF52 (Mata leu2-2, 112 urajdelta canl hisjdelta GAL10pGAL4-URAJ, cir° ) . Pre ďalšie vyhodnocovanie a ďalšie experimenty boli kmene CF52 a- CF55 uchovávané vo forme zmrazených zásobných vzoriek.

Rekombinantná kvasinka zo zmrazenej zásobnej vzorky bola kultivovaná v médiu YEHD [Carty a ďalší, J. Industrial Micro. 2, 117 až 121 /1987/J. Bunky boli zobraté, keď rast dospel do stacionárnej fázy. Boli vyrobené lysáty, ktoré boli rozdelené elektroforézou na polyakrylamidovom gele s natriumdodecylsulfátom /SDS-PAGE/ a imunoblotované s protilátkami proti HBsAg. V súlade s predpovedanou molekulovou hmotnosťou tranzlačného produktu otvoreného čítacieho' rámce proteínu S bol nájdený jeden polypeptid s molekulovou hmotnosťou približne 24 kD. Okrem toho lysáty rekombinantnej ale nie rodičovskej kvasinky sú pozitívne na S pri rádioimunostanovení /AUSRIA^/. Elektrónovou mikroskopiou sa v čiastočne purifikovaných kvasinkových lysátoch zistí vysoká hustota typických častíc HBsAg.

Promotor aktívny v kvasinke iniciuje transkripciu HBsAg a príbuzných génov. Odborníkom v tomto odbore je zrejmé, že namiesto proinotora GAP491 je možné použiť akékoľvek promotorové sekvencie aktívne v kvasinkách ( ako ich neobmedzujúce príklady je možné uviesť GALI, GAL10, ADH2, Pho5 atd. ) . Odborníkom v tomto odbore je tiež zrejmé, že aby bolo možné optimalizovat dobu zberu kultúry, s účelom dosiahnuť maximálny výťažok, mal by sa používať vhodný skúšobný systém, napríklad imunoblotová metóda alebo RIA alebo imunoeseje zviazaného s enzýmom ( EIA-enzyine-linked iinmuno-assay) ku stanoveniu expresie HBsAg a príbuzných polypeptidov v tomto systéme.

Promotor GAP491 sa ukázal byť užitočný pri expresii niekoľkých cudzích proteínov v kvasinkách, vrátane HBsAg [Bitter a ďalší, Gene 32: 263 až 274 /1984/; Wampler a ďalší,Proc. Mati. Acod. Sci. USA 82, str.6830 až .6834 /1935/J. Na základe našich predchádzajúcich výsledkov pri expresii HBsAg .s obsahom až do asi 40 % rozpustného kvasinkového proteínu (Kniskern a ďalší, viď hore uvedená citácia? bol tento promótor použitý pre vyvolanie expresie HBsAg a príbuzných proteínov vo vhodných hostiteľských kvasinkových bunkách.

Odborníkom v tomto odbore je zrejmé, že vhodný kvasinkový kmeň pre expresiu povrchových proteínov HBV je možno voliť zo širokej palety kandidátov. Vhodné kvasinkove kmene zahŕňajú, i keď na ne nie sú obmedzené, kmene s genetickými a fenotypickými charakteristikami, ako sú proteázové deficiencie a zmenená schopnosť glykozylácie.

Za účelom kontroly a definície glykozylácie rekombinantných proteínov HBV exprimovaných kvasinkami bol vyššie uvedeným spôsobom skonštruovaný kmeň S. cerevisiae CG52 (Mata leu2-2, 112 ura3delta canl hisddelta: : GAL10pGAL4ura3, cir°).

Expresný plazmid pCl/lpGAL10HBsAg-tADH-l bol použitý pre transformáciu CG52 ( ľ.íata leu2~2, 112 ura3delta canl. his3delta:: GAL10pGAL4-ura3, cir°). Transformované klony boli selektované na minimálnom médiu. (leu )obsahujúcim IM sorbitol. Tieto klonované transformanty boli uložené vo forme zmrazených zásobných vzoriek v 17ľí glycerole pre ďalšie vyhodnocovanie a ďalšie pokusy.

Tiež bola vyrobená glykozylovan.á kontrolná vzorka divokého typu. Pritom sa tiež použil expresný plazmid a transformovaný bol Kvasinkový kmeň GG54 , ktorý bo± Izolovaný štandardnými technológiami z kmeňa CF52. Tento kmeň sa spontánne vracia na typ mnn9+ ( a teda je divokým typom, pokiaľ sa týka glykozylácie, ale ináč má rovnaký genotyp ako kmeň CF52 )· Transforomované klonové izoláty so uložia v vo forme zmrazených vzoriek v 17# glycerole pre dalšie vyhodnocovacie a experimentálne práce.

Klony transformovanej kvasinky obsahujúce expresné plazmidy boli nanesené na misky s leu” selektívnym agaroín (obsahujúcim IM sorbitol, v prípade mnn9- transformantov Inkubácia bola realizovaná po dobu 2 až 3 dní pri J0° C. Táto kvasinka bola inokulovaná do 5 až 7 ml kultúr s komplexným YEHD médiom (Carty a ďalší, vid vyššie uvedená citácia)_t pričom toto médium obsahovalo O,1M až IM sorbitol a 2 % galaktozy, v prípade plazmidov na bázi GAL10. Kultúry boli inkubované pri 30° C po dobu 12 až 18 hodín za súčasného prevzdušňovania.

Vyššie uvedene kultúry boli použité k naočkovaniu nádob obsahujúcich vždy 50 ml komplexného YEHD média .s IM sorbitolom /toto médium je ďalej označované skratkou YEHDS/ Inokulácia sa robila na počiatočnú hodnotu =0,1 a kultúry sa inkubovali pri

30° C za súčasného trepania pri frekvencii otáčania trepaéky 35u min~^ po dobu 48 až /2 hodín, až do finálnej hodnoty = iu až 16. Vzorky z desiatich jednotiek ^A6uO ^boli uložené do skúmaviek a kvasinkové bunky boli peletizované 10 minútovým odstreďovaním pri 2u0U x g.

Skúšanie vzoriek bolo robené buď hneď alebo sa vzorky uložili v zmrazenom stave pri -70° C. V čase skúšania boli pelety resuspendované v 0,4 ml fyziologického v solného roztoku pufrovaného fosfátom /PBS/ s obsahom 2mM fenylmetylsulfonylfluoridu /PMSF/ a suspenzie boli prevedené do 1,5 ml Eppendorfových skúmaviek. Kvasinkové bunky boli rozbite 1/ prídavkom 200 až 300. mg omytých sklenených perál (s priemerom 0,45 mm )q nasledujúcim miešaním vo vírivom mixére po dobu 15 minút, 2/ prídavkom povrchovo aktívnej [látky TRITON X-100 do koncentrá21 cie 0,5 3/ dvojminútovým miešaním vo vírivom mixére a 4/ desaťminútovou inkubáciou pri 4° C. Rozdrtené zvyšky buniek a sklenené.perly boli oddelené a v supernatante bol stanovený proteín.fmetodou pódia Lowry a ďalší, J.Biol. Chem. 193, 265 /1951/J θ urobilo sa stanovenie RIA, ktoré je špecifické pre preS2+S [Hansson a ďalší, Infect. Immunol., 26: 125-130 /1979/; Machida a ďalší, Gastro nterology 86: 910 až 918 /1984/J alebo pre S (AUSRIA?.

Klony transformovanej kvasinky mnn9^_obsahujúce expresné plazmidy boli nanesené na misky s leu- selektívnym agarom s obsahom IM sorbitolu a kultúry boli 2 až 3 dni inkubované pri 30° C. Táto kvasinka bola inokulovaná do 5 až 7 ml kultúr s komplexným YEHDS médiom, ktoré rovnako obsahovalo 2 % galaktózy pre plazmidy s promotorom GA110. Inokulácia bola realizovaná na počiatočnú hodnotu ^A600 ^0,1 a kultúry boli inkubované pri 30° C za súčasného trepania pri frekvencii otáčania trepačky 350 min ¹ po dobu 48 až 72 hodín, až do finálnej hodnoty = 10 až 16. Trikrát replikované vzorky z desiatich jednotiek boli uložené do skúmaviek a kvasinkové bunky boli peletizované 10 minútovým odstreďovaním pri 2000 x g. Skúšanie vzoriek sa robilo buď .hneď alebo sa vzorky uložili v zmrazenom stave pri -70° C.

Imunoblotové analýzy polypeptidu získaného zo všetkých rekombinantných klonov popísaných vyššie v hostiteľských bunkách mnn9” fenotypu vykazovali jeden pás so zdánlivou molekulovou hmotnosťou asi 24 kí)a

U rekombinantných proteínov je kvalitatívny a kvantitatívny profil glykozylácie funkciou, ktorá je značne závislá na druhu hostiteľskej bunky a v rámci jedného druhu na bunečnej línii. Odborníkom v tomto odbore je preto zrejmé, že volba hostiteľského kmeňa sa vzťahuje i na druhy a bunečné línie odlišné od S. cerevisiae, pro ktoré je možné identifikovať mutácie enzýmov na glykozylačnej dráhe. Odborníkom je tiež rovnako známe, že volba hostiteľských kmeňov S, cerevisise sa vzlahuje na všetky kmene, u ktorých je možné identifikoval mutácie enzýmov na glykozylačnej dráhe.

Transformované klony boii potom podrobené skriningu na prítoinnosi HBsAg a expresii p24 a p41 . Bunky boli pov nechané rast na médiu YEHDS, ktoré tiež obsahovalo galaktózu pre plazmidy s proraotorom GAL1O, za účeloni indukcie expresie po vyčerpaní glukózy. Vyrobili sa lyzáty, tie sa rozdelili elektroforézou na polyakrylamidovom gele s nátriumdodecyisulfátom /SDS-ťAGE/ a blotovali sa /Western Blot/ na nltrocelulózu. Bolo .zistené, že ako produkt p24 tak produkt p41 je špecifický na obalový proteín, pretože je prítomný len v indukovaných transformantocn a je reaktívny so sérom anti-p24 /p41 bol tiež reaktívny s antisérom anti-preS/. Jeden kloň z každej stratégie bol zvolený pre ďalšiu analýzu. Ukrem toho,lyzáty trans·* formantov, ale nie rodičovský kmeň S. cerevisiae, boli pozitívne na HBsAg pri rádioiinunostanovení.

Tento výsledok jasne ukazuje užitočnost expresného vektora, ktorý používa promotor GALIU pre riadenie expresie HBsAg a podobných povrchových proteínov v S. cerevisiae. Odborníkom v tomto odbore je jasne zrejmé, že regulačný pro motor GAL10 alebo promotory GALI, GAL2, GAL7 alebo MEL1, ktoré pôsobia nerozlišiteíným spôsobom, umožňujú preniest rast rekornbinantnej kultúry S. cerevisiae do produkčného merítka prel začatím syntézy rekombinantného proteínu tak, aby boli negatívne účinky na hostiteľskú bunku minimalizované. Ďalej je odborníkom v tomto odbore zrejmé, že pre priamu expresiu peptidov obsahujúcich S a preS je mož•ŕ né použit expi-esný vektor, obsahujúci iný regulačný promotor /vrátane ADH2 a faktoraX-párovania, na ktorý sa však vynález neobmedzuje/, ktorý je fyziologicky indukovatelný

- 23 a u ktorého je možne⁷ zaistiť derepresiu inými prostriedKami. OdbornÍKom je tiež zrejme', že konštitutívny promutor, ktorý je menej účinný ako GA'púH, ako jeho neobmedzujúci príklad je možné uviesť GYC1, vyvoláva expresiu polypeptidov obsahujúcich S a preS do nižšieho percentuálneho obsahu bunečného proteínu, takže sa dá vyhnúť, negatívnym fyzialogickým účinkom, ktoré sú spôsobené nadexpresiou. Odborníkom v tomto odbore je tiež jasné, že aby bolo možné optimalizovať dobu zberu kultúry, s účelom d siahnuť maximálny výťažok, mal by sa používať vhodný skúšobný systém, napríklad Western Blot alebo rádioimunoeseje pre stanovenie expresie polypeptidov s obsahom S a preS v tomto systéme.

Pre purifikáciu proteínu S alebo podobného proteínu z transformovanej kvasinky S. cerevisiae bol použitý imuno-afinitný stĺpec s naviazanými kozími protilátkami, ktoré rozoznávajú časticovú formu HBsAg. Eluovaný produkt je pri readioimunoeseji pozitívny na HBsAg a pri pozorovaní elektrónovou mikroskopiou javí časticovú formu. Takáto časticová forma, ktorá zahrňuje ako HBsAg tak antigény preS alebo samotný HBsAg, je účinná ako očkovacia látka proti HBV a diagnostické Činidlo.

Boli vypestované a zobrané kvosinkové bunky transformované expresnými vektormi kódujúcimi povrchový proteín vírusu Hepatitis B alebo jeho varianty. Ak je to potrebné, je možné bunky skladovať tak, že sa premyjú roztokom pufru, napríklad PBS, spracujú sa na bunečnú pastu a tá sa zmrazí, obvykle na teplotu -70° C.

Purifikácia HBsAg a príbuzných proteínov obvykle začína takto: dávka čerstvej alebo zmrazenej bunečnej pasty sa suspenduje v pufre, prednostne TRIS,s vysokou hodnotou pH v rozmedzí od asi 8,5 do asi 11,0, prednostne asi 10,5 pričom pufer môže tiež obsahovať vhodné inhibítory proteázy). Potom sa bunky rozbijú, prednostne mechanickými prostriedkami. Zistilo sa, že jemný spôsob rozbíjania pomocou perál nie je vhodný pre použitie ** v _z vo velkom meritku. Prednosť sa dáva rozbíjaniu buniek vo vysokotlakom homogenizátore, ktorý pracuje približne pri tlaku 68,7 až 137,4 IvíPa . Použiť sa môže napríklad Gaulinov alebo Stanstedov homogenizátor. Použitiu homogenizátora sa dáva prednosť, pretože rozbíjanie buniek je účinné a rýchle.

Pri použití kvasinkových buniek vzniká surový extrakt Hodnota pH surového extraktu sa nastavuje v rozmedzí 8,0 až 11,0, pričom hodnote 10,5 sa dáva prednosť.

V tomto okamihu môže byt výhodné pridával k surovému extraktu detergent. Prídavok detergentu uľahčuje oddelovanie membrán kvasinxových buniek od nežiadúcich rozdrtených buniek. Ukázalo sa, že proteín preSl+preS2+S, ako i iné formy povrchových proteínov, sa môžu asociovať s membránami kvasinkových buniek. Môžu sa používať rôzne neutrálne alebo neiónové detergenty, ako ich [neobmedzujúce príklady je možné uviesť detergenty zo série TRITON-N, série TRITON-X, série BRIJ, série TWEEN alebo série EMASOL, deoxycholát, oktylgluxopyranozid alebo N0NIDET-Np-40. Užitočnými a vhodnými činidlami sú tiež detergenty s amfotérnymi iónami /zwitterióny/, ako je CHAPS afebo CHAPSO.

Ak sa má použiť detergent, je ním prednostne TRITON X-100 v koncentrácii približne 0,5 %. Je potrebné zdôrazniť, že spôsob podlá vynálezu v tomto stupni nutne nevyžaduje použitie detergentu a použitie detergentov nie je preto obligatórne.

rokial neboli v priebehu lýzy pridané inhibítory proteázy, môže sa potom extrakt.tepelne spracovať. Tepelné spracovanie je účinné v určitom rozmedzí teploi a diŽKy trvania, obvykle sa používa teplota v rozmedzí od 45 do 6u° C, pričom prednostnou teplotou je ceplota 50° C. uobo tepelného spracovania obvyKle reží v rozmedzí od 20 clo 40 minút, pričom prednostná doba je 30 minút. Extrakt sa tepelne spracováva vo vhodnej nádobe. Táto nádoba sa buď ponorí do zahrievaného kúpeľa alebo sa používa výmenník tep*, la. Potom sa látka ochladí na asi 10° C, prednostne tak, že sa umiestni do kúpela s ľadovou vodou alebo sa použije výmenník tepla. Odborníkom v tomto odbore je jasné, že pri tomto sposobe podlá vynálezu sa môže poradie, v ktorom sa realizujú stupne tepelného spracovania a odstraňovania . zvyškov buniek, obrátiť, bez toho,aby to malo podstatný účinok na výsledok celého postupu. Alternatívne sa môže postupovať tak, že sa celé kvasinkové bunky zahrievajú v pufre s neutrálnym pH, potom sa bunky rozbijú a pridá sa detergent, ako to bolo popísané vyššie.

Odstránenie zvyškov buniek z tepelne spracovaného surového extraktu je nutné, aby sa zabránilo fyzikálnej oklúzii v priebehu nasledujúcich purifikačných stupňov. Zvyšky buniek je možné odstrániť odstredovaním, mikrofiltráciou alebo filtráciou a tak sa získa číry extrakt, najväčšia prednosť sa z týchto metód dáva odstreďovaniu a mikrofiltrácii. Odstreďovanie sa môže robit po rôznu dobu pri rôznych odstredivých silách. Zistilo sa, že .pätnásťminútové odstreďovanie pri 3si 3000 x g pri 4° C je dostačujúce. Tiež môže byt výhodné extrakt pred odstreďovaním zriediť, aby sa znížila typicky viskózna povaha surového extraktu z kvasinkových buniek. Zriedenie nenaruší žiadny z nasledujúcich stupňov tohoto postupu,

Mikrofiltrácia má výhodu v tom, že filtráciu a dialýzu je možné robit súčasne. Pre použitie v tomto stupni sa hodí niekoľko typov mikrofiltračných jednotiek, napríklad KROSFLO, výrobok firmy Idicrogon Inc. alebo akákoľvek z rôznych patrón s dutými vláknami, vyrábaná firmou Amicon olebo A/G Technol^ gy. Prednostná rnikrofiltračná metóda spočíva v priechode extraktu cez membránu Prostak Durapore /iáillipore/ miskovej alebo rámovej rnikrofiltrečnej jednotky, pričom membrána má veikost pórov v rozmedzí od asi 9,1 do asi 0,2 _zum a jednotka pracuje pri vstupnom tlaku asi 13,74 až asi 48,1 kPa, za použitia pufru obsahujúceho približne O,1M TRIS s pH asi

10,4 a asi 0,1 % detergentu TRITOIÍ X-100.

v

Pred realizáciou nasledujúceho stupňa tohoto postupu sa môže supernatant z odstreďovania alebo filtrát z mikroŕiltrácie skoncentroval. Koncentračný postup sa môže realizoval rôznymi metódami, ako ich neobmedzujúce príklady je možné uviesť dialýzu, filtráciu, lyofilizáciu, ultrafil.tráciu a diafiltráciu. Prednostná koncentračná metóda y/ pri spôsobe podlá vynálezu spočíva v priechode vycereného extraktu u'ltrafiltračným systémom s dutými vláknami s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti 10 . Objem vyčereného extraktu sa typicky znižuje asi 6,5 násobne, v prípade produktu z rnikrofiltrácie, a asi dvojnásobne, v prípade zriedeného produktu z odstreďovania, pričom sa získava skoncentrovaný retentát. Po tejto koncentrácii sa vretentát diafiltruje, aby sa ďalej odstránili nečistoty s nižšou molekulovou hmotnosťou. Diafiltrácia sa robí za použitia systému s dutými vláknami s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti približne 10 .

Pokial bol pridaný detergent TRITON X-100, môže sa odstránil rôznymi konvenčnými metódami, ako ich neobmedzujúce. príklady je možné uviest dialýzu, prí.davok určitých organických rozpúšťadiel, vymrazovanie, chromatograv fické oddelovanie a kontaktovanie s gélom alebo pryskyricou, ktorá špecificky viaže detergenty, ako je Extractogel /Pierce/ a pryskyrica XAD /Romicon/. Pri prednostnom spôsobe realizácie tohoto vyrnálezu sa detergent TRITuN

X·· 1 00 odstraňuje tak, že sa nechá tepelne spracovaný extrakt s obsahom TRITúIÍ X-100 cirkuloval patrónou obsahujúcou pryskyricu XAD-2 alebo ΧΑΏ-4 /polystyrén-divinylbenzénová pryskyrica/. Tepelne spracovaný extrakt sa nechá cirkulovať náplňou XAD po dobu asi 10 hodín pri 4° C a potom sa zhromaždí vo vhodnej nádobe, napríklad uzavieratelnej sklenenej flasi.

Pokial boli bunKy rozbité v pufre s vysoxou hodnotou pH, nastaví sa hodnota pH tepelne spracovaného extraktu v tejto dobe na hodnotu v rozmedzí od 7,u do 7,9, pričom hodnote pH približne 7,7 sa dáva preanost. Úpravou pH na asi

7,7 po tepelnom spracovaní, ktoré bolo realizované v súlade so spôsobom podlá vynálezu pri vysoxej hodnote pH, sa v,eími uľahčí adsorpcia obalových proteínov na široké pory oxidu kremičitého, ktorý sa používa v nasledujúcom stupni, prispôsobenie pH tepelne spracovaného extraktu S3 môže robili pred stupňom odstraňovania detergentu TRITOn X-lOO, bez toho, aby to nejako ovplyvnilo výsleaok celého postupu. Odborníkom v tomto odbore je teda zrejmé, že pri tomto spôsobe podlá vynálezu sa môže poradie stupňov, v ktorých sa robí úprava pH a odstraňovanie detergentu TRITuN X-100, obrátil bez toho, aby to malo podstatný účinok na výsledok celého postupu.

Potom sa môže HBsAg íahko oddelil od nečistôt, za vzniku v podstate purifikovaných Častíc. Prednostnou metódou odstraňovania nečistôt je adsorpcia častíc na oxid kremičitý so širokými porami. Najvačšia prednosť sa podlá vynálezu dáva metóae, pri ktorej sa povrchový proteín adsorbuje na široké póry oxidu Kremičitého, t.j. na oxid kremičitý s priemerom pórov v rozmedzí od asi 1vt) do asi 1 50 nm a veľkosti častíc v rozmeazí od asi 30 do 1JO_zum /AmiCľon/. Povrchový proteín ľahko vstupuje do pórov tohoto oxidu kremičitého a zostáva v nich zadržaný. Nečistoty kvasinkového bunečného proteínu je preto možné ľahko vypláchnuť.

Adsorpcia častíc na oxid kremičitý so sironýtmi pórmi 39 môže realizovať chromátografickým postupom alebo nechromatograficky diskontinuálnym postupom. Chromátografická ad.sorpcia sa robí tak, že sa extrakt s nastavenou hodnotou pH nechá prechádzať cez oxid kremičitý so širokými pórmi, uloženom v zariadení pre stĺpcovú chromatografiu. ubvykie sa asi 1 liter tepelne spracovaného extraKtu aplikuje na pa tcentimetrovú kolónu s duplikátorovým plástom obsahujúcu asi JOO ml /asi 1UO g sušiny/ perál oxidu kremičitého so širokými pórmi, pri prietokovej rýchlosti 2uO ml/h.

Nechromatograf ická adsorpcia na široké póry oxidu kremičitého sa obvykle realizuje tak, že sa tepelne spracovaný extrakt zmieša vo vhodnej nádobe, napríklad v uzavierateľnej sklenenej flaéi s oxidom kremičitým. V prednostnom prevedení sa asi 300 ml oxidu kremičitého so širokými pórmi pridá k asi 1 1 tepelne spracovaného extraktu v sklenenej fíasi a zmes sa udržuje za konštantného miešania prednostne po dobu asi 1,5 hodiny pri teplote v rozmedzí od asi 4 do^: asi 8° C. Môže sa však použiť i iná kontaktná doba a a iná teplota.

Premývanie oxidu kremičitého s adsorbovoným povrchovým proteínom, ktorým sa odstraňuje neadsorbovaná látka, _A ľ sa tiež môže realizovať nechroinatograf icky. Oxid kremičitý sa však tiež môže uložiť do koJ.ony a premývanie sa môže robiť v zariadení pre chromatografickú adsorpciu. Diskontinuálne premývanie sa realizuje tak, že sa tepelne spracovaný extrakt nechá vytiecť zo širokých pórov oxidu kremičitého a potom sa pridá niekoľko objemov pufru, ktorý nespôsobí uvoľnenie častíc adsorbovaných na oxide kremičitom. Prednostným pufrom je PBS. Vypustenie kvapalnej fáze z oxidu kremičitého a premývacie stupne sa opakujú 3 až 5x.

Chromátografické premývanie povrchového HBsAg adsorbovaného na oxide Kremičitom sa robí tak, že sa cez lôžko oxidu kremičitého nechá prúdit PBS prietokovou rýchiosíou približne <íOO ml za hodinu tak dlho, až je extinkcia pri 280 nm konštantná.

HBsAg. sa eluujú z premytého oxidu Kremičitého so širokými pórmi pomocou roztoku pufru, ktorého hodnota pH je približne v rozmedzí od 8,5 do 9,0· Povrchové proteíny ,· sa prednostne desorbujú za použitia roztoku pufru obsahujúceho približne 0,05 M borátu pri pH asi 8,7. Desorpcia proteínov HBsAg sa môže ulahčií zvýšením teploty v širokom rozmedzí. Prednostná teplota pri desorpčii je asi 55° C.

Nechromatografická desorpcia sa realizuje tak, že sa zmieša 1200 ml 0,05 M borátového pufru s pH 8,7 s asi 700 mJL premytých častíc oxidu kremičitého so širokými pórmi s adsorbovanými časticami. Desorpcia sa realizuje, po dobu asi 25 minút. ísluát sa zachycuje a desorpČné stupne sa dvakrát opakujú. Potom sa eluát ochladí.

Chromatogragická desorpcia sa realizuje tak, že sa Kolóna s dupiikátorovým plástom obsahujúcim premytý oxid Kremičitý zahreje približne na teplotu b5° C. u,05 M borá• tový pufer s pH 8,7 sa zahreje na 55° C a potom sa nechá prechádzal Kolónou prietokovou rýchlosťou 50u mi za hodinu. Eluát sa zachycuje a chladí. Objem eluátu je približne ekvivalentný objemu tepelne spracovaného extraktu aplikovaného na oxid kremičitý so širokými pórmi.

Obvyxle je potrebné eluovaný HBsAg koncentrovať. Prednostným koncentračným postupom je postup, pri ktorom sa eluát nechá prechádzať diafiltračným systémom s dutými 5 vláknami s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti 10 za použitia 0,05 M borátového pufru s pH 8,7. Za použitia

JO tohoto systému so objem eluovaného povrchového proteínu obvykle zníži až asi 16x. Diafiltračný retentát sa môže ✓ v sterilizovat mikrofiltráciou, pokial je to potrebné.

Obsah uhlohydrátu v časticiach sa stanovuje spôsobom ktorý popísali Dubois M. a Óolší v Anál. Chein. 28, str. 350 /1956/. Všeobecným princípom tohoto postupu je, že jednoduché cukry, oligosacharidy, polysacharidy a ich deriváty, vrátane metyléterov, s voínými alebo potenciálne y volnými redukčnými skupinami poskytujú oranžovožlté zafarbenie pri spracovaní fenolom a koncentrovanou kyselinou sírovou. Intenzita vzniknutého zafarbenia pri konštantnej koncentrácii fenolu je priamo úmerná množstvu prítomného cukru.

Praktické stanovenie obsahu uhlohydrátu vo vzorkái povrchových proteínov HDV sa robí tak, že sa 1 ml roztoku obsahujúceho ÍU až 70 yig proteínu umiestni do skúmavky. Pripraví sa séria uhlohydrátových étandárdov a slepých vzoriek. Do každej skúmavky sa pridá 1 ml 5% roztoku fenolu, obsah skúmaviek sa premieša a potom sa pridá 5 ml 96 % roztoku kyseliny sírovej a obsah skúmaviek sa znova premieta. Skúmavky sa udržujú pri teplote miestnosti,ich obsah sa premieša a znova sa udržujú 20 minút pri 25 až 30° C. Skúšanie vzoriek sa robí v spektrofotometre /Α^θ, v prípade hexos a metylovaných hexos a Α^θ^, v prípade pentos, urónovej kyseliny a ich metylovaných derivátov/. Obsah uhľohydrátov vo vzorkách HBsAg so stanoví na základe porovnania s uhlohydrátovými štanardami..

Hore uvedeným postupom sa stanovuje obsah uhlohydrátu v časticiach vytvorených v.ŕekombinantných kvasinkových bunkách divokého typu /CF54/ a v HBsAg vytvorenom v rekombi nantných kvasinkových bunkách CF52. Ha základe týchto výsledkov sa vydelením množstva uhlohydrátu /v mikrogramoch/ množstvom proteínu vo vzorke /v mikrogramoch/ vypočíta po31 mer uhľohydrátu k proteínu v každej vzorke. Výpočtom tohoto

kvasinkových bunkách mnn9~ konzistentne obsahuje jednu desatinu obsahu uhľohydrátu v HBsAg produkovanom v rekornbinantných kvasinkových bunkách divokého typu. Tieto výsledky ukazujú, že HBsAg produkovaný v mutantných kvasinkových bunkách mnn9- iná podstatne znížený obsah uhľohydrátov v porovnaní s HBsAg produkovaným v kvasinkových bunkách divokého typu.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch realizácie. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter a v žiadnom ohlade vynález neobmedzujú. Všetky uvádzané citácie predstavujú náhradu za prenesenié ich celého textu do popisu tohoto vynálezu.

Príklady realizácie vynálezu

Príklad 1

Klonovanie. HBV DNA do pBR322

Z humánnej plazmy /nosiča/ sa izolujú a purifikujú Dánske /Dane/ častice HBV /serotypu adw a ayw/ a v týchto časticiach sa pomocou endogénnej polymerázy syntetizuje dvojreíazcová DNA spôsobom, popísaným v Landers a ďalší, J. Virology, 23, 368 až 376 /1977/ a Hruška a ďalší, J. Virology 21, /1977/. DNA sa izoluje po štiepení enzýmom Proteinase. K v SDS, potom sa urobí extrakcia zmesou fenolu a chloroformu a zrážanie etanolom. Genomová DNA HBV sa štiepi EcoRI, za vzniku jedného 3,2kbp fragmentu, ktorý sa klonuje do miesta EcoRI pBR322, za vzniku pHBV/ADW-1 alebo pHBV/AYW-1. Prítomnost HBV DNA sa potvrdí štiepením EcoRI, prenosom Southern Blot na nitrocelulózu a hybridizáciou s načenými špecifickými oliginukleotidovými próbami.

- J2 Príklad 2

Klonovanie génu preS2+S do klonovacieho vektora

Plazmid pHBV/ADW-1 /popísaný v príklade/ sa štiepi EcoRI a Accl a O,8kbp fragment sa purifikuje preparatívnou elektroforézou na agarózovom gele. Tiež plazmid pUG sa štiepi EcoRI a BamHI a lineárny vektor sa purifikuje preparatívnou elektroforézou na agarózovom gele.

Pre rekonštrukciu 5*časti otvoreného čítacieho rámca preS2+S sa syntetizuje dvojica oligonukleotidov, ktoré rekonštituujú otvorený Čítací rámec pred miestom EcoRI.smerom k ATG prostredníctvom lOBp sekvencie NTL cez miesto HindlII do konca EcoRI. Tieto oligonukleotidy majú nasledujúce sekvencie:

AATTCAAGCT TACAAAACAA AATGCAGTGG (SEQIDNO: 2)

10 20 30

GTTCGAATGT TTTGTTTTAC GTCACCTTAA (SEQIDNO: 3)

10 20 30

Pre rekonštrukciu 3*časti otvoreného čítacieho rámca preS2+S sa syntetizuje druhý pár oligonukleotidov, ktoré rekonštituujú otvorený čítací rámec od miesta Accl prostredníctvom tranzlačného terminátora cez miesta HindlII do konca BamHI. Tieto oligonukleotidy majú nasledujúce sekvencie:

ATACATTTAA AGCTTG (SEQIDNO: 4)

10 16

TGTAAATTTC GAACCTAG (.SEQIDHOt 5 T

10

Dvojice oligonukleotidov sa tepelne hybridizujú a potom ligujú do vektora pUC ätiepeného EcoRI-BamHI. Výsledný vektor /2,8kbp/ sa purifikuje preparatívnou elektroforézou na agarózovom gele. 0,8kbp fragment EcoRI-AccI, vid vyššie.·, se liguje s týmto vektorom. Prítomnosť a orien' tácia otvoreného čítacieho rámca preS2+S sa potvrdí analýzou pomocou reštrikčnej endonukleázy a metodou Sothern Blot. Analýza skevencie DNA £Sanger a další, 1977J ukazuje dve substitúcie báz, ktoré majú za následok vznik omínokyselinových rozdielov v porovnaní so sekvenciou kódovanou DNA plazmidu HBpreSGAP347/19T. Pre vyhodnotenie identických polypeptidov v oboch týchto konštrukciách sa miestne orientovanou mutagenézou zmenia tieto nukleotidové substitúcie, ktoré boli T miesto C v bázi 64 /kódujúce phe miesto Leu/ a C miesto A v bázi 352 /kódujúce His miesto Gin/ fZoller a Smith, Nucleic Acids Rese search 10: 6487 až 650 /1982/J.

Flazmid obsahujúci kódujúcu oblast HBsAg bez kódujúcej oblasti preS2 sa skonštruuje nasledujúcim spôsobom: plazmid pUGHBpreS2+S /popísaný vyššie/ sa štiepi restriictnými endonukleázami EcoRI a Styl. Od DNA fragmentu kódujúceho preS2 sa oddelí velký fragment DNA /3,3kbp/, ktorý obsahuje. pUG a kódujúcu oblast HBsAg a prečistí sa preparatívnou elektroforézou na agarózovom gele. Dvojica oligonukleotidov syntetickej DNA

AATTCAAGCľ TACAAAACAA AATGGAGAAC ATCACATCAG

10 20 30 40

GATTC (SEQIDHO: 6)

GTTCGAATGT TTTGTTTTAC CTCTTGTAGT GTAGTCCTAA

10 20 30 40

GGATC (SEQIDNO: 7) sa potom liguje s fragmentom pUCHBsAg. Táto dvojica syntetických oligonukleotidov obsahuje 5*EcoRI a 3'styí Lepivé konce a súčasne poskytuje miesto HindlII, ktoré hneď nasleduje za miestom 5'EcoRI. Okrem toho dvojica oligonukleotidov syntetickej DNA obsahuje kodon HBsAg ATG, pred ním stépreloženú lObp vedúcu sekvenciu a za ním 21 nukleotidov obsahujúcich miesto Styl.

Tento oLigonukleotidový pár znovu vystaví úplnú kódujúcu oblasť HBsAg a umožňuje jej nasledujúce odstránenie v neporušenom stave z vektora na bázu pUC štiepením HindlII.

DNA vektor pUC-HBsAg s ligovaným oligonukleotidovým párom DNA popísaným vyššie sa použije pre transformáciu E coLi. Selekciou sa oddelia rekombinantné plazmidy, ktoré obsahujú úplne rekonštruovanú kódujúcu oblasť pre HBsAg. Z rekombinantného plazmidu sa štiepením HindlII a nasledujúcou izoláciou a purifikáciou 0,7 kbp HBsAg DNA preparatívnou elektroforézou na agaró-. ... zovom gele odstráni otvorený čítací rámec úplného HBsAg, za účelom klonovania do expresného vektora vektora.

P r í k. L a d 3

Klonovanie otvoreného čítacieho rámca HBsAg do troch rôznych expresných vektorov

Pre konštrukciu expresných kaziet HBsAg sa použijú tri rôzne expresné vektory. Nedávno popísaná expresná kazeta s promotorom GAP49L /Kniskern a ďalší, 1986, Gene 46,str. 135 až 14.1/ sa skladá z asi l,lkbp glyceraldehyd.-J-fosfát dehydrogenázového /GAPDH/ promotora a asi 350bp kvasinkového alkohol: dehydrogenázovéhc L /ADH1/ terminátora v hlavnowretazci pBR322 s jediným miestom HindlII medzi promotorom a terminátorom. Otvorený čítací rámec HBsAg z príkladu 2 sa Liguje v jedinom mieste HindlII a jeho prítomnosť a orientácia sa po* tvrdí analýzou pomocou reštrikčnej endonukleázy a metódou Southern Blot.

3.5

Alternatívne sa 0,5kbp promotorom GALIU /Schlutz a ďalší, 1987, Gene 54, str.113 až 123/ nahradí l,lkbp promótor GAP v hore uvedenej konštrukcii a L,25kbp promotorom ADH2 /Kniskern a ňalsí, 1988, Hepatology 8, 82 až 8// sa nahradí promotor GAP /viď obr. 1/.

V každom z týchto prípadov sa expresná kazeta obsahujúca špecifický promotor, otvorený čítací rámec HBsAg a terminátor ADH1 kJLonuje? do shuttle vektora pCl/1 /Beggs, viá. hore uvedená citácia; Rosenberg a áalší, viá hore uvedená citácia/ za vzniku kvasinkového expresného vektora, ktorý, sa potom použije pre áalej popísanú tranformáciu kvasinky

S. cerevisiae.

Príklad 4

Konštrukcia mutantného kvasinkového kmeňa S, cerevisiae CF52 /mnn9~/

V

Kmeň kvasinky S. cerevisiae KHY1O7 /cir ,adel ,leu2 a mnn9-/ sa skonštruuje nasledujúcim spôsobom. Kmeň <k -párovacieho typu CZ5/LB347-1C /mnn9-,SUCZ / sa páruje s kmeňom typu a 2150-2-3 /leu , adel / zmiešaním kmeňov na miske s úplným médiom YEHD. Z dôvodu selekcie diploidov sa párované kmene replikujú na miske s leu minimálnym médiom obsahujúcim 2 % sacharózy ako jediný zdroj uhlíka. Po izoLácii jednctlivých kolonií _ diploidy sporulujú a ich asci sa štandardnou technikou rozrežú. Kmeň KHY-1.07 sa izoluje ako jediná spóra a charkterizuje ako cir⁺,adel⁺,leu2 a mnn9~/technikou Schiffovho farbenia/.

Kmeň KHY107 /cir⁰/ sa odvodí od kmeňa KHY-107/cir⁺/ spôsobom, popísaným v Broach, Methods in Enzymology 101, čast C, str. 307 až 325 /1983/. Opravený kmeň sa prevedie ma uraj“ integráciou rozštiepeného génu ura3. Výsledný kmeň KHY-107ura3delta sa pestuje na bohatých médiách, aby sa umožnila akumulácia spontánnych mutácií. Selektuje sa kanavanin-rezistentný mutant. Komplementačnými testami sa potvrdilo, že mutantný kmeň CF55 má povalu canl. Expresná kazeta GAL10pGAL4 sa integruje do génu His3 CF55£Methods in Enzymology, 1990, 185, str. 297 až 3O9J, za vzniku finálneho hostiteiského kmeňa CF52 /Mata leu-2,112 urajdelta canl his3deita: :ΟΑί1ΟρΟΑ14-ίΓΗΑ3, cir° /.

Príklad 5

Transformácia kvasinky a zaistenie zárodkov pre HBsAg na mutantné kvasnice CF52 mnn9Plazmid pCl/lpGALlO-HBsAg-tADH-1, popísaný. . v príklade 3 sa použije k transformácii kmeňa S. cerevisiae CF52. Klony sa selektujú na minimálne m diuitt /leu-, s obsahom IM sorbitolu/, uložia sa vo forme zmrazených vzoriek /v 17 % glycerole/ a vyhodnocujú sa Šalej popísaným sposobom.

Príklad 6

Rast a expresia génu HBsAg za promótorom GALLO v kvasinke CF52 /mnn9-/

Klony kvasinky obsahujú expresný plazmid popísaný v príklade 5 sa nanesú na misky s leu- selektívnym agarom obsahujúcim IM sorbitol a misky sa 2 až 3 dni inkubujú pri 30° C· Táto kvasinka sa inokuluje do 5 až 7 ml komplexného YEHD média s IM sorbitolam /toto médium je Šalej označované skratkou YEHDS/ a vzniknuté kultúry sa 12 až 18 hodín inkubujú pri 30° C za súčasného prevzdušňovania. Nádoby obsahujúce 50 ml YEHDS s 2 galaktóz.y sa inokulujú vyääie uvedenou kultúrou na počiatočnú hodnotu ^A600 ^{= 0,1 8} ^^iúry ^sa inkubujú pri 30° C za súčasného trepania pri frekvencii otáčania trepačky 350 min po dobu 72 hodín, až do finálnej hodnoty Α^θθ 10 až

16. Vzorky z desiatich jednotiek ^a5qq ^sa uložia do skúmaviek a kvasinkové bunky sa peletizujú lu minútovým odstre pri 2000 x g.

Skúšanie vzoriek sa robí buď hneď alebo sa vzorky uložia v zmrazenom stave pri ύ-70^σ C. V obe skúšania sa pelety resuspendujú v 0,4 ml fyziologické ;o soľného roztoku pufrovaného fosfátom s obsahom 2mM fenylmetylsulfonylfluoridu /PMSFP. Kvasinkové bunky sa rozbijú 1/ prídavkom 200 až 300 mg omytých sklenených perál ./ s priemerom 0,45 mm/, 2/ miešaním vo vírivom mixéri po dobu 15 minút, 3/ prídavkom povrchovo aktívnej látky TRITON X-100 do koncentrácie 0,5 % objemového, 4/ dvojminútovým miešaním vo vírivom mixéri a 5/ desať až pätnásť minútovou inkubáciou pri 4° C. Rozdrtené zvyšky buniek a sklenené per. y sa odstredia desaťminútovou centrifu.íáciou pri 13000 x g. Vyčerený supernatant sa oddelí a stanoví sa v ňom proteín /metódou podľa Lowry a ďalší, J, Biol. Chem. 193, 265 /1951/ a HBsAg pomocou skúšky AUSRIA ^K /Abbott/. Typické výsledky skúšok sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.

Tabulka I

Popis vzorky /trepacie fľaš	AUSRlA/ug/mg/ íe/ proteínu	rozbíjanie buniek	úroveň P24 /imunoblot/
mutant mnn9-	/0,55; 0,61; 0,53;/	sklenené
		perly	+++
divoký typ	/1,8/	sklenené
/nmn9+/		perly	+

Príklad 7

Kultivácia S. cerevisiae /mnn9-/ produkujúceho HBsAg vo veľkom merítku vo fermentoroch

Zmrazená kultúra rekombinantných kvasiniek sa inokuluje na misky s leu- agarom s obsahom IM sorbitolu a misky sa v obrátenej polohe inkubujú 2 až 3 dhi pri 28° C. Nárast na miskách sa resuspendujé v YEHDS a resuspendovaný nárast sa prevedie do dvojlitrovej Erlenmayerovej banky obsahujúcej 500 ml YEHDS a 2 % galaktózy. Banka sa inkubuje pri 28° C a frekvenciou otáčania 350 min v trepanom inkubátore s kontrolovaným prostredím po dobu 18 až 22 hodín. Tieto očkovacie kultúry sa potom použijú pre inokuláciu nádob v produkčnom stupni.

Inokulum /1 až 5 % objemových/ z jednej alebo viacerých baniek sa prenesie do 16-litrového alebo 250-litrového fermentora obsahujúceho 10 1 alebo 200 1 YEHDS. 16-litrové fermentory sa prevádzkujú pri frekvencii otáčania 500 min”\ rýchlosti prevzdušňovania 5 1/min a teplote 28° C. 250-litrové fermentory sa prevádzkujú pri frekvencii otáčania 160 min , rýchlosti prevzdušňovania 60 1/min a teplote 28° C. Zber sa robí po 40 až 46 hodinách od inokulácie očkovacou kultúrou. Obvykle sa dosiahne hodnbt optickej hustoty 15,0 /'jednotky Α^θ/. Zber sa robí tak, že sa bunky skoncentrujú za použitia filtračného zariadenia s dutými vláknami, potom sa bunky premyjú pufrovanými soľnými roztokmi. Bunečné suspenzie sa podrobia ďalej uvedenému skúšaniu alebo sa skladujú v zmrazenom stave pri -70° C, za účelom ďalšieho spracovania alebo analýzy.

Malé vzorky/0,6 ml/ 20 % premytých bunkových suspenzií sa rozbíja za použitia sklenených perál /priemer 0,45 až 0,52 mm/ v 1,5 ml Eppendorfových skúmavkách. Ako inhibítor proteázy sa pridá PMSF /6,5 ul 2(J0mM zásobného roztoku/. Po rozbití buniek sa zo skúmaviek odoberú alikvotné vzorky, ktoré sa zmrazia pri -70° C pre imunoblotovú analýzu. K zostávajúcej časti vzorky v skúmavke sa pridá vždy detergent TRITON X-100 do konečnej koncentrácie 0,5 %,vzorky sa krátko premiešajú a 20 až 40 minút inkubujú pri 4° C. Rozdrvené zvyšky buniek sa oddelia centrifugáciou a vyčerený bunečný extrakt sa skúša na antigén skúškou AUSRIA^^R\ a na proteín /JLowry/.

Príklad 8

Purifikácia proteínu S v časticovej forme pomocou imunitnej afinitnej chromatografie

Rekombinantný kmeň S. cerevisiae skonštruovaný spôsobom popísaným v príklade 5 sa kultivuje buď v bankách alebo vo fermentoroch. Kvasinkové bunky sa pozbierajú mikrofiltráciou v jednotke Amicon DC-10, suspendujú v 30 ml pufru A O,1M Na₂HPO₄, pH 7,2, 0,5M NaCl a rozbijú v

Stanstedovej tlakovej komore v priebehu siedmich priechodov za tlaku 515_}2 až 584 kPa. Suspenzia rozbitých buniek /hmotnosť vlhkých bunie 31 g/ sa zriedi 120 ml pufru A, pridá sa k nej detergent TRITON X-100 do konečnej koncentrácie 5 g/1 a suspenzia sa vyčerí centrifugáciou pri 10000 x g po dobu 20 minút pri 4° C. Vyčerená kvapalina sa dekantuje a inkubuje so Sepharose 4B s naviazanými protilátkami proti HBsAg /McAleer a ďalší, Náture, 307: 178 /1984/ po dobu 19 hodín pri 4° C, aby sa antigén adsorboval na pryskyricu. Po tejto inkubačnej perióde sa suspenzia zahreje na teplotu miestnosti, pri ktorej sa realizujú všetky ďalšie stupne a za vákua odplynia /15 minút/. Odplynená suspenzia sa naleje do kolóny 2,5 x 40 cm. Po úplnom naplnení kolóny sa nenaviazaný proteín vymyje pufrom A. Antigén sa eluuje 3M tiokyanatanom draselným v pufru A. Frakcie obsahujúce antigén sa dialyzujú proti roztoku 0,007M dinátriumhydrogénfosfátu /s pH 7,2, 0,15 M chloridu sodného pri 4° C a spoja sa, za vzniku dialyzovaného produktu obsahujúceho 1,08 mg proteínu v 20 ml. 16 ml tohoto dialyzovaného produktu sa zriedi na koncentráciu 40/ig/ml 5,6 ul 0,006M roztoku Νβ2ΗΡ0^, pH 7,2, 0,15M NaCl. Produkt sa sterilizuje filtráciou cez membránu Millex-GV /0,22/im/. Identita látky v dialyzovanom produkte sa overí detekciou, reakti-ŕ R ) vitý HBsAg pomocou skúšky AUSRIA ·

Tabuľka II

Popis, vzorky /fermentory/

AUSRIA /^ug/mg/ proteínu rozbíjanie buniek rautanť mnn9” /1,13; 1,10; 1,06;/ sklenené perly mutant mnn9 /3,1; 4,4;/ divoký typ /3,3/

Manton-Gaulin

Manton-Gaulin

Príklad 9

Purifikácia rekombinantného HBsAg vo veľkom merítku

Asi 250 g zmrazenej bunečnej pasty /produkujúcej rekombinantný proteín S sa resuspenduje na koncentráciu 170 g/1 /vlhká hmotnosť, celkový objem asi 1500 ml/ vo fosfátom pufrovanom fyziologickom soľnom roztoku /PBS/. Bunky sa zahrejú na 45° C ponorením do vodného kúpeľa. Pri tejto teplote sa bunky udržujú po dobu 15 minút a potom sa ochladia na ľade na asi 10° C. Ďalej sa bunky rozbijú dvoma priechodmi

Gaulinovým homogenizátorom.

Po homogenizácii sa pridá 10 % TRITON X-100 až do konečnej koncentrácie 0,3 % a zmes sa asi 15 minút mieša. Bunečný extrakt sa odstrekuje 20 minút pri 4° C a 3600 x g a oddelí sa supernatant.

Tento supernatant sa pasážuje cez stĺpec obsahujúci asi 200 g pryskyrice XAD-2, aby sa odstránil TRITON X-100. Vytekajúci prúd sa potom priamo pasážuje cez kolónu obsahujúcu asi 150 g oxidu kremičitého so širokými pórmi /veíkosl pórov približne 150 nm a veíkosl častíc približne 50 um/. Použitá kolóna má priemer 5 cm /Pharmacia/ a prevádzkuje sa pri prietokovej rýchlosti asi 200 ml/h.

Stĺpec oxidu kremičitého sa premýva PBS tak dlho, dokiaí sa Α£θθ nevráti na základnú líniu.

Proteín S sa zo stĺpca oxidu kremičitého eluuje za použitia najprv chladného boritanového pufru /50mM, pH 8,7, 4° C/, pri prietokovej rýchlosti približne 500 ml/h tak dlho, dokiaí nie je pozorovaný nárast Α2θθ· Keď začne stúpal, kolóna sa zahreje na 50° C a začne sa do nej uvádzal boritanový pufer o teplote 55° C prietokovou rýchlosťou približne 500 ml/h. Eluát obsahujúci preteín S /približne 1 liter/ sa zachycuje na íade. Eluát sa skon“ centruje približne na 200 ml diafiltráciou proti 50 mM boritanového pufru s pH 8,7 za použitia diafiltračnej jednotky s dutými vláknami s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti 10 . Potom sa odfiltruje proteín S na filtri s otvormi 0,2 um a uloží sa. Tento produkt je stály a nie je u neho pozorovaná žiadna významná degradácia podía analýzy Western Blot.

Príklad 10

Stanovenie obsahu uhľohydrátu v rekombinantných povrchových proteínoch HBV

Obsah uhľohydrátu v rekombinantných povrchových proteínoch HBV sa stanovuje sposobom, ktorý popísali Duboi M, a ďalší v Anál. Chem. 28, str. 350 /1956/. Všeobecným princípom tohoto postupu je, že jednoduché cukry, oligosacharidy, polysacharidy a ich deriváty, vrátane metyléterov, s voínými alebo potenciálne voľnými redukčnými skupinami poskytujú oranžovožlté zafarbenie pri spracovaní fenolom a koncentrovanou kyselinou sírovou. Intenzita vzniknutého zafarbenia pri konštantnej koncentrácii fenolu je priamo úmerná množstvu prítomného cukru.

Pri praktickej realizácii stanovenia ohsahu uhľohydrátu v HHsAg produkovanom v kvasinkovom kmeni divokého typu a kvasinkovom kmeni mnn9“ sa postupuje nalsedujúcim spôsobom: 1 ml rozotku obsahujúceho 10 až 70 ug proteínu sa umiestni do skúmavky. Pripraví sa séria uhlohydrátových štandárd a slepých vzoriek s rôznym obsahom uhľohydrátu. Do každej skúmavky sa pridá 1 ml 5 % roztoku fenolu, obsah skúmaviek sa premieša a potom sa pridá 5 ml 96 % roztoku kyseliny sírovej a obsah skúmaviek sa znova premieša. Skúmavky sa udržujú 10 minút pri teplote miestnosti, ich obsah sa premieša a znovu sa udržujú 20 minút pri 25 až 30° C. Skúšanie vzoriek sa robí v spektrofotometri /Α^θ, v prípade hexos a metylovaných hexos a Α^θθ, v prípade pentos, urónovej kyseliny a ich metylovaných derivátov/. Obsah uhľohydrátov vo vzorkách povrchového proteínu HBV sa stanoví na základe porovnania s uhlohydrátovými štandardami.

Na základe týchto výsledkov sa vydelením množstva

3 uhľohydrátov /v mikrogramoch/ množstvom proteínu vo vzorke /v mikrogramoch/ vypočíta pomer množstva uhľohydrátu k proteínu v každej vzorke, ktorý je dalej uvedený.

Pomer uhľohydrátu k proteínu v HBsAg kvasinkový kmeň uhlohydrát/proteín mnn90,05 vzhíadom ku glykozylácii divoký typ /mnn9⁺/

0,5’6

Výpočtom tohoto pomeru sa zistí, že HBsAg produkovaný v rekombinantných kvasinkových bunkách mnn9” konzistentne obsahuje jednu desatinu obsahu uhľohydrátu v HBsAg produkovanom v rekombinantných kvasinkových bunkách divokého typu. Tieto výsledky ukazujú, že HBsAg produkovaný v mutantných kvasinko.yých bunkách mnn9- má podstatne znížený obsah uhľohydrátu v porovnaní s HBgAS produkovaných v kvasinkových bunkách divokého typu.

Soznam sekvencií (1) Všeobecné informácie íi) Prihlasovateľ:

Kniskern, P. J.

Hagopian, A.

(ii) Názov vynálezu: Povrchový proteín vírusu

Hepatitis B, so zníženým obsahom uhľohydrátu z hostiteía (iii) Počet sekvencii: 9 (iv) Adresa pre koreápodenciu:

(A) Meno: Merck.§ Co. Inc.

(B) Ulica: P.O. Box 2000

(.C) Mesto: Rahway (D) Štát: New Jersey (E) Krajina: USA » (F? Poštové smerovacie číslo: ZIP : 07065-0900 » (V) strojovo čitateiná forma:

(A) stredný typ: floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilný (jC) operačný systém: PC-DOS/MS-DOS

CD) software: Patentln Release č.1.0, verzia ^1,25 (vi) Údaje: o súčasnej prihláške:

(A) Číslo prihlášky: nie je k dispozícii (B) Dátum podania: nie je k dispozícii (G) Klasifikácia: nie je k dispozícii (vii) Informácie o zastúpení:

• (A) Meno: Pfeiffer, Hesna J.

(B ) Registračné číslo: 22 640 (CJ Referenčné číslo spisu: I8J46 (vili) Telekomunikačná informácie:

(A) Telefón: 908 594-4251 (B) Telefax: 908 594-4720 (2) Informácie o SEQ ID NO: 1:

(í) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka 10 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovost: jeden reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA /genomová/ í

(xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO:1 ACAAAACAAA.

(2) Informácie o SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristika sekvencie: (AJ DÍžka: 30 párov báz (B? Typ: nukleová kyselina (C) Retazovosť:. jeden retazec (D? Topológia: lineárna (ii') Typ molekuly: DNA /genomová/ (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO.2

AATTCAAGCT TACAAAACAA AATGCAGTGG (2) Informácia o SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍŽka: 30 párov báz (B ) Typ: nukleová kyselina (C) Reťa zovosť: jeden reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA /genomová/

Qxi) Popis sekvencie: SEQ ID NO.3

GTTCGAATGT TTTGTTTTAC GTCACCTTAA 30 (2) Informácie o SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristika sekvencie:

(Al DÍžka· L párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reiazovosi: jeden reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA /genomová/ (_xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 4

ATACATTTAA GCTTG 15 (2) Informácia o SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A⁵* DÍžka: 18 párov báz (B) Typ:: nukleová kyselina ^C) Relazovosť: jeden reíazec (D) Topológia: lineárna (ii^ Typ molekuly: DNA /genomová/ ςχί) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 5

TGTAAATTTC GAAGCTAG 18 (2) Informácia o SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristika sekvencie:

CA) DÍžka: 45 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Ketazovosť: jeden retazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA /genomová/ (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO.6

AATTCAAGCT TACAAAACAA AATGGAGAAC ATCACATCAG GATTC 45 (2) Informácie o SEQ ID NO: 7:

(i.) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 45 párov báz _LB ) Typ: nukleová kyselina (C) Relazovost: jeden retazec (D) Topologia: lineárna ( ii} Typ molekuly: DNA /genomová/ (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 7

GTTCGAATGT TITGTTTTAC CTCTTGTAGT GTAGTCCTAA GGATC *5 (2) Informácie o SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A') DÍžka: 29 párov báz (B) Typ* nukleová kyselina (C J Retazovosí: jeden retazec (D) Topológia: lineárna (ií) Typ molekuly: DNA /genomová/ (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO.

AATTGTCGAC AGCTAGCTGA ATTCCCGGG 29 ( 2) Informácia o SEQ ID NO: ::

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: párov báz (B'' Typ: nukleová kyselina (C) Reť azovosť: jeden reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA /genomová/ (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO.

AGCTCCCGGG AATlCAGCTA GCTGTCGAC ,₀

Claims (16)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Eukaryotický expresný systém pre produkciu rekombinantných polypeptidov a proteínov obsahujúcich zníženú koncentráciu uhlohydrátu alebo glykoproteínov z hostiteľskej bunky.

2. Expresný systém podlá nároku 1, kde eukaryo- , tickým hostiteľom je kvasinka.

3. Expresný systém podľa nároku 2, kde kvasinkovým hostiteľom je Saccharomyces cerevisiae.

4. Expresný systém podľa nároku 1, kde rekombinantným polypeptidom alebo proteínom je polypeptid alebo proteín vírusu Hepatitis B.

5. Expresný systém podľa nároku 4, kde polypeptidom alebo proteínom vírusu Hepatitis B je obalový polypeptid alebo proteín.

r

6. Expresný systém podľa nároku 5, kde polypeptidom t alebo proteínom. vírusu Hepatitis B je HBsAg.

7, produkovaný v rekombinantných kvasinkových bunkách, ktoré sú geneticky deficientné, čo sa týka glykozylácie proteínu.

7. Povrchový proteín vírusu Hepatitis B vytvárajúci častice s podstatne zníženým obsahom strhnutého uhlohydrátu alebo glykoproteínu.

8, kde genetická deficiencia kvasinkovej bunky je v géne mnn9.

8. Povrchový proteín vírusu Hepatitis B podľa nároku

9. Povrchový proteín vírusu Hepatitis B podlá nároku

10. Povrchový proteín vírusu Hepatitis B podlá nároku 7, kde pomer uhlohydrátu k proteínu v purifikovanom povrchovom proteíne je nižší ako 0,5.

*

Lk.

Očkovacia látka proti vírusu Hepatitis B pre , použitie u Íudí, vyznačujúca sa tým, že obsahuje povrchový proteín vírusu Hepatitis B vytvárajúci častice s podstatne zníženým obsahom strhnutého uhlohydrátu alebo' glykoproteínu.

12. Očkovacia látka podlá nároku 5, produkovaná v ŕekombinantných kvasinkových bunkách, ktoré sú geneticky deficientné, čo sa týka glykozylácie proteínu.

13. Očkovacia látka podlá nároku 12, kde genetická deficiencia je v géne mnn9.

_r

14. Očkovacia látka podlá nároKu 11, kde pomer uhlohydrátu k proteínu v povrchovom proteíne je nižší ako

0,5.

15. Imunologické diagnostické činidlo, vyznačujúce sa t. ý m, že obsahuje proteín vírusu Hepatitis B vytvárajúce častice s podstatne zníženým obsahom uhľohydrátu alebo glykoproteínov strhnutých z hostiteľskej bunky, pričom ten proteín vykazuje reaktivitu s prírodné sa vyskytujúcimi proti-kvasinkovými protilátkami·

16. Imunologické diagnostické činidlo podlá nároku 15, v ktorom pomer uhlohydrátu k proteínu v purifikovanom povrchovom proteíne je nižší ako 0,5.