JPH02449A - ペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はペプチドの製造法に関する。さらに詳しくは、
本発明はＢ型肝炎ウィルス表面抗原活性を有するペプチ
ドの製造法およびその製造法に用いられるＤ　Ｎ　Ａお
よび真核細胞に関する。

（従来の技術およびその問題点） Ｂ型肝炎は、特に熱帯アフリカ、東南アジアおよび極東
において多発するウィルス性疾但であり、慢性肝炎や肝
硬変、さらには原発生肝ガンの原因にもなることか疫学
的に示唆されている。病因は、Ｄ　Ｎ　Ａウィルスの１
種であるＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）で、それは直径＝
１２ｎｍの球状粒子で発見者の名を冠してチン（Ｄａｎ
ｅ）粒子と呼ばれる。その外層に存在するエンベロープ
（ｅｎｖ）蛋白中には、表面抗原（ＩＩＢｓＡｇ）Ｓ、
ＭおよびＬ蛋白があり、その抗原性の違いによってａｄ
ｒ、　ａｄｗ、　ａｙｒ、　ａｙｗなどのサブタイプに
分けられているが、日本で見いだされるのはａｄｗ型お
よびａｄｒ型である。

■３型肝炎ル者の血中には、チン粒子のほかに小型粒子
や管状粒子が検出され、これらの粒子にはチン粒子と同
じ型のＨＢｓＡｇが認められている。

ウィルスの表在性抗原に対する抗体がそのウィルスの感
染を防御することは他のウィルスでも知られており、Ｈ
ＢＶの場合にもＨＢｓＡｇをもとにＢ型肝炎に対するワ
クチンの製造が考えられる。ところが、ＨＢＶはヒトや
チンパンノーにしか感染せず、培養細胞への感染の試み
は成功していない。

そのため１１１３　ｓΔｇはヒト感染者＋ｆＩｌ中から
の入手に限定されており、得られた小型粒子などは診断
用試薬の（オｆ、−１としての需要を、黄たしてら、ワ
クチンの大１１１の製造のためには不十分な状態である
。

分子生物学の最近の進歩により非細菌性の蛋白質をコー
ドするＤ　Ｎ　Ａを微生物や動物細胞に導入し、発現さ
けることが可能になってきた。この遺伝子組換えの技術
を応用し、　ｅｎｖ蛋白中のＨＢｓＡ　ｇ　　Ｓ　（＋
’２５）蛋白遺伝子を酵は内［Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、
Ｐら、　Ｎａｔｕｒｅ（ネイチｙ　　）、２９８．３４
７（１９８２）；Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ、Ａ、ら、　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ブロン
−ジンゲス・才ブ・ザ・ナンヨナル・アカデミ−・オフ
・サイエンセス）ＵＳＡ、　８０．１（１９８３）；１
１ｉｔｚｅｍａｎ　Ｒ＝〜、ら、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１
ｄｓ、　Ｒｅｓ、（ヌクレイツク・アノッズ・リサーチ
）Ｉｌ、　２７４５（１９８３）；１１ａｒｒｏｒｄ　
Ｎ、ら、　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌＳｔａｎｄａｒｄｉｚａｔ　１ｏｎ（デベ
ロップメント・イン・）＜イオロジカル・スタンダーデ
イゼーンヨン）５４゜１２５（１９８３）＋　Ｍｕｒｒ
ａｙ、に、ら、　ＥＭＢＯＪ、（ザ・エンボ・ジャーナ
ル）、３．６４５（１９８４）：　Ｃｈｏｏ、に、Ｂ、
ら、　ＢｉｏｃｈｅＩＩｌＢｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、
　Ｃｏｍｍｕｎ、（バイオケミカル・アンド・パイオフ
イノカル・リサーチ・コミュニケーションズ）、１３１
．１６０（１９８５）コで発現させ、ＨＢ　Ｖ感染のな
いｌ−ｌＢｓＡｇを作製し、ＨＩ３ワクチンとして開発
されるに至っている。また、最近では、ｅｎＶ蛋白中の
ＨＢｓＡｇ　　Ｍ蛋白（Ｐ３１）遺伝子［ＩＬｏｈ、Ｙ
、ら。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ
ｍｍｕｎ、、　１３８．２６８（１９８６）：　Ｉｔｏ
ｈ、Ｙ、　＆　Ｆｕｊｉｓａｗａ、Ｙ、、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　１４１．９４２（１９８
６）］やＬ蛋白（Ｐ３９）遺伝子［Ｄｅｈｏｕｘ、Ｐ、
ら、　Ｇｅｎｅ（ノーン）、４８．１５５（１９８６）
］が酵母内で発現されている。これら菌体内に生成され
た遺伝子産物は、いくつかの精製過程をへてはじめて単
離することが出来るのが通常である。らし該産物が培地
中へ分泌されるならば、産物の精製単離はきわめて容易
になることが予想される。

動物細胞を宿主に用いてＳやＭ遺伝子を発現させろと、
Ｓ蛋白粒子［Ｌｉｕ、Ｃ，Ｃ，ら、　ＤＮＡ、　１．２
１３（１９８２）；　Ｍｏｒｉａｒｔｙ、Ａ、Ｍ、ら、
　Ｐｒｏｃ、　ＮａＬｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７８．２６０６（１９８１）；　
Ｄｕｂｏｉｓ、Ｍ、Ｆ、ら。

Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ［ｌ　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ、　　７７、　４５４９（１９８０）；Ｃｈｒｉｓ
ｔｍａｎ、Ｊ、Ｋ　　ら、　　ｌ”ｒｏｃ、　　−１ａ
ｔ１．　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

７９、１３１５（１９ｇ２）１．ＳとＭ蛋白の混合粒子
［Ｍｉｃｈｅｌ。

Ｍｌｌ、ら　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ、　８４．７７０８（１９８４）；　！
＋！１ｃｈｅ１．Ｍ、Ｌ。ら、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ（バイオテクノロジー）、３．５６１（１９８
５）］が培地中に分泌されることは知られている。しか
し、培養の煩雑さや経済性を考慮すると、動物細胞はは
るかに不（１１である。しｆ二がって酵母か該ｅｎＶ蛋
白を培養液中に分泌するならば、細胞を培養液から分離
するだけで細胞由来の夾雑物の混入が大幅に低減でき、
免疫原の分離精製か簡素化されると予想される。

しかしながら、酵母組換え体がｅｎｖ蛋白粒子を培地中
に分泌する例は従来まったく知られていない。

一方、Ｉ−１１３Ｖに感染し、発症した急性肝炎患者の
血清中には、Ｉ−１１３ｓ抗原−抗１１Ｂｓ抗体系、　
Ｉ−（Ｂ　ｃ抗原−抗ｔｌ　Ｂ　ｃ抗体系、　ＨＢ　ｃ
抗原−抗１−Ｉ　Ｂ　ｅ抗体系に先立って、ｐｒｅ−８
抗原−抗ｐｒｅ−９抗体系か誘導されることが知られて
いる［Ａ、Ｒｏｂｅｒｔ　ＮｅｕｒａＬｈら、　Ｎａ［
ｕｒｅ、３１５．１５４（１９８５）］。ｐｒｅ　−Ｓ
抗原お上び抗ｐｒｅ−Ｓ抗体がＩＩＢＶの感染成立、Ｂ
型肝炎の発症機序や予防などの而でどのような役割を果
たしているかが注目されている。特に、ｐｒｅ　−Ｓ領
域内のｐｒｅ　−Ｓ　２ベプヂドに対する抗血清はｒ−
１１３■を中和すること［Ａ、Ｒｏｂｃｒｔ　Ｎｅｕｒ
ａｔｈら、　Ｖａｃｃｉｎｅ（ワクチン）、　４．３５
（１９８６）コやｐｒｅ　−Ｓ　２ペプチドワクチンに
よってＩ−Ｉ　Ｂ　Ｖによる急性肝炎の発症は予防され
ることか、ヂンパンジーを用いた実験で最近証明されて
いる　［Ｙ、Ｉｔｏｈら、Ｐｒｏｃ、　ＮａｔｌＡｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３．９１７４（１９８６
）］。また、ｐｒｅＳ領域内のｐｒｅ　−Ｓ　ｌペプチ
ドに対する抗体がＩ］ＢＶと肝癌由来細胞との結合を阻
止することが報告されている［Ａ、Ｒｃ）ｂｅｒｔ　Ｎ
ｅｕｒａｔｈら、Ｃｅ１ｌ（セル）４６、４２９（１９
８６）］。このように抗ｐｒｅ　−Ｓ抗体の重要性が認
識されるにつれ、抗ｐｒｅ　−Ｓ抗体を誘導しうる新型
のＢ型肝炎ワクチンの開発が期待されている。Ｍｉｃｈ
ｅｌら　［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　ｔｌｓＡ。

８１、７７０８（１９８４）］は、動物細胞（ＣＨＯ細
胞）にＬ蛋白遺伝子を導入し、ＭとＳ蛋白を含むＨＢｓ
Ａｇ拉子を産粒子ている。修飾Ｍ蛋白遺伝子が導入さ４
％た酵母では、Ｍ蛋白ＣＧＰ３７とＧｌ”３４）から構
成されたｌｌｌＥｓＡｇｌｌＢｓＡｇ拉子ことが知られ
ている（Ｙ、ｆｔｏｈ　＆　ＹＪｕｊｉｓａｖｔａ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、、　１４１．９４２（＋９８６）コ。最
近では、Ｌ蛋白遺伝子か酵母で発現され、分子量３９ｋ
Ｄａの蛋白（ｅ３９）が産生されている［Ｐ、Ｄｅｈｏ
ｕｘら、　Ｇｅｎｅ、イ８，１５５（＋９８６）］。し
かしながら、ｌ−ｌＢｓＡｇの生産端は、市販のキット
、Ａｕ５ｒｉａ（オースリア）ＩＴ（アボット社製）で
測定されたところ、培養液ＩＱあたり約２５μｇ（総蛋
白１ｍｇあたり０１〜０．２μｇ）と粁しく低いレベル
であった。これは、酵母によるＩ−Ｉ　Ｂ　ｓＡｇ　　
Ｓ蛋白粒子の生産虫や酵母によるＩ−１［ｓＡｇＭ蛋白
粒子の生産ｍに比べて粁しく低いものである。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、まずＨＢＶ　ｅｎｖ蛋白を酵母において
細胞外に分泌生産させる方法を開発すべく研究を開始し
た。

分泌蛋白は膜結合型ポリゾームで合成され、粗面小胞体
の内腔に隔離され、ゴルジ装置１分泌顆粒をへて細胞外
へ分泌される［Ｂｌｏｂｅｌ、Ｇ、　＆Ｄｏｂｂｅｒｓ
ｔｅｉｎ、Ｂ、、　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、（ジ
ャーナル・オブ・セル・バイオロジー）、　６７、８３
５（１９７５）］。

この分泌蛋白質の遺伝子を調べると、該蛋白質のコード
領域の直前にほとんど例外なくシグナルペプチドをコー
ドする領域が存在していることが明らかにされている［
Ｗａｌｔｅｒ、Ｐ、ら、　Ｃｅ１ｌ、　３８．５（１９
８４）］。つまり、このシグナルペプチドが蛋白質の分
泌への方向付けをしていると考えられている。

ところが、動物細胞で発現されたｅｎｖ蛋白、　Ｉ（Ｉ
３ｓＡｇ　　ＳとＭは他の分泌蛋白とは異なり例外的に
シグナルペプチドに相当するものがないにしかかわらず
、細胞外へ分泌される特異な蛋白質である。

この場合には、該ＨＢｓＡｇは最初、粗面小胞体の膜蛋
白として生成され、該膜上でモノマーＨＢ　ｓＡｇの凝
集が起こり、次いで該膜内腔へのｂｕｄｄｉｎｇによっ
て該１１１３ｓＡｇ拉子が形成される。該粒子はその後
ゴルノをへて分泌顆粒に入り、細胞外へ分泌されると説
明されている［Ｅｂｌｅ、８．Ｅ、ら、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、（モルキュラー・アンド・セル
ラー・バイオロジー）、　６．１４５４（１９８６）］
。しかしながら、同じ真核細胞である酵母においてはｅ
ｎｖ蛋白粒子の細胞外への分泌は全く知られていない。

そこで、本発明台らは、組換えＤＮＡ法を用いて鋭き検
討した結果、ｅｎｖ蛋白すなわちｌｌＢｓＡｇのＳ　（
Ｐ２５）Ｍ（Ｉ’３１．ｐｒｃ　−Ｓ　２　＋　Ｓ　）
あるいはＬ（Ｐ３９．全ｐｒｅ−８＋Ｓ）蛋白遺伝子の
直前にそれぞれソゲナルペプチドのコード領域を連結し
たものを用いることによって、上記ｅｎｖ蛋白粒子をそ
れぞれ酵母の細胞外に分泌させろことを見いだした。さ
らに、本発明台らは［、蛋白遺伝子の直前にシグナルペ
プチドのコード領域を連結した組換えＤＮＡを保持する
酵母におけろ菌体内発現νｎを調べた結果、驚くべきこ
とに、シグナルペプチドのコード領域が付加されていな
い組換えＤＮＡを用いる場合に比へ、はるかに高い抗原
が菌体内に蓄積されていることを見い出した。

本発明は、Ｉ−Ｉ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ活性を有するペプチ
ドをコードするＤＮＡの５°−末端に真核細胞において
作動するシグナルペプチドをコードするＤＮＡが連結さ
れた組換えＤ　Ｎ　Ａ　、数組換えＤＮＡを保持する真
核細胞および数組換えＤＮＡを保持する真核細胞を培養
し、培養液中にＩ−（ＢｓＡｇ活性を有するペプチドを
生成蓄積させ、該ペプチドを採取することを特徴とする
Ｉ−Ｉ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ活性を有するペプチドの製造法
を提供するものである。

ｆ（ＢｓＡｇ活性をａするペプチドをコードするＤＮＡ
としてはａｄｒ型、　ａｄｗ型、　ａｙｖ型およびａｙ
ｒ型のＳ蛋白遺伝子１Ｍ蛋白遺伝子お上び１，蛋白遺伝
子があげられる。これらの遺伝子の一部は変異（修飾）
されていてもよい。トリプシン様プロテアーゼ生産酵母
を宿主として用いる場合、Ｌ蛋白およびＭ蛋白はプロテ
アーゼによって分解される可能性があるためＭ蛋白のＮ
末端より４８番目のアルギニンまたはそれを含むペプチ
ド（好ましくは４４〜４９番目のペプチド）を欠損させ
るように変異させることが好ましい。より好ましい遺伝
子としてはたとえば第５図で示されるアミノ酸配列１〜
３８３番をコードするし蛋白遺伝子（変異型）アミノ酸
配列１０９〜３８３番をコードするＭ蛋白遺伝子（変異
型）およびアミノ酸配列１５８〜３８３番（または第６
図で示されるアミノ酸配列）をコードするＳ蛋白遺伝子
があげられる。

シグナルペプチドをコードするＤＮＡとしては真核細胞
において作動するシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
であればいずれでら用いることができるが、たとえばｍ
ａｔｉｎｇ　　ｒａｃｔｅｒ　　ａ　Ｉ　［Ｂｒａｋｅ
。

＾、Ｊ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１　４６４２（＋９８４）＋　Ｂ
ｉｔＬｅｒ、Ｇ、Ａ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　５ｃｉ１１ｓＡ、　８１．５３３０（１９
８４）］、　Ｓ　Ｕ　Ｃ２とＰＨ０５［Ｓｎ＋ｉＬｈ、
Ｒ，Ａ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９．１２＋９（
１９８５）］。

Ｋ１１ｌｅｒ［５ｋｉｐｐｅｒ、Ｎ、ら、　５ｃｉｅｎ
ｃｅ、　２３０．９５８（１９８５）；　Ｂａ１ｄａｒ
ｉ、Ｃら、　ＥＭＢＯＪ、、　６．２２９（１９ｇ？）
］。

ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ　Ｉ　［Ａｒ５ｄｅ１１．
Ｊ、Ｎ、Ｖら、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　５
．６０（１９８７）］、　　Ｉ　ＦＮ−ａ　Ｉ　、　Ｉ
　ＦＮ　−ａ　２と■Ｐ　Ｎ　−７［Ｈｉｔｚｅｍａｎ
、Ｒ，Ａ、ら５ｃｉｅｎｃｅ、　　２１９．　６２０（
１９８３）コ、　　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｖａｍｏ
ｒｉ　ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ［Ｉｎｎ１ｓ、Ｍ、Ａ
、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ２２８、２１（１９８５）］、
　ｍｏｕｓｅ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎλとμ［
Ｗｏｏｄ　、　Ｃ，Ｒ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１４
．４４６（１９８５）］ｃｈｉｃｋｅｎ　Ｉｙｓｏｚｙ
ｍｅ［０ｂｅｒｔｏ、Ｊ、　　＆　　Ｄａｖｉｓｏｎ、
Ｊ、。

Ｇｅｎｅ、　　４０．　５７（１９８６）］、　　Ｗｈ
ｅａｔ　　ａ　−ａｍｙｌａｓｅ［Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ
、Ｓ、　Ｊら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０８．６６２（１
９８４）］。

１ｎＮｕｅｎｚａ　Ｈ＾［Ｊａｂｂａｒ、Ｍ、＾、ら、
　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２．２０１９（１９８５）］な
どのシグナル配列があげられる。これらのノブナル配列
はその一部を変異（修飾）させてらよい。

発現に用いられるプロモーターは真核細胞で機能しうる
ちのであればいかなるものであってもよいが、たとえば
酵母においてはＧＬＤ（ＧＡＰＨ）プロモーター、　Ｐ
　Ｉ−１０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、　Ａ
　Ｄ　Ｉ−（プロモーター、ＰＨ０８１プロモーターな
どが好ましく用いられる。

発現用ベクターとしては真核細胞内で複製できる乙ので
あり、挿入された遺伝子を発現しうるしのであればいか
なるものでもよい。酵母における発現用ベクターとして
は具体的にはｐＰＨＯＩ７ｐＧＬ、Ｄ９０６．ｐＧＬＤ
９０６−１［１ｔｏｈ、ＹらＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｎ＋ｕｎ、、１３８．２
６８（１９８６）］があげられる。

宿主としての真核細胞としては酵母、カビ類、動物細胞
があげられるか、なかでも酵母が好ましく用いられる。

酵母のなかでもＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓ　ｉａｅが好ましい。

ＨＩ３ｓＡｇ活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ
はＨ１３Ｖ　−Ｄ　Ｎ　Ａまたはそれが組み込まれたプ
ラスミドを適当な制限酵素処理、適当なアダプター結合
などの手段を用いることにより調製することができる。

シグナルペプチドをコードするＤ　Ｎ　Ａは該ＤＮＡを
含有する遺伝子より酵素的に調製することができるか、
一般にシグナルペプチドは約２０個のアミノ酸より成る
ため、容易にＤＮＡを化学合成することらできる。

プロモーターは対応する遺伝子より酵素的に調製するこ
とができる。また、化学合成することしできる。

発現用ベクターは宿主において１９袈可能なプラスミド
にプロモーターを挿入することによりＡ製することかで
きる。酵母において冷製可能なプラスミドとしてはｐｓ
Ｉ−（１９などがあげられる。

シグナルペプチドをｊ−ドするＤＮＡの、Ｈｆ３ＳＡｇ
活性を有するペプチドをコードするＤＮＡの５′末端へ
の結合、得られるノグナルベブチドをコードするＤＮＡ
とＨＢｓＡｇ活性をａするペプチドをコードするＤＮＡ
の結合物の、発現ベクター中のプロモーターの３°末端
への挿入は酵素的（ＤＮＡリガーゼ）に行うことができ
る。ｌ−ｌＢｓＡｇ活性を打するペプチドをコードする
ＤＮＡの終止コドンの後には、産生量を増太さ仕るため
に、ターミネータ−（たとえばＰＧＫターミネータ−）
が付加されてもよく、また、ングナルベブチドＤＮＡと
ＨＢｓＡｇＤＮＡとの間およびプロモーターとンクナル
ベブヂドＤ　Ｎ　Ａの間にはスペーサーＤ　Ｎ　Ａが挿
入されていてもよい。スペーサーＤ　Ｎ　、Ａは約４０
塩梧以下であることが好ましい。

組換えＤＮＡ（プラスミド）を用いて真核細胞を形質転
換する方法は自体公知の方法に従って行うことができる
。

得られた形質転換体は自体公知の方法に従って培ｉ％さ
れろ。酵母用培地としてはたとえばＢｕｒｋｈｏｌｄｅ
ｒ最小培）ｔ！！［ＢｏｓＬｊａｎ、に、１．、ｅｔ　
ａｌ：ｒプロンーノング・オブ・ザ・ナンヨナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンスＪ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ）、　７７、４５０５（１，９８０）］かあげら
れる。培徨は通常１５°Ｃ〜４０℃、好ましくは２４°
Ｃ〜３７℃で１０〜９６時間、好ましくは２４〜７２時
間行い、必要に応じて通気や攪拌を加えることらできる
。

本発明によれば、ｌＢｓＡｇ活性を有するペプチドは通
常、脂質などを含む粒子として細胞外に分泌される。し
たがって、培養終了後、遠心分離などのそれ自体公知の
方法で細胞と上清とを分離し、細胞外に分泌されたペプ
チドを培養上清から通常の蛋白質精製法７例えば塩析２
等重点沈澱、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー
、高速液体クロマトグラフィー、アブイニイティ・クロ
マ）・グラフィー、ンヨ糖グラノエント超遠心、塩化セ
シウムグラジェント超遠心などの精製工程を適当に組み
合わせることによって容易に精製することができる。

特に、Ｌ蛋白は細胞外に分泌される一方、細胞内に多重
に蓄積される。したがって、培養終了後、それ自体公知
の方法で細胞を集め、得られた菌体から通常の蛋白質精
製法、たとえば細胞破砕、塩析ポリエチレングリコール
による沈澱と分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラ
フィー、高速液体クロマトグラフィー、アブイニイティ
・クロマトグラフィー、シヨ糖グラジェント超遠心、塩
化セシウムグラノエント超遠心などの精製工程を適当に
組み合わせることによって細胞内に蓄積されたペプチド
（通常粒子）を精製することらできる。

（作　用） 本発明で得られるｅｎＶ蛋白は、ＨＢＶ感染者の血液を
原料にして製造された公知のＨＢｓＡｇ小型粒子と同様
の生物活性を有し、ＨＢｓＡｇ小型粒子と同様にしてＩ
−１［３ウイルス感染の予防のためのワタチノとして、
また診断用キットの材料（たとえば、抗Ｌ［Ｂ　ｓ　Ａ
　ｇ抗体の検出用抗原）として用いることができる。

なお、本願明細古および図面において、塩基やアミノ酸
などを略号で表示する場合、Ｉ　ＵＰＡＣＩ　Ｕ　１３
　　Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌＮＯＩＩｌｅｌｌＣＩａｌｔｌｒｅによる略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり
、その例を次にあげる。またアミノ酸に関し光学異性体
がありうる場合は、特に明示しなければＬ一体を示すも
のとする。

ＤＮＡ　　　デオキシリボ核酸 ｒ（Ｎ　Ａ　　　リボ核酸 ｍＲＮ＾　　　メッセンジャーＲＮＡ Ａ　　　アデニン ′ｒ　　　チミン Ｇ　　　グアニン Ｃントシン ｄＡＴＰ　　　　デオキノアデノノン三リン酸ｃｌＴＴ
Ｐ　　　　デオキノチミジン三リン酸ｄＧＴＰ　　　　
デオキソグアノンン三リン酸ｄＣＴＰ　　　　デオキン
シヂジン三リン酸Ａ　Ｔ　Ｐ　　　アデノシン三リン酸 Ｅ　Ｄ　’ｒ　Ａ　　エヂレンジアミン四酢酸ドデシル
硫酸ナトリウム ジヂオスレイトール グリシノ（Ｇ） アラニン（＾） バリン（Ｖ） ロイシン（１４） イソロイシン（１） セリン（Ｓ） スレオニン（Ｔ） システィン（Ｃ） ハーフシスヂン メヂオニン（Ｍ） グルタミン酸（Ｅ） アスパラギン酸（Ｄ） リジン（Ｋ） アルギニン（Ｒ） ヒスデシン（１１） フェニルアラニン（Ｆ） チロシン（Ｙ） トリプトファン（Ｗ） Ｐ「０ ブ【１リン（１）） ＾ｓｎ アスパラギン（Ｎ） ｌｎ グルタミン（Ｑ） アンピシリン耐性遺伝子 テトラサイクリン耐性遺伝子 オートノマス・レブリケーション・ シーフェンスＩ Ｃａｕ＊ｏｎｏｍｏｕｓ　　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　
　５ｃｑｕｃｎｃｃ　　Ｉ） １１１　　　　インバーテツド・リピート（ｉｎｖｅｒ
【ｃｄ　　ｒｅｐｅａｔ） ｒｓ　Ｉ （実施例） 以トに実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する
が本発明はこれらに限定されるべきものではない。

実施例に記載のプラスミドを保持する微生物の寄託機関
への寄託およびその受託番号は第１表に示４−とおりで
ある。

ノ〈中、ＩＦＯはＩＩ４Ｉ４大法人発酵研究所Ｆｌｔｌ
は日本国通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所を
、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｃｃｒｅｖｉｓｉａｅを表わず。

ＩＦＯ ＲＩ ］ Ｓ、ｃｃｒｅｖｉｓｉａｃ＾ｌ＋２２Ｒ−／Ｉ）Ｇ１．
Ｄ　１，Ｐ３１−ＲｃＴ　　　１０３３７　　　ＢＰ−
１７４４（Ｐ−９３２０） Ｓ、ｃｃｒｅｖｉｓｉａｃ　ＡｌＩ２２ＲＶｐＧＬＤ　
ＬＰ３９−ＲｃＴ　　　１０３３６　　　ＢＰ−１７４
５（Ｐ−９３２１） Ｓ、ｃｃｒｃｖｉｓｉａｃ＾ｌ＋２２Ｒ−／Ｉ）Ｇｌ、
Ｄ　１．ｒ’２５ＷＢＰ−１７４６ （Ｐ−９３２３） なお、ｐＧｌ、Ｄ９０６−１の５ａｉｌ消化１）ＮΔは
ｐｃ＋、ｏ　Ｐ３１Ｒを５ａｌｌ消化することにより得
ることらできる。

ｐＧｌ、Ｄ　Ｐ３１Ｒを保持するＳ、ｃｃｒｃｖｉｓｉ
ａｃ＾Ｉ＋２２Ｒ−／Ｉ）Ｇ１、Ｄ　Ｉ’３１ＲはＩＦ
ＯにＩＩ”０　１０１４５として、また、Ｆ　Ｒｆ　１
．１　Ｆ’　Ｅ　１７　Ｍ　　ＨＰ−８（１０としテ直
託されている。

実施例１ ングナルー配−烈炎千二 のり・？製 ド４゛るＤＮＡ［Ｘｈｏｌ　ＲｃｏＲＩ］ｆ！ｎＶ蛋白
１１ｒ３ｓΔｇを培地中へ分泌させる丸めのシグナル配
列として卵白リゾチー１２のシグナルペプチドを利用し
ノこ。公知のアミノ酸配列ｃＪｕｎｇ、＾。

ｃＬａｌ、プロシージング・オシ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オシ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１ｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、　ＵＳＡ、　７７、５７５９
（１９８０月を参ηに、第１図（ａ）に示ずような５°
末端にＸｈｏｌザイト。

３′末端にＥｃｏＲＩサイトがもうけられている合成ヌ
クレオチド配列を用いた。全配列は８個のオリゴヌクレ
オヂドブ【ノック（＃１，＃２．＃３．＃／Ｉ。

＃５．＃６．＃　Ｉ　７．＃　Ｉ　８）から成り、これ
らはホスフォアミダイド法［Ｃａｒｕｔｈｃｒｓ、Ｍ、
１１．ｃＬ　ａｌ；テ］・ラヘドロン・レターズ（Ｔｃ
Ｌｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）２２、１８５９
（１９８１月によって合成された。

ま「＃２〜＃Ｇ、＃１７をそれぞれ１０／１１２（５μ
ｇ）ずつ混合しこれに１０倍濃度のキサーゼ緩衝液［０
，５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＣ，０，ＩＭ　ＭｇＣＬ、　０
．１Ｍメルカプトエタノール、ｐｉ４７．６］２０μＱ
、１０ｍＭ　　ＡＴＰ２０μ（、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（宝酒造社製）２０μＱ（５０Ｕ）、蒸留水８
０μＱを加えて３７°Ｃで２時間反応させた後、６５℃
で２０分処理して反応をとめた。この反応液に＃ｌと＃
１８とをそれぞれｌＯμ！２（５μｇ）を加え、Ｔ４リ
ガーゼ（ＮＥＢ社製月０μＱを加えて１４℃で一夜反応
させた。反応液を６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけ、８０ｂｐのフラグメントを切り出し電気泳動溶
出によってゲルから抽出し、これを２０μＱの蒸留水に
溶解した。ファーノベクター・Ｍ　Ｉ　３　ｍｐ　Ｉ　
Ｏ［Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、、メソッド・イン・エンサイ
モロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙＩＩ＋ｏ１
．）ｌｏｔ、　２０（１９８３）］の２本鎖ＤＮＡ　Ｉ
μｇを２０μＱの反応液［５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
（！（ｐＨ７，５）、１００ｍＭ　ＮａＣＱ、　　Ｉ　
ＯｍＭ　ＭｇＣＬ、　　Ｉ　ｍＭジチオスレイトール］
中、ＩＯユニットの旧ｎｄ［とＩＯユニットのＥｃｏＲ
Ｉで３７℃、２時間反応を行い、該ＤＮＡをｌ１ｉｎｄ
［部位とＥｃｏＲ１部位で開環させた。該反応液に６５
°Ｃ，１５分間の熱処理を加え、制限酵素を失活さＵ“
た。該ＤＮＡ０．０２μｇに上記の８０ｂｐｃ′）ＤＮ
Ａ断片の０１ｇｇと、ホスフォアミダイド法で化学合成
し、さらにＴ４ボリヌクレオチドギナーゼを用いて５°
末端をリン酸化したＤＮＡから成る合成１１ｉｎｄ［［
Ｉ　−Ｘｈｏｌリンカ−０，５μｇを加え、２０μｇの
反応液中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの作用でＤＮＡを連結さ
せた後、Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、の方法［ＭｅＬｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１０１．２０（１９８３
）］で犬大腸菌ＭＩ０３に導入し、プラーク（溶菌斑）
を作ら仕た。

白色プラークの中からＭＩ３ｍｐｌＯに、上記８０ｂｐ
ｏ　Ｎ　Ａ断片がクローニングされたＭＩ３ｉｐ１０８
０を得た。ＭＩ３ｍｌ）１０−８０の２本鎖ＤＮＡ２０
μｇを４０ユニツトのＸｈｏｌと４０ユニツトのＥｃｏ
ＲＩで１２００μ（の反応液［５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣ
ｏ、（＋）Ｈ７，５）、１００ｍＭ　ＮａＣ（！、　　
Ｉ　ＯｍＭＭｇＣＱｔ、　　ｌ　ｍＭジチオスレイトー
ル］中、室温で一夜反応さけた後、該反応液を６％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、８０ｂｐのフラグ
メントを切り出し電気泳動溶出によってゲルから抽出し
、これを蒸留水ｌＯμＣに溶解し、−２０℃で保存した
。（第１．２図） 実施例２ 修飾Ｍ蛋白（Ｐ３１）の発現用プラスミドｐＧＬＤ　Ｐ
３１ＲｃＴ（特願昭６１−１２８９１８号明細書に記載
）４０７１ｇを１００ユニツトの制限酵素ＥｃｏＲｌと
５ａｌＩで５００μ（の反応液［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
１（（ｊ！（＋）Ｉ−１７，５）、　Ｉ　００ｍＭ　Ｎ
ａＣ（！、　　ｌ　ＯｍＭ　！＋１ｇＣｆ２ｔ、　　Ｉ
　ｍＭジチオスレイトール］中、室温で一夜反応させた
後、アガロースゲル電気泳動で分離し、修飾Ｍ蛋白遺伝
子を含む１．１ｋｂＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡ０．５
μｇと実施例Ｉで得たングナル配列をコードするＤＮＡ
０．５μｇを、プラスミドＩ）Ｇｌ、Ｄ　９０６１（特
開昭６１−４３９９１号公報）の５ａｌｌ消化ＤＮＡ０
．０５μｇと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合
させた後、大腸菌ＤＨＩを形質転換さけ、アンピッリン
耐性を示す組換え体を得た。

数組換え体の中から、Ｇ　Ｌ　Ｄプロモーターの下流に
ノブナル配列コード領域および修飾Ｍ蛋白遺伝子−ＰＧ
Ｋターミネータ−がプロモーターと同一方向に挿入され
たプラスミドｐＧＬＤ　ＬＰ３１−ＲｃＴを得た。（第
２図） ｐＧＬＤ　ＬＰ３１−ＲｃＴを用いて、酵母Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａｔ１２２Ｒ
−を形質転換し、形質転換体（Ａｌ１２２ＲＶｐＧＬＤ
　ＬＰ３１−ＲｃＴ）を取得した。

実施例３ 修飾Ｍ蛋白遺伝子の酵母における分泌発現実施例２で得
られた修飾Ｍ蛋白遺伝子分泌発現プラスミドを含む酵母
形質転換体を、５＋Ｊの培養液［１１！あたり、Ｋ２１
１Ｐ０４３　ｇ、グルコース５０ｇ、アスパラギン−１
ｇ、Ｌ−ヒスデシンＩ　ＯＯｍｇ、　Ｋｌ　ＯＩ　ｍｇ
、　ＭｇＳＯ４・７１１２０５００　ｍｇ、　ＣａＣＱ
ｚ　・２１１＝０３３０ｍｇ、　ＣｕＳＯ４・５１１，
００．４ｍｇ、　Ｆｅ５０．ｄｌｌ、０２．５ｍｇ、Ｍ
ｎ５Ｏ，−４１１ｔ０　０．４　ｍｇ、（ＮＩｌ４）３
Ｐｏ、　・１２ＭｏＯａ　・３１１ＦＱ　０　、２　ｍ
ｇ−ＺＩＴＳＯ４・７ＩＩｔ０３　、　Ｉ　ｍｇ、イノ
ントールｌ０ｍｇ、チアミン０．２ｍｇ、ピリドキシン
０．２ｍｇ。

Ｃａ−パントテン酸０．２ｍｇ、ナイアシン０　、２　
ｍｇビオヂン０．００２ｍｇを含む］中で３０℃、３日
間振とう培養を行った後、その２滅を上記の培地１８１
ｎ１に序し、３０℃、１日間培養し、更にその２−を１
８寸の新鮮培地［ｌりあたり、Ｋｌｌ、Ｐｏ。

４００ｍｇ、ンヨＭ８０ｇ、アスパラギン５ｇ、Ｌ−ヒ
スデシン３００ｍｇ、　ＫＣＣ２，Ｏｇ、　Ｋｌ　Ｏ，
Ｉｍｇ、　Ｍｇ５０−　・７１１ｚ０６５０ｍｇ、Ｃａ
Ｃ４ｘ　・２１１ｚＯ４２９ｍｇ、グルコースＩＯｇＪ
リスーマレイン酸（ｐＨ６，５）２５ｍＭ、　ＣｕＳＯ
４・５１１ｔＯＯ，４ｍｇ、　ＦｅＳＯ４・７ＨｚＯ２
，５ｍｇ、　ＭｎＳＯ４−４１１２００、４ｍｇ、（Ｎ
Ｉｌ、）ｓＰｏ、　・１２Ｍ０Ｏ３・３１１ｙｏ　０　
、２　ｍｇ、Ｚｎ５Ｏ＊　・７１１ｔＯ３、ｌ　ｍｇ、
イノシトール１０ｍｇ、チアミン０．２ｍｇ、ピリドキ
シン０．２Ｂ。

Ｃａ−パントテン酸４．ＯＢ、ナイアシン４．０ｍｇ。

ビオチン０．０４０ｍｇを含む］に移し、３０℃で３日
間振とう培養し、７２時間後にサンプリングし、遠心分
離機（１０，ｏＯｏｘｇ、　　Ｉ　０分間）にかけ、上
清と菌体を分離した。

上記上清のＨＢｓＡｇ活性をオースザイム■［アボット
（抹）製］を用いて測定した。その結果を第２表に示す
が、Ｉ−Ｉ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇの生成量はブロスｌａあた
りとして計算された。

実施例４ シグナル配列をコードするＤ　Ｎ　Ａ　［Ｘｈｏｌ　−
Ｔａｑｌ］の調製 ｅｎｖ蛋白ＨＢｓＡｇを培地中へ分泌させるためのシグ
ナル配列として卵白リゾチームのシグナルペプチドを利
用した。公知のアミノ酸配列［Ｊｕｎｇ、＾。

ｅＬ　ａｌ　　ブロシーノング・才ブ・ザ・ナンヨナル
・アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、　ＵＳＡ、　？７．５７５９
（１９８０）］を参考に、第１図（ｂ）に示ずような５
゛末端にＸｈｏｌサイト、３゜末端にＴａｑ　Ｉサイト
がもうけられている合成ヌクレオヂド配列を用いた。全
配列は８個のオリゴヌクレオヂドブロック（＃１．＃２
Ｊ３．＃４．＃５．＃６、＃７．＃８）から成り、これ
らはホスフォアミダイド法［Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ、
Ｉｌ、ｅｔ　ａｌ　；　テトラヘドロン・レターズ（Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）２２．１８５
９（１９８１）］によって合成した。

まず＃２〜＃７をそれぞれｌＯμＱ（５μｇ）ずつ混合
しこれに１０倍ａ度のキナーゼ緩衝液［０，５Ｍ　　Ｔ
ｒｉｓ−１１ｃ（！、　　Ｏ，ＩＭ　ＭｇＣ＆２．　０
．１Ｍメルカプトエタノール、ｐｌ−１７，６］２０　
μＱ、　　ｌ　ＯｍＭ　ＡＴＰ２０μ（１，Ｔ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ（宝酒造社製）２０　ｕＱｃ５０　
Ｕ）、蒸留水８０μ（ｌを加えて３７℃で２時間反応さ
せた後、６５℃で２０分処理して反応をとめた。この反
応液に＃ｌと＃８とをそれぞれ１０μｆｆ（５μｇ）を
加え、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ社製月Ｏμρを加えて１４
℃で一夜反応させた。反応液を６％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけ、７６ｂｐのフラグメントを切り出
し電気泳動溶出によってゲルから抽出し、これを２０μ
りの蒸留水に溶解した。

実施例５ 構築と該プラスミドによる酵母の形質転換＋１［３ｘ八
ｇＳ（Ｐ２５）蛋白発現用プラスミドｐＨＢｓ５１（特
開昭６１−７０９８９号公報）８０μｇを２００ユニツ
トの制限酵素Ｈｐａｌｌで５００μｇの反応液［１０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ２（ｐｌ（７，５）、　Ｉ　Ｏ
ｔｎＭ　　ＭｇＣｆ２ｔ、ＩｍＭジチオスレイトール］
中、室温で一夜反応さＵた後、アガロースゲル電気泳動
で分離し、Ｓ蛋白遺伝子を含む０．８１５ｋｂＤＮＡ断
片を得た。該ＤＮＡ０．５μｇと実施例４で得たシグナ
ル配列をコードするＤＮＡ５μｇを混合し、７ＭＤＮＡ
リガーゼを用いて結合させた後、１０ユニツト（１）　
　ＸｈｏｌとＩ　Ｏユニー／トノ１ｌｐａＩＩテ、４０
μ（！の反応液［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐｌ
４７．５）、　Ｉ　ＯＯｍＭＮａＣρ、Ｉ　ＯｍＭ　Ｍ
ｇＣＬ、１ｍＭジチオスレイトールコ中、３７℃、２時
間反応し、アガロースゲル電気泳動で０．８９１ｋｂの
シグナル配列を含むＳ蛋白遺伝子断片を分離した。ファ
ージベクター・Ｍ１３　ｍｐ９　［Ｍｅｓｓｉｎｇ、ｊ
、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１０
１゜２０（１９８３）］の２本鎖ＤＮＡ　ｌμｇを２０
μＱの反応液［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＩＣｆ２（ｐｌ
［７，５）、　ｌ　ＯＯｍＭ　’ＩａＣＱ。

１０ｍＭ　ｖｇＣｆＬ、　　Ｉ　ｍＭジチオスレイトー
ルコ中、ＩＯユニットの旧ｎｄｌＩＩと１０ユニツトの
Ｐｓｔｌで３７°Ｃ，２時間反応を行い、該ＤＮＡをｌ
１ｉｎｄ［１１部位とＰｓｔ１部位で開環させた。該反
応液に６５℃！５分間の熱処理を加え制限酵素を失活さ
せた。

該ＤＮＡ０．０２μｇに上記の０．８９ｋｂのＤＮＡ断
片Ｏｌμｇとホスフォアミダイド法で化学合成し、さら
にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５゛末端をリ
ン酸化したＤＮＡ から成る合成１１ｐａ　ＩＩ　−Ｐｓｔ　ｌリンカ−０
，５μｇと実惟例Ｉで用いた合成重ｎｄ［−Ｘｈｏｌリ
ンカ−０，５μｇとを加え、２０μＱの反応液中、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼの作用でＤＮＡを連結させた後、Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ。

Ｊの方法［ＭｅＬｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、
　１０１．２０（１９８３）］で大腸菌ＪＭＩ０３に導
入し、プラーク（溶菌斑）を作らせた。白色プラークの
中からＭＩ３ｍｐ９に、上記０．８９ｋｂＤＮＡ断片が
クローニングされたＭ１３ｍｐ９−ｌ、Ｉ）２５を得た
。

Ｍ　Ｉ　３　ｍｐ　９−　ＬＩ’２５の２本鎖ＤＮＡ２
０μｇを４Ｑｊ−、ニーブトのＸｈｏｌと４０ユニシト
の５ａｌｌで６００ｕ（ｌの反応液［５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−１１ｃＱ（ｐｌ＋　７　、５　）１００ｍＭ　Ｎａ
Ｃ０，、Ｉ　ＯｍＭ　ＭｇＣ１！、、　　Ｉ　ｍＭジチ
オスレイトール］中、３７°Ｃ，４時間反応させた後、
アガロースゲル電気泳動で０　、９　ｋｂのシグナル配
列を含むＳ蛋白遺伝子断片を分離した。該ＤＮＡ０．５
μｇとプラスミドｐＧＬＤ　９０６−１（特開昭６１４
３９９１号公報）の５ａｌｌ消化ＤＮＡ０．０　ｓｌと
混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた後、大
腸菌Ｄ　Ｉ−Ｉ　１を形質転換させ、アンピシリン耐性
を示す組換え体を得た。数組換え体の中から、Ｇ　Ｌ　
Ｄプロモーターの下流にシグナル配列コード領域および
Ｓ蛋白遺伝子−ＰＧＫターミネータ−がプロモーターと
同一方向に挿入されたプラスミドｐｃ＋、ｏ　１，Ｐ２
５Ｗを得た。（第３図）ｐＧＬＤ　　ＬＰ２５Ｗを用い
て、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ　ＡＨ２２Ｒ−を形質転換し、形質転換体（Ａ１１
２２ＲＶＩ）ＧＬＤ　ＬＰ２５１’）を取得した。

実施例６ Ｓ蛋白遺伝子の酵母における分泌発現 実施例５で得られたＳ蛋白遺伝子分泌発現プラスミドを
含む酵母形質転換体を５ｇの培養液［１ｇあたり、Ｋ、
ｌｌＰＯ４３ｇ、グルコース５０ｇ、アスパラギン４ｇ
、Ｌ−ヒスチジン１００ｍｇ、　Ｋｌ　Ｏ，Ｉｍｇ。

Ｍｇ５Ｏａ・ＩＨｔｏ　５００ｍｇ、　ＣａＣＱｔ・２
１（ｔｏ　３３０ｍｇ。

Ｃｕ５Ｏ，・５１１ｙＯＯ，４ｍｇ、Ｐｅ５ｏ、　・７
ｔｌｔＯ２、５ｍｇＭｎＳＯ４・４１１−００　、４　
ｍｇ、　（Ｎ１１４）３Ｐ０４・１２ＭｏＯ５・３ｔｌ
ｔＯＯ、２ｍｇ、　ＺｎＳＯ４・ＩＨｔｏ　３　、　Ｉ
　ｍｇ、イノシトール１０ｍｇ、ヂアミン０．２ｍｇ、
ピリドキシン０．２ｍｇ、Ｃａパントテン酸０．２ｍｇ
、ナイアシン０．２ｍｇ、ビオチン０．００２ｍｇを含
む］中で３０℃、３日間振とう培養を行った後、その０
．５ｇを上記の培地４５　Ｍｌに移し、３０℃、１日間
培養し、更にその２ｍｇを１８滅の新鮮培地［ＩＱあた
り、Ｋｌ、Ｐｏ、　４００ｍｇ、ンヨ糖８０ｇ、アスパ
ラギン５ｇ、Ｌ−ヒスデシン３００ｍｇ、　ＫＣＱ　２
．０ｇ、　Ｋｌ　Ｏ，Ｉｍｇ、　Ｍｇ５Ｏ。

・７１１ｔＯ６５０ｍｇ、　ＣａＣＱｔ　・２ｔｌｚＯ
４２９ｍｇ、グルコースｌＯｇ、）リス−マレイン酸（
ｐＩ−（６，５）２５ｍＭ、　　Ｃｕ５Ｏ，−５ｔｌｚ
０　０．＝１ｍｇ、　　Ｆｃ５Ｏ，・７１Ｌ０　２．５
ｍｇ、　　Ｍｎ５Ｏ＝　・４１１２０　０．４　ｍｇ、
（Ｎｉｌ、）＋ＰＯ４Ｈ１２Ｍｏ０３・３１１２００．
２ｍｇ、　ＺｎＳＯ４＋　７１１，０３　、　Ｉ　ｍＬ
イノントールｌ０ｍｇ、ヂアミン０．２ｍｇ、ピリドキ
シン０　、２　ｍｇＣａ−パントテン酸４．０ｍｇ、ナ
イアノン４．０ｍｇビオヂン０．０４０ｍｇを含む］に
移し、３０℃で３日間振とう培養し、７２時間後にサン
プリングし、遠心分離機（１０，０００Ｘｇ、　　Ｉ　
０分間）にかけ、上清と菌体を分離した。

上記上清のＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ活性をオースザイム■［ア
ボット（株）製コを用いて測定した。その結果を第２表
に示すが、ＨＢｓＡｇの生成量はブロス１ａあたりとし
て計算された。

実施例７ プラスミドｐＨＢｒ　３３０［Ｏｎｏ、Ｙ、ら、ヌクレ
イツク・アンラド・リサー−７−（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１１１７４７（＋９８３）１２０ｕ
ｇを１００ユニツトの制限酵素Ｂａｍ１ｌｌで５００μ
ｆ２の反応液［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＣ（ｒ）ｌ
−１７，５）、５０＋ｎＭ　　ＮａＣＱ、　　ｌ　Ｏｍ
Ｍ　　ＭｇＣｆｆｔ、　　Ｉ　ｍＭノチオスレイトール
］中、３７℃、２時間反応させた後、アガロースゲル電
気泳動で分離し、３２ｋｂのＤ　Ｎ　Ａ断片を得た。該
ＤＮＡｌ０μｇを３０ユニツトのＥｃｏＲＩで２０μｆ
２の反応液［５０ｍＭＴｒｉｓ−１１ｃρ（ｐＦＩ７．
５）、＋　００＋ｎＭ　ＮａＣ（１，Ｉ　Ｏ＋ｎＭＭｇ
ＣＬ、ＩｍＭジチオスレイトール］中３７℃、２時間反
応させた後３０ユニツトのＴａｑ　Ｉで６５℃、２時間
反応し、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により０
，３４ｋｂＤＮＡ断片を分離した。該ＤＮ　Ａ　７　ｔ
ｔ　ｇをＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　’Ｊガーゼニヨリ結合さ
せた後、５０ユニツトのＴａｑ　Ｉで２０μＱの反応液
［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃ１２（ｐＨ７，５）、　
ｌ　００ｍＭ　ＮａＣＬｌ　０ｍＭ　ＭｇＣ（！、、　
　Ｉ　ｍＭジチオスレイトール］中６５°Ｃ，３時間反
応させ、０．６８ｋｂのＤＮＡ断片とした。さらに０．
５ｍＭ　ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ　ｄＣＴＰ、０゜５ｍＭ
　ｄＧＴＰ、　　０．５ｍＭ　ｄＴＴＰの存在下、５Ｕ
のクレノーフラグメントを１００μｇの反応液［３３ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７、９）、　６６
　ｍＭ　Ｋａｃｅｔａｔｅ、　ｌ　　ＯｍＭ　　Ｍｇ−
ａｃｅｔａｔｅ、　ｌ　　００　μｇ、／ｍｆｌＢＳΔ
（牛血ｔ？１アルブミノ）］中３７℃、５分間反応させ
、０　、２　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　５μＱを加え反応を
止めた後フェノール−クロロホルム（Ｉｌｌ）で除たん
ばくを行った。ホスフ十アミダイド法により化学合成し
、さらにＴ　４ポリヌクレオヂドキナーゼを用いて５°
末端をリン酸化したアダプター５°−Ｐ　−ｄ（ＧＧＡ
ＡＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣ）　　０　．５　６　ｇと５°
　−Ｐ−ｄ（ＧＧＴＣＧＡＧＧＡ八ＴＴＣＣ）　０へ、
　５　ｔｔ　ｇを加え、２０ｔｔＱＯ’）反応液中、′
ｒ４Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼの作用でＤＮＡを連結さけ、３
０ユニツトのＥｃｏＲｌで３７℃、３時間反応させた（
０゜３６ｋｂＤＮＡ）。ファーノベクター・ＭＩ３ｍｐ
９の２本ＲＩＤＮＡＩｕｇを２０μρの反応液［５０ｍ
ＭＩｒ１ｓ−１１ｃＱ（ｐＨ７，５）、　Ｉ　ＯＯｍＭ
　ＮａＣ（１，Ｉ　ＯｍＭ％ＩｇＣＱｔ、　　Ｉ　ｍＭ
ノチオスレイトール］中、ｌ　Ｑ　ユ＝　ソトの１１ｉ
ｎｄＩ１１と１０ユニツトのＳａｌで３７°Ｃ，２時間
反応を行い、該ＤＮＡをｌｌ１ｎｄ［１部位とＳａｌ［
部位で開環させた。該反応液に６５°Ｃ，１５分間の熱
処理を加え、制限酵素を失活させた。該Ｄ　Ｎ　Ａ０６
０２μｇに上記の０．３６ｋｂＤＮＡ断片０．２μｇと
実施例１によりｆ９だＭ　Ｉ　３ｍｐｌ　０　８　ｏｌ
、＝ｉｌＩＩ限酵素旧ｎｄｌＩＩとＥｃｏＲ−１を反応
させて得た８ｓｂｐフラグメント０．５μｇとプラスミ
ドｐＧＬＤ　　Ｐ３１−ＲｃＴ（第２図）に制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩと５ａｉｌを反応させて得たＩ　、　Ｉ　ｋｂ
ＤＮＡＩ片Ｑ、Ｉμｇを加え、２０μ（１の反応液中、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼの作用でＤＮＡを連結さ仕た後、Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、の方法［Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ、　１０１．２０（１９８３月で大腸ＩＪ
ＭＩ０３に導入し、プラーク（溶菌斑）を作らせた。白
色プラークの中からＭ１３ｍｐ９に、１．５ｋｂＤＮＡ
断片かクローニングされたＭ　Ｉ　３　ｍｐ９−　ＬＰ
３９−ＲｃＴを得た。

Ｍ　ｌ　３　ｍｐ９　　ＬＰ３９４ｃＴの２本鎖ＤＮＡ
２０μｇを４０ユニツトのＸｈｏｌと４０ユニツトの５
ａｌｌで６００μＱの反応液［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃ９（ｐＩｒ　７　、５　）。

１００ｍＭ　ＮａＣ＋！、　　Ｉ　ＯｍＭ　ＭｇＣＬ、
　　ｌ　ｍＭジチオスレイトール］中、３７℃、４時間
反応させた後、アガロースゲル電気泳動で１．４ｋｂの
シグナル配列を含む修飾り蛋白遺伝子断片を分離した。

該ＤＮＡ　Ｏ、５ｔｔ　ｇとプラスミドｐＧＬＤ　９０
６−１（特開昭６１４３９９１号公報）の５ａｌｌ消化
Ｄ　Ｎ　Ａ　０　、０５μｇと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて結合させた後、大腸菌Ｄ　１−１１を形質
転換させ、アンピンリン耐性を示す組換え体を得た。該
組換え体の中から、Ｇ　Ｌ　Ｄプロモーターの下流にシ
グナル配列コード領域および修飾り蛋白遺伝子−ＰＧＫ
ターミネータ−がプロモーターと同一方向に挿入された
プラスミドｐＧＬＤ　ＬＰ３９−ＲｃＴを得た。（第・
１図）ｐＧｌ、Ｄ　ＬＰ３９−ＲｃＴを用いて、酵母Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｃｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＨ
２２Ｒ−を形質転換し、形質転換体（ＡＩ（２２ＲＶｐ
Ｇ１．Ｄ　ＬＰ３９−ＲｃＴ）を取得した。

実施例８ 修飾Ｉ７蛋白遺伝子の酵母における分泌発現実施例７で
得られた修飾し蛋白遺伝子分泌発現プラスミドを含む酵
母形質転換体を５旋の培徨液［Ｎ！アたり、Ｋ、ＩＩＰ
ｏ、　３ｇ、グルコース５０ｇアスパラギン＝１ｇ、Ｌ
−ヒスチジン１００ｍｇ、　Ｋｌ　Ｏ，１ｍｇ、　Ｍｇ
ＳＯ４・７１１ｔＯ５００ｍｇ、　ＣａＣＱ、・２１１
２０３３０ｍＬ　Ｃｕ５Ｏ，・５１１ｔＯ０，４＋＋＋
ｇ、　ＦｅＳＯ４・７１１ｔＯ２，５ｍｇ。

！ｄｎｓＯ，−４１１ｔＯＯ、４ｍｇ、（Ｎ１１．）３
ＰＯ４・１２Ｍｏｏ、　・３１１．００　、２　ｍｇ、
　Ｚｎ５Ｏ，・７１１２０３　、１　ｍｇ、イノシトー
ル１０ｍｇ、チアミン０．２ｍｇ、ピリドキシン０．２
Ｂ、Ｃａパントテン酸０．２ｍｇ、ナイアシン０．２ｍ
ｇ、ビオチンＱ、ＱＯ２ｍｇを含む］中で３０℃、３日
間域とう培養を行った後、その０．５！ｎ１を上記の培
地４゜５扉に移し、３０°Ｃ，１日間培養し、更にその
２寸を１８−の新鮮培地［ｌＱあたり、ＫＩｌ、Ｐｏ、
　４００ｍｇ、シヨ糖８０ｇ、アスパラギン５ｇ、Ｌ−
ヒスチジン３００ｍｇ、　ＫＣＱ２．Ｏｇ、　ＫＩ　Ｏ
，１ｍｇ、　ｌＡｇ５ｏ４・７１１．０６５０ｍｇ、　
ＣａＣＱｘ　−２Ｈ，０４２９ｍｇ、グルコースＩＯｇ
、）リス−マレイン酸（ＩｌｌＮ６．５）２５ｍＭ、ｃ
ｕｓＯ４・５１（ｚｏ　０，４ｍｇ、　Ｆｅ５０．・７
１１２０２．５ｍｇ〜１ｎｓｏ、　−４１１，００、４
ｍｇ、（Ｎｌ＋、）３ＰＯ，・１２Ｍ０Ｏ，・３Ｈ，０
０、２ｍｇ、　Ｚｎ５Ｏ，・７ｔｌｔＯ３、Ｉ　ｍｇ、
イノシトール１０ｍｇ、チアミン０　、２　ｍｇ、ピリ
ドキシン０　、２　ｍｇ。

Ｃａ−パントテン酸４．０ｍｇ、ナイアンン４．０ｍｇ
ヒオチン０．０４０ｍｇを含む］に移し、３０℃で３日
間域とう培養し、７２時間後にサンプリングし、遠心分
離機（１０，０００Ｘｇ、　　Ｉ　０分間）にかけ、上
清と菌体を分離した。

」二足−Ｌ清のＩｒＢｓＡｇ活性をオースザイム■［ア
ボット（株）製］を用いて測定した。その結果を第２表
に示ずが、ｌ−ｌＢｓＡｇの生成量はブロスＩＱあたり
として計算された。

また、得られた菌体中のＨｒ３ｓＡｇ活性をオースザイ
ムＩ■を用いて測定したところ、ｔｌ　１３　ｓΔｇの
生成量はブロスＩＱあたり約５０ｍｇであった。

第２表 実施例９ 分泌１１ＢｓＡｇ ｅｎｖ蛋白）ＩＢｓＡｇを培地中へ分泌させるためのノ
ブナル配列として卵白リゾデームのシグナルペプチドを
利用した。公知のアミノ酸配列［Ｊｕｎｇ、Ａ。

ｅｔ　　ａｌ、プロシーディング・才ブ・ザ・ナンヨナ
ル・アカデミ−・才ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌＡｃａｄ、　　　Ｓｃｉ、）ＩＩＳ八、、　　７　
７　．５　７　５　９（１９８０）］を参考に第７図に
示すような５′末端にＸｈｏ　ｌサイト、３′末端にＴ
ａｑ　　ｌサイトからうけられている合成ヌクレオチド
配列を用いた。全配列は８個のオリゴヌクレオチドブロ
ック（＃１．＃２．＃３＃４　　＃５．＃６．＃２７．
＃２８）から成り、これらはホスフォアミダイド法［Ｃ
ａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、　ｔｌ、　ｅｔａｌ、テトラ
ヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎｔ、ｅｕ
ｅｒｓ）２２．１８５９（＋　９８１）コによって合成
した。

まず＃２〜＃６　　＃２７をそれぞれ＋０μ＆（５ｔｔ
ｇ）ずつ混合しこれにＩθ倍濃度のキナーゼ緩衝液［０
，５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＩＩＣｌ、０．１Ｍ　ＭｇＣＬ、　
Ｏ，１Ｍメルカプトエタノール、ｐｉ４７．６］２０μ
ＬＩＯｍＭ　　ＡＴ　Ｐ　　２０　ｔｔＱ、Ｔ　４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）２０μＱ（５０Ｕ
）、蒸留水８０μＱを加えて３７℃で２時間反応させた
後、６５℃で２０分処理して反応をとめた。この反応液
にａｌと＃２８とをそれぞれ１０μＱ（５μｇ）を加え
、Ｔ　４リガーゼ（ＮＥＢ社製月０７ｚ１７を加えて１
４°Ｃで一夜反応させた。反応液を６％ポリアクリルア
ミドゲル’ＩＴｉ気泳動にかけ、７１ｂｐのフラグメン
トを切り出し電気泳動溶出によってゲルから抽出し、こ
れを２０μＱの蒸留水に溶解した。

実施例ＩＯ プラスミドＩ）Ｉ−Ｉ　Ｂ　ｒ３３０　［Ｏｎｏ、　Ｙ
、ら、ヌクレイツク・アシブト・リサーチ（Ｎｕｃｌ、
人ａｉｄｓ　Ｒｅｓ、）。

１　　！、＋７４７　　Ｃｌ９８３）］２０ｔｔｇを１
００ユニシトの制限酵素＋３ａｍＨＩで６００μＱの反
応液［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ　（ｐｉ−［７，
５）、５０ｍＭ　ＮａＣ１１０ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ、Ｉ
ｍＭジヂオスレイトールコ中、３７℃−夜反応させた後
、アガロースゲル電気泳動で分離し、３　、２　ｋｂの
ＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡｌ０μｇを３０ユニツトの
ＥｃｏＲＩで２０／ｌＱの反応液［５０ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＩＩＣＩ（１）Ｈ７，５）１００ｍＭ　　ＮａＣ１
，ｌｏｍＭ　　ＭｇＣＩｔ、ＩｍＭジチオスレイトール
］中３７℃、２時間反応させた後３０ユニツトのＴａｑ
ｌで６５℃、２時間反応し、６％ポリアクリルアミドケ
ル電気泳動により０．３４ｋｂＤＮＡ断片を分離した。

プラスミドベク９　　ｐＵｃ　Ｉ　８のＤＮＡ　　２μ
ｇを２０ｔｔＱ（１）反応液［５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
ｔｌｃＩ（ｐＩ（７，５）、ＩＯｍＭＮａＣ１，　Ｉ　
ＯｍＭ　　ＭｇＣ１２，１ｍＭジチオスレイトール］中
１０ユニットのト１ｉｎｄｌＩｌとＩＯユニットのＥｃ
ｏＲｌで３７℃−晩反応を行い、該ＤＮＡをｆ−１ｉｎ
ｄＩＩＩ部位とＥｃｏＲ［部位で開環させ、−２０℃で
保存した。該ＤＮＡ　　０．０４μｇに上記の０．３４
ｋｂ　　ＤＮＡ断片０．２μｇと実施例９により得た７
１ｂｐフラグメント０．５μｇと実施例１で用いた合成
１−１ｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｘｈｏ　［リンカ−０，５μｇ
とを加え、２０μＱの反応液中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの
作用でＤＮＡを連結させた後、Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊの
方法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　
　Ｉ　Ｏ１，２０（１９８３）］で犬大腸菌Ｍ　　１０
３に導入し、コロニーを作らせた。白色コロニーの中か
らｐＵＣＩ８に」二足０．４２ｋｂ　ＤＮＡ断片がクロ
ーニングされたｐ［ＪＣ１１１１−０，４２ＤＮＡを得
た。

ｐＵｃＩ　８−０．４２ＤＮＡのＤＮＡ２０μｇを４０
ユニツトのｌｌ１ｎｄｌｌと４Ｑユ＝−７トのＥｃｏＲ
Ｉで８００μｆ２の反応液［５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ（ｐＩ（７，５）、Ｉ　ＯｍＭ　　ＮａＣｌ、Ｉ　
ＯｍＭ　　ＭｇＣＬ、１ｍＭジチオスレイトール］中、
３７℃で一晩反応させた後、アガロースゲル電気泳動で
０．４２ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。プラスミドベク
ターｐｕＣ＋８のＤＮＡ２μｇを２０μ（！の反応液［
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、ｌ０ｍＭ　
　ＮａＣｌ、ＩＯｍＭＭｇＣｌｙ、　Ｉ　ｍＭジヂオス
レイトール］中、ＩＯユニットのＨｉｎｄ［ｌで３７℃
−晩反応を行い、さらに反応液をＩ　５０ｍＭ　　Ｎａ
Ｃｌの濃度にしてＩＯユニットの５ａｌｌで３７℃−晩
反応を行い、該ＤＮＡをＨｉｎｄ［部位とＳａｌ　　１
部位で開環させ、−２０℃で保存した。該ＤＮＡ　　０
．０４μｇに上記の０゜４２ｋｂＤＮＡ断片０．５μｇ
とプラスミドｐＧＬＤＰ３１−ＲｃＴに制限酵ｇＥｃｏ
ＲＩと５ａｉｌを反応させて得た１゜ＩｋｂＤＮＡ断片
０．１μｇを加え、２０μＱの反応液中、Ｔ　４　Ｄ　
Ｎ　Ａリガーゼの作用でＤＮＡを連結させた後、Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ、　Ｊ、の方法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ、　　ｌ　０１．２０（１９８３）］で大大
腸菌ＭＩ０３に導入し、コロニーを作らせた。白色コロ
ニーの中からｐＵｃＩ８に上記１゜５ｋｂＤＮＡ断片が
クローニングされたｐＵｃＩ８ＬＩＩＰ３９−ＲｃＴを
得た。

ｐＵｃＩ８−Ｌ［ＩＰ３９−ＲｃＴのＤＮＡ　　２０μ
ｇを４０ユニツトのＸｈｏｌと４０ユニツトの５ａｉｌ
で６００μｅの反応液［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
ｐＨ７，５）、Ｉ　００ｍＭ　　ＮａＣ１，ｌ　ＯｍＭ
　ＭｇＣＬ。

１ｍＭジチオスレイトールコ中３７８Ｃ，５時間反応さ
せた後アガロースゲル電気泳動で１．５ｋｂのシグナル
配列を含む修飾し蛋白遺伝子断片を分離した。該ＤＮＡ
０．５μｇとプラスミドＩ）ＧＬＤ９０６ｉ（特開昭６
１−４３９９１号公報）の５ａｉｌ消化ｐＮＡ０．０５
μｇと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた
後、大腸菌ＤＨ１を形質転換させ、アンピシリン耐性を
示す組換え体を得た。数組換え体の中から、Ｇ　Ｌ　Ｄ
プロモーターの下流にシグナル配列コード領域および修
飾■７蛋白遺伝子−ＰＧＫターミネータ−がプロモータ
ーと同一方向に挿入されたプラスミドｐＧＬＤ　　Ｌ口
Ｐ３９−４ＣＴを得た（第８図）。

ｐＧＬＤ　　ＬｎＰ３９−ＲｃＴを用いて酵母Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃａｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａ　Ｈ
２２ｎ−を形質転換し、形質転換体（ＡＨ２２Ｒ″″／
ｐＧＬＤＬＩＩＰ　３９−　ＲｃＴ）を取得した。

実施例１１ 修飾し蛋白遺伝子の酵母における発現 実施例１０で得られた修飾し蛋白遺伝子発現プラスミド
を含む酵母形質転換体を５滅の培養液［ＩＱあたり、Ｋ
ｚｌｌＰ０４３　ｇ、グルコース５０ｇ、アスパラギン
４ｇ、Ｌ−ヒスチジンＩ　００ｍｇ、　Ｋｌ　Ｏ，Ｉｍ
ｇ。

Ｍｇ５Ｏ，−７１１，０５００ｍｇ、　ＣａＣＣｔ　・
２１１！０３３０ｍｇ。

Ｃｕ５Ｏ，−５１１，００，４ｍｇ、　Ｆｅ５０．−７
１１．０２．５ｍｇ、Ｍｎ５ｏ、　・４＋１２００　、
　＝１　ｍｇ、（ＮＨ，）３ＰＯ４・１２Ｍ０Ｏ，・３
１１，００　、２　ｍｇ、　Ｚｎ５Ｏ，・７ＨｔＯ３、
Ｉ　ｍｇ、イノントール１０ｍｇ、チアミン０．２ｍｇ
、ピリドキシン０　、２　ＢＣａ−パントテン酸０．２
ｍｇ、ナイアシン０　、２　ｍｇ。

ビオチン０．００２ｍｇを含む］中で３０°Ｃ，３日間
振とう培養を行った後、その０．５ｄを上記の培地４．
５−に移し、３０℃、■日間培養し、更にその２ｇを１
８滅の新鮮培地［１ｇあたり、ＫＩｌ、Ｐｏ。

４００ｍｇ、シヨ糖８０ｇ、アスパラギン５ｇ、Ｌ−ヒ
スチジン３００ｍｇ、　ＫＣＱ２．Ｏｇ、　ＫＩ　Ｏ，
Ｉｍｇ、　Ｍｇ５Ｑ、・７１１ｚＯ６５０＋Ｊ１ｇ、　
ＣａＣＱｔ・２１１ｔＯ４２９ｍｇ、グルコースＩＯｇ
、トリスーマレイン酸（ｐＨ６，５）２５　　ｍＭ、Ｃ
ｕＳＯ４・５１１ｔＯ０，４ｍｇ、　ＦｅＳＯ４・７Ｈ
２０２、５ｍｇ、　Ｍｎ５Ｏ，・４Ｈｔ００．４　ｍｇ
、（Ｎｌｌａ）＊ＰＯａ　−１２ＭｏＯ３・３！ｌｔｏ
　Ｏ，２ｍｇ、　Ｚｎ５Ｏ，−７ｔｌｔ０３　、　Ｉｍ
ｇ、イノシトール　１０ｍｇ、チアミン０．２ｍｇ、ビ
リドキソン０．２ｍｇ、Ｃａ−パントテン酸４．０ｍｇ
、ナイアシン４．０ｍｇ、ビオチン０．０４０ｍｇを含
む］（こ（多し、３０℃で振どう培養し、４８時間後に
サンプリングし、遠心分離機（１０，０００ｘｇ、　　
Ｉ　０分間）にかけ、上清と菌体を分離した。

得られた菌体中のＨＢｓＡｇ活性をオースサイムロ［ア
ボット（株）製］を用いて測定したところ、Ｉ］＋３ｓ
Δｇの生成ＩＡはブロスＩＱあたり約５０ｍｇであった
。

実施例１２ 修飾し蛋白の精製 （１）菌体からの抽出 実施例！Ｉ記載の方法で培養し、−２０℃で凍結して得
た酵母Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａ　Ｉ４２２　Ｒ
−／１）ＧＬＤ　　Ｌ［ＩＰ３９−ｎｃＴの凍結保存菌
体１５０ｇを０１％ポリオキンエチレン（２０）ソルビ
タンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ　８０）　−７，５Ｍ
尿素−１５ｍＭエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩
（ＥＤＴＡ）−２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオ
ライド（ＰＭＳＦ）−０，ＩｍＭ（＋）−アミジノフェ
ニル）メタンスルボニルフルオライド塩酸塩（ＰＡＰＭ
ＳＦ）−１００ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液（ｐ
ｌ−１７，２）６００−に均一に懸濁した。この’ｆＡ
Ｅ液をビートビータ−（バイオスペック社、米国）によ
り、水中でガラスピーズ（直径０，５０〜０．７５ｍｍ
）で６分間処理し、細胞を破壊した。この抽出液を１２
０００ｘｇで３０分間遠心して上清５４０藏を得た。

（２）ポリエチレングリコールによる分画上記で得た上
清に０．７５倍量の３３％濃度（Ｗ／Ｗ）ポリエチレン
グリコール６０００（ＰＥＧ６０００）をゆっくり添加
し、ｌ）Ｈを６．０に調整したのち３０分間攪拌してか
ら、Ｉ　３９００　ｘｇで３０分間遠心してＨＢｓＡｇ
画分を沈澱として回収した。得られた沈澱物を７．５Ｍ
尿素−１５ｍＭＥＤＴＡ−２ｍＭ　　ＰＭＳＦ−０，１
ｍＭ　　Ｐ−ＡＰＭＳＦ−１００ｍＭリン酸ナトリウム
を含む緩衝液（ｐＨ７，２）２００ｄ中で４０℃、−晩
攪拌して溶解した。

（３）セシウムクロライド（ＣｓＣ＆）密度勾配超遠心
分離 Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｓ　Ｗ　−２８用超遠心チユーブに、
４０％セシウムクロライド（ＣｓＣｆｆ）−５Ｍ尿素−
２ｍＭＥＤ↑Ａ−１ｍＭ　　ＰＭＳＰ−０，０５ｍＭＰ
−ＡＰＭＳＦ−１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７
，４）４滅、３０％ＣｓＣｆｆ１−５Ｍ尿素−２ｍＭＥ
ＤＴＡ−１ｍＭ　　ＰＭＳＦ−０，０５ｍＭ　　ＰＡＰ
ＭＳＦ　　ｌ０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐ１１７．
４）６＋Ｊ、２０％ＣｓＣＣ−５Ｍ尿素−２ｍＭＥＤＴ
Δ−ＩｍＭ　　ＰＭＳＰ−０，０５ｍＭ　　ＰＡＰＭＳ
　Ｆ−１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７、−４）
　７　ｒｔｒｌ　、　Ｉ　０％Ｃ５Ｃ（！−５Ｍ尿素−
２ｍＭＥＤＴΔ−１ｍＭ　　ＰＭＳＦ−０，０５ｍＭ　
　ＰＡＰＭＳＦ−１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐｌ
−１７，４）ＬＪおよび上記溶解液１３ノｄを重層し、
２８００　Ｏｒｐｍ、４℃で１６時間超遠心を行いｆ（
［３Ｓ八ｇ修飾Ｉ７蛋白を密度１．２付近に濃縮、精製
した。

上記超遠心により濃縮、精製されたｌ−ｌＢｓＡｇ画分
を７．５Ｍ尿素−１５ｍＭ　　ＥＤＴＡ−２ｍＭＰＭＳ
Ｐ−０，ＩｍＭ　Ｐ　　ＡＰＭＳＦ　　Ｉ　００ｍＭリ
ン酸ナトリウムを含む緩衝液（ｐＨ７，２）に対して透
析後、得られた溶液を上記のＣ５ＣＱ密度勾配超遠心に
より再度分画し、得られた濃縮、精製Ｈ１３ｓ　Ａ　ｇ
画分をＰ　Ｉ’３　Ｓ　（１ρ当たりＮ　ａ　ＣＱ　８
　ｇ　、　Ｎ　ａ　ｔｌｌＰＯ，−＋　２Ｈ２０２，９
ｇ、ＫＨ，Ｐｏ、０．２ｇ。

ＫＣ（！　０．２ｇを含む）−０，１ｍＭ　　Ｐ−ＡＰ
ＭＳＦに対して透析し、３１Ｍ１．のｔｌＢｓＡｇ修飾
り蛋白溶液を得た。

（４）ショ糖密度勾配超遠心分離 Ｂｅｃｌｖａｎに５Ｗ−２８用超遠心チユーブに、５０
％ンヨ糖−２ｍＭ　　ＥＤＴＡ−０，０５ｍＭ、ＰＡ　
ＰＭＳ　Ｆ　−Ｉ　０１１１Ｍリン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ７，４）６ＩＲ１，，４０％シヨ糖−２ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ−００５ｍＭ　　Ｐ−ＡＰＭＳＦ−１０＋ｎＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）６ｄ、３０％シヨ糖
−２ｍＭＥＤＴＡ−０，ＯＦｚｎＭ　　Ｐ−ＡＰＭＳＦ
　−１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）６１
ｎｌ、２０％シヨ糖−２ｍＭ　　ＥＤＴＡ−０，０５ｍ
Ｍ　　Ｐ−ＡＰＭＳＦ−１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７゜＝１）６ｄ、１０％０％シミ２ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ−０，０５ｍＭ　　Ｐ−ＡＰＭＳＦ−１０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）６！Ｒ１，、および上
記（３）のＨＢｓＡｇ修飾り蛋白溶液７Ｍｌを重層し、
２８００　Ｏｒｐｍ４℃で１６時間超遠心を行いＨＢｓ
Ａｇ修飾り蛋白をショ糖轟度３５％付近に濃縮、精製し
た。

上記超遠心により濃縮、精製されたＨＢｓＡｇ修飾り蛋
白画分をＰＢＳ−０，１ｍＭ　　Ｐ　　ＡＰＭＳＦに対
して透析後、得られた溶液を上記のショ糖密度勾配超遠
心により再度分画、ｄ３折して２６威のＩＩ　１３　ｓ
Δｇ修飾Ｉ７蛋白溶液を得た。

（５）セファクリルＳ−４００によるゲルろ過上記（・
１）で得たＩＩｆ３ｓＡｇ修飾り蛋白溶液をＰＢＳで平
衡化したセファクリルＳ−４００（ファルマノア社、ス
ウェーチン）カラム（１，８ｘ　８５ｃｍ２１０１Ｉｉ
７りに負荷し、同一緩衝液で溶出して、ｌ−ｒＩ３ｓＡ
ｇ修飾り蛋白画分８０滅を集めた。溶出液を濃縮して、
蛋白濃度３３５μｇ／滅のＨＢｓＡｇ修飾り蛋白精製標
品液５　、０　ｎｉｌを得た。

実施例１３ 修飾し蛋白の性質 実施例Ｉ２で得たＨ　１３　ｓ　Ａ　ｇ修飾り蛋白につ
いて以下の性質を調べた。

（１）分子量 ラエムリ［ＮａＬｕｒｅ、２２７．６８０（１９７０）
］に準じて５ＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル電気
泳動を行ったあと、銀染色を行なった結果、該ＨＢｓＡ
ｇ修飾し蛋白は分子１約４９０００および５２０００の
糖蛋白から構成されていた。

（２）Ｎ末端アミノ酸配列 該ＨＢｓＡｇ修飾り蛋白２　、２　ｎｍｏｌに気相プロ
テインシークエネーター（アプライド・バイオンステム
ズ社製４７０Ａ型、アメリカ）を用いる自動エドマン分
解法を適用して、Ｎ末端アミノ酸配列を分析した。フェ
ニルチオヒダントインアミノ酸（ＰＴＨ−アミノ酸）は
ミクロパック５Ｐ−ＯＤＳカラム（パリアン社製、アメ
リカ）を用いる高速液体クロマトグラフィーにより同定
した。各ステップで検出されたＰ　Ｔ　ｌ−１−アミノ
酸を第３表に示す。

（以下余白） 第３表 ｙｓ ａｌ ｉｎ ｌｙ ｅｔ ｌｙ ｈｒ ｅａ ａｌ Ｐｒ。

５ｎ Ｐｒ。

ｅｕ ｌｙ ｈｅ ｈｅ 表中Ｘについては未決定である。

（３）電子顕微鏡観察 該１−（Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ修飾し蛋白を日本電子の１２０
０Ｅ型電子顕微鏡で観察した結果、直径２３．３±３゜
３ｎｍの球状粒子が観察された。他に主として短径１２
．７±Ｉ　、　ｌ　ｎｍ、長径約４０〜１２０ｎｍから
なる棒状粒子が見られた。

（４）Ｃ末端アミノ酸配列 該ＨＢｓＡｇ修飾り蛋白２．０４ｒ＋ｍｏｌについてＣ
末端アミノ酸配列の分析を行った結果、イソロイノンで
あった。

実施例１４ 修飾し蛋白のｖｔ製 実施例８記載の方法で培養し、−２０℃で凍結して得た
酵母Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａ　Ｈ２２Ｒ７／ｐ
Ｇ　ＬＤ　　ＬＰ３９−ＲｃＴの凍結保存菌体２１０ｇ
を用いて、実施例１２と同様の方法でＨＢｓＡｇ修飾り
蛋白を抽出、精製して、蛋白濃度４５５μｇ／−のＨＢ
ｓＡｇ修飾り蛋白精製標品液３．５１１Ｉ１２を得た。

実施例１５ 修飾し蛋白の性質 実施例１４で得たＨＢｓＡｇ修飾し蛋白について以下の
性質を調べた。

（１）分子ｉｉ１ 実施例＋３（１）と同様の方法でＨｒ３ｓΔｇ修飾１，
蛋修飾槽成蛋白質の分子量を調べたところ、５００００
と５２０００であった。

（２）Ｎ末端アミノ酸配列 該１（［３ｓ　Ａ　ｇ修飾し蛋白２　、７　ｎｍｏｌに
ついて実施例＋３（２）と同様の方法で調べた結果を第
４表に示す。

（以下余白） 第４表 Ｉ　　　　　　　　　　　　Ｌｙｓ ２　　　　　　　　　　　　Ｖａ１ ３　　　　　　　　　　　　Ｍ　ｅ　ｔ４　　　　　　
　　　　　　　Ｇ１ｎ ５　　　　　　　　　　　Ｔｒｐ ６　　　　　　　　　　　　Ａｓｎ Ｘ Ｘ ９　　　　　　　　　　　　Ｘ １０　　　　　　　　　　　　　Ｘ Ｉ　　　　　　　　　　　　　ＣＩｎ ２　　　　　　　　　　　ＧＩＹ ３　　　　　　　　　　　　Ｍｅｔ ４　　　　　　　　　　　ｃｒｙ ５　　　　　　　　　　　　Ｔｈｒ ６　　　　　　　　　　　　Ｘ ７　　　　　　　　　　　　Ｌｅｕ ８　　　　　　　　　　　　Ｘ ９　　　　　　　　　　　　Ｖａ１ ２０　　　　　　　　　　　　Ｐｒ。

表中Ｘについては未決定である。

（３）　７１ｔ子顕微鏡観察 該）Ｉ　Ｂ　ｓへｇ修飾■７蛋白を日本電子の１２００
Ｅ型電子顕微鏡で観察した結果、直径２４６±３゜９ｎ
ｍの球状粒子が観察された。他に主として短径１３２±
Ｉ　、　７　ｎｍ、長径約４０〜１３０ｎｍからなる棒
状粒子が見られた。

（４）Ｃ末端アミノ酸配列 該ｔ［Ｉ３ｓＡｇ修飾り蛋白２．Ｉ５ｎｍｏｌにツｌ、
ＮてＣ末端アミノ酸配列の分析を行った結果、イソロイ
ノンであった。

実施例１６ 修飾Ｍ蛋白の精製 実施例３に記載の培養物を４℃、１３９００ｘｇで１０
分間遠心して上清１０ρを得た。この上清を６０％硫安
飽和にした後、１２０００ｘｇで２０分間遠心してＩ（
Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ修飾Ｍ蛋白画分を沈澱として回収した。

得られた沈澱物を２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）７０滅に懸濁し、同一緩衝液に対して透析後
、得られた溶液を２７００ＱＸｇで１０分間遠心して上
清７０滅を得た。

（１）抗体力ラム 上記で得た上清７０−を２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐｉ−１６、０）で平衡化したマウス由来の抗ｌｌ
ＢｓＡｇ抗体（国際出願ＰＣＴ／ＪＰ８５１００１６Ｉ
の参芳例１〜３に記載）［特願昭６１−４０９２号：昭
和６１年１月ｌＯ日提出］を結合させたナルミルーセル
ロファイン力ラム（Ｉ　０Ｍ１）を通過させた。次いで
ＨＢｓＡｇを吸着させたカラムをＩ　Ｍチオンアン酸ア
ンモニウム−１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６
、０）で洗浄したのち、４Ｍチオシアン酸アンモニウム
−１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６、０）で溶
出し、この溶出液を２．２１ＲＩｌにまで５縮した。

（２）セファクリルＳ−３００によるゲルろ過上記で得
た濃縮液を０．８５％塩化ナトリウム２０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化したセファクリル
Ｓ−３００（ファルマシア社、スウェーチン）カラム（
１，８ｘ　７４　ｃｍ、３ｄ）に負荷し、同一緩衝液で
溶出、ｆｓ縮して蛋白濃度１５μｇ／蔵の１−（ＢｓＡ
ｇ修飾Ｍ蛋白精製標品液１゜５−を得た。

実施例１７ 修飾Ｍ蛋白の性質 実施例１６で得たＨ　Ｂ　ｓへｇ修飾Ｍ蛋白について以
下の性質を調べた。

（１）分子量 ラエムリ［Ｎａｔｕｒｅ、２２７，６８０（１９７０）
］に準じて該１−ｒＢｓＡｇを５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドスラブゲル電気泳動にかけ、銀染色を行った結果、
該ｌｌＢｓＡｇｌＢｓＡｇ修分子量的３４０００゜３１
０００　２８０００　２４０００．１７０００゜および
１４０００の蛋白質から構成されていた。

（２）電子顕＠鏡観察 該Ｈ１３ｓ　Ａ　ｇ修飾Ｍ蛋白を日本電子の１２００１
Ｅ型電子顕微鏡で観察した結果、直径１９．４±２３ｎ
ｍの球状粒子が観察された。

各プラスミド中のシグナルペプチドＤＮＡとＬ（ＢｓＡ
ｇＤＮＡとの間のスペーサーＤＮＡ配列は下記のとおり
である。

（１）　ｐＧＬＤ　ＬＰ３９−ＲｃＴスペーサー配列＾
＾Ｇ　ＧＴＴ　ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＴＧＧ　ＡＡＴ　ＴＣ
ＣＴＣＧ　ＡＣＣＣＧＡＬｙｓ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｇｌ
ｎ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ
ＣＡＡ　ＧＧＣ Ｇｉｎ　Ｇｌｙ （２）　ｐＧＬＤ　ＬＰ３１ＲｃＴスペーサー配列ＡＡ
Ｇ　　ＧＴＴ ｔｙｓ　　Ｍａｌ （３）　ｐＧＬＤ　ＬＰ２５Ｗスペーサー配列ＡＡＧ　
ＧＴＴ　ＴＴＣＧＧＧ　ＡＴＣＬｙｓ　Ｍａｌ　　Ｐｈ
ｅ　Ｇｌｙ　　１ｉｅ（１１）　ｐＧＬＤ　１．１１　
Ｐ３９−ＲｃＴスペーサー配列＾ＡＧ　ＧＴＴ　ＣＧＡ
　ＣＡＡ　ＧＧＣＬｙｓ　Ｖａｌ　　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　
Ｇｌｙ（発明の効果） 本発明によればＨＢｓＡｇ活性を有するペプチドは細胞
外に分泌され、精製工程が容易である。また、特に［、
蛋白については細胞外に分泌される一方、細胞内に多重
に蓄積される。したがってＬ蛋白の量産化が可能になっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は卵白リゾチームシグナルペプチドをコドするＤ
ＮＡ配列を示す。 第２図はｐＧＬＤ　１．Ｐ３１−ＲｃＴの構築図を、第
３図はｐＧＬＤ　ＬＩ１２５Ｗの構築図を、第４図はｐ
Ｇｌ、Ｄ　ＬＰ３９−ＲｃＴの構築図を示す。 第５図はａｄｒ型ＨＢ　ｓＡ　ｇ　１．、蛋白（Ｍ蛋白
、Ｓ蛋白）をコードするＤＮＡ配列およびそのアミノ酸
配列を示し、第６図はａｄｗ型ＨＢｓＡｇ　Ｓ蛋白をコ
ードするＤＮＡ配列およびそのアミノ酸配列を示す。 第７図は卵白リゾチームシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ配列を示し、第８図はｐＧＬＤ　Ｌ　ＦＪ　Ｐ３
９−ＲｃＴの構築図を示す。 代理人　　弁理士　岩　１）　　弘 昧

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原活性を有するペプチド
   をコードするＤＮＡの５’−末端に真核細胞において作
   動するシグナルペプチドをコードするＤＮＡが結合され
   たＤＮＡ。（２）Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原活性を有す
   るペプチドをコードするＤＮＡの５’−末端に真核細胞
   において作動するシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
   が結合されたＤＮＡにより形質転換された真核細胞。 （３）Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原活性を有するペプチド
   をコードするＤＮＡの５’−末端に真核細胞において作
   動するシグナルペプチドをコードするＤＮＡが結合され
   たＤＮＡにより形質転換された真核細胞を培養し、培養
   液中にＢ型肝炎ウィルス表面抗原活性を有するペプチド
   を生成蓄積させ、該ペプチドを採取することを特徴とす
   る、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原活性を有するペプチドの
   製造法。 （４）Ｂ型肝炎ウィルスのｐｒｅ−Ｓ１，ｐｒｅ−Ｓ２
   およびＳ抗原性を有するペプチドをコードするＤＮＡの
   ５’末端に真核細胞において作動するシグナルペプチド
   をコードするＤＮＡが結合されたＤＮＡにより形質転換
   された真核細胞を培養し、培養物中にＢ型肝炎ウィルス
   のｐｒｅ−Ｓ１，ｐｒｅ−Ｓ２およびＳ抗原性を有する
   ペプチドを生成蓄積させ、該ペプチドを採取することを
   特徴とする、Ｂ型肝炎ウィルスのｐｒｅ−Ｓ１，ｐｒｅ
   −Ｓ２およびＳ抗原性を有するペプチドの製造法。