KR900005534B1 - 복합 프로모터를 이용한 효모 발현 벡터에 의한 b형 간염 바이러스 표면항원들의 제조방법 - Google Patents

Abstract

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Description

복합 프로모터를 이용한 효모 발현 벡터에 의한 B형 간염 바이러스 표면항원들의 제조방법

제1도는 pBR322 플라스미드의 BamHI부위에 HBV DNA가 클로닝된 pHBV 156 플라스미드를 나타내며,

제2도는 디데옥시 사슬 정지 DNA 서열방법에 의해 결정된 pre-S2부위 및 S유전자의 염기 배열 순서도를 나타내며,

제3도는 pre-S2부위와 S유전자의 5' 및 3' 말단의 불필요한 부분을 제거하여 코딩 서열만을 갖는 pHBs148 및 pHBPs149의 제조방법을 설명한 도면을 나타내며,

제4도는 pUC18 플라스미드의 EcoRI부위에 클로닝된 α-인자 1(MFα1)유전자를 나타낸 도면이며,

제5도는 pUC18의 EcoRI 부위에 클로닝된 GAL1(갈락토키나제) 유전자 및 GAL10 유전자의 일부 및 중앙의 조절부위를 포함하는 서열을 나타내는 도면이며,

제6도는 α-인자 유전자의 프로모터와 GAL1, GAL10 유전자의 조절부위를 융합한 혼성 프로모터를 갖고 α-유전자의 프리-프로서열 및 정지서열을 갖는 pαG629플라스미드 제조방법을 설명한 도면을 나타내며,

제7도는 효모에서 pre-S2 부위 및 S유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있는 pMH148 및 pMH149 벡터를 제조하는 방법을 설명한 도면을 나타낸다.

본 발명은 재조합 DNA기술을 이용하여 효모에서 B형 간염 바이러스 표면항원들을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더 상세히는 본 발명은 효모 유래 유전자 2종의 프로모터를 변형 제작한 복합 프로모터의 제조방법, 이 복합 프로모터를 갖는 효모 발현 벡터의 제조방법 및 이를 이용한 B형 간염 바이러스의 표면항원들을 제조하는 방법에 관한 것이다.

B형 간염은 바이러스에 의한 간질환의 일종으로 열대아프리카, 동남아시아 및 극동아시아에 널리 퍼져있는데, 특히 중요한 것은 B형 간염 환자의 5-10%는 만성 보균자화 되며 이들중 상당수는 간경변이나 간암으로 발전하게 되는 것이다.

B형 간염 바이러스는 데인(Dane)입자라고 불리우는 42nm 크기의 구형 입자로서 일부의 단일 나선 부분을 포함하는 이중나선 구조의 DNA를 갖고 있으며 내인성 중합 요소(endogeneone polymerase), 핵항원(core antigen) 및 외피(envelope)를 형성하는 표면항원으로 구성되어 있다. 이중에서 표면항원은 항원성의 차이에 따라 adr, adw, ayr 및 ayw와 같은 아형(subtype)으로 분류할 수 있는데 한국에서는 주로 adr형만이 검출되고 있다. 또한, 표면항원은 환자의 혈액내에서 데인입자외에 22mm 크기의 구형입자 및 판상형 입자로도 발견되는데, 이들 표면항원은 다른 바이러스의 경우와 마찬가지로 백신으로서의 역할을 할 수 있다는 것은 공지의 사실이다. 그러나 인간과 침팬지만이 B형 간염 바이러스로 감염될 수 있는 유일한 숙주 동물이기 때문에 다른 배양세포를 B형 간염 바이러스로 감염시켜 백신을 생산코져 하는 시도는 모두 실패하였다. 따라서 1980년대 초반까지는 오직 환자의 혈액만이 백신의 유일한 원료로 사용되었는데 한정된 혈액의 양과 인간 면역결핍증 바이러스와 같은 외래성 바이러스(exogeneou virus)를 완전히 제거하여야 하는 문제점등을 안고 있었다.

환자의 혈액으로부터 분리한 표면항원을 좀더 자세히 분석해보면 지금까지 확인된 226개의 아미노산으로 구성된 주표면항원(S-antigen)의 앞쪽에 108 내지 119개의 아미노산으로 구성된 pre-S1부위 및 55개의 아미노산으로 구성된 pre-S2 부위가 부착된 여러가지 형태의 표면항원의 존재함을 알 수 있다. 즉 pre-S1 및 pre-S2부위가 붙어있는 표면항원인 39킬로달톤의 p39, pre-S2만이 붙어있는 표면항원인 31킬로달톤의 p31 및 pre-S부위가 없는 24킬로달톤의 p24와 이들의 글리코실화된 형태인 gp42, gp33 및 gp27의 6가지 형태로 존재한다. 한편 데인입자의 표면에는 중합된 인혈청 알부민(polymerized Human serum albumin)과 결합할 수 있는 수용체를 갖고 있기 때문에 알부민과 결합하여 간세표 표면에 부착되어 감염하는 것으로 알려져 있다. 그런데 p31표면항원의 pre-S2부위에도 중합된 인혈청 알부민의 수용체가 존재한다는 것이 증명되었다. 그러므로 데인입자의 중합된 인혈청 알부민 수용체를 p31에 대한 항체로 은폐시킬 수 있다면 데인입자가 간세포와 더 결합할 수 없기 때문에 B형 간염 바이러스의 감염이 더 효과적으로 예방될 수 있다. 다시 말하면 지금까지 백신의 주성분으로 사용되었던 p24 표면항원과 더불어 pre-S2부위를 갖고 있는 p31도 백신으로서의 좋은 효과를 나타낼 수 있다는 것이다.

최근 분자 생물학의 발전은 재조합 DNA기술을 이용하여 특정 유전자를 선별, 증폭하여 유전자의 구조 및 기능을 정확하게 규명하는데 성공하였을 뿐만 아니라, 많은 외래성 단백질들을 이.콜라이(Escherichia coli) 및 효모에서 형질 발현시킬 수 있게 되었다. 따라서 혈장 유래 B형 간염백신의 안정성 및 대량생산의 문제점을 해결하기 위해 많은 연구자들은 재조합 DNA기술을 응용한 B형 간염백신의 생산에 박차를 가하게 되었다.

많은 재조합 유도된 단백질 발현에 가장 통상적으로 사용되는 미생물계는 대장균과 효모인데 이중에서도 특히 이.콜라이(Escherichia coli)와 사카로마이세스.세레비지에가 널리 이용되고 있다. 그러나 이.콜라이에서는 면역학적 활성을 갖는 표면항원을 발현시키려는 시도는 성공하지 못하였다.

반면, 사카로마이세스.세레비지에는 면역학적 활성을 갖는 표면항원을 발현시킬 수 있음이 밝혀졌다. 즉, 효모에서 발현된 표면항원을 백신화하였을 때 혈장 유래된 표면항원과 마찬가지로 인간에 대한 임상적 시험에서 면역학적으로 유효하여 B형 간염 바이러스의 감염을 예방할 수 있음이 입증되었다. 이러한 과정에서 볼 때 재조합 표면항원을 발현시키는 숙주 세포로서 사카로마이세스 세레비지에는 매우 유용하며 p24 및 pre-S2를 포함하는 p31을 사카로마이에스.세레비지에에서 발현시키는 것이 바람직할 것이다.

재조합 DNA기술을 이용하여 유용한 단백질을 미생물계에서 대량생산 하고져 할때는 몇가지 중요한 문제들을 선결하여서만 가능하게 된다.

첫째, 대량생산을 위해서는 유전자 발현의 양을 조절하는 프로모터 및 말단부(terminator)의 올바른 선택이 필요하다. 즉 사용하고자 하는 숙주 미생물에게 과량생산되고 있는 단백질 유전자의 강력한 프로모터 및 말단부를 사용하여야 하는 것이다.

둘째, 발현시키고자 하는 단백질의 고유의 성질을 변형시키지 않고, 활성을 갖고 있는 형태로 생산할 수 이는 숙주를 선택하여야 한다. 예를 들면, 원하는 단백질이 면역원성이나 생화학적 성질을 갖기 위해서 글리코실화(glycosylation)나 인산화(phosphorylation)되어야 한다면, 발현시키고자 하는 숙주에서도 이러한 기능을 수행할 수 있어야만 생산균주로 사용할 수 있다.

세째, 단백질을 가능한한 정제하기 용이한 형태로 발현시켜야 한다. 즉, 아무리 많은 양을 발현시킨다 하더라도 정제하기가 어렵다면 최종적으로 사용가능한 양은 매우 적어지기 때문이다.

네째, 형질 전환된 미생물이 매우 안정하여야 한다는 것이다. 즉, 항시 일정한 생산성을 나타내어야만 규모확장이나 배양의 문제점들을 배제시킬 수 있는 것이다.

일반적으로 여러가지 재조합 미생물 발현계에서 많은 양의 이종 단백질을 합성케 할 경우, 숙주 생물에 해로운 것으로 밝혀졌다. 결과적으로 이러한 이종 단백질의 발현에 대한 선택압이 있어 대량 배양을 할 경우 이종 단백질의 발현을 중지하거나 발현을 극소화하여 비경제적인 공급원으로 변형되게 된다. 일부의 경우 이러한 유해한 영향은 강력한 프로모터를 사용할 때 종종 나타나게 된다. 이러한 현상을 극복하는 한가지 방법으로 평상시에는 발현이 억제되었다가 어떤 유도물질(inducer)에 유도가능한 프로모터를 사용할 수도 있다. 하지만 이 경우에도 숙주가 동종 단백질을 유도할 때와 같은 대폭적인 유도는 이종 단백질의 경우는 일반적으로 도달될 수 없다는 것이 밝혀져 있다. 또한, 정제를 보다 용이하게 하기 위하여 숙주 세포의 분비 유도 유전자를 사용하는 경우도 있는데, 이는 발현 단백질의 종류에 따라 불가능한 경우가 많다.

표면항원 p24 및 pre-S2를 포함하는 p31를 발현하기에 유용한 것으로 알려진 사카로마이세스 세레비지에의 경우 이용가능한 여러종류의 프로모터들이 알려져 있다. 첫째 강력한 프로모터를 갖고있는 것으로 알려진 알콜 탈소수효소I B.D.Hall 등, Jounal of Biological Science,257,(1982)], 글리셀알데하이드-3-인산 탈수소효소[Holland J. P. 등, JBC,255(1980)) 및 3-인산 글리세레이트 키나제(Dobson,M.J 등, Nucleic acid Res. 10,2656(1982)]의 유전자들의 구조가 밝혀졌으며 이들의 프로모터를 이용하여 표면항원을 발현시키고져 하는 시도가 많이 있었다[Valenzuela,et al,Nature,298,347(1980)] Zuclecerman et al, Nature,295,95(1982),R.A. Hifzeman et al,Nucleic acid Res.11,2745(1983)]. 그러나, 대부분의 경우 많은 양의 표면항원을 안정력으로 발현시키는 데는 문제점이 있음을 시사하고 있다. 둘째, 유도성 프로모터를 갖고있는 것으로 알려진 억제 산인산 화제(Repressible-aid phosphatase)[Myehack,B등, EMBO J,6,675(1982)]갈락토오즈(또는 젖당) 유도 유전자[Paois R.W 등,J.M.Boil 152,885(1982)] 및 알콜 탈수효소II(Alcohol dehydrogenseII )[A.Miya nohara 등, Proc,Natl,Acad,Sci. 80,1(1983)]의 유전자구조가 알려져 있으며, 이들 프로모터를 이용하여 표면항원을 발현하고자 하는 시도들이 있엇다. 그러나 이 경우에도 마찬가지로 숙주내의 동종 단백질의 경우처럼 높은 유도성을 나타내지는 않았다. 세째 배양물로 분비시킬 수 있는 분비 프로모터를 갖고 있는 α-인자 [J.Kujan 등, Cell,30,933(1982)]와 살상독소(Killer toxin)의 유전자 구조가 알려져 있으나 표면항원을 발현 분비시키는 시도는 없었다. 이것은 표면항원이 22nm 크기의 입자로 존재하기 때문일것이라 추정된다.

본 발명은 효모, 사카로마이세스 세레비지에에서 α-인자 유전자와 갈락토오즈 유도 유전자 1.10의 조절부분을 변형 제작한 복합 프로모터의 제조방법. 이 복합 프로모터를 갖는 발현 벡터의 제조방법, 이 발현벡터의 프로모터 3' 말단에 B형 간혐 바이러스의 표면항원 p24 및 pre-S2를 함유하는 p31의 유전자를 접합시킨 DNA분자, 이 벡터로 형질 전환된 사카로마이세스 세레비지에 및 여기서 수득된 표면항원들에 관한 것이다.

상기에서 서술한 바와 마찬가지로 재조합 미생물 발현계에서 극복되어야 할 여러 문제들을 검토하고 사카로마이세스 세레비지에에서 사용할 수 있는 여러가지 프로모터들의 성질들을 살펴볼 때, 한가지 성질을 갖는 프로모터를 이용하는 것은 무리가 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 B형 간염 바이러스의 표면항원 p24와 p31을 효율적이고 경제적으로 발현시키기 위해 여러가지 특징을 복합적으로 나타낼 수 있는 복합 프로모터를 제조하였다. 즉, α-인자의 프로모터의 성질을 이용하여 숙주에 해가 되지 않을 정도의 표면항원을 항시 발현시켜 대량 배양에서의 불안정성 문제를 해결함과 동시에 α-인자의 프리-프로서열(pre-pro sequence)을 적절히 이용하여 발현된 표면항원들이 세포체에서 분해되지 않고 분해경로를 통해 세포막으로 이동하게 함으로써 최종 정제과정을 용이하게 하였다. 또한 α-인자의 프로모터의 5' 말단에 존재하는 조절기능에 무관한 부분을 다시 갈락토오즈 유도 유전자 1, 10의 핵심 조절부위만으로 대체하여 대량배양의 후반부에서 갈락토오즈 유도배양을 실시함으로써 매우 효과적으로 발현양을 급격히 증가시킬 수 있는 특성을 갖게 하였다.

환자의 혈액으로부터 adr형의 데인입자를 초고속 원심법으로 분리정제하여 자연적으로 일부가 단일나선구조로 되어있는 B 간염 바이러스의 DNA를 내성 중합 효소를 이용하여 완전한 이중나선 구조로 복구시킨다. 복구된 DNA를 탈 단백화하여 분리하고 Bam HI으로 완전히 절단하고 이.콜라이 벡터인 pBR322를 Bam HI으로 절단하여 이 두종류의 DNA를 다시 연결하여 이.콜라이를 형질전환시킨다.

형질 전환체 중에서 완전한 B형 간염 바이러스의 DNA를 함유하는 재조합체만 선별 분리한 뒤 여러가지 제한효소와 Bal 31-뉴클레아제를 이용하여 p24와 p31의 유전자 부분만을 갖는 재조합체를 제조한다. 이들을 각각 pUC18벡터의 HindIII, salI부위에서 서브클로닝 한다.

사카로마이세스 세레비지에의 염색체 DNA(chromosomal DNA)를 EcoRI과 HindIII로 완전 절단하여 EcoRI과 HindIII로 절단한 pUC18에 연결하여 만든 효모 유전자 은행에서 DNA 합성기로 합성한 5'-GTA CAT TGG TTG GCC AGG-3'의 올리고뉴클레오티드 탐침(oligonucleotide probe)으로 α-인자를 선별하고, 이를 다시 EcoRI으로 자른뒤 PBR 322의 유도체에 옮긴다. 마찬가지로 효모 유전자은행에서 DNA합성기로 합성한 5'-AAT TCG ACA GTT ATC-3' 올리고뉴클레오티드 탐침으로 Gal 1.10의 조절부분을 선별하여 이를 다시 Sau3A, DdeI으로 완전히 절단하여 Sau3A, EcoRI으로 자른 α-인자의 5' 발단부위와 대체한다. 이렇게 하여 만들어진 벡터의 HindIII, SalI부위에 B형 간염 바이러스의 표면항원들의 유전자들을 옮긴뒤 전체의 발현부분을 EcoRI으로 잘라 이.콜라이와 효모의 셔틀벡터(shuttle vector)인 PMT5의 EcoRI부위에 연결하여 효모 발현벡터를 완성한 후, 이 벡터로 사카로마이세스 세레비지에 20B-12균주를 형질 전환시켜 트립토판이 없는 최소배지에서 올바른 형질 전환체를 선별하여 B형 간염 바이러스의 표면항원 생산균주로 사용하였다.

첨부 도면으로 본 발명을 설명한다.

제1도는 pBR322플라스미드의 BamHI부위에 HVB DNA가 클로닝된 pHBV156플라스미드로서 핵항원 및 표면항원의 코오딩서열을 내포하는 3.2Kb의 크기이며, XhoI, XbaI부위가 표면항원 유전자에 존재하며 핵항원에는 두개의 BalII부위가 존재한다. -선은 pBR322 DNA이며,

는 HBV DNA를 나타낸다.

제2도는 디데옥시 사슬정지 DNA서열(Dideoxy chanin termination DNA sequencing)방법에 의하여 결정된 pre-S2부위 및 S유전자의 염기 배열 순서도로서, 1번 사각형은 pre-S2부위의 개시 코돈이며, 2번 사각형은 S유전자의 개시코돈이며, 3번 삭각형은 정지코돈이다. 위에는 염기 배열순서를 아래는 이에 해당하는 아미노산서열을 표시하였다. 좌우의 숫자는 염기의 위치이다.

제3도는 pre-S2부위와 S유전자의 5' 및 3' 말단의 불필요한 부분을 제거하여 코딩서열만을 갖는 pHBs148 및 pHBPs149의 제조방법을 설명한 도면으로서, 3' 말단을 AccI으로 전달하여 합성올리고뉴클레오타이드를 연결함으로써 불필요한 부분을 제거함과 동시에 유전자의 변형을 용이하게 할 수 있도록 새로운 제한효소부위를 첨가하였다. 5' 말단은 pre-S2에 가장 가까운 TagI부위를 이용하여(pHBV158) Ba131 뉴클레아제를 처리함으로써 pre-S2 및 S유전자의 개시코론으로 시작되는 플라스미드를 제조하였다.(pHBs148 및 pHBPs149)

제4도는 pUC18플라스미드의 EcoRI부위에 클로닝된 α-인자 1(MFα1)유전자를 나타낸 도면으로서 EcoRI에서 PstI 부위까지는 프로모터 부분이, PstI에서 Hind III부위까지는 α-인자의 변형에 관계되는 프리-프로서열이 존재하여 HindIII부위에는 α-인자의 13개 아미노산을 코오딩하는 4개의 구조 유전자가 있고, SaII에서 EcoRI부위에는 정지서열이 포함되어 있다. 도면중 -는 pUC18 DNA를,

는 α-인자 유전자를 나타낸다.

제5도는 pUC18의 EcoRI부위에 클로닝된 GAL1(갈락토키나제)유전자 및 GAL10 유전자의 일부 및 중앙의 조절부위를 포함하는 서열을 나타내는 도면으로서 EcoRI부위에는 GAL10 유전자가 화살표 방향으로 존재하고 DdeI과 Sau3A부위에는 조절부위를 포함하고 있으며, AvaI부터 EcoRI부위 사이에는 GAL1 유전자가 화살표방향의 판독프레임을 갖으며 존재한다.

제6도는 α-인자 유전자의 프로모터와 GAL1, GAL10 유전자의 조절부위를 융합한 혼성프로모터를 갖고 α-유전자의 프리-프로서열 및 정지서열을 갖는 pαG629플라스미드 제조방법을 설명한 도면으로서 pGAL110의 Sau 3A-DdeI절편과 pαE2의 Pst-Sau3A 융합하여 pαG628을 제조하였고 여기서 EcoRI-PstI절편을 분리하여 다시 α-인자 유전자의 프리-프로서열 및 정지서열에 연결시킨 다음, 타 유전자를 삽입할 수 있는 HindIII-Sa1I부위를 이용하기 위해 HindII, Sa1I부위가 존재하지 않는 pBR233플라스미드로 옮겨 pαG629플라스미드를 제조하였다.

제7도는 효모에서 pre-S2부위 및 S유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있는 PMH148 및 PMH149벡터를 제조하는 방법을 설명한 도면으로서 pHBs148 및 pHBPs149플라스미드에서 HindIII-Sa1I부위에 코오딩서열만을 분리하여 pαG629의 HindIII-Sa1I부위와 대체시킨 후, (pαHBs148 및 pαHBPs149)프로모터 및 정지서열을 모두 포함하는 EcoRI절편을 다시 분리하여 효모에서 복제할 수 있는 2μ플라스미드의 일부분과 ARS서열 및 trpl 유전자를 갖고있는 이 콜라이 효모 셔틀벡터인 pMT5의 EcoRI부위에 클로닝하여 pMH148 및 pMH149플라스미드를 제조하였다.

[실시예 1]

[B형 간염 바이러스 게놈(Genome)의 클로닝]

adr 혈청형의 표면항원 및 e항원(HBeAg) 양성인 혈청을 탈섬유소화시켜 20%-65% 슈크로즈 농도구배 용액상에서 초원심시켜 데인입자를 침전시킨 뒤, 이를 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 0.1M NaCl, 20mM MgCl2, 40mM NH4Cl, 0.4% NP 40, 10mM 2-메르캅토에탄올 및 0.2mM의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP를 함유하는 완충액에 현탁시키고 37℃에서 3시간 배양시켜 내인성 DNA 중합효소(endoge neous DNA poymerase)로 하여금 HBV 게놈의 단일나선 부분을 이중나선으로 합성하게 한다.

이 현탁액을 다시 10mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10mM EDTA 및 0.1% SDS를 함유하는 완충액으로 희석하고, 프로테이나제 K(0.8mg/ml)를 가하여 56℃에서 2시간 배양시킨 후, 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(25:24:1)로 2회 추출하여 탈단백질화 시키고 상층 용액에 2배 용적의 에탄올을 가하여 DNA만을 침전 시킨다.

침전된 DNA를 미량의 완충용액[150mM NaCl, 6mM 트리스-HCl(pH 7.9) 6mM MgCl₂, 6mM 2-메르캅토에탄올, 10mg/ml BSA(bovine serumal bumim,]에 현탁시키고, BamHI 제조한 효소를 가하여 37℃에서 2시간 배양시켜 HBV DNA를 전달한다. 여기에 BamHI 제한 효소를 절단하여 탈인산화 시킨 100ng의 pBR322 플라스미드를 혼합하여 상기 기술한 바와 같이 페놀로 추출한 다음, 에탄올로 침전시킨다.

HBV의 DNA와 pBR322 플라스미드가 혼합 첨가된 DNA를 20㎕의 완충 용액에 [50mM 트리스-HCl(pH 7.8), 10mM MgCl₂, 20mM DTT(Ditbiotheritol) 1mM ATP, 50mg/ml BSA]에 현탁시켜 400 단위의 T4 DNA 리가제(Ligase)를 가하여 16℃에서 12시간 배양시켜 DNA를 연결 시킨다.

연결된 DNA를 이.콜라이 균주 HB101에 형질전환 시키기 위해서 배양된 이.콜라이 HB101균 10⁸개 정도를 원심 침전 시키고 1ml의 완충액에 [10mM MOPS(morp horinopropane sulfonic acid)(pH 7.0), 10mM RbCl₂]현탁시켜 다시 원심 침전 시키고 1ml의 완충액에 [0.1M MOPS(pH 6.5), 50mM CaCl₂, 10mM RbCl₂]현탁시켜 얼음속에 15분간 보관한 후, 원심 침전하여 0.2ml의 상기 완충액에 현탁시키고 3㎕의 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 연결된 DNA 10㎕를 가한다. 이 용액을 얼음속에 30분간 방치한 뒤 43.5℃의 수조에서 30초간 열처리 한 뒤 5ml의 엘.브로스(Luria broth)를 가하여 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 배양된 균드을 다시 원심 침전시켜 200㎕의 엘.브로스에 현탁하여 암피실린(50㎍/ml)이 첨가된 엘.브로스 한천 고형 배지에 도말하여 37℃에서 20시간 배양시킨다. 콜로니를 형성한 각각의 형질 전환체들을 다시 암피실린(50㎍/ml)과 테트라 사이클린이 각기 들어 있는 고형 배지에 옮겨 알피실린에는 내성이 있고 테트라 사이클린에 내성은 없는 콜로니만을 선별하면 이는 pBR322의 BamHI 제한 효소 부위에 HBV DNA가 삽입되었음을 알려준다.

이러한 형질 전환체는 플라스미드 pHBV156를 함유하고 있음을 알 수 있는데 이 플라스미드 DNA를 정제분리하여 BamHI 제한 효소로 절단하여 평판 아가오로즈 겔상에서 전기 영동하여 EtBr(ethidium-bromide)로 염색하여 UV상에서 관찰하면 약 4300bp(base pair)의 pBR322 절편과 3200bp의 HBV DNA 절편이 나타난다. pHBV156 플라스미드의 제한 효소 지도(Restriction enzyme map) 및 각 유전자의 배열은 제1도에 나타나 있으며, pre-S2 및 S 유전자의 염기배열 순서는(Dideoxy chain termination DNA sequence 법에 의해 결정) 제2도에 나타나 있다. pHBV156은 실시예 2에서 pHBs148 및 pHBPs149의 제조에 사용된다.

[실시예 2]

[Pre-S2 및 S유전자의 서브클로닝]

adr혈청형의 HBV DNA를 함유한 pHBV156 플라스미드 10㎍을 100㎕의 반응혼합물[6mM NaCl, 6mM 트리스-HCl(pH 7.5), 6mM MgCl₂, 6mM 2-메르캅토에탄올, 100mg/ml BSA]중에서 10단위의 Accl 제한 효소를 가하여 37℃에서 3시간 동안 처리하여 실시예 1에서 기술한 바와 같이 페놀로 추출하여 탈단백화하고 에탄올로 침전시킨 후, 다시 100㎕의 반응혼합물(50mM NaCl, 100mM 트리스-HCl(pH 7.5), 5mM MgCl₂, 100mg/ml BSA)중에서 10단위의 EcoRI으로 37℃에서 3시간 동안 처리한 뒤 1% 저융해점 아가로오즈 겔사에서 전기 영동하여 EtBr로 염색하여 UV상에서 3Kb(kilo base)의 절편만을 잘라낸다. 이 겔 절편을 65℃에서 5분간 방치하여 녹인다음, 5배 부피의 완충액[20mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA]을 첨가하고 상온에서 페놀로 2회 처리한 뒤 에탄올을 가하여 DNA를 침전시킨다. 이렇게 정제된 DNA는 표면 항원 유전자의 3'말단 부위의 불필요한 부분을 완전히 제거한 형태이나 1개의 아미노산 서열과 정지 코돈이 소실되었으므로 이를 재생하기 위해 DNA 합성기로 아래와 같은 서열의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다.

즉, 합성 올리고뉴클레오타이드는 한쪽에 AccI 부위가 존재하고 1개의 아미노산 서열과 정지코돈 및 PstI, BamHI, HindIII 제한 효소 서열을 갖도록 합성된 것이다. 정제된 DNA와 합성 올리고뉴클레오타이드를 혼합한 후, pUC19 플라스미드 DNA를 EcoRI과 HindIII로 절단하고 다시 혼합하여 실시예 1에서와 같이 T4 DNA 리가제로 DNA들을 연결한다.

이 연결된 혼합 DNA로 이.콜라이 균주 HB101을 형질 전환시켜 형질 전환체를 분리 동정하여 표면 항원 유전자의 정확한 3'말단을 갖는 플라스미드 pHBV157를 제조하였다.(제3도 참조)

pHBV157 플라스미드로부터 표면항원 유전자의 5'말단의 불필요한 부위를 제거하기 위하여 pHBV157 DNA 50㎍을 200㎕의 반응혼합물(150mM NaCl, 6mM 트리스-HCl, 6mM MgCl₂, 6mM p-메르캅토에탄올, 100mg/BSA)중에서 50단위의 BamHI 제한 효소를 가하여 37℃에서 3시간 동안 처리한 후 상기 서술한 바와 같이 1% 저융해점 아가로오즈 겔상에서 전기 영동하여 2.6Kb 절편만을 정제하고 이 정제된 DNA를 다시 50㎕의 반응혼합물 중에서 20단위의 XhoI과 20단위의 TagI으로 차례로 절단하고 다시 저융해점 아가로오즈 겔상에서 전기 영동하여 450bp의 절편만을 정제하였다.

DNA를 20㎕의 반응혼합물[50mM Tris-HCl(pH 7.2), 10mM MgSO₄, 0.1mM DTT, 50mg/ml BSA, 2mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP]중에서 5단위의 클레노 절편(DNA polymeraseI, klenow fragment)을 가하여 상온에서 30분간 처리한 뒤 70℃에서 5분간 열처리하여 DNA 폴리머라제I을 실활시키고 EcoRI 링커를 혼합하여 T4 DNA 리가제로 연결시킨다. EcoRI 링커가 연결된 DNA를 다시 EcoRI과 XhoI 제한 효소를 절단하면 한쪽 말단은 EcoRI 부위가 생기고, 다른 부위는 XhoI 부위가 다시 생기게 된다. pHBV158 DNA를 EcoRI과 Xhol으로 절단하여 얻는 큰 절편을 상기 절편과 혼합하여 T4 DNA 리가제로 다시 연결 시킨 뒤 이.콜라이 HB101 균주를 형질 전환시켜 올바른 형질 전환체를 분리 동정하여 pHBV158이라 명명하였다.

pHBV158 플라스미드 DNA를 EcoRI으로 분해하여 저융해점 아가로오즈에서 분리 정제하여 100㎕의 반응혼합물(600mM NaCl, 12mM CaCl₂, 20mM 트리스-HCl(pH 8.01), 1mM EDTA)중에서 2단위의 Bal-31 뉴클레아제를 처리하여 1분간격으로 10㎕씩을 분획하여 동량의 40mM EGTA를 가하여 뉴클레아제를 실활시키고 페놀로 처리하여 탈단백한 후, 에탄올을 가하여 DNA를 침전 시킨다.

이들 각 분획의 DNA의 일부를 PstI으로 절단한 뒤 1% 평판 아가로오즈 겔상에서 전기 영동하여 DNA의 손실 정도를 확인하여 정확히 pre-S2를 포함하는 S유전자는 847bp 크기의 절편을, S유전자만을 갖는 유전자는 684bp 크기의 절편만을 분리 정제 한다. 이렇게 정제된 각각의 절편을 클레노 절편으로 처리하고 HindIII 링커를 첨가하여 연결시킨 후, 다시 HindIII와 PstI으로 절단하여 pUC18 플라스미드 DNA를 HindIII와 PstI으로 절단한 절편과 함께 연결시켜 HB101 균주에 형질 전환시켜 형질전환체를 분리동정하여 제한효소로 확인하고 염기배열 순서를 조사하여 정확한 크기와 염기 배열순서를 갖는 플라스미드를 분리하였다.

즉, pre-S2와 S유전자가 동시에 포함되는 pHBPs149 플라스미드와 S유전자만을 갖는 pHBs148 플라스미드가 제조된 것이다.(제3도 참조)

이들 플라스미드들은 제3도에서 알 수 있듯이 불필요한 5'말단의 모든 잔기들을 제거하고 각각의 개시코돈으로 시작되는 염기 서열을 갖게됨은 물론, 3'말단도 필요한 부분만을 갖고 있으므로 각 유전자를 발현시키는데 적합하게 변형되었다.

[실시예 3]

[효모의 α-인자 유전자 및 갈라토키나제 유전자의 클로닝]

효모 사카로마이세스 세레비지에 20B-12 균주를 100ml의 YEPD 배지(1% Yeast extracts, 2%, Peptone, 2% Dextrose)중 30℃에서 20시간 진탕 배양한 뒤 원심하여 4ml의 완충액에[50mM 트리스-HCl(pH 7.5) 50mM EDTA]현탁하여 세척한 후, 다시 4ml의 완충액(1mM Sorbitol, 20mM EDTA)에 현탁하고, 0.4mg의 지몰라제(zymolase)를 가한 뒤 30℃에서 2시간 처리한다. 이렇게 처리된 효모를 원심하여 4ml의 완충액(0.15M NaCl, 0.1M EDTA, 20mg/ml 프로테이나제 K)에 현탁시킨 뒤, 0.2ml의 10% SDS를 가하고 잘 섞어서 37℃에서 2시간, 70℃에서 15분간 처리한 뒤 0.5ml의 5M 아세트산 칼륨을 가하여 현탁한 후, 얼음에 30분간 방치시킨다.

이 용액을 원심하여 상층액만을 분리하여 페놀로 탈단백하고 에탄올로 침전시켜 효모 염색체 DNA를 분리한다.

분리 정제된 효모 염색체 DNA 20㎍을 EcoRI 제한 효소로 절단하여 0.8% 평판 아가로오즈 겔에 10㎍씩 분획하여 전기 영동한다. 전기 영동후 겔을 각 분획별로 잘라 5배 부피의 변성용액(Denaturation solution)(1.5M NaCl, 0.5M NaOH)에 넣어 1시간 동안 변성시키고 다시 겔을 5배 부피의 재활성용액(renaturation solution)(1M 트리스-HCl(pH 8.0), 1.5M NaCl)에서 1시간 동안 처리한다. 이렇게 처리된 겔을 10xSSC상에서 니트로셀룰로오즈 지로 20시간 동안 서던 블로팅(southern beotting)한다.

DNA가 전달된 니트로셀룰로오즈 지를 상온에서 건조한 후, 진공 항온기 안에 넣어 80℃로 2시간 완전 건조한 다음, 6xSSC 용액(20xSSC 용액 ; 3M NaCl, 0.3M 시트르산 나트륨, pH 8.0)에 적신다음 전-혼성화 용액(pre-hybridization solution,(5xDenhandt's soln, 10mM EDTA, 0.5% SDS)에 넣어 45℃에서 5시간 동안 전처리하고 혼성화 용액[6xNET soln, (20xNET ; 3M NaCl, 20mM EDTA, 0.3M 트리스-HCl, pH 8.0) 5x덴하르트 용액, 0.1% SDS, 250㎍/ml tRNA]10ml에 각각의 니트로셀룰로오즈 지들을 넣는다. 혼성화용액에 α-인자와 갈락토키나제 유전자 각각에 보완적인 5'-GTACATTGGTTGGC-CAGG-3'과 5'-AATCACTTCTTCTGAATG-3'의 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로³²P를 표지시킨 용액을 각각 10⁶cpm/ml이 되게 첨가하고 45℃에서 18시간 동안 혼성화 시킨다. 혼성화 시킨 니트로셀룰로오즈 지들을 200ml의 세척용액(6xNET, 0.5% SDS)으로 상온에서 4회 세척한 후, 동일 용액으로 45℃에서 1분간 세척하여 건조시킨 다음, X-레이필림을 넣어 -70℃에서 18시간 노출시켜 현상한다. 현상된 필림에는 α-인자에 올리고뉴클레오타이드로 혼성화 한 경우는 1.75kb정도에, 갈락토키나제에 보완적인 올리고뉴클레오타이드의 경우는 2kb정도에 밴드가 나타남을 알 수 있었다.

이 정보를 이용하여 EcoRI으로 절단한 효모 염색체 DNA를 저융해성 평판 겔에 전기 영동한 후, 1.75kb와 2kb의 절편을 절단하여 용해시킨 뒤 탈단백화 하고 에탄올로 침전시켜 정제한다.

정제된 DNA 절편을 각각 EcoRI으로 절단된 pUC18 플라스미드와 혼합하여 T4 DNA 리가제로 연결시킨 뒤 HB101 균주를 형질전환시켜 암피실린이 들어있는 한천 평판배지에서 12시간 배양한 후 생성된 균체들을 니트로셀룰로오즈 지로 옮긴다음 다시 한천 평판 배지에서 6시간 배양하고 클로람페니콜(150mg/ml)을 함유한 한천 평판 배지 위로 니트로셀룰로오즈 지들을 옮겨 16시간 동안 배양하여 플라스미드를 증폭시켰다. 이렇게 니트로셀룰로오즈 지상에서 배양된 군체들을 10% SDS상에서 5분 동안 처리하여 분해 시키고 알칼리 용액(0.5N NaOH, 1.5M NaCl)에서 3분간 처리하여 DNA를 변성시키고, 재활성시킨 뒤 상온에서 건조하고, 진공 항온기에서 건조하여 군체들의 DNA를 니트로셀룰로오즈 지에 완전히 부착시킨다. 이 니트로셀룰로오즈 지들을 세척용액에(3xSSC, 0.5% SDS)넣어 65℃에서 5시간 세척한 후, 전술한 바와 같이 전혼성화 용액에서 5시간 처리하고³²P로 표지된 올리고뉴클레오타이드가 들어있는 혼성화용액으로 혼성화한 후, 세척하고 X-ray 필름을 감광시킨 뒤 현상한다.

현상된 필름상에서 양성으로 나타내는 군체들을 다시 배양하여 플라스미드를 분리 정제한 뒤 EcoRI으로 절단하여 보면 α-인자의 경우는 1.75Kb의 절편을, 갈락토키나제의 경우는 2Kb 크기의 절편을 갖고 있음을 알 수 있다.(제4,5도 참조) 이들 플라스미드를 각각 여러 가지 제한 효소를 분해하여 효소지도를 만들고 pαE2(제4도) 및 pGAL110(제5도)로 명명하였다. 또한, 이들의 DNA 배열 순서를 조사한 결과, α-인자 유전자 및 갈락토키나제 유전자임을 확인할 수 있었다.

pαE2와 pGAL110은 실시예 4에서 pαG629를 작제하는데 사용되었다.

[실시예 4]

[혼합 프로모터를 갖는 pαG629의 제작]

pGAL110 플라스미드를 EcoRI, AVaI으로 절단하여 저융해점 아가로오즈 겔에 전기 영동한 후, 990bp 크기의 절편을 분리 정제하여 DdeI으로 다시 절단하고 DNA 폴리머라제I(클레노 절편)을 처리한 뒤 EcoRI 링커를 혼합하여 접합시킨 다음, EcoRI과 Sau3A로 전달한다. 한편 pαE2 플라스미드를 PstI으로 절단하여 760bp 크기의 절편을 분리 정제하여 Sau3AI으로 다시 절단한 뒤, pGAL110 플라스미드에서 정제한 절편과 혼합하여 연결시키고 연결된 절편을 다시 pUC18을 EcoRI, PstI으로 절단한 절편과 혼합하여 연결시킨 다음, HB101을 형질전환시켜 올바르게 작제된 플라스미드 pαG627를 분리해낸다(제6도 참조).

pαE2를 PstI으로 절단하여 800bp 크기의 절편을 분리 정제한 후, pαG627를 PstI으로 절단한 DNA와 혼합하여 연결시켜 pαG628 플라스미드를 만든다.

pBR322 플라스미드를 HindIII와 PuvII로 절단하고 DNA 폴리머라제I으로 처리한 후, 2.3kb 크기의 절편을 분리 정제하고 연결시켜 pBR233 플라스미드를 만든 뒤 이를 다시 EcoRI으로 절단하고 pαG628를 EcoRI으로 절단하여 분리 정제한 1735bp 크기의 절편과 혼합 연결시켜 pαG629 플라스미드를 제작하였다.

pαG629 플라스미드는 EcoRI과 PstI 부위에 α-인자와 갈락토키나제 유전자의 혼성 프로모터를 갖고 있으며, PstI과 HindIII 부위에 α-인자 유전자의 프리-프로 서열을 갖으며 HindIII와 SalI 부위에 α-인자의 구조유전자를, SalI과 EcoRI 부위에는 정지서열을 갖고 있다. 즉, HindIII와 SalI 부위를 타 유전자로 대체하면 대체된 유전자를 발현시킬 수 있는 모든 정보를 내포하고 있는 벡터인 것이다.(제6도 참조)

[실시예 5]

[간염 바이러스 표면 항원 발현을 위한 효모 발현벡터 pMH148 및 pMH149의 작제]

pMHBs148 및 pMHPs149 플라스미드를 각각 HindIII, SalI으로 절단하여 pHBs148에서는 690bp 크기의 절편을 pHBPs149에서는 850bp 크기의 절편을 분리 정제하여 pαG629 플라스미드를 HindIII, SalI으로 절단한 용액에 혼합 연결하여 각각 pαHBs148 및 pαHBs149 플라스미드를 분리 정제 하였다.

효모의 2μ 플라스미드의 일부분과 trpI 유전자 및 trpI 유전자의 ars 서열(autonomously replication sequence 갖고 있는 이. 콜라이 효모 셔틀 벡터인 pMT5(제7도 참조)를 EcoRI으로 절단한 다음 pαHBs148 및 pαHBPs149를 EcoRI으로 절단하여 분리 정제 한 2.1Kb 크기의 절편과 2.3Kb 크기의 절편을 혼합 연결하여 pMH148 및 pMH149 플라스미드를 완성하였다. pMH148 및 pMH149 플라스미드는 효모내에서 안정적으로 유지될 수 있는 정보를 갖고 있으며 혼성 프로모터와 정지서열에 표면 항원의 유전자의 발현이 조절될 수 있다.

더욱이 2개의 프로모터를 혼성시켰으므로 두 프로모터의 장점을 이용할 수 있어 발현의 효율성이 매우 높다.

[실시예 6]

[pMH148 및 pMH149로 형질전환된 효모의 제조]

trpI 유전자가 불활성된 사카로마이세스 세레비지에 20B-12(α, trpI, pep3-4)균주를 40ml의 YEPD배지에서 30℃로 18시간 동안 진탕 배양한 후 OD₆₀₀=1정도에서 원심 침전시켜 증류수에 현탁 세척한 뒤 다시 원심 침전하여 10ml의 0.1M LiAc 용액에 재현탁시킨 뒤 30℃에서 1시간 동안 방치한다. 이를 다시 원심침전하여 0.4ml의 0.1M LiAc 용액에 현탁시켜 50㎕씩을 분획하여 pMH148 및 pMH149 플라스미드 1㎕씩을 각각 첨가하여 30℃에서 30분간 방치하고 0.6ml의 40% PEG-4000 10mM 트리스-HCl(pH 7.5)용액을 가하여 잘 섞고, 30℃에서 1시간 동안 방치한다. 이를 42℃에서 5분간 열처리하고 원심 침전하여 500㎕의 멸균 증류수로 2회 세척하고, 150㎕의 멸균 증류수에 현탁하여 YNB 한천 고형배지(0.65% Yeast nitrogen base, 0.5% Cassamino acid, 2% Dextrose, 1.5% Ager)에 도말하여 30℃에서 3일간 배양한다. 생성된 형질 전환체들을 다시 YNB 액상 배지에 접종하여 30℃에서 진탕 배양하여 플라스미드 DNA를 분리 정제하고 제한 효소를 절단한 뒤 평판 아가로오즈 겔상에서 전기 영동하여 나이트로셀룰로오즈 지로셔튼. 블로팅하고³²P로 표식된 PMH148 및 PMH149를 탐침으로 하여 혼성화 실험을 수행하였을 때, 각각의 형질 전환체들을 PMH148 및 PMH149 플라스미드를 갖고 있음을 알 수 있었다.

배양된 형질 전환 효모들을 원심 침전하여 상기 서술한 바와 같이 지몰라제들 처리한 뒤, 다시 원심 침전하여 완충액[50mM 인산염 완충액(pH 7.2), 0.01% 트리톤 X-100)으로 추출한 뒤 원심하여 상층액을 수득하고, 표면 항원의 양을 방사선 면역 표지법(AUSRIA : Abbott 사제품)으로 정량 분석하여 수율을 조사한 결과는 표 1과 같다.

또한 PMH149로 형질전환된 효모에서 발현되는 pre-S2를 포함하는 표면항원을 Pre-S2 부위에 특이적인 방사선 면역 표지법으로도 정량 분석하였다. PMH148 및 PMH149로 형질 전환된 효모에서 분리 정제된 표면항원들은 B형 간염 바이러스 감염의 진단 및 예방용 백신으로 유용하다.

[표 1]

이들 미생물은 한국 종균 협회(KFCC)에 1988년 6월 8일자로 기탁되어 있으며, 그의 수탁 번호는 표 2에 나타낸다.

[표 2]

Claims (14)

1. 효모의 α-인자의 조절부분과 갈락토키나제 조절부분을 융합시킨 프로모터를 이용함을 특징으로 하여 B형 간염 바이러스의 표면항원을 효모에서 형질발현 할 수 있는 서열을 함유한 재결합체 발현벡터.
2. 제1항에 있어서, B형 간염 표면항원을 코오딩하는 서열이 adr형의 S유전자만을 포함하는 발현벡터.
3. 제1항에 있어서, B형 간염 바이러스 표면항원을 코오딩하는 서열이 adr형의 pre-S2 부위 및 S유전자를 포함하는 발현벡터.
4. 효모의 α-인자의 조절부분과 갈락토키나제 조절부분을 융합시킨 프로모터를 이용함을 특징으로 하여 B형 간염 바이러스의 표면항원을 효모로부터 형질발현 할 수 있는 서열을 함유한 재결합체 발현 벡터의 제조방법.
5. 제4항에 있어서, 표면항원 유전자들의 3'말단의 불필요한 부분을 제거하는 방법.
6. 제4항에 있어서, 표면항원 유전자들의 5'말단의 불필요한 부분을 제거하는 방법.
7. 제4항에 있어서, α-인자의 프로모터의 일부와 갈락토키나제 프로모터의 일부분을 Sau3A 부위를 이용하여 결합시키는 방법.
8. 제4항에 있어서, 혼성 프로모터와 표면항원 유전자를 재결합시키는 방법.
9. 제4항에 있어서, 표면항원 유전자의 3'말단에 효모 α-인자 정지서열을 연결하는 방법.
10. 제4항에 있어서, 프로모터, 표면항원 유전자, 정지서열을 포함하는 DNA 절편을 효모 벡터를 옮기는 방법.
11. 제4항 또는 7항에 있어서, α-인자의 프로모터를 Sau3A를 사용하여 분리하는 방법.
12. 제4항 또는 7항에 있어서, 갈락토키나제 프로모터 부위를 DdeI과 Sau3A를 사용하여 분리하는 방법.
13. 효모의 α-인자의 조절 부분과 갈락토키나제 조절 부분을 융합시킨 프로모터를 이용하여 B형 간염 표면항원을 코딩하는 서열이 adr형의 S유전자만을 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 사카로마이세스.세레비지에 20B-12/PMH148 형질 전환체.
14. 효모의 α-인자의 조절 부분과 갈락토키나제 조절 부분을 융합시킨 프로모터를 이용하여 B형 간염 표면항원을 코딩하는 서열이 adr형의 pre-S2부위 및 S유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 사카로마이세스.세레비지에 20B-12/PMH149 형질 전환체.

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