CN1040053A - 在甲基营养型酵母中表达乙型肝炎前s2蛋白 - Google Patents

Abstract

一种提高主要由前S₂蛋白组成之抗原颗粒生产量的方法，还公开了新的DNA分子及用这些分子转化的宿主。

Description

本发明涉及DNA重组技术领域。一方面，本发明涉及提高基本上由前S₂蛋白组成的抗原颗粒在甲基营养型酵母中之表达能力的方法;另一方面，本发明涉及新的DNA分子及由其转化的新的酵母菌株。

B型肝炎病毒（HBV）可引起急性和慢性肝脏疾病，并可造成全球性的社会保健问题。HBV表现以慢性感染作用，其可引起进行性严重肝损伤，原发性肝癌和死亡。在大多数情况下，受HBV感染的病人能彻底恢复。但也有相当一部分人在遭受HBV感染后成为疾病的慢性携带者，而有可能将疾病传播给别人。

近年来由于DNA重组技术的进展，已出现了许多揭示HBV之基因结构及制备抗HBV疫苗的方法。现已知道HBV基因组由大约3，200个碱基对的双链DNA组成，并有一共价连接的DNA聚合酶分子一起包裹在27nm核壳体中。核壳体则被包藏在由细胞脂质和B型肝炎表面抗原（HBs        Ag）组成的脂蛋白外壳中;这就是所说的病毒颗粒，其直径为42nm。

也已发现病毒外壳包含三种不同但相关的表面蛋白质。一般将这些蛋白质称为S、前S₂和前S₁蛋白。每个病毒颗粒包含300-400个S蛋白分子、40-80个前S₂和前S₁蛋白分子。

S蛋白由226个氨基酸组成，并且是正常病毒脂蛋白外壳的主 要成分。S蛋白分子量约为24-25千道尔顿（KDa）并可称为P24或P25。S蛋白也可被糖基化为称作GP27或GP28的27-28千道尔顿的糖蛋白。

第二种HBs Ag（乙型肝炎病毒表面抗原）蛋白是前S₂表面抗原，也称为中期HBs Ag多肽。前S₂包含281个氨基酸，由在S蛋白的N末端加上55个氨基酸而形成的。前S₂蛋白分子量约为31千道尔顿，并可称为p31蛋白。前S₂也有33千道汞顿和36千道尔顿两种糖基化的形式，分别称为GP33和GP36。据信该抗原可在对S无反应或反应微弱者体内引起另一种抗原反应。

第三种HBs Ag蛋白是前S₁表面抗原，也称为晚期HBs Ag多肽。前S₁由389-400个氨基酸组成（根据HBV的抗原亚型而异）。它是将一段含有108-119个氨基酸的属于前S₁的氨基酸序列加到完整前S₂蛋白的N端而形成的。前S₁蛋白分子量约43千道尔顿，并可称为P43蛋白。前S₁也有一种基化形式，分子量为46千道尔顿，称为GP46糖蛋白。

在HBV感染的过程中，完整的病毒核壳体被包在脂蛋白外壳内形成42nm颗粒。HBV感染期间还可形成主要含S和前S₂蛋白及某些前S₁蛋白的中空的22nm颗粒。虽然完整的病毒核壳体有感染性，但22nm中空颗粒则没有感染性。但中空颗粒可引发免役系统足够的免疫反应，并可用于制备抗HBV疫苗。

从前，用于制备B型肝炎疫苗的22nm颗粒是从HBV携带者的血浆中制得的。但必须对得自人血浆的22nm颗粒充分纯化，以除去感染性HBV颗粒以及其它存在于血浆的病原体。再者，由于人血 浆的来源有限，而使B型肝炎疫苗的制备受到极大的限制。

利用DNA重组技术，已经有可能在转化的哺乳动物细胞系及酵母中表达22nm颗粒的S蛋白。

试图生产抗原性和可能作为有效疫苗的前S₂蛋白的努力迂到很大困难。已发现前S₂蛋白对重组系统中的蛋白水解作用十分敏感。水解作用产生两个失去了前S₂抗原性的较小片段。另外，前S₂蛋白很难在重组系统中表达。前S₂的表达水平大约是在同一重组系统中表达S蛋白水平的十分之一。

因此，建立一种生产主要由非糖基化HBV前S₂蛋白组成之HBV抗原颗粒的方法，将是对本领域的重要贡献。

本发明的一个目的在于提供一种以较高产率生成主要由非糖基化HBV前S₂蛋白组成之HBV抗原颗粒的方法。

本发明的另一个目的是提供含有编码前S₂蛋白之DNA顺序的新的载体。

本发明的再一个目的是提供用能够增加由前S₂蛋白组成之HBV抗原颗粒生产的一种或多种载体转化的新的甲基营养型酵母。

本发明的再一个目的是提供用生产主要由非糖基化前S₂蛋白组成HBV抗原颗粒的方法生产的产品。

根据本文公开的内容及权利要求，将会进一步了解本发明的这些和其它的目的。

根据本发明，我已发现提高抗原性HBV颗粒生产的方法包括：（1）用至少一种载体转化甲基营养型酵母，所说的载体具有一个含 有前S₂结构基因的可相容的表达暗盒;（2）在适于生产颗粒的条件下培养所得到的转化体。

图1显示了含有HBV adw血清型的前S₂基因。质粒AM6是图1所示HBV基因组的衍生物，其中pBR322质粒是在26位BamHⅠ位点插入的。

图2显示质粒pYM4，是在BamHⅠ位点插入巴斯德毕赤酵母（Pichia        pastoris）HIS4基因的pBR322的衍生质粒。括号标示被破坏的酶切位点。HIS4基因寄存在pYJ30（NRRL-15800）之中。

图3显示质粒pYM10。PYM10是pYJ30（NRRLB-15890）的衍生物，其在2959位的BamHⅠ位点已被破坏。图中括号标示被破坏的限制性酶切位点。

图4显示质粒pA0804，其在顺钟向由BglⅡ到BglⅡ的片段中含有一个线性的整合位点特别性载体。结构基因可被插入该质粒的唯一的EcoRⅠ位点中。

前S₂结构基因是本领域中已知的，已由L₀测定了它的顺序（Characteristics of Pre S Region of Hepatitis BVirus，135 Biochemical and Biophysical Research Communications 382，1986）。本领域内的许多研究人员已克隆了该结构基因并已表达成功（如见L₀和Valenzuela，Synthesis and Assembly in Yeast of Hepatitis B Surface Antigen Particles Containing the Polyalbumin Receptor，3Biotechnology 317，1985）。因此可由本领域的研究者处得到 该结构基因，或者合成或再分离到该结构基因。任何前S₂血清型均可用于本发明的实践中。

用于本发明实践的前S₂结构基因adw血清型是由质粒AM6得到的。质粒AM6是图1所示HBV基因组的衍生物，其中在位于26的BamHⅠ酶切点插入了pBR322质粒。表1中给出该前S结构基因的核苷酸顺序。可在任何合适的大肠杆菌宿主（如MC1061）中培养本发明所用的质粒。

由质粒AM6中回收前S结构基因的两个片段，并在体外合成N端前13个氨基酸的核苷酸序列。可用化学或酶学方法合成用于本发明的核苷酸序列，如使用基于磷酸三酯或亚磷酸盐化学的化学合成法。

含有75%前S₂结构基因的C端编码区是用内切酶Dral消化质粒而得到的。Dral消化是使用商品DraⅠ核酸内切酶完成的（所有核酸内切酶均按照制造商推荐的方法使用）。然后用苯酚提取Dral片段并用乙醇沉淀之。

然后依照标准的DNA合成技术制备一个八个碱基对的StuⅠ接头（AAGGCCTT），并使用T4连接酶以平头连接法连接到DraⅠ片段上。用苯酚提取以终止连接反应，然后用乙醇沉淀。再用StuⅠ核酸内切酶消化所得片段以除去StuⅠ的多聚体。

然后用XbaⅠ消化StuⅠ连接的片段。用凝胶电泳法分离所得到含前S₂结构基因之C湍编码区的约600bp长的StuⅠ/XbaⅠ片段。

然后用T4连接酶将该600bp片段连接到已用琼脂糖凝胶电泳 法分离到的质粒pYM4的5.7ka        XbaⅠ/StuⅠ水解片段中（图2）。

然后将连接混合物直接用于转化感受态大肠杆菌细胞（MC1061），并在含氨苄青霉素的培养基中培养之。

筛选转化成功的菌落并用Birnboim和Doly所述的方法（Nucleic        Acids        Research        7：1513，1979）提取质粒DNA。

用StuⅠ消化所提取的质粒DNA，用苯酚提取并经乙醇沉淀。制备EcoRⅠ接头并用T4连接酶将其连接到StuⅠ片段上。用EcoRⅠ消化以除去多余的接头。进一步用XbaⅠ消化这些EcoRⅠ连接的片段并经电泳分离含有前S₂结构基因之C端部分的片段。

将XbaⅠ-EcoRⅠ消化产物连接到用XbaⅠ-EcoRⅠ切割的pUC18中。将连接混合物转化到感受态大肠杆菌细胞（MC1061）中，然后于氨苄青霉素存在下培养所得细胞。使用ClaⅠ和XbaⅠ经片段消化分析法选择含有前S₂结构基因之C端部分的转化细胞。用该方法筛选到的质粒定名为pHS2-B。

用XbaⅠ和BamHⅠ一次消化质粒AM6回收前S₂基因的中间部分。经凝胶电泳分离所要的250bp片段。然后将此250bp XbaⅠ/BamHⅠ片段连接到已用XbaⅠ和BamHⅠ消化过的pVC18中，并用其转化大肠杆菌MC1061。通过回收质粒DNA并用BamHⅠ消化来分析生长于含氨苄青霉之培养基中的细胞。经电泳分析，证明这些含有2.7kb线性片段的质粒具有所需的250bp片段。分离一个含有250bp片段的转化菌株并进行大量培养。用EcoRⅠ和BamHⅠ消化由该菌落中分离并纯化的质粒DNA。用电泳法分离载体带。然后使载体与下列已用激酶处理过的双链寡核苷酸相连接：

PstI BamHI

                                                                                    5′AATTCAATCCGTCTGCAG    3′

                                                                                        3′    GTTAGGCAGACGTCCTAG    5′

用连接反应混合物转化大肠杆菌MC1061并根据氨苄青霉素抗性选择含正常插入片段的菌落。该质粒定名为pPS2。

为制备前S₂的N端编码区，合成具有下列顺序的寡核苷酸：

HindIII

5′AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA    3′

                        ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAG    5′

将该顺序克隆到pUC18的Hind        Ⅲ和PstⅠ消化片段中。经EcoRⅠ消化和电泳后，根据存在一大约75bp片段来鉴定所需的转化体。将用该方法筛选的质粒定名为pTBO-2A。

经用PstⅠ和XbaⅠ消化载体pIBO-2A而加入该基因的中间部分;该插入片段是得自pPS2的250bp PstⅠ-XbaⅠ片段。根据存在＞300bp的EcoRⅠ片段以及290bp XbaⅠ/Hind Ⅲ片段确定转化体。将该正确的分离物称为pTBO-3。将来自pTBO-3的Hind Ⅲ/XbaⅠ片段插入XbaⅠ/Hind Ⅲ消化的pHS2B中即构成完整的前S₂基因。该构建物被称为pTBO4。

可用适当方法培养上述大肠杆菌菌株。培养大肠杆菌的一般技术是本领域内已知的，而根据本发明所用菌株的特殊要求，对所用方法作适当改进将是本领域内普通技术人员能够作到的。

可根据其致密程度和环形超螺旋型，用几种不同的技术回收大肠杆菌的质粒DNA。例如可在收获后离心沉淀宿主细胞，然后悬浮并溶菌。离心溶菌产物以除去细胞碎片，并保留含DNA的上清液。然后进行苯酚提取以从DNA中除去大部分其它污染物。然后用密度梯度离心法或凝胶过滤技术进一步处理苯酚抽提的DNA，以使质粒DNA与细菌DNA分离开。完成上述分离的技术是已知的，而且所用的各种方法也是已知的。

可选择适当的核酸内切酶对质粒进行酶消化，所选择的酶应能以利于回收前S₂结构基因的方式切割所选择的质粒。应根据欲从中切掉前S₂基因的质粒选用核酸内切酶。例如，质粒AM6携带的前S₂结构基因可作为DraⅠ-Hind Ⅲ片段回收。

可用许多技术完成DNA的凝胶电泳（参见P.G.Sealy        and        E.M.Southern，Gel        Electrophoresis        of        Nucleic        Acids-A        Practical        Approach，（D.Rickuood        and        B.D.Hames，eds.）p39（1982））。可根据所用凝胶的不同使用不同的技术进行洗脱，，如电洗脱、扩散、凝胶溶融（琼脂糖凝胶）或物理挤压（琼脂糖凝胶）。但应明确的是，对于某些凝胶，如高质量、低熔点的凝胶则不一定要洗脱。

一旦分离出含前S₂结构基因或其片段的片段，即应在将其插入载体之前进行另外的处理。这些处理可包括加入接头或将片段修 成平头，但不仅限于这些。

分离了前S₂结构基因之后，即可将基因插入适当的甲基营养型酵母载体（如质粒）中。本发明实践中优选的载体是能与毕赤属（Pichia）酵母，特别是巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）相容的载体。

质粒一直是DNA重组技术中所用的基本材料之一。质粒是见于微生物中的染色体外的环形双链DNA。已发现每个细胞可出现一个或多个质粒拷贝。质粒DNA中包括了质粒增殖所需的信息，正如细菌复制包括所需的复制原点。质粒内编码的信息中还包括了一种或多种根据转化的细胞表型筛选质粒的方法。由于存在表型或筛选标志，如抗生素抗性基因或补偿宿主生化途径中缺陷的基因，从而可以识别、筛选和保留已被转化之宿主细胞的克隆。

为了在甲基营养酵母中表达前S₂结构基因，必须将基因以可启动的方式连接到5′调节区和3′终止序列上，以形成表达暗盒，然后通过载体插入宿主细胞内。

为清楚起见，将有关术语定义如下：

以可启动方式连接：调整有关组成部分的位置，以使之完成其启动表达的功能。

调节区：对各种刺激起反应并影响mRNA转录速率的DNA序列。

3′终止序列：指3′端至终止密码间的序列，其功能在于导致多聚苷酸化以稳定其mRNA。

“毕赤属相容的”是指在毕赤属酵母中能完成其正常功能的 DNA顺序，如得自毕赤属酵母的调节区和3′终止顺序。

本发明实践中优选的是整合性载体，如欧洲专利申请86114700.7号中所述的、Cregg的线性位点特异性整合载体。这种载体包含至少一个所说的有序排列的顺序：1）第一个插入的DNA片段;2）可选择的标志基因;3）第二个可插入的DNA片段。

第一和第二个可插入的DNA片段，每个长度均至少为大约200个核苷酸，并具有与毕赤属酵母之基因组DNA的某些部分同源的核苷酸顺序。整合载体的各组分均有序排列而形成一线性DNA片段，这样表达暗盒和用于筛选的标志基因即定位于第一个可插入的DNA片段的3′端与第二个可插入之DNA片段的5′端之间。在有序排列的线性片段中，第一和第二个可插入的DNA片段相应地定向如在其亲代基因组中一样。

用作第一和第二个可插入之DNA片段的核苷酸顺序是与固有基因组位点（在该位点将发生基因修饰）的分离部位的核苷酸顺序同源的。为此，如果基因组修饰发生在乙醇氧化酶基因位点上，所用的第一和第二个可插入的DNA片段将是与乙醇氧化酶基因位点的分离部位同源的顺序。为了按本发明的方法进行基因组修饰，两个可插入的片段在线性片段中必须如其存在于亲代基因组中一样相应定向。可用作第二和第二个可插入之DNA片段的核苷酸包括选自乙醇氧化酶（AOX1）基因、二羟丙酮合成酶（DHAS1）基因、p40基因和HIS4基因的核苷酸顺序。涉及AOX1基因、DHAS1基因、p40基因和HIS4基因的共同待批专利申请780，102号被列为本文参考文献。

第一个可插入的DNA片段可含有一个可启动的调节区，该调节区则可能包括用于表达暗盒的调节区。使用第一个可插入的DNA片段作为表达暗盒的调节区是本发明的一个优选实施方案。图4显示了利用第一个可插入的DNA片段作为暗盒之调节区的载体。

如图4所示，可将一个或多个插入位点及3′终止顺序直接位于第一个可插入之DNA片段的3′侧。线性位点特异性整合载体的这种构型所具有另一优点是提供了一个便于结构基因插入的位点，而不必加入一段相容的3′终止顺序。

用以转化宿主菌株的DNA中至少还必需包括一个可供筛选的标志基因。这将有助于筛选和分离那些已获得转化DNA的细胞。该标志基因可为对已转化的生物体贡献宿主所没有的表型特征，如可使某种特定氨基酸生物合成途径有缺陷的未转化的宿主菌株恢复产生该特定氨基酸的能力，或者使宿主菌获得抗生素的抗生等。

筛选的标志基因可选择得自巴斯德毕赤酵母和啤酒酵母的HIS4基因和ARG4基因、得自啤酒酵母的转换酶基因（SUC2）或得自大肠杆菌可转座成分Tn601或Tn909的G418磷酸转移酶基因。

本领域内的技术人员可以理解到，其它的DNA顺序，如细菌质粒DNA、噬菌体DNA等也可以掺入到本发明所使用的载体中。这些DNA顺序使得上述载体可在细菌宿主中扩增或保留。

如果第一个可插入的DNA片段不含有调节区，则需要一个合适的调节区以可启动的方式连接到结构基因上，以提供可启动的表达暗盒。同样，如果在插入位点没有提供3′终止顺序，便不能构成完整的表达暗盒，而必须将-3′终止顺序以可启动方式连接到欲被插入的结构基因上。

本领域内的技术人员应了解，已经鉴定了许多调节区并可与甲基营养型酵母一起使用。所说的调节区包括选自由啤酒酵母中分离酸性磷酸酶、半乳糖激酶、醇脱氢酶、细胞色素C、α-接合因子和3-磷酸甘油醛脱氢酶等的调节区;特别是得自巴斯德毕赤酵母的醇氧化酶（AOX1）、二羟丙酮合成酶、（DAS1）、p40调节区及HIS4调节区等，但不止这些。用于本发明的优选的调节区是根据它们对含甲醇培养基诱导能力而确定的，这样的调节区包括AOX1、DHAS1、p40以及共同待批专利申请780，102号中所公开者。

本发明最优选的调节区是AOX1调节区。

3′终止顺序可用于表达暗盒或成为上述载体的一部分。当以可启动的方式连接到基因上时，3′终止顺序可以起到终止、聚腺苷酸化和/或稳定由结构基因编码之信使RNA的作用。用于本发明的3′终止顺序的来源包括（但不仅限于）啤酒酵母、多形汉逊酵母（Hansenula        polymorpha）及毕赤酵母3′终止顺序。其中优选的是衍生于巴斯德毕赤酵母者，如AOX1基因、DHAS1基因、p40基因和HIS4基因的3′终止顺序，但特别优选的是AOX1基因的3′终止顺序。

为完成本发明，最好使用线性转化载体，如图4所示之构建物的BglⅡ片段。

可用任何适当技术将前S₂结构基因插入适当载体中，该方法 选择在适当位点切断载体，并致使至少一个含前S₂结构基因的可启动的表达暗盒存在于载体中。

可用适当的连接技术，如使用T4 DNA连接酶完成前S₂结构基因的连接。

可将连接混合物转化到细菌宿主如大肠杆菌内，以完成对前S结构基因与载体之连接混合物的最初筛选、增殖和最适扩增。适用于大肠杆菌的转化技术是本领域中已知的。论文，为在细菌宿主内保留载体所必须的筛选标志和细菌复制原点也是本领域中已知的。

可使用自宿主DNA中分离质粒DNA的适当方法，分离和纯化表达系统中含前S₂结构基因的所需质粒。

相似地，最好在增殖后检验经连接作用所形成的载体，以证实前S₂基因的存在，及其与调节区和3′终止顺序的可启动的连接。这可借助多种技术来完成，这些技术包括（但不仅限于）核酸内切酶消化、凝胶电泳或核酸内切酶消化-Southern印迹杂交。

可使用适当的转化技术将质粒或线性载体转化到酵母宿主内，这些技术包括（但不仅限于）Hinnen等人（Proc.Natl.Acad.Sci.75，1929（1978）、Ito等人（J.Bacteriol.153，163（1983））、Cregg等人（Mol.Cell        Biol.5，3376（1985））或Kreekrishna等人（Gene        59，115（1987））所描述者。本发明实践中最好使用Cregg的转化技术。操作中需要使用过量的线性载体，并使用Southern杂交技术对多种插入进行筛选。

所转化的酵母宿主可以是任何适用的甲基营养型酵母。甲基营养型酵母包括（但不仅限于）选自汉逊酵母属（Hansenula）、假 丝酵母属（Candida）克勒克酵母属（Kloeckera）、毕赤酵母属（Pichia）、酵母属（Saccharomyces）、球拟酵母属（Torulopsis）和红酵母属（Rhodotoruld）的、能在甲醇基质上生长的酵母。C.Anthony在The        Biochemistry        of        Methylotrophs，269（1982）中列出了这类酵母的某些特定种。其中最好是毕赤酵母的甲基营养型酵母，如营养缺陷型巴斯德毕赤酵母GS115（NRRL        Y-15851）。因此易于选择，所以营养缺陷型甲基营养酵母很适用于本发明。如果选择适当的转化标志基因，也可使用野生型甲基营养酵母并获得同样的成功，如可使用SUC2将巴斯德毕赤酵母转化为能够在蔗糖上生长的菌株，或者使用抗生素抗性标志，如G418基因。

可使用适当技术来筛选已转化的甲基营养酵母，这些技术包括（但不仅限于）在转化后没有（由于细胞的营养缺陷）所要求的生化产物的条件下培养原营养缺陷细胞，通过检验新的表型（“methanol        slow”）或在对转化体内没有相应抗性基因的酵母有毒性的抗生素存在下培养细胞而进行筛选。

可用适当的发酵技术，如摇瓶发酵法、高密度发酵法或Cregg等人（High-Level        Expression        and        Efficicent        Assembly        of        Hepatitis        B        Burface        Antigen        in        the        Methylotrophic        Yeast，Pichia        Pastoris，5        Bio/Technoloqy        479（1987））公开的发酵技术培养已分离的、转化之甲基营养型酵母细胞。

可用适于利用调节区的方法完成表达。显然如果利用的是甲醇 反应性调节区，可以将营养性培养基中的转化细胞转移到含适量醇培养基中启动调节区而诱导表达。

可使用标准技术，如先破碎细胞然后离心除去细胞碎片，从经过足够长时间诱导的转化下表获得粗制品中回收抗原颗粒。本领域内技术人员熟知的许多从单细胞宿主微生物中提取异源性蛋白质的方法，均可用来代替上述的一般提取技术，或用于进一步纯化所需产品。Gregg等人于1988年4月13日提交的专利申请中公开的纯化方法可作为本发明实践中优先选用的方法（该文献代理案号为[32342US]，并已列入本文参考文献）。

下列实施例旨在进一步阐明本发明。

各实施例均使用巴斯德毕赤酵母GS115（his        4）NRRLY-15851作为宿主酵母菌株。

培养基

YPD，1升        10g酵母浸膏

20g        蛋白胨

20g        葡萄糖

LB培养液，1升        5.0g酵母浸膏（Difco）

10.0g胰蛋白胨（Difco）

5.0g        NaCl

实施例1

载体pTBO4的构建

质粒AM6是图1所示HBV基因组的衍生物，其中在26位BamHⅠ酶切点处插入了质粒pBR322。

载体pTBO4含有编码B型肝炎表面抗原281氨基酸前S₂蛋白的基因。该基因是由三个片段构建成的：包括75%结构基因的C端、编码13个氨基酸的N端接头，以及其余的中间部分。含有前S2基因（adw血清型）的质粒AM6是本发明所用的前S2基因之C端部分及中央部分的来源。Valenzuela等人[ICN-UALA Symposia on Animal Virus Genetics，p57-70（1980）]公开了该顺序，其中有下列修饰：

天然序列        ATG-CAG-TGG-AAT-TCC

诱变序列        ATG-CAG-TGG-AAC-TCC

A.前S₂的C端部分

（所有限制性内切酶均购自Boehringer        Mannheim公司，并均按制造商推荐的方法使用）。

用DraⅠ酶切割质粒AM6，将在其中的B型肝炎病毒基因上两个位点上切断，（图1），从中分离C端部分，其中一个切点在表面抗原最后一个氨基酸的密码子处。在30μl反应体积中用牛小肠碱性磷酸酶处理以使末端去磷酸化（在50m M Tris·Cl（PH 9.0）、1mM MgCl₂、100μM ZnCl₂、1mM精脒中用1单位酶于37℃处理1小时）。用苯酚提取全部消化产物并用乙醇沉淀（Maniatis等）。用DNA合成仪（Applied Biosystems Model 380A），通过氰乙基氨基磷酸酯法合成八个碱基的StuⅠ接头（AAGGCCTT）。取1μg等分部分并在含70mM Tris·Cl、PH7，6，10mM MgCl₂、5mM二硫苏糖醇、1mMATP和10单位多核苷酸激酶的总反应体积为50μl的溶液中，于37℃用磷酸盐标记30分钟。将接头加热到90℃以终止酶促反应，并缓慢冷却到室温以利于双链DNA形成。将StuⅠ接头加到上述DraⅠ消化产物中并用T4连接酶按下述方法连接之：在10μl含有6.6M Tris·Cl，PH7.6，5mM MgCl₂、5mM二硫苏糖醇、1mM ATP和1Weiss单位T4连接酶的反应混合物中，于23℃反应1小时。经苯酚提取及继后的乙醇沉淀而终止连接反应。然后用大于50单位的StuⅠ酶处理过夜，以除去StuⅠ接头的多聚体。经DraⅠ消化后加上StrⅠ接头，便恢复了因DraⅠ消化所除去的翻释终正密码子。

用XbaⅠ消化StuⅠ连接的DraⅠ片段，结果生成约600bp的所需StuⅠ/XbaⅠ片段;可由0.8%制备性琼脂糖凝胶中将其分离出来。然后将该含有基因C端75%片段克隆到已用XbaⅠ和StuⅠ消化的载体pYM4（图2）中，并按上述方法去磷酸化（可用ClaⅠ消化质粒pYM30并再连接两末端得到pYM4）。包含pYM30的大肠杆菌宿主细胞寄存在Northern        Regional        Research        Center，United        States        Department        of        Agriculture，Peoria，Illinois，寄存号为NRR7        B-15890）。由0.8%制备性琼脂糖凝胶中分离pYM4的5.7kb限制性片段。使用载体pYM4仅因其具有便于利用的限制性酶切点。在总反应应积为10μl的50m MTris-HCl（PH7.4）、10mM MgCl、10mM二硫苏糖醇、1mM亚精胺、1mM ATP中，于23℃用1 Weiss单位T4连接酶连接50ng载体和500ng插入片段。直接用连接反应混合物转化感受态MC1061细胞（大肠杆菌），使之产生氨苄青霉素抗性。大肠杆菌MC1061菌株可得自Northern Regional Research Center，United States Department of Agriculture，Peoria，Illinois，寄存号为NRRL-18016。MC1061具有下列表型：F（-），ara D139 δ（lac IPOZY）X74 galk galv hsr hsm（+）rpslδ（ara ABOIC leu）7697。可用下述方法使MC1061成为感受态细胞以便转化：在Damon IEC DPR 600离心机中，以3，000rpm离心5分钟收获大肠杆菌MC1061的对数生长中期的培养物并在10m M NaCl中洗涤。将培养物再悬浮于25ml 50mM CaCl₂中，于0℃放置30分钟。按上述方法离心得到细胞并重新悬浮于2ml 50mM CaCl₂中。为进行转化，将连接反应混合物加到100μl感受态细胞悬液中并在水浴中冷却15分钟，然后于37℃热冲击5分钟后于23℃保温5分钟。将细胞直接铺敷在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平皿上。平皿于37℃下保温10～16小时。收获所得菌落并用限制性消化法鉴定。将细胞在5ml含50μ/ml氨苄青霉素的L培养液中培养5小时（37℃）并用Birnboim和Doly[Nucleic Acids Research 7：1513（1979）]的方法制备DNA。用BamHⅠ和XbaⅠ消化微量制备物。产生1.5kb Xba/Bam消化之片段的培养物被视为具有插入片段，按上述方法纯化培养物的大量DNA制品，然后进行氯化铯-溴 乙啶梯度离心分带。该克隆称为pHS1。

用StuⅠ消化质粒pHS1，按上述方法去磷酸化、用苯酚提取并用乙醇沉淀。按前述方法合成EcoRⅠ接头（GGAATTCC）、使之磷酸化、自身退火，并连接到修成平端的DNA上。用EcoRⅠ消化过夜以除去过量的接头，并在经苯酚提取和乙醇沉淀后用XbaⅠ消化DNA。经1.0%制备性凝胶电泳分离相似600bpXbaⅠ-EcoRⅠ片段DNA及582bp（XbaⅠ-EcoRⅠ）载体片段之一。将这些片段（500ng）连接到XbaⅠ-EcoRⅠ消化并去磷酸化的上述pUC18（50ng）中，用以按上述方法转化MC1061使之成为氨苄青霉素抗性菌株。检测微量DNA的限制性消化产物，以确定两片段中那一个已被克隆。不需要的片段有-ClaⅠ切点，从而ClaⅠ/XbaⅠ双酶消化产物将产生大约560bp+2400bp的片段，而正确的片段在用ClaⅠ消化后则产生一个线性3kb片段。用EcoRⅠ和XbaⅠ消化待选择的片段以产生600bp+2400bp片段。大量纯化一个这样的克隆并定名为pHS2-B。该克隆片段在其完整的前S₂基因C端区域最后一个密码子后面有一个EcoRⅠ位点。

B.前S₂基因的中间部分

按下述方法克隆前S₂基因的中间部分。用XbaⅠ和BamHⅠ消化质粒AM6，并由0.8%制备琼脂糖凝胶中分离250bp片段。按上述方法将该片段（50ng）连接到用XbaⅠ和BamHⅠ消化并去磷酸化的5ng pUC18上。用连接反应混合物转化大肠杆菌菌株Mc1061以使之产生氨苄青霉素抗性。用BamHⅠ消化微量制备物并选择含2.7kb线性片段的消化产物。选择一个分离克隆大量培养并按上 述方法分离和纯化DNA。该克隆称为pPS1。用EcoRⅠ和BamHⅠ切割该克隆并用0.8%制备琼脂糖凝胶电泳分离和纯化载体带。将依上述方法合成的下列经激酶处理的双链寡核苷酸连接到该载体上。：

EcoRI PstI BamHI

                            5′AATTCAATCCGTCTGCAG    3′

                                        3′GTTAGGCAGACGTCCTAG    5′

用此连接反应混合物转化大肠杆菌MC1061使之成为氨苄青霉素抗性菌株。经用PstⅠ消化以鉴定微量制备物。选择一个含250bpPstⅠ片段的克隆，进行大量DNA制备并分离质粒pPS2。

C.前S₂基因的N端部分

由按上述方法合成下列顺序的寡核苷酸，其中包括EcoRⅠ接头及前13个氨基酸编码顺序的N端区域：

HindIII EcoRI

    5′AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA    3′

        3′ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAG    5′

该片段含有HindⅢ和Pst末端及在ATG前面的EcoRⅠ识别顺序。将十倍过量的寡核苷酸克隆到经HindⅢ和PstⅠ消化并去磷酸化的pUC18中，然而根据其是否存在一个小的EcoRⅠ位点 （～75bp）而鉴定之。该克隆被定名为pTBO-2A。

用PstⅠ和XbaⅠ消化载体pTBO-2A以加入基因的中间部分;插入部分为得自pPS2的250bp Pst-Xba片段。根据大于300bp EcoRⅠ片段及290bp XbaⅠ/HindⅢ片段的存在来确定转化体。筛选的正确克隆被称为pTBO-3。将pTBO-3的HindⅢ/XbaⅠ片段插入XbaⅠ/HindⅢ消化hop HS2B中即得到完整的前S₂基因。根据存在825bp EcoRⅠ片段来鉴定上述氨苄青霉素抗性转化体，该构建物被称为pTBO4。

实施例2

载体pTBO        5A的构建

用于大肠杆菌宿主中的pAO804载体得自美国农业部北方地区研究中心（Northern        Regional        Research        Center        of        United        States        Department        of        Agriculture，Peoria，Illinois），寄存登记号为NRRL        B-18114。经分离质粒DNA得到pA0804、用EcoRⅠ消化，凝胶电泳以回收～7.5kb片段，该片段为在唯一的EcoRⅠ位点切断的线性pA0804。

由载体pA0804和pTBO4（pTBO4是实施例1中制得的）构建含有编码前S₂之基因的载体。按前述方法用EcoRⅠ消化2μg pA0804并在30μl反应体积用碱性磷酸酶处理之（在50mM Tris·Cl PH9.0，1mM MgCl₂、100μM ZnCl₂、1mM亚精胺中用1单位酶于37℃处理1小时）。用EcoRⅠ消 化pTBO4并得到含前S₂基因的825bp片段。用0.8%琼脂糖制备凝胶电泳纯化该片段。使用实施例1中所述的方法连接500ng片段和50ng pA0804。使用实施例1所述的方法，用所得载体转化MC1061，使之成为氨苄青霉素抗性菌株。依Birnboim和Doly[Nucleic Acids Research 1：1513（1979）]的方法分离DNA并用PstⅠ消化进行鉴定。鉴定一含2.1kb PstⅠ片段的克隆，确定其具有正确定向的插入段，并定名为pTBO5A。

实施例3

多拷贝前S₂菌株GS115/p TBO5A（S10）和单拷贝菌株GS115/p TBO5A的建立

在0.8%制备琼脂糖凝胶上纯化pTBO5        A的5.9kb        BglⅡ片段以产生多拷贝菌株GS115/p        TBO5        A（S10）。在实施例1中所述条件下使10μg片段自身连接过夜。根据在0.6%琼脂糖凝胶上存在高分子量产物来监测连接反应混合物的各等分样品。使用Cregg等人（Bio/Techmology        5：479-485，1987）所述的球型原生质体转化技术以其转化巴斯德毕赤酵母GS115。在基本培养基上恢复转化体并按下述方法筛选合适的突变表型。在无菌蒸馏水存在下经刮取平皿的表面收集转化菌株并以低输出功率超声处理 15秒钟。然后稀释到A600＝0.1并以10^-3和10^-4稀释度平铺在含甘油（作为碳源）的基本培养皿上（各两份），于30℃下温育2-3天。然后再以重复方式转移至其中蒸发相内加有100μl甲醇的小平皿上。于30℃温育24小时后，可见10-20%的转化株在甲醇上较之其他转化株生长慢。然后选择10个生长慢的菌落作进一步分析。由含甘油的小培养皿中收集这些菌落，使之生长在实施例5所述的摇瓶中，并按实施例8中所述方法检测22nM样颗粒的活性。用Southern印迹分析法（Maniatis等）进一步鉴定了一个活性提高了四倍的转化株。将一个多拷贝转化体的BglⅡ消化片段转移到硝酸纤维素滤膜上，并用缺口平移标记的HIS4特异性探针即pYM4（pYM4如实施例Ⅰ所述）进行探查。印迹中含有两个杂交带：一个来自基因组HIS4位点，一个来自表达载体。得自多拷贝菌株中表达暗盒之各带强度的比例，相对于标准化HIS4基因组带的单一拷贝，其每个下表共产生4个拷贝。

以同样方法产生单拷贝菌株GS115/p        TBO5A，但省去片段自身连接反应。

实施例4

酵母DNA微量制备物

10⁴细胞/ml在5ml YPD中30℃培养过夜，然后用DamonIEC DPR600临床离心机的3，000rpm离心5分钟沉淀细胞。将细胞沉淀物重新悬浮于0.5ml的1M山梨醇、0.1ml 0.5M ED TA（PH7.5）中，并将样品移入1.5ml微量离心管中。加入0.02ml浓度为2.5mg/ml的Zymolyase        60，000（Miles        Laboratories）并将样品于37℃下保温60分钟。用微量离心管以高速离心1分钟沉淀细胞，重新悬浮于0.5ml        50mM        Tris·Cl（PH7.4）和20mM        EDTA中。加入0.05ml        10%SDS，混合均匀后于65℃下保温30分钟。加入0.2ml        5M醋酸钾并将样品在冰上放置60分钟。再将样品在微量离心管中以高速离心5分钟。

将上清液移入另一干净的1.5ml微量离心管中并于室温下加入1倍体积的异丙醇。混合样品并于室温下静置5分钟，然后在微量离心管中以高速短时间（10秒）离心。弃去上清并将细胞沉淀风干。将细胞沉淀重新悬浮于0.3ml        10mM        Tris·Cl（PH7.4）和1mM        EDTA中之后，加入1mg/ml胰RNase溶液，将样品于37℃下保温30分钟。加入0.03ml        3M醋酸钠，混匀样品并加入0.2ml异丙醇。在微量离心管中以高速度离心样品以沉淀DNA。弃去上清，沉淀干燥后重新悬浮在0.1～0.3ml        10mM        Tris·Cl（PH7.4）和1mM        EDTA中。（注：在DNA用于限制性酶切之前，必须在微量离心管中以高速度将溶液离心15分钟，以除去可能会抑制消化过程的不溶性物质）。

实施例5

摇瓶表达研究

发酵之前，使所用菌株均生长于摇瓶中以确保有足够的表达水

表1

对前S_Z表达的分析

%蛋白质        %蛋白质

菌株 AUSRIA^TMWestern

1.GS115/PTBO        5A        0.11%        0.23%

2.GS115/pTBO5        A（S10）        0.31%        0.63%

实施例6

发酵表达研究

按下述方法进行发酵。向Fernbach瓶中的500ml酵母氮基培养液（YNB）+2%甘油内接种种子培养物或基本葡萄糖平皿培养物。（每月传代以维持培养皿，应没有可测出的菌株损伤）。以200rpm和30℃下振荡培养1天后，将菌接种到7.5升含480g甘油、40mg生物素和40ml微量盐溶液（表Ⅲ）的基本培养基（表Ⅱ）中。发酵器保持30℃及PH5.5，培养物则以批量方式生长，直到甘油耗尽（约24小时）。加入NH₃气以控制PH。根据CO₂释放量的急剧降低和溶解氧的急剧增加（或氧摄取速率降低）来指示甘油耗 平。一般作法是将转化菌株接种到含2-5%甘油的0.67%酵母氮源培养基（YNB）中，于30℃温育过夜，使之达到中至晚生长对数期。然后使用Damon IEC DPR600临床离心机于3，000rpm离心5分钟收集细胞。用无菌水将细胞沉淀洗涤两次，然后以0.5A600单位/ml的密度接种到含1%甲醇的0.67%YNB中并以中速振荡在30℃下培养4-6天。在不同时间取出50A600单位等分样品并储存于-20℃。由这些样品制备的蛋白质提取物用于AUSRIA^TM和Western印迹分析（分别见实施例8和7）。将细胞的等分样品（100A600单位）移入13×100mm硅酸硼培养管中并通过在Sorvall RC-5B型离心机中以12，000rpm离心（4℃）用20倍体积的溶菌缓冲液（0.5M NaCl、0.1%Triton X-100（w/v）、1M苯甲基磺酰氟和10mM磷酸钠，PH7.5）洗涤两次。用0.5g酸洗的玻璃珠（0.5mm）加0.35ml溶菌缓冲液再悬浮细胞样品，使用Vortex混合器以最大速度，每隔一分钟搅拌一次共八次。搅拌间隔期间，混合物至少在冰上冷却1分钟。溶菌完成后，去除破碎之细胞溶液，用0.35ml溶胞缓冲液洗涤玻璃珠，合并两溶液并使用SorvallRC-5B离心机以13，000rpm，4℃离心以除去细胞碎片。然后用AUSRIA法和Western印迹法分析蛋白质样品（见表1）。经TCA（三氯醋酸）沉淀后用Lowry法测定蛋白浓度。 尽。开始以18ml/小时供入甲醇以使发酵器内含量达～0.5%MeOH，并维持在这一水平。根据甲醇的实际消耗率调整进料流速。以大约2天间隔加入20ml等分的微量盐溶液以维持甲醇消耗速率。供入甲醇期间HBs        Ag水平约持续增加三天。

表Ⅱ

培养基组成（7.5升）

480g        甘油

40mg        生物素

134ml H₃PO₄（85%）

5.8g CaSO₄·2H₂O

92g H₂SO₄

75g MgSO₄·7H₂O

21g        KOH

表Ⅲ

IM₁微量盐溶液

五水合硫酸铜        0.06

碘化钾        0.08

一水合硫酸镁        0.30

钼酸钠        0.20

硼酸        0.02

一水合硫酸锌        2.00

一水合氧化铁        4.8

硫酸        5.00ml/升

图Ⅳ显示了对由生长于发酵罐内的菌株制得的提取物按实施例1所述方法作AUSR1 A^TM分析的结果。

表Ⅳ

菌株 经AUSRIA^TM测得的容积产率

（mg/L）

GS115/p        TBO5A        9

GS115/p        TBO5A（S10）        60

实施例7

检测和证实前S₂的存在

按实施例5中所述方法对溶解毕赤酵母细胞得到的蛋白质作Western印迹分析。所用抗体购自Cal        Biochem，Lot＃702106、以1000倍稀释的HBs        Ag特异性抗体。

另外，SDS/PAGE分析和对部分纯化之蛋白制品的银染色也证明了前S₂多肽，即p31的存在。

实施例8

AUSRIA^TM放射免疫分析法

使用Abbott        AUSRIA试剂盒检测毕赤酵母生产体系合成的HBs        Ag量。试剂盒中的抗体与HBs        Ag颗粒结合，但不与HBs        Ag单体结合。所有稀释液均在含1.0%BSA、0.02%迭氮钠的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（PH7.4）中配制。所用方法基本上如药盒使用说明书所述。依下述方法绘制标准曲线。

管号        检查的ng数        缓冲液（μl）        阳性对照（μl）

1-4        无NSB        无        200（只有缓冲液）

5-6        0.1        195        5

7-8        0.2        190        10

9-10        0.5        175        25

11-12        1.0        150        50

13-14        2.0        100        100

15-16        3.0        50        150

17-18        4.0        无        200

按下述方法标记微量滴定极的各小孔：

AA        BB        CC        DD

1        1        2        3        4

2        5        6        7        8

3        9        10        11        12

4        13        14        15        16

5        17        18        19        20……

各小孔内先加入小珠，然后加缓冲液，最后加入标准（阳性对照）或稀释的样品。稀释待测物以得到在标准曲线范围内的结果。将估计的样品浓度（mg/ml）除以0.02，得到所用的稀释度。一般将100μl样品加到含100μl缓冲液的小孔内。附盖各小孔并朝顶部轻轻敲击托盘。然后在室温下保温过夜以得到最大结合效率。第二天早晨使用Abbott试验室提供的Pentawash系统，用去离子水将各小孔洗4次。向各小孔内加入200μlⅠ标记的抗HBs抗体，轻轻敲击托盘，然后于45℃水中保温1小时。按前述方法洗小珠并作γ计数。根据标准曲线测定未知物的浓度。

Claims (22)

1、一种提高抗原性HBV颗粒生产量的方法，其包括

a)用至少具有一个表达暗盒的至少一个载体转化甲基营养型酵母，其中所说的表达暗盒含有以可启动方式连接到调节区及3′终止序列上的前S₂结构基因；然后

b)在适当条件下培养所得已转化的酵母菌株，从而得以产生所说的HB_sA_g前S₂蛋白。

2、根据权利要求1的方法，其中所说的载体选自于质粒或线性的整合位点特异性载体。

3、根据权利要求2的方法，其中载体是线性的整合位点特异性载体。

4、根据权利要求3的方法，其中所说的线性整合位点特异性载体含有下列连续排布的顺序：

a）第一个可插入的DNA顺序，

b）一个标志基因，及至少一个含前S₂结构基因的、以可启动的方式与调节区和3′终止序列连接的表达暗盒，及

c）第二个可插入的DNA顺序;

其中成分（b）所述标志基因及暗盒的次序可以互换。

5、根据权利要求4的方法，其中第一个可插入的序列和第二个可插入的序列是由巴斯德毕赤酵母分离的、选自由AOX1、p40、DHAS和HIS4组成的那组中的一个基因的DNA顺序衍生的。

6、根据权利要求4的方法，其中所说的表达暗盒包括

a）一个选自从巴斯德毕赤酵母分离之AOX1、p40、DHAS，及从啤酒酵母分离之酸性磷酸酶、半乳糖苷酶、醇脱氢酶、细胞色素C、α接合因子和3-磷酸甘油醛脱氢酶的调节区，与该调节区以可启动方式连接的

b）前S₂的结构基因，与该结构基因以可启动方式连接的

c）选自由AOX1基因、p40基因、DHAS基因和HIS4基因分离之3′终止序列的巴斯德毕赤酵母3′终止序列。

7、根据权利要求4的方法，其中所说的标志基因选自从巴斯德毕赤酵母分离的HIS4和ARG4、由啤酒酵母分离的SUC2以及Tn903和Tn601的G418^R基因。

8、根据权利要求4的方法，其中所说的载体包括

a）第一个可插入的DNA片段，其为由巴斯德毕赤酵母分离之AOX1调节区的约1千碱基，与该片段以可启动方式连接的

b）前S₂的结构基因，与该结构基因以可启动方式连接的

c）由巴斯德毕赤酵母分离的AOX1的3′终止序列，该终止顺序连接到

d）由巴斯德毕赤酵母分离的HIS4标志基因，该标志基因连接到

e）3′AOX1终止顺序之大约0.65千碱基的第二个可插入的DNA片段。

9、一个线性的整合位点特异性载体，其包括下列连续排列的部分：

a）第一个可插入的DNA片段，

b）以可启动方式连接到调节区和3′终止顺序上的标志基因及至少一个包含前S₂之结构基因的表达暗盒，及

c）第二个可插入的DNA顺序;

其中组分（b）中的标志基因和暗盒的次序可以互换。

10、根据权利要求9的载体，其中所说的第一个可插入的DNA片段和同样的第二个可插入的DNA片段是由巴斯德毕赤酵母中分离的并选自AOX1、p40、DHAS和HIS4的基因的DNA顺序衍生的。

11、根据权利要求9的载体，其中所说的表达暗盒包括

a）一个选自由巴斯德毕赤酵母分离之AOX1、p40、DHAS和HIS4、由啤酒酵母分离之酸性磷酸酶、半乳糖苷酶、醇脱氢酶、细胞色素C、α-接合因子及3-磷酸甘油醛脱氢酶的调节区，与该调节区以可启动方式连接的

b）前S₂的结构基因，与该结构基因以可启动方式连接的

c）选自从巴斯德毕赤酵母的AOX1基因，p40基因、DHAS基因和HIS4基因分离的3′终止序列的3′终止序列。

12、根据权利要求9的载体，其中所说的标志基因选自从巴斯德毕赤酵母中分离的HIS4、ARG4;从啤酒酵母分离的SUC2及细菌Tn903和Tn601的G148^R。

13、根据权利要求9的载体，其中所说的载体包括

a）第一个可插入的DNA片段，其为由巴斯德毕赤酵母中分离的长约1千碱基的5′AOX1基因的可启动调节区，与该调节区以可启动方式连接的

b）前S₂的结构基因，与该结构基因以可启动方式连接的

c）由巴斯德毕赤酵母中分离的AOX1的3′终止顺序，与该顺序连接的

d）从巴斯德毕赤酵母中分离的HIS41标志基因，及与标志基因连接的

e）3′AOX1终止顺序的长约0.65千碱基的第二个可插入的DNA片段。

14、用至少含一个表达暗盒的至少一个载体转化的甲基营养型酵母，其中所说的表达暗盒包含一以可启动方式连接到前S₂结构基因上的调节区，该结构基因则以可启动方式连接到3′末端终止顺序上。

15、根据权利要求14的甲基营养型酵母，其中所说的酵母是巴斯德毕赤酵母。

16、根据权利要求14的甲基营养型酵母，其中所说的酵母是巴斯德毕赤酵母菌株GS115。

17、根据权利要求16的巴斯德毕赤酵母GS115菌株，其中所说的GS115菌株是用至少一个线性的整合位点特异性载体转化的，所说的载体包含依次排列的：

a）第一个可插入的DNA片段;

b）一个标志基因和至少一个包括前S₂结构基因的相容的表达暗盒，与该结构基因以可启动方式连接的

c）由巴斯德毕赤酵母的AOX1基因、p40基因、DHAS基因和HIS4基因分离之3′终止顺序筛选的3′终止顺序，

d）第二个可插入的DNA片段，

其中组成成分（b）中标志基因和暗盒的次序是可以互换的。

18、根据权利要求17的线性位点特异性整合载体，其中所说的载体包括

a）由巴斯德毕赤酵母中分离的5′AOX1调节区之约1千碱基长的第一个可插入的DNA片段，与该片段以可启动方式连接的

b）前S₂的结构基因，与该基因以可启动方式连接的

c）由巴斯德毕赤酵母中分离AOX1基因的3′终止顺序，与该终止顺序连接的

d）由巴斯德毕赤酵母中分离的HIS4标志基因，以及与之连接的

e）3′AOX1终止顺序之大约65千碱基肠的第二个可插入的DNA顺序。

19、巴斯德毕赤酵母GS115/p        TBO5A。

20、根据权利要求17的转化的巴斯德毕赤酵母菌株GS115，其中所说的GS115菌株是用一个以上所说的线性的整合位点特异性载体的拷贝转化的。

21、巴斯德毕赤酵母GS115/p        TBO5        A（S10）。

22、依权利要求1的方法制得的抗原性HBV颗粒。

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