NO891687L - Ekspresjon av hepatitt-b pres2-protein i metylotrofe gjaersorter. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår området rekombinant-DNA-bioteknologi. En

side ved oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til forbedret ekspresjon av antigene partikler bestående hovedsakelig av preS2-proteinet i metylotrofe gjærsorter. En annen side ved den foreliggende oppfinnelse angår nye DNA-molekyler og nye gjærstammer transformert med disse.

Hepatitt-B-virus (HBV) forårsaker både akutte og kroniske sykdommer og representerer et verdensomspennende folkehelse-problem. HBV viser seg som en kronisk svekkende infeksjon som kan føre til gradvis alvorlig leverskade, primærkarsinom og død. I de fleste tilfeller blir pasientene fullstendig friske fra HBV. En betydelig del av befolkningen som er infisert med HBV blir imidlertid kroniske bærere av sykdommen med muligheten for å overføre sykdommen til andre.

Den senere tids fremskritt innen rekombinant-DNA-teknikker

har skaffet mange nyttige metoder til klarlegging av den gene-tiske struktur av HBV samtidig som de skaffer metoder til fremstilling av vaksiner mot HBV. Man vet nå at HBV-genomet består av tilnærmet 3,2 kilobasepar av delvis dobbelttrådet DNA med en DNA-polymerase som er kovalent festet innkapslet i

et 27 nm nukleokapsid. Nukleokapsidet er pakket inn i en lipoproteinkappe som består av cellulære lipider og hepatitt-B-overflateantigener (HBsAg). Dette kalles virionet og er 42 nm i diameter.

Det er også funnet at viruskappen består av tre forskjellige

men beslektede overflateproteiner. Disse proteiner betegnes generelt som S-, preS2_ og preS ]_-proteiner. Hvert virion består av 300-400 S-proteinmolekyler og 40-80 preS2~og preS]_-proteinmolekyler.

S-proteinet består av 226 aminosyrer og er den viktigste komponent av normal viro-lipoproteinkappe. S-proteinet er tilnærmet 24-25 kilodalton (kDa) og kan betegnes som P24 eller P25. S-proteinet kan også være glykolysert til et 27-28 kilodalton glykoprotein betegnet som GP27 eller GP28.

Det annet HBsAg-protein er preS2-overflateantigenet, også betegnet som det midterste HBsAg-polypeptid. preS2består av 281 aminosyrer dannet ved tilføyelsen av 55 aminosyrer til isl-enden av S-proteinet. preS2~proteinet er tilnærmet 31 kilodalton og kan betegnes som P31-proteinet. preS2_proteinet har også

to glykosylerte former på 3 3 kilodalton og 3 6 kilodalton, betegnet som henholdsvis GP33 og GP36. Dette antigen antas å utløse en ytterligere antigen reaksjon hos personer som ikke reagerer på S eller som reagerer svakt på S.

Det tredje HBsAg-protein er preS]_-overflateantigenet, også betegnet som det sene HBsAg-polypeptid. preS^består av 3 89-400 aminosyrer (avhengig av den antigene undertype av HBV). Sekvensen som er unik for preS]_ består av 108-119 aminosyrer som er føyet til N-enden i det komplette preS2~protein. preS^-proteinet er tilnærmet 43 kilodalton og kan også betegnes som P43-proteinet. preS^eksisterer også i en glykosylert form på 46 kilodalton, betegnet som GP46 glykoprotein.

I løpet av en HBV-infeksjon blir fullstendige virus-nukleokap-sider pakket inn i en lipoprotein-kappe for dannelse av 42 nm-partikler. Videre blir der under HBV-infeksjonen dannet tomme 22 nm-partikler som består for det meste av s- og preS2_pro-teinene, og noen preS]_-proteiner. Skjønt det fullstendige virus-nukleokapsid er infektiøst, er de tomme 22 nm-partikler ikke infektiøse. De tomme partikler vil imidlertid utløse en immunreaksjon som er tilstrekkelig til å meddele immunitet og kan benyttes i fremstillingen av vaksiner for HBV.

Hepatitt-B-vaksiner fremstilt med 22 nm-partikler ble historisk fremstilt fra plasmaet av humane bærere av HBV. Uheldigvis må 22 nm-partiklene som fås fra humant plasma underkastes utstrakt rensing for å fjerne infektiøse HBV-partikler så vel som even-tuelle andre plasmabårede patogener. Dessuten er fremstillingen av hepatitt-B-vaksine blitt alvorlig hindret på grunn av den begrensede tilgjengelighet av humant plasma.

Ved anvendelse av rekombinant-DNA-bioteknologi er det blitt mulig å uttrykke hepatitt-S-proteinet i en 22 nm-partikkel i transformerte pattedyrcellelinjer og gjær.

Anstrengelser for å produsere det antigene og potensielt vaksine-effektive preS2_protein har vist at dette er usedvanlig vanskelig. preS2-proteinet er funnet å være meget ømfintlig overfor proteolyse i rekombinante systemer. Proteolyse gir to mindre proteinfragmenter som ikke bibeholder preS2S antigenisi-tet. Dessuten har preS2~proteinet vært meget vanskelig å uttrykke i rekombinante systemer. Ekspresjonsnivået av preS2er tilnærmet 1/10 av nivået av S-proteinet produsert i de samme rekombinante systemer.

Det vil således være et betydelig bidrag til faget å utvikle en fremgangsmåte til fremstilling av antigene HBV-partikler bestående stort sett av ikke-glykosylert preS2~protein av HBV.

Det er derfor en hensikt med oppfinnelsen å skaffe en fremgangsmåte til forbedret fremstilling av antigene HBV-partikler bestående hovedsakelig av det ikke-glykosylerte preS2~protein av HBV.

Nok en hensikt med oppfinnelsen er å skaffe nye vektorer inneholdende DNA-sekvenser som koder for preS2~proteinet.

En annen hensikt med oppfinnelsen er å skaffe nye metylotrofe gjærsorter transformert med en vektor eller vektorer som kan fremme produksjonen av HBV-partikkelen bestående av preS2~proteinet.

Nok en hensikt med oppfinnelsen er det produkt som fremstilles ved prosessen for produksjon av antigen HBV-partikkel bestående hovedsakelig av ikke-glykosylert preS2~protein.

Disse og andre hensikter med oppfinnelsen vil fremgå fra be-skrivelsen og de tilhørende krav.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er det funnet en fremgangsmåte til den forbedrede fremstilling av en antigen HBV-partikkel som omfatter å transformere en metylotrof gjær med minst én vektor som har en forenlig ekspresjonskassett inneholdende et strukturelt gen for preS2og dyrking av de resulterende transformanter under betingelser som er egnet for oppnåelse av produksjonen av partikler. Fig. 1 gir en representasjon av HBV som inneholder preS2~genet av HBV seratype adw. Plasmid AM6 er et derivat av det HBV-genom som er vist på fig. 1, hvor pBR322-plasmidet er innskutt ved BamHI-setet i posisjon 26. Fig. 2 gir en representasjon av plasmid pYM4, et pBR322-avledet plasmid inneholdende Pichia pastoris HlS4-genet innskutt i BamHI-setet. Parenteser angir at setet ble ødelagt. HIS4-genet er deponert innen pYJ30 (NRRL B-15890). Fig. 3 gir en representasjon av plasmid pYMlO. pYMlO er et derivat av pYJ30 (NRRL B-15890) med BamHI-setet ved 2959 ødelagt. Parentesene i figuren angir et ødelagt restriksjonssete. Fig. 4 gir en representasjon av plasmid pA0804 som inneholder en lineær integrativ setespesifikk vektor i fragmentet i retning med urviseren fra Bglll til Bglll. Det strukturelle gen kan innsettes i dette plasmids unike EcoRI-sete.

Det preS2strukturelle gen er velkjent i faget og er blitt sekvensert av Lo, Charac teris tics of PreS.2 Region of Hepatitis B Virus, 135 Biochemical and Biophysical Research Communications 382 (1986). En rekke forskere innen dette område har klonet dette strukturelle gen og uttrykt det såsom f.eks. Lo og Valenzuela, Svnthesis and Assemblv in Yeast of Hepatitis B Surface Antigen Particles Containina the Polvalbumin Receotor.

3 Biotechnolgy 317 (1985) for bare å nevne to. Det strukturelle

gen kan således fås fra forskere på området syntetisert eller reisolert. Det er også kjent at en hvilken som helst preS2-seratype kan anvendes for utførelse av oppfinnelsen.

Den preS2strukturelle gen seratype adw som anvendes for ut-førelse av oppfinnelsen, ble oppnådd fra plasmid AM6. Nukleotidsekvensen for dette preS2strukturelle gen er vist i tabell

1. De plasmider som her ble brukt, kan dyrkes i en hvilken

som helst egnet E. coli-vert såsom MC1061. Plasmid AM6 er et derivat av HBV-genomet vist på fig. 1, hvor pBR322-plasmidet er innskutt ved BamHI-setet i posisjon 26.

To segmenter av preS2strukturelle gener ble utvunnet fra plasmid AM6 og nukleotidsekvensen for de første 13 aminosyrer av N-enden ble syntetisert in vitro. Syntesen av nukleotidsekvensen som her benyttes kan oppnås på enten kjemisk eller enzymatisk måte såsom kjemiske fremgangsmåter basert på fosfo-triester- eller fosfittkjemi. C-endens kodende område omfattende 7 5% av det strukturelle gen for preS2, ble oppnådd fra plasmid AM6 ved en Dral-digerering av plasmidet. Dral-digereringen ble utført ved bruk av i han-delen tilgjengelig Dral-endonuklease (all endonuklease ble anvendt i henhold til fabrikantens anbefalinger). Dral-fragmentene ble deretter fenolekstrahert og etanolutfelt.

En oktamer Stul-linker (AAGGCCTT) ble deretter fremstilt i henhold til standard DNA synteseteknikker og ligatisert til Dral-fragmentene ved anvendelse av T4-ligase i en butt-ende ligasjon. Ligasjonen ble avsluttet ved fenolekstraksjon fulgt av etanolutfelling. De resulterende fragmenter ble deretter digerert med Stul-endonuklease for å fjerne multimerer av Stul.

De Stul-koblede fragmenter ble deretter digerert med Xbal.

Det resulterende StuI/Xbal-fragment på ca. 600 bp inneholdende det C-ende kodende område av det preS2strukturelle gen ble isolert ved gelelektroforese.

Dette 600 bp-fragment ble deretter ligatisert med T4-ligase inn i et 5,7 kb Xbal/Stu-digerert stykke av plasmid pYM4,

fig. 2, som var blitt isolert ved agarosegelelektroforese.

Ligasjonsblandingen ble deretter anvendt direkte til å transformere kompetente E. coli-celler (MC1061) som deretter ble dyrket i nærvær av ampicillin.

Vellykkede transformerte kolonier ble valgt, og det plasmide DNA ekstrahert ved fremgangsmåten i henhold til Birnboim og Doly [Nucleic Acids Research 7:1513 (1979)].

Det ekstraherte plasmid-DNA ble digerert med Stul, fenolekstrahert og etanolutfelt. EcoRI-linkere ble fremstilt og T4-ligati-sert til Stul-fragmentene. Overskytende linkere ble fjernet ved EcoRI-digerering. Disse EcoRI-koblede fragmenter ble ytterligere digerert med Xbal og underkastet elektroforese for å isolere fragmentene som inneholdt C-endepartiet av det preS2strukturelle gen.

Det Xbal/EcoRI digererte stykke ble ligatisert inn i Xbal/EcoRI-kuttet pUC18. Ligasjonsblandingen ble transformert inn i kompetente E. coli-celler (MC1061), som deretter ble dyrket i nærvær av ampicillin. Transformerte celler inneholdende C-endepartiet av det preS2strukturelle gen ble utvalgt ved fragment-digereringsanalyse ved anvendelse av Clal og Xbal. Det plasmid som ble valgt ved denne prosess, ble betegnet pHS2-B.

Det midtre parti av preS2~genet ble utvunnet ved at plasmid

AM6 først ble digerert med Xbal og BamHI. Det ønskede 250 bp-fragment ble isolert ved gelelektroforese. Det 250 bp Xbal/BamHI-fragment ble deretter ligatisert inn i pUC18 som

var blitt digerert med Xbal og BamHI og brukt til å transformere E. coli MC1061. Kulturer som vokste i nærvær av ampicillin

ble analysert ved utvinning av plasmid-DNA og digerering av dette med BamHI. De plasmider som inneholdt et 2,7 kb lineært fragment ved elektroforese, ble ansett for å ha det ønskede 250 bp-fragment. En transformert koloni inneholdende 250 bp-fragmentet, ble isolert og dyrket i stor målestokk. Det plasmide DNA ble isolert og renset fra kolonien som ble digerert med EcoRI og BamHI. Vektorbåndet ble isolert ved elektroforese.

Vektoren ble deretter ligatisert med det følgende kinaserte dobbelttrådede oligonukleotid:

Ligasjonsreaksjonsblandingen ble benyttet til å transformere

E. coli MC1061 og kolonier med det riktige innsatte materiale selektert ved ampicillinresistens. Plasmidet ble betegnet pPS2.

Det N-endekodende område av preS2ble fremstilt som et syntetisk oligonukleotid med den følgende sekvens:

Denne sekvens ble klonet inn i et HindiII og Pstl digerert stykke av pUC18. De ønskede transformanter varkarakterisertved nærværet av et tilnærmet 7 5 bp fragment etter EcoRI-digerering og elektroforese. De plasmider som ble valgt ved denne fremgangsmåte, ble betegnet pTBO-2A.

Det midtre parti av genet ble tilføyet ved digerering av vektoren pTB0-2A med Pstl og Xbal. Det innskutte materiale var det 250 bp-fragment Pstl-Xbal fra pPS2. Transformanter varkarakterisert vednærværet av et >300 bp EcoRI-fragment så vel som et 290 bp XbaI/HindIII-fragment. Det riktige isolat ble betegnet pTBO-3. Det fullstendige preS2_gen ble oppnådd ved innsetting av HindIII/XbaI-fragmentet fra pTBO-3 i Xbal/Hindlll-digerert pHS2B. Ampicillinresistente trans formanter varkarakterisert vednærværet av et 825 bp EcoRI-fragment. Dette konstruerte stykke ble betegnet pTB04.

Dyrking av den E. coli-stamme som er angitt ovenfor kan utføres ved en hvilken som helst egnet metode. Generelle teknikker for dyrking av E. coli er allerede kjent i faget og en hvilken som helst tilpasning av disse metoder til de spesielle behov for de stammer som her benyttes, ligger godt innenfor evnene til fagfolk.

Utvinning av plasmid DNA fra E. coli kan oppnås ved forskjellige teknikker på grunn av dets kompakte størrelse og lukkede sfær-iske superspiralform. For eksempel, etter høsting kan verts-celler pelleteres ved sentrifugering og deretter resuspenderes og lyseres. Lysatet bør sentrifugeres for å fjerne celleavfall og supernatanten inneholdende DNA bevares. En fenolekstråksjon kan deretter utføres for å fjerne de fleste andre forurensninger fra DNA. Det fenolekstraherte DNA kan deretter ytterligere behandles ved bruk av en densitetgradientsentrifugering eller en gelfiltreringsteknikk for å separere det plasmide DNA fra det bakterielle DNA. De teknikker for oppnåelse av separasjonen som er antydet ovenfor, er velkjente i faget, og en rekke forskjellige metoder for utførelse av disse teknikker er kjent.

Nukleasedigerering av plasmidet kan utføres ved valg av riktige endonukleaser som vil kutte det valgte plasmid på en slik

måte at det letter utvinningen av det preS2strukturelle gen. De endonukleaser som benyttes, vil avhenge av det plasmid som preS2_genet skal kuttes fra. For eksempel kan det preS2struk-

turelle gen som inneholdes i plasmid AM6, utvinnes i et Dral-HincII-fragment.

Gelelektroforese av DNA kan utføres ved bruk av en rekke forskjellige teknikker. Se P. G. Sealy og E. M. Southern, Gel Electrophoresis of Nucleic Acids - A Practical Approach

(D. Rickwood og B. D. Hames, eds.) p. 39 (1982). Eluering kan også utføres ved bruk av en rekke forskjellige teknikker som passer for den gel som er involvert, såsom elektroeluering, diffusjon, geloppløsning (agarosegeler) eller fysisk ekstru-dering (agarosegeler). Man innser dessuten at eluering ikke behøver å være nødvendig med visse geler såsom høykvalitets-agarose som smelter ved lav temperatur.

Straks det fragment som inneholder det preS2strukturelle gen eller fragmenter derav er isolert, kan ytterligere manipuleringer være nødvendige før det innsettes i vektoren. Disse manipuleringer kan innbefatte, men er ikke begrenset til at linkere tilføyes eller at fragmentet gis butte ender.

Etter isoleringen av det preS2strukturelle gen blir genet innsatt i en egnet metylotrof gjærvektor såsom et plasmid. Foretrukne vektorer for utførelse av oppfinnelsen er de som

er forenlige med Pichia-slekten og helst Pichia pastoris.

Plasmider har lenge vært et av de grunnleggende elementer som anvendes i rekombinant DNA-teknologi. Plasmider er sirkulært ekstrakromosomalt, dobbelttrådet DNA som finnes i mikroorga-nismer. Plasmider er funnet å opptre i enkelte eller flere kopier pr. celle. Innbefattet i plasmid-DNA er den informasjon som er nødvendig for plasmid reproduksjon, dvs. et opprinnelses-sted for replikasjon er inkludert for bakteriell replikasjon.

En eller flere måter til fenotypisk selektering av plasmidet

i transformerte celler kan også være inkludert i den informasjon som er kodet i plasmidet. Fenotypiske eller seleksjonsmarkører såsom antibiotiske resistensgener eller gener som komplementerer defekter i vertens biokjemiske veier, tillater kloner av verts-

cellene som er blitt transformert å gjenkjennes, selekteres og opprettholdes.

For å uttrykke det preS2strukturelle gen i metylotrof gjær

må genet være operabelt forbundet med et 5'-regulatorisk område og 3'-endesekvens som danner den ekspresjonskassett som skal innsettes i verten via en vektor.

De følgende uttrykk er her definert for klarhets skyld.

Operabelt forbundet - betegner en sammenstilling hvor kompo-nentene er satt sammen slik at de utfører sin funksjon.

Regulatorisk område - DNA-sekvenser som reagerer på forskjellige stimulanser og virker inn på hastigheten av mRNA-transkripsjon.

3'-endesekvens - sekvensene 3' til stoppkodonet som har som funksjon å stabilisere mRNA såsom sekvenser som frembringer polyadenylering.

"Pichia-forenlig" - betegner DNA-sekvenser som vil utføre deres normale funksjon i Pichia såsom regulatoriske områder og 3'-endesekvenser avledet fra Pichia.

For utførelse av den foreliggende oppfinnelse foretrekkes integrative vektorer såsom den lineære setespesifikke integrative vektor i henhold til Cregg, som beskrevet i europeisk patentsøknad nr. 86114700.7. Slike vektorer omfatter en nevnt arrangert rekkefølge av minst 1) et første innsettbart DNA-fragment, 2) et selekterbart markørgen og 3) et annet innsettbart DNA-fragment.

De første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver minst

ca. 200 nukleotider lange og har nukleotidsekvenser som er homologe med partier av det genomiske DNA av arter av slekten Pichia. De forskjellige komponenter av den integrative vektor er arrangert i serie for dannelse av et lineært fragment av DNA slik at ekspresjonskassetten og det selekterbare markørgen

er anordnet mellom 3'-enden av det første innsettbare DNA-fragment og 5'-enden av det annet innsettbare DNA-fragment.

De første og andre innsettbare DNA-fragmenter er orientert med hensyn til hinannen i det i rekkefølge arrangerte lineære fragment på samme måte som de er orientert i opprinnelsesgenomet (parent genome).

Nukleotidsekvenser som er nyttige som de første og andre innsettbare DNA-fragmenter er nukleotidsekvenser som er homologe med separate partier av det native genomiske sete hvor genomisk modifikasjon skal finne sted. For eksempel, dersom genomisk modifikasjon skal finne sted ved lokuset av alkoholoksidasegenet, vil de første og andre innsettbare DNA-fragmenter som anvendes, være sekvenser som er homologe med separate partier av alkoholoksidasegen-lokuset. For at genomisk modifikasjon i henhold til den foreliggende oppfinnelse skal finne sted, må

de to innsettbare DNA-fragmenter være orientert med hensyn til hinnanen i det lineære fragment med samme relative orientering som de eksisterer i opprinnelsesgenomet. Eksempler på nukleotidsekvenser som kan anvendes som første og andre innsettbare DNA-fragmenter, er nukleotidsekvenser valgt fra gruppen bestående av alkoholoksidasegenet (A0X1), dihydroksyacetonsyn-tasegenet (DHAS1), p40-genet og HIS4-genet. AOXl-genet, DHAS1-genet, p40-genet og HIS4-genet er angitt i søknad nr. EP-A-

183 071.

Det første innsettbare DNA-fragment kan inneholde et operabelt regulatorisk område som kan omfatte det regulatoriske område som anvendes i ekspresjonskassetten. Bruken av det første innsettbare DNA-fragment som det regulatoriske område for en ekspresjonskassett, er en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen. Fig. 4 viser et diagram av en vektor som anvender det første innsettbare DNA-fragment som et regulatorisk område for en kassett.

Valgfritt, som vist på fig. 4, kan et innskuddssete eller

-seter og en 3'-endesekvens anordnes i umiddelbar nærhet av 3' i forhold til det første innsettbare DNA-fragment. Denne

konformasjon av den lineære setespesifikke integrative vektor has den ytterligere fordel at det skaffer et ferdig sete for innsetting av et strukturelt gen uten at det nødvendiggjør tilføyelsen av en forenlig 3'-endesekvens.

Det er også nødvendig å innlemme minst ett selekterbart. markør-gen i det DNA som anvendes til å transformere vertsstammen. Dette letter seleksjonen og isolasjonen av de organismer som har innlemmet det transformerende DNA. Markørgenet meddeler den transformerte organisme et fenotypisk trekk som verten ikke hadde, f.eks. gjenopprettelse av evnen til å produsere en spesiell aminosyre hvor den utransformerte vertsstamme har en defekt i den spesielle aminosyre-biosyntetiske vei eller resi-stens overfor antibiotika og lignende.

Eksempler på selekterbare markørgener kan velges fra gruppen bestående av HIS4-genet og ARG4-genet fra Pichia pastoris og Saccharomyces cerevisiae, invertasegenet (SUC2) fra Saccharomyces cerevisiae, eller G418-fosfotransferasegenet

fra de E. coli-transposable elementer Tn601 eller Tn903.

Fagfolk vil innse at ytterligere DNA-sekvenser også kan inn-lemmes i de vektorer som anvendes i utførelsen av den følgende oppfinnelse, som f.eks. bakterielt plasmid-DNA, bakteriofag-DNA og lignende. Slike sekvenser tillater ampiifikasjonen og opprettholdelsen av disse vektorer i bakterieverter.

Dersom det første innsettbare DNA-fragment ikke inneholder et regulatorisk område, må et egnet regulatorisk område innsettes operabelt forbundet med det strukturelle gen for å skaffe en operabel ekspresjonskassett. På lignende måte, dersom ingen 3'-endesekvens er skaffet ved innsettingssetet for å fullføre ekspresjonskassetten, må en 3'-endesekvens forbindes operabelt med det strukturelle gen som skal innsettes.

Fagfolk er klar over en rekke forskjellige regulatoriske områder som er blittkarakterisertog som kan anvendes i forbindelse med metylotrofe gjærsorter. Eksempler på regulatoriske områder omfatter, men er ikke begrenset til gjær-regulatoriske områder valgt fra gruppen bestående av sur fosfatase, galaktokinase, alkoholdehydrogenase, cytokrom c, alfaparingsfaktor og glycer-aldehyd-3-fosfatdehydrogenase regulatoriske områder isolert fra Saccharomyces cerevisiae, det primære alkoholoksidase (A0X1), dihydroksyacetonsyntase (DHS1), de p40-regulatoriske områder og det HIS4-regulatoriske område som fås fra Pichia pastoris og lignende. For tiden foretrukne regulatoriske områder som anvendes til utførelse av oppfinnelsen, er de som er kjenne-tegnet ved deres evne til å reagere på metanolholdige medier såsom regulatoriske områder valgt fra gruppen bestående av A0X1, DHAS1, p40 og angitt i søknad nr. EP-A-183 071.

Det mest foretrukkede regulatoriske område for utførelse av oppfinnelsen er det AOX1 regulatoriske område.

3'-endesekvenser kan anvendes i ekspresjonskassetten eller være en del av vektoren som beskrevet ovenfor. 3'-endesekvenser kan tjene til å avslutte, polyadenylere og/eller stabilisere det messenger-RNA som kodes for ved det strukturelle gen når det er operabelt forbundet til et gen. Noen eksempler på illu-strative kilder for 3'-endesekvensene for utførelse av oppfinnelsen omfatter, men er ikke begrenset til Saccharomyces cerevisiae-, Hansenula polymorpha- og Pichia 3'-endesekvensene. De som fås fra Pichia pastoris foretrekkes, såsom de som er valgt fra gruppen bestående av 3'-endesekvensene av AOXl-genet, DHASl-genet, p40-genet og HIS4-genet. Særlig foretrukket er 3'-endesekvensen av AOXl-genet.

For utførelse av den foreliggende oppfinnelse foretrekkes det for tiden å anvende lineære transformasjonsvektorer såsom BglII-fragmentene av de konstruerte stykker vist på fig. 4.

Innsettingen av det preS2strukturelle gen i egnede vektorer kan oppnås ved en hvilken som helst egnet teknikk som kløyver den valgte vektor ved et passende sete eller seter og fører til at minst én operabel ekspresjonskassett inneholdende det preS2strukturelle gen foreligger i vektoren.

Ligasjon av det preS2strukturelle gen kan oppnås ved en hvilken som helst passende ligasjonsteknikk såsom anvendelse av T4 DNA-ligase.

Den opprinnelige seleksjon, formering og valgfritt amplifikasjon av ligasjonsblandingen av det preS2strukturelle gen og en vektor blir fortrinnsvis utført ved transformasjon av blandingen inn i en bakterievert såsom E. coli. Egnede transformasjonsteknikker for E. coli er velkjent i faget. Dessuten er selek-sjonsmarkører og bakterielle opprinnelsessteder for replikasjon som er nødvendige for opprettholdelsen av en vektor i en bakterievert, også velkjent i faget.

Isolasjonen og/eller rensingen av det ønskede plasmid som inneholder det preS2strukturelle gen i et ekspresjonssystem, kan utføres ved en hvilken som helst egnet fremgangsmåte for separasjon av plasmid-DNA fra verts-DNA.

På samme måte kan vektorer som dannes ved ligasjon utprøves fortrinnsvis etter formering for å bekrefte nærværet av preS2~genet og dets operable binding til et regulatorisk område og en 3'-endesekvens. Dette kan oppnås ved en rekke forskjellige teknikker som innbefatter, men ikke er begrenset til endonukle-asedigerering, gelelektroforese eller endonukleasedigerering/- Southern hybridisering.

Transformasjon av plasmider eller lineære vektorer inn i gjær-verter kan utføres ved egnede transformasjonsteknikker som omfatter, men ikke er begrenset til de som er vist av Hinnen et al, Proe. Nati. Acad. Sei. 75, (1978) 1929; Ito et al,

J. Bacteriol 153, (1983) 163; Cregg et al Mol. Cell Biol. 5

(1985) pp. 3376 eller Sreekrishna et al, Gene, 59 (1987) pp. 115. For utførelse av den foreliggende oppfinnelse foretrekkes transformasjonsteknikken i henhold til Cregg. Det er ønskelig for utførelse av oppfinnelsen å benytte et overskudd av lineære vektorer og selektere for multiple innsetninger ved Southern hybridisering. Gjærverten for transformasjon kan være en hvilken som helst egnet metylotrof gjær. Metylotrofe gjærsorter innbefatter, men er ikke begrenset til gjærsorter som kan vokse på metanol valgt fra slektene Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis og Rhodotorula. En liste over spesielle arter som er eksempler på denne klasse gjær, finnes i C. Anthony, The Biochemistrv of Methvlotro<p>hs. 269 (1982). For tiden foretrekkes metylotrofe gjærsorter av slekten Pichia såsom den auxotrofe Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851). Auxotrofe metylotrofe gjærsorter er også fordelaktige for utførelse av oppfinnelsen på grunn av at de lett kan selekteres. Det innses at vill type metylotrofe gjærstammer kan anvendes med like stort hell dersom et egnet transformerende markørgen velges såsom bruken av SUC2 til å transformere Pichia pastoris til en stamme som kan vokse på sakkarose, eller dersom en antibiotisk resistens-markør anvendes såsomG418<R->gen.

Transformerte metylotrofe gjærceller kan selekteres for ved anvendelse av riktige teknikker som innbefatter, men ikke er begrenset til dyrking av tidligere auxotrofe celler etter transformasjon i fravær av et biokjemisk produkt som er nød-vendig (på grunn av cellens auxotrofi), seleksjon ved påvisning av en ny fenotype ("metanol langsom") eller dyrking i nærvær av et antibiotikum som er giftig for gjæren i fravær av et resistensgen som inneholdes i transformanten.

Isolerte, transformerte, metylotrofe gjærceller dyrkes ved riktige fermenteringsteknikker såsom ristekolbefermentering, høytetthets-fermentering eller de teknikker som er angitt av Cregg et al, Hiah- Level Expression and Efficient Assemblv of Hepatitis B Surface Antigen in the Methvlotrophic Yeast.Pichia Pastoris, 5 Bio/Technology 479 (1987).

Ekspresjon kan utføres ved fremgangsmåter som passer for det regulatoriske område som anvendes. Dersom på metanol reagerende regulatoriske områder anvendes, kan fortrinnsvis induksjonen av ekspresjonen utføres ved at de transformerte celler i et næringsmedium utsettes for en passende alkohol for det regulatoriske område som anvendes.

De antigene partikler kan utvinnes i en rå form ved lysering

av transformerte celler som er blitt indusert i en tilstrekkelig lang periode ved bruk av standardteknikker såsom perlemølling, fulgt av sentrifugering tilstrekkelig til å fjerne celleavfall. Fagfolk er klar over en rekke forskjellige fremgangsmåter som er tilgjengelige for ekstråksjon av et heterologt protein fra encellede vertsorganismer som kan substitueres for den generelle ekstraksjonsteknikk angitt ovenfor eller for ytterligere rensing. Den foretukne fremgangsmåte til rensing for utførelse av oppfinnelsen omfatter å utføre lyse av de transformerte celler i nærvær av buffrede kaotropiske forbindelser, utfelling av lipider og forurensende proteiner fra supernatanten som fås fra lysen, diafiltrering av supernatanten, behandling av det tilbakeholdte materiale (retentate) med silika, vasking av forurensende proteiner fra det silika-absorberte hepatitt-B-overflateantigen med en buffer som har en pH-verdi i området 6-8, eluering av antigenet fra silikaet med et buffret eluer-ingsmiddel som har en pH-verdi i området 9,5-11 inneholdende 0,5-8 molaritet urea, underkaste de antigenholdige fraksjoner som oppnås på denne måte for gelfiltrering og deretter underkaste den antigenholdige fraksjon anionvekslingskromatografi.

De følgende ikke-begrensende eksempler er angitt for ytterligere å illustrere utførelsen av oppfinnelsen.

Eksempler

Generell informasjon som angår eksemplene:

Pichia pastoris GS115 (his4) NRRL Y-15851 var den vertsgjær-stamme som ble anvendt i disse eksempler. Medier

Eksempel I

Konstruksjon av vektor pTB04

Plasmid AM6 er et derivat av det HBV-genom som er vist på

fig. 1, hvor pBR322-plasmidet er innskutt ved BamHI-setet i posisjon 26.

Vektoren pTB04 inneholder genet som koder for 281 aminosyre preS2-formen av hepatitt-B-overflateantigenet. Genet ble kon-struert i tre segmenter: de C-terminale 7 5% av det strukturelle gen, en N-endelinker som koder for 13 aminosyrer og det res-terende sentrale parti. Plasmidet AM6 inneholdende preS2-genet, adw seratype, var kilden til C-endepartiet og det midtre parti av det preS2~gen som ble anvendt her. Sekvensen er angitt hos Valenzuela et al. ICN- UCLA Symposia on Animal Virus Genetics.p. 57-70 (1980) med den følgende modifikasjon:

A. C- endeoarti av<p>reS2

(Alle restriksjonsenzymer ble oppnådd fra Bohringer, Mannheim, og anvendt i henhold til produsentens instruksjoner).

C-endepartiet ble isolert fra plasmidet AM6 (fig. 1) ved digerering med Dral som kutter HBV-genomet på to steder, hvorav ett er ved kodonet for den siste aminosyre av overflateantigenet. Endene ble defosforylerte ved behandling med kalvetarm alkalisk fosfatase i et 30 pl reaksjonsvolum (1U enzym ved 37°C i 1 h i 50 irt Tris-HCl, pH 9,0, 1 mM MgCl2, 100 uM ZnCl2, 1 mM spermidin). Hele det digererte stykke ble fenolekstrahert

og etanolutfelt (Maniatis et al). En oktamer Stul-linker (AAGGCCTT) ble syntetisert ved en DNA-syntetisator fra Applied Biosystems Model 380A ved anvendelse av cyanoetylfosforamiditt-kjemi. 1 ug Stul-linkere ble oppløst i destillert vann. En porsjon på 10 ng ble fjernet og merket med fosfat i et samlet volum på 50 pl inneholdende 7 0 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 1 mM ATP og 10 enheter polynukleotid-kinase i 30 min ved 37°C. Linkerne ble varmet opp til 90°C

for å avslutte den enzymatiske reaksjon og langsomt avkjølt til værelsetemperatur for å lette dannelsen av dobbelttrådet DNA. Stul-linkerne ble satt til det ovenfor angitte Dral digererte stykke og ligatisert med T4-ligase som følger. Reaksjonen fant sted i et 10 ul volum inneholdende 6,6 M Tris-HCl, p.H 7,6, 5 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 1 mM ATP og 1 Weiss-enhet T4-ligase i 1 h ved 23°C. Ligasjonsreaksjonen ble avsluttet ved fenolekstraksjon fulgt av etanolutfelling. En Stul-restriksjonsdigerering ble deretter utført med >50 U enzym over natten for å fjerne multimerer av stul-linkeren. Kombinasjonen av Dral-digerering og Stul-linkere gjenopprettet det translasjons-stoppkodon som var fjernet ved Dral-digerering.

De Stul-koblede Dral-fragmenter ble digerert med Xbal som gav det ønskedse StuI/Xbal-fragment på tilnærmet 600 bp. Det ble isolert fra en 0,8% preparativ agarosegel. Dette fragment inneholdt de C-terminale 7 5% av genet og ble klonet inn i vektoren pYM4 (fig. 2) som var blitt digerert med Xbal og Stul og defosforylert som angitt ovenfor. (pYM4 kan fås fra plasmid pYM30 ved digerering av pYM30 med Clal og religatisering av endene. pYM30 er tilgjengelig i en E. coli-vert deponert ved the Northern Regional Research Center, De forente staters landbruksdepartement, Peoria, Illinois, aksesjonsnr. NRRL B-15890). Restriksjonsfragmentet på 5,7 kb av pYM4 ble isolert fra en 0,8% preparativ agarosegel. Vektor pYM4 ble anvendt ene og alene for dens passende restriksjonsseter. 50 ng av vektoren og 500 ng av det innskutte stykke ble ligatisert ved 23°C i 1 h i 50 mM Tris-HCl, pH 7,4,. 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 1 mM spermidin, 1 mM ATP med 1 Weiss-enhet T4-ligase i 10 pl volum. Ligasjonsreaksjonen ble anvendt direkte til å transformere kompetente MC1061-celler (E. coli) for ampicillinresistens E. coli-stamme MC1061 er tilgjengelig ved the Northern Regional Research Center, De forente staters landbruksdepartement, Peoria, Illinois, aksesjonsnr. NRRL-18016. MC1061 har

den følgende genotype: F(-), ara D139 delta (lacIPOZY) X74

galk galU hsr hsm(+) rpsL delta (araABOIC leu) 7697. MC1061

ble gjort kompetent for transformasjon på følgende måte: En middels logaritmisk kultur (50 ml) av E. coli MC1061 ble høstet ved sentrifugering i en Damon IEC DPR600 sentrifuge ved

3000 omdr./min i 5 min ved 4°C og vasket i 10 mM NaCl. Kulturen ble resuspendert i 25 ml 50 mM CaCl2i 30 min ved 0°C. Cellene ble sentrifugert som angitt ovenfor og resuspendert i 2 ml

50 mM CaCl2. For transformasjon ble ligasjonsreaksjonen satt til 100 ul av suspensjonen av kompetente celler og inkubert ved 0°C på is i 15 min, underkastet varmesjokk ved 37°C i 5 min og inkubert ved 23°C i 5 min. Cellene ble platet direkte på LB-agarplater inneholdende 50 ug/ml ampicillin. Platene

ble inkubert ved 37°C i 10-16 h. De resulterende kolonier ble høstet ogkarakterisert vedrestriksjonsdigerering. Cellene ble dyrket i 5 ml L-næringsvæske inneholdende 50 ug/ml ampicillin i 5 h ved 37°C og DNA ble fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til Birnboim og Doly [ Nucleic Acids Research 7:1513

(1979)]. Minipreparatene ble digerert med BamHI og Xbal. Kulturer som gav et 1,5 kb Xba/Bam-fragment, ble ansett for å ha det innskutte materiale og en fremstilling av DNA i stor skala av én kultur ble renset som angitt ovenfor, fulgt av bånd-dannelse på en cesiumklorid/etidiumbromid-gradient. Denne klon ble kalt pHSl.

Plasmidet pHSl ble digerert med Stul, defosforylert som angitt ovenfor, fenolekstrahert og etanolutfelt. EcoRI-linkere (GGAATTCC) syntetisert som angitt ovenfor ble fosforylert, selv-sammenføyet og ligatisert til dette DNA med butt ende. Overskytende linkere ble fjernet ved EcoRI-digerering over natten og DNA ble deretter digerert med Xbal fulgt av fenolekstraksjon og etanolutfelling. En dublett inneholdende det 600 bp Xbal/EcoRI-fragment av interesse og et vektorfragment på 582 bp (Xbal/EcoRI) ble isolert ved 1,0% preparativ gelelektroforese. Disse fragmenter (500 ng) ble ligatisert inn i Xbal/EcoRI-digerert og defosforylert pUC18 (50 ng) som beskrevet ovenfor og brukt til å transformere MC1061 til ampicillinresistens som beskrevet ovenfor. Restriksjonsdigererte stykker av minipreparert DNA ble anvendt til å bestemme hvilke av de to fragmenter som var blitt klonet. Det uønskede fragment hadde et Clal-sete slik at et Clal/Xbal dobbelt digerert stykke ville gi fragmenter på tilnærmet 560 bp + 2400 bp, mens det riktige fragment gav et lineært 3 kb-fragment ved Clal-digerering. Kandidatmaterialer ble digerert med EcoRI og Xbal for å gi fragmenter på 600 bp + 2400 bp. En slik klon ble renset i stor skala og betegnet pHS2-B. Dette inneholder et EcoRl-sete etter det siste kodon ved C-endeområdet av det fullstendige preS2<->gen.

B. Midtparti av preS2- qen

Midtpartiet av preS2~genet ble klonet som følger. Plasmidet

AM6 ble digerert med Xbal og BamHI og et fragment på 250 bp

ble isolert fra en 0,8% preparativ agarosegel. Dette fragment (50 ng) ble ligatisert som beskrevet ovenfor til 5 ng pUC18 digerert med Xbal og BamHI og defosforylert. Ligasjonsreaksjonen ble benyttet til å transformere E. coli-stamme MC10 61 til ampicillinresistens som angitt ovenfor. Minipreparater ble digerert med BamHI og de som inneholdt et 2,7 kb lineært fragment, ble valgt. Ett isolat ble dyrket i stor målestokk og DNA ble isolert og renset som beskrevet. Denne klon er kalt pPSl. Klonen ble kuttet med EcoRI og BamHI og vektorbåndet isolert og renset ved 0,8% preparativ agarosegelelektroforese. Til denne vektor ble ligatisert det følgende kinaserte dobbelttrådede oligonukleotid syntetisert som ovenfor:

Ligasjonsreaksjonen ble anvendt til å transformere E. coli MC1061 til ampicillinresistens. Minipreparatene blekarakterisert vedPstl-digerering. En klon inneholdende et 250 bp Pstl-fragment ble valgt, en fremstilling av DNA i stor målestokk ble utført og plasmidet pPS2 ble isolert.

C. N- endeparti av preS2~ qen

N-endeområdet omfattende EcoRI-linkeren og kodingssekvensene for de første tretten aminosyrer ble generert fra et syntetisk oligonukleotid inneholdende den følgende sekvens syntetisert som ovenfor:

Dette fragment inneholdt Hindlll- og Pstl-ender såvel som en EcoRI-sekvens som gikk forut for ATG. Denne sekvens ble klonet inn i Hindlll- og Pstl-digerert og defosforylert pUC18 ved ligatisering av et ti ganger så stort overskudd av oligo-nukleotidet inn i vektoren og karakterisering av transformantene ved nærværet av et lite EcoRI-sete (~75 bp). En slik klon ble kalt pTB0-2A.

Midtpartiet av genet ble tilføyet ved digerering av vektorenPTB0-2A med Pstl og Xbal. Innskuddet var det 250 bp Pst/Xba-fragment fra pPS2. Transformanter blekarakterisert vednærværet av et >300 bp EcoRI-fragment såvel som 290 bp Xbal/Hindlll-fragment. Det korrekte isolat ble betegnet pTBO-3. Det fullstendige preS2_gen ble oppnådd ved innsetting av Hindlll/Xbal-fragmentet fra pTBO-3 inn i Xbal/Hindlll-digerert pHS2B. Ampicillinresistente transformanter blekarakterisertsom angitt ovenfor ved nærværet av et 825 bp EcoRI-fragment. Dette konstruerte stykke ble betegnet pTB04.

Eksempel II

Konstruksjon av vektor PTB0 5A

pA0804-vektoren er tilgjengelig i en E. coli-vert fra the Northern Regional Research Center ved De forente staters landbruksdepartement, Peoria, Illinois, aksesjonsnr. NRRL B-18114.PA0804 utvinnes ved isolering av plasmid-DNA, digerering med EcoRI, gelelektroforese for utvinning av det~7,5 kb-fragment som er lineært pA0804 kuttet ved sitt unike EcoRI-sete.

En vektor inneholdende det gen som koder for preS2< ble kon-struert fra vektorer pA0804 og pTB04 (pTB04 ble skaffet i eksempel I). 2 ug pA0804 ble digerert med EcoRI som tidligere og behandlet med alkalisk fosfatase i et 30 ul reaksjonsvolum (1 U enzym ved 37°C i 1 h i 50 mM Tris-HCl, pH 9,0, 1 mM MgCl2, 100 uM ZnCl2, 1 mM spermidin). pTB04 ble underkastet EcoRI-digerering og et 825 bp fragment som koder for preS2~genet ble frigjort. Dette fragment ble renset ved anvendelse av preparativ agarosegelelektroforese ved anvendelse av 0,8% agarose. 500 ng av fragmentet og 50 ng av pA0804 ble ligatisert ved anvendelse av fremgangsmåter som beskrevet i eksempel I. Den resulterende vektor ble benyttet til å transformere MC1061 til ampicillinresistens ved anvendelse av den fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel I. DNA ble isolert ved anvendelse av fremgangsmåten i henhold til Birnboim og Doly f Nucleic Acids Research 7:1513 (1979)] ogkarakterisert veddigerering med Pstl. En klon inneholdende et 2,1 kb Pstl-fragment ble ansett for å ha det innskutte materiale i den riktige orientering og ble betegnet pTBOSA.

Eksempel III

Utvikling av multikooi preSo- stamme GS115/ pTBQ5A( S10)

og enkeltkopi- stamme GS115/ pTB05A

Multikopistammen GS115/pTBO5A(S10) ble generert ved rensing

av 5,9 kb BglII-fragmentet fra pTB0 5A på en 0,8% preparativ agarosegel. 10 ug av fragmentet ble selvligatisert over natten

ved anvendelse av betingelser som beskrevet i eksempel I. Porsjoner av ligasjonsreaksjonen ble overvåket for nærværet av materialet med høly molekylvekt på en 0,6% agarosegel. Dette ble anvendt til å transformere Pichia pastoris GS115 ved anvendelse av sfæroplast-transformasjonsteknikken som beskrevet av Cregg et al., Bio/ Technology 1:479-485 (1987). Transformanter ble regenerert på minimalt medium og sortert for den riktige mutantfenotyp på følgende måte. Transformanter ble slått sammen ved skraping av overflaten av platen i nærvær av sterilt, destillert vann og underkastet lydbehandling (sonicated) ved lav effekt i 15 s. De ble deretter fortynnet til en AgQQ= 0,1 og platet ved fortynninger på lO-^Qg10"<4>i duplikat på minimalplater inneholdende glycerol som karbon-kilden og inkubert ved 3 0°C i 2-3 dager. De ble deretter replikaplatet på minimalplater til hvilke 100 ul metanol ble tilsatt i dampfase. Etter en 24 timers inkubasjon ved 30°C var det tydelig at 10-20% av transformantene vokste langsommere på metanol enn resten av transformantene. Ti av disse lang-somtvoksende kolonier ble deretter utvalgt for ytterligere analyse. Det ble plukket fra minimalplaten inneholdende glycerol, dyrket i ristekolber som beskrevet i eksempel V og analysert for 22 nm-lignende partikkelaktivitet som beskrevet i eksempel VIII. En transformant som hadde en fire gangers for-sterket aktivitet, ble ytterligerekarakterisert vedSouthern blott-analyse (Maniatis et al.). Et Bglll-digerert stykke av multikopitransformanten ble overført til nitrocellulose og filteret ble probet med den nick-translaterte HIS4-spesifikke probe, pYM4 (pYM4 er beskrevet i eksempel I). Blottet inneholdt to hybridiserende bånd: ett fra det genomiske HlS4-lokus og ett fra ekspresjonsvektoren. Et forhold mellom intensiteten av båndene som ble oppnådd fra ekspresjonskassettene i multi-kopi-stammen i forhold til en enkeltkopi normalisert til intensiteten av de HIS4 genomiske bånd, gav i alt 4 kopier pr. celle.

Enkeltkopistammen GS115/pTB05A ble generert på samme måte med sløyfing av fragment-selvligasjonsreaksjonen.

Eksempel IV

Gi ær- DNA- minipreparat

IO<4>celler pr. ml ble dyrket i 5 ml YPD ved 30°C over natten og deretter pelletert ved anvendelse av en Damon IEC DPR600 klinisk sentrifuge ved 3000 omdr./min i 5 min. Pelleten ble resuspendert i 0,5 ml IM sorbitol, 0,1 ml 0,5 M EDTA, pH 7,5 og prøven overført til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. 0,02 ml av 2,5 mg/ml Zymolyase 60.000 (Miles Laboratories) ble tilsatt, og prøven ble inkubert ved 37°C i 60 min. Cellene ble pelletert ved anvendelse av mikrosentrifugen i 1 min ved høy hastighet og resuspendert i 0,5 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 og 20 mM EDTA. 0,0 5 ml av 10% SDS ble tilsatt, prøven blandet og inkubert ved 65°C i 30 min. 0,2 ml 5 M kaliumacetat ble tilsatt, og prøven ble inkubert på is i 60 min. Prøven ble igjen spunnet i en mikrosentrifuge ved høy hastighet i 5 min.

Supernatanten ble overført til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør og 1 volum av isopropanol ved værelsetemperatur ble tilsatt. Prøven ble blandet og tillatt å sitte ved værelsetemperatur i

5 min, deretter spunnet meget kort (10 s) i en mikrosentrifuge

ved høy hastighet. Supernatanten ble helt av og pelleten luft-tørket. Etter resuspendering av pelleten i 0,3 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 og 1 mM EDTA ble 15 ul av en 1 mg/ml oppløsning av bukspyttkjertel-RNase tilsatt, og prøven ble inkubert ved 37°C i 30 min. 0,03 ml 3M natriumacetat ble tilsatt, prøven blandet og 0,2 ml isopropanol tilsatt. Prøven ble spunnet i en mikrosentrifuge ved høy hastighet for å pelletere DNA. Supernatanten ble deretter helt av, pelleten tørket og resuspendert i 0,1-0,3 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 og 1 mM EDTA.

(Bemerk: Før anvendelse av DNA i et restriksjonsdigerert stykke kan det være nødvendig å spinne oppløsningen i 15 min ved høy hastighet i mikrosentrifugen for å fjerne eventuelt uoppløselig materiale som kan hindre digerering).

Eksempel y

Ristekolbe-ekspresionsundersøkelser

Før gjæring ble alle stammer dyrket i ristekolber som følger for å bringe på det rene ekspresjonsnivåene. På rutinemessig måte ble en transformant sådd i 0,67% gjærnitrogenbase inneholdende 2-5% glycerol og dyrket over natten ved 30°C til middels eller sen logaritmisk fase. Cellene ble deretter samlet ved sentrifugering ved bruk av en Damon. IEC DPR600 klinisk sentrifuge ved 3000 omdr./min i 5 min. Pelleten ble vasket i sterilt vann to ganger, deretter sådd med en densitet på 0,5 Aggg-enheter pr. ml inn i 0,67% YNB inneholdende 1% metanol

og dyrket i 4-6 dager ved 30°C ved moderat risting. På forskjellige tidspunkter ble porsjoner på 50 Aggg-enheter fjernet og lagret ved -20°C. Proteinekstrakter ble fremstilt fra disse porsjoner for å anvendes i en "AUSRIA" og Western blott-analyse (se henholdsvis eksempel VIII og VII). Porsjoner av celler (100 Aggg-enheter) ble overført til 13 x 100 mm borsilikat-dyrkningsrør og vasket to ganger ved sentrifugering i en Sorvall Model RC-5B ved 12 000 omdr. pr. min, 4°C med 20 volumer lysebuffer [0,5 M NaCl, 0,1% Triton X-100 (<w>/v), 1 M fenylmetyl-sulfonylfluorid og 10 mM natriumfosfat, pH 7,5]. Celleprøver ble resuspendert med 0,5 g syre-vaskede glassperler (0,5 mm) pluss 0,35 ml lysebuffer og agitert i åtte, 1-minutters perioder med maksimal hastighet ved anvendelse av en hvirvelmikser (vortex mixer). Mellom periodene ble blandingen kjølt på is i minst 1 min. Etter at lysering var fullført, ble oppløsningen av oppbrutte celler fjernet, glassperlene ble vasket med 0,3 5 ml lysebuffer, og de to oppløsninger kombinert og sentrifugert ved anvendelse av Sorvall RC-5B-apparatet ved 13 000 omdr., 4°C for å fjerne eventuelt celleavfall. Proteinprøver ble deretter analysert ved "AUSRIA" og ved Western blott-analyse (se tabell I). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt i henhold til Lowrys metode etter TCA-utfelling.

Eksempel VI

Gi ærinas- ekspresi onsundersekelser

Gjæringer ble utført som følger. 500 ml gjærnitrogenbase (YNB)

+ 2% glycerol i en Fernbach-kolbe ble podet fra en såkultur eller en minimal glukose-plate av kulturen. (Plater kan opprettholdes ved månedlig passasje uten noen påviselig stammefor-ringelse). Etter en dags risting ved 200 omdr./min og 30°C

ble podestoffet podet i 7,5 liters minimalt medium (tabell II) inneholdende 480 g glycerol, 40 mg biotin og 40 ml oppløs-ning av spormengdesalter (tabell III). Gjæringsapparatet ble holdt på 30°C og pH 5,5 mens kulturen vokste i satsvis modus inntil glycerolen var uttømt (ca. 24 h). pH-verdien ble regulert ved tilsetning av NH3~gass. Glycerol-uttømming ble observert ved en kraftig reduksjon i CO^-avgivelsen og en kraftig økning i det oppløste oksygen (eller reduksjon i oksygenopptakshastig-heten). Et metanolmatningsmateriale ble startet ved 18 ml/h for å bringe nivået i gjæringsapparatet på~0,5% MeOH, og opprettholdt på dette nivå. Strømningshastigheten ble justert basert på den faktiske metanolforbrukshastighet. 20 ml's porsjoner av spormengdesalter ble tilsatt ved tilnærmet to dagers mellomrom for å opprettholde metanolforbrukshastigheten. Nivået av HBsAg øket i ca. tre dager på metanolmatningsmaterialet.

Tabell IV viser "AUSRIA"-resultatene som beskrevet i eksempel VIII på ekstrakter fremstilt fra stammer dyrket i gjæringsapparatet .

Eksempel VII

Påvisning oa bekreftelse av nærværetav preSo

. Western blott ble utført (Maniatis et al.) på proteiner utvunnet fra lyserte Pichia-celler som angitt i eksempel V. Det antistoff som ble anvendt, var spesifikt for HBsAg, oppnådd fra Cal Biochem, vareparti nr. 702106, ved en fortynning på 1:1000.

Dessuten antydet SDS/PAGE-analyse og sølvmerking (silver staining) av et delvis renset proteinpreparat nærværet av<p>reS2~polypeptid, p31.

Eksempel VIII

" AUSRIA" RIA- Protokoll

Abbott "AUSRIA" analysepakke ble brukt til å måle mengden av HBsAg syntetisert ved Pichia-produksjonssystemet. Antistoffet

i pakken binder til HBsAg-partikler, ikke HBsAg-monomerer.

Alle fortynninger ble utført i 1% BSA, 0,02% Na-azid i fosfat-buffret saline, pH 7,4. Fremgangsmåten som ble fulgt var stort sett som angitt i instruksjonene i pakken. Standardkurven ble fremstilt som følger:

Brønnene av mikrotiter-skåler ble merket som følger:

Perlene ble først satt til hver brønn, fulgt av bufferen, og til slutt standarden (positiv sammenligning) eller den for-tynnede prøve. Ukjente ble fortynnet for oppnåelse av signaler innenfor området av standardkurven. Overslag av prøvekonsentra-sjoner i mg/ml ble typisk dividert med 0,0 2 for oppnåelse av den fortynning som skulle anvendes. Vanligvis ble 100 ul av prøven satt til brønnen inneholdende 100 ul buffer. Brønnene ble dekket, og brettet ble forsiktig banket mot toppen av benken. Prøvene ble deretter inkubert over natten ved værelsetemperatur for oppnåelse av maksimal bindingsvirkning. Neste morgen ble hver brønn vasket fire ganger med avionisert vann ved anvendelse av Pentawash-systemet skaffet av Abbott Labs. 200 ul av det<125>i anti-HBs ble satt til hver brønn med forsiktig banking på brettet og deretter inkubert i et 45°C vannbad i 1 h. Perlene ble vasket som før og tellet. Konsen-trasjonene av ukjente ble bestemt fra standardkurven.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av antigene HBV-partikler, . karakterisert ved at den omfatter a) å transformere en metylotrof gjær med minst én vektor som har minst én ekspresjonskassett inneholdende et strukturelt gen for preS2- operabelt forbundet med et regulatorisk område og en 3'-endesekvens, og deretter b) å dyrke den resulterende transformerte gjærstamme under egnede betingelser for produksjon av det nevnte HBsAg preS2 -protein.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at der anvendes en vektor valgt fra gruppen bestående av plasmider eller lineære, integrative setespesifikke vektorer, særlig en lineær integrativ setespesifikk vektor som inneholder det følgende arrangement i serie: a) et første innsettbart DNA-fragment, b) et markørgen og minst én ekspresjonskassett inneholdende et strukturelt gen for preS2- operabelt forbundet med et regulatorisk område og en 3'-endesekvens, og c) et annet innsettbart DNA-fragment, idet rekkefølgen av markørgenet og kassetten i komponent (b) kan byttes om.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at der anvendes en lineær integrativ setespesifikk vektor hvor det første innsettbare DNA-fragment og det annet innsettbare DNA-fragment fås fra DNA-sekvensen av et gen isolert fra Pichia pastoris og valgt fra gruppen bestående av A0X1, p40, DHAS og HIS4, særlig hvor den nevnte ekspre sjonskassett omfatter a) et regulatorisk område valgt fra gruppen bestående av A0X1, p40, DHAS isolert fra Pichia pastoris, sur fosfatase, galaktosidase, alkoholdehydrogenase, cytokrom c, alfaparingsfaktor og glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase isolert fra Saccharomyces cerevisiae operabelt forbundet med b) et strukturelt gen for preS2 , operabelt forbundet med c) en 3'-endesekvens fra Pichia pastoris valgt fra gruppen bestående av 3'-endesekvensene isolert fra AOXl-genet, p40-genet, DHAS-genet og HIS4-genet, og særlig hvor det nevnte markørgen velges fra gruppen bestående av HIS4 og ARG4, isolert fra Pichia pastoris, SUC2 isolert fra Saccharomyces cerevisiae og G418 <R-> genet av Tn903 og Tn601.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at vektoren omfatter a) et første innsettbart DNA-fragment som er tilnærmet én kilobase av det 5'A0X1 regulatoriske område isolert fra Pichia pastoris operabelt forbundet med b) et strukturelt gen for preS2/ operabelt forbundet med c) 3'-endesekvensen av A0X1 isolert fra Pichia pastoris ligatisert til d) et markørgen som er HIS4 isolert fra Pichia pastoris ligatisert til e) et annet innsettbart DNA-fragment som er tilnærmet 0,65 kilobaser av 3'AOXl-endesekvensen,

5. Lineær, integrativ setespesifikk vektor for anvendelse i fremgangsmåten som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at den omfatter det følgende arrangement i serie: a) et første innsettbart DNA-fragment, b) et markørgen og minst én ekspresjonskassett inneholdende et strukturelt gen for preS2 , operabelt forbundet med et regulatorisk område og en 3'-endesekvens, og c) et annet innsettbart DNA-fragment, idet rekkefølgen av markørgenet og kassetten i komponent (b) kan byttes om, særlig hvor det første innsettbare DNA-fragment og det annet innsettbare DNA-fragment fås fra DNA-sekvenser av et gen isolert fra Pichia pastoris og valgt fra gruppen bestående av A0X1, p40, DHAS og HIS4, den nevnte ekspresjonskassett omfatter a) et regulatorisk område valgt fra gruppen bestående av A0X1, p40, DHAS og HIS4 isolert fra Pichia pastoris, sur fosfatase, galaktosidase, alkoholdehydrogenase, cytokrom c, alfaparingsfaktor og glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase isolert fra Saccharomyces cerevisiae operabelt forbundet med b) et strukturelt gen for preS2' operabelt forbundet med c) en 3'-endesekvens valgt fra gruppen bestående av 3'-endesekvensene isolert fra AOXl-genet, p40-genet, DHAS-genet og HIS4-genet isolert fra Pichia pastoris, og det nevnte markørgen velges fra gruppen bestående av HIS4 og ARG4, isolert fra Pichia pastoris, SUC2 isolert fra Saccharomyces cerevisiae og G418 <R-> genet av Tn903 og Tn601.

6. Vektor som angitt i krav 5, karakterisert ved at den omfatter a) et første, innsettbart DNA-fragment som er et operabelt regulatorisk område av 5'-AOXl-genet tilnærmet én kilobase langt, isolert fra Pichia pastoris operabelt forbundet med b) et strukturelt gen for preS2 , operabelt forbundet med c) 3'-endesekvensen av A0X1 isolert fra Pichia pastoris ligatisert til d) et markørgen som er HIS4 isolert fra Pichia pastoris ligatisert til e) et annet innsettbart DNA-fragment som er tilnærmet 0,65 kilobaser av 3'-AOXl-endesekvensen.

7. Metylotrof gjær transformert med en vektor som angitt i et av kravene 5-6.

8. Metylotrof gjær som angitt i krav 7, karakterisert ved at gjæren er Pichia pastoris, særlig hvor gjæren er Pichia pastoris stamme GS115, spesielt hvor . den nevnte GS115 er transformert med minst én lineær integrativ setespesifikk vektor som er et seriearrangement av a) et første innsettbart DNA-fragment b) et markørgen og minst én Pichia-forenlig ekspresjonskassett inneholdende et strukturelt gen for preS2> operabelt forbundet med c) en 3'-endesekvens valgt fra gruppen bestående av 3'-endesekvens isolert fra AOXl-gen, p40-gen, DHAS-gen og HIS4-gen isolert fra Pichia pastoris, d) et annet innsettbart DNA-fragment, idet rekkefølgen av markørgenet og kassetten i komponent (b) kan byttes om, og fortrinnsvis hvor gjæren er Pichia pastoris GS115/pTB05A.

9. Pichia pastoris GS115 transformert som angitt i krav 8, karakterisert ved at GS115 er transformert med mer enn én kopi av den nevnte lineære integrative setespesifikke vektor.

10. Pichia pastoris GS115/pTB05A (S10).