JP2511394B2 - 酵母菌中でのｂ型肝炎表面抗原の製造 - Google Patents

酵母菌中でのｂ型肝炎表面抗原の製造

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JP2511394B2 JP57150186A JP15018682A JP2511394B2 JP 2511394 B2 JP2511394 B2 JP 2511394B2 JP 57150186 A JP57150186 A JP 57150186A JP 15018682 A JP15018682 A JP 15018682A JP 2511394 B2 JP2511394 B2 JP 2511394B2
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    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）用ワクチンの製
造で使用するための酵母菌生物中でのＢ型肝炎表面抗原
（HBsAg）の製造のために組換えDNA技術を使用すること
に関する。本発明は、その一局面において、発現を行な
わせるプロモーター系と操作可能に連結されているＢ型
肝炎表面蛋白質抗原を暗号化しているDNA配列を含有す
る微生物発現ビークル（vehicles）の構成及びそのよう
に構成された発現ビークルに関する。本発明は、別の局
面においては、そのような発現ビークルで形質転換さ
れ、かくして上記DNA配列の発現を目的とする酵母菌に
関する。本発明は、さらに別の局面において、そのよう
な酵母菌発現の最終生成物を、Ｂ型肝炎ウイルスに対し
て有用なワクチンの如きものに転換する手段及び方法に
関する。好ましい実施態様では、本発明は、約22nmの粒
子の形で生産され、Ｂ型肝炎ウイルスの抗原決定基を含
有する所望の蛋白質を結合した形で高収率で与えるＢ型
肝炎表面抗原蛋白質を暗号化しているDNA配列の末端に
ある強力な酵母菌プロモーター及びDNA配列を利用する
特定の発現ベクトルを提供する。
本発明の背景を説明するために、そして特定の場合は
本発明の実施に関する詳細を付加的に示すために使用さ
れる刊行物及びその他の資料は、本明細書中に参照文献
として引用されており、便宜のため本明細書中では番号
を付して参照され、本明細書の終りに一括して参照文献
として掲載されている。
A.B型肝炎ウイルス Ｂ型肝炎（血清肝炎）ウイルスはヒトの間で感染し、
重症肝障害、原発癌及び死亡へと進行する結果となる可
能性のある慢性衰弱性病原菌である。多くの場合、Ｂ型
肝炎感染からの完全な回復を期待することができる。し
かしながら、かなり多数の人々は、とくに多数のアフリ
カ及びアジアの国々において、慢性保菌者であつて、こ
の病気を感染流行させる危険な可能性をもつている。
肝炎はウイルスベクター（Ｂ型肝炎ウイルス、略して
HBV）が原因となつておこる。このウイルスベクターは
全体としては−いわゆるデーン粒子−ヴイリオンを表わ
し、DNA分子を包み込む27nmのヌクレオカプシド及びこ
のヌクレオカプシドを取り囲むエンベロープからなる。
このヴイリオンと会合している蛋白質はコア抗原（HBcA
g）、DNAポリメラーゼ及び表面抗原（HBsAG）を含有
し、この表面抗原は感染した保菌者の血清中で発見され
ている。HBsAGに対する抗体もまたHBVに感染したヒトの
血清中で発見されている。HBsAGは、抗体（抗HBs）の免
疫生成を誘導することができるHBV抗原であり、従つてH
BsAGはHBVワクチンにおける主成分であると信じられて
いる。参照、Dane et al.,Lancet 1970(I),695（197
0）;Hollinger et al.,Ｊ．Immunology 107,1099（19
71）:Ling et al.,Ｊ．Immunology 109,834（1972）;
Blumberg,Science 197,17（1977）;Peterson et al.,
Proc.Nat.Acad.Sci (USA) 74,1530（1977）及びViral
Hepatitis, A Contemporary Assessment of Etiology,
Epidemiology,Pathogenesis and Prevention.（Vyas et
al.,eds.） Franklin Institute Press,Philadelphi
a,1978。これらの文献は、本発明の背景をさらに示すた
めに参照として本明細書に記載されている。
HBsAgは、感染したヒトの血漿中に、約16〜25nmの範
囲の直径を有する球形粒子、いわゆる「25nm粒子」の形
で主として存在している。これらは非感染性のウイルス
性エンベロープを表わすと考えられる。HBsAgに対する
抗体はHBV感染に対して保護するから、これらの非感染
性粒子はワクチンとして有効に使用することができる。
Ｂ型肝炎ウイルスが細胞培養物中で感染性ではなく感
染したヒト又は高等霊長類から得られるのみである限
り、HBVに対する免疫法のための抗原を生成させるのに
使用するHBVの十分な供給を入手しかつ維持するために
利用できる手段は従来なかつた。
本発明は、HBVに対して有効なワクチンを製造するた
めの手段及び方法を提供する。組換えDNA技術により、H
BsAgを暗号化している遺伝子を適当な翻訳開始信号及び
停止信号といつしよに適当な発現プロモーターの制御下
に複製可能な発現ベクトルに挿入し、後者を使用して酵
母菌細胞を形質転換した。このように遺伝学的に方向付
けられた細胞は、直接的にかつ粒子の形でHBsAgを生産
した。このHBsAeは、精製すると、HBVに対して免疫を与
えるのに適したものとなる。
B.組換えDNA技術 組換えDNA技術の出現とともに、莫大な種類の有用な
ポリヘプチドの制御された微生物的生産が可能となつ
た。ヒト成長ホルモン、白血球インターフエロン等の多
くの哺乳動物のポリヘプチドが種々の微生物によつてす
でに生産されている。この技術のお陰で莫大な種類の有
用なポリヘプチドの微生物による生産が可能となり、多
種の医薬を目的とする応用に対して使用されるホルモ
ン、酵素、抗生物質及びワクチンの微生物的に方向付け
られた生産が手のどとどく範囲に置かれている。
組換えDNA技術に基本的要素はプラスミドである。プ
ラスミドは細菌中でしばしば細胞１個当り複数のコピー
として発現される染色体外に存在する二重鎖DNAの輪で
ある。プラスミドDNA中に暗号化された情報の中には、
娘細胞中にプラスミド（すなわち、レプリコン又は複製
のオリジン）及び通常抗生物質耐性等の１つ又は複数の
表現型選択特性を再生するのに必要とされる情報が含ま
れている。これらの特性は、注目しているプラスミドを
含有する宿主細胞のクローンを認識し選択培地の中で優
先的に生育させることを可能とする。細菌性プラスミド
の有用性は、プラスミドDNA上の異なる部位を認識する
各々の制限エンドヌクレアーゼ又は「制限酵素」によつ
て細菌性プラスミドを特異的に切断することができると
いう事実にある。切断後切断部位で又は切断部位に隣接
する再構生末端で末端を結合することにより異種遺伝子
又は遺伝子切片をプラスミドの中へ挿入することができ
る。いわゆる複製可能な発現ビークルはこのように形成
されるのである。
DNAの組換えは微生物の外部で行なわれ、生成する
「組換えた」複製可能な発現ビークル又はプラスミド
は、形質転換として知られている方法により微生物の中
へ導入することができ、この形質転換体を生育すること
により大量の組換えビークルが得られる。さらに、暗号
化されたDNAメツセージの転写及び翻訳を支配するプラ
スミドの部分に関して遺伝子が適切に挿入される場合
は、挿入された遺伝子が暗号化しているポリペプチド配
列の生産、すなわち発現といわれるプロセスを行なわせ
るためにこの生成した発現ビークルを使用することがで
きる。
発現はプロモーターとして知られているDNAの領域で
開始される。発現の転写相において、DNAがほどけて、D
NA配列からメツセンジヤーRNAの合成を開始するための
鋳型としてDNAが露出する。次いでメツセンジヤーRNAは
リボソームと結合し、そこでメツセンジヤーRNAは翻訳
されて、mRNAにより暗号化されているアミノ酸配列を有
するポリヘプチド鎖となる。各々のアミノ酸はヌクレオ
チド三連符又は「コドン」により暗号化されている。コ
ドンは集まつて、「構造遺伝子」、すなわち発現される
ポリペプチド生成物のアミノ酸配列を暗号化しているDN
A配列の部分を作り上げる。翻訳は「開始」信号（通常
はATG、これは生成するメツセンジヤーRNA中ではAUGに
なる）で開始される。いわゆる信止コドンは翻訳の終
了、従つてアミノ酸単位のそれ以上の生産の終了を規定
する。この生成物は宿主細胞を溶解させ、その他の細菌
性蛋白質から分離し適当に精製してこの生成物を回収す
ることにより得ることができる。
実際、組換えDNA技術を使用することにより、全く異
種の（通常は与えられた微生物中に発見されない、又は
与えられた微生物によつて生産されない）ポリペプチド
を発現させることができ−−−−−−いわゆる直接発現
−−−−−あるいはまた別に同種の（対応する野生型微
生物中に発見されるか又は対応する野生型微生物によつ
て生産される（ポリペプチドのアミノ酸配列の部分と融
合した異種ポリペプチドを発現することができる。後者
の場合、目的とする生活性な生産物は、細胞外の環境に
おいて融合した同種／異種ポリペプチドが切断されるま
では、融合した同種／異種ポリペプチド内で時によると
不活性化されている。参照、例えば、イギリス特許公告
第2007676A号及びWetzel,American Scientist 68,664,
（1980）。
もし組換えDNA技術がその将来の見込みを十分に達成
すべきであるとするなら、目的とするポリペプチド生産
物を制御した環境において高収率で入手することができ
るようにするために、遺伝子の挿入部の発現を最適にす
る方法を案出しなければならない。
C.当該技術の状態 1980年６月４日発行のイギリス特許出願第2034323A号
は、EcoRI消化及びそれに続く連結を利用する、約3200
のヌクレオチドを含有するHBVゲノムの単離及びこのDNA
のベクター中への導入を記載している。生成するクロー
ン化されたHBV-DNAは標識を付して血清中のデーン粒子
を検出するためのプローブとして使用することができる
こと及びこのベクターはＢ型肝炎蛋白質切片を含有する
ポリペプチドを発現させるために使用することができる
であろうことが記述されている。
同じ研究所からの関連する論文（Proc.Natl.Acad.Sci
(USA)，77,4545（1980））において、直列のクローン化
したＢ型肝炎ゲノムをマウス細胞中に導入し、マウスの
染色体中に組込んだことが報告されている。肝炎表面抗
原として同定されるポリペプチドは、感染したヒトの血
清中で発見された粒子と同様の粒子としてその細胞から
排出された。
ヨーロツパ特許出願公告第13828号は、ゲノムDNAから
のmRNA転写の読み取り翻訳によるHBVコア抗原の生産を
記載している。表面抗原は検出されなかつた。
ヨーロツパ特許出願公告第20251号においては、その
称するところによればHBVの表面抗原蛋白質の部分を含
有している融合蛋白質の大腸菌内での生産が記載されて
いる。表面抗原決定基は融合蛋白質として存在していた
のであるから、その構造は固有のものではありえなかつ
た。従つて、報告された免疫活性は小さかつた。
本発明は、組換えDNA技術を使用してＢ型肝炎表面抗
原を直接的にかつ分離した粒子の形で成功裡にかつ効率
よく生産することができるという発見に基づいている。
この生産物は、感染しやすいヒトにＢ型肝炎ウイルスに
対する免疫原性を授与するにあたつて使用するために、
あるいはそのように使用に供するワクチンを製造する目
的に適している。この生産物は、真核生物宿主−酵母菌
−中で生産され、従つてそのような系はヒトがつくる蛋
白質とより密に関連してる対応する蛋白質生産物、すな
わち、グリコシル化物並びに糖及び脂質会合物を与える
という利点がある。これに対して細菌が生産する蛋白質
の宿主はそのような精巧な過程を行なうことができな
い。それに加えて、真核生物である酵母菌の細胞は原核
生物の組織よりもよりよく蛋白質生産物に耐え、肝炎蛋
白質自体が致死的である細菌組織よりも発現レベル及び
収率を著しく増加させることは疑いがない。
本発明は生産されたＢ型肝炎表面抗原（HBsAG）及び
その製造方法及び手段を含む。とくに、本発明は、酵母
菌中で生産されたＢ型肝炎ウイルスの免疫決定基を含む
粒子の形のHBsAgに関する。このHBsAgは、HBVゲノムの
別の部分によつて暗号化されるにせよ、使用した酵母菌
菌株と同種のDNAによつて暗号化されるにせよ、分離し
た粒子の形で、別の人工的な融合ポリペプチドがない状
態で、生産される。本発明はさらに直接発現しうる形で
HBsAgを暗号化している遺伝子配列を収容する複製可能
なDNA発現ビークルに関する。さらに、本発明は、HBsAg
を生産することができる、上記発現ビークルで形質転換
された酵母菌菌株及びそのような形質転換された酵母菌
菌株の微生物的培養に関する。さらに別の局面におい
て、本発明は、上記HBsAg遺伝子配列、DNA発現ビーク
ル、酵母菌菌株及び培養物を生産するに際して有用な種
々の方法並びにそれらの特定の実施態様に関する。さら
になお、本発明は、感染しやすいヒトにHBVに対する免
疫原性を与えるのに有用なワクチンの製造のためのこの
ように生産されたHBsAgの使用、そのようなワクチン並
びに感染しやすいヒトに接種しHBVに対する免疫原性を
与えるためにそれらを使用する方法に関する。
本発明において好ましいプロモーターは、後に記載す
る酵母菌３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロ
モーター領域から作られたプロモーターである。このPG
K遺伝子は、配列するのに役に立つと思われる制限部位
が解析された。これらの制限部位の１つについてのDNA
配列解析により、特定のATGで開始する翻訳はヒト及び
ウマのPGKの同じＮ−末端アミノ酸に対応するＮ−末端
アミノ酸をもつ蛋白質を与えることが示され、この側面
に位置するDNAは酵母菌PGKプロモーター領域であると考
えられた。このPGKプロモーター領域は、独自の制限部
位を論理的に支持する領域について解析された。プライ
マー修復反応を行なつたところ、この独自の部位はPGK
プロモーター領域の３′末端の位置にあつた。この独自
の部位は、PGKプロモーター領域が酵母菌中でこのよう
に融合された遺伝子の直接的発現を行なわせることを可
能とした。
後に記載する酵母菌／細菌にシヤトルプラスミド、pC
V13（又はYEp13）は、いくつかの制限切片を取除いたも
のであつた。表面抗原に融合したPGKプロモーター領域
によりこれらの切片を置きかえてベクターを再閉鎖し
た。このベクターを使用して通常の発酵条件下で生育す
る酵母菌を形質転換し、所望のHBsAg生産物を生産する
ことができた。形質転換された酵母菌を破壊して開き、
ついで生産物を回収した。遠心分離された溶液の表面浮
遊物質をＢ型肝炎表面抗原放射線免疫検定法において基
質として使用した。
転写ターミネーター（terminator）として適している
ことが発見された特定のDNA配列を、mRNA合成を停止さ
せ適当なmRNAプロセシング及び翻訳のためのポリＡ付加
部位を提供するために、HBsAgを暗号化している遺伝子
配列の後に置いた。このターミネーターはpFRL4中に含
有されているTrp１遺伝子からの232bpのHindIII〜Bg1II
制限切片に基づいている。この切片は、酵母菌TRP１遺
伝子からのある暗号配列及び適当な転写停止及びポリア
デニル化のために必要な３′−側面を有する配列を含有
するものが単離された。このターミネーター切片はその
HindIII部位をへてHBsAg遺伝子のHindIII部位に融合さ
れた。酵母菌中での融合酵母菌プロモーターによるHBsA
g遺伝子の転写は融合したTRP１ターミネーター切片にお
いて停止するように設計されている。
pCV13（１）は、大腸菌中でのプラスミド選択を可能
とするアンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子、
DNA複製の大腸菌オリジン、酵母菌中でのプラスミドの
選択を可能とするLEU２遺伝子及び酵母菌中でのプラス
ミドのDNA複製を可能とする２（ミクロン）オリジンを
含有する。このプラスミドは、形質転換された酵母菌の
核質中で発見される。テトラサイクリン耐性遺伝子の小
さなHindIII〜BamHI切片をベクターから取り除いた。次
いで生成した大きなベクター切片を、1.6kbpのHindIII
〜EcoRIの組立てPGKプロモーター切片及び1.1kbpのEcoR
I〜Bg1IIのHBsAg/TRP１ターミネーター切片に連結し
て、第６図に示すpYcHBsベクターをつくつた。このHBsA
g発現ベクターは、PGKプロモーター切片がHBsAg構造遺
伝子の転写を開始し、次いであらかじめHBsAg遺伝子に
融合したTRP1ターミネーター中でこの転写が停止するよ
うに構成された。
第Ａ図は、SV40DNAを含有し、VP−１蛋白質のための
暗号領域を欠くプラスミドpSVRの構成を示す。
第１図は、ベクターpB1の3.1kbpのHindIII挿入の制限
地図を図式的に示す。PGKプロモーターはそれから単離
された。PGK遺伝子の５′−側面を有するDNAへのEcoRI
部位及びXbaＩ部位の挿入を示す。
第２図は、XbaＩ及びEcoRI部位の挿入前のPGK遺伝子
についての５′−側面を有する配列プラス最初の暗号配
列を示す。
第３図は、PGKプロモーターに位置−８でXbaＩ部位を
挿入し、このXbaＩ末端及びSau3A末端を含有するPGKの
５′−側面を有する配列の39bpの切片を単離するのに使
用する技術を図式的に示す。
第４図は、上記39bpの切片、PvuＩ〜Sau3Aからの付加
的なPGKの５′−側面を有する配列（265bp）（第１図参
照）及びXbaＩに隣接するEcoRI部位を含有する300bp切
片の構成を図式的に示す。
第５図は、第４図において構成された切片に加えて、
PGKの５′−側面を有する配列からの1300bpのHindIII〜
PvuＩ切片（第１図参照）を含有する1500bpのPGKプロモ
ーター切片（HindIII/EcoRI）の構成を図式的に示す。
第６図は、修正されたPGKプロモーター、HBsAg遺伝子
及び酵母菌TRP１遺伝子のターミネーター領域を含有す
る、酵母菌中での肝炎表面抗原のための発現ベクターの
構成を図式的に示す。これは本明細書中により詳細に記
載されている。
第７図Ａは酵母菌が生産したHBsAgと22nm粒子のスク
ロース密度勾配沈降の比較を示し、第７図Ｂは両者の対
応するCsCl密度勾配遠心分離を示す。
酵母菌宿主生物 好ましい実施態様において、発現系を、大腸菌及び酵
母菌、サツカロミケスセレビシエの両方において選択及
び複製が可能であるプラスミドpCV13（１）の中におい
た。酵母菌中での選択のためにプラスミドはLEU2遺伝子
（２）を含有する。この遺伝子は、酵母菌の染色体III
上に発見されたこの遺伝子における突然変異を含む酵母
菌を補足する（ロイシンの不存在下での生育を可能とす
る）（３）。ここで使用された菌株は、遺伝子型leu2 t
rp1 ade6 ade2 lys1 can１を有する菌株XV610-8Cであつ
た。この株菌は、アメリカ特許出願の出願と同時に制限
を付することなくAmerican Type Culture Collectionに
寄託されている（ATCC No.20622）。しかし、細胞をLeu
２とする突然変異を含有するいかなるサツカロミケスセ
レビシエ菌株もこの発現システムを含有するプラスミド
の発現のための効果的な環境であることは理解されよ
う。使用することができる別の菌株の例は、遺伝子型le
u２−3 leu２−112 his４−519 can１を有するATCC No.
38626のものである（４）。この菌株はleu2において２
点の突然変異を有し、それがLeu-のLeu+への復帰を制限
しより厳格な形質転換を可能とする。
酵母菌プロモーター （アルコールデヒドロゲナーゼ１のための）酵母菌遺
伝子からの５′−側面を有するDNA配列は、酵母菌を形
質転換するために使用するプラスミドの中においた場合
外来の遺伝子（例えば、白血球インターフエロンＤ）の
発現をプロモートすることができる。酵母菌中での適当
な転写停止及びポリアデニル化を可能とするために別の
酵母菌遺伝子をこの構成の３′−末端においた。実際、
我々は、mRNA転写は酵母菌TRP１遺伝子の停止／アデニ
ル化領域において予想どおり終了することを示した
（３′−末端）（Hitzeman et al.,Hature，印刷中）。
このプロモーターは他の場合と同じように本発明の場合
も好適に使用することができる。後述参照。好ましい実
施態様において、酵母菌３−ホスホグリセリン酸キナー
ゼ遺伝子の５′−側面を有する配列（５）を肝炎表面抗
原のための構造配列から上流におき、再びTRP１遺伝子
停止−ポリアデニル化信号を含有するDNAを設けた。
酵母菌アルコールデヒドロゲナーゼI5′−側面配列及
び３−ホスホグリセリン酸キナーゼ５′−側面配列（後
述）はともに酵母菌中で外来の遺伝子の発現をプロモー
トする働きをすることができるから、重要な遺伝子生産
物の発現のためにいかなる高度に発現された酵母菌遺伝
子の５′−側面を有する配列も使用することができるよ
うに思われる。ある種の環境の下において酵母菌はその
可溶性蛋白質の65パーセントまでをグルコース分解酵素
（６）として発現したので、そしてこの高水準は個々の
mRNAの高水準の生産の結果である（７）と思われるの
で、そのような発現を目的としていかなる他のグルコー
ル分解遺伝子、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒ
ド−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナー
ゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナ
ーゼ、グルコース−６−ホスフエート、イソメラーゼ、
３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナー
ゼ、トリオースホスフエートイソメラーゼ、ホスホグル
コースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ等の５′−側面
を有する配列を使用することが可能であるべきである。
これらの遺伝子の３′−側面を有する配列のいずれのも
のもまた、そのような発現系における適当な停止及びmR
NAポリアデニル化のために使用することができるであろ
う。上記参照。いくつかの他の高度に発現された遺伝子
は、酸性ホスフアターゼのための遺伝子（８）及び通常
Ty1トランスポゾン要素の存在により、５′−側面領域
における突然変異による高水準の生産を発現する遺伝子
（発現を増加させる突然変異体）（９）である。
上に記述したすべての遺伝子は、酵母菌RNAポリメラ
ーゼIIにより転写されると考えられる（９）。リボソー
ムDNA,5S DNA及びtRNA DNAを転写するRNAポリメラーゼ
Ｉ及びIIIのためのプロモーター（9,10）もまたそのよ
うな発現構成において使用することが可能である。
最後に、多くの酵母菌プロモータは、生育条件におけ
る変化により該プロモーターを終止させあるいは開始さ
せることができる転写制御を同時に含有している。その
ような酵母菌プロモーターのいくつかの例は下記の蛋白
質を生産する遺伝子である：アルコールデヒドロゲナー
ゼII、イソチトクローム、酸性ホスフアターゼ、窒素代
謝と関連する分解酵素、グリセルアルデヒド−３−ホス
フエートデヒドロゲナーゼ及びマルトースとガラクトー
ス利用を行なわせる酵素（９）。そのような制御領域
は、とくに蛋白質生産が酵母菌にとつて有毒であるとき
に、蛋白質生産の発現を制御するのに極めて有用であろ
う。１個の５′−側面を有する配列の制御領域を高度に
発現された遺伝子からのプロモーターを含有する５′−
側面を有する配列とともに配置することもまた可能であ
るべきである。これは結果として雑種プロモーターを生
じさせるであろうし、制御領域とプロモーターが物理的
に異なるDNA配列であるように思われるから、可能であ
るべきである。
PGKプロモーターDNAの同定 ヒトの３−ホスホグリセリン酸酵素から精製したこの
酵素の６個のＮ−末端アミノ酸は次の通りである： １−２−３−４−５−６ SER−LEU−SER−HSM−LYS−LEU− 141bpのSau3A〜Sau3A制御切片のDNA配列から生成した
翻訳読み取りフレームの一つ（最初のHincII部位を含有
する：第１図のPGK制限地図参照）は、下記のアミノ酸
配列を生産する： １−２−３−４−５−６ MET−SER−LEU−SER−SER−LYS−LEU− イニシエーターであるメチオニンの除去後、PGK N−
末端アミノ酸配列は、ヒトのPGKのＮ−末端アミノ酸配
列と同種の６個のアミノ酸のうちの５個のアミノ酸を有
することが示される。
この配列の結果は、酵母菌PGK構造遺伝子の開始はpB1
の141bpのSau3A制限切片中のDNAにより暗号化されてい
ることを示唆した。以前の研究（５）は、PGK mRNAを特
定化するDNA配列はHind III切片のこの区域に存在する
ことを示唆している。141bpのSau3A切片をさらに配列さ
せると、PGKプロモーターのDNA配列がより多く生成する
（第２図に図示）。
プロトコール： PGK遺伝子の５′−側面を有する配列中へのXbaI/EcoR
Iの挿入及びプロモーター切片の構成（第１図参照） 段階１） 39bpのXbaＩ〜Sau3A切片のプライマー修復反
応及びクローニング（第３図に図示） 段階２） クローンPvuＩ〜XbaＩ部分プロモーター切片
（第４図に図示） 段階３） クローンEcoRI〜EcoRIプロモーター切片（第
５図に図示） 発現プラスミドの構成のため第６図で使
用されるHindIII〜EcoRIプロモーター切片を含有する。
PGKプロモーター中へのEcoRI制限部位の挿入及びプロモ
ーター組立て体 酵母菌中での異種遺伝子の直接的発現のためのPGKプ
ロモーターの使用は、PGKイニシエーターATGを含有しな
いPGKプロモーター切片の３′末端上に制限部位がある
ことを要求する。第１図、第３図、第４図及び第５図
は、我々がPGKプロモーター中へEcoRI部位をどのように
挿入したかを示す。我々は、最初にXbaＩ部位をプロモ
ーター配列の３′末端中へ挿入するためにプライマー修
復反応（11）を使用した。このXbaＩ粘着末端を、Xba１
部位に隣接するEcoRI部位を含有するLEIFA（12）遺伝子
のXbaＩ部位へ連結した。LEIFA遺伝子の５′末端におけ
るこの結合配列は次のとおりである： ５′−TCTAGAATTCATG−３′ ３′−AGATCTTAAGTAC−５′ LEIFA遺伝子上でこの結合は、EcoRI部位がPGKプロモ
ーター上のXbaＩ部位の次にどのように挿入されたかを
示している。このXbaＩ〜EcoRI結合の使用は、発現を目
的としてPGKプロモーターの３′末端にこれらの制限末
端のいずれかを含有する構造遺伝子をおくことを可能と
する。
発現ベクターの構成 HBsAg構造遺伝子の単離 HBsAgを暗号化している構造遺伝子を、pBR322のEcoRI
部位へクローン化したHBVの全ゲノムを含有するプラス
ミド（pHBV−７−1A）から回収した。このクローンはVa
lenzuelaらによつて最近発表された方法（14）及び（1
5）と同様の方法で得た。
この構造遺伝子は二つの点で修正した。
（１） その一つは、最初のATGメチオニンコドンの前
に直接独自の制限部位を導入した点であり、 （２） 他の一つは、HBsAg遺伝子の末端に位置したHBV
Hpa I部位をpBR322のEco RI部位中のふさがれた末端へ
平担末端結合した点である。HBsAg構造遺伝子を含有す
るDNA切片に対するこれら二つの修正は下記のように行
なわれた。
１） pHBV−Ｔ−IA DNA50μｇをまず最初に酵素供給業
者（BRL）の反応条件に従い200μｌの反応混合物中のHp
aII（80単位）を用いて消化し、1.7kbのDNA切片を得
た。このDNA切片中ではHBsAgの暗号化配列のための開始
コドンは有意なDNA−本鎖（約400bp）の５′末端に接近
した位置にあつた。このDNAはポリアクリルアミドゲル
（PAGE）上の電気泳動により精製した。精製したHpaII
切片は次に100μｌの反応混合物（New England BioLa
b）中でλエキソヌクレアーゼ（２単位）を用いて30分
間37℃で処理した。λエキソニクレアーゼは二重鎖DNA
を消化する５′エキソヌクレアーゼである。この反応は
HBsAgを暗号化している配列からの「有意な一本鎖」DNA
の５′半分を分解し、加えたプライマーと対をなすため
アンチセンスストランドを露出した。λエキソヌクレア
ーゼで処理したDNAは、蛋白質を除き、リン酸カリウム
緩衝液（pH7.4）40mM、DTT 1mM,BSA 50μg/ml,MgCl2 6m
M,dNTP各0.5mM及びdATGGAGAACATC0.2n mole（ポリヌク
レオチドキナーゼにより５′末端で32Ｐによりラベルし
たもの）を含有する反応混合物50μｌ中に再懸濁させ
た。この混合物は最初90℃で１分間加熱し、０℃で30分
間冷やし、次いで大腸菌DNAポリメラーゼI Klenow切片
２単位の存在下において37℃で３時間培養した（16）。
このDNAポリメラーゼは、加えたプライマーにより始動
されたDNAを合成し、３′−OH末端を有する一本鎖DNAを
分解し、従つて平担末端のDNA分子をつくつた。次いで
生成したDNAは蛋白質を除き、反応混合物100μｌ中でHB
sAg遺伝子内に位置する部位でXbaI（45単位）を用いて
消化し、PAGEにより分画した。HBsAg遺伝子の最初の30
コドンを含有する91塩基対のDNA切片をオートラジオグ
ラフイーで検出した後単離した（分画Ａ）。
HBsAg遺伝子に対し直接５′の位置にある独自の制限
部位をつくるために、我々は、EcoRI部位に位置する配
列： AATTCTGCAG GACGTCKTTAA をもつ合成DNA切片を含有するプラスミドpBR322（pNCV
と呼ぶ）の誘導体を利用した。この合成DNA配列の中へP
stI部位を導入する。最初にpNCV DNA 10μｇを混合物10
0μｌ中のPstI酵素24単位で切断し、次いで上記のよう
な反応混合物50μｌ中の大腸菌DNAポリメラーゼKlenow
切片２単位で８℃において１時間処理した。このDNAポ
リメラーゼ処理によつて、PstI消化によりつくられて
３′でぶらさがつている４つの塩基対を除去し、完全な
EcoRI制限部位を有する平担末端のDNAを残した。このDN
AはpBR322の複製のオリジンを含有する切片Bを与えた。
上記のように調製した平担末端のHBsAg遺伝子切片Aを切
片BのEcoRI部位に連結した。これを３つの切片連結にお
いて行ない、プラスミドpAS94をつくつた。第三の切片
（切片C）は次のようにして調製した。
２） プラスミドpHBV−Ｔ−1AからのHBsAg遺伝子をHBs
Ag遺伝子の末端にある部位でHpaIを用いて切断した。こ
のHpaI部位は、あらかじめDNAポリメラーゼI Klenow切
片で満たしたpBR322のEcoRI部位に連結した（16）。こ
れは、pBR322の誘導体をサブクローニングしpAS42を生
成することによつて完成した。このプラスミドはXbaI
（コドン31で切断する）及びBamHI（pBR322のEcoRI部位
から375塩基対を切断する）で切断し、HBsAg遺伝子の大
部分、HBsAg遺伝子の末端に約150の塩基対を含有するDN
A切片及びプロモーター／オペレーター及びテトラサイ
クリン耐性遺伝子の最初の200塩基対を生成させた。Xba
I及びBam HIの境界を有するこのDNA切片ＣをPAGEによつ
て単離し、上記の３つの切片の結合に使用してプラスミ
ドpHS94を得た（第Ａ図）。
酵母菌中で異種遺伝子の発現を成功させるためには、
適当なプロセシング（ポリアデニル化）及びその転写の
輸送を可能とするDNA配列をもつ遺伝子末端の転写が必
要である。
DNA制限及び修飾酵素 制限酵素EcoRI及びHindIII並びに細菌性アルカリ性ホ
スフアターゼはBethesda Research Laboratoriesから購
入した。DNAポリメラーゼ（Klenow切片）はBoehringer-
Mannheimから購入した。Ｔ4ポリヌクレオチドキナー
ゼ、ATP及びデオキシヌクレオシド三リン酸dATP,dGTP,d
CTP及びdTTPはPL Biochemicalsから購入した。その他の
DNA制限酵素及び代謝酵素はすべてNew England Biolabs
から購入した。〔γ−32Ｐ〕ATPはAmersham Corp.から
購入した、DNA制限及び代謝糞は各製造業者によつて記
載されているとおりの条件で使用した。
DNAの調製及び形質転換 大腸菌（17）及び酵母菌（18）並びに大腸菌の形質転
換体（19）及び酵母菌の形質転換体（20,21）からの共
有結合的に閉環した環状プラスミドDNAの精製は前に記
載されているように行なつた。大腸菌のミニスクリーン
は前に記載されているように行なつた（32）。
菌株及び培地 すべての細菌の形質転換のために大腸菌Ｋ−12菌株29
4（ATCC No.31446）（23）を使用した。遺伝子型（leu2
trp1 ade６及び／又はade2,lys1 can１）を有する酵母
菌菌株XV610-8Cを酵母菌クローニング宿主として使用し
た（ATCC No.20622）。
LB（富）培地はMiller（24）により記載されているよ
うに精製し、アンピシリン（シグマ）20μg/ml又はテト
ラサイクリン（シグマ）20μg/mlのいずれかを加えた。
pBlの3.1kb挿入部の制限地図及び部分配列 pBl（５）300μｇを反応容量500μｌ中のHindIIIで徹
底的に消化し、次いで１パーセントアガロースの分取用
アガロース（Sea Kem）ゲル上で電気泳動した。3.1kbの
HindIII挿入部をエチジウム付着ゲルから切り取り、電
気溶離し（25）、緩衝溶液を飽和させた等容量のフエノ
ール及びクロロホルムで２回抽出し、エタノールで沈殿
させる。再懸濁させたDNA切片の部分を分割し、異なる
制限酵素で切断し、第１図に示した部分的制限地図を得
た。
精製した3.1kbの挿入部30μｇをSau3Aで切断し、次い
で６パーセントアクリルアミドゲル上で処理した。256b
p及び141bpに対応する切片を上記と同様にして電気溶離
により分離精製した。次いで各DNA切片のDNA配列の分析
を行なつた（25）。
このDNA配列の部分を第２図に示す。PGK構造遺伝子の
Ｎ−末端アミノ酸に対応するアミノ酸をDNA配列の上方
に示す。
PGK5′プロモーター領域への制限部位の挿入 配列５′ATTTGTTGTAAA3′を有する合成オリゴヌクレ
オチドを標準的な方法で合成した（26）。〔γ−32Ｐ〕
ATP200μCiを同時に含有する反応混合物20μｌ中のT4ポ
リヌクレオチド10単位を使用してこのプライマー100ng
を５′末端でラベルした。PGK構造遺伝子配列のすぐ前
にくるPGKの５′−側面を有するDNA中へEcoRI制限部位
をおくために、多段階プロセスにおける第１段階である
ように設計されたプライマー修復反応において上記のラ
ベルしたプライマー溶液を使用した。この多段階プロセ
スを以下で説明する。
段階１（第３図） 39bpXbaＩ〜Sau3A PGK片のプライマー修復反応及びクロ
ーニング pBl 100μｇをHaeIIIを用いて完全に消化し、次いで
６パーセントポリアクリルアミドゲル上で処理した。エ
チジウム付着ゲル上の最も上方の帯（PGKプロモーター
領域を含有する）は上記と同様に電気溶離した。DNAの
この1200bpのHaeIII片をHindIIで制限し、次いで６パー
セントアクリルアミドゲル上で処理した。650bpの帯を
電気溶離で単離した。DNA5μｇが単離された。DNAのこ
の650bpのHaeIII〜HindII片をdIH2O 20μｌ中に再び懸
濁させ、次いで上記のリン酸化プライマー溶液20μｌと
混合した。この混合物をフエノールクロロホルムで１回
抽出し、次いでエタノールで沈殿させた。乾燥したDNA
とＨ2O 50μｌ中に再び懸濁させ、次いで沸騰水浴中で
７分間加熱した。次にこの溶液をドライアイス−エタノ
ール浴中で急速に冷却し（10〜20秒）、次いで氷水浴に
移した。この溶液に、10X DNAポリメラーゼＩ緩衝液（B
oehringer Mannheim）10μｌ、前につくつた各々のデオ
キシヌクレオシド三リン酸（dATP,dTTP,dGTP及びdCTP）
が2.5mMの溶液10μｌ、dIH2O 25μｌ及びDNAポリメラー
ゼＩ、Klenow切片５単位を含有する溶液50μｌを加え
た。この反応混合物100μｌを37℃で４時間培養した。
次いでこの溶液をフエノール−クロロホルムで１回抽出
し、エタノールで沈殿させ、凍結乾燥法で乾燥し、その
後Sau3A 10単位で徹底的に制限した。次にこの溶液を６
パーセントアクリルアミドゲル上で処理した。大きさ39
bpに対応する帯をゲルから切り取り、次いで上記の電気
溶離により単離した。この39bpの帯は一つの平担末端と
一つのSau3A粘着性末端を有する。この切片をクローン
化し修正pFIFtrp69ベクター（11）とした。10μｇのpFI
Ftrp69をXbaＩを用いて綿状化し、フエノール−クロロ
ホルムで１回抽出し、その後エタノールで沈殿させた。
各々のヌクレオシド三リン酸250μＭを含有する反応混
合物50μｌ中のDNAポリメラーゼI Klenow切片を用いてX
baＩ粘着性末端を充たした。このDNAをBamHIで切断し、
次いで６パーセントアクリルアミドゲル上で処理した。
このベクター切片を電気溶離によつてゲルから単離し、
次いでdIH2O 20μｌ中に再び懸濁した。このベクター20
ngを上で合成した30bpの切片20ngと室温で４時間連結し
た。連結混合物の５分の１を使用して大腸菌菌株294をL
B＋20μg/ml ampプレート上で形質転換しアンピシリン
耐性にした。形質転換体からのプラスミドは迅速スクリ
ーン法（22）により調べた。１つのプラスミドpPGK-39
（36）を配列分析のために選択した。このプラスミド20
μｇをXbaＩで消化し、エタノールで沈殿させ、次いで
細菌性アルカリ性ホスフアーゼ1000単位を用いて68℃で
45分間処理した。このDNAをフエノール−クロロホルム
で３回抽出し、その後エタノールで沈殿させた。次いで
脱リン酸化末端を〔δ−32Ｐ〕ATP200μCi及びＴ4ポリ
ヌクレオチドキナーゼ10単位を含有する反応混合物20μ
ｌ中でラベルした。このプラスミドをSalＩで切断し６
パーセント アクリルアミドゲル上で処理した。
このラベルした挿入部の帯をゲルから単離し化学的分
解法により配列を決めた（25）。このプロモーター片の
３′末端におけるDNA配列は予期されたとおりであつ
た。
段階２（第４図） 312 bp PvuＩ〜EcoRI PGKプロモーター切片の構成 pPGK-39（第３図）25μｇをSalＩびびXbaＩ（各５単
位）を用いて同時に消化し、次いで６パーセントゲル上
で電気泳動した。39bpのプロモーター片を含有する390b
pの帯を電気溶離により単離した。この再懸濁DNAをSau3
Aで制限し、次いで８パーセントアクリルアミドゲル上
で電気泳動させた。この39bpのPGKプロモーターの帯を
電気溶離により単離した。このDNAは、Sau3A〜XbaＩ切
片上のPGKプロモーターの５′末端の39bpを含有してい
た。
pBl 25μｇをPvuＩ及びKpnＩで制限し、次いで６パー
セントゲル上で電気泳動させた。DNAの0.8Kbpの帯を電
気溶離により単離し、次いでSau3Aで制限し、６パーセ
ントゲル上で電気泳動させた。PGKプロモーター（第１
図）からの265bpの帯を電気溶離により単離した。
次にこのDNAを上記からの39bpのプロモーター切片と
室温で２時間連結させた。連結混合物をXbaＩ及びPvuＩ
で制限し、次いで６パーセントアクリルアミドゲル上で
電気泳動させた。この312bpのXbaＩ〜PvuＩ制限切片を
電気溶離により単離し、次いでpBR322〔前に単離された
162のPvuＩ〜PstＩ制限切片を失つたもの〕200ng及びpL
EKIFtrpA 20μｇから前に単離されたXbaＩ〜pstI LeIFA
CDNA遺伝子200ngを含有する連結混合物に加えた。この
３−フアクター連結混合物を使用して大腸菌菌株294を
形質転換しテトラサイクリン耐性とした。形質転換体コ
ロニーをミニスクリーンし、コロニーの一つ、pPGK-300
を、pBR322をベースとするベクター中でLeIFA遺伝子に
融合したPGK5′−側面を有するDNAの304bpをもつものと
して単離した。LeIFA遺伝子の５′末端は次の配列:5′
−CTAGAAATTC−３′を有し、従つてこの配列中へのPGK
プロモーター切片からのXbaI部位の融合はXbaＩ部位へ
のEcoRI部位の付加を可能とする。pPGK-300はこのよう
にPvuＩ〜EcoRI切片中で単離されたPGKプロモーターの
部分を含有する。
段階４ 1500bpのEcoRI〜EcoRI PGKプロモーター切片の構成 pBl 10μｇをPvuＩ及びEcoRIで消化し、６パーセント
アクリルアミドゲル上で処理した。PGK5′−側面を有す
るDNAからの1.3KbのPvuＩ〜EcoRI DNAの帯を電気溶離に
より単離した。10μｇのpPGK-300をEcoRI及びPvuＩで消
化し、消化混合物を６パーセントゲル上で電気泳動させ
た後、312bpのプロモーター切片を電気溶離により単離
した。５μｇのpFRL4をEcoRIで切断し、エタノールで沈
殿させ、次いで細菌性アルカリ性ホスフアターゼで68°
で45分間処理した。DNAをフエノール／クロロホルムで
３回処理した後、エタノールで沈殿させ、そしてdIH2O
20ml中に再び懸濁させた。このベクター200ngをpPGK-30
0からの312bpのEcoRI〜PvuI DNA100ng及びpBlからのEco
RI〜PvuI DNA100ngと連結させた。この連結混合物を使
用して大腸菌菌株294を形質転換しアンピシリン耐性と
した。ApRコロニーの一つからpPGK-1500を得た。このプ
ラスミドは、DNAのEcoRI〜EcoRI片又はHindIII〜EcoRI
片として1500bpのPGKプロモーター切片を含有してい
る。
発現ベクターの構成（第６図） 20μｇのpFRL4をHindIII及びBglIIで消化し、次いで
６パーセントアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。
構造遺伝子の部分及び３′非翻訳領域を含有するTRP１
遺伝子からの230bpの切片（28）をゲルスライスから電
気溶離により単離した。これは酵母菌ターミネーター制
限切片である。
10μｇのpHS94をHindIII及びEcoRIで制限し、６パー
セントアクリルアミドゲル上で処理した。HBsAg遺伝子
を表わす870bpの帯を電気溶離により単離した。
HbsAg遺伝子３μｇをTRP１「ターミネーター」１μｇ
と２時間室温で連結させた。次にこの溶液をEcoRI及びB
glIIで制限し、６パーセントアクリルアミドゲル上で電
気泳動させた。５′−HBsAg/TRP1−３′DNA切片に対応
する1.1kbの帯を電気溶離により単離した。50μｇのpPG
K-1500をHindIII及びEcoRIで制限し、次いで６パーセン
トアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。1.5kbpのPG
Kプロモーター切片を電気溶離により単離した。10μｇ
のpCV13をHindIII及びBamHIで制限し、次いで１パーセ
ントアガロースゲル上で電気泳動させた。大きなベクタ
ー切片を電気溶離により単離した。0.9μｇのpCV13（Hi
ndIII〜BamHI）、150ngのHindIII〜EcoRI PGKプロモー
ター切片及び100ngのEcoRI〜BglII HbsAg/TRP１融合物
を16℃で12時間連結させ、次いでこの連結混合物を使用
して大腸菌菌株294を形質転換させアンシピリン耐性と
した。多数の形質転換体のミニスクリーン分析により、
いくつかのコロニーはプロモーターHBsAg構造遺伝子−T
RP１ターミネーターを有する適当なベクター構成を含有
していることが示された。これらのプラスミドのいくつ
かを使用して酵母菌をLeu+に形質転換させた。
酵母菌の形質転換及びHbsAgの評価 標準的方法（20,21）を使用する形質転換のために調
製したYPD（29）中で酵母菌菌株XV610-8Cを生育し、最
小YNB（−leu）上でプラスミドpCV13又はpYeHBsを使用
して形質転換しロイシンプロトトロピー（Leu+）とした
（菌株及び培地参照）。形質転換体コロニーは次のよう
にしてHBsAg放射線免疫検定法（Abbott Labs）のために
調製した。
（１） YNB−ロイシン中30℃で通気しながら酵母菌10m
lを生育し660mμでの吸光度を1.0とする。
（２） 培養物を５分間5000xgで回転する。浮遊物質は
捨てる。
（３） PBS（pH＝７のリン酸ナトリウム20mMプラスNac
l 0.14m）500μｌ中に細胞を再び懸濁させ、殺菌ガラス
玉（0.45〜0.50mm）1.5gを加え、５分間（氷の上に断続
的に置くことにより低温に保つて）攪拌する。
（４） 細胞抽出物を5000xgで３分間４℃で回転させ
る。標準放射線免疫評価のための細胞抽出物200μｌを
使用する。細胞抽出物はPBS使用して希釈した。
pYeHBsによる酵母菌中でのHBsAg発現の証拠 YNB-lue最小培地でpYeHNs及びpCV13を使用して酵母菌
菌株XV610-8Cを形質転換しロイシンプロトトロピーとし
た。このプラスミドの存在は、ロイシン選択（YPD）を
有しないプレート上でこれらの酵母菌を生育させてコロ
ニーとし、続いて複製してYNB（−ロイシン）プレート
（２パーセントアガー）とすることにより証明した。YE
PD上で生育したコロニーの50〜60パーセントはYNB-leu
上で生育した。このことは酵母菌の50〜60パーセントが
pCV13又はpYeHBsを含有したことを示す。Leu復帰変異体
はYNB-leu上でのすべてのコロニーの生育を示すことに
注目すべきである。酵母菌中でのPCV13安定性はpYeHBs
よりも大きくはなかつた。このことはHBsAgの生産は
（後に検討するように）細胞に圧力を及ぼしてコピー数
を制限することはないことを示唆している。形質転換体
酵母菌を液体ロイシン選択培地（YNB-leu）中で生育
し、次いでガラス玉懸濁物と共に強く攪拌することによ
り破壊開口した（後述）。放射線免疫検定法を使用して
透明な酵母菌抽出物中のHBsAg生産を評価した。22nm HB
sAg粒子はHBsAgモノマー単独よりも約1000倍も抗原活性
であり、我々はこの粒子に対抗して調製される抗体を使
用した。酵母菌抽出物についてのRIAは、酵母菌中でのp
YeHBsからのHBsAgの生産を示す。〔pCV13形質転換酵母
菌抽出物はHBsAg抗原物質を生産しない。〕 酵母菌中のHBsAgの特性付け １） 上述のように調製した酵母菌抽出物200μｌを、
トリス−HCl（pH7.4）20mM中サツクロース５〜20パーセ
ント（w/v）、EDTA0.5mM及びNaCl0.5Mから成る線型密度
勾配液5mlの上部に層状におき、次いでSW50.1ローター
中45,000rpmで２時間遠心分離した。分画を集め、放射
線免疫評価法によりHBsAgを評価した。
２） 上と同じ源からの抽出物200μｌをトリス−HCl
（pH7.4）20mM、EDTA0.5mM及びCsCl（密度1.2g/cc）を
含有する溶液5mlの上部に層状におき、次いでSW50.1ロ
ーター中45,000rpmで70時間遠心分離した。HBsAgを上述
のように評価し、CsClの比重を各グラジエント分画の屈
折率を記録することにより決定した。
肝炎表面抗原は合成され、粒子（22nm粒子）として肝
細胞から分泌される。上記の構成において、成熟構造遺
伝子プラスいくつかの３′非翻訳配列を表わす暗号領域
のみが含まれていた。我々は酵母菌細胞内肝炎表面抗原
モノマーの粒子の性質を評価した。この目的のため、HB
sAgを含有する酵母菌細胞抽出物を沈降速度分析及び沈
降平衡分析にかけた。第７図に示すように、酵母菌細胞
中で合成された肝炎表面抗原は、本物の22nm粒子を分泌
している細胞系統（PLCWIII）から得られる「22nm粒
子」の形のHBsAgの沈降速度と実質的に同じ沈降速度を
もつ。
酵母菌中で合成されるHBsAgは、沈降平衝分析により
決定されるように、浮揚密度1.18g/cm3をもつ。この値
は、感染した肝細胞中で合成されたHBsAgの値よりもわ
ずかに小さい。
ワクチンの製造 本明細書に記載のようにして生産したHBsAgを成分と
する、本発明のワクチンは、該HBsAgを適当な賦形薬と
混合して、公知の方法に従つて製造することができる。
適当な賦形薬には、例えば、塩溶液、種々の公知のアジ
ユバント、当業界においてウイルス感染を防止するため
に利用される組成物中で使用されると認められるその他
の添加剤が含まれる。そのようなワクチンは、宿主に対
する効果的な投与のために使用されるワクチンを製造す
るために、有効量の該HBsAg及び適当量の賦形薬を含有
する。New Trends and Developments in Vaccines,Edit
ors:A.Voller and H.Friedman,University Park Press,
Baltimore,1978,参照。この文献は、ワクチンの製造に
ついてその背景をさらに詳細に知るための参照文献とし
てここに記載してある。
参照文献 1.Broach,J.R.,Strathern,J.N.,and Hicks,J.B.Gene
8,121-133（1979）。
2.Ratzkin,B.,and Carbon,J.Proc．Natl．Acad．Sci.U.
S.A.74,487-491（1977）。
3.Chinault,A.C.,and Carbon,J.Gene 5 111-126（197
9）。
4.Hinnen,A.,Hicks,J.B.,and Fink,G.R.Proc．Natl．Ac
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【図面の簡単な説明】
第１図は、酵母菌の３−ホスホグリセリン酸遺伝子の
５′側面を有するDNAへのEcoRI部位の挿入を示す。 第２図は、酵母菌３−ホスホグリセリン酸キナーゼ構造
遺伝子の５′末端のDNA配列及び側面にあるDNAを示す。 第３図は、PGKプロモーターに位置−８でXbaＩ部位を挿
入し、このXbaＩ末端及びSau3A末端を含有するPGKの
５′−側面を有する配列の39bpの切片を単離するのに使
用する技術を図式的に示す。 第４図は、上記39bpの切片、PvuＩ〜Sau3Aからの付加的
なPGKの５′−側面を有する配列（265bp）（第１図参
照）及びXbaＩに隣接するEcoRI部位を含有する300bp切
片の構成を図式的に示す。 第５図は、第４図において構成された切片に加えて、PG
Kの５′−側面を有する配列からの1300bpのIndIII〜Pvu
Ｉ切片（第１図参照）を含有する1500bpのPGKプロモー
ター切片（HindIII/EcoRI）の構成を図式的に示す。 第６図は、修正されたPGKプロモーター、HBsAg遺伝子及
び酵母菌TRP１遺伝子のターミネーター領域を含有す
る、酵母菌中での肝炎表面抗原のための発現ベクターの
構成を図式的に示す。 第７図Ａは酵母菌が生産したHBsAgと22nm粒子のスクロ
ース密度勾配沈降の比較を示し、第７図Ｂは両者の対応
するCsCl密度勾配遠心分離を示す。 第８図は、SV40DNAを含有し、VP−１蛋白質のための暗
号領域を欠くプラスミドpSVRの構成を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ダニエル・ジ−・ヤンスラ アメリカ合衆国カリフオルニア州94134 サンフランシスコ・ピオシユ−125 (56)参考文献 特開 昭58−77823（ＪＰ，Ａ)

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】酵母宿主菌株中での複製及び表現型の選択
    が可能なDNA発現ベクターであって、該ベクターは、酵
    母菌宿主菌株に対して適合性を有するプロモーター及
    び、Ｂ型肝炎表面抗原を暗号化しているが、Ｂ型肝炎表
    面抗原前駆配列に由来する配列を全て欠失しているDNA
    配列を含有し、該配列は、該ベクター中に翻訳開始信号
    及び翻訳停止信号とともに、形質転換体酵母菌菌株中で
    単離された粒子の形のＢ型肝炎表面抗原を生産するべく
    発現されるように該プロモーターの制御下に配置されて
    いることを特徴とするDNA発現ベクター。
  2. 【請求項２】プロモーターが酵母のグルコース分解酵素
    遺伝子または酸性ホスファターゼ遺伝子由来のものであ
    る特許請求の範囲第１項記載のDNA発現ベクター。
  3. 【請求項３】プロモーターが酵母の３−ホスホグリセリ
    ン酸キナーゼ（PGK）遺伝子由来のものである特許請求
    の範囲第１項記載のDNA発現ベクター。
  4. 【請求項４】下記の構造を有するプラスミドpYeHBsであ
    る特許請求の範囲第１項記載のDNA発現ベクター。
  5. 【請求項５】酵母宿主菌株中での複製及び表現型の選択
    が可能なDNA発現ベクターであって、該ベクターは、酵
    母菌宿主菌株に対して適合性を有するプロモーター及
    び、Ｂ型肝炎表面抗原を暗号化しているが、Ｂ型肝炎表
    面抗原前駆配列に由来する配列を全て欠失しているDNA
    配列を含有し、該配列は、該ベクター中に翻訳開始信号
    及び翻訳停止信号とともに、形質転換体酵母菌菌株中で
    単離された粒子の形のＢ型肝炎表面抗原を生産するべく
    発現されるように該プロモーターの制御下に配置されて
    いることを特徴とするDNA発現ベクターを用いて形質転
    換された酵母菌菌株。
  6. 【請求項６】プロモーターが酵母のグルコース分解酵素
    遺伝子または酸性ホスファターゼ遺伝子由来のものであ
    る特許請求の範囲第５項記載の酵母菌菌株。
  7. 【請求項７】プロモーターが酵母の３−ホスホグリセリ
    ン酸キナーゼ（PGK）遺伝子由来のものである特許請求
    の範囲第５項記載の酵母菌菌株。
  8. 【請求項８】leu2栄養要求変異種酵母菌菌株を形質転換
    することにより得られる特許請求の範囲第５項記載の酵
    母菌菌株。
  9. 【請求項９】下記の構造を有するプラスミドpYeHBsを用
    いて形質転換された特許請求の範囲第５項記載の酵母菌
    菌株。
  10. 【請求項１０】菌株XV610-8Cを形質転換することによっ
    て得られる特許請求の範囲第５項記載の酵母菌菌株。
  11. 【請求項１１】ヒトにＢ型肝炎ウイルスに対する免疫原
    性を与えるために使用するのに適した粒子の形のＢ型肝
    炎表面抗原の製造方法であって、 酵母宿主菌株中での複製及び表現型の選択が可能なDNA
    発現ベクターであって、該ベクターは、酵母菌宿主菌株
    に対して適合性を有するプロモーター及び、Ｂ型肝炎表
    面抗原を暗号化しているが、Ｂ型肝炎表面抗原前駆配列
    に由来する全ての配列を欠失しているDNA配列を含有
    し、該配列は、該ベクター中に翻訳開始信号及び翻訳停
    止信号とともに、形質転換体酵母菌菌株中で単離された
    粒子の形のＢ型肝炎表面抗原を生産するべく発現される
    ように該プロモーターの制御下に配置されていることを
    特徴とするDNA発現ベクターを用いて形質転換された酵
    母菌菌株を培養し、該Ｂ型肝炎表面抗原を発現し、該Ｂ
    型肝炎表面抗原を単離された粒子の形で該酵母菌菌株か
    ら回収することを特徴とする方法。
  12. 【請求項１２】プロモーターが酵母のグルコース分解酵
    素遺伝子または酸性ホスファターゼ遺伝子由来のもので
    ある特許請求の範囲第11項記載の方法。
  13. 【請求項１３】プロモーターが酵母の３−ホスホグリセ
    リン酸キナーゼ（PGK）遺伝子由来のものである特許請
    求の範囲第11項記載の方法。
  14. 【請求項１４】DNA発現ベクターが、下記の構造を有す
    るプラスミドpYeHBsである特許請求の範囲第11項記載の
    方法。
  15. 【請求項１５】酵母菌菌株がleu2栄養要求変異種酵母菌
    菌株を形質転換することにより得られる特許請求の範囲
    第11項記載の方法。
  16. 【請求項１６】酵母菌菌株が、菌株XV610-8Cを形質転換
    することによって得られる特許請求の範囲第11項記載の
    方法。
  17. 【請求項１７】ａ） 酵母菌宿主菌株中での複製及び表
    現型の選択が可能なDNA転移ベクターを用意し、 ｂ） 酵母菌宿主菌株に対して適合性を有するプロモー
    ターを含有するDNA配列の切片を用意し、 ｃ） Ｂ型肝炎表面抗原を暗号化しているDNA配列であ
    ってＢ型肝炎表面抗原前駆配列に由来する配列を全て欠
    失しているDNA配列の切片を用意し、 ｄ） 段階ａ）の該ベクター及び、ｂ）及びｃ）の該DN
    A配列の切片を適当な位置におかれた翻訳開始信号及び
    翻訳停止信号とともに組み立てて複製可能な発現ベクタ
    ーを生成させ、段階ｃ）の該DNA配列は単離されたＢ型
    肝炎表面抗原を生産するべく発現されるように該プロモ
    ーターの制御下にあることを特徴とし、 ｅ） 段階ｄ）のベクターを用いて酵母菌菌株を形質転
    換させ、 ｆ） 該酵母形質転換体中に該Ｂ型肝炎表面抗原が生産
    されるまで該酵母形質転換体を通常の発酵条件下で成育
    し、次いで、 ｇ） 該Ｂ型肝炎表面抗原を単離された粒子の形で回収
    する、 ことを特徴とする特許請求の範囲第11項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】段階ｃ）のDNA配列が、その暗号鎖の
    ５′末端から順に、ATG翻訳開始コドン、Ｂ型肝炎表面
    抗原を暗号化しているヌクレオチド及び翻訳停止信号を
    含有している特許請求の範囲第17項記載の方法。
  19. 【請求項１９】段階ｅ）の酵母菌菌株がXV610-8Cである
    特許請求の範囲第17項記載の方法。
  20. 【請求項２０】段階ｂ）のプロモーターが酵母菌PGKプ
    ロモーター領域から誘導される特許請求の範囲第17項〜
    第19項のいずれかに記載の方法。
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