JPS58109427A

JPS58109427A - 酵母菌中でのｂ型肝炎表面抗原の製造

Info

Publication number: JPS58109427A
Application number: JP57150186A
Authority: JP
Inventors: ロナルド・エイ・ヒツツマン; ア−サ−・デイ−・レビンソン; ダニエル・ジ−・ヤンスラ
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1981-08-31
Filing date: 1982-08-31
Publication date: 1983-06-29
Anticipated expiration: 2011-06-26
Also published as: EP0073657A1; GB2104902B; IE56711B1; JP2511394B2; AU8779782A; NZ201705A; ZA826251B; HK37494A; GB2104902A; AU560122B2; EP0073657B1; DE3280284D1; IE822086L; ATE59409T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、Ｂ８！ｌ肝炎ウィルス（ＨＢＶ）用ワクチン
の製造で使用するための酵母菌生物中でのＢ型肝炎表面
抗原（ＨＲｓＡｇ）の製造のために組換えＴ）　Ｎ　Ａ
技術を使用することに関する。本発明は、その−局面に
おいて、発現を行なわせるプロモーター系と操作可能に
連結されているＢ型肝炎表面蛋白質抗原を暗号化してい
るＤ　、Ｎ　Ａ配列を含有する微生物発す、ビークル（
ｖｅ）口ｃ、　ｌ　ｅ　ｓ　）の構成及びそのように構
成された発」、ビークルに関する。本発明は、別の局面
においては、そのような発現ピーク！しで形質転換され
、′ｈ・り１−１て上記ＤＮＡ配列の発９１、を目的と
する酵母菌に関する。本発明は、さら（Ｃ別の局面にお
いて、そのような酵母菌発現の最終生成物ｋ、”型肝炎
つイｌレスに対１−．て有用なワクチンの如きものに転
換する手段及びｂ法に５− 関する。好ましい実施態様では、本発明は、約２２０ｍ
の粒子の形で生産され、Ｂ型肝炎ウィルスの抗原決定基
を含有する所望の蛋白質を結合した形で高収率で轢える
Ｂ型肝炎表面抗原蛋白質を暗号化し、ているＤＮＡ配列
の末端にある強力な酵母菌プロモーター及びＩ）ＮＡ配
列を利用する特定の発現ベクトルを提供する。

本発明の詳細な説明するために、そして特定の場合は本
発明の実施に関する詳細を付加的に示すために使用され
る刊行物及びその他の資料は、本明細書中に参照文献と
して引用されておｈ１便宜のだめ本明細書中では番号を
付して参照され、本明細書の終りに一括して参照文南１
゛と（７て掲載さねでいる。。

Ａ、　　＋１型肝炎ウイルスＢ型肝炎（血清肝炎）つ・イルスはヒトの間で感　６− 染；、７、重症肝障害、加発癌及び死亡−＼と進行する
結果となる可能性のある慢性衰弱性病坤閑である。

多くの場合、８型肝炎感染からの完全な沖１復を期待す
ることができる。しかしながら、かなり多数の人々１１
、とぐに多数のアフリカ及びアジアの国々において、慢
性保菌者であって、この病気を感染汁６行さげる危険な
ｏｆ能性をもっている。

肝１ｕｉｌ−ウィルスベクター（Ｂ型肝炎ウィルス、略
して）ｌ　Ｂ　Ｖ　）が肺内となっておこる。このウイ
ルスペク々−は全体としては□いわゆるゾーン粒子−ヴ
、４１１オンを表わｌ−、、ＴＪＮＡ分子を包み込ム２
７　ｎ　＋ｎのヌクレオカブンド及びこのヌ々し４−カ
プツ）’　ｆ　ＩｒＩ／り囲むエンベロープからなる。

このヴイリオンと会合している蛋白％はコア抗原（１１
８ｔ：ｋｌＺ）、′Ｄ１”ＪＡホリメ１ラーゼ及び表面
転属（ＨＢ　ｓＡ（＋　）を含有し、この表面抗原は感
染した保酌者の血清中で発見されている。ＨＢｓＡＣ）
ＩｔＣ対する抗体もまた）ｌ　Ｂ　Ｖに感染したヒトの
血清中で発情されている。ＨＢｓＡＧは、抗体（抗ｔ（
Ｂ　ｓ　）の免疫生成を誘導することができる［（ＢＶ
抗原であね、従ってＨｆ３　ｓ　ｋＧは）（ＲＶワクチ
ンにおける主成分であると信じられている。参照、Ｄａ
ｎｅＩｎｇｙ　　１０（Ｉ、ｆ’（：３４（’ＩＱ７２
）；ＩＩＩｔ＋ｍｂｅｒｇ。

Ｆｒａｎｋｌ　ｉｎ　　Ｉｎ５１口ｕｌｐ　　’Ｐｒｅ
ｓｓ　、Ｐｈｉ　Ｉａｄｐｌ−ＩＴＩＩ　ｉａ、　ｌ　
９７８ｎ　　これらの文献に、本発明の背１ｉる・作ら
ｔζ示ずために径間として本明＃Ｉ書に記載されている
。

ＨＢｓＡｇは、感染したヒトの血漿中（ｆ（、約１６〜
２５　ｎ　ｍの蘭囲の直径を有する球彰粒子、いわゆる
「２２ｎｍ粒子、ｊの形で主２［２て存在１．ている。

これらは非感染性のウィルス性エンベロープを表わすと
考えら力５る。ＨＢｓＡｇＫ７対する抗体はＨＢ　Ｖ感
染に対し、て保睡するから、ζわらの非感染性粒子１は
ワクチンとして有カｒＫ使用するととかで入る。

Ｂ型肝炎ウィルスが細胞型づ件物中で■生性で１なく感
染したヒト父上１高等霊長？ｉ′ｉから得らｔｌろの春
１′ある限）１．ＦＴＢＶに対する免疫法のための抗原
を生成さ÷τるのに使用するＨｌｌｖの十分カイｊｔ給
を入手１−ウつ維持するために利用できる手段は従来な
−ｂつ＊。

本発明は、ＨｆＳ　Ｖ　ｙ（対［７て有効系・ワクチン
を製−！〕− 造するための手段及び方法を掃供する。糾換えＤＮＡ技
術ＶＣより、ＨＢｓＡｇを暗号化している遺伝子を適当
な翻訳開始信号及び停止信号といっしょに適当な発現プ
ロモーターの制御下に複製可能な発覗ベクトルに挿入Ｌ
Ｘ後者を使用［２て酵母菌細胞を形質転換した。このよ
うに遺伝学的に方間付けられた細胞は、直接的に６・つ
粒子の影で［］口ｓＡｇ　を生産しまた。このＨｆｌ　
ｓ　Ａ　ｇす、精製すると、ＨＢＶｃ（対して免疫ケミ
えるのに適した。ものと々る。

１（１組換えＩＪ　Ｎ　Ａ技術組換えＤＮＡ技術の出現とともｉ／（二、莫大な種類の
有用なポリヘプチドの制州１さゾまた微生物的生産が回
前と７ｒつ゛た１、ヒト成鴎オル沿ン、白＋ｎｔ球イン
ターフェロンとの多くの哨羽動物Ｉのポリへブチドが室
中々の微生物Ｗ−よ′つてすでに生産プれてｔ・）２、
。

この技術のお陰で莫大な種！ｌ：ｔ′Ｊの有用なポリへ
ブチ１０− ドの微生物による生産が可能となり、多種の医薬を目的
とする応用に対して使用されるホルモン、酵素、抗生物
質及びワクチンの微生物的に方向付けられた生産が手の
とどく範囲に置かれている。

組換えＤＮＡ技術の基本的要素はプラスミドである。プ
ラスミドは細菌中でしばしば細胞１個当り複数のコピー
として発見される染色体外に存在する二重鎖ＤＮＡの輪
である。プラスミドＤＮＡ中に暗号化された情報の中に
は、１１β細胞中にプラスミド（すなわら、レプリコン
又は複製のオリジン）及び通常抗生物質耐性等の１つ又
は複数の表現型選択特性を再生するのに必要とされる情
報が含捷れでいる。これらの特性は、注目１．ているプ
ラスミドを含有する宿主却１胞のりａ−ンを認識し１冑
釈培地の中で優先的に生育させることを可能とする。細
菌性プラスミドの有用性は、プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　」
二の異なる部位を認識する各々の制限エツトヌクレアー
ゼ又は「制限酵素」によって細菌性プラスミドを特異的
に切断することができるという事実にある。切断後切断
部位で又は切断部位に隣接する再構生末端で末端を結合
することにより真補遺伝子又は遺伝子切片をプラスミド
の中へ挿入することができる。いわゆる複製可能な発現
ビークルはこのように形成されるのである。

ＤＮＡの組換えは微生物の外部で行なわれ、生成する「
組換えた」板製可能な発現ビークル又はグラスミドは、
形質転換として知られている方法により微生物の中へ導
入することができ、この形質転換体を生育することによ
り大量の組換えビークルが得られる。さらに、暗号化さ
れたＤＮＡメジ十−ジの転写及び′＃Ａ訳を支配するプ
ラスミドの部分に関して遺伝子が適切に挿入される場合
は、挿入された遺伝子が暗号化しているポリペプチド配
列の生産、すなわら発明、といわれるプロ士スを行なわ
せるためにこの生成した発現ビークルを使用することが
できる。

発現はプロモーターとして知られているＤＮＡの領域で
開始される。発現の転写相において、Ｔ）ＮＡがほどけ
て、ＤＮＡ配列からメンセンジャーＲＮＡの合成を開始
するだめの鋳型としてＤＮＡが露出する。次いでメツセ
ンジャーＲＮＡはリポソームと結合し、そこでメンセン
ジャーＲＮＡは翻訳されて、ｍＲＮＡにより暗号化され
ているアミノ酸１１１列を有するポリへブチド鎖となる
。各々のアミノ酸はヌクレチオド三連符又ｄ「コドン」
により暗号化されている。コドンは集まって、［構造遺
伝子−１、すなわら発狭さねるポリペプチド生成物のア
ミノ酸配列を暗号化しているＩ）Ｎ＾配列の部分を作り
上げる。翻訳は［開始−１信号（通常はＡＴ（）、これ
は生成するメンセンジャーＲＮＡ中ではＡ　Ｕ　（＋に
なる）で開始される。いわゆる信１３− 止コトンは翻訳の終了、従ってアミノ酸単位のそれ以上
の生産の終了を規定する。この生成物は宿主細胞を溶解
させ、その他の細菌性蛋白質から分離し適当に精製して
この生成物を回収することにより得ることができる。

実際、組換えＤＮＡ技術を使用することにより、全く異
種の（通常は力えられた微生物中に発見されない、ヌは
〜えられた微生物によって生産されない）ポリペプチド
を発現させることができ−−−−−−いわゆる直接発ｍ
−−−−−あるいはまた別に同種の（対応する野生型微
生物中に発見されるか又は対応する野生型微生物によっ
て生産さｔする（ポリペプチドのアミノ酸配列の部分と
融合した異種ポリペプチドを発現することができる。

後者の場合、目的とする生活性な生産物は、細胞外の環
境ＶＣおいて融合した同種／異種ポリペプチドが切１’
ｉｉさ〕′するまでは、融合した同８Ｉ／異種ポリ−１
４− ペプチド内で時によると不活性化されている。参照、例
えば、イギリス特許公告第２０１１７６７６Ａ号及びＷ
ｅｔｚｅｌ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｓｔ
６８、’６６４　、（１９８０）。

も１２組換えＤＮＡ技術がその将来の見込みを十分に達
成すべきであるとするなら、目的とするポリペプチド生
産物を制御した環境において高収率で入手することがで
きるようにするために、遺伝子の挿入部の発現を＃適に
する方法を案出１．々ければならない。

Ｃ０当該技術の状態１９８０年６月４日発行のイギリス特許出願第２０３４
３２３　Ａ号は、Ｅ（・ＯＲＩ消化及びそれに続く連結
を利用する、約３２００のヌクレオチドを含有するＩＢ
Ｖゲノムの単離及びこのＤＮＡのベクター中・＼の導入
を記載している１、生成するクローン化されたＨＢＶ−
ＤＮＡは標識を付して面清中のゾーン粒子を検出するだ
めのプローブとして使用することができること及びこの
ベクターはＢ型肝炎蛋白質切片を含有するポリペプチド
を発現させるために使用することができるであろうこと
が配達されている。

同じ研究所からの関連する論文ｒＰ「ｏｃ、Ｎａｔｌ。

において、直列のクローン化したＢ型肝炎ゲノムをマウ
ス細胞中に導入し、マウスの染色体中に組込んだことが
報告されている。肝炎表面抗原とし２て同定されるポリ
ペプチドは、感染したヒトの面清中で発停、された粒子
と同様の粒子としてその細胞赤ら排出された。

ヨーａツバ特許出願公告第１４（８２８号は、ゲノムＤ
ＮＡからメ晶□□ＲＮＡ転写の読み増り都訳によるＨＢ
ｖコア抗原の生産を記載している。表面抗原は検出され
なかった。

ヨーａツバｔｕｂ許出願公告第２０２５１号においては
、その称するところによれげＨＢＶの表面抗原蛋白質の
部分を含有１．ている融合蛋白質の大腸菌内での生産が
記載されている。表面抗原決定基は融合蛋白質として存
在していたのであるから、その構造は固有のものではあ
りえなかった。従って、報告された免疫活性は小さかっ
た。

本発明は、組換えＤＮＡ技術を使用１−でＢ型肝炎表面
抗原を直接的にかつ分離した粒子の形で成功裡にかつ効
率よく生産することがで六るという発停１に基づいてい
る。この生産物は、感染１．やすいヒトにＢ型肝炎ウィ
ルスに対する免疫原性を授力するにあたって使用するた
めに、あるいけそのような使用に伊するワクチンを製造
する目的に適１でいる。この生産物は、真核生物学生−
１ｆＰｌ丹菌−中で生産され、従ってそのような系はヒ
Ｉ・かつくる蛋白質とより密に関連１．ている対応する
１７− 蛋白質生産物、すなわら、グリコジル化物並びに糖及び
脂質会合物を与えるという利点がある。これに対して細
菌が生産する蛋白質の宿主はそのような精巧な過程を行
なうことができない。それに加えて、真核生物である酵
母菌の細胞は原核生物の組織よりもよりよく蛋白質生産
物に耐え、肝炎蛋白質自体が致死的である細菌組織より
も発現レベル及び収率を著しく増加させることは疑いが
ない。

本発明は生産されたＢ型肝炎表面抗ｍ、’　（ＨＢ　ｓ
ＡＧ　）及びその製造方法及び手段を含む。とぐに、本
発明は、酵母菌中で生産されたＢ型肝炎ウィルスの免疫
決定基を含む粒子の形のＨＢｓＡｇに関する。

このＨ’ＢｓＡｇは、）ＩＢＶ’Ｔ’ツムの別の部分に
よって暗号化されるにせよ、使用した酵母菌菌株と同種
のＤＮＡによって暗号化されるにせよ、分離した粒子の
形で、別の人工的な融合ポリペプチドが１８− ない状態で、生産される。本発明はさらに直接発現しう
る形でＨＢｓＡｇを暗号化している遺伝子配列を収容す
る複製可能なりＮＡ発現ビークルに関する。さらに、本
発明は、ＨＢｓＡｇを生産することができる、上記発現
ビークルで形質転換された酵母菌菌株及びそのような形
質転換された酵母菌菌株の微生物的培養に関する。さら
に別の局面において、本発明は、上記ＨＢｓＡｇ遺伝子
配列、ＤＮＡ発現ビークル、酵母菌菌株及び培養物を生
産するに際して有用な種々の方法並びにそれらの特定の
実施態様に関する。さらになお、本発明は、感染しやす
いヒトにＨＢＶに対する免疫原性を匂えるのに有用なワ
クチンの製造のためのこのように生産された［ＢｓＡｇ
の使用１、そのようなワクチン並びに感染しやすいと１
・にｉ種しＨＢＶに対する免疫原性を与えるためにそれ
らを使用する方法に関する。

本発明において好ましいプロモーターは、後に記載する
酵母菌３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＣ＋Ｋ）プ
ロモーター領域から作られたプロモーターである。この
ＰＧＫ遺伝子は、配列するのに役に立つと思われる制限
部位が解析された。これらの制限部位の１つについての
ＤＮＡ配列解析により、、　％定のＡ’Ｉ’Ｇで開始す
る翻訳はヒト及びウマのＰ　Ｇ　Ｋの同じＮ−末端アミ
ノ酸に対応するＮ−末端アミノ酸をもつ蛋白質を与える
ことが示され、この側面に位置するＤＮＡは酵母菌Ｐ（
）Ｋプロモーター領域であると考えられた。この’ＰＯ
Ｋプロモーター領域は、独自の制限部位を論理的に支持
する領域について解析さｔｌり。プライマー修復反応を
行なったところ、この独自の部位はＰＧＫプＯモーター
領域の゛３′末端の位置にあった。この独自の部位は、
ＰＧＫブａモーター領域が酵母菌中てこのように融合さ
れた遺伝子の、直接的発現を行なわせることを可能とし
た。

後に記載する酵母菌／細菌シャトルプラスミド、ｐＣＶ
　１　：（（又ｔｊ、ＹＥｐ　１３　）ｕ、イくツカノ
制限切片を取除いたものであった。表面抗原に融合した
ｐ　ｎ　Ｋプロモーター領域によりこれらの切片を置き
かえてベクターを再閉鎖した。このベクターを使用１−
て通常の発酵条件下で生育する酵母菌を形質転換し、所
望のＨＢｓＡｇ生産物を生産することができた。形質転
換された酵母菌を破壊して開き、ついで生産物を回収し
た。遠心外ｎｔされた溶治の表面浮遊物質をＢ型肝炎表
面抗原放射線免疫検定法において大賀として使用ｌ、た
３゜転写汐−ミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）とし
て適していることが発見された特定のＤＮＡ配列を、ｍ
ＲＮＡ　合成を停止させ適当なｍ　ＲＮ　Ａ　　プロセ
シング及び翻訳のためのボ１７　Ａ付加部位を提供する
２１− 丸めに、）（８ｓＡｇを暗号化している遺伝子配列の後
に置いた。このターミネータ−はｐＦＲＬ４中に含有さ
れているＴｒｐｌ遺伝子からの２３２　ｂｐのＨｉｎｄ
１１１〜シ」■制限切片に基づいている。

この切片は、酵母菌ＴＲＰＩ　遺伝子からのある暗号配
列及び適当な転写停止及びポリアデニル化のために必要
な；３′−側面含有する配列を含有するものが単離され
た。このターミネータ−切片はそのＨｉｎｄ■部位をへ
てＨＢｓＡｇ遺伝子のＨｉｎｄ■部位に融合された。酵
母菌中での融合酵母菌プロモーターによるＨＢｓＡｇ遺
伝子の転写は融合したＴＲＰ１ターミネータ−切片にお
いて停止するように設計されている。

ｐＣＶ１３（１）は、大腸菌中でのプラスミド選択を可
能とするアンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子
、ＤＮＡ複製の大腸菌オリジン、酵母菌中でのプラスミ
ドの選択を可能とするＬＥＵ２遺伝子及び酵母菌中での
プラスミドのＤＮＡ複製を可能とする２（ミクロン）オ
リジンを含有する。

このプラスミドは、形質転換された酵母菌の核質中で発
情される。テトラサイクリン耐性遺伝子の小心なＨｉ　
ｎ　ｄ　Ｔｌｌ〜ＢａｍＨＩ切片をベクターから取り除
いた。次いで生成した大きなベクター切片を、１．６ｋ
ｂｐのＨｉｎｄｌｌｌ〜ＥｃｏＲＩの組立てＰＧＫブＯ
モーター切片及び１．１ｋｂｐのＥｃｏＲＩ〜Ｂｇｌｌ
ＴのＨＢｓＡｇ／ＴＲＰＩ　　ターミネータ−切片に連
結して、第６図に示すｐ　Ｙ　ｃ　ＨＢ　ｓ　　ベクタ
ーをつくった。この）（ＢｓＡｇ　　発現ベクターは、
Ｐ　（）　Ｋブロモ−々−切片がＨＢｓＡｇ構造遺伝子
の転写を開始し、次いであらかじめＨＢｓＡｇ辿伝子に
融合したＴＲ７Ｊ＊−ミネーター中でこの転写が停止す
るように構成さノ１だ。

第八図は、Ｓ　Ｖ　４０　ＤＮＡ’ｅ含’ｔｒＬ、Ｖ”
Ｐ−１蛋白質のための暗号領域を欠くプラスミドｐｓＶ
Ｒの構成を示す。

第１図は、ベクターｐａｌの３．１ｋｂｐのＨｉｎｄ１
口挿入の制限地図を図式的に示す。Ｐ（）Ｋプロモータ
ーはそれから単離された。Ｐ　（：）　Ｋ遺伝子の５１
−側面を有するＤＮＡへのＥｃｏＲＩ部位及びＸｂａ１
部位の挿入を示す。

輌２図は、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲ１部位の挿入前のＰ　
Ｇ　Ｋ遺伝子についての５′−側面を有する配列プレス
最初の暗号配列を示す。

第３図は、Ｐ　ＣＩ　Ｋプロモーターに位＃−８でＸｂ
ａ　１部位を挿入し、このＸｂ’ａ）末端及び５ａｕ３
Ａ末端を含有するＰＧＫの５’　−４Ｉｌ１１面を有す
る配列の３９ｂｐの切片を単離するのに使用する技術を
図式的に示す。・第４図は、上記３９ｂｐの切片、Ｐｖｕ　Ｔ　〜Ｓａｔ
＋３λフ）１らの付加的なＰＣ＋にの５′−側面を有す
る配列（２６５ｂｐ　）　（第１図参Ｎ＠）及びＸｂａ
Ｉに隣接するＥｃｏＲＩ部位を含有する３　００　ｂｐ
切片の構成を図式的に示す。

第５図は、第４図において構成された切片に加えて、Ｔ
）（）Ｋの５′−側面を有する配列からの１３００　ｂ
ｐのＨｉ　ｎ　ｄ　１１１〜Ｐ　ｖ　ｕ　Ｔ切片（第１
図参照）を含有する１　５００　ｂｐのＰ　（）　Ｋプ
ロモーター切片（Ｈｉ　ｎｄ　Ｉｎ／　ｇｃｏ　ＲＩ　
）の構成を図式的に示す。

第６図は、修正されたＰｎＫプロモーター、ＨＢｓＡｇ
遺伝子及び酵母ＭＴＲＰ１　遺伝子のターミネータ−領
竣を含有する、酵母菌中での肝炎表面抗原のだめの発現
ベクターの構成を図式的に示す。、これは本明細書中Ｕ
こより詳細にｒ載されている。

第７図Ａはｒ（’ｉ母ｐｉ”：が生産したＨＢｓＡｇと
２２ｎ’ｍ粒子のスクロース密度勾配沈降の比較を示し
、第２５− ７図Ｅ３は両者の対応するＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を
示す、。

好ましい実施態様におｊ／′１て、発現系を、大腸菌及
び酵母菌、サソ力ロミケスセレピシエの両方ＩＣおいて
鍔折及び複製が可能であるプラスミドｐＣｖ１３（１）
の中ＶＣおいた。酵母菌中での遺択のためにプラスミド
はＴ、ＥＵ２遺伝子（２）を含有する。この遺伝子は、
酵母狛の染色体ｌｎ上に発見されたこの遺伝子（ておけ
る突然変異を含む酵母直を補足する（［１インンの不存
在下での生育を可能とする）（３）。

ここで使用された菌株は、遺伝子型１ｅｕ　：２ｔｒｐ
ｌ　とＶ６　ウ２　、艷ｌ　幻すｌ　を有する菌株ＸＶ
６１０　８’Ｃであった。この菌株は、アメリカ特許用
ｋＩ（の出願と同時１て制限を付寸゛るととなぐ　Ａｍ
ｐｒｉｅ　ａｎ’　　Ｔ’ｙｐｐ　　　Ｃｕ１ｔｕｒ　
ｅ　　Ｃｎ’ｌ’ｌｐ’ｒｔ’ｉｎｎ２６一ＶＣ寄託されている（ＡＴＣＣ扁：２０６２２　＞。し
かし、細胞１Ｌｅｕ２　　とする突然変異を含有するい
かなるサツ力ロミケスセレビシェ菌株もこの発現ンステ
ムを含有するプラスミドの発現のための効果的彦環境で
あることは理解さｈよう。使用することができる別の菌
株の例は、遺伝子型Ｉｅｕ２−：３　１ｅｕ２−１　１
２　　ｈｉｓ４−５１９　　ｃａｎｌを有するＡＴＣＣ
ｓ　　３８６２６のものである（４）。この菌株は１ｐ
ｕ２において２虚の突然変異を有し、それがＬｒｕ〜の
ＩＪｅＬｌ＋−＼の復−涌を制限１゜よ＃′）＃格な形
質転換を可能とする。

（アル：７−ルデヒドａゲナーゼ１のための）酵１５：
　Ｍ遺伝子からの５′−側面を有するＤＮＡ配列は、酵
母菌を形質転換するだめに使用するプラスミドの中１／
７７おいｆｒ：、埋合外来の拍伝子Ｃ例えば、白血球イ
ンターフェロンＤ）の発現をプロモートすることかでき
る。酵母菌中での適当な転写停止及びポリアデニル化を
可能とするために別の酵母菌遺伝子をこの構成の：う′
−末端においた。実際、我々は、ｍＲＮＡ転写は酵母菌
ＴＲＰ　１遺伝子の停止／アデニル化領域において予想
どおり終了することを示した（３′−末端）　Ｄｌｉｔ
ｚｅｍａｎ　ｐ（ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、印刷中）。

このプｏモーター１ｔ。

他の場合と同じように本発明の場合も好適に使用するこ
とができる。後述参照。Ｆｔしい実施別様において、酵
母菌３−ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子の５′−側
面を有する配列（５）を肝炎表面抗原のだめの構造配列
から上流におき、再びＴＲＰ１遺伝子停止−ボリアデニ
ル比信号を含有するＤＮＡを続けた。

酵母菌アルコールデヒドロゲナーゼ１５’　−（１ｊ１
面配列及び：う−ホストグリ＋１１ン酸キナーゼ５′−
側面配列（後述）はともに酵母菌中で外来の遺伝子の発
現をプロモートする働きをすることかで＾るから、重要
な遺伝子生産物の発現のためにいかなる高度に発現され
た酵母菌遺伝子の５７−側面を有する配列も使用するこ
とができるように思わね、る。ある種の環境の下におい
て酵母菌はその可溶性蛋白質の６５パーセン）［でをグ
ルコース分解酵素（６）として発現したので、そしてこ
の高水準は個々のｍＲＮＡの高水準の生産の結果である
（７）と思ねね、るので、そのような発現を目的と１２
てい≠・なる他のグルコース分解遺伝子、例えば、エノ
ラーゼ、グリセルアルデヒド−３−＋スフエートデヒド
ロゲナーゼ、ヘキソ窪ｔ−−ゼ、ピルビン酸カルボギシ
ラーゼ、ホスポフｌレクトキナーゼ、グルコース−６−
ホスフェート、イソメラーゼ、：う−ホスホグリセリン
醐ムターゼ、ピルビンＳ９キｔ−ゼ、トリオースホスフ
ェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及
びグルコギナー２９− ゼ等の５７−側面を有する配列を使用することが可能で
あるべきである。これらの遺伝子の３７−側面を有する
配列のいずれのものもまた、そのような発現系における
適当な停止及びｍＲＮＡポリアデニル化のために使用す
ることができるであろう。

上記参照。いくつかの他の高度に発現され、た遺伝子は
、酸性ホスファターゼのだめの遺伝子（８）及び通常Ｔ
ｙｌ　　トランスポゾン要１の存在により、５′−側面
領域における突然変異による高水準の生産全発現する遺
伝子（発現を増加させる突然変異体）（９）である。

上に配達したすべての遺伝子は、酵刊Ｍ　ＲＮ　Ａポリ
メラーゼ■により転写されると考えられる（９）。

リポソームＤＮＡ　、５Ｓ　ＤＮＡ汲びｔＲＮＡ　ＤＮ
Ａを転写するＲＮＡポリメラーゼＩ及び（１１のための
）Ｏモーａ　−（９、１（１）もまたそのような発現構
成において使用することが可能である。

−４３９− 最抜に、多くの酵母菌プロモータは、生育条件における
変化により該プロモーターを終Ｉトさせあるいは開始さ
せることができる転写制御を・同時に含有［７でいる。

そのような酵母菌プロモーターのいくつかの例は下記の
彊白質を生産する遺伝子でアル：アルコールデヒドロゲ
ナーゼ［１、イソ千トクローム、酸性ホスファターゼ、
窒素代謝と関連する分解酢味、グリセルアルデヒド−３
−ホスフェートデヒドロゲナーゼ及びマルトースとガラ
クトース利用を行なわせる酵ｇ（９）。そ１７）　、ｔ
：うな制御領域に、とくに蛋白官生産が・嘩１ｆ菌に狸
って有害であるときに、蛋白佃生産の発現１を開側１す
るのに・極めて有用であろう。１個の５’−（ｊｉｌｔ
而を有する配列の制御領域全高度に発現さね、た遺伝子
からのプロモーターを含有する５′ｌ−側面を有する配
列とともに配置することも捷だ可能であるべきＣある。

これは結果として雑種ブＯモーターを生じさせるであろ
うし、制御領域とプロモーターが物理的に異なるＤＮＡ
配列であるように思わわるから、回部であるべきである
。

ヒトの３−ホスホグリセリン酸酵素から精製したこの酢
漬の６個のＮ−末端アミノ酸ｔま次の）…りである：１−　２　’−３−４−５〜６ＳＥＲ−１．［ｉ２１］−８ＥＲ−０８Ｍ−Ｔ、ＹＳ−
Ｌ　ＥＵ−１４１Ｍの３ａｕ３Ａ−３ａｕ　３Ａ制制限
片のＴ’）ＮＡ自１１列仏ら生成し７た＃η訳読み取り
フレームの一つ（最初のＨｉｎｃ（［部位を含有する；
第１図の１）　（＋　Ｋ制限地図参照）（・ま、下Ｎｌ
’のアミノ酸配列を生産する：　　　、パ□・：１−　２−：（−／Ｉ　　−５−６Ｍ　Ｆ；　Ｉ”−８Ｅ　１？、−Ｊ−４ｌ−８ＥＲ−８
ＥＲ−ＬＹＳ−ＬＥＬ）−イニシエーターＣあるメチオ
ニンの除去後、１）ｌ（、Ｎ−未系ｉアミノ酸内１列は
、ヒトのＰ（）ＫのＮ−末端アミノ酸配列と同種の６個
のアミノ酸のうらの５個のアミノ酸を有することが示さ
ｆする。

このＱｆ列の結果は、酵母Ｉ″ｊ４Ｔ）　ｎ　Ｋ構造遺
伝子の開始ｖ、１：　ｐ　Ｂ　１のｌ　４１　ｂｐのＳ
ａｕ：（Ａ制限切片中＋ｉ’−）　Ｉ）　Ｎ　Ａにより
暗号化されていることを示唆１．た。

以前の研９℃（５）は、ＰＯＫ　　ｍＲ，ＮＡを特定化
する１、）　Ｎ　Ａ配列は旧ｎｄ　　ｍ　　切片のこの
区域に存在　　′することを示唆し７ている。１４１ｈ
ｐの５ａｕ３Ａ−切片をさらに配列さぜると、Ｐ（＋に
プロモーターのＤ　Ｎ　Ａ配列がにり多ぐ生１ｔ１５す
る（％’＋、２図に図示）。

プロト“、７−ル：ｐ　（］Ｋ遺伝子の５′−側面をイ１する配列中′＼（
７）ＸＩ＋ａ　ｉ　／に：ｔ：ｏ　Ｒ１のｌｉｄ人及と
ドア°ロモーターＲＪ片の構成（第１回診１！＠）段Ｍ’ｌ　）　　３９　ｂｐのＸｈａｌ−３ａｕ：うＡ
切１〒ノブ−１う３− ライマー修復ル応及びりａ−ニング（第３図に図示）段階２）　りｒｙ−／Ｐｖｕｌ−Ｘｂａｌ　　部分プロ
モーター切片（第４図に図示）段１端３）　　り’　　７Ｅｃｎ）？、］−ＥｒｎＲＩ
　　プロモーター切片（第５図に図示）　　発現プラスミドの構成のため９５６図で使用さねる１（ｉｎｄ
　ｌｌｌ　〜ＥｃｏＲ，Ｔプロモーター切片を含有する
。

酵母菌中での鴇種遺伝子の直接的発追１のだめのＰ　（
’＋　Ｋ　−ｆ　ｒｙ　モーターの使用１７ｔ、Ｐ　（
）　Ｋイニシエ−７−ＡＴ（＋を含、有しな（八Ｔ）　
（＋　Ｋ　゛７°ζストーター切片の：（’−Ｊ一端上
に制限部位があることを要求する。

第１図、第：３図、第４１・４及び第５図は、我々が１
’　（＋　Ｋブロモ−ター中ｌ＼ト〕ｃ・ｎＲ１部位不
・どのよう４− に挿入したかを示す。我々は、最初にＸｂａ［部位をプ
ロモーター配列の３′末端中へ挿入するためにプライマ
ー修復反応（１１）を使用した。このＸｂａ７粘着末端
を、にリリ部位に隣接するＥＣｏＲＩ部位を含有するＬ
ＥＩＦＡ（１２）遺伝子のＸｂａ■部位・＼連結した。

ＬＥＩＦＡ遺伝子の５′末端におけるこの結合配列は次
のとお松である＝５’−ＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧ−
３’３’−ＡＧＡＴＣＴＴＡＡＧＴＡＣ−５’１、Ｅ、
ＩＦＡ遺伝子上でのこの結合は、ＥＣＯＲ１部位がＰ　
Ｇ　Ｋプロモーター上のＸｈａ１部位の次にどのように
挿入されたかを示している。このＸｌ＋ａＴ−ＥＣＯＲ
Ｔ結合の使用は、発現を目的としてＰ　Ｇ　Ｋプロモー
ターの；３′末端にこれらの制限末端のいずれかを含有
する構造遺伝子をおくことを可能とする。

ＨＢｓＡｇ構造遺伝子の単離ＨＢ、ｓＡｇを暗号化している構造遺伝子を、ｐＢＲ３
２，２０ＥｃＯＲ■部位・＼クローン化したＨＢＶの全
ゲノムを含有するプラスミド（ｐＨＢＶ−７−ＩＡ）か
ら回収した。このクローンはＶａｌｅｎｚｕｅｌａらに
よって最近発表された方法（１４）及び（１５）と同様
の方法で得た。

この構造遺伝子は二つの点で修正した。

（１）ソノ一つは、最初のＡ’ｌ’Ｇメチオニンコドン
の前に直接独自の制限部位を導入した点であ峠、（２）
他の一つは、ＨＢｓＡｇ遺伝子の末端に位置１゜たＨＢ
Ｖ　　Ｈｐａ　Ｔ部位をｐＢＲ３２２のＥｃｏ　Ｒ１部
位中のふさがれた末端へ平担末端結合した点である。Ｉ
（ＢＳＡｇ構造遺伝子を含有するＤＮＡ切片に対するこ
れら二つの修正は下デのように行なわれた。

＋　）　　ｐＨＢＶ−Ｔ−ＩＡ　ＤＮＡ５０１１ｇｉま
ず最初に酵素供給業者（ＢＲＬ　）の反応条件に従い２
００　μｔの反応混合物中のＨｐａＴＩ（８０単位）を
用いて消化し、１．７ｋｂのＤＮＡ切片を得た。このＤ
ＮＡ切片中では）（ＢｓＡｇの暗号化配列のだめの開始
コドンは有意なりＮＡ−末鎖（約４００　ｂｐ）の５′
末端に接近した位置にあった。このＤＮＡはポリアクリ
ルアミドゲル（ＰＡ（＋Ｅ）上の電気泳動により精製し
た。精製したＩ（ｐａｌＴ切片は次に１００μｌ−の反
応混合物ｒＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂ）中
でλエキソヌクレアーゼ（２単位）を用いて３０分間３
７℃で処理した。λエキソニクレアーゼは二重ＭＤＮＡ
を消化する５′エキソヌクレアーゼである。この反応は
ＨＢｓＡｇを暗号化し７ている配列からの「有意な一末
鎖、１　ＤＮＡの５′半分を分解し７、加えたプライマ
ーと対をなすためア／チセ／スストランドを露出した。

λエキソヌクレアーゼで処理したＤＮＡは、蛋白質を除
き、リン酸カリウ３７− ム緩衝液（ｐＨ７，４）４０ｍＭ、ＤＴＴ　１ｍＭ。

ＢＳＡ　５０μｆ／ｄ、ＭｇＣｌ、　６ｍＭ、ｄＮＴＰ
各０．５ｍＭ及びｄＡＴＧＧＡＧＡＡｃＡＴｃｏ、２ｎ
　ｍｏＩｅ（ポリヌクレオチドキナーゼにより５′末端
で１１２ｐによりラベルしたもの）を含有する反応混合
物５０μを中に再懸濁させた。この混合物は最初９０℃
で１分間加熱し、０℃で３０分分間中［２、次いで大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＩＫｌｅｎｏｗ　　切片２単位の
存在下において３７℃で３時間培養した（１６）。この
ＤＮＡポリメラーゼは、加えたプライマーにより始動さ
れたＤＮＡを合成し、３’−ＯＨ末端を有する一本鎖Ｄ
ＮＡを分解し、従って平担末端のＤＮＡ分子をつくった
。次いで生成し、たＤＮＡは蛋白９ｒを除き、ル応混合
物１００ｔ１を中で）（ＢｓＡｇ遺伝子内に位置する部
位でＸｂａ（（４５単位）を用いて消化し、ＰＡＧＥに
より分画した。ＨＢｓＡｇ遺伝子の最初の３０コドンを
含−：３８− 有する９１塩基対のＤＮＡ切片をオートラジオグラフィ
ーで検出した後単離１−だ（分画Ａ）。

ｔｌ　Ｈｓ　Ａ　ｇ遺伝子に対し直接５′の位置にある
独自の制限部位をつくるために、我々は、ＥＣｏＲＩ部
位に位置する配列：ＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣ＋ＡＣＧＴＣＴ’ＦＡＡをもつ合成１）ＮＡ切片を含有するプラスミドｐｓＲ３
２２（＋）ＮＣＶと呼ぶ）の誘導体を利用した。この合
成１）ＮＡ配列の中へＴ’ｓｔ’１部位を導入する。

最初にｐＮＣＶ　Ｔ）ＮＡ　　１０μ２を混合物１００
μノ中のＰｓｔｌ酵素２４単位で切断し、次いで上記の
ようなル応渭、合物５０．ａノ中の大腸菌ＤＮＡ　　ボ
１１メラーゼＫｌｅｎｏｗ切片２単位で８℃において１
時間処理した４、このＤＮＡわ：リメラーゼ処理によっ
て、ＰＳｔＩ消化によりつくられて３′でぶらさがって
いる４つの塩基対を除去し、完全なＥ　ｃ、。

ＲＩ制限部位を有する平担末端のＤＮＡを残した。

このＤＮＡはｐＢＲ３２２の複製のオリジンを含有する
切片Ｂを与えた。上記のように調製した平担末端のＨＢ
ｓＡｇ遺伝子切片〜を切片一旦のＥＣｏＲＴ部位に連結
した。これを３つの切片連結において行ない、プラスミ
ドｐＡｓ　９４をつくった。

第三の切片（切片旦）は次のようにして調製した。

２）　プラスミ）”ｐＨＢＶ−Ｔ−ＬＡからのＨｅｓＡ
ｇ遺伝子を）ＩＢｓＡｇ遺伝子の末端にある部位で）ｌ
ｐａ■を用いて切断した。このＨｐａＩ部位は、あらか
じめＤＮＡポリメラーゼＴ　Ｋｌｅｎｏｗ　切片で満た
したｐＢＲ’３２２のＥｃｏＲＩ部位に連結した（１６
）。

これは、ｐＢＲ３２２の誘導体をサブクローニングしｐ
ＡＳ　４２を生成することによって完成した。

このプラスミドはＸｂ＋ａ　Ｔ　（コドン３１で切断す
る）及びＢａｍＨＴ　（ｐＢＲ３２２のＦ；Ｃ０ＲＩ　
部位から３７５塩基対を切断する）で切Ｈ１ｉ　Ｌ、、
１（ＢｓＡｇ遺伝子の大部分、）（ＢｓＡｇ遺伝子の末
端に約１５０の塩基対を含有するＤＮＡ切片及びプロモ
ーター／オペレーター及びテトラサイクリン耐性遺伝子
の最初の２００塩基対を生成させた。

ＸｂａＪ及びＢａｍＨＩの境界を有するこのＤＮＡ切片
ＣをＰ　Ａ　（＋　Ｅによって単離し、上記の３つの切
片の結合に使用してプラスミドｐＨ８９４を得た（第六
図）。

酵母菌中で異種遺伝子の発現を成功させるためには、適
当なプロセシング（ポリアデニル化）及びその転写の輸
送を回部とする１）ＮＡ配列をもつ遺伝子末端の転写が
必要である。

ルカリ性ホスファターゼはＢｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｐ、
５ｅａ−ｒｃｂ　Ｌａｈｎｒａｔｏｒｉｅｓ６−ら購入
した。ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｐｎｏｗ切片）はＨｏ
ｅｈｒ　ｉｎｇｐｒ　−Ｍ４１− ａｎｎｈｅｉｍから購入ｌまた。Ｔ、ポリヌクレオチド
キナーゼ、ＡＴＰ及びデオキシヌクレオシド三リン酸ｄ
ＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰはＰＬＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。その他のＤＮＡ制限
酵素及び代謝酵素はすべてＮｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉ
ｏｌａｂｓから購入し、、た。Ｃｒ−”Ｐ：）ＡＴＰは
Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃ０ｒｐ、から購入した。ＤＮＡ制
限及び代謝酵素は各製造業者によって記載されていると
おりの条件で使用した。

大腸菌（１７）及び酵母菌（１８）並びに大腸菌の形質
転換体（１９）及び酵母菌の形質転換体（２０゜２１）
ｈ・らの共有結合的に閉環した環状プラスミドＤＮＡの
精製は前に記載されているように行なった。大腸菌のミ
ニスクリーンは前に記載されて（ハるように行なった（
２２）、。

菌株及び培地４２− すべての細菌の形質転換のために大腸菌に一１２０４株
２９４　（ＡＴＣＣＡ　３１４４６）Ｃ２３’）　ヲ使
株Ｘ’Ｖ６１０−８０を酵母菌クローニング宿主として
使用した（ＡＴＣＣ篇　２０６２２）。

ＬＢ（富）培地はＭｉｌｌｅｒ　（２４）　　により記
載されているように調製し、アンピシリン（シグマ）２
０μ９７　ｍ　’又はテトラザイクリン（シグマ）２０
μＶ／−のいずれかを加えた。

ｐＢｌ（５）：Ｈ）０μｆを反応容１１５００μ！中の
Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＴＩで徹底的に消化し、次いで１パー
セントアガロースの分度用アガロース（Ｓｅａｔ　Ｋｅ
ｍ）ゲル上で電気泳動（−だ１．３．１ｋｈの（Ｔｉｎ
ｃｌＴ１１挿入部を工千ジウト付着ゲルから切ね取り、
電気溶離しく２５）、緩衝溶液を飽和させたやト溶−４
１のフェノール及びクロロホルムで２回抽出し、エタノ
ールで沈殿させた。再懸濁させｆｃｌ）ＮＡ　切片の部
分を分割し、異なる制限酵素で切断し、第１図に示Ｅ７
た部分的制限地図會得た。

精製した３、］ｋｂの挿入部３０．１’を５ａｕ３Ａで
切断し、次いで６パーセントアクリルアミドゲル上で処
理した。２６５　ｂｐ及び］　４１　ｂｐ　に対応する
切片を上記と同様にして電気溶離により分離精製した。

次いで各ＤＮＡｇ団の１）ＮＡ配列の分析を行なったＣ
２５）。

このＤＮＡ配列の部分を第２図に示す。ＰＧＫ構造遺伝
子のＮ−末端アミノ酸に対応するアミノ酸をＴ）ＮＡ配
列の上方に示す。

ＰＧＫ　５　’プロモーター領域への制限都立の挿入妃
列５’ＡＴＴＴ（）’ＴＴ（）ＴＡＡＡ３’を有する合
成オリゴヌクレオチドを標準的な方法で合成した（２６
）。

［γ−３２Ｉ）　）　ＡＴＰ　２０　ｎμＣｉを同時に
含有する反応混合物２０μを中のＴ４ポリヌクレオチド
ｌＯｍ位を使用してこのプライマー１００ｎｆｉ５’末
端でラベルｌ、　：ｊ。ＰＧＫ構造遺伝子配列のすぐ前
にぐるＰＧＫの５′−側面を有するＤＮＡ中・＼ト；ｃ
ｎＲＩ制限部位をおくために、多段階プロセスにおける
第１段階であるように設計されたプライマー修復反応に
おいて上記のラベルしたプライマー溶液を使用し７た。

この多段階プロセスを以下で説明する１、。

段階１（第３図）：う９　ｂｐ　Ｘｂａ　Ｔ〜Ｓａｕ：（Ａ　ＰＧＫ片の
ブライマー修復Ｊｖ応及びクローニングｐＢＩ＋００４ｇをＩ（ａｅｌｌｌを用いて完全に消化
し、次いで６パーセントポリアクリルアミドゲル上で処
理しん１．エチジウム付着ゲル上の最も上方の帯（Ｐ（
Ｈ（プロモーター領域を含有する）ｄ上献と同様に市、
気溶離［７た。ＤＮＡのとの１２００−　・１５− ｂｐのＦ（ａｅｌｌ１片１Ｈｉｎｄｌｌで制限し、次い
で６パーセントアクリルアミドゲル上で処理した。６５
０ｂｐの帯を電気溶離で単離した。ＤＮＡ　５μｇ　が
単離された。ＤＮＡのこの６５０　ｂｐのＨａｅｌｒｌ
〜Ｈ１ｎｄＩ′Ｔ片をｄＩＨ，０２０μを中に再び懸濁
させ、次いで上記のリン酸化プライマー溶液２０ＩＪｔ
と混合した。この混合物をフェノールクロロホルムで１
回抽出し、次いでエタノールで沈殿させた。

乾燥したＤＮＡとＨ，０５０μｌ中に再び懸濁させ、次
いで沸騰水浴中で７分間加熱した。次にこの溶液をドラ
イアイス−エタノール浴中で急速に冷却しく　１　’０
〜２０秒）、次いで氷水浴に移し、た。この溶液に、ｌ
０ＸＤＮＡポリメラーゼＴ緩衝液（Ｈｎｅｈｒｉｎｇｐ
ｒ　Ｍａｎｎｈｒｉｍ）１０ｔｔ／、前につくった各々
のデオキシヌク１／オシド三り７　ｆｆ４　（ｄＡＴＰ
　。

ｄＴＴＰ　、　ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ）が２．５ｍＭの
溶液１０μｌ、ｄＩＨ，０２５μ！及びＤＮＡボリメラ
′４６− −ゼｌＸＫｌｅｎｏｗ切片５単位を含有する溶液５０μ
ｌを加えた。乙の反応混合物１００μノ、を：つ７℃で
４時間培養（−２だ。次いでこの溶液をフェノール−ク
ロロホルムで１回抽出し、エタノールで沈殿させ、凍結
乾燥法で乾燥［２、その後５ａＬ１３Ａ１０単位で徹底
的に開眼した。次にこの溶液を６パーセントアクリルア
ミドゲル上で処理した。大きさ３９ｂｐに対応する帯を
ゲル力・ら切り取り、次いで上記の電気溶離により単離
１．た。この３９ｈｐの帯は一つの平担末端と一つの３
ａｕａＡ粘着性末端を有する。この切片をクローン化し
修正ｐＦＩＦ”ｔ　ｒｐ　６９ベクター（１１）とした
。ＩＯμｆのｐＦＩＦｔｒｐ　６９をＸｂａ）を用いて
綿状化１１．７ｆ、ノール−クロロホルムで１回抽出し
、その後エタノールで沈殿′させた。各＾のヌクレオシ
ド三リン酸２５０μＭを含有するｌ（応混合物５０μｍ
中のＤＮＡポリメラーゼＴ　Ｋｌｅｎｏｗ切片を用いて
汐りＩ粘着性末端を充たし二そ１、とのＩＪＮＡをＢａ
ｍＨｌで切断し、次いで６パーセントアクリルアミドゲ
ル上で処理した。このベクター切片を電気溶離によって
ゲルから単離し、次いでｄＩＨ，０２０μｌ中１（再び
懸濁した。このベクター２　Ｑｎｆを上で合成【７た３
　９　ｈｐの切片２０　ｎｆ　　と室温で４時間連結し
た。連結混合物の５分の１を使用して大腸菌菌株２９４
　’ｉＬＲ＋２０１１９　／ｍｌ　ａｍｐｍｐ−レート
上質転換しアンピシリン耐性にした。

形質転換体からのプラスミドは迅速スクリーン法（２２
）により調べた。１つのプラスミドｐＴ）ＧＫ−３９（
３６）を＾１１列分析のために遣損した。このプラスミ
ド２０μ２をχ±ｇＴで消化し、エタノールで沈殿させ
、次いで細菌性アＩｌカリ性ホスファーゼ１０００単位
を用いて６８℃で４５分間処理］た。このＤＮＡ、ｉフ
ェノール−クロロホルムで３回抽出（１、そケ）後エタ
ノールで沈殿させた。次いで脱リン酸化末端を〔δ−”
Ｐ　）ＡＴＰ　２００　ｔｒＣｉ及びＴ、ポリヌクレオ
チドキナーゼｌＯ単位を含有する反応混合物２０μを中
でラベルした。このプラスミドをＳａｌ　Ｉで切断し６
パーセント　アクリルアミドゲル上で処理した。

このラベルした挿入部の帯をゲルから単離し化学的分解
法により配列を決めた（２５）。このプロモーター片の
３′末端におけるＤＮＡ配列は予期されたとおりであっ
た。

段階２（第４図）３１２　　ｂｐ　　ＰｖｕＴ　〜ＥｃｏＲＩ　　Ｐ（＋
にプロモーター切片の構成ｐＰＧＫ−３９（第３図）２５／ｊｆを５ａｌｉびびＸ
ｈａＴ（各５単位）を用いて同時に消化し、次いで６パ
ーセントゲル上で電気泳動した。；つ９ｂｐのプロモー
ター片を含有する３　９０　ｂｐ　の帯を電気溶離によ
ね単離した。この再懸濁ＤＮＡを４９− ３ａｕａＡで制限し、次いで８パーセントアクリルアミ
ドゲル上で電気泳動させた１この３９　ｂｐのＰ（）Ｋ
プロモーターの帯を電気溶離により単離１−Ｐ（＋にプ
ロモーターの５′末端の３９ｂｐを含有していた。

し、次いで６パーセントゲル上で電気泳動させた。

ＤＮＡの０．８Ｋｂｐの帯を電気溶離により単離し、次
いでＳａｕ　３Ａで制限し２．６パーセントゲル上で電
気泳動させた。Ｐ　（、）　Ｋプロモーター（第１図）
からの２６５　ｂｐの帯を電気溶離により単離［７た。

次にこのＩ）ＮＡを上＆Ｆからの３９　ｈｐのプロモー
ター切片と室温で２時間連結させた。連結混合物をＸｂ
ａＴ及びＰｖｕ　７で制限（、次いで６パーセントアク
リルアミドゲル上で電気泳動させた。

この；う１２ｂｐのＸｈａ　Ｉ　−Ｐｖｕ　■　制限切
片を電５０− 気溶離により単離し、次いでｐＢＲ３２２［曲に単離さ
れた１６２のＰｖｕＪ−Ｐｓｔｉ制限切制限切片喪失の
’）　２０　Ｏｎｆ及びｐＬＥＩＦｔｒｐＡ２０ａｔか
ら前に単離されたＸｂａ　Ｉ−ｐｓ　ｔ　ＩＬｅｌＦＡ
ＣＤＮＡ遺伝子２００　ｎｆを含有する連結混合物に加
えた。この３−ファクタ一連結混合物を使用して大腸菌
菌株２９４を形質転換しテトラサイクリン耐性とした１
、形質転換体コロニーをミニスクリーンし、コロニーの
一つ、ｐＰＧＫ−：（１１０を、ｐＢＲ３２２をベース
とするベクター中でＬｅＩＦＡ遺伝子に融合したＰＵＫ
５’−側面をイＪする１）ＮＡの３０４１）ｐをもつも
のとして単離し７た。ＬＰＩＦＡ遺伝子の５′末端は次
の配列：　５’−ＣＴＡｎＡＡＡＴＴ（”−：３′を有
し、従って、この配列中−＼のＰ（）Ｋプロモーター切
片からのＸｈａＴ部裕の融合はＸ　ｌ）　ａ　Ｔ部位′
＼のＩ；ｃｎｌ’（Ｉ部位の付加を可能と１）、。ｐＰ
（＋に−３００はこのようにＰｖｕｌ〜ＥｃｎＲ１切片
中で単離されたＰ（）Ｋプロモーターの部分を含有する
。

段階４ −ター切片の構成ｐＢｌ　１０ＡｆをＰｖｕｉ及びｈＥｃ　ＯＲＴ　で消
化し、６パニセントアクリルアミドゲル上で処理した。

Ｐ（＋ｉ（５’−側面を有するＤＮＡからの１．３Ｋｂ
のＰｖｕ　Ｔ　〜Ｅｃｏ　ＲＴ　　Ｔ）ＮＡの帯を雷、
気溶離により単離し、た。１０μｍのｐＰＧＫ−’（０
０をＥＣ０ＲＩ及びＰｖｕ７で消化し、消化混合物を６
パーセントゲル上で電気泳動させた後、３］２ｈｐのプ
ロモーター切片を電気溶離により単離した。５μｔのｐ
ＦＲＬ　４をＥｒ、ＯＲ１■で切断１１、エタノールで
沈殿させ、次いで細菌性アルカリ性ホスファターゼで６
８°で４５分間処坤１．．　；＃ｏ１）ＮＡをフェノー
ル／クロロホルムで３回処理し、た後、エタノールで沈
殿させ、そしてｄｌＨ，０２０８１中に再び懸濁させた
。このベクター２００ｎｆをｐ　Ｐ、ＧＫ　−３０，０
からの３１２ｂｐのＥＣ０ＲＩ〜Ｐｖｕ　ＴＴ）ＮＡ　
１００　ｎｆ及びｐＢｌから（７）ＥＣＯＲＴ　−Ｐｖ
ｕ　Ｔ　　ＤＮＡ　１００　ｎｆと連結させた。この連
結混合物を使用して大腸菌菌株２９４を形質転換しアン
ピンリン耐性とした。ＡｐＲコａニーの一つからｐＰ（
（Ｋ　−１５００を得た。このプラスミド（ゴ、ＤＮＡ
のＩ’：　ＣＯＲＩ　〜Ｅ　ｃ　ＯＲＴ片又はＨｉｎｄ
ＩＩＩ〜Ｅ　ＣＯＲＴ片として１５００ｂｐの１）（＋
Ｋ　プロモーター切片を含有Ｅ７ている。

２０μｔのｐＦＲＬ４を即り１１１−及び８１口で消化
１２、次いで６パーセントアクリルアミドゲル上で電気
泳動させた。構造遺伝子の部分及び：Ｓ′非ｆＡＪか！
領域を含有するＴＲＰ１遺伝子からの１！３０１１１）
の切；４（２８）をゲルスライスから電気溶離に５３− より単離した。これは酵母菌ターミネータ−制限切片で
ある。

１０μｆのｐＨ８９４をＨｉｎｄｌｌｌ及びＦ、ｃｏＲ
Ｔで制限Ｌ、６パーセントアクリルアミドゲル上で処理
した。ＨＢｓＡｇ遺伝子を表わす８７０　ｂｐの帯を電
気溶離により単離した。

ＨｂｓＡｇ遺伝子３ａｔをＴＲＰ］ｒターミネータ−」
１μ？と２時間室温で連結させた。次にこの溶液をＥＣ
０ＲＩ及びＢｇｌｌで制限１２．６パーセ／ドアクリル
アミドゲル上で！、電気泳動せた。、５’−ＨＢｓＡｇ
／ＴＲＰ１−：（’ＤＮＡ切片に対応する１、１ｋｂの
帯を電気溶離により単ｍｌだ。５０１ｉｔのｐＰＯＫ−
１５００をＨｉｎｒｌｌＴｌ及びＥＣ０ＲＩで制限１．
、、次いで６パーセントアクリル°アミドゲル上で電気
泳動させた。１．５ｋｂｐのＰＵＫプロモーター切片を
電気溶離により単１１１ｊ、　Ｌ　７”ｒ−０１０μｆ
のｐＣＶ　］　：（ｆ　Ｆｌｉｎｄｌｌｌ及びＢａｍＨ
ｌで制限１、５４− 次いで１パーセントアガロースゲル上で電気泳動さぜた
。大きなベクター切片を電気溶離により単離した。０．
９＃ｆのｐＣＶ　１３　（Ｈｉｎｄ　ｌ’ｌ　〜Ｂａｍ
ｆ（Ｉ）、　　’Ｉ　　　５　０　　ｎｔ　　の　”　
　ｎｄ　ｍ　〜　ト：ｃｏ　　ＲＩ　　　Ｐ（＋にプロ
モーター切片及び１００ｎｌＦのＥＣ０ＲＩ〜１１ｇ１
１１　　ＨｈｓＡｇ　／ＴＲＰ　１融合物を１６℃で１
２時間連結させ、次いでこの連結混合物を使用し、て太
腸閑菌株２９４を形質転換させアンシビリン耐性とした
。多数の形質転換体のミニスフ＋１−フ分析により、い
くつかの：：Ｊ　Ｏ、：ｌ−−はプロモーター）ＩＢｓ
Ａｇ構造遭伝子−ＴＲＰＩターミネータ−を有する適当
なベクター構成を含有１．ていることが示されプこ。こ
れらのプラスミドのいくつかを使用して酵イサ菌をＬｅ
ｕ＋に形質転換させた。

標準的方法（’２０．：２１）を使用する形少ｆ転換の
ために調製し、たＹＰＤ（２９）中で酵母菌菌株ＸＶ６
１０−８０に生育し、最小Ｙ　Ｎ　Ｂ　（−１ｅ　ｕ　
）上でプラスミドｐｃＶ１３又はｐＹｅＨＢｓを使用し
て形質転換しロイシンプロトトロピー（Ｌ　ｅ、　ｕ　
　）とｉ−だ（菌株及び培地参照）。形質転換体コｏ　
、＝−は次のように１〜て旧３ｓＡｇ放射ａ矩疫検定法
（Ａｂｂｏｔｔ　　Ｌａｂｓ）のために調製した。

（１）　　、　Ｙ　Ｎ　Ｈ，ａイシン中：う０℃で通気
しながら酵母菌ＩＱｗｊを生育し６６０ｍμでの吸光度
’１ｉ、。

とする。

（２）培養物を５分間５０００　ｘ？で回転する２浮遊
物雀は捨てる。

（３）　ＰＨ８（ｐＨ＝７のリン酸ナトリウＡ２０ｍＭ
プラスＮａｃ１０．１４ｍ）ｆｉ０１１μ！中に細胞を
再び懸濁させ、殺菌ガラス玉（０，４５〜０．５０ｒａ
ｎ）１．５２を力１１え、５分間（氷の上に］す？Ｍ；
的に置くことにより低τ＾、′に保って）歓ｌ拝すλ。

（４）　　＃胞抽出物％７５０００　ｘ　ｆで゛う分１
ｉｊ　４℃で回転させる。標準放射線免疫評価のため細
胞抽出物２００μｌを使用する。細胞抽出Ｉｌｉ′／君
ＰＢＳ′ｆｒ使用して希釈１．た。

の証拠ＹＮＢ−１ｅｕ　最小培地でｐ　Ｙ　ｅ　ｒ（Ｂ　Ｓ及
びｐＣｖ１３を使用して酵母菌菌株ＸＶ６１０−８（”
を形質転換し７０インンブ口トトロビーとしだ。このプ
ラスミドの存在は、ａイシン孕Ｈｙ　（Ｙ　Ｐ　ｉ−）
　）を有１、丁５・いプレート上でこれらの９１）　面
を生育させて二ＴＯニーとし２、続いてＷｉ、ｌ！して
ＹＮ［［−ロイシン）プレート（２パーセントアガー）
とすることに」：り証明１．、ｆｒ。ＹＥＰｒｌ上で生
育またコロニーの１ｊＣ）〜６０バー＋ントはＹ　Ｎ　
Ｂ　−ｌ　ｒ　ｕ　−トで生育１欠。このことけ酵ｎト
菌＋７）　５Ｑ−６（）ノζ−セントがｐ（’ＶＩ３Ｖ
はｐ　Ｙ　ｐ　ＨＢ　Ｓ　’（ｉ”　含’；ｆＣＬ　”
＝コト’にネすｎｌ＋ｒ・ｕ　復帰實異体はＹＮＢ−ｌ
ｅｔ＋　上ｅの−ｉｉ　　７　−− すべてのコロニーの生育を示すことに注目すべきである
。酵母菌中でのＰＣＶ１３安定性はｐＹｅＨＢｓ　　よ
りも大きくは・なかった。このことはＨＢ　ｓ　Ａ、　
ｇ　の生育は（後に検討するように）細胞に圧力を及ぼ
してコピー数を制限することはないことを示唆１−でい
ろ。形質転換体酵母菌を液体ロイシン選択培地（ＹＮＢ
−１ｅｕ）中で生育し、次いでガラス玉懸濁物と共に強
＜Ｎ）拌することにより破壊開口した（後述）。放射線
免疫検定法を使用して；４゛明な酵母菌抽出物中のＨＥ
ｌ　ｓ　Ａ　ｇ　　生産を評価した。２２℃ｍ　）４Ｂ
ｓＡｇ％子はＨＢｓＡＶ・−ツマ−単独よりも約１０［
１０倍も抗原活性であｈ１我々はこの粒子に対抗して調
製される抗体を使用［７た。Ｆｌｉ￥母菌抽出物につい
てのＲＩＡけ、−・ｙ計画中ｒ４）ｐＹｒＨＢｓからの
）ＨｌｓＡｇ　の生産を示す１、「ｐＣｖ１３形質転換
゛博Ｉｔ１菌抽出物けｉＴＢｓＡｇ抗坤物質を生産１．
ない。〕５８− 酵母菌中の［（ＢｓＡＨの特性付け１）　上述のように調製し７た酵母菌抽出物２００Ｚ’
　Ｚ　７（、トリス−４１Ｃ１ｒｐＨ７，４）２０ｍＭ
中サフサツクロース５〜２０パーセント／Ｖ）、Ｅｌ）
ＴＡ　Ｏ，５ｍＭ及びＮａＣ１０，５Ｍから成る線型密
度勾配ｇｋ　５　ｍｌの上部に層状におき、次いで５Ｗ
５０．１０−ター中４５．００Ｏｒｐｍで２時間遠心分
部した。分画ｆ年め、放射線免疫評価法によりＨＢｓＡ
ｇを評価し一／、、。

２）　土と同じ源からの抽出牛７１２　（１０μ／ヲト
リスーＨＣｌ　（ｐＨ７，４）　２０　ｍＭＸＥ’ｒ）
ＴＡ　Ｏ，５ｍＭ及び（”５ｃｌ（密度１．２　ｙ　／
　ｒｒ　）を含有する溶液５　Ｍ（の上部に層状におき
、次いで５Ｗ５０．１０−ター中４５．ｎ００ｒｐｍで
７０時間遠心分離した一、１ｌＨｓＡｙを上１ホ／７）
ように評価１２、ＣｓＣｌ　の比重を各グラジェント分
画の屈折率を配録することにより決定した。

肝炎表面抗原は１合成され、粒子（２２０ｍ粒子）とし
て肝ａ胞から分路される。上記の構成において、成熟構
造遺伝子プラスいくつかの３′非翻訳配列を表わす暗号
領域のみが含１れていた。我々は酵母菌細胞内肝炎表面
抗原上ツマ−の粒子の性質を評価した。この目的のため
、ＨＦｉ　ｓ　Ａ　ｇを含有する酵母菌細胞抽出物を沈
降速度分析及び沈降平衡分析にかけた。第７図に示・ず
よう１（、酵州、菌細胞中で合成きれた肝炎表面抗原は
、本物の゛２２ｎｍ粒子ケ分泌［２ている細胞系統（Ｐ
Ｔ、ＣＷ　Ｉｌｌ　）から得られる［２２　ｎｍ粒子−
１の形のＨＲｓ　Ａ、　ｇの沈降速度と実や的に同じ沈
降速度な・もつ。

酵Ｒｆ菌中で合成さ第１るＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇは、沈降
平部１公析により７ｔＬ定されるように、浮陽糸・度１
．　］　８　ｆ　／ｍ３をもつ。この値、は、感染した
肝細胞中で合成されたＨ　Ｈｓ　Ａ、　ｇの値よりもわ
ずかに小さｉｎ　＋）「ククートンの製造本町細１１１に記載のようにして生産しまた［ｌＢｓＡ
ｇを成分２−する、本発明のワクチンは、該１（Ｒｓ　
Ａ、ｇ全適当なＱｌζ形薬と混合し７て、公知のｈ法に
従って１トセ造することができる。適当な賦形薬にｒｌ
、例えＶ１゛、塩溶希・、神々の公知のアジュバント、
当業界においてウィルス感染を防止するためにオＩＪ用
されるｍ１１成物中で使用されると認められるその他の
添加剤が倉ｌれる。そのよらなワクチンは、宿主に封子
Ｚ）効果的な投句のだめに使用されるワクチンを製造す
るために、有効邦・り該）（１：ｌ　ｓ　Ａ　ｇ及び適
当Ａ、Ｖ（ＩＩ　ｌｐｒ　　ａｎｔｉ　　ｒ−Ｌ　　ｔ
ｉ’ｒｉｐ山ｎａｎ　、１．１ｎｉｖｐｒｓｉ　ＩｙＰ
ａ＋ｆ　　ｌ’ｒｆ゛ｓｓ　、Ｈ；＋Ｉ　ｔｌｍｏｒｅ
　、Ｉ　　’Ｊ７８　、ｔｉｅ照３、この文献は、「ワ
クチンの製造（・ζ一ついてそ°の背城なさらに詳細（
Ｌｒ：知るための参照文献としてここに記載しである。

６１　− 参照文献１、　　　Ｆｌｒｏａｃｈ、Ｊ、Ｒ，，５ｔｒａｔｈｅ
ｒｎ、Ｊ、Ｎ、、ａｎｄＨｉｃｋｓ、、’１．　Ｈｌ（
Ｉｅｎｅ　８．　］　２　＋−１３３Ｎ９７９）。

２、　　　　　Ｌ＋ｔｚｋｉｎ　　、Ｈ，、ａｎｄ　　
　ｒｌａｒｈｏｎ　　、Ｊ、　　Ｉ’ｒｎｃ。

４９１　（’　＋　９７７　）。

３、　　　　ＣＩ＋１ｎａｕｌ＋、へ、　Ｃ、＋　　　
ａｎ　（１（、’ｒ　ａ　　ｒ　Ｆ、’　［１ｎ　　＋
　　Ｊ　。

０ｅｎｃ・５　　ｌ１ｌ−１２Ｆｉ（１（１７９）。

４、　８ｉｎｎｐｎ、Ａ、、　Ｈｉｃｋｓ、Ｉｌ、　ｌ
−１，、；Ｉｎｄ　１ｉ”ｉｎｌ＋　。

７　Ｆｌ　、　　＋　９２９　１９：３３　（］　９７
　ｒ＜　）。

５、　　　Ｈｉ　ｌ　ｚｒｑｎＨＩｎ　、　Ｉｔ、　　
へ、、　　Ｃ１ａｒｋｅ、Ｌ、、　　ａｎｒｌｌ　２（
１’／　３　（＋　９８０　）。

ｒｉ、　　　　１１ｒ−ｓｓ　　、　　Ｂ、’、　　　
ｌうｎ１ｌｐｔ１ｘ　　、Ａ、、　　　ａｎｒｌ　　　
Ｋｒｕ　ｇｐｒ。

６２− Ｊ、　Ａｄｖ、　ｇｎｚｙｍｐ　　Ｒｅｇｕｌ、　　７
．　１４９−１６７（１９６８）。

７、　　Ｈｎｌｌａｎｄ、Ｊ、、］、、ａｎｄ　　Ｈｏ
１ｌａｎｄ、Ｊ、Ｐ。

Ｈｉｎｃｌ＋ｅｎ−＋ｉｓ　ｔｒｙ　　Ｉ　７．　４９
００−４９０７（’　＋　９７８　）。

８、　　）（ｎｓｔｉａｎ、に、Ａ、、Ｌｅ＋ｎ１ｒｅ
、ＪＪ＋１．、Ｃａｎｎｏｎ。

Ｌ、　ｈ：、、　ａｎｄ　Ｈａ　Ｉ　ｖｏｒ　ｓｎｎ　
、　Ｈ，Ｏ，’ｌ’ｒｎｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、１．１．８．Ａ、７７、
　４５０４−ｌ＋５０ｓ（１９８０）。

９、　　　　Ａｈｓｌｒａｒｌｓ　　　ｎ　　書　　ｐ
ａｒｔ（’Ｉ’ｓ　　　ｐｒＭ’５ｒｌｌｌＰ（１旧　
　ｔｈｅ　Ｉ　　ｑＲｌ　　ｍｐｐｔ　ｉｎｇ　ｎｎ　
　Ｔｈｅｒｓ４ｏｌｐｃｕｌ＋ｒ　　Ｂｉｏｌｏｌｒｙ
　　ｏｆ’　　Ｙｅ；＋５ｔ（ＡｕＨｒｕｓｔ　　１　
＋　−Ａｕｎｔ＋ｓｔ　　＋　６．　　Ｉ　！＋）’　
Ｉ　）（シ０Ｉ（Ｉ　　　５ｎｒｉｎ）＝　　Ｈ旧　＋
１ｏｒ　　　’Ｌａｂｎｒａｌｎｒｙ。

ｔ’ｒ＋　Ｉ　ｃｉ　　　ξ；ｐｒ　　ｉ　ｎＦ！　Ｈ
ａｒｈｏｒ　　ｌ、　ｔｑ、ｅｗ　　Ｙｎｒｋ　。

１　（’）、　　ｌｈ；ｕｎｌ−ｏｎ　、　Ｐ、　Ａｎ
ｎ、　ｌイ、ｐｖ、旧ｎ　ｔ：　Ｉｅｉ。４４゜”１１
３６：う８　（１で）７５　）。

１１、　　　ｔ）ｏｅｄｃｌｅｌ　、Ｉ）、　Ｖ、、　
５ｈｅｐａｒｄ、　ｒ（、Ｉ’ｖ１．。

Ｙ　ｅ　１ｖｅｒｔｏｎ　　、　　Ｅ、、　　　’Ｌｅ
ｕｎｇ　　、　　Ｄ、、　　　ａｎｒｌＣｒｐａ　、　
Ｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　１（ｐｓｐａｒ
ｃｈ８．４０５７−４０７３（１９８０）。

１２、　　　　　Ｎｎ　　　ｒｅ（ｅｒｅｎｃｅ０１３
、　　　（＋ｎｅｒｌｄｅｌ、’Ｉ）、Ｖ、ｅｔ、ａ！
、Ｎａｔｕｒｅ２８７　４１１、　　／１１６（１９８
０）。

１４、　　　Ｐ、Ｖａｌｐｒ＋ｚｕｅｌａ、ｅｔ、ａｌ
、Ｎ；ｔＮ＋ｒｅ　。

２８０．８１５−８１９．（１９’７（１’）。

−７！　２２ｆ；　（１９７９）。

１７、　　（：Ｉ；＋ｒｌ＋・、ｌｊ’＋’、”’；ｌ
ｎ’ｌ　（’ａｒｌ）ｏｎ　、Ｊ、Ｃｅ１ｌ！Ｉ　、　
９　ｌ　−９〔＋　（１９７に　）。

１８、　　　’ｌ”Ｉａｖｉｓ、Ｒ，、Ｗ、、Ｔｌ：ｏ
ｍａｓ、Ｖ、Ｃａｍｅｒｏｎ。

Ｊ、、Ｓｔ、Ｊｏｈｎ、Ｔ、Ｐ、、５ｃｈｅｒｅｒ、Ｓ
、。

ａｎｄ　Ｐａｄｇｅｔｔ、　Ｒ，Ａ、Ｍｅｔｈｎｒｌｓ
　　１ｎ１９、　　　（１１ａｒｋ、’Ｌ、、ａｎｄ　
　Ｃａｒｂｏｎ、、１．”Ｐｒｏｃ。

Ｎａ　ｔ　Ｉ　、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＬＪ、　
Ｓ、　Ａ、７２．４３６１−　／Ｉ　：（ｆｉ　５　（
１９７５）。

２（１，ｌうｅｇｇｓ　、Ｊ、１．）、Ｎａｔｕｒｅ　
　：！　７５．Ｉ　０４−１０９（１９７８）。

２］、　　　Ｈｉｎｎｅｎ　、Ａ、、Ｈｉｅドｓ　、　
Ｊ、　Ｒ，、ａｎｄＦｉｎｋ　、（Ｌ　Ｒ，Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、Ａｒａｔｌ、３ｃｉ。

ＩＪ、Ｓ、Ａ、７５．１９２９−＋９：（３ｒ１９７８
）。

２２、　　Ｈｉｒｎｂｏｉｍ、Ｉｉ、Ｃ，、ａｎｄ　Ｐ
ｏ１ｙ、Ｊ、ＮｕｃｌｅｉＣＡｃ１ｄｓ　　１（ｅｓ、
７．　　Ｉ　　ＦＩ　１　　：（−１５２３゜ソ３．　　　Ｈａｃｈｍ；＋ｎ、に、、Ｔ’１ａｓｈｎ
ｅ、Ｍ、、ａｎｄ６５− （１９７６）。

４　３　３　　、　　ｒｎｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈ
ａｒｂｎｒ　　Ｌａ１）ｏ−ｒａｔｎｒｙ、ｒ’ｏｌｄ
　　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｈｏｒ、　　Ｎ。

Ｙｌ、２５、　　　Ｍａｘａｍ、ＡＪＬ、ａｎｄ（）ｉｎｃｒ
ｔ、Ｗ。

Ｍｅｔｈｎｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｎｌ、　６５．
４９０−５ｆｉ５（＋９８０）。

２６、　　　Ｃｒｅａ、Ｒ，ａｎｄＦｌｏｒｎ、Ｔ、Ｎ
ｕＣｌｅｉＣ（＋　９８０　）。

２７、　　　　　Ｈｏ１ｖｉ　　ａ　ｒ、Ｆ　、　、Ｒ
，ｏｒｌｒｉｇｕｒ−ｚ、　　Ｒ，、ｉ：＋。

（ｌｒｅｅｎ　、Ｐ、Ｙ、、Ｂｅｔ　１ａｃｈ　、Ｍ、
Ｃ，。

１Ｔｒｖｎｅｋｒｒ　、Ｈ，Ｌ、、Ｆｌｎｙｅｒ　、Ｈ
，Ｗ、。

（１ｒｏｓ；ｌ、　　Ｙ、　Ｈ，、ａｎｄ　Ｆａｌｋｎ
ｗ、　Ｓ、Ｕｐｒ＋ｒ−２、９ｆｉ−１Ｉ　３（１９７
７）。

６６− ２８、　　　Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ、０．、ａｎｒｌ　Ｃ
ａｒｂｏｎ　−Ｊ。

Ｇｅｎｅ　　ｌ　Ｏ、１５７−１６６（１９８０）。

２９、　　１Ｊａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　　
ｆｏｒ　　ａ　　ＣｏｕｒｓｅＭｅｔｈｎｄｓ　　ｉｎ
　　Ｙｅａｓｔ　　０ｅｎｅｔｉｃｓ　　ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇ　　Ｔ−ｒａｒｈｏｒ　　　Ｌａｈｏｒａｔｏ
ｒｙ、　Ｓｈｅ−ｒｍａｎ　、Ｐｉｎｋ　、ａｒ＋ｒ！
Ｈｉｃｋｓ　、Ｃｏ１ｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂＯｒ
　、ＮｅｗＹｎｒｋ０

【図面の簡単な説明】

ｈｔ、Ａ図ｉ１，５Ｖ４０ｏＮＡｆｆｉ４Ｌ、ＶＰ−１
ｍ白’Ｐ（（７以−めの暗号領域を／メ”ぐプラスミド
ｐｓＶＲの構成を示す。第１図は、酵母菌の３−ボー７ホグ１ト１とリン酸遺伝
子の５′側面を有するＤＮＡ−＼の１Ｒ１１部位の挿入
を示寸（１第２図け、統１；Ｊ：　＋！ｉ　’（−、にス：ホグリ
ナリ／デ・曹・“コキナ〜ゼ構迄１１！ｆ′Ｉ：′子の
５′）１一端のｒ）Ｎ　Ａ配列及び側面にある＋）ＮＡ
を示す１、第３図は、Ｐ（）Ｋプロモーターに位Ｍ−８でＸｂ８１
部位を挿入し、このＸｂａ（末端及びＳａ　、ｕ３Ａ末
端を含有するＰ　（３Ｋの５′−側面を有する配列の３
９　ｈｐの切片を単離するのに使用する技術を図式的に
示す。第４図は、上記３９　ｂｐの切片、Ｐｖ１］Ｉ〜５ａｕ
３Ａからの付加的なＰ　Ｇ　Ｋの５′−側面を有する配
列（２６５ｂｐ　）　（第１図参照）及びＸｂａ■に瞬
接するＥＣｏＲＴ部位全含有する３００ｂｐ切片の構成
を図式的に示す。第５図は、第４図において構成された切片に加えて、Ｐ
（ＩＫの５１−側面を有する配列からの＋３ｎｏｂｐの
Ｉｎｄ■〜ＰＶＬＩ■切Ｗ（第１図参照）を含有する＋
５００ｂｐのＰ（ＩＫプロモーター切片（Ｉｙｒｉｎｄ
ｌ！Ｉ／ＥＣＯＲＴ　）の構成を図式的に示す、。第６図は、イ白正されたＰ（＋にプロ七−ターｉ１ｔｌ
ｓＡｇ遺伝子及び酵母菌ＴＲＪ’　１ｍｍ壬子ターミネ
ータ−領域を含有する、酵母菌中ｒの肝炎表面抗層のた
めの発現ベクターの構成苓・図式的に示す。第７四Ａは！Ｗ、母酌が年産した［（ＢＳＡｇと２２ｎ
ｍ粒子のスクロース密度勾配沈降の比較を示し、第７図
１うけ両者の対応するＣｓＣ１密度勾配遠心分離を示す
１、時計出願人　ジエネンテノク・イン＝１−ボレーテッド −ｎ　Ｑ　− −１０’　　　　　−Ｉ　　ＭＥＴ５’−−−−−−−−−一胚ＴＣＡＴ触ＧＧ触ＧＴ蔀Ｔ
ＴＡＴＣＴＡＣＴＴＴＴＴＡＣ触Ｃ思ＴＡ↑靜触ＣＡ　
ＡＴＧメツλン、？。ＴＣＴ　　ＴＴＡ　　ＴＣＴ　　ＴＣＡ　　ＡＡＧ　　
ＴＴＧ　　ＣＴＣＧＴＣＨＢＶ　ＤＮＡ丁　続　補　正　書　（自発）昭和５７年１２１Ｆ）２９日特許庁長官　　若杉和大殿５、補正命令の日付　　　　な　　し７、補正の内容（１）Ｈ・・紳依給６７頁り９〜１１行に「第３図は、
・・・・・・・・・を示す。」とあるを削除する。（２）１０Ｉ＠６９頁紀８行とぎ！’　９４＝の間に以
下の文を加入する。「泥８図は、５Ｖ４０ＤＮＡを含有し、ＶＰ−１蛋白質
のだめの暗号領域を欠くプラスミドｐＳＶＲの構成を示
す。」（３）図面の浄書（内容に変ｐｆｘし）を別紙のとおシ
１ｉｉｊ正する（本袖正は図面の浄書でｈシ、同時（Ｃ
，全図を通じて連続奇岩となるべく豹正し且つムＮ図及
び第２図の説明文字を削除したものでろ＃）まず）。以上

Claims

【特許請求の範囲】１、酵母菌宿主菌株中での枦製及び表現型の選択が可能
なりＮＡ発現ベクターであって、該ベクターは、ぴ母菌
宿主菌株に対して適合性を有するプロモーター及びＢ型
肝炎表面抗原を暗号化しているＤＮＡ配列を含有し、該
配列は、該ペクト肝炎表面抗原を生産するべく発現され
るように該プロモーターの制御下に配置されていること
を特徴とするＤＮＡ発現ベクター。２、プラスミドｐＹｅＨＢｓ。３、　　’ｔ！ｊ許情求の範囲第１項記載のＤＮＡ発犯
ベクターを用いて形質転換された算母蘭を株。４、　１ｅｕ２　栄養要求変異種酵母菌菌株を形質転換
することにより得られる特許請求の範囲第３項記載の酵
母菌菌株。５、特許請求の範囲第２項記載のプラスミドを用いて形
質転換された酵母菌菌株１．。６、菌株ＸＶ６１０−８Ｃを形質転換することによって
得られる特許請求の範囲第５項記載の酵母１’／Ｎ１ｍ
株。７、特許請求の範囲第３〜６項のいずれか記載の形質転
換された酵母菌を含有する発情培養物。８、感染性のヒトにＢ型肝炎ウィルスに対する免疫原性
を与えるために使用するのに適した粒子の形のＢ型肝炎
表面抗原の製造方法であって、ａ　）　’　％′４＠菌
宿主・嶌株中での複製及び表現１型の１′纜４Ｒが可ｈ
′ヒなりＮＡ転移ベクターを用意り７、ｌ・）　酵母菌
宿主菌株に対して適合性を有するプロモーターを含有す
るＤＮＡ切片を用意ｃ）　　Ｂ型肝炎表面抗原を暗号化
しているＤＮＡ、切片を用意し、ｄ）　段階ａ）、ｂ）及びＣ）の切片を適当な位置にお
かれた翻訳開始信号及び翻訳停止信号とともに組立てて
複製可能な発現ベクターを生成させ、段階Ｃ）の該配列
は分離したＢ型肝炎表面抗原を生産するべく発現される
ように該プロモーターの制御下にあることを４！徴とし
、ｅ）　段階ｄ）のベクターを用いて酵母菌菌株を形質転
換させ、「）　該酵母菌形質転換体中に該１３型肝炎表面抗原が
生産されるまで該酵母菌形質転換体を通常の発酵条件下
で”・生誓し、ぞ１．てｇ）　該Ｂ早肝炎表面抗紳を分
離した粒子の形で回収する、ことを特徴とする方法。９．４　　段階Ｃ）のＤＮＡ配列が、その暗号鎖の５′
末端から順に、ＡＴＧ翻訳開始コドン、Ｂ型肝炎ゲノム
のＢ型肝炎表面抗原を暗号化しているヌクレオチド及び
翻訳停止信号を含有している特・　　許請求の範囲第８
項記載の方法。１０、段階ｅ）の酵母菌菌株がＸＶ６１０−８Ｃである
特許請求の範囲第８珀記載０方法・］　１．　　段階ｂ
）のブロモ−！−が酵母菌Ｐ　（Ｉ　Ｋプロモーター領
域−り島ら誘導される特許請求の範囲第８〜１０項のい
すね、糸に記載の方法。１２、感染性のヒトにＢ型肝炎ウィルスに対する免疫原
性を辱えるたぬ、又はＢ型肝炎用のワクチンを製造する
ために、特許請求の範囲第８項記載の方法により生産さ
れたＢ型肝炎表面抗Ｎ、を使用する方法、。１３、％許請求の範囲第８項記載の方法の生産物。