PT1610820E - Formulações de elevada concentração de anticorpos e proteínas - Google Patents

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PT1610820E PT04759018T PT04759018T PT1610820E PT 1610820 E PT1610820 E PT 1610820E PT 04759018 T PT04759018 T PT 04759018T PT 04759018 T PT04759018 T PT 04759018T PT 1610820 E PT1610820 E PT 1610820E
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Description

ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Formulações de elevada concentração de anticorpos e proteínas" ANTECEDENTES DO INVENTO Campo do Invento O presente invento refere-se a formulações altamente concentradas de anticorpos, que são particularmente adequadas para administração subcutânea. O presente invento proporciona ainda formulações liquidas estáveis, altamente concentradas (p.ex., >100 mg/ml de proteína).
Descrição da Arte Relacionada
Existe uma procura significativa de formulações líquidas de anticorpos altamente concentradas. No entanto, as formulações proteicas altamente concentradas colocam vários problemas. Um problema é a instabilidade devida à formação de particulados. Com preparações liofilizadas reconstituídas para gerar formulações líquidas, este problema foi resolvido através da utilização de tensioactivos (p.ex., um polissorbato), mas os tensioactivos são inadequados para formulações líquidas, porque podem tornar o posterior processamento difícil. Além disso, os tensioactivos não reduzem ainda a maior viscosidade causada em resultado de numerosas interacções intermoleculares pela natureza macromolecular dos anticorpos.
Embora se tenha mostrado que os tensioactivos reduzem significativamente o grau de formação de particulados de proteínas, eles não resolvem o problema de maior viscosidade que torna difícil a manipulação e administração de formulações de anticorpos concentradas. Os anticorpos tendem a formar soluções viscosas a elevada concentração devido à sua natureza macromolecular e ao potencial para interacções intermoleculares. Além disso, açúcares farmaceuticamente aceitáveis são frequentemente utilizados em grandes quantidades como estabilizantes. Tais açúcares podem aumentar 2 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ as interacções intermoleculares, aumentando deste modo a viscosidade da formulação. As formulações altamente viscosas são dificeis de fabricar, aspirar para uma seringa e injectar subcutaneamente. A utilização de força na manipulação de formulações viscosas conduz a excessiva formação de espuma, que pode conduzir à desnaturação e inactivação de compostos biológicos activos. Falta uma solução satisfatória deste problema.
Embora a arte anterior indica numerosos exemplos de excipientes que podem ser adequadamente empregues para criar formulações farmacêuticas, muito poucas proteínas têm sido formuladas com sucesso acima de 100 mg/ml, nem têm sido descritas técnicas para o fazer.
Os requerentes descobriram que a Arginina, especificamente a Arginina-HCl é particularmente adequada para formulações líquidas de proteínas ou anticorpos altamente concentradas.
Formulações de proteínas liofilizadas isotónicas estáveis são descritas na publicação PCT WO 97/04801, publicada a 13 de Fevereiro de 1997. As formulações liofilizadas divulgadas podem ser reconstituídas para gerar formulações líquidas de elevada concentração em proteínas sem aparente perda de estabilidade. No entanto, as potenciais questões associadas à elevada viscosidade das formulações reconstituídas não são respondidas. A agregação de proteínas foi anteriormente reduzida através da adição de açúcares, mas fazê-lo pode aumentar dramaticamente a viscosidade e osmolaridade, tornando deste modo o processamento e a utilização impraticáveis.
Os requerentes do pedido PCT, publicação W002/30463, publicado a 18 de Abril de 2002 divulgam formulações de elevada concentração de proteínas, mas baixa viscosidade obtidas: 1) através de pH baixo (cerca de 4,0 a 5,3); 2) pH elevado (cerca de 6,5 a 12,0), ou 3) aumentando a força iónica total da formulação através da adição de sais ou tampões. No entanto, embora maior força iónica diminua a viscosidade da formulação (tal como com NaCl), pode também resultar em maior turbidez da solução, a qual é muitas vezes associada à formação de partículas proteicas (p.ex., agregação). Assim, 3 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ uma formulação de proteínas de elevada concentração óptima tem de ultrapassar os desafios de estabilidade, viscosidade, osmolaridade e turbidez.
SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento refere-se a formulações altamente concentradas do anticorpo anti-IgE E25 que são estáveis e de baixa viscosidade e turbidez tal como definido nas reivindicações.
Em particular, o presente invento refere-se a formulações de anticorpos altamente concentradas de baixa turbidez compreendendo proteína ou anticorpo (100-260 mg/ml), histidina (10-100 mM), arginina-HCl (50-200 mM) e polissorbato (0,01%-0,1%), possuindo um pH de 5,5-7,0, uma viscosidade de 50 cs ou menos e uma osmolaridade de 200 mOsm/kg 450 mOsm/kg. Alternativamente, o anticorpo nas formulações pode variar de 120-260 mg/ml, alternativamente 150-260 mg/ml, alternativamente 180-260 mg/ml, alternativamente 200-260 mg/ml anticorpo. Alternativamente a osmolaridade varia de 250 mOsm/kg - 350 mOsm/kg. Alternativamente, a concentração de arginina-HCl varia de 100-200 mM, alternativamente 150-200 mM, alternativamente 180-200 mM. São também aqui descritas formulações de anticorpos altamente concentradas de baixa turbidez compreendendo anticorpo (40-150 mg/ml), histidina (10-100 mM), açúcar (p.ex., trealose ou sacarose, 20-350 mM) e polissorbato (0, 01%-0,1%).
Numa concretização particular, o presente invento proporciona uma formulação contendo elevadas concentrações de proteínas de grande peso molecular, que são anticorpos ou imunoglobulinas. Os anticorpos são dirigidos contra um antigénio predeterminado particular, cujo antigénio é IgE (rhuMAbE-25 descrito em U.S.P. 6329509 e WO 99/01556).
As formulações do presente invento podem ser formulações farmacêuticas. Num aspecto específico, a formulação é distribuída subcutaneamente. 4 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
Noutra concretização, ο presente invento proporciona utilização médica das formulações aqui divulgadas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo num método para o tratamento, profilático ou terapêutico, de um distúrbio tratável através do anticorpo formulado. Tais formulações são particularmente úteis para administração subcutânea. Num aspecto especifico, o distúrbio é um distúrbio mediado por IgE. Ainda noutro aspecto especifico, o distúrbio mediado por IgE é rinite alérgica, asma (p.ex., asma alérgica e asma não alérgica), dermatite atópica, gastroenteropatia alérgica, hipersensibilidade (p.ex., anafilaxia, urticária, alergias alimentares, etc.), aspergilose broncopulmonar alérgica, doenças parasitárias, cistite intersticial, síndroma de hiper-lgE, ataxia-telangiectasia, síndroma de Wiskott-Aldrich, alinfoplasia timica, mieloma de IgE e reacção de enxerto-versus-hospedeiro.
Ainda noutra concretização, o presente invento proporciona um artigo de fabrico compreendendo um recipiente encerrando uma formulação aqui divulgada. Num aspecto, o artigo de fabrico é uma seringa pré-enchida. Ainda noutro aspecto especifico, a seringa pré-enchida está ainda contida dentro de um dispositivo de injecção. Ainda noutro aspecto especifico, o dispositivo de injecção é um auto-injector.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1. Cromatografia de interacção hidrófoba de um anticorpo monoclonal anti-lgE digerido com pepsina. As amostras foram formuladas a diferentes pH e tampões: (·) Acetato 20 mM, (Δ) Succinato 20 mM, (A) Na2HP04 20 mM, ( ) K2P04 20 mM e (*) tampão Tris 20 mM. As amostras foram armazenadas a 30°C durante 6 meses.
Figura 2. Cromatografia de exclusão de tamanho de um anticorpo monoclonal anti-lgE armazenado a 40 °C durante 6 meses. As amostras foram formuladas a diferentes pH e tampões: () Glutamato 20 mM, (·) Acetato 20 mM, (Δ) Succinato 20 mM, (□) Histidina 20 mM, (A) Na2HP04 20 mM, (T) K2P04 20 mM e (*) tampão Tris 20 mM. 5 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
Figura 3. Actividade de um anticorpo monoclonal anti-lgE armazenado a 30°C durante 6 meses. As amostras foram formuladas a diferentes pH e tampões: (·) Acetato 20 mM, (Δ) Succinato 20 mM, (□) Histidina 20 mM, (A) Na2HPC>4 20 mM, (▼) K2P04 20 mM e (*) tampão Tris 20 mM.
Figura 4. Efeitos do Polissorbato 20 na turbidez do anticorpo monoclonal anti-lgE sujeito a stress. As amostras contêm 100 mg/ml de anticorpo, Succinato 20 mM, Trealose 192 mM e várias quantidades de polissorbato 20 a pH 6,0. As concentrações de polissorbato são () 0, (A) 0,01%, (·) 0,02% e (Δ) 0,05%.
Figura 5. Turbidez de um anticorpo monoclonal anti-lgE a «150 mg/ml com diferentes excipientes (A) CaCl2, (V) MgCl2 e (Δ) Arginina-HCl.
Figura 6. Turbidez do anticorpo monoclonal anti-lgE a *150 mg/ml com vários excipientes. As amostras foram armazenadas a (A) -70°C, () 2-8°C, (Δ) 15°C, (□) 30°C e (V) 40°C.
Figura 7. Análises de cromatografia de interacção hidrófoba do anticorpo monoclonal anti-lgE digerido com papaina. As amostras foram formuladas a «150 mg/ml com vários dos excipientes e armazenadas a (▼) -70°C, () 2-8°C, (A) 15°C, (Δ) 30°C e (□) 40°C.
Figura 8. Cromatografia de exclusão de tamanho do anticorpo monoclonal anti-lgE a «150 mg/ml em () arginina-HCl 200 mM, histidina 23 mM, pH 6,0 (A) arginina-HCl 182 mM, histidina 20 mM, pH 6,0 (·) arginina-HCl 182 mM, histidina 20 mM, sacarose 91 mM, pH 6,0 (□) MgCl2 50 mM, 27 mg/ml de trealose, acetato a 0,01%, (Δ) MgCl2 50 mM, MgAc2 30 mM, acetato a 0,01%, e (o) MgCl2 50 mM, MgAc2 45 mM, acetato a 0,01%. As amostras foram armazenadas a 30°C durante 6 meses.
Figura 9. Análises de cromatografia de interacção hidrófoba do anticorpo monoclonal anti-lgE digerido com papaina. As amostras foram formuladas em () arginina-HCl 200 mM, histidina 23 mM, (A) arginina-HCl 182 mM, histidina 20 mM, (·) arginina-HCl 182 mM, histidina 20 mM, sacarose 6 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ 91 mM, (□) MgCl2 50 mM, 27 mg/ml de trealose, acetato a 0,01%, (Δ) MgCl2 50 mM, MgAC2 30 mM, acetato a 0,01% e (o) MgCl2 50 mM, MgAc2 45 mM, acetato a 0,01%. As amostras foram armazenadas a 30°C durante 6 meses.
Figura 10. Mostra uma comparação das sequências inteiras (ambas as cadeias variáveis e constantes) dos anticorpos anti-IgE E25, E26 e Hu-901. As regiões CDR de Hu-901 são mostradas sublinhadas. Para E25 e E26, as regiões CDR tal como definidas por Chothia são mostradas a negrito, enquanto as regiões CDR tal como definidas por Kabat são delineadas com parêntesis. A Figura 10A mostra as sequências da cadeia leve de E25, E26 e Hu-901 (SEQ ID NOS :1-3), enquanto a Figura 10B mostra as sequências da cadeia pesada de E25, E26 e Hu-901 (SEQ ID NOS:4-6) . DESCRIÇÃO DETALHADA DA CONCRETIZAÇÃO PREFERIDA I. Definições
Por "proteina" entenda-se uma sequência de aminoácidos para a qual o comprimento da cadeia é suficiente para produzir os niveis superiores da estrutura terciária e/ou quaternária. Assim, as proteínas são distintas dos "péptidos" que são também moléculas baseadas em aminoácidos que não têm tal estrutura. Tipicamente, uma proteína para utilizar aqui terá um peso molecular de pelo menos cerca de 15-20 kD, de preferência pelo menos cerca de 20 kDa.
Exemplos de proteínas englobadas dentro da definição daqui incluem proteínas de mamífero, tais como, p.ex., hormona do crescimento, incluindo hormona do crescimento humana e hormona do crescimento bovina; factor de libertação da hormona do crescimento; hormona da paratiróide; hormona estimuladora da tiróide; lipoproteínas; α-1-antitripsina; cadeia A da insulina; cadeia B da insulina; proinsulina; hormona estimuladora do folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulação tais como factor VIIIC, factor IX, factor tecidular e factor de von Willebrands; factores anticoagulantes, tais como Proteína c; factor natriurético atrial; tensioactivo pulmonar; um activador do plasminogénio, tal como uroquinase ou activador do 7 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ plasminogénio de tipo de tecido (t-PA, p.ex., Activase®, TNKase®, Retevase®) ; bombazina; trombina; factor de necrose tumoral α e β; encefalinase; RANTES (regulado na activação, normalmente expresso e segregado em células T); proteína inflamatória de macrófagos humanos (ΜΙΡ-1-α); albumina do soro tal como albumina do soro humano; substância inibidora da muleriana; cadeia α da relaxina; cadeia β da relaxina; prorelaxina; péptido associado à gonadotrofina de ratinho; ADNase; inibina; activina; factor de crescimento vascular endotelial (VEGF); receptores para hormonas ou factores de crescimento; uma integrina; proteina A ou D; factores reumatóides; um factor neurotrófico, tal como o factor neurotrófico derivada do osso (BDNF), neurotrofina-3, 4, 5, ou 6 (NT-3, NT-4, NT-5 ou NT-6), ou um factor de crescimento dos nervos, tal como NGF-β; factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crescimento de fibroblastos tais como aFGF e bFGF, factor de crescimento epidérmico (EGF); factor de crescimento transformante (TGF), tal como TGF-α e TGF-β, incluindo TGF-βΙ, TGF^2, TGF-p3, TGF-p4, ou TGF-p5; factor de crescimento semelhante a insulina-I e II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-1 cerebral); proteínas de ligação ao factor de crescimento semelhante à insulina; proteínas CD tais como CD3, CD4, CD8, CD19 e CD20; eritropoietina (EPO), trombopoietina (TPO); factores osteoindutores; imunotoxinas; uma proteina morfogenética do osso (BMP); um interferão tal como interferão-α, β e γ; factores estimuladores de colónias (CSFs), p.ex., M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas (ILs), p.ex., IL-1 a IL-10; superóxido-dismutase; receptores de células T; proteínas da superfície da membrana; factor de aceleração do declínio (DAF); um antigénio virai tal como, por exemplo, uma porção do envelope de SIDA; proteínas de transporte; receptores de retorno; adressinas; proteínas reguladoras; imunoadesinas; anticorpos; e fragmentos ou variantes biologicamente activos de qualquer um dos polipéptidos acima listados. A proteína que é formulada é de preferência essencialmente pura e desejavelmente essencialmente homogénea (i.e. livres de proteínas contaminantes). Proteína "essencialmente pura" significa uma composição compreendendo pelo menos cerca de 90% do peso em proteína, com base no peso total da composição, de preferência pelo menos cerca de 95% do 8 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ peso. Proteína "essencialmente homogénea" significa uma composição compreendendo pelo menos cerca de 99% do peso em proteína, com base no peso total da composição.
Em certas concretizações, a proteína é um anticorpo. 0 anticorpo pode ligar-se, por exemplo, a qualquer uma das moléculas acima mencionadas. Alvos moleculares exemplares para os anticorpos englobados pelo presente invento incluem IgE, as proteínas CD CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 e CD40; membros da família de receptores HER tais como o receptor de EGF, o receptor HER2, HER3 ou HER4; 2c4, 4D5, PSCA, LDP-2, moléculas de adesão celular tais como LFA-1, Macl, pl50, 95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e integrina αν/β3 incluindo as subunidades α e β desta (p.ex., anticorpos anti-CDlla, anti-CDl8 ou anti-CDllb); factores de crescimento tais como VEGF; antigénios do grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor da obesidade (OB) ; receptor mpl, CTLA-4, e proteína C. 0 termo "anticorpo" tal como aqui se utiliza inclui anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos inteiros que possuem uma região Fc de imunoglobulina), composições de anticorpos com especificidade poliepitópica, anticorpos multiespecíficos (p.ex., anticorpos biespecíficos, diacorpos, e moléculas de cadeia simples, bem como fragmentos de anticorpo ('p.ex., Fab, F(ab')2r e Fv) . O termo "imunoglobulina" (Ig) é aqui utilizado alternadamente com "anticorpo". A unidade básica do anticorpo de 4 cadeias é uma glicoproteína heterotetramérica composta por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas idênticas (H) . Um anticorpo igM consiste em 5 das unidades básicas heterotetraméricas, juntamente com um polipéptido adicional designado cadeia J, e contêm 10 locais de ligação ao antigénio, enquanto os anticorpos igA compreendem de 2-5 unidades básicas de 4 cadeias que podem polimerizar para formar conjuntos polivalentes, em combinação com a cadeia J. No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeias tem geralmente cerca de 150 000 daltons. Cada cadeia L está ligada a uma cadeia H através de uma ligação dissulfureto covalente, enquanto as duas cadeias H são ligadas uma à outra através de uma ou mais ligações dissulfureto dependendo do isotipo da cadeia H. Cada 9 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ cadeia Η e L tem também pontes dissulfureto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia H tem no terminal N um domínio variável (VH) seguido de três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias α e γ e quatro domínios CH para os isotipo μ e ε. Cada cadeia L tem no seu terminal N um domínio variável (VL) seguido de um domínio constante na sua outra extremidade. O VL é alinhado com o VH e o CL é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1) . Crê-se que determinados resíduos de aminoácidos formem uma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. O emparelhamento de um VH com um VL forma um local de ligação ao antigénio único. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, ver p.ex., "Basic and Clinicai Immunology", 8a Edição, Daniel P. Sties, Abba I. Terr e Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 e Capítulo 6. A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode ser atribuída a um de dois tipos claramente distintos, designados por capa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, possuindo cadeias pesadas designadas, α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As classes γ e μ são ainda divididas em subclasses com base em diferenças relativamente pequenas na sequência e função de CH, p.ex., os humanos expressam as seguintes subclasses: IgGl, IgG2, lgG3, IgG4, IgAl e IgA2. O termo "variável" refere-se ao facto de certos segmentos dos domínios variáveis diferirem extensivamente na sequência entre anticorpos. O domínio V medeia a ligação ao antigénio e define a especificidade de um determinado anticorpo para o seu antigénio particular. No entanto, a variabilidade não é uniformemente distribuída ao longo de toda a extensão dos domínios variáveis. Em vez disso, as regiões V consistem em trechos relativamente invariantes designados regiões estruturais (FRs) de cerca de 15-30 resíduos de aminoácidos separadas por regiões mais curtas de extrema variabilidade designadas "regiões hipervariáveis" ou por vezes "regiões 10 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ determinantes de complementaridade" (CDR) que têm cada uma 9-12 aminoácidos de comprimento. Os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves nativas compreendem cada um quatro FRs, adoptando grandemente uma configuração de folha β, ligadas através de três regiões hipervariáveis, que formam voltas ligando-se, e nalguns casos fazendo parte, da estrutura em folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em íntima proximidade através das FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antigénio dos anticorpos (ver Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1991). Os domínios constantes não estão directamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem várias funções efectoras, tais como participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). O termo "região hipervariável" (também conhecida como "regiões determinantes de complementaridade" ou CDR) quando aqui utilizado refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que estão (habitualmente três ou quatro curtas regiões de extrema variabilidade da sequência) dentro do domínio da região V de uma imunoglobulina que forma o local de ligação ao antigénio e são os principais determinantes de especificidade do antigénio. Existem pelo menos dois métodos para identificação dos resíduos de CDR: (1) Uma abordagem baseada na variabilidade da sequência de espécies cruzadas (i.e., Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (National Institute of Health, Bethesda, MS 1991); e (2) Uma abordagem baseada em estudos cristalográficos de complexos antigénio-anticorpo (Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987). No entanto, até ao ponto em que as duas técnicas de identificação de resíduos definem regiões de sobreposição, mas não regiões idênticas, elas podem ser combinadas para definir uma CDR híbrida. O termo "anticorpo monoclonal" tal como aqui se utiliza refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, i.e., os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural e/ou 11 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ modificações pós-tradução (p.ex., isomerizações, amidações) que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Para além disso, em contraste com preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante do antigénio. Para além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por serem sintetizados através da cultura de hibridoma, não contaminados por outras imunoglobulinas. O adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e não deve ser entendido como requerendo a produção do anticorpo através de qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a utilizar de acordo com o presente invento podem ser produzidos através do método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature 256: 495, 1975, ou podem ser produzidos através de métodos de ADN recombinante (ver, p.ex., Patente U.S. N.° 4816567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas fágicas de anticorpos utilizando técnicas descritas em Clackson et al., Nature 352: 624-628, 1991 e Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991, por exemplo.
Os anticorpos monoclonais daqui incluem especificamente anticorpos (imunoglobulinas) "quiméricos" nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma determinada classe ou subclasse de anticorpo, enquanto o restante da cadeia ou cadeias é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como a fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a actividade biológica desejada (Patente U.S. N.° 4816567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA 81: 6851-6855, 1984). Os anticorpos quiméricos de interesse aqui incluem anticorpos "primatizados" compreendendo sequências de ligação ao antigénio do domínio variável de um primata não humano (p.ex., Macaco do Velho 12 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
Mundo, hominóideos, etc.) e sequências da região constante humana.
Um anticorpo "intacto" é um que compreende um local de ligação ao antigénio bem como um CL e pelo menos os dominios da cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os dominios constantes podem ser dominios constantes de sequência nativa (p.ex., dominios constantes de subsequência nativa humana) ou variantes da sequência de aminoácidos destes. De preferência, o anticorpo intacto tem uma ou mais funções efectoras.
Um "fragmento de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo intacto, de preferência a região de ligação ao antigénio e/ou variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; (ver Patente U.S. N.° 5641870, Exemplo 2; Zapata et ai., Protein Eng. 8(10): 1057-1062, 1995); moléculas de anticorpo de cadeia simples e anticorpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticorpo. A digestão com papaina de anticorpos produziu dois fragmentos de ligação ao antigénio idênticos, designados fragmentos "Fab", um fragmento "Fc" residual, uma designação que reflecte a capacidade para cristalizar facilmente. O fragmento Fab consiste numa cadeia L inteira juntamente com o domínio da região variável da cadeia H (VH), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH1) . Cada fragmento Fab é monovalente em relação à ligação ao antigénio, i.e., possui um único local de ligação ao antigénio. O tratamento com pepsina de um anticorpo produz um único fragmento F(ab')2 grande que corresponde aproximadamente a dois fragmentos Fab ligados por dissulfureto possuindo diferente actividade de ligação ao antigénio e é ainda capaz de se ligar de forma cruzada ao antigénio. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab por possuírem alguns resíduos adicionais no terminal carboxilo do domínio CH1 incluindo uma ou mais cisteínas da região charneira do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' em que o resíduo ou resíduos de cisteína dos domínios constantes possuem um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de 13 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ charneira entre si. Outras ligações químicas de fragmentos de anticorpo são também conhecidas. O fragmento Fc compreende as porções carboxi-terminais de ambas as cadeias H mantidas juntas através de dissulfuretos. As funções efectoras dos anticorpos são determinadas pelas sequências na região Fc, a região que é também reconhecida pelos receptores de Fc (FcR) verificados em certos tipos de células. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de reconhecimento e ligação ao antigénio completo. Este fragmento consiste num dímero de um domínio da região variável da cadeia pesada e um da cadeia leve em forte associação não covalente. Da dobragem destes dois domínios emanam seis voltas hipervariáveis (3 voltas de cada da cadeia H e L) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para ligação ao antigénio e conferem especificidade de ligação ao antigénio ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDR específicas para um antigénio) tem a capacidade para reconhecer e ligar-se ao antigénio, embora a uma menor afinidade que o local de ligação inteiro. "Fv de cadeia simples" também abreviado como "sFv" ou "scFv" são fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios de anticorpo vh e vl ligados numa única cadeia polipeptídica. De preferência, o polipéptido sFv compreende ainda um ligador polipeptídico entre os domínios VH e VL que permitem que sFv forme a estrutura desejada para ligação ao antigénio. Para uma revisão de sFv, ver Pluckthun em "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, New York, págs. 269-315 (1994). O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo preparados através da construção de fragmentos sFv (ver parágrafo anterior) com ligadores curtos (cerca de 5-10 resíduos) entre os domínios VH e VL de modo a ser alcançado emparelhamento inter-cadeias mas não intra-cadeias dos domínios V, resultando deste modo num fragmento bivalente, i.e., um fragmento possuindo dois locais de ligação ao antigénio. Os diacorpos biespecíficos são heterodímeros de 14 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ dois fragmentos sFv "cruzados" nos quais os dominios Vh e Vl dos dois anticorpos estão presentes em diferentes cadeias polipeptidicas. Os diacorpos são descritos em mais detalhe, por exemplo, em EP 404097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448, 1993.
Um anticorpo que se "liga especificamente a" ou é "especifico para" um determinado polipéptido ou um epitopo num determinado polipéptido é um que se liga a esse polipéptido ou epitopo particular num determinado polipéptido sem se ligar substancialmente a qualquer outro polipéptido ou epitopo polipeptidico. O termo "fase sólida" descreve uma matriz não aquosa à qual o anticorpo do presente invento pode aderir. Exemplos de fases sólidas aqui englobadas incluem as formadas parcialmente ou inteiramente de vidro (p.ex., vidro de poro controlado), polissacáridos (p.ex., agarose), poliacrilamidas, poliestireno, álcool polivinílico e silicones. Em certas concretizações, dependendo do contexto, a fase sólida pode compreender o poço de uma placa de ensaio; noutras é uma coluna de purificação (p.ex., uma coluna de cromatografia de afinidade). Este termo inclui também uma fase sólida descontinua de partículas discretas, tais como as descritas na Patente U.S. N.° 4275149.
As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (p.ex., de murideo) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos destas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao antigénio de anticorpos) principalmente de sequências humanas, que contêm uma sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais os resíduos de uma região hipervariável (também CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato ou coelho possuindo a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas. Nalguns casos, os resíduos da região estrutural Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Para além disso, os "anticorpos humanizados" tal como aqui se utiliza podem 15 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ também compreender resíduos que não se verificam nem no anticorpo receptor nem no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para refinar mais e optimizar o desempenho do anticorpo. O anticorpo humanizado compreenderá também optimamente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et ai., Nature 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature 332: 323-329, 1988; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596, 1992.
Um "anticorpo dependente da espécie", p.ex., um anticorpo de mamífero anti-lgE humano, é um anticorpo que tem uma actividade de ligação mais forte para um antigénio de uma primeira espécie de mamífero que para um homólogo desse antigénio de uma segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpo dependente da espécie "liga-se especificamente" a um antigénio humano (i.e., tem um valor de afinidade de ligação (Kd) de não mais de cerca de lxlCT7 M, alternativamente não mais de cerca de lxlCT8 M, alternativamente não mais de cerca de lxlCT9 M) mas tem uma actividade de ligação para um homólogo do antigénio de uma segunda espécie de mamífero não humano que é pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1000 vezes, mais fraca que a sua afinidade de ligação ao antigénio não humano. O anticorpo dependente da espécie pode ser de qualquer um dos vários tipos de anticorpos tal como definido acima, mas é de preferência um anticorpo humanizado ou humano.
As "funções efectoras" do anticorpo referem-se às actividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou uma variante da sequência de aminoácidos da região Fc) de um anticorpo e variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efectoras dos anticorpos incluem: ligação Clq e citotoxicidade dependente do complemento; ligação ao receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; sub-regulação de receptores da superfície celular (p.ex. receptores de células B); e activação de células B. "Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade em que Ig segregada ligada a receptores de Fc (FcR) presentes 16 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ em certas células citotóxicas (p.ex. células assassinas naturais (NK), neutrófilos, e macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se liguem especificamente a uma célula alvo possuindo o antigénio e subsequentemente matem a célula alvo com citotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são necessários para matar a célula alvo através deste mecanismo. As células primárias para mediar ADCC, as células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. a expressão de Fc em células hematopoéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92, 1991. Para avaliar a actividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode ser efectuado um ensaio ADCC in vitro, tal como o descrito na Patente U.S. N.° 5500362 ou 5821337. Células efectoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a actividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, p.ex., num modelo animal tal como o divulgado em Clynes et al., PNAS (USA) 95: 652-656, 1998. "Receptor de Fc" ou "FcR" descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Para além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII, e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas de processamento alternativo destes receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor activador") e FcyRIIB (um "receptor inibidor"), que possuem sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente nos dominios citoplasmáticos destes. O receptor activador FcyRIIA contém um motivo de activação baseado em tirosina imuno-receptor (ITAM) no seu dominio citoplasmático. O receptor inibidor FcyRIIB contém um motivo de inibição baseado em tirosina imuno-receptor (ITIM) no seu domínio citoplasmático (ver Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234, 1997). Os FcR são revistos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92, 1991; Capei et al., Immunomethods 4: 25-34, 1994; e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41, 1995). Outros FcR, incluindo aqueles a identificar no futuro, estão aqui englobados pelo termo "FcR". O termo inclui também o receptor neonatal, FcRn, que é 17 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587, 1976; e Kim et al., J. Immunol. 24: 249, 1994). "Células efectoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcR e efectuam funções efectoras. De preferência, as células expressam pelo menos FcyRIII e efectuam a função efectora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC), células assassinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; sendo preferidos as PBMC e as células MNK. As células efectoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa, p.ex. sangue. "Citotoxicidade dependente do complemento" ou "CDC" refere-se à lise de uma célula alvo na presença do complemento. A activação da via clássica do complemento é iniciada através da ligação do primeiro componente do sistema do complemento (Clq) a anticorpos (da subclasse apropriada) que estão ligados ao seu antigénio cognato. Para avaliar a activação do complemento, pode ser efectuado um ensaio de CDC, p.ex., tal como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163, 1996. "Isolado" quando utilizado para descrever os vários polipéptidos e anticorpos aqui divulgados, significa um polipéptido ou anticorpo que foi identificado, separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente de produção. De preferência, o polipéptido isolado está livre de associação com todos os outros componentes do seu ambiente de produção. Os componentes contaminantes do seu ambiente de produção, tais como os resultantes de células transfectadas recombinantes, são materiais que tipicamente interfeririam com utilizações de diagnóstico ou terapêuticas para o polipéptido, e podem incluir enzimas, hormonas, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em concretizações preferidas, o polipéptido será purificado (1) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna através da utilização de um sequenciador de copo giratório, ou (2) até à homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições não redutoras ou redutoras utilizando coloração azul de Coomassie ou, de preferência, de 18 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ prata. Vulgarmente, no entanto, um polipéptido ou anticorpo isolado será preparado através de pelo menos um passo de purificação.
Uma molécula de ácido nucleico "isolada" codificando os polipéptidos e anticorpos daqui é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está vulgarmente associada no ambiente em que foi produzida. De preferência, o ácido nucleico isolado está livre de associação com todos os componentes associados ao ambiente de produção. As moléculas de ácido nucleico isoladas codificando os polipéptidos e anticorpos daqui estão numa forma diferente da forma ou disposição na qual se verifica na natureza. As moléculas de ácido nucleico isoladas são portanto distintas de ácidos nucleicos codificando os polipéptidos e anticorpos daqui que existem naturalmente nas células. O termo "sequências de controlo" refere-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operativamente ligada num determinado organismo hospedeiro. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas incluem, por exemplo, um promotor, opcionalmente uma sequência de operador e um local de ligação ao ribossoma. Sabe-se que as células eucarióticas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e estimuladores. 0 ácido nucleico está "operativamente ligado" quando é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, ADN para uma pré-sequência ou líder de secreção está operativamente ligado a ADN para um polipéptido se for expresso como uma pré-proteína que participe na secreção do polipéptido; um promotor ou estimulador está operativamente ligado a uma sequência de codificação se afectar a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma está operativamente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de modo a permitir a tradução. Geralmente, "operativamente ligado" significa que as sequências de ADN a ligar são contíguas e, no caso de um líder de secreção, contíguas e em fase de leitura. No entanto, os estimuladores não têm de ser contíguos. A ligação é alcançada através de ligação em locais de restrição convenientes. Se 19 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ tais locais não existirem, são utilizados adaptadores ou ligadores oligonucleotidicos sintéticos de acordo com a prática convencional. O termo "marcado com epitopo" quando aqui utilizado refere-se a um polipéptido quimérico compreendendo um polipéptido ou anticorpo aqui descrito fundido com um "polipéptido marcador". O polipéptido marcador tem resíduos suficientes para proporcionar um epitopo contra o qual pode ser produzido um anticorpo, contudo é suficientemente curto para que não interfira com a actividade do polipéptido ao qual está fundido. O polipéptido marcador é de preferência também razoavelmente único para que o anticorpo não reaja substancialmente de forma cruzada com outros epítopos. Os polipéptidos marcadores adequados têm geralmente pelo menos seis resíduos de aminoácidos e habitualmente entre 8 e 50 resíduos de aminoácidos (de preferência, entre cerca de 10 e 20 resíduos de aminoácidos).
Tal como aqui se utiliza, o termo "imunoadesina" designa moléculas semelhantes a anticorpos que combinam a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga (uma "adesina") com as funções efectoras dos domínios constantes de imunoglobulinas. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada que é diferente da do local de reconhecimento e ligação ao antigénio de um anticorpo (i.e., é "heteróloga") com uma sequência de um domínio constante de imunoglobulina. A parte adesina de uma molécula imunoadesina é tipicamente uma sequência de aminoácidos contígua compreendendo pelo menos o local de ligação de um receptor ou um ligando. A sequência do domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida de qualquer imunoglobulina, tal como dos subtipos lgG-1, lgG-2, IgG-3 ou IgG-4, IgA (incluindo IgA-Ι e lgA-2), igE, igD ou IgM. As fusões de Ig incluem de preferência a substituição de um domínio de um polipéptido ou anticorpo aqui descrito em vez de pelo menos uma região variável dentro de uma molécula de Ig. Numa concretização particularmente preferida, a fusão de imunoglobulina inclui a charneira, CH2 e CH3, ou as regiões charneira, CHI, CH2 e CH3 de uma molécula de IgGl. Para a 20 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ produção de fusões de imunoglobulinas ver também a Patente U.S. N.° 5428130 publicada a 27 de Junho de 1995.
Uma formulação "estável" é uma em que a proteína nesta retém essencialmente a sua estabilidade e integridade física e química durante a armazenagem. Várias técnicas analíticas para medição da estabilidade das proteínas estão disponíveis na arte, e são revistas em "Peptide and Protein Drug Delivery", 247-301, Vincent Lee ed., Mareei Dekker, inc., New York, New York, Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery rev. 10: 29-90, 1993. A estabilidade pode ser medida a uma temperatura seleccionada durante um período de tempo seleccionado. Para pesquisa rápida, a formulação pode ser mantida a 40°C durante 2 semanas a 1 mês, altura em que é medida a estabilidade. Quando a formulação é para ser armazenada a 2-8°C, geralmente a formulação deve ser estável a 30°C ou 40°C durante pelo menos 1 mês e/ou estável a 2-8°C durante pelo menos 2 anos. Quando a formulação é para ser armazenada a 30°C, geralmente a formulação deve ser estável durante pelo menos 2 anos a 30°C e/ou estável a 40°C durante pelo menos 6 meses. Por exemplo, a extensão de agregação durante o armazenamento pode ser utilizada como um indicador de estabilidade das proteínas. Assim, uma formulação "estável" pode ser uma em que menos que cerca de 10% e de preferência menos que cerca de 5% da proteína estão presentes como um agregado na formulação.
Noutras concretizações, pode ser determinado qualquer aumento na formação de agregados durante a armazenagem da formulação.
Uma formulação "reconstituída" é uma que foi preparada através da dissolução de uma formulação de proteína ou anticorpo liofilizada num diluente para que a proteína seja dispersa na formulação reconstituída. A formulação reconstituída é adequada para administração (p.ex. administração parentérica) a um paciente a ser tratado com a proteína de interesse e, em certas concretizações do presente invento, pode ser uma que seja adequada para administração subcutânea.
Uma formulação "isotónica" é uma que tem essencialmente a mesma pressão osmótica que o sangue humano. As formulações isotónicas terão geralmente uma pressão osmótica de cerca de 250 a 350 mOsm. O termo "hipotónica" descreve uma formulação 21 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ com uma pressão osmótica abaixo da do sangue humano. Correspondentemente, o termo "hipertónica" é utilizado para descrever uma formulação com uma pressão osmótica acima da do sangue humano. A isotonicidade pode ser medida utilizando um osmómetro de tipo pressão de vapor ou crioscópico, por exemplo. As formulações do presente invento são hipertónicas em resultado da adição de sal e/ou tampão.
Uma formulação "reconstituída" é uma que foi preparada através da dissolução de uma formulação de proteína ou anticorpo liofilizada num diluente para que a proteina seja dispersa na formulação reconstituída. A formulação reconstituída é adequada para administração (p.ex. administração parentérica) a um paciente a ser tratado com a proteína de interesse e, em certas concretizações do presente invento, pode ser uma que seja adequada para administração subcutânea.
Um "ácido farmaceuticamente aceitável" inclui ácidos inorgânicos e orgânicos que são não tóxicos na concentração e no modo pelo qual são formulados. Por exemplo, ácidos inorgânicos adequados incluem o clorídrico, perclórico, bromídrico, iodídrico, nítrico, sulfúrico, sulfónico, sulfínico, sulfanílico, fosfórico, carbónico, etc. Ácidos orgânicos adequados incluem de alquilo de cadeia linear e ramificada, aromáticos, cíclicos, cicloalifáticos, arilalifáticos, heterocíclicos, saturados, insaturados, mono, di e tri-carboxílicos, incluindo, por exemplo, fórmico, acético, 2-hidroxiacético, trifluoroacético, fenilacético, trimetilacético, t-butilacético, antranílico, propanóico, 2-hidroxipropanóico, 2-oxopropanóico, propandióico, ciclo-pentanopropiónico, ciclopentano-propiónico, 3-fenilpropiónico, butanóico, butandióico, benzóico, 3-(4-hidroxi-benzoíl)benzóico, 2-acetoxibenzóico, ascórbico, cinâmico, laurilsulfúrico, esteárico, mucónico, mandélico, succínico, embónico, fumárico, málico, maleico, hidroximaleico, malónico, láctico, cítrico, tartárico, glicólico, glicónico, glucónico, pirúvico, glioxálico, oxálico, mesílico, succínico, salicílico, ftálico, palmóico, palmeico, tiociânico, metanossulfónico, etanossulfónico, 1,2-etanodissulfónico, 2-hidroxietanossulfónico, benzenossulfónico, 4-clorobenzenos-sulfónico, naftaleno-2-sulfónico, p-toluenossulfónico, 22 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ canforsulfónico, 4-metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-eno-l-carboxílico, gluco-heptónico, 4, 4'-metilenobis-3-(ácido hidroxi-2-eno-l-carboxílico), hidroxinaftóico. "Bases farmaceuticamente aceitáveis" incluem bases inorgânicas e orgânicas que são não tóxicas na concentração e no modo pelo qual são formuladas. Por exemplo, bases adequadas incluem as formadas a partir de metais formadores de bases tais como lítio, sódio, potássio, magnésio, cálcio, amónio, ferro, zinco, cobre, manganésio, alumínio, N-metilglucamina, morfolina, piperidina e bases orgânicas não tóxicas incluindo, aminas primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas, aminas cíclicas e resinas básicas de permuta iónica, (p.ex., N(R')4+ (onde R' é independentemente H ou alquilo Ci-4, p.ex., amónio, Tris)), por exemplo, resinas de isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dietilaminoetanol, trimetamina, diciclo-hexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilenodiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, poliamina e semelhantes. Bases orgânicas não tóxicas particularmente preferidas são isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetamina, diciclo-hexilamina, colina e cafeína. Ácidos e bases farmaceuticamente aceitáveis adicionais utilizáveis com o presente invento incluem os que são derivados dos aminoácidos, por exemplo, histidina, glicina, fenilalanina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina e asparagina.
Tampões e sais "farmaceuticamente aceitáveis" incluem os derivados de sais de adição ácida e básica dos ácidos e bases acima indicados. Tampões e/ou sais específicos incluem histidina, succinato e acetato.
Um "lioprotector" é uma molécula que, quando combinada com uma proteína de interesse, previne ou reduz significativamente a instabilidade química e/ou física da proteína após liofilização e subsequente armazenamento. Lioprotectores exemplares incluem açúcares e seus álcoois de açúcar correspondentes; um aminoácido tal como o glutamato 23 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ monossódico ou a histidina; uma metilamina tal como betaína; um sal liotrópico tal como sulfato de magnésio; um poliol tal como álcoois de açúcar tri-hídricos ou de maior peso molecular, p.ex. glicerina, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol; propilenoglicol; polietilenoglicol; Pluronics® e combinações destes. Exemplos adicionais destes lioprotectores incluem glicerina e gelatina, e os açúcares melibiose, melezitose, rafinose, manotriose e estaquiose. Exemplos de açúcares redutores incluem glicose, maltose, lactose, maltulose, isomaltulose e lactulose. Exemplos de açúcares não redutores incluem glicósidos não redutores de compostos poli-hidroxilo seleccionados a partir de álcoois de açúcar e outros poliálcoois de cadeia linear. Álcoois de açúcar preferidos são os monoglicósidos, especialmente os compostos obtidos através de redução de dissacáridos tais como lactose, maltose, lactulose e maltulose. O grupo lateral glicosídico pode ser glucosídico ou galactosidico. Exemplos adicionais de álcoois de açúcar são glucitol, maltitol, lactitol e iso- maltulose. Os lioprotectores preferidos são os açúcares não redutores trealose ou sacarose. O lioprotector é adicionado à formulação pré-liofilizada numa "quantidade lioprotectora" que significa que, após a liofilização da proteína na presença da quantidade lioprotectora de lioprotector, a proteína retém essencialmente a sua estabilidade e integridade física e química após liofilização e armazenamento.
Na preparação de formulações de viscosidade reduzida do presente invento, deve ser tomado cuidado ao utilizar os excipientes acima enumerados bem como outros aditivos, especialmente quando adicionados a elevada concentração, para não aumentar a viscosidade da formulação.
Um "açúcar farmaceuticamente aceitável" é uma molécula que, quando combinada com uma proteína de interesse, previne ou reduz significativamente a instabilidade química e/ou física da proteína após armazenamento. Quando se pretende que a formulação seja liofilizada e depois reconstituída, os "açúcares farmaceuticamente aceitáveis" podem também ser conhecidos como um "lioprotector". Açúcares e seus álcoois de 24 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ açúcar correspondentes exemplares incluem: um aminoácido tal como glutamato monossódico ou histidina; uma metilamina tal como betaína; um sal liotrópico tal como sulfato de magnésio; um poliol tal como álcoois de açúcar tri-hidricos ou de maior peso molecular, p.ex. glicerina, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, e manitol; propilenoglicol; polietilenoglicol; Pluronics®; e combinações destes. Lioprotectores exemplares adicionais incluem glicerina e gelatina, e os açúcares melibiose, melezitose, rafinose, manotriose e estaquiose. Exemplos de açúcares redutores incluem glicose, maltose, lactose, maltulose, isomaltulose e lactulose. Exemplos de açúcares não redutores incluem glicósidos não redutores de compostos poli-hidroxilo seleccionados a partir de álcoois de açúcar e outros poliálcoois de cadeia linear. Álcoois de açúcar preferidos são monoglicósidos, especialmente os compostos obtidos através de redução de dissacáridos tais como lactose, maltose, lactulose e maltulose. O grupo lateral glicosidico pode ser glucosídico ou galactosidico. Exemplos adicionais de álcoois de açúcar são glucitol, maltitol, lactitol e isomaltulose. Os açúcares farmaceuticamente aceitáveis preferidos são os açúcares não redutores trealose ou sacarose.
Os açúcares farmaceuticamente aceitáveis são adicionados à formulação numa "quantidade protectora" (p.ex. pré-liofilização) o que significa que a proteína retém essencialmente a sua estabilidade e integridade física e química durante o armazenamento (p.ex., após reconstituição e armazenamento). O "diluente" de interesse aqui é um que seja farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um humano) e seja útil para a preparação de uma formulação líquida, tal como uma formulação reconstituída após liofilização. Diluentes exemplares incluem água estéril, água bacteriostática para injecção (BWFI), uma solução de pH tamponado (p.ex. solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose. Numa concretização alternativa, os diluentes podem incluir soluções aquosas de sais e/ou tampões. 25 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
Um "conservante" é um composto que pode ser adicionado às formulações daqui para reduzir a actividade bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiusos (dose múltipla). Exemplos de potenciais conservantes incluem cloreto de octadecildimetilbenzilamónio, cloreto de hexametónio, cloreto de benzalcónio (uma mistura de cloretos de alquilbenzildimetilamónio em que os grupos alquilo são compostos de cadeia longa), e cloreto de benzetónio. Outros tipos de conservantes incluem álcoois aromáticos tais como fenol, álcool butilico e benzilico, alquilparabenos tais como metil ou propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclo-hexanol, 3-pentanol, e m-cresol. O conservante mais preferido aqui é o álcool benzilico. "Tratamento" refere-se tanto a tratamento terapêutico como profilático ou medidas preventivas. Aqueles que necessitam de tratamento incluem os que já têm o distúrbio bem como aqueles nos quais se pretende prevenir o distúrbio. "Mamífero" para fins de tratamento refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de quinta, e animais de zoológico, desporto ou estimação, tais como cães, cavalos, coelhos, gado, porcos, hamsters, gerbilos, ratinhos, doninhas, ratos, gatos, etc. De preferência, o mamífero é humano.
Um "distúrbio" é qualquer condição que beneficiará de tratamento com a proteína. Isto inclui doenças ou distúrbios crónicos e agudos incluindo as condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Exemplos não limitantes de distúrbios a tratar aqui incluem carcinomas e alergias.
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é, pelo menos, a concentração mínima necessária para efectuar uma melhoria mensurável ou prevenção de um determinado distúrbio. As quantidades terapeuticamente eficazes de proteínas conhecidas são bem conhecidos na arte, enquanto que as quantidades eficazes das proteínas descobertas daqui em diante podem ser determinadas através de técnicas padrão que estão bem dentro da perícia de um perito na arte, tais como um vulgar médico. 26 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ "Viscosidade" tal como aqui se utiliza pode ser "viscosidade cinemática" ou "viscosidade absoluta". A "viscosidade cinemática" é uma medida do fluxo resistente de um fluido sob a influência da gravidade. Quando dois fluidos de volume igual são colocados em viscosímetros capilares idênticos e deixados fluir por gravidade, um fluido viscoso leva mais tempo do que um fluido menos viscoso para fluir através do capilar. Se um fluido leva 200 segundos para completar o seu fluxo e outro fluido leva 400 segundos, o segundo fluido é duas vezes mais viscoso que o primeiro numa escala de viscosidade cinemática. A "viscosidade absoluta", por vezes designada viscosidade dinâmica ou simples, é o produto da viscosidade cinemática pela densidade do fluido:
Viscosidade Absoluta = Viscosidade Cinemática χ Densidade A dimensão da viscosidade cinemática é L2/T onde L é um comprimento e T é um tempo. Vulgarmente, a viscosidade cinemática é expressa em centistokes (cSt). A unidade SI de viscosidade cinemática é mm2/s, que é 1 cSt. A viscosidade absoluta é expressa em unidades de centipoise (cP). A unidade SI da viscosidade absoluta é o miliPascal-segundo (mPa-s), onde 1 cP = 1 mPa-s.
Um "anti-histamínico" tal como aqui utilizado é um agente que antagoniza o efeito fisiológico da histamina. A ligação da histamina aos seus receptores, Hi e H2 resulta nos sintomas e efeitos alérgicos característicos ou comichão, vermelhidão, inchaço, etc. Muitos anti-histaminicos actuam através do bloqueio da ligação da histamina aos seus receptores, Hl, H2; no entanto crê-se que outros funcionem através da inibição da libertação de histamina. Exemplos de anti-histaminicos são a clorfeniramina, difenidramina, prometazina, cromolina sódica, astemizole, maleato de azatadina, maleato de brofeniramina, maleato de carbinoxamina, cloridrato de cetirizina, fumarato de clemastina, cloridrato de cipro-heptadina, maleato de dexbromofeniramina, maleato de dexclorofeniramina, dimenidrinato, cloridrato de difenidramina, succinato de doxilamina, cloridrato de fexofendadina, cloridrato de terfenadina, cloridrato de hidroxizina, loratidina, cloridrato 27 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ de meclizina, citrato de tripelanamina, cloridrato de tripelenamina, cloridrato de triprolidina.
Um "boncodilatador" tal como aqui se utiliza, descreve agentes que antagonizam ou revertem a broncoconstrição, um evento fisiológico que ocorre tipicamente na fase inicial das reacções asmáticas resultando em decréscimo da capacidade pulmonar e falta de fôlego. Exemplos de broncodilatadores incluem epinefrina, um alfa e beta-adrenérgico de ampla acção, e os beta-adrenérgicos albuterol, pirbuterol, metaproterenol, salmeterol e isoetarina. A broncodilatação pode também ser alcançada através da administração de xantinas, incluindo aminofilina e teofilina.
Um "glucocorticóide" tal como aqui se utiliza, descreve agentes baseados em esteróides possuindo actividade anti-inflamatória. Os glucocorticóides são vulgarmente utilizados para atenuar a reacção asmática de fase tardia. Exemplos de glucocorticóides incluem prednisona, dipropionato de beclometasona, acetonida de triamcinolona, flunisolida, betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de fluorocortisona, flunisolida, propionato de fluticasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona e triamcinolona.
Um "fármaco anti-inflamatório não esteróide" ou "ΑΙΝΕ", tal como aqui se utiliza descreve agentes possuindo actividade anti-inflamatória que não são baseados em esteróides. ΑΙΝΕ exemplares incluem acetaminofeno, aspirina, bromfenac sódico, diclofenac sódico, diflunisal, etodolac, fenoprofeno cálcico, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, meclofenamato sódico, ácido mefenâmico, nabumetona, naproxeno, naproxeno sódico, oxifenbutazona, fenilbutzona, piroxicam, sulindac, tolmetina sódica. II. Modos de Realização do Invento A. Preparação de Polipéptidos e Anticorpos A seguinte descrição refere-se principalmente à produção dos polipéptidos ou anticorpos aqui descritos através de cultura de células transformadas ou transfectadas com um 28 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ vector contendo ácido nucleico codificando os mesmos, e à purificação da proteína ou do anticorpo resultante. Está, como é claro, contemplado que podem ser empregues métodos alternativos, que são bem conhecidos na arte, para preparar tais polipéptidos ou anticorpos. Por exemplo, tais sequências ou porções delas, podem ser produzidas através de síntese peptídica directa utilizando técnicas de fase sólida (ver, p.ex., Stewart et al., "Solid-Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154, 1963). A síntese proteica in vitro pode ser efectuada utilizando técnicas manuais ou através de automação. A síntese automatizada pode ser alcançada, por exemplo, utilizando um Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) utilizando as instruções do fabricante. Várias porções das proteínas ou dos anticorpos aqui descritos podem ser quimicamente sintetizadas separadamente e combinadas utilizando métodos químicos ou enzimáticos. 1. isolamento de ADN codificando as proteínas aqui descritas ADN codificando as proteínas aqui descritas pode ser obtido a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido que se creia possuir o ARNm correspondente e para expressá-lo a um nível detectável. Concordantemente, tal ADN codificando uma proteína humana pode ser convenientemente obtido a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido humano, tal como descrito nos Exemplos. O gene codificando a proteína pode também ser obtido a partir de uma biblioteca genómica ou através de procedimentos sintéticos (p.ex., síntese de ácidos nucleicos automatizada).
As bibliotecas podem ser pesquisadas com sondas (tais como oligonucleótidos de pelo menos cerca de 20-80 bases) desenhadas para identificar o gene de interesse. A pesquisa da biblioteca de ADNc ou genómica com a sonda seleccionada pode ser conduzida utilizando procedimentos padrão, tal como descrito em Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Um meio alternativo para isolar o gene codificando o gene desejado é utilizar metodologia de PCR (Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., "PCR Primer: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)). 29 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
Os Exemplos abaixo descrevem técnicas para pesquisar uma biblioteca de ADNc. As sequências oligonucleotidicas seleccionadas como sondas devem ter um comprimento suficiente e serem suficientemente inequívocas para que sejam minimizados os falsos positivos. O oligonucleótido é de preferência marcado para que seja detectado após hibridação com o ADN da biblioteca a pesquisar. Os métodos de marcação são bem conhecidos na arte e incluem a utilização de radiomarcadores tais como ATP marcado com P, biotimlaçao ou marcaçao enzimática. As condições de hibridação, incluindo rigor moderado e rigor elevado, são proporcionadas em Sambrook et al., supra.
As sequências identificadas em tais métodos de pesquisa de bibliotecas podem ser comparadas e alinhadas com outras sequências conhecidas depositadas e disponíveis em bases de dados públicas tais como Genbank ou outras bases de dados de sequências privadas. A identidade da sequência (ao nível dos aminoácidos ou dos nucleótidos) dentro de regiões definidas da molécula ou ao longo da sequência inteira pode ser determinada utilizando métodos conhecidos na arte e tal como aqui descrito. O ácido nucleico possuindo a sequência de codificação da proteína pode ser obtido através da pesquisa de bibliotecas de ADNc ou genómicas seleccionadas utilizando a sequência de aminoácidos deduzida aqui divulgada pela primeira vez, e, se necessário, utilizando procedimentos de extensão de iniciadores convencionais tal como descrito em Sambrook et al., supra, para detectar precursores e intermediários de processamento de ARNm que podem não ter sido transcritos de forma reversa em ADNc. 2. Selecção e Transformação de Células Hospedeiras
As células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com vectores de expressão ou de clonagem contendo as proteínas ou os anticorpos aqui descritos para produção e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para indução de promotores, selecção de transformantes, ou amplificação dos genes codificando as sequências desejadas. As 30 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ condições de cultura, tais como meios, temperatura, pH e semelhantes, podem ser seleccionadas pelo perito na arte sem demasiada experimentação. Em geral, os princípios, protocolos, e técnicas práticas para maximização da produtividade das culturas celulares podem ser verificadas em "Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach", M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et al., supra.
Os métodos de transfecção de células eucarióticas e de transformação de células procarióticas são conhecidos do vulgar perito na arte, por exemplo, CaCl2, CaP04, mediada por lipossomas e electroporação. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é efectuada utilizando técnicas padrão apropriadas a tais células. O tratamento de cálcio empregando cloreto de cálcio, tal como descrito em Sambrook et al., supra, ou a electroporação são geralmente utilizados para procariotas. A infecção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada para transformação de certas células vegetais, tal como descrito por Shaw et al., Gene 23: 315, 1983 e WO 89/05859 publicado a 29 de Junho de 1989. Para células de mamífero sem tais paredes celulares, pode ser empregue o método de precipitação em fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology 52: 456-457, 1978. Os aspectos gerais das transfecções do sistema de células hospedeiras de mamífero foram descritos na Patente U.S. N.° 4399216. As transformações em levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact. 130: 946, 1977 e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76: 3829, 1979. No entanto, podem também ser utilizados outros métodos para introdução de ADN em células, tais como através de microinjecção nuclear, electroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas, ou policatiões, p.ex., polibreno, poliornitina. Para várias técnicas para transformação de células de mamífero, ver Keown et al., Methods in Enzymology 185: 527-537, 1990 e Mansour et al., Nature 336: 348-352, 1988. Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ADN nos vectores daqui incluem células de procariotas, de levedura ou de eucariotas superiores. Procariotas adequados incluem mas não se limitam a eubactérias tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como E. coli. Várias estirpes de 31 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ Ε. coli estão publicamente disponíveis, tais como a estirpe de E. coli K12 MM294 (ATCC 31446); E. coli X1776 (ATCC 31537); E. coli estirpe W3110 (ATCC 27325) e K5 772 (ATCC 53635). Outras células hospedeiras procarióticas adequadas incluem Enterobacteríaceae tais como Escheríchia, p. ex., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p. ex., Salmonella typhimurium, Serratia, p. ex., Serratia marcescans e Shigella, bem como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheniformis (p. ex., B. licheniformis 41P divulgada em DD 266710 publicada a 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa e Streptomyces. Estes exemplos são ilustrativos em vez de limitantes. A estirpe W3110 é um hospedeiro ou hospedeiro parental particularmente preferido porque é uma estirpe hospedeira comum para fermentações de produtos de ADN recombinante. De preferência, a célula hospedeira segrega quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por exemplo, a estirpe W3110 pode ser modificada para efectuar uma mutação genética nos genes codificando proteínas endógenas ao hospedeiro, com exemplos de tais hospedeiros a incluir E. coli W3110 estirpe 1A2, que tem o genótipo completo tonA; E. coli W3110 estirpe 9E4, que tem o genótipo completo tonA ptr3; E. coli W3110 estirpe 27C7 (ATCC 55244), que tem o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr; E. coli W3110 estirpe 37D6, que tem o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; E. coli W3110 estirpe 40B4, que é a estirpe 37D6 com uma mutação de deleção degP não resistente à canamicina; e uma estirpe de E. coli possuindo protease periplasmática mutante divulgada na Patente U.S. N.° 4946783 publicada a 7 de Agosto de 1990. Alternativamente, são adequados métodos de clonagem in vitro, p.ex., PCR ou outras reacções da polimerase de ácidos nucleicos.
Para além dos procariotas, micróbios eucariotas tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vectores codificando as proteínas ou os anticorpos aqui descritos. Saccharomyces cerevisiae é um microrganismo hospedeiro eucariótico inferior vulgarmente utilizado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach e Nurse, Nature 290: 140, 1981; EP 139383 publicada a 2 de Maio de 1985); hospedeiros de Kluyveromyces (Patente U.S. N.° 4943529; Fleer et ai., Bio/Technology 9: 968-975, 1991) tais 32 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ como, p. ex., K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154(2): 737-1742, 1983, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178); K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906; Van den Berg et al., Bio/Technology 8: 135, 1990), K. thermotolerans e K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183070; Sreekrishna et al., J. Basic Mícrobíol. 28: 265-278, 1988); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 5259-5263, 1979); Schwanniomyces tais como
Schwanniomyces occidentalis (EP 394538 publicada a 31 de Outubro de 1990); e fungos filamentosos tais como, p.ex., Neurospora·, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado a 10 de Janeiro de 1991) e hospedeiros de Aspergillus tais como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112: 284-289, 1983; Tilburn et al., Gene 26: 205-221, 1983; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1470-1474, 1984) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J. 4: 475-479, 1985). As leveduras metilotrópicas são adequadas aqui e incluem, mas não se limitam a, leveduras capazes de crescer em metanol seleccionadas a partir dos géneros que consistem em Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis e Rhodotorula. Uma lista de espécies especificas que são exemplares desta classe de leveduras pode ser verificada em C. Anthony, "The Biochemistry of Methylotrophs", 269, 1982) . Células hospedeiras adequadas para a expressão da forma glicosilada dos polipéptidos e anticorpos aqui descritos são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrado incluem células de insecto tais como células S2 de Drosophila e Sf9 de Spodoptera, bem como células vegetais. Exemplos de linhas de células hospedeiras de mamífero úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) e COS. Exemplos mais específicos incluem a linha de rim de macaco CVl transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para crescerem em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59, 1977); células de ovário de hamster
chinês/-DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216, 1980); células de sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251, 1980); células de pulmão humano
(W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB
8065); e tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51). A 33 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ selecção da célula hospedeira apropriada é considerada estar dentro da perícia na arte. 3. Selecção e Utilização de um Vector Replicável O ácido nucleico (p.ex., ADNc ou ADN genómico) codificando os polipéptidos e anticorpos aqui descritos pode ser inserido num vector replicável para clonagem (amplificação do ADN) ou para expressão. Estão disponíveis ao público vários vectores. O vector pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula virai ou fago. A sequência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida no vector através de uma variedade de procedimentos. Em general, o ADN é inserido num ou mais locais de endonucleases de restrição apropriados utilizando técnicas conhecidas na arte. Os componentes do vector incluem geralmente, mas não se limitam a, uma ou mais sequências sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento estimulador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição. A construção de vectores adequados contendo um ou mais destes componentes emprega técnicas de ligação padrão que são conhecidas dos peritos na arte. A produção recombinante dos polipéptidos ou anticorpos pode ser alcançada não só directamente, mas também como um polipéptido de fusão com um polipéptido heterólogo. A porção heteróloga pode ser uma sequência sinal ou outro polipéptido possuindo um local de clivagem específico no terminal N da proteína ou polipéptido maduro. Em geral, a sequência sinal pode ser um componente do vector ou pode ser uma parte do ADN codificando o polipéptido ou anticorpo que é inserido no vector. A sequência sinal pode ser uma sequência sinal procariótica seleccionada, por exemplo, a partir do grupo dos líderes da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou enterotoxina II termo-estável. Para a secreção em levedura a sequência sinal pode ser, p.ex., o líder da invertase de levedura, líder do factor alfa (incluindo os líderes do factor α de Saccharomyces e Kluyveromyces, o último descrito na Patente U.S. N.° 5010182), ou o líder da fosfatase ácida, o líder de glucoamilase de C. albicans (EP 362179 publicada a 4 de Abril de 1990) ou o sinal descrito em WO 90/13646 publicado a 15 de Novembro de 1990. Na expressão em células de mamífero, 34 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ podem ser utilizadas sequências sinal de mamífero para dirigir a secreção da proteína, tais como sequências sinal de polipéptidos segregados da mesma espécie ou de espécies aparentadas, bem como líderes de secreção virais.
Tantos os vectores de expressão como de clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite que o vector se replique numa ou mais células hospedeiras seleccionadas. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo 2μ é adequada para levedura, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vectores de clonagem em células de mamífero.
Os vectores de expressão e de clonagem conterão tipicamente um gene de selecção, também designado um marcador seleccionável. Os genes de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, p.ex., ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos, p.ex., o gene codificando a D-alanina-racemase para Bacilli.
Um exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero são os que permitem a identificação de células competentes para tomar a sequência de ADN codificando os polipéptidos ou anticorpos aqui descritos, tais como DHFR ou timidina-quinase. Uma célula hospedeira apropriada quando é empregue DHFR de tipo selvagem é a linha celular CHO deficiente na actividade de DHFR, preparada e propagada tal como descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216, 1980. Um gene de selecção adequado para utilizar em levedura é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al.r Nature 282: 39, 1979; Kingsman et al., Gene 7: 141, 1979; Tschemper et al., Gene 10: 157, 1980). O gene trpl proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura sem a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics 85: 12, 1977). 35 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
Os vectores de expressão e de clonagem contêm habitualmente um promotor operativamente ligado a tais sequências de ADN para dirigir a síntese de ARNm. Os promotores reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras são bem conhecidos. Promotores adequados para utilizar com hospedeiros procarióticos incluem os sistemas promotores da β-lactamase e da lactose (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), fosfatase alcalina, um sistema promotor do triptofano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8: 4057, 1980; EP 36776) e promotores híbridos tais como o promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 21-25, 1983). Os promotores para utilizar em sistemas bacterianos conterão também uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente ligada a tais sequências de ADN.
Exemplos de sequências promotoras adequadas para utilizar com hospedeiros de levedura incluem os promotores para a 3-fosfoglicerato-quinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 1: 149, 1968; Holland, Bíochemístry 17: 4900, 1978), tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfo-frutoquinase, glicose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglicose-isomerase e glucoquinase.
Outros promotores de levedura, que são promotores indutíveis possuindo a vantagem adicional de transcrição controlada através das condições de crescimento, são as regiões promotoras para a álcool-desidrogenase-2, o isocitocromo C, a fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas ao metabolismo do azoto, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização da maltose e da galactose. Os vectores e promotores adequados para utilizar em expressão de levedura são melhor descritos em EP 73657. A transcrição de vectores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, através de promotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como o vírus de polioma, vírus da varíola aviária, (UK 2211504 publicada a 5 36 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ de Julho de 1989), adenovírus (tais como Adenovírus 2), vírus do papilomavírus bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e Vírus Símio 40 (SV40) de promotores heterólogos de mamífero, p.ex., o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, e de promotores de choque térmico desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas celulares hospedeiros. A transcrição do ácido nucleico codificando os polipéptidos ou anticorpos daqui por eucariotas superiores é aumentada através da inserção de uma sequência estimuladora no vector. Os estimuladores são elementos de ADN de acção em eis, habitualmente cerca de 10 a 300 pb, que actuam num promotor aumentando a sua transcrição. São agora conhecidas muitas sequências estimuladoras de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, utilizar-se-á um estimulador de um vírus de células eucarióticas. Exemplos incluem o estimulador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o estimulador do promotor inicial de citomegalovírus, o estimulador de polioma no lado tardio da origem de replicação e estimuladores de adenovírus. O estimulador pode ser processado no vector numa posição 5' ou 3' da sequência de codificação, mas é colocado de preferência num local a 5' do promotor.
Os vectores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (células de levedura, fungos, insecto, vegetais, animais, humanas ou nucleadas de outros organismos multicelulares) conterão também sequências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do ARNm. Tais sequências estão vulgarmente disponíveis a partir das regiões não traduzidas 5', e ocasionalmente 3', de ADN ou ADNc eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do ARNm codificando os polipéptidos ou anticorpos aqui descritos.
Ainda outros métodos, vectores e células hospedeiras adequados para adaptação à síntese dos polipéptidos ou anticorpos aqui descritos em cultura de células de vertebrado recombinantes são descritos em Gething et al., Nature 293: 37 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
620-625, 1981; Mantei et al., Nature 281: 40-46, 1979; EP 117060 e EP 117058. 4. Detecção de Amplificação/Expressão do Gene A amplificação e/ou expressão do gene pode ser medida numa amostra directamente, por exemplo, através de Southern blotting, Northern blotting convencional para quantificar a transcrição de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 5201-5205, 1980), dot blotting (análise de ADN), ou hibridação in situ, utilizando uma sonda apropriadamente marcada, com base nas sequências aqui proporcionadas. Alternativamente, podem ser empregues anticorpos que podem reconhecer dúplexes específicos, incluindo dúplexes de ADN, dúplexes de arn e dúplexes híbridos de ADN-ARN ou dúplexes de ADN-proteína. Os anticorpos podem por sua vez ser marcados e o ensaio pode ser realizado quando o dúplex está ligado a uma superfície, de modo a que após a formação do dúplex na superfície, possa ser detectada a presença do anticorpo ligado ao dúplex. A expressão do gene pode, alternativamente, ser medida através de métodos imunológicos, tais como coloração imuno-histoquímica de células ou secções de tecido e ensaio da cultura celular ou de fluidos corporais, para quantificar directamente a expressão do produto do gene. Os anticorpos úteis para coloração imuno-histoquímica e/ou ensaio dos fluidos da amostra podem ser monoclonais ou policlonais e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra os polipéptidos aqui descritos ou contra um péptido sintético baseado nas sequências de ADN aqui proporcionadas ou contra uma sequência exógena fundida com o ADN codificando tais polipéptidos e anticorpos e codificando um epítopo de anticorpo específico. 5. Purificação do Polipéptido
As formas podem ser recuperadas a partir do meio de cultura ou de lisados das células hospedeiras. Se ligadas à membrana, podem ser libertadas da membrana utilizando uma solução detergente adequada (p.ex., Triton-X 100) ou através de clivagem enzimática. As células empregues na expressão de dos polipéptidos ou anticorpos aqui descritos podem ser 38 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ rebentadas através de vários meios físicos ou químicos, tais como ciclos de congelação-descongelação, ultra-sons, destruição mecânica, ou agentes de lise celular.
Pode desejar-se purificar os polipéptidos ou anticorpos aqui descritos a partir de proteínas ou outros polipéptidos celulares recombinantes. Os seguintes procedimentos são exemplares de procedimentos adequados de purificação: através de fraccionamento numa coluna de permuta iónica; precipitação em etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia em sílica ou numa resina de permuta catiónica tal como DEAE; cromatofocagem; SDS-PAGE; precipitação em sulfato de amónio; filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A-Sepharose para remover contaminantes tais como IgG; e colunas de quelantes metálicos para ligar formas marcadas com epítopos do polipéptido ou anticorpo. Podem ser empregues vários métodos de purificação proteica e tais métodos são conhecidos na arte e estão descritos por exemplo em Deutscher, Methods in Enzymology 182: 1990; Scopes, "Protein Purification: Principies e Practice", Springer-Verlag, New York, 1982. O passo ou passos de purificação seleccionados dependerão, por exemplo, da natureza do processo de produção utilizado e do polipéptido ou anticorpo particular produzido. B. Preparação do anticorpo
Em certas concretizações a proteína de escolha é um anticorpo. Seguem-se técnicas para a produção de anticorpos, incluindo anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecíficos e heteroconjugados. 1) Anticorpos policlonais
Os anticorpos policlonais são geralmente criados em animais através de múltiplas injecções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antigénio relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antigénio relevante a uma proteína que seja imunogénica na espécie a imunizar, p.ex., hemocianina da lapa (KLH), albumina do soro, tiroglobulina bovina ou inibidor da tripsina de soja, utilizando um agente bifuncional ou de derivação, p.ex., éster de maleimido- 39 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ benzoílsulfossuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são, independentemente, grupos alquilo inferiores. Exemplos de adjuvantes que podem ser empregues incluem adjuvante completo de Freund e adjuvante MPL-TDM (monofosforil-Lípido A, dicorinomicolato de trealose sintético) . O protocolo de imunização pode ser seleccionado por um perito na arte sem demasiada experimentação.
Os animais são imunizados contra o antigénio, conjugados imunogénicos, ou derivados através da combinação de, p.ex., 100 pg ou 5 pg da proteína ou conjugado (para coelhos ou ratinhos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injectando a solução intradermicamente em múltiplos locais. Um mês depois, os animais são reforçados com 1/5 a 1/10 da quantidade original do péptido ou conjugado em adjuvante completo de Freund através de injecção subcutânea em múltiplos locais. Sete a catorze dias depois, os animais são sangrados e o soro é ensaiado quanto ao título de anticorpo. Os animais são reforçados até ao título alcançar um patamar. Os conjugados podem também ser produzidos em cultura de células recombinantes como proteínas de fusão. Agentes de agregação tais como alúmen são também adequadamente utilizados para aumentar a resposta imunitária. 2) Anticorpos monoclonais
Os anticorpos monoclonais são obtidos a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais constituindo a população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural e/ou modificações pós-tradução (p.ex., isomerizações, amidações) que possam estar presentes em quantidades menores. Assim, o adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos.
Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando o método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al.r Nature 256: 495, 1975, ou podem ser produzidos através de métodos de ADN recombinante (Patente U.S. N.° 4816567). 40 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
No método de hibridoma, um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado tal como aqui descrito acima para desencadear linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). O agente imunizante incluirá tipicamente a proteína antigénica ou um variante de fusão desta. Geralmente são utilizados linfócitos do sangue periférico ("PBLs") se forem desejadas células de origem humana, ou são utilizadas células do baço ou células de nódulos linfáticos se forem desejadas fontes de mamífero não humano. Os linfócitos são então fundidos com uma linha celular imortalizada utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies e Practice", Academic Press, 1986) págs. 59-103).
As linhas celulares imortalizadas são habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origem em roedor, bovino e humano. Habitualmente, são empregues linhas celulares de mieloma de rato ou ratinho. As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e criadas num meio de cultura adequado que contém de preferência uma ou mais substâncias que inibam o crescimento ou a sobrevivência das células parentais de mieloma não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não tiverem a enzima hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"), substâncias estas que impedem o crescimento de células deficientes em HGPRT. Células de mieloma imortalizadas preferidas são as que se fundem eficientemente, suportam uma produção estável de 41 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ elevado nível de anticorpo pelas células produtoras de anticorpos seleccionadas e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. Entre estas, as preferidas são linhas de mieloma de murídeo, tais como as derivadas de tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-11 disponíveis no Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, e células SP-2 (e derivados destas, p.ex., X63-Ag8-653) disponíveis na American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia, USA. Foram também descritas linhas celulares de mieloma humano e de heteromieloma ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001, 1984; Brodeur et ai., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987)). O meio de cultura no qual as células de hibridoma estão a crescer é ensaiado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. De preferência, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada através de imunoprecipitação ou através de um ensaio de ligação in vítro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunossorvente enzimático (ELISA). O meio de cultura no qual as células de hibridoma são cultivadas pode então ser ensaiado quanto à presença de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio desejado. De preferência, a afinidade e especificidade de ligação do anticorpo monoclonal podem ser determinadas através de imunoprecipitação ou através de um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunossorvente enzimático (ELISA). Tais técnicas e ensaios são conhecidos na arte. Por exemplo, a afinidade de ligação pode ser determinada através de análise Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. 107: 220, 1980.
Após serem identificadas as células de hibridoma que produzem os anticorpos de especificidade, afinidade e/ou actividade desejadas, os clones podem ser subclonados através de procedimentos de diluição limitante e crescimento através de métodos padrão (Goding, supra). Meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, meio DMEM ou RPMI-1640. 42 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
Adicionalmente, as células de hibridoma podem ser criadas in vivo como tumores de ascites num mamífero.
Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascites ou soro através de procedimentos de purificação de imunoglobulinas convencionais tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia de hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.
Os anticorpos monoclonais podem também ser produzidos através de métodos de ADN recombinante, tais como os descritos na Patente U.S. N.° 4816567. ADN codificando os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (p.ex., através da utilização de sondas oligonucleotídicas que sejam capazes de se ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murídeo). As células de hibridoma servem como fonte preferida de tal ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que de outro modo não produzem proteína imunoglobulina, para sintetizar anticorpos monoclonais em tais células recombinantes. Artigos de revisão sobre expressão recombinante em bactérias de ADN codificando o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5: 256-262, 1993 e Pluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188, 1992.
Noutra concretização, os anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas fágicas de anticorpos geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al.f Nature 348: 552-554, 1990. Clackson et al., Nature 352: 624-628, 1991 e Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991 descrevem o isolamento de anticorpos de murídeo e humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas fágicas. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (intervalo nM) através de baralhação de cadeias (Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783, 1992), bem como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construção de bibliotecas fágicas muito grandes (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266, 43 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ 1993). Assim, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpos monoclonais para isolamento de anticorpos monoclonais. O ADN pode também ser modificado, por exemplo, através da substituição da sequência de codificação para os dominios constantes das cadeias pesadas e leves humanas em vez das sequências de murideo homólogas (Patente U.S. N.° 4816567; Morrison et al., supra) ou através da união covalente à sequência de codificação da imunoglobulina de toda ou parte da sequência de codificação para um polipéptido não-imunoglobulina. Tais polipéptidos não-imunoglobulina substituem tipicamente os dominios constantes de um anticorpo ou substituem os dominios variáveis de um local de combinação com um antigénio de um anticorpo para criar um anticorpo quimérico bivalente compreendendo um local de combinação com um antigénio possuindo especificidade para um antigénio e outro local de combinação com um antigénio possuindo especificidade para um antigénio diferente.
Os anticorpos monoclonais aqui descritos podem ser anticorpos monovalentes, cuja preparação é bem conhecida na arte. Por exemplo, um método envolve expressão recombinante da cadeia leve da imunoglobulina e de uma cadeia pesada modificada. A cadeia pesada é truncada geralmente em qualquer ponto na região Fc de modo a impedir a ligação cruzada da cadeia pesada. Alternativamente, residuos de cisteína relevantes podem ser substituídos por outro residuo de aminoácido ou serem suprimidos de modo a prevenir a ligação cruzada. Métodos in vitro são também adequados para a preparação de anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir fragmentos destes, particularmente fragmentos Fab, pode ser alcançada utilizando técnicas de rotina conhecidas na arte.
Podem também ser preparados anticorpos quiméricos ou hibridos in vitro utilizando métodos conhecidos na química de síntese de proteínas, incluindo aqueles envolvendo agentes de ligação cruzada. Por exemplo, podem ser construídas imunotoxinas utilizando uma reacção de permuta de dissulfureto ou através da formação de uma ligação tioéter. Exemplos de 44 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato. 3) Anticorpos humanizados
Os anticorpos podem ainda compreender anticorpos humanizados ou humanos. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (p.ex., de murideo) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos destas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao antigénio de anticorpos) que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais os resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato ou coelho possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns casos, resíduos estruturais de Fv da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não se verifiquem no anticorpo receptor nem na CDR importada ou sequências estruturais. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos ou pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de consenso da imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado compreenderá também optimamente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323-329, 1988; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596, 1992.
Os métodos para humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na arte. Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente referidos como resíduos "de importação", que são tipicamente tomados de um domínio variável "de importação". A humanização pode ser 45 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ essencialmente efectuada seguindo o método de Winter e colegas, Jones et ai., Nature 321: 522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536, 1988, ou através da substituição de sequências de um anticorpo humano pelas correspondentes CDR ou sequências de CDR de roedor. Concordantemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. N.° 4816567), em que substancialmente menos que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedor. A escolha de domínios humanos variáveis, tanto leves como pesados, a utilizar na produção de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o designado método do "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é pesquisada contra a biblioteca inteira de sequências de domínios variáveis humanos conhecidas. A sequência humana que estiver mais próxima da do roedor é então aceite como estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado. Sims et al., J. Immunol. 151: 2296-2308, 1993; Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987. Outro método utiliza uma determinada estrutura derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um determinado subgrupo de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes. Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285-4289, 1992; Presta et al., J. Immunol. 151: 2623-2632, 1993. É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de elevada afinidade para o antigénio e de outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar este objectivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulina estão vulgarmente disponíveis e são familiares aos peritos na arte. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e apresentam estruturas conformacionais 46 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas seleccionadas. A inspecção destas apresentações permite a análise do provável papel dos residuos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise dos residuos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao seu antigénio. Deste modo, residuos de FR podem ser seleccionados e combinados a partir das sequências do receptor e de importação de modo a que seja alcançada a característica desejada do anticorpo, tal como uma maior afinidade para o antigénio ou antigénios alvo. Em geral, os residuos de CDR estão directamente e muito substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antigénio.
Estão contempladas várias formas do anticorpo humanizado. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser um fragmento de anticorpo, tal como um Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agentes citotóxicos para gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo humanizado pode ser um anticorpo intacto, tal como um anticorpo IgGl intacto. 4) Anticorpos humanos
Como alternativa à humanização, podem ser gerados anticorpos humanos. Por exemplo, é agora possível produzir animais transgénicos (p.ex., ratinhos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinas endógenas. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de junção da cadeia pesada do anticorpo (JH) em ratinhos quiméricos e mutantes na linha germinal resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência da série génica de imunoglobulinas da linha germinal humana em tais ratinhos mutantes na linha germinal resultará na produção de anticorpos humanos após confronto com antigénio. Ver, p.ex., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 2551, 1993; Jakobovits et al., Nature 362: 255-258, 1993; Bruggermann et al., Year in Iirnun. 1: 33, 1993;
Patente U.S. N.° 5591669 e WO 97/17852.
Alternativamente, pode ser utilizada tecnologia de apresentação fágica para produzir anticorpos humanos e 47 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ fragmentos de anticorpo in vitro, a partir de repertórios de genes do domínio variável (V) de imunoglobulinas, de dadores não imunizados. McCafferty et al., Nature 348: 552-553, 1990; Hoogenboom e Winter, j. Mol. Biol. 227: 381, 1991. De acordo com esta técnica, os genes do domínio V dos anticorpos são clonados enquadrados num gene da proteína de revestimento principal ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e apresentados como fragmentos de anticorpo funcionais à superfície da partícula fágica. Como a partícula filamentosa contém uma única cópia de ADN de cadeia simples do genoma do fago, as selecções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo resultam também em selecção do gene codificando o anticorpo que exibe essas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades das células B. A apresentação fágica pode ser efectuada numa variedade de formatos, revistos, p.ex., em Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Curr. Opin Struct . Biol. 3: 564-571, 1993. Para apresentação fágica podem ser utilizadas várias fontes de segmentos de genes V. Clackson et al., Nature 352: 624-628, 1991 isolaram uma série diversa de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados dos baços de ratinhos imunizados. Pode ser construído um repertório de genes V de dadores humanos não imunizados e anticorpos para uma série diversa de antigénios (incluindo auto-antigénios) pode ser isolada seguindo essencialmente as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991, ou Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734, 1993. Ver também, Patente U.S. Nos. 5565332 e 5573905.
As técnicas de Cole et al., e Boerner et al., estão também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss, pág. 77 (1985) e J. Immunol. 147(1): 86-95, 1991. Semelhantemente, anticorpos humanos podem ser produzidos através da introdução de loci de imunoglobulinas humanas em animais transgénicos, p.ex., ratinhos nos quais os genes de imunoglobulina endógenos foram parcialmente ou completamente inactivados. Após confronto, observa-se a produção de anticorpos humanos, que se assemelham muito aos observados em humanos em todos os aspectos, incluindo rearranjo génico, montagem e repertório de anticorpos. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. N.os 48 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ 5545807; 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016 e nas seguintes publicações cientificas: Marks et al.,
Bio/Technology 10: 779-783, 1992; Lonberg et al., Nature 368: 856-859, 1994; Morrison, Nature 368: 812-13, 1994, Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51, 1996, Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826, 1996 e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Imunol. 13: 65-93, 1995.
Finalmente, os anticorpos humanos podem também ser gerados in vítro através de células B activadas (ver Patentes U.S. N.os 5567610 e 5229275) . 5) Fragmentos de anticorpo
Em certas circunstâncias há vantagem em utilizar fragmentos de anticorpo, em vez de anticorpos inteiros. O menor tamanho dos fragmentos permite uma rápida eliminação, e pode conduzir a melhor acesso a tumores sólidos.
Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos eram derivados através de digestão proteolitica de anticorpos intactos (ver, p.ex., Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Method. 24: 107-117, 1992; e Brennan et al., Science 229: 81, 1985). No entanto, estes fragmentos podem agora ser produzidos directamente através de células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos de anticorpo Fab, Fv e scFv podem todos ser expressos e segregados a partir de E. coli, permitindo assim a produção fácil de grandes quantidades destes fragmentos. Os fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir das bibliotecas fágicas de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser directamente recuperados de E. coli e ligados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167, 1992). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados directamente a partir de cultura de células hospedeiras recombinantes. Fab e F(ab')2 com maior semi-vida in vivo são descritos na Patente U.S. N.° 5869046. Noutras concretizações, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Ver WO 93/16185; Patente U.S. N.° 5571894 e Patente U.S. N.° 5587458. O fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpo linear", p.ex., tal como 49 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ descrito na Patente U.S. N.° 5641870. Tais fragmentos de anticorpo lineares podem ser monoespecificos ou biespecificos. 6) Terapia de Pró-fármacos Mediada por Enzimas Dependentes de Anticorpos (ADEPT)
Os anticorpos do presente invento podem também ser utilizados em ADEPT através da conjugação do anticorpo com uma enzima activadora de um pró-fármaco que converta um pró-fármaco (p.ex., um agente quimioterapêutico peptidilo, ver WO81/01145) num fármaco anti-cancro activo. Ver, por exemplo, WO 88/07378 e Patente U.S. N.° 4975278. O componente enzima do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de actuar num pró-fármaco de modo a convertê-lo na sua forma citotóxica mais activa.
As enzimas que são úteis no método deste invento incluem, mas não se limitam a, glicosidase, glicose-oxidase, lisozima humana, glucuronidase humana, fosfatase alcalina útil para conversão de pró-fármacos contendo fosfato em fármacos livres; arilsulfatase útil para converter pró-fármacos contendo sulfato em fármacos livres; citosina-desaminase útil para converter 5-fluorocitosina não tóxica no fármaco anti-cancro 5-fluorouracilo; proteases, tais como protease de Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases (p. ex., carboxipeptidase G2 e carboxipeptidase A) e catepsinas (tais como catepsinas B e L), que são úteis para conversão de pró-fármacos contendo péptidos em fármacos livres; D-alanilcarboxipeptidases, úteis para converter pró-fármacos que contenham substituintes de D-aminoácidos; enzimas clivadoras de hidratos de carbono tais como β-galactosidase e neuraminidase úteis para converter pró-fármacos glicosilados em fármacos livres; β-lactamase útil para converter fármacos derivados com β-lactamos em fármacos livres; e penicilina- amidases, tais como penicilina V-amidase ou penicilina G- amidase, úteis para converter fármacos derivados nos azotos das suas aminas com grupos fenoxiacetilo ou fenilacetilo, respectivamente, em fármacos livres. Alternativamente, anticorpos com actividade enzimática, também conhecidos na arte como "abzimas", podem ser utilizados para converter os pró-fármacos do presente invento em fármacos activos livres 50 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ (ver, ρ. ex., Massey, Nature 328: 457-458, 1987). Conjugados anticorpo-abzima podem ser preparados tal como aqui descrito para distribuição da abzima a uma população de células tumorais.
As enzimas acima podem ser covalentemente ligadas aos polipéptidos ou anticorpos aqui descritos através de técnicas bem conhecidas na arte tais como a utilização dos agentes de ligação cruzada heterobifuncionais discutidos acima. Alternativamente, podem ser construídas proteínas de fusão compreendendo pelo menos a região de ligação ao antigénio do anticorpo ligada a pelo menos uma porção funcionalmente activa de uma enzima do presente invento utilizando técnicas de ADN recombinante bem conhecidas na arte (ver, p. ex., Neuberger et al., Nature 312: 604-608, 1984). 7) Anticorpos biespecíficos e poliespecíficos
Anticorpos biespecíficos (BsAbs) são anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes, incluindo aqueles na mesma ou noutra proteína. Alternativamente, um braço pode ser armado para se ligar ao antigénio alvo e outro braço pode ser combinado com um braço que se ligue a uma molécula desencadeadora num leucócito tal como uma molécula receptora de células T (p.ex., CD3), ou receptores de Fc para IgG (FcyR), tal como FcyRI (CD64), FcyRll (CD32) e FcyRIII (CD16), de modo a focar e localizar os mecanismos de defesa celular na célula que expressa o antigénio alvo. Tais anticorpos podem ser derivados de anticorpos inteiros ou fragmentos de anticorpo (p.ex., anticorpos biespecíficos F(ab')2).
Os anticorpos biespecíficos podem também ser utilizados para localizar agentes citotóxicos em células que expressam o antigénio alvo. Tais anticorpos possuem um braço que se liga ao antigénio desejado e outro braço que se liga ao agente citotóxico (p.ex., saporina, anti-interferão a, alcaloide vinca, cadeia A do rícino, metotrexato ou hapteno de isótopo radioactivo). Exemplos anticorpos biespecíficos conhecidos incluem anti-ErbB2/anti-FcgRlll (WO 96/16673), anti-ErbB2/anti-FcgRI (U.S.P. 5837234), anti-ErbB2/anti-CD3 (U.S.P. 5821337) . 51 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
Os métodos para produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na arte. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos inteiros baseia-se na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm especificidades diferentes. Millstein et al., Nature 305: 537-539, 1983. Devido à distribuição aleatória das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma potencial mistura de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecifica correcta. A purificação da molécula correcta, que é habitualmente feita através de passos de cromatografia de afinidade, é bastante trabalhosa e os rendimentos do produto são baixos. Procedimentos semelhantes são divulgados em WO 93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659, 1991.
De acordo com uma abordagem diferente, os dominios variáveis do anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antigénio) são fundidos com as sequências do domínio constante da imunoglobulina. A fusão é de preferência com um domínio constante da cadeia pesada da imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões de charneira, CH2 e CH3. É preferível ter a primeira região constante da cadeia pesada (CHI) contendo o local necessário para ligação à cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os ADN codificando as fusões de cadeia pesada da imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve da imunoglobulina, são inseridos em vectores de expressão separados e são co-transfectados num organismo hospedeiro adequado. Isto proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptídicos nas concretizações quando razões desiguais das três cadeias polipeptídicas utilizadas na construção proporcionam os rendimentos óptimos. É, no entanto, possível inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias polipeptídicas num vector de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em razões iguais resulta em elevados rendimentos ou quando as razões não têm particular significância. 52 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
Numa concretização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecificos são compostos por uma cadeia pesada de imunoglobulina hibrida com uma primeira especificidade de ligação num braço e um par híbrido de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Verificou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeias de imunoglobulina indesejadas, uma vez que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade das moléculas biespecificas proporciona um modo fácil de separação. Esta abordagem é divulgada em WO 94/04690. Para mais detalhes sobre a criação de anticorpos biespecificos, ver, por exemplo, Suresh et ai., Methods in Enzymology 121: 210, 1986.
De acordo com outra abordagem descrita em W096/27011 ou U.S.P. 5731168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser concebida para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recuperados a partir da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte da região CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenas da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (p.ex., tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante ao da cadeia ou cadeias laterais grandes são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo através da substituição de cadeias laterais de aminoácidos grandes por mais pequenas (p. ex., alanina ou treonina). Isto proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero em relação a outros produtos finais indesejados tais como homodímeros.
Na literatura foram descritas técnicas para a criação de anticorpos biespecificos a partir de fragmentos de anticorpo. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos biespecificos utilizando ligação química. Brennan et al., Science 229: 81, 1985 descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2· Estes fragmentos são reduzidos na presença de um agente de complexação ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vizinhos e prevenir a formação de dissulfureto 53 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é então reconvertido no derivado Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecifico. Os anticorpos biespecificos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização selectiva de enzimas.
Os fragmentos Fab' podem ser directamente recuperados a partir de E. coli e quimicamente ligados para formar anticorpos biespecif icos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225, 1992 descrevem a produção de moléculas de anticorpo biespecificas F(ab')2 completamente humanizadas. Cada fragmento Fab' foi separadamente segregado a partir de E. coli e sujeito a ligação química dirigida in vitro para formar o anticorpo biespecifico. O anticorpo biespecifico assim formado foi capaz de se ligar a células sobre-expressando o receptor ErbB2 e células T humanas normais, bem como desencadear a actividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor da mama humano. Várias técnicas para produzir e isolar fragmentos de anticorpo biespecificos directamente a partir de cultura de células recombinantes foram também descritas. Por exemplo, foram produzidos heterodímeros bivalentes utilizando fechos de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553, 1992. Os péptidos com fechos de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes através de fusão de genes. Os homodímeros do anticorpo foram reduzidos na região charneira para formar monómeros e depois re-oxidados para formar os heterodímeros do anticorpo. A tecnologia de "diacorpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448, 1993 proporcionou um mecanismo alternativo para produção de fragmentos de anticorpo biespecificos/bivalentes. Os fragmentos compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligador que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Concordantemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando deste modo dois locais de ligação ao antigénio. Foi também relatada outra estratégia para produzir fragmentos de anticorpo 54 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ biespecificos/bivalentes através da utilização de dimeros de Fv de cadeia simples (scFv) . Ver Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368, 1994.
Os anticorpos com mais de duas valências estão contemplados. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos triespecificos. Tutt et al., J. Imunol. 147: 60, 1991.
Anticorpos biespecificos exemplares podem ligar-se a dois epitopos diferentes numa dada molécula. Alternativamente, pode combinar-se um braço anti-proteina com um braço que se ligue a uma molécula desencadeadora num leucócito, tal como uma molécula receptora de células T (por exemplo, CD2, CD3, CD28 ou B7) ou receptores de Fc para igG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16) de modo a focar os mecanismos de defesa celular na célula que expressa a proteina particular. Os anticorpos biespecificos podem também ser utilizados para localizar agentes citotóxicos em células que expressem uma determinada proteina. Tais anticorpos possuem um braço de ligação à proteina e um braço que se liga a um agente citotóxico ou um quelante de radionúclidos, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA ou TETA. Outro anticorpo biespecífico de interesse liga-se à proteina de interesse e liga-se adicionalmente ao factor tecidular (TF). 6) Anticorpos heteroconjugados
Os anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos covalentemente unidos. Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser ligado a avidina, o outro a biotina. Tais anticorpos foram propostos, por exemplo, para dirigirem células do sistema imunitário para células indesejadas, U.S.P. 4676980, e para tratamento de infecção por VIH. WO 91/00360; WO 92/200373 e EP 0308936. Está contemplado que os anticorpos podem ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos na química de síntese de proteínas, incluindo aqueles envolvendo agentes de ligação cruzada. Por exemplo, podem ser construídas imunotoxinas utilizando uma reacção de permuta de dissulfureto ou através da formação de uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e os divulgados, por exemplo, na Patente U.S. N.° 4676980. Os 55 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos utilizando quaisquer métodos de ligação cruzada convenientes. Os agentes de ligação cruzada adequados são bem conhecidos na arte, e são divulgados na Patente U.S. N.° 4676980, juntamente com várias técnicas de ligação cruzada. 7) Desenho da Função Efectora
Pode ser desejável modificar o anticorpo do presente invento em relação à função efectora, de modo a aumentar a eficácia do anticorpo no tratamento de cancro. Por exemplo, pode ser introduzido um ou mais resíduos de cisteína na região Fc, permitindo assim a formação de ligações dissulfureto intercadeias nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter uma capacidade de internalização melhorada e/ou maior morte celular mediada pelo complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Ver, Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195, 1992 e Shopes, J. Immunol. 148: 2918-2922, 1992. Podem também ser produzidos anticorpos homodiméricos com maior actividade anti-tumoral utilizando agentes de reticulação heterobifuncionais, tal como descrito em Wolff et al., Câncer Research 53: 2560-2565, 1993. Alternativamente, pode conceber-se um anticorpo que tenha regiões Fc duplas e possa deste modo ter maior capacidade de lise do complemento e de ADCC. Ver, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230, 1989. 8) Imunoconjugados O presente invento refere-se também a imunoconjugados compreendendo um anticorpo conjugado com um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, toxina (p.ex., uma toxina enzimaticamente activa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal ou fragmentos seus) ou um isótopo radioactivo (i.e., um radioconjugado).
Agentes quimioterapêuticos úteis na geração de tais imunoconjugados incluem BCNU, estreptozoicina, vincristina, vinblastina, adriamicina e 5-fluorouracilo.
Toxinas enzimaticamente activas e fragmentos destas que podem ser utilizados incluem a cadeia A da difteria, 56 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ fragmentos activos sem ligação da toxina da difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de rícino,, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.
Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico são produzidos utilizando uma variedade de agentes de conjugação de proteínas bifuncionais tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como dimetil-adipimidato-HCl), ésteres activos (tais como suberato de dissuccinimidilo), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoíl)-hexanodiamina), derivados bis-diazónio (tais como bis-(p-diazónio-benzoíl)etilenodiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-activos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, pode ser preparada uma imunotoxina de rícino tal como descrito em Vitetta et al., Science 238: 1098, 1987. O ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminopenta-acético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para conjugação de radionucleótidos com o anticorpo. Ver WO94/11026. O ligador pode ser um "ligador clivável" facilitando a libertação do fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, pode ser utilizado um ligador instável em ácido, um ligador sensível a peptidases, um ligador dimetílico ou um ligador contendo dissulfureto (Chari et al., Câncer Res. 52: 127-131, 1992).
Adicionalmente, estão também contempladas as toxinas de molécula pequena tais como caliqueamicina, maitansina (U.S.P. 5208020), tricoteno e CC1065 como toxinas conjugáveis para utilização com a formulação do presente invento. Numa concretização o anticorpo inteiro ou fragmentos de ligação ao antigénio deste podem ser conjugados com uma ou mais moléculas de maitansinóides (p.ex., cerca de 1 a cerca de 10 moléculas de maitansinóides por molécula de anticorpo). Os maitansinóides são inibidores mitóticos que actuam através da 57 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ inibição da polimerização da tubulina. Foram descritos maitansinóides isolados a partir de fontes naturais ou preparados sinteticamente, incluindo maitansina, maitansinal e derivados e análogos destes, ver p.ex., Patente U.S. N.° 5208020 e referências ai citadas (ver col. 2, linha 53 a col. 3, linha 10) e Patentes U.S. 3896111 e 4151042. O método de preparação de conjugados de anticorpo-maitansinóide é também descrito na Pat. U.S. N.° 5208020. Numa concretização preferida, um maitansinóide é ligado ao anticorpo através de um dissulfureto ou outro grupo ligador contendo enxofre. A maitansina pode, por exemplo, ser convertida em May-SS-Me, que pode ser reduzido em May-SH3 e reagir com o anticorpo modificado para gerar um imunoconjugado maitansinóide-anticorpo. Chari et al., Câncer Res. 52: 127-131, 1992. O anticorpo pode ser modificado através de métodos conhecidos e o anticorpo contendo grupos tiol livres ou protegidos reage então com um maitansinóide contendo dissulfureto para produzir o conjugado. A citotoxicidade do conjugado anticorpo-maitansinóide pode ser medida in vitro ou in vivo através de métodos conhecidos e a CI50 determinada. A caliqueamicina é outro imunoconjugado de interesse. A família de antibióticos das caliqueamicinas é capaz de produzir quebras do ADN de cadeia dupla a concentrações sub-picomolares. Análogos estruturais da caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas não se limitam a, γι1, α21, α3χ, N-acetil-γι1, PSAG e Θ1! (Hinman et al., Câncer Res. 53: 3336-3342, 1993 e Lode et al., Câncer Res. 58: 2925-2928, 1998). Outros fármacos anti-tumorais com que o anticorpo pode ser conjugado incluem QFA que é um antifolato. Tanto a caliqueamicina como o QFA têm locais de acção intracelulares e não atravessam facilmente a membrana plasmática. Portanto, a tomada celular destes agentes através de internalização mediada por anticorpos aumenta grandemente os seus efeitos citotóxicos. imunoconjugados formados entre um anticorpo e um composto com actividade nucleolitica (p.ex., uma ribonuclease ou ADN-endonuclease tal como desoxirribonuclease, ADNase) estão também contemplados. 58 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ Ο anticorpo pode também ser conjugado com um átomo altamente radioactivo. Está disponível uma variedade de radionuclídeos para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem At211, Bi212, i131, In131, Y90, Re186, Re188, Sm153, P e Pb e isotopos radioactivos de Lu. Quando o conjugado e utilizado para diagnóstico, pode compreender um átomo radioactivo para estudos cintigráficos, por exemplo Tc99m ou I , ou um marcador de spin para imagiologia de ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecida como imagiologia de ressonância magnética, IRM), tal como iodo-123 iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, azoto-15, oxigénio-17, gadolínio, manganésio ou ferro.
Os radiomarcadores ou outros marcadores podem ser incorporados no conjugado através de modos conhecidos. Por exemplo, o péptido pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado através de síntese química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácidos adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 em vez de hidrogénio. Marcadores tais como Tc99 ou I123, Re186, Re188 e In111 podem ser ligados através de um resíduo de cisteína ao péptido. ítrio-90 pode ser ligado através de um resíduo de lisina. O método IODOGEN® pode ser utilizado para incorporar iodo-123, Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57, 1978. Outros métodos de conjugação de radionuclídeos são descritos em "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) .
Alternativamente, pode ser produzida uma proteína de fusão compreendendo o anticorpo e o agente citotóxico através de técnicas recombinantes ou síntese peptídica. A extensão de ADN pode compreender as respectivas regiões codificando as duas porções do conjugado, adjacentes umas às outras ou separadas através de uma região codificando um péptido ligador que não destrua as propriedades desejadas do conjugado.
Noutra concretização, o anticorpo pode ser conjugado com um "receptor" (tal como estreptavidina) para utilização em pré-direccionamento para tumores, em que o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao paciente, seguido de remoção do conjugado não ligado da circulação utilizando um agente de eliminação e depois administração de um "ligando" 59 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ (p.ex., avidina) que esteja conjugado a um agente citotóxico (p.ex., um radionucleótido). 9) Imunolipossomas
Os anticorpos aqui divulgados podem também ser formulados como imunolipossomas. Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composta por vários tipos de lipidos, fosfolipidos e/ou tensioactivos que são úteis para distribuição de um fármaco a um mamifero. Os componentes do lipossoma são vulgarmente dispostos numa formação de bicamada, semelhante à disposição lipidica das membranas biológicas.
Lipossomas contendo o anticorpo são preparados através de métodos conhecidos na arte, tal como descrito em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 3688, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4030, 1980; e Patentes U.S. Nos. 4485045 e 4544545. Lipossomas com maior tempo de circulação são divulgados na Patente U.S. N.° 5013556.
Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados através do método de evaporação de fase reversa com uma composição lipidica compreendendo fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada com PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrudidos através de filtros de tamanho de poro definido para produzir lipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab' do anticorpo do presente invento podem ser conjugados com os lipossomas tal como descrito em Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288, 1982 através de uma reacção de permuta de dissulfureto. Um agente quimioterapêutico (tal como Doxorrubicina) está opcionalmente contido dentro do lipossoma. Ver Gabizon et al., J. National Câncer Inst. 81 (19): 1484, 1989. 10) Outras Modificações dos Anticorpos
Outras modificações do anticorpo estão aqui contempladas. Por exemplo, o anticorpo pode ser ligado a uma variedade de polímeros não proteináceos, p.ex., polietilenoglicol, polipropilenoglicol, polioxialquilenos ou copolímeros de polietilenoglicol e polipropilenoglicol. O anticorpo pode também ser aprisionado em microcápsulas preparadas, por 60 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ exemplo, através de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial (por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente), em sistemas de distribuição de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microsferas de albumina, microemulsões, nano-particulas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Tais técnicas e outras formulações adequadas são divulgadas em Remington: "The Science and Practice of Pharmacy", 20a Ed., Alfonso Gennaro, Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000). C. Formulações Liofilizadas
As formulações aqui descritas podem também ser preparadas como formulações liofilizadas reconstituídas. As proteínas ou os anticorpos aqui descritos são liofilizados e depois reconstituídos para produzir as formulações líquidas estáveis de reduzida viscosidade do presente invento. Nesta concretização particular, após a preparação da proteína de interesse tal como descrito acima, é produzida uma "formulação pré-liofilizada". A quantidade de proteína presente na formulação pré-liofilizada é determinada tendo em conta os volumes de dose desejados, o modo ou modos de administração, etc. Por exemplo, a concentração de partida de um anticorpo intacto pode ser de cerca de 2 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, de preferência de cerca de 5 mg/ml a cerca de 40 mg/ml e de maior preferência de cerca de 20-30 mg/ml. 1) Preparação de Formulações Liofilizadas A proteína a formular está geralmente presente em solução. Por exemplo, nas formulações de viscosidade reduzida de elevada força iónica do presente invento, a proteína pode estar presente numa solução de pH tamponado a um pH de cerca de 4-8, e de preferência de cerca de 5-7. A concentração de tampão pode ser de cerca de 1 mM a cerca de 20 mM, alternativamente de cerca de 3 mM a cerca de 15 mM, dependendo, por exemplo, do tampão e da tonicidade desejada da formulação (p.ex. da formulação reconstituída). Tampões e/ou sais exemplares são os que são farmaceuticamente aceitáveis e podem ser criados a partir de ácidos, bases e sais destes 61 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ adequados, tais como os que são definidos como ácidos, bases ou tampões "farmaceuticamente aceitáveis".
Numa concretização, é adicionado um lioprotector à formulação pré-liofilizada. A quantidade de lioprotector na formulação pré-liofilizada é geralmente tal que, após reconstituição, a formulação resultante será isotónica. No entanto, podem também ser adequadas formulações hipertónicas reconstituídas. Adicionalmente, a quantidade de lioprotector não deve ser demasiado baixa que ocorra uma quantidade inaceitável de degradação/agregação da proteína após liofilização. No entanto, concentrações exemplares de lioprotector na formulação pré-liofilizada são de cerca de 10 mM a cerca de 400 mM, alternativamente de cerca de 30 mM a cerca de 300 mM, alternativamente de cerca de 50 mM a cerca de 100 mM. Lioprotectores exemplares incluem açúcares e álcoois de açúcar tais como sacarose, manose, trealose, glicose, sorbitol, manitol. No entanto, em circunstâncias particulares, certos lioprotectores podem também contribuir para um aumento na viscosidade da formulação. Como tal, deve-se ter cuidado para seleccionar lioprotectores particulares que minimizem ou neutralizem este efeito. Lioprotectores adicionais são descritos acima sob a definição de "lioprotectores", também aqui referidos como "açúcares farmaceuticamente aceitáveis". A razão de proteína para lioprotector pode variar para cada proteína ou anticorpo e combinação de lioprotector particular. No caso de um anticorpo como proteína de escolha e um açúcar (p.ex., sacarose ou trealose) como lioprotector para a geração de uma formulação isotónica reconstituída com uma elevada concentração proteica, a razão molar de lioprotector para anticorpo pode ser de cerca de 100 a cerca de 1500 moles de lioprotector para 1 mole de anticorpo, e de preferência de cerca de 200 a cerca de 1000 moles de lioprotector para 1 mole de anticorpo, por exemplo de cerca de 200 a cerca de 600 moles de lioprotector para 1 mole de anticorpo.
Numa concretização preferida, pode ser desejável adicionar um tensioactivo à formulação pré-liofilizada. Alternativamente, ou adicionalmente, o tensioactivo pode ser adicionado à formulação liofilizada e/ou à formulação reconstituída. Tensioactivos exemplares incluem tensioactivos 62 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ não iónicos tais como polissorbatos (p.ex. polissorbatos 20 ou 80); polioxâmeros (p.ex. polioxâmero 188); Triton; octilglicósido de sódio; lauril-, miristil-, linoleil-, ou estearil-sulfobetaina; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- ou cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- ou isostearamidopropil-betaina (p.ex. lauroamidopropil-); miristamidopropil-, palmidopropil- ou isostearamidopropil-dimetilamina; metilcocoilo sódico, ou metil-oleil-taurato dissódico; e a série MONAQUA™ (Mona Industries, Inc., Paterson, New Jersey), polietilglicol, polipropilglicol, e copolimeros de etileno e propilenoglicol (p.ex. Pluronics, PF68, etc). A quantidade de tensioactivo adicionada é tal que reduz a formação de particulados da proteína reconstituída e minimiza a formação de particulados após reconstituição. Por exemplo, o tensioactivo pode estar presente na formulação pré-liofilizada numa quantidade de cerca de 0,001-0,5%, alternativamente de cerca de 0,005-0,05%.
Uma mistura do lioprotector (tal como sacarose ou trealose) e um agente de carga (p.ex. manitol ou glicina) pode ser utilizada na preparação da formulação pré-liofilização. O agente de carga pode permitir a produção de um bolo liofilizado uniforme sem bolsas excessivas no interior, etc. Outros transportadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis tais como os descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16a Edição, Osol, A. Ed. (1980) podem ser incluídos na formulação pré-liofilizada (e/ou na formulação liofilizada e/ou na formulação reconstituída) desde que não afectem adversamente as características desejadas da formulação. Os transportadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregues e incluem: agentes de tamponamento adicionais; conservantes; co-solventes; anti-oxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; agentes quelantes tais como EDTA; complexos metálicos (p.ex. complexos Zn-proteína); polímeros biodegradáveis tais como poliésteres; e/ou contra-iões formadores de sais tais como sódio. 63 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ A formulação daqui pode também conter mais de uma proteína conforme necessário para a indicação particular a tratar, de preferência aquelas com actividades complementares que não afectem adversamente a outra proteína. Por exemplo, pode ser desejável proporcionar um ou mais anticorpos que se liguem ao alvo desejado (p.ex., receptor ou antigénio) numa única formulação. Tais proteínas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido.
As formulações a utilizar para administração in vivo têm de ser estéreis. Isto é facilmente alcançado por filtração através de membranas de filtração estéreis, antes ou após, liofilização e reconstituição. Alternativamente, a esterilidade de toda a mistura pode ser alcançada através de autoclavagem dos ingredientes, excepto da proteína, a cerca de 120°C durante cerca de 30 minutos, por exemplo.
Após a proteína, um lioprotector opcional e outros componentes opcionais são misturados uns com os outros, a formulação é liofilizada. Muitos secadores por congelação diferentes estão disponíveis para este fim tais como os
TM TM secadores por congelação Hull50 (Hull, USA) ou GT20 (Leybold-Heraeus, Alemanha). A secagem por congelação é alcançada através da congelação da formulação e subsequente sublimação do gelo a partir do conteúdo congelado a uma temperatura adequada para secagem primária. Com esta condição, a temperatura do produto está abaixo do ponto eutéctico ou da temperatura de colapso da formulação. Tipicamente, a temperatura de armazenamento para a secagem primária variará de cerca de -30 a 25°C (desde que o produto permaneça congelado durante a secagem primária) a uma pressão adequada, variando tipicamente de cerca de 50 a 250 mTorr. A formulação, o tamanho e tipo do recipiente contendo a amostra (p.ex., frasco de vidro) e o volume de líquido, ditarão principalmente o tempo necessário para secagem, que pode variar de poucas horas a vários dias (p.ex. 40-60 h) . Opcionalmente, um estádio de secagem secundária pode também ser efectuado dependendo do nível de humidade residual desejada no produto. A temperatura à qual a secagem secundária é realizada varia de cerca de 0-40°C, dependendo principalmente do tipo e tamanho do recipiente e do tipo de proteína empregue. Por exemplo, a 64 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ temperatura de armazenamento ao longo de toda a fase de remoção da água da liofilização pode ser de cerca de 15-30°C (p.ex., cerca de 20°C). O tempo e a pressão necessários para a secagem secundária serão os que produzem um bolo liofilizado adequado, dependente, p.ex., da temperatura e de outros parâmetros. O tempo da secagem secundária é ditado pelo nível de humidade residual desejado no produto e leva tipicamente pelo menos cerca de 5 horas (p.ex., 10-15 horas). A pressão pode ser a mesma que a empregue durante o passo de secagem primária. As condições de secagem por congelação podem ser variadas dependendo da formulação e do tamanho do frasco. 2. Reconstituição de uma Formulação Liofilizada
Antes da administração ao paciente, a formulação liofilizada é reconstituída com um diluente farmaceuticamente aceitável de modo a que a concentração proteica na formulação reconstituída seja pelo menos cerca de 50 mg/ml, por exemplo de cerca de 50 mg/ml a cerca de 400 mg/ml, alternativamente de cerca de 80 mg/ml a cerca de 300 mg/ml, alternativamente de cerca de 90 mg/ml a cerca de 150 mg/ml. Tais concentrações proteicas elevadas na formulação reconstituída são consideradas serem particularmente úteis quando se pretende a distribuição subcutânea da formulação reconstituída. No entanto, para outras vias de administração, tal como administração intravenosa, podem ser desejadas concentrações mais baixas da proteína na formulação reconstituída (por exemplo de cerca de 5-50 mg/ml, ou de cerca de 10-40 mg/ml de proteína na formulação reconstituída). Em certas concretizações, a concentração proteica na formulação reconstituída é significativamente superior à da formulação pré-liofilizada. Por exemplo, a concentração proteica na formulação reconstituída pode ser cerca de 2-40 vezes, alternativamente 3-10 vezes, alternativamente 3-6 vezes (p.ex. pelo menos três vezes ou pelo menos quatro vezes) a da formulação pré-liofilizada. A reconstituição ocorre geralmente a uma temperatura de cerca de 25°C para assegurar a completa hidratação, embora possam ser empregues outras temperaturas conforme desejado. O tempo necessário para a reconstituição dependerá, p.ex., do tipo de diluente, da quantidade de excipiente(s) e da 65 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ proteína. Diluentes exemplares incluem água estéril, água bacteriostática para injecção (BWFI), uma solução de pH tamponado (p.ex. solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose. O diluente contém opcionalmente um conservante. Conservantes exemplares foram descritos acima, com álcoois aromáticos tais como álcool benzílico ou fenólico sendo os conservantes preferidos. A quantidade de conservante empregue é determinada através da avaliação de diferentes concentrações de conservante para compatibilidade com a proteína e testes de eficácia do conservante. Por exemplo, se o conservante for um álcool aromático (tal como álcool benzílico), pode estar presente numa quantidade de cerca de 0,1-2,0% e de preferência de cerca de 0,5-1,5%, mas de preferência cerca de 1,0-1,2%.
De preferência, a formulação reconstituída tem menos de 6000 partículas por frasco que têm > 10 pm de tamanho. D. Formulações Líquidas
As formulações terapêuticas são preparadas para armazenamento através de mistura do ingrediente activo possuindo o grau de pureza desejado com transportadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais ("Remington's Pharmaceutical Sciences", 18a Edição, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 [1990]). Os transportadores, excipientes, ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregues, e incluem tampões, antioxidantes incluindo ácido ascórbico, metionina, Vitamina E, metabissulfito de sódio; conservantes, isotonificantes, estabilizantes, complexos metálicos (p.ex. complexos Zn-proteína); agentes quelantes tais como EDTA e/ou tensioactivos não iónicos.
Quando o agente terapêutico é um fragmento de anticorpo, é preferido o menor fragmento inibidor que se ligue especificamente ao domínio de ligação da proteína alvo. Por exemplo, com base nas sequências da região variável de um anticorpo, podem ser desenhados fragmentos de anticorpo ou mesmo moléculas peptídicas que mantêm a capacidade de se ligar à sequência proteica alvo. Tais péptidos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos através de 66 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ tecnologia de ADN recombinante (ver, p.ex., Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 7889-7893, 1993).
Os tampões são utilizados para controlar o pH num intervalo que optimiza a eficácia terapêutica, especialmente se a estabilidade for dependente do pH. Os tampões estão de preferência presentes a concentrações variando de cerca de 50 mM a cerca de 250 mM. Agentes de tamponamento adequados para utilizar com o presente invento incluem ácidos tanto orgânicos como inorgânicos e sais destes. Por exemplo, citrato, fosfato, succinato, tartrato, fumarato, gluconato, oxalato, lactato, acetato. Adicionalmente, os tampões podem ser constituídos de sais de histidina e trimetilamina tais como Tris. São adicionados conservantes para atrasar o crescimento microbiano e estão tipicamente presentes num intervalo de 0,2%-l,0% (p/v). Conservantes adequados para utilizar com o presente invento incluem (cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; halogenetos de benzalcónio (p.ex., cloreto, brometo, iodeto), cloreto de benzetónio; timerosal, álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquilparabenos de tais como metilparabeno de propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol, 3-pentanol e m-cresol.
Agentes de tonicidade, por vezes conhecidos como "estabilizantes" estão presentes para ajustar ou manter a tonicidade do líquido de uma composição. Quando utilizados com biomoléculas grandes, carregadas tais como proteínas e anticorpos, são frequentemente designados "estabilizantes" porque podem interactuar com os grupos carregados das cadeias laterais dos aminoácidos, reduzindo deste modo o potencial para interaeções inter e intramoleculares. Os agentes de tonicidade podem estar presentes em qualquer quantidade entre 0,1% a 25% em peso, de preferência 1 a 5%, tendo em conta as quantidades relativas dos outros ingredientes. Agentes de tonicidade incluem álcoois de açúcar poli-hídricos, de preferência tri-hídricos ou álcoois de açúcar superiores, tais como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol. 67 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
Excipientes adicionais incluem agentes que podem servir como um ou mais dos seguintes: (1) agentes de carga, (2) estimuladores da solubilidade, (3) estabilizantes e (4) agentes de prevenção de desnaturação ou aderência à parede do recipiente. Os estabilizantes podem estar presentes no intervalo de 0,1 a 10000 partes por peso de proteina activa ou anticorpo. Estabilizantes típicos incluem: álcoois de açúcar poli-hídricos (enumerados acima); aminoácidos tais como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido glutâmico, treonina, etc.; açúcares orgânicos ou álcoois de açúcar, tais como sacarose, lactose, lactitol, trealose, estaquiose, manose, sorbose, xilose, ribose, ribitol, mioinisitose, mioinisitol, galactose, galactitol, glicerol, ciclitóis (p.ex., inositol), polietilenoglicol; agentes redutores contendo enxofre, tais como ureia, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, α-monotioglicerol e tiossulfato de sódio; proteínas de baixo peso molecular tais como albumina de soro humano, albumina de soro bovino, gelatina ou outras imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tal como polivinilpirrolidona; monossacáridos (p.ex., xilose, manose, frutose, glicose; dissacáridos (p.ex., lactose, maltose, sacarose); trissacáridos, tais como rafinose; e polissacáridos tais como dextrina ou dextrano.
Tensioactivos não iónicos ou detergentes (também conhecidos como "agentes humidificantes") estão presentes para ajudar a solubilizar o agente terapêutico bem como a proteger a proteína terapêutica contra agregação induzida por agitação, que também permite que a formulação seja exposta a tensão superficial de cisalhamento causando desnaturação da proteína ou do anticorpo terapêutico activo. Os tensioactivos não iónicos estão presentes num intervalo de cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml, de preferência cerca de 0,07 mg/ml a cerca de 0,2 mg/ml.
Tensioactivos não iónicos adequados incluem polissorbatos (20, 40, 60, 65, 80, etc.), polioxâmeros (184, 188, etc.), polióis Pluronic®, Triton®, monoéteres de polioxietilenossorbitano (Tween®-20, Tween®-80, etc.), 68 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, óleo de rícino hidrogenado de polioxietileno 10, 50 e 60, monoestearato de glicerol, éster de ácidos gordos de sacarose, metilcelulose e carboximetilcelulose. Detergentes aniónicos que podem ser utilizados incluem laurilsulfato de sódio, dioctil-sulfossuccinato de sódio e dioctil-sulfonato de sódio. Detergentes catiónicos incluem cloreto de benzalcónio ou cloreto de benzetónio.
Para que as formulações sejam utilizadas para administração in vitro, têm de ser estéreis. A formulação pode ser tornada estéril por filtração através de membranas de filtração estéril. As composições terapêuticas daqui são geralmente colocadas num recipiente possuindo uma porta de aceso estéril, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou um frasco possuindo uma tampa perfurável através de uma agulha de injecção hipodérmica. A via de administração está de acordo com métodos conhecidos e aceites, tais como através de bolo único ou múltiplo ou infusão durante um longo período de tempo de um modo adequado, p.ex., injecção ou infusão através das vias subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, intralesional ou intra-articular, administração tópica, inalação ou através de meios de libertação sustida ou de libertação prolongada. A formulação daqui pode também conter mais de um composto activo conforme necessário para a indicação particular a tratar, de preferência aqueles com actividades complementares que não se afectem adversamente um ao outro. Alternativamente, ou adicionalmente, a composição pode compreender um agente citotóxico, uma citocina ou um agente inibidor do crescimento. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para os fins pretendidos.
Os ingredientes activos podem também ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de destribuição de fármacos coloidais (por exemplo, 69 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ lipossomas, microsferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18a Edição, supra.
Podem ser feitas preparações de libertação sustida. Exemplos adequados de preparações de libertação sustida incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o anticorpo, matrizes essas que estão na forma de artigos moldados, p.ex., películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação sustida incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(vinilálcool)), poliláctidos (Patente U.S. N.° 3773919), copolímeros de ácido L-glutâmico e y-etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis tais como o LUPRON DEPOT™ (microsferas injectáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolide), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. O microencapsulamento de proteínas recombinantes para libertação sustida foi efectuado com sucesso com hormona do crescimento humana (rhGH), interferão-(rhIFN-), interleucina-2, e MN rpg 120. Johnson et al., Nat. Med. 2: 795-799, 1996; Yasuda et al., Biomed. Ther. 27: 1221-1223, 1993; Hora et al., Bio/Technology 8: 755-758, 1990; Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polilactide Poliglycolide Microsphere Systems," em Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds., (Plenum Press: New York, 1995), págs. 439-462; WO 97/03692; WO 96/40072; WO 96/07399; e Patente U.S. N.° 5654010.
As formulações de libertação sustida destas proteínas podem ser desenvolvidas utilizando polímero de ácido poliláctico-coglicólico (PLGA) devido à sua biocompatibilidade e ampla variedade de propriedades biodegradáveis. Os produtos de degradação de PLGA, ácidos láctico e glicólico, podem ser eliminados rapidamente no corpo humano. Além disso, a degradabilidade deste polímero pode ser ajustada durante meses a anos dependendo do seu peso molecular e composição. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polimer", em Biodegradahle Polimers as Drug Delivery Systems 70 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ (Mareei Dekker; New York, 1990), M. Chasin e R. Langer (Eds.) págs. 1-41.
Embora polímeros tais como acetato de etileno-vinilo e ácido láctico-ácido glicólico permitam a libertação de moléculas durante mais de 100 dias, certos hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando os anticorpos encapsulados permanecem no corpo durante um período de tempo longo, podem desnaturar ou agregar-se em resultado da exposição à humidade a 37°C, resultando numa perda de actividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Podem ser concebidas estratégias racionais para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, quando se verifica que o mecanismo de agregação é a formação de ligações intermoleculares S-S através de intercâmbio de tio-dissulfureto, a estabilização pode ser alcançada através da modificação de resíduos sulfidrilo, liofilização a partir de soluções ácidas, controlo do teor de humidade, utilização de aditivos apropriados e desenvolvimento de composições de matrizes poliméricas específicas.
Podem também ser utilizadas composições lipossómicas ou proteinóides para formular as proteínas ou os anticorpos aqui divulgados. Ver Patentes U.S. Nos. 4925673 e 5013556. A estabilidade das proteínas e dos anticorpos aqui descritos pode ser aumentada através da utilização de "sais metálicos polivalentes solúveis em água" não tóxicos. Exemplos incluem Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+,
Cu2+, Sn2+,
Sn 4 + ai2+ e Al3\
Aniões exemplares que podem formar sais solúveis em água com os catiões metálicos polivalentes de cima incluem os formados a partir de ácidos inorgânicos e/ou ácidos orgânicos. Tais sais solúveis em água têm uma solubilidade em água (a 20°C) de pelo menos cerca de 20 mg/ml, alternativamente pelo menos cerca de 100 mg/ml, como alternativa pelo menos cerca de 200 mg/ml. Ácidos inorgânicos adequados que podem ser utilizados para formar os "sais metálicos polivalentes solúveis em água" incluem o ácido clorídrico, acético, sulfúrico, nítrico, tiociânico e fosfórico. Ácidos orgânicos adequados que podem ser utilizados incluem ácido carboxílico alifático e ácidos 71 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ aromáticos. Os ácidos alifáticos dentro desta definição podem ser definidos como ácidos carboxilicos C2-9 saturados ou insaturados (p.ex., ácidos mono, di e tricarboxilicos alifáticos). Por exemplo, ácidos monocarboxílicos exemplares dentro desta definição incluem os ácidos monocarboxílicos C2-9 saturados acético, propiónico, butírico, valérico, capróico, enântico, caprílico, pelargónico e capriónico, e os ácidos monocarboxílicos C2-9 insaturados, ácido acrílico, metacrílico propriólico, crotónico e isocrotónico. Ácidos dicarboxílicos exemplares incluem os ácidos dicarboxílicos C2-9 saturados malónico, succínico, glutárico, adípico e pimélico, enquanto os ácidos dicarboxílicos C2-9 insaturados incluem os ácidos maleico, fumárico, citracónico e mesacónico. Ácidos tricarboxilicos exemplares incluem os ácidos tricarboxilicos C2-9 saturados tricarbalílico e 1,2,3-butanotricarboxílico. Adicionalmente, os ácidos carboxilicos desta definição podem também conter um ou dois grupos hidroxilo para formar ácidos hidroxicarboxílicos. Ácidos hidroxicarboxílicos exemplares incluem o ácido glicólico, láctico, glicérico, tartrónico, málico, tartárico e cítrico. Os ácidos aromáticos dentro desta definição incluem o ácido benzóico e salicílico.
Sais metálicos polivalentes solúveis em água vulgarmente empregues que podem ser utilizados para ajudar a estabilizar os polipéptidos encapsulados deste invento incluem, por exemplo: (1) os sais metálicos de ácidos inorgânicos de halogenetos (p.ex., cloreto de zinco, cloreto de cálcio), sulfatos, nitratos, fosfatos e tiocianatos; (2) os sais metálicos de ácidos carboxilicos alifáticos (p.ex., acetato de cálcio, acetato de zinco, proprionato de cálcio, glicolato de zinco, lactato de cálcio, lactato de zinco, tartrato de zinco); e (3) os sais metálicos de ácidos carboxilicos aromáticos de benzoatos (p.ex., benzoato de zinco) e salicilatos. E. Métodos de tratamento:
Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um agente activo dependerá do tipo de doença a tratar, tal como definido acima, da gravidade e curso da doença, de se o agente é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, de terapia anterior, da história clínica do 72
ΕΡ 1 610 820/PT paciente e da resposta ao agente, e da discrição do médico assistente. O agente é adequadamente administrado ao paciente de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos.
Um método de tratamento preferido é o tratamento de distúrbios mediados por IgE. Os distúrbios mediados por igE incluem distúrbios atópicos, que se caracterizam por uma propensão herdada para responder imunologicamente a muitos antigénios comuns de ocorrência natural inalados e ingeridos e à produção continua de anticorpos IgE. Distúrbios atópicos específicos incluem asma alérgica, rinite alérgica, dermatite atópica e gastroenteropatia alérgica. Os doentes atópicos têm frequentemente múltiplas alergias, significando que têm anticorpos IgE para, e sintomas de, muitos alergénios ambientais, incluindo pólenes, fungos (p.ex., bolores), animais e detritos de insectos e certos alimentos.
No entanto, os distúrbios associados a níveis elevados de IgE não estão limitados aqueles com uma etiologia herdada (atópicos). Outros distúrbios associados a níveis elevados de IgE, que parecem ser mediados por IgE e são tratáveis com as formulações deste presente invento incluem hipersensibilidade (p.ex., hipersensibilidade anafilática), eczema, urticária, aspergilose broncopulmonar alérgica, doenças parasitárias, síndroma de hiper-IgE, ataxia-telangiectasia, síndroma de Wiskott-Aldrich, alinfoplasia tímica, mieloma de IgE e reacção de enxerto versus hospedeiro.
Rinite alérgica, também conhecida como rinoconjuntivite alérgica ou febre dos fenos, é a manifestação mais comum de uma reacção atópica a alergénios inalados, cuja gravidade e duração está frequentemente correlacionada com a intensidade e duração da exposição ao alergénio. É uma doença crónica, que pode aparecer pela primeira vez em qualquer idade, mas o surgimento é normalmente durante a infância ou adolescência. Um ataque típico consiste em profusa rinorreia aguada, espirros paroxismais, obstrução nasal e comichão do nariz e palato. A drenagem pós-nasal de muco causa também dor de garganta, eliminação pela garganta e tosse. Pode também haver sintomas de blefaroconjuntivite alérgica, com intensa irritação da conjuntiva e das pálpebras, vermelhidão, lacrimação, e fotofobia. Ataques graves são frequentemente 73 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ acompanhados por mal-estar sistémico, fraqueza, fadiga, e por vezes, dor muscular após períodos intensos de espirros.
Asma, também conhecida como doença obstrutiva das vias respiratórias reversível, caracteriza-se por hiper-responsividade da árvore traqueobrônquica a irritantes respiratórios e químicos broncoconstritores, produzindo ataques de dificuldade respiratória, dispneia, constrição do peito e tosse, que são reversíveis espontaneamente ou com tratamento. É uma doença crónica que envolve todas as vias respiratórias, mas varia em gravidade de episódios transitórios suaves ocasionais a obstrução brônquica grave, crónica, com risco de vida. A asma e a atopia podem coexistir, mas apenas cerca de metade dos asmáticos são também atópicos, e uma percentagem ainda menor de pacientes atópicos tem também asma. No entanto, a atopia e a asma não são inteiramente independentes por a asma ocorrer mais frequentemente entre indivíduos atópicos que entre não atópicos, especialmente durante a infância. A asma foi ainda historicamente dividida em dois subgrupos, asma extrínseca e asma intrínseca. A asma extrínseca, também conhecida como asma alérgica, atópica ou imunológica, é descritiva de doentes que geralmente desenvolvem asma precocemente, habitualmente durante a primeira infância ou infância. Outras manifestações de atopia, incluindo eczema ou rinite alérgica coexistem frequentemente. Os ataques asmáticos podem ocorrer durante a época dos pólenes, na presença de animais, ou na exposição a pó doméstico, almofadas de penas ou outros alergénios. Os testes de pele mostram reacções positivas de bolha e vermelhidão aos alergénios causadores. Interessantemente, as concentrações séricas de igE totais são frequentemente elevadas, mas estão por vezes normais. A asma intrínseca, também conhecida como asma não alérgica ou idiopática, ocorre tipicamente pela primeira vez durante a vida adulta, após uma infecção respiratória evidente. Os sintomas incluem obstrução brônquica crónica ou recorrente, não relacionada com as estações de pólen ou exposição a outros alergénios. Os ensaios de pele são negativos para os habituais alergénios atópicos, a concentração sérica de igE é normal. Sintomas adicionais 74 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ incluem sangue na expectoração e eosinofilia. Outros esquemas para a classificação de asma em subgrupos, como sensível à aspirina, induzida por exercício, infecciosa e meramente psicológica, definem factores desencadeadores externos que afectam mais certos pacientes do que outros.
Finalmente, é importante observar que enquanto algumas classificações historicamente associaram apenas a asma alérgica à dependência de igE, há agora fortes dados estatisticamente significativos que mostram uma correlação entre IgE e asma (tanto alérgica como não alérgica). Capítulo 27, "The Atopic Diseases", A.I. Terr in Medicai Imunology, 9a Ed., Simon e Schuster, Stites et al., Ed. (1997). Como resultado, o termo "distúrbios mediados por IgE", para fins deste pedido de patente, inclui tanto a asma alérgica como a não alérgica.
Os sinais físicos de um ataque de asma incluem taquipneia, dificuldade respiratória audível, e utilização de músculos acessórios da respiração. Pulsação rápida e pressão sanguínea elevada estão também tipicamente presentes, tal como elevados níveis de eosinófilos no sangue periférico e nas secreções nasais. As funções pulmonares mostram uma diminuição nas taxas de fluxo e um volume expiratório forçado de 1 segundo (FEVi) . A capacidade pulmonar total e a capacidade residual funcional são tipicamente normais ou estão ligeiramente aumentadas, mas podem ser diminuídas com um broncoespasmo extremo. A patologia da asma pode ser distinguida em reacções de fase inicial e de fase tardia. A fase inicial caracteriza-se por contracção do músculo liso, edema e hipersecreção, enquanto que as reacções de fase tardia por inflamação celular. A asma pode ser induzida através de vários desencadeadores não específicos incluindo infecções (p.ex., infecções respiratórias virais), factores fisiológicos (p.ex., exercício, hiperventilação, respiração funda, factores psicológicos), factores atmosféricos (p.ex., dióxido de enxofre, amónia, ar frio, ozono, vapor de água destilada), ingeríveis (p.ex., propranolol, aspirina, fármacos anti-inflamatórios não esteróides), inalantes experimentais (p.ex., soluções hipertónicas, ácido cítrico, histamina, metacolina, 75 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ prostaglandina F2a) θ inalantes ocupacionais (p.ex., isocianatos). Vários alergénios ocupacionais ou ambientais adicionais que causam asma alérgica podem incluir produtos animais, poeiras de insectos, seres marinhos, produtos vegetais, frutas, sementes, folhas e pólenes, tintas e corantes orgânicos, agentes microbianos, enzimas, agentes terapêuticos, agentes de esterilização, produtos químicos inorgânicos e orgânicos.
Dermatite atópica, também conhecida como eczema, neurodermatite, eczema atópico ou prurigo de Besnier, é um distúrbio crónico da pele comum específico de um subconjunto de doentes com as características familiares e imunológicas de atopia. A característica essencial é uma resposta inflamatória dérmica prurítica, que induz uma erupção cutânea característica distribuída simetricamente com predilecção para certos locais. Existe também frequente sobreprodução de IgE por linfócitos B. Embora a dermatite atópica esteja classificada como uma forma cutânea de atopia porque está associada a rinite alérgica e asma e níveis elevados de IgE, a gravidade da dermatite, no entanto, nem sempre se correlaciona com a exposição a alergénios em testes de pele, e a dessensibilização (ao contrário de outras doenças alérgicas) não é um tratamento eficaz. Embora a IgE sérica elevada seja confirmação de um diagnóstico de asma alérgica, níveis normais não a excluem. 0 surgimento da doença pode ocorrer em qualquer idade, e as lesões começam de forma aguda com pápulas ou placas edematosas eritematosas com escamação. A comichão conduz a drenagem e formação de crosta, depois a liquenificação crónica. Ao nível celular, a lesão aguda é de edema e a derme é infiltrada com células mononucleares, linfócitos CD4. Os neutrófilos, eosinófilos, células plasmáticas e basófilos são raros, mas estão presentes mastócitos desgranulados. As lesões crónicas apresentam hiperplasia epidérmica, hiperqueratose e paraqueratose e a derme é infiltrada com células mononucleares, células de Langerhans e mastócitos. Pode também haver áreas focais de fibrose, incluindo o envolvimento do perineuro de pequenos nervos.
Gastroenteropatia alérgica, também conhecida como gastroenteropatia eosinófila, é uma invulgar manifestação 76 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ atópica em que múltiplas sensibilidades alimentares de igE estão associadas a uma reacção local da mucosa do tracto gastrointestinal. É rara em adultos, mas mais comum, mas transiente, em bebés. A condição resulta quando os alergénios alimentares ingeridos reagem com anticorpos IgE locais na mucosa do jejuno, libertando mediadores dos mastócitos, resultando em sintomas gastrointestinais pouco tempo após a refeição. A exposição contínua produziu inflamação crónica, resultando em perda das proteínas gastrointestinais e edema hipoproteinémico. A perda de sangue através da mucosa intestinal inflamada pode ser suficientemente significativa para causar anemia por deficiência de ferro. A reacção alérgica ocorre localmente na mucosa gastrointestinal superior após exposição ao alergénio, mas resolve-se com o evitar do alergénio. A anafilaxia e a urticária são claramente mediadas por IgE, mas não têm determinantes genéticos e não têm qualquer predilecção por indivíduos atópicos. A anafilaxia é uma reacção alérgica aguda generalizada com o envolvimento simultâneo de vários sistemas de órgãos, habitualmente o cardiovascular, respiratório, cutâneo e gastrointestinal. A reacção é imunologicamente mediada, e ocorre na exposição a um alergénio ao qual o sujeito foi anteriormente sensibilizado. A urticária e o angioedema referem-se a inchaço físico, eritema e prurido resultante do receptor estimulado por histamina em vasos sanguíneos superficiais cutâneos, e é a marca característica cutânea de anafilaxia sistémica. A anafilaxia sistémica é a ocorrência de uma reacção mediada por IgE simultaneamente em múltiplos órgãos resultante de um fármaco, veneno de insectos ou de um alimento. É causada subitamente por IgE de mastócitos carregados induzidos por um alergénio, resultando numa alteração profunda com perigo de vida no funcionamento de vários órgãos vitais. 0 colapso vascular, a obstrução aguda das vias respiratórias, a vasodilatação cutânea e o edema e espasmo muscular gastrointestinal e genitourinário ocorrem quase simultaneamente, embora nem sempre com o mesmo grau. A patologia de anafilaxia inclui angioedema e pulmões hiperinsuflados, com entupimento mucoso das vias respiratórias e atelectasia focal. Ao nível celular, os pulmões surgem de 77 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ forma semelhante aquela durante um ataque agudo de asma, com hipersecreção das glândulas submucosas brônquicas, edema da mucosa e submucosa, congestão vascular peribrônquica e eosinofilia nas paredes brônquicas. Pode estar presente edema e hemorragia pulmonar. Pode também estar presente espasmo muscular brônquico, hiperinsuflação, e mesmo rotura de alvéolos. Características importantes de anafilaxia humana incluem edema, congestão vascular, e eosinofilia na lâmina própria da laringe, traqueia, epiglote e hipofaringe. A exposição ao alergénio pode ser através de ingestão, injecção, inalação ou contacto com a pele ou membrana mucosa. A reacção começa em segundos ou minutos após a exposição ao alergénio. Pode haver um susto inicial e a sensação de perigo iminente, seguidos rapidamente de sintomas num ou mais sistemas de órgãos alvo: cardiovascular, respiratório, cutâneo e gastrointestinal.
Os alergénios responsáveis pela anafilaxia diferem dos vulgarmente associados a atopia. Alimentos, fármacos, venenos de insectos ou látex são as fontes comuns. Os alergénios de alimentos incluem os verificados em crustáceos, moluscos (p.ex., lagosta, camarão, caranguejo), peixe, legumes (p.ex., amendoins, ervilhas, feijões, alcaçuz), sementes (p.ex. sésamo, semente de algodão, alcaravia, mostarda, linho, girassol), nozes, bagas, claras de ovo, trigo sarraceno e leite. Os alergénios de fármacos incluem os verificados em proteínas heterólogas e polipéptidos, polissacáridos e fármacos hapténicos. Os alergénios de insectos incluem os de insectos himenópteros, incluindo a abelha, vespa carnívora, vespão, vespa e formiga-de-fogo.
Embora a epinefrina seja o tratamento típico para a anafilaxia, os anti-histamínicos ou outros bloqueadores da histamina são tipicamente prescritos para a urticária menos grave ou reacção angioedémica. F. Terapias de Combinação O método do presente invento pode ser combinado com métodos de tratamento conhecidos para distúrbios mediados por 78 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
IgE, como passos de tratamento combinados ou adicionais ou como componentes adicionais de uma formulação terapêutica.
Por exemplo, anti-histamínicos, especialmente anti-histaminicos não sedativos, podem ser administrados antes, durante, ou ao mesmo tempo que os anticorpos anti-lgE do presente invento. Anti-histamínicos adequados incluem os de alquilamina (p.ex., a clorfeniramina), etanolamina (p.ex., difenidramina) e fenotiazina (p.ex., prometazina). Enquanto muitos anti-histamínicos antagonizam os efeitos farmacológicos da histamina bloqueando os seus locais receptores nas células efectoras, outros fármacos anti-histamínicos comuns operam bloqueando a libertação de histamina a partir de mastócitos que foram sensibilizados e armados com IgE específica para o alergénio (p.ex., cromolina sódica). Anti-histamínicos exemplares incluem astemizole, maleato de azatadina, maleato de brofeniramina, maleato de carbinoxamina, cloridrato de cetirizina, fumarato de clemastina, cloridrato de cipro-heptadina, maleato de dexbromfeniramina, maleato de dexclorfeniramina, dimenidrinato, cloridrato de difenidramina, succinato de doxilamina, cloridrato de fexofendadina, cloridrato de terfenadina, cloridrato de hidroxizina, loratidina, cloridrato de meclizina, citrato de tripelanamina, cloridrato de tripelenamina, cloridrato de triprolidina.
Os sintomas particulares dos distúrbios mediados por IgE (p.ex., reacções da fase inicial) podem ser melhorados com simpatomiméticos ou fármacos possuindo efeito broncodilatador. A epinefrina é um alfa e beta-adrenérgico de ampla acção frequentemente administrado subcutaneamente numa dose de 0,2-0,5 ml de solução aquosa 1:100. Uma forma de acção mais prolongada da epinefrina (i.e., terbutalina) em suspensão 1:200 é também utilizada quando é desejado um efeito de duração mais prolongada. Beta-adrenérgicos adicionais adequados incluem o albuterol, pirbuterol, metaproterenol, salmeterol, isoetarina e formoterol para administração nasal (p.ex., nebulizador de mão, dispositivo de respiração de pressão positiva intermitente, ou inaladores doseadores pressurizados) ou oral. A broncodilatação pode também ser alcançada através da administração de xantinas, especialmente quando são 79 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ administradas em combinação com os fármacos simpatomiméticos de cima. Exemplos de xantinas incluem aminofilina (iv. 250-500 mg) e teofilina (oral, concentração sérica de 10-20 pg/ml).
Outros sintomas de vários distúrbios mediados por IgE (p.ex., reacções da fase tardia) podem ser atenuados através de tratamento com glucocorticóides ou outros fármacos possuindo efeitos anti-inflamatórios. A prednisona (30-60 mg diariamente) é administrada sistemicamente para ataques graves, enquanto o dipropionato de beclometasona, acetonido e flunisolido de triamcinolona são administrados sob a forma de aerossol como terapia de manutenção de longo prazo. Adicionalmente, os corticosteróides que têm efeitos anti-inf lamatórios incluem: betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de fludrocortisona, flunisolida, propionato de fluticasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona. Fármacos anti-inflamatórios não esteróides que podem também ser utilizados em combinação com os métodos terapêuticos do presente invento incluem acetaminofeno, aspirina, bromfenac sódico, diclofenac sódico, diflunisal, etodolac, fenoprofeno cálcico, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, meclofenamato sódico, ácido mefenâmico, nabumetona, naproxeno, naproxeno sódico, oxifenbutazona, fenilbutzona, piroxicam, sulindac, tolmetina sódica.
Adicionalmente, o beneficio terapêutico máximo pode também ser alcançado com a administração de descongestionantes (p.ex., fenilefrina, fenilpropanolamina, pseudoefadrina), supressores da tosse (p.ex., dextrometorfano, codeína ou hidrocodona) ou analgésicos (p.ex., acetaminofeno, aspirina). A dessensibilização ao alergénio é uma forma de tratamento na qual os alergénios são injectados no paciente com o objectivo de reduzir ou eliminar a resposta alérgica. É também conhecida como imunoterapia de alergénio, terapia de hipo-sensibilização ou de injecção de alergia. É frequentemente utilizada em combinação com outros tratamentos de alergia, mas pouco frequentemente como tratamento primário. 80 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
Foi empregue com sucesso quando é impossível evitar o alergénio. Um tratamento de dessensibilização ao alergénio típico incorpora a injecção subcutânea de alergénio estéril em doses crescentes uma vez ou duas vezes por semana até ser alcançada uma dose que produza um pequena área local de inflamação transiente no local da injecção. A dose é então dada num programa de manutenção uma vez cada 2-4 semanas. A dessensibilização alérgica é utilizada muito frequentemente no tratamento da asma alérgica e rinite alérgica, embora se tenha tido sucesso no tratamento de anafilaxia. A dessensibilização tem também sido utilizada eficazmente através da utilização de adjuvantes, tais como adjuvante incompleto de Freund, que é uma emulsão de antigénio aquoso em óleo mineral. O efeito fisiológico cria um depósito de líquido insolúvel, a partir do qual são gradualmente libertadas gotícuias de alergénio. Outra forma de dessensibilização ao alergénio é polimerizar alergénios monoméricos com glutaraldeído para criar uma molécula com uma capacidade alergénica relativamente fraca (i.e., causa resposta alérgica), mantendo ao mesmo tempo um grau eficaz de imunogenicidade. G. Dosagens Farmacêuticas:
As dosagens e a concentração de fármaco desejadas das composições farmacêuticas do presente invento podem variar dependendo da utilização particular considerada. A determinação da dosagem ou da via de administração apropriadas está bem dentro da vulgar perícia na arte. Experiências em animais proporcionam uma orientação fiável para a determinação das doses eficazes para terapia humana. 0 escalonamento interespecífico das doses eficazes pode ser efectuado seguindo os princípios colocados por Mordenti, J. e Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics", em "Toxicokinetics and New Drug Development", Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, págs. 42-46.
Quando é utilizada administração in vivo dos polipéptidos ou anticorpos aqui descritos, as quantidades de dosagem normais variam de cerca de 10 ng/kg até cerca de 100 mg/kg do peso corporal do mamífero ou mais por dia, de preferência cerca de 1 mg/kg/dia a 10 mg/kg/dia, dependendo da via de administração. É proporcionada orientação quanto às dosagens e 81 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ métodos de distribuição particulares na literatura; ver, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 4657760; 5206344; ou 5225212. Está dentro do âmbito do presente invento que diferentes formulações serão eficazes para diferentes tratamentos e diferentes distúrbios, e que a administração pretendida para tratar um órgão ou tecido especifico pode necessitar de distribuição de um modo diferente da de outro órgão ou tecido. Além disso, as dosagens podem ser administradas através de uma ou mais administrações separadas, ou através de infusão continua. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. No entanto, podem ser úteis outros regimes de dosagem. O progresso desta terapia é facilmente monitorizado através de técnicas e ensaios convencionais. H. Administração da Formulação
As formulações do presente invento, incluindo mas não se limitando a formulações reconstituídas, são administradas a um mamífero que necessite de tratamento com a proteína, de preferência um humano, de acordo com métodos conhecidos, tal como administração intravenosa como um bolo ou através de infusão contínua durante um período de tempo, através das vias intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, oral, tópica ou por inalação.
Em concretizações preferidas, as formulações são administradas ao mamífero através de administração subcutânea (i.e., por baixo da pele). Para tais fins, a formulação pode ser injectada utilizando uma seringa. No entanto, estão disponíveis outros dispositivos para administração da formulação tais como dispositivos de injecção (p.ex. os dispositivos Inject-ease e Genject ); canetas injectoras (tais como a GenPen™); dispositivos auto-injectores, dispositivos sem agulha (p.ex. MediJector™ e BioJector”); e sistemas de distribuição subcutânea por adesivo.
Numa concretização específica, o presente invento é dirigido a estojos para uma unidade de administração de dose única. Tais estojos compreendem um recipiente de uma 82 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ formulação aquosa da proteína ou do anticorpo terapêutico, incluindo seringas previamente enchidas com uma ou múltiplas câmaras. Seringas previamente enchidas exemplares estão disponíveis em Vetter GmbH, Ravensburg, Alemanha. A dosagem apropriada ("quantidade terapeuticamente eficaz") da proteína dependerá, por exemplo, da condição a tratar, da gravidade e do curso da condição, de se a proteína é administrada para fins preventivos ou terapêuticos, da terapia anterior, da história clínica do paciente e da resposta à proteína, do tipo de proteína utilizada e da discrição do médico assistente. A proteína é adequadamente administrada ao paciente de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos e pode ser administrada ao paciente em qualquer momento a partir do diagnóstico. A proteína pode ser administrada como um único tratamento ou em conjunto com outros fármacos ou terapias úteis em tratamento da condição em questão.
Quando a proteína de escolha é um anticorpo, cerca de 0. 1-20 mg/kg é uma dosagem inicial candidata para administração ao paciente, através, por exemplo, de uma ou mais administrações separadas. No entanto, podem ser úteis outros regimes de dosagem. O progresso desta terapia é facilmente monitorizado através de técnicas convencionais.
As utilizações para uma formulação de anti-lgE (p.ex., rhuMAbE-25, rhMAbE-26, Hu-901) incluem o tratamento ou profilaxia de doenças alérgicas mediadas por IgE, infecções parasitárias, cistite intersticial e asma, por exemplo. Dependendo da doença ou do distúrbio a tratar, uma quantidade terapeuticamente eficaz (p.ex. cerca de 1-15 mg/kg) do anticorpo anti-lgE é administrada ao paciente. 1. Artigos de Fabrico
Noutra concretização do presente invento, é proporcionado um artigo de fabrico que contém a formulação e proporciona de preferência instruções para a sua utilização. O artigo de fabrico compreende um recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos (p.ex. frascos de câmara dupla), seringas (tais como seringas de câmara simples 83 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ ou dupla) e tubos de ensaio. O recipiente pode ser formado a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente guarda a formulação e a etiqueta nele, ou associada a ele, pode indicar orientações para reconstituição e/ou utilização. A etiqueta pode ainda indicar que a formulação é útil ou pretendida para administração subcutânea. O recipiente guardando a formulação pode ser um frasco multi-uso, que permite administrações repetidas (p.ex. 2-6 administrações) da formulação reconstituída. O artigo de fabrico pode compreender ainda um segundo recipiente compreendendo um diluente adequado (p.ex. BWFI). Após mistura do diluente com a formulação liofilizada, a concentração final de proteína na formulação reconstituída será geralmente de pelo menos 50 mg/ml. O artigo de fabrico pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e folhetos informativos com instruções para utilização. O presente invento será mais completamente compreendido por referência aos seguintes exemplos. Estes não devem, no entanto, ser entendidos como limitando o âmbito do presente invento.
Noutra concretização, o presente invento proporciona um artigo de fabrico compreendendo as formulações aqui descritas para administração num dispositivo auto-injector. Um auto-injector pode ser descrito como um dispositivo de injecção que após activação, distribuirá o seu conteúdo sem necessária acção adicional do paciente ou administrador. São particularmente adequados para auto-medicação de formulações terapêuticas quando a taxa de distribuição tem de ser constante e o tempo de distribuição é superior a alguns momentos. EXEMPLO 1
Preparação da Formulação de rhuMAbE25 Anti-IgE ("E25")
Formulações do anticorpo monoclonal anti-IgE rhuMAbE25 foram preparadas a partir do Lote K9094A de E25 bruto residual (40 mg/ml de rhuMAb E25, trealose 85 mM, histidina 5 mM, pH 6, 84 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
Tween 20 a 0,01%) ou rhuMAbE25 Q-Pool (5 mg/ml de rhuMAb E25, Tris 25 mM, NaCl 200 mM).
Soluções aquosas de rhuMAbE25 foram preparadas através de diálise para diferentes tampões (His-HCl 20 mM e Arg-HCl 200 mM, pH 6,0) a 2-8°C utilizando uma Cassete de Diálise Slide-A-Lyzer (Pierce) . As amostras foram então transferidas para o reservatório de amostras de microconcentradores por centrifugação Centricon-30 (Amicon). As proteínas foram concentradas através de centrifugação do concentrador Centricon-3 a 4000-5000 g até ser alcançada a concentração de proteína desejada.
As amostras foram então concentradas a *150 mg/ml de rhuMAb E25 utilizando ultrafiltração. Foi adicionado Tween 20 a cada preparação até uma concentração final de 0,02%. Todas as formulações foram filtradas, enchidas de forma asséptica em frascos FormaVitrum de 3 cm3 e fechadas com tampas Diakyo de 13 mm numa sala de Classe 100. EXEMPLO 2
Materiais e Método:
Estudos de Estabilidade: Todas as formulações foram enchidas a 1 ml em frascos de vidro FormaVitrum de 3 cm3 e tapadas com tampas Diakyo 13 mm numa sala de enchimento estéril de Classe 100. Os frascos foram colocados a -70, 2-8, 15, 30 e 40°C em recipientes impermeáveis à luz.
Estudo de Agitação: Foram colocadas alíquotas de cada formulação os frascos de vidro. Os frascos foram agitados horizontalmente num Agitador de Bancada Glas-Col à temperatura ambiente. O agitador foi regulado para 70 com um comprimento do braço de 30 cm (máximo) . Após agitação, as amostras foram inspeccionadas e analisadas de acordo com o seguinte protocolo.
Estudo de Congelação-Descongelação: Amostras de E25 foram sujeitas a três ciclos de congelação-descongelação. Cada ciclo consistiu em congelação a -70°C de um dia para o outro e subsequentemente descongelamento à temperatura ambiente
85 ΕΡ 1 610 820/PT durante cerca de uma hora. Após cada ciclo, as amostras foram inspeccionadas visualmente utilizando uma caixa de luz para avaliar a cor e clareza do liquido. A turbidez e agregados solúveis foram medidos seguindo o protocolo descrito abaixo. Métodos analíticos: Amostras de estabilidade foram analisadas através dos métodos delineados na Tabela 1.Tabela 1: Métodos Analíticos
Ensaio Objectivo Cor, Clareza, Aparência3 Inspecção visual das formulações líquidas Cromatografia de Exclusão de Tamanho (CET)b Mede a % de agregados monoméricos solúveis e componentes de baixo peso molecular Cromatografia de Interacção Hidrófoba (CIH)C Mede o nível de isomerização de Asp-32 e tiol livre Varrimento do Espec. de UV (Gravimétrico)f Mede a concentração proteica Turbidez (DO Média 340-360 nm)d Mede agregados solúveis e insolúveis Actividade® Determina a actividade de ligação do anti-IgE aPasse para Cor, Aparência e Clareza: A cor, aparência e clareza da amostra foram visualmente avaliadas contra o fundo branco e negro da inspecção e comparadas com um controlo negativo de igual volume. As amostras devem ser cuidadosamente rodadas para assegurar uma mistura homogénea, mas não muito vigorosamente para não criar bolhas de ar. bCromatoqrafia de Exclusão de Tamanho: Foi utilizada uma coluna TSK SUPER SW3000 (4,6x300 mm) num sistema de cromatografia HP 1100. A coluna foi carregada com 20 pg de proteína e eluída em fosfato de potássio 0,1 M, pH 6,8. A amostra foi medida a 280 nm através de um detector de UV. cCromatografia de Interacção Hidrófoba (CIH): As experiências de CIH foram conduzidas utilizando uma coluna TSK Fenil-5PW (7,5x75 mm) (TosoHaas) num sistema de cromatografia líquida HP 1100. A coluna foi carregada com 28 pg de fragmentos Fab digeridos com papaína e eluída com um gradiente de concentrações de sulfato de amónio em tampão Tris 20 mM de 2 M a 0 M. Os picos foram monitorizados a 210 nm através de um detector de UV. dTurbidez: A turbidez das amostras foi determinada numa cuvete com um comprimento de via de 1 cm utilizando um espectrómetro HP. A turbidez foi calculada como a absorvância média de 340-360 nm. eA actividade do anticorpo monoclonal anti-IgE foi determinada através de um ensaio de inibição da ligação ao receptor. As 86 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ amostras foram diluídas para caírem dentro do intervalo da curva padrão de 100 e 1,56 pg/ml num diluente de ensaio contendo tampão fosfato, BSA a 0,5%, polissorbato 20 a 0,05%, Timerosol a 0,01%. Uma placa de microtitulação foi revestida com receptor de IgE, depois incubada com a amostra de IgE-biotina e anti-IgE diluído. A quantidade de IgE-biotina ligada ao receptor que se correlacionou com a actividade do anticorpo monoclonal anti-IgE foi medida utilizando Estreptavidina-HRP. Os dados foram analisados utilizando um programa logístico de ajuste de curvas de 4 parâmetros. fA concentração de anticorpo foi obtida num espectrofotómetro de díodos em série Hewlett Packard 8453 com uma cuvete de quartzo de 1 cm. A concentração foi calculada utilizando uma capacidade de absorção de 1,5 cm-1 (mg/ml)-1._
Sumário das Formulações Líquidas
Formulações Intervalo de Proteína Tampão/ Intervalo Excipientes/ Intervalo E25 a 80 mg/ml, Histidina-HCl 50 mM, Trealose 150 mM, Polissorbato 20 a 0,05% pH 6,0 40-150 mg/ml Intervalo de His-HCl ou His-Acetato: 10 mM-100 mM Intervalo do Açúcar Trealose ou Sacarose: 20 mM-350 mM Polissorbato: 0,01%-0,1% E25 a 150 mg/ml, Histidina-HCl 20 mM, Arg-HCl 200 mM, Polissorbato 20 a 0,02% pH 6,0 40-260 mg/ml Intervalo de His-HCl ou His-Acetato: 10 mM-100 mM Intervalo de Arg-HCl: 50 mM-200 mM Polissorbato: 0,01%-0,1%
Dados de Estabilidade para E25 a 150 mg/ml em formulação de Histidina e Arg-HCl
Temp. (°C) Tempo (meses) Visual PH % de Monómero por CETa % do Principal por CIHb Potência0 Turbidezd 0 pass 6,2 99, 0 64 106 0,25 1 pass 6,0 99,2 63 100 0,27 3 pass 6,0 99,3 63 111 0,25 16 pass 6,0 98, 9 62 83 0,27 1 pass 5, 9 98, 43 54 91 0,25 30 3 Pass 6,1 97, 53 42 65 0, 30 16 Pass 6,0 90,63 19 28 0,54 87 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
Dados de Estabilidade para E25 a 80 mg/ml em formulação de Histidina e Trealose
Temp. (°C) Tempo (meses) Visual PH % de Monómero por CETa % do Principal por CIHb Potência0 Turbidezd 0 Pass 5,7 99,1 64 100 0,20 1 Pass 5,8 98, 7 63 92 0,20 5 3 Pass 5,7 98, 8 63 124 0,20 6 Pass 5,7 99,1 63 97 0,21 14 Pass 5,7 99, 0 62 83 0,21 24 Pass 5,7 98, 8 62 84 0,20 1 Pass 5,8 98, 7 55 77 0,20 3 Pass 5,7 97, 4 41 76 0,29 30 6 Pass 5,8 95,5 31 48 0,38 14 Pass 5,7 93,1 22 30 0,48 a. Cromatografia de exclusão de tamanho para medição de agregados e fragmentos solúveis. b. Cromatografia de interacção hidrófoba para E25 digerido com papaina. c. Ensaio de inibição da ligação ao receptor de IgE. d. DO Média (340-360 nm)
Estudo de Agitação: T0 Agitação após 3 dias Formulação Visual CET (% de Monómero) Turbidez Visual CET (% de Monómero) Turbidez 1 Pass 99,5 0,18 pass 99,3 0,18 2 Pass 99, 0 0,19 pass 99, 4 0,19 Formulação 1: E25 a 156 mg/ml, Arg-Cl 200 mM, His 23 mM, T20 a 0,02% Formulação 2: E25 a 150 mg/ml, Arg-Cl 182 mM, His 20 mM, T20 a 0,02%
Estudo de congelação-descongelação: TO Após l2 Ciclo Após 32 Ciclo Formu lação Visual % de Monómero por CET Turbidez Visual % de Monómero por CET Turbidez Visual % de Monómero por CET Turbidez 1 pass 99,5 0, 18 pass 99, 3 0,17 pass 99,4 0, 17 2 pass 99,0 0, 19 pass 99, 2 0,19 pass 99,2 0, 18 Formulação 1: E25 a 156 mg/ml, Arg-Cl 200 mM, His 23 mM, T20 a 0,02% Formulação 2: E25 a 150 mg/ml, Arg-Cl 182 mM, His 20 mM, T20 a 0,02% 88 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ EXEMPLO 3
Amostras das formulações líquidas de anticorpo monoclonal anti-igE (E26) foram preparadas em tampões 20 mM e depois armazenadas a 30°C e 40°C. A estabilidade de E26 foi determinada através de cromatografia e medições de actividade. A cromatografia de exclusão de tamanho foi utilizada para determinação dos agregados solúveis, e a cromatografia de interacção hidrófoba da amostra digerida com pepsina foi utilizada para medição da isomerização. A actividade da amostra foi monitorizada através da utilização de um ensaio de inibição da ligação ao receptor de igE. Tal como mostrado na Figura 1, 2 e 3, a degradação de E26 é altamente dependente do pH dos tampões. Ο E26 parece ser mais estável em torno de pH 6,0. EXEMPLO 4 A formulação particulada é um grande desafio para a produção de formulação liquida de elevada concentração, uma vez que normalmente aumenta com o aumento da concentração de proteína sob as condições de stress. A Figura 4 mostra o resultado do estudo de agitação para uma formulação líquida de E26 concentrada. A formulação foi preparada em succinato 20 mM, trealose 192 mM a pH 6,0 com diferentes concentrações de polissorbato 20. A formulação particulada foi monitorizada através da medição da turbidez. O resultado mostra que a turbidez da solução de E26 aumenta com o tempo de agitação. A adição de pelo menos 0,01% de polissorbato é essencial para a redução da formação de particulados sob a condição de stress. Foram também observados resultados semelhantes para a formulação líquida concentrada de E25. EXEMPLO 5 A Figura 5 mostra a formulação líquida de E25 a 150 mg/ml preparada através de reconstituição do E25 liofilizado. O aumento da concentração de sal inibe a formação reversível de particulados e resulta na redução da leitura da turbidez. Entre todos os sais testados, a formulação com Arg-HCl parece ter a menor turbidez. O efeito da concentração de sal no 89 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ abaixamento da leitura da turbidez foi também observado para E25 preparado utilizando um processo de TFF. EXEMPLO 6 A formulação liquida de E25 na presença de Arg-HCl parece também ter melhor estabilidade que outras formulações liquidas. A Figura 6 e 7 mostram o estudo de estabilidade de E25 a 150 mg/ml em formulações liquidas contendo Arg-HCl, CaCl2 e MgCl2. Para a formulação liquida contendo Arg-HCl com ou sem sacarose, existe pouca diferença na sua estabilidade em termos de turbidez, isomerização e fragmentação. As formulações liquidas contendo ArgHCl são mais estáveis que a formulação contendo MgCl2 e CaCl2. EXEMPLO 7 A Figura 8 mostra os resultados de um estudo de estabilidade da formulação liquida de E25 com formulações de acetato e histidina. A formulação com histidina tem um pH mais elevado que a formulação de acetato. Os resultados mostraram claramente que ο E25 numa formulação liquida de histidina, ArgHCl são mais estáveis que sob outras condições. EXEMPLO 8 A elevada concentração de E25 pode formar um gel sólido na presença de certos iões, tais como citrato, succinato e sulfato (Tabela I), particularmente à temperatura de armazenagem de 2-8°C. A utilização de arginina-HCl como excipiente permite-nos formular E25 até mais do que 200 mg/ml sem formação de gel ou precipitado. 90 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
Tabela 1: Efeito de vários excipientes na gelificação de E25 a 125 mg/ml, pH »6,0
Excipiente Concentração de Excipiente mM Preparação Turbidez a TO (340-360 nm) Concentração de Anticorpo mg/ml Aspecto Visual SWFI Lyo Recon 0,21 125 Transparente NaCl 188 Lyo Recon 0,25 125 Transparente Succinato 94 Lyo Recon 0,31 125 Gel Succinato 19 Lyo Recon 0,28 125 Gel Citrato 188 Lyo Recon Pendente 125 Gel Citrato 19 Lyo Recon Pendente 125 Gel N32SO4 Pendente Lyo Recon Pendente 125 Gel N32SO4 Pendente Lyo Recon Pendente 125 Opalino Fosfato Pendente Lyo Recon Pendente 125 Opalino Acetato 188 Lyo Recon Pendente 125 Transparente Acetato 94 Lyo Recon Pendente 125 Transparente Acetato 19 Lyo Recon Pendente 125 Transparente Histidina 94 Lyo Recon 0,19 125 Transparente Histidina 47 Lyo Recon 0,24 125 Transparente Arginina-HCl 150 Lyo Recon 0,25 137 Transparente Arginina-HCl 200 TFF 0,19 162 Transparente Arginina-SOí 150 Lyo Recon 0,27 137 Gel CaCl2 125 TFF 0,32 147 Transparente MgCl2 125 TFF 0,48 147 Opalino EXEMPLO 9
Expressão da proteína ou do anticorpo em E. coli
Este exemplo ilustra a preparação de uma forma não glicosilada de uma proteína ou um anticorpo desejado através de expressão recombinante em E. coli. A sequência de ADN codificando a proteína ou o anticorpo desejado é inicialmente amplificada utilizando iniciadores de PCR seleccionados. Os iniciadores devem conter locais de enzimas restrição que correspondam aos locais de enzimas de restrição no vector de expressão seleccionado. Pode ser empregue uma variedade de vectores de expressão. Um exemplo de um vector adequado é pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolívar et al.r Gene 2: 95, 1977) que contém genes para resistência a 91 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ ampicilina e tetraciclina. O vector é digerido com uma enzima de restrição e desfosforilado. As sequências amplificadas por PCR são então ligadas no vector. O vector incluirá de preferência sequências que codificam para um gene de resistência a antibióticos, um promotor trp, um lider poli-his (incluindo os primeiros seis codões STH, a sequência poli-his, e o local de clivagem de enteroquinase), a região de codificação da proteína ou do anticorpo desejado, o terminador da transcrição lambda, e um gene argU. Adicionalmente, o vector pode incluir pelo menos porções não insignificantes das secções não traduzidas 5' e 3' do ácido nucleico de sequência nativa codificando a proteína ou o anticorpo desejado. A mistura de ligação é então utilizada para transformar uma estirpe de E. coli seleccionada utilizando os métodos descritos em Sambrook et al., supra. Os transformantes são identificados através da sua capacidade para crescerem em placa de LB e colónias resistentes ao antibiótico são então seleccionadas. O adn plasmídico pode ser isolado e confirmado através de análise de restrição e sequenciação de ADN.
Os clones seleccionados podem ser criados de um dia para o outro em meio de cultura líquido tal como caldo LB suplementado com antibióticos. A cultura de um dia para o outro pode ser subsequentemente utilizada para inocular uma cultura em maior escala. As células são então criadas até uma densidade óptica desejada, durante a qual é ligado o promotor da expressão.
Após cultura das células durante mais algumas horas, as células podem ser colhidas através de centrifugação. O sedimento celular obtido através da centrifugação pode ser solubilizado utilizando vários agentes conhecidos na arte, e a proteína ou o anticorpo desejado solubilizado pode então ser purificado utilizando uma coluna de quelante metálico sob condições que permitam forte ligação da proteína ou do anticorpo solubilizado. A proteína ou o anticorpo desejado pode ser expresso em E. coli numa forma marcada com poli-His, utilizando o seguinte procedimento. O ADN codificando a proteína ou o anticorpo desejado é inicialmente amplificado utilizando iniciadores de 92 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ PCR seleccionados. Os iniciadores conterão locais de enzimas de restrição que correspondam ao locais de enzimas de restrição no vector de expressão seleccionado, e outras sequências úteis proporcionando uma iniciação da tradução eficiente e fiável, rápida purificação numa coluna de quelante metálico e remoção proteolítica com enteroquinase. As sequências amplificadas por PCR, marcadas com poli-His são então ligadas num vector de expressão, que é utilizado para transformar um hospedeiro de E. coli baseado na estirpe 52 (W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq)). Os transformantes são primeiro criados em LB contendo 50 mg/ml de carbenicilina a 30°C com agitação até ser alcançada uma D06oo de 3-5. As culturas são então diluidas 50-100 vezes em meio CRAP (preparado através da mistura de 3,57 g de (NH4)2S04, 0,71 g de citrato de sódio*2H20, 1,07 g de KC1, 5,36 g de extracto de levedura de Difco, 5,36 g de Hycase SF de Sheffield em 500 ml de água, bem como MPOS 110 mM, pH 7,3, glicose a 0,55% (p/v) e MgS04 7 mM) e criadas durante aproximadamente 20-30 horas a 30°C com agitação. As amostras foram removidas para se verificar a expressão através de análise de SDS-PAGE, e a cultura bruta é centrifugada para sedimentar as células. Os sedimentos celulares são congelados até à purificação e redobragem. A pasta de E. coli de fermentações de 0,5 a 11 (sedimentos de 6-10 g) é ressuspensa em 10 volumes (p/v) em guanidina 7 M, Tris 20 mM, tampão pH 8. É adicionado sulfito de sódio sólido e tetrationato de sódio para perfazer concentrações finais de 0,1 Me 0,02 M, respectivamente, e a solução é agitada de um dia para o outro a 4°C. Este passo resulta numa proteína desnaturada com todos os resíduos de cisteína bloqueados através de sulfitolização. A solução é centrifugada a 40000 rpm numa Ultracentrífuga Beckman durante 30 min. O sobrenadante é diluído com 3-5 volumes de tampão da coluna de quelato metálico (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) e filtrado através de filtros de 0,22 micrómetros, para clarificar. O extracto clarificado é carregado numa coluna de quelato metálico Ni-NTA de Qiagen de 5 ml equilibrada no tampão da coluna de quelato metálico. A coluna é lavada com tampão adicional contendo imidazole 50 mM (Calbiochem, grau Utrol), ph 7,4. A proteína é eluída com tampão contendo imidazole 250 mM. As fracções contendo a proteína desejada são 93 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ reunidas e armazenadas a 4°C. A concentração de proteína é estimada através da sua absorvância a 280 nm utilizando o coeficiente de extinção calculado com base na sua sequência de aminoácidos.
As proteínas são redobradas diluindo a amostra lentamente em tampão de redobragem preparado de fresco consistindo em: Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, ureia 2,5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM e EDTA 1 mM. Os volumes de redobragem são escolhidos de modo a que a concentração final de proteína fique entre 50 e 100 microgramas/ml. A solução de redobragem é agitada suavemente a 4°C durante 12-36 horas. A reacção de redobragem é extinta através da adição de TFA até uma concentração final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de mais purificação da proteína, a solução é filtrada através de um filtro de 0,22 micrómetros e adiciona-se acetonitrilo até uma concentração final de 2-10%. A proteína redobrada é sujeita a cromatografia numa coluna de fase reversa Poros Rl/H utilizando um tampão móvel de TFA a 0,1% com eluição com um gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%. Alíquotas de fracções com absorvência A2so são analisadas em géis de SDS-poliacrilamida e as fracções contendo proteína redobrada homogénea são reunidas. Geralmente, as espécies correctamente redobradas da maioria das proteínas são eluídas às concentrações mais baixas de acetonitrilo uma vez que essas espécies são as mais compactas com os seus interiores hidrófobos protegidos da interacção com a resina da fase reversa. As espécies agregadas são normalmente eluídas às maiores concentrações de acetonitrilo. Além de separar as formas mal dobradas das proteínas da forma desejada, o passo de fase reversa remove também endotoxinas das amostras.
As fracções contendo a proteína ou o anticorpo desejado dobrado são reunidas e o acetonitrilo é removido utilizando uma corrente suave de azoto dirigida para a solução. As proteínas são formuladas em HEPES 20 mM, pH 6,8 com cloreto de sódio 0,14 M e manitol a 4% através de diálise ou através de filtração em gel, utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas no tampão de formulação e esterilizadas por filtração. 94 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ EXEMPLO 10
Expressão da proteína ou do anticorpo em células de mamífero
Este exemplo ilustra a preparação de formas potencialmente glicosiladas da proteína ou do anticorpo desejado através de expressão recombinante em células de mamífero. O vector, pRK5 (ver EP 307247, publicada a 15 de Março de 1989), é empregue como vector de expressão. Opcionalmente, o ADN codificando a proteína ou o anticorpo desejado é ligado em pRK5 com enzimas de restrição seleccionadas para permitir a inserção de tal ADN utilizando métodos de ligação tal como descrito em Sambrook et al., supra.
Numa concretização, as células hospedeiras seleccionadas podem ser células 293. As células humanas 293 (ATCC CCL 1573) são criadas até à confluência em placas de cultura de tecidos em meio tal como DMEM suplementado com soro fetal de vitelo e, opcionalmente, componentes nutrientes e/ou antibióticos. Cerca de 10 pg de ADN codificando a proteína ou o anticorpo desejado ligado em pRK5 são misturados com cerca de 1 pg de ADN codificando o gene de VA RNA (Thimmappaya et al., Cell 31: 543, 1982) e dissolvidos em 500 pl de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl2 0, 227 Μ. A esta mistura são adicionados, às gotas, 500 pl de hepes 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaP04 1,5 mM e deixa-se formar um precipitado durante 10 minutos a 25°C. O precipitado é suspenso e adicionado às células 293 e deixado assentar durante cerca de guatro horas a 37°C. O meio de cultura é aspirado e são adicionados 2 ml de glicerol a 20% em PBS durante 30 segundos. As células 293 são então lavadas com meio sem soro, é adicionado meio fresco e as células são incubadas durante cerca de 5 dias.
Aproximadamente 24 horas após as transfecções, o meio de cultura é removido e substituído por meio de cultura (sozinho) ou meio de cultura contendo 200 pCi/ml de 35S-cisteína e 200 pCi/ml de 35S-metionina. Após uma incubação de 12 horas, o meio condicionado é recolhido, concentrado num filtro de centrifugação, e carregado num gel de SDS a 15%. O gel processado pode ser seco e exposto a película durante um 95 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ período de tempo seleccionado para revelar a presença da proteína ou do anticorpo desejado. As culturas contendo células transfectadas podem ser sujeitas a mais incubação (em meio sem soro) e o meio é testado em bioensaios seleccionados.
Numa técnica alternativa, a proteína ou o anticorpo desejado pode ser introduzido transientemente em células 293 utilizando o método de sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 12: 7575, 1981. As células 293 são criadas até à densidade máxima num frasco de centrifugação e são adicionados 700 pg de ADN codificando a proteína ou o anticorpo desejado ligado em pRK5. As células são primeiro concentradas a partir do frasco de centrifugação através de centrifugação e lavadas com PBS. O precipitado de ADN-dextrano é incubado no sedimento celular durante quatro horas. As células são tratadas com glicerol a 20% durante 90 segundos, lavadas com meio de cultura de tecidos, e reintroduzidas no frasco giratório contendo meio de cultura de tecidos, 5 pg/ml de insulina de bovino e 0,1 pg/ml de transferrina bovina. Após cerca de quatro dias, o meio condicionado é centrifugado e filtrado para remover células e restos celulares. A amostra contendo a proteína ou o anticorpo expresso desejado pode então ser concentrada e purificada através de qualquer método seleccionado, tal como diálise e/ou cromatografia em coluna.
Noutra concretização, a proteína ou o anticorpo desejado pode ser expresso em células CHO. O ADN codificando a proteína ou o anticorpo desejado ligado em pRK5 pode ser transfectado para células CHO utilizando reagentes conhecidos tais como CaP04 ou DEAE-dextrano. Tal como descrito acima, as culturas celulares podem ser incubadas e o meio substituído por meio de cultura (sozinho) ou meio contendo um marcador radioactivo tal como 35S-metionina. Após determinação da presença da proteína ou do anticorpo desejado, o meio de cultura pode ser substituído com meio sem soro. De preferência, as culturas são incubadas durante cerca de 6 dias, e depois o meio condicionado é colhido. O meio contendo a proteína ou o anticorpo desejado expresso pode então ser concentrado e purificado através de qualquer método seleccionado. 96 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
Variantes com marcadores epitópicos da proteína ou do anticorpo desejado podem também ser expressas em células CHO hospedeiras. O ADN codificando a proteína ou o anticorpo desejado ligado em pRK5 pode ser subclonado a partir do vector pRK55. A inserção do subclone pode ser sujeita a PCR para ser fundida enquadrada com um marcador epitópico seleccionado tal como um marcador poli-his num vector de expressão baculoviral. O ADN marcado com poli-his codificando a inserção da proteína ou do anticorpo desejado pode então ser subclonado num vector dirigido por SV40 contendo um marcador de selecção, tal como DHFR, para selecção de clones estáveis. Finalmente, as células CHO podem ser transfectadas (tal como descrito acima) com o vector dirigido por SV40. Pode ser efectuada marcação, tal como descrito acima, para verificar a expressão. O meio de cultura contendo a proteína ou o anticorpo desejado expresso marcado com poli-His pode então ser concentrado e purificado através de qualquer método seleccionado, tal como através de cromatografia de afinidade Ni2+-quelato. A proteína ou o anticorpo desejado pode também ser expresso em células CHO e/ou COS através de um procedimento de expressão transiente ou em células CHO através de outro procedimento de expressão estável. A expressão estável em células CHO é efectuada utilizando o seguinte procedimento. As proteínas são expressas como uma construção de igG (imunoadesina), na qual as sequências de codificação para as formas solúveis (p.ex. domínios extracelulares) das respectivas proteínas são fundidas com uma sequência da região constante de igGl contendo os dominios charneira, CH2 e CH2 e/ou é uma forma marcada com poli-His.
Após amplificação por PCR, os respectivos ADN são subclonados num vector de expressão de CHO utilizando técnicas padrão tal como descrito em Ausubel et al., "Current Protocols of Molecular Biology", Unidade 3.16, John Wiley and Sons (1997) . Os vectores de expressão de CHO são construídos para terem locais de restrição compatíveis a 5' e 3' do ADN de interesse para permitir o vaivém conveniente dos ADNc. O vector de expressão utilizado em células CHO é tal como descrito em Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24: 9 1774-1779, 1996, e utiliza o promotor/estimulador inicial SV40 para 97 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ dirigir a expressão do ADNc de interesse e da di-hidrofolato-redutase (DHFR). A expressão de DHFR permite a selecção da manutenção estável do plasmideo após transfecção.
Doze microgramas do ADN plasmidico desejado são introduzidos em aproximadamente 10 milhões de células CHO utilizando reagentes comercialmente disponíveis Superfect® (Quiagen), Dosper® ou Fugene® (Boehringer Mannheim). As células são criadas tal como descrito em Lucas et ai., supra. Aproximadamente 3xl0^7 células são congeladas numa ampola para posterior crescimento e produção tal como descrito abaixo.
As ampolas contendo o ADN plasmidico são descongeladas através de colocação em banho-maria e misturadas sujeitando-as a vórtice. O conteúdo é pipetado para um tubo de centrífuga contendo 10 ml de meio e centrifugado a 1000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante é aspirado e as células são ressuspensas em 10 ml de meio selectivo (PS20 filtrado a 0,2 pm com soro fetal bovino a 5% diafiltrado a 0,2 pm) . As células são então aliquotadas para um frasco rotativo de 100 ml contendo 90 ml de meio selectivo. Após 1-2 dias, as células são transferidas para um frasco rotativo de 250 ml cheio com 150 ml de meio de crescimento selectivo e incubadas a 37°C. Após outros 2-3 dias, são semeados frascos rotativos de 250 ml, 500 ml e 2000 ml com 3xl05 células/ml. O meio celular é trocado por meio fresco através de centrifugação e ressuspensão em meio de produção. Embora possa ser utilizado qualquer meio de CHO adequado, um meio de produção descrito na Patente U.S. N.° 5122469, publicada a 16 de Junho de 1992 pode ser de facto utilizado. Um frasco rotativo de produção de 3 1 é semeado a 1,2χ106 células/ml. No dia 0, é determinado o número de células e o pH. No dia 1, o frasco rotativo é amostrado e é iniciada aspersão com ar filtrado. No dia 2, o frasco rotativo é amostrado, a temperatura é mudada para 33°C e são tomados 30 ml de glicose a 500 g/1 e 0,6 ml de anti-espuma a 10% (p.ex., emulsão de polidimetilsiloxano a 35%, Emulsão de Grau Médico 365 de Dow Corning) . Ao longo da produção, o pH é ajustado conforme necessário para mantê-lo em torno de 7,2. Após 10 dias, ou até a viabilidade cair abaixo de 70%, a cultura celular é colhida por centrifugação e filtração através de um filtro de 0,22 pm. O filtrado foi 98 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ armazenado a 4°C ou imediatamente carregado em colunas para purificação.
Para as construções marcadas com poli-His, as proteínas são purificadas utilizando uma coluna Ni-NTA (Qiagen). Antes da purificação, é adicionado imidazole ao meio condicionado a uma concentração de 5 mM. 0 meio condicionado é bombeado para uma coluna Ni-NTA de 6 ml equilibrada a 4°C, em Hepes 20 mM, tampão de pH 7,4, contendo NaCl 0,3 M e imidazole 5 mM a um caudal de 4-5 ml/min. Após carregamento, a coluna é lavada com mais tampão de equilíbrio e a proteína eluída com tampão de equilíbrio contendo imidazole 0,25 Μ. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalgada num tampão de armazenamento contendo Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M e manitol a 4%, pH 6,8, com uma coluna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml e armazenada a -80°C.
As construções de imunoadesina (contendo Fc) são purificadas a partir do meio condicionado como se segue. O meio condicionado é bombeado para uma coluna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que tinha sido equilibrada em tampão fosfato de Na 20 mM, pH 6,8. Após o carregamento, a coluna é lavada extensivamente com tampão de equilíbrio antes da eluição com ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. A proteína eluída é imediatamente neutralizada através da colheita de fracções de 1 ml para tubos contendo 275 μΐ de tampão Tris 1 M, pH 9. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalgada para tampão de armazenamento tal como descrito acima para as proteínas marcadas com poli-His. A homogeneidade é avaliada através de géis de SDS-poliacrilamida e através de sequenciação de aminoácidos N-terminal através por degradação de Edman. EXEMPLO 11
Expressão de proteínas ou anticorpos em Levedura O seguinte método descreve a expressão recombinante da proteína ou do anticorpo desejado em levedura.
Primeiro, vectores de expressão de levedura são construídos para produção intracelular ou secreção da proteína 99 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ ou do anticorpo desejado a partir do promotor ADH2/GAPDH. O ADN codificando a proteina ou o anticorpo desejado e o promotor são inseridos em locais de enzimas de restrição adequados no plasmídeo seleccionado para dirigir a expressão intracelular. Para secreção, o ADN codificando a proteina ou o anticorpo desejado pode ser clonado no plasmídeo seleccionado, juntamente com o ADN codificando o promotor ADH2/GAPDH, um péptido sinal nativo ou outro péptido sinal de mamífero, ou, por exemplo, uma sequência sinal/líder de secreção do factor alfa ou da invertase de levedura, e sequências ligadoras (se necessário) para expressão da proteína ou do anticorpo desejado. Células de levedura, tais como a estirpe de levedura AB110, podem ser transformadas com os plasmídeos de expressão descritos acima e cultivadas em meio de fermentação seleccionado. Os sobrenadantes das leveduras transformadas podem ser analisados através de precipitação com ácido tricloroacético a 10% e separação através de SDS-PAGE, seguido de coloração dos géis com o corante Azul de Coomassie. A proteína ou o anticorpo recombinante pode subsequentemente ser isolado e purificado através da remoção das células de levedura do meio de fermentação através de centrifugação e depois concentração do meio utilizando filtros de cartucho seleccionados. O concentrado contendo a proteína ou o anticorpo recombinante pode ainda ser purificado utilizando resinas de cromatografia de coluna seleccionadas. EXEMPLO 12
Expressão da Proteína ou do Anticorpo em Células de Insecto Infectadas com Baculovírus O seguinte método descreve a expressão recombinante da proteína ou do anticorpo desejado em células de insecto infectadas com Baculovírus. A sequência de codificação para a proteína ou o anticorpo desejado é fundida a montante de um marcador epitópico contido dentro de um vector de expressão baculoviral. Tais marcadores epitópicos incluem marcadores poli-His e marcadores de 100 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ imunoglobulina (tais como regiões Fc ou igG). Pode ser empregue uma variedade de plasmideos, incluindo plasmideos derivados de plasmideos comercialmente disponíveis tais como pVLl393 (Novagen). Resumidamente, a sequência codificando a porção desejada da proteína ou do anticorpo, tal como a sequência codificando o domínio extracelular de uma proteína transmembranar ou a sequência codificando a proteína madura se a proteína for extracelular, é amplificada por PCR com iniciadores complementares às regiões 5' e 3'. O iniciador 5' pode incorporar locais de enzimas de restrição flanqueadores (seleccionados). O produto é então digerido com essas enzimas de restrição seleccionadas e subclonado no vector de expressão. O baculovírus recombinante é gerado através de co-transfecção do plasmídeo de cima com ADN virai BaculoGold™ (Pharmingen) em células Spodoptera frugiperda ("Sf 9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (comercialmente disponível em GIBCO-BRL) . Após 4-5 dias de incubação a 28°C, os vírus libertados são colhidos e utilizados para mais amplificações. A infecção virai e expressão proteica são efectuadas tal como descrito por 0'Reilley et ai., "Baculovírus Expression Vectors: A Laboratory Manual", Oxford; Oxford University Press (1994) .
A proteína ou o anticorpo marcado com poli-His expresso pode então ser purificado, por exemplo, através de cromatografia de afinidade de Ni2+-quelato como se segue. São preparados extractos a partir de células Sf9 recombinantes infectadas com vírus tal como descrito por Rupert et al., Nature 362: 175-179, 1993. Resumidamente, células Sf9 são lavadas, ressuspensas em tampão de ultra-sons (25 ml de Hepes, pH 7,9; MgCl2 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol a 10%; NP-40 a 0,1%; KC1 0,4 M), e sujeitas a ultra-sons durante 20 segundos em gelo. O material sujeito a ultra-sons é clarificado por centrifugação e o sobrenadante é diluído 50 vezes em tampão de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol a 10%, pH 7,8) e filtrado através de um filtro de 0,45 pm. É preparada uma coluna de agarose de Ni2+-NTA (comercialmente disponível em Qiagen) com um volume de leito de 5 ml, lavada com 25 ml de água e equilibrada com 25 ml de tampão de carga. O extracto celular filtrado é carregado na coluna a 0,5 ml por minuto. A 101 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ coluna é lavada até à A280 limiar com tampão de carga, ponto ao qual é iniciada a colheita das fracções. Depois, a coluna é lavada com um tampão de lavagem secundário (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, glicerol a 10%, pH 6,0), que elui a proteina ligada não especificamente. Após se alcançar novamente o limiar da Α2βο, a coluna é revelada com um gradiente de Imidazole de 0 a 500 mM no tampão de lavagem secundário. São colhidas fracções de 1 ml que são analisadas através de SDS-PAGE e coloração de prata ou Western blot com Ni2+-NTA conjugado com fosfatase alcalina (Qiagen). As fracções contendo a proteina ou o anticorpo marcados com Hisio eluido são reunidas e dializadas contra tampão de carga.
Alternativamente, a purificação da proteina ou do anticorpo marcadoas com IgG (ou marcados com Fc) pode ser efectuada utilizando técnicas de cromatografia conhecidas, incluindo por exemplo, cromatografia em coluna de Proteina A ou Proteina G. EXEMPLO 13
Preparação de Anticorpos
Este exemplo ilustra a preparação de anticorpos monoclonais que se podem ligar especificamente à proteina de interesse ou ao antigénio desejado.
As técnicas para produção de anticorpos monoclonais são conhecidas na arte e estão descritas, por exemplo, em Goding, supra. Os imunogénios que podem ser empregues incluem a proteina desejada purificada ou o anticorpo alvo, proteínas de fusão contendo a proteína desejada ou o antigénio alvo, e células expressando tal proteína ou antigénio recombinante na superfície celular. A selecção do imunogénio pode ser feita pelo perito na arte sem demasiada experimentação.
Ratinhos, tais como Balb/c, são imunizados com a proteína desejada ou o imunogénio antigénio alvo emulsionado em adjuvante completo de Freund e injectado subcutaneamente ou intraperitonealmente numa quantidade de 1-100 microgramas. Alternativamente, o imunogénio é emulsionado em adjuvante MPL-TDM (Ribi Imunochemical Research, Hamilton, MT) e injectado 102 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ nas almofadas das patas traseiras do animal. Os ratinhos imunizados são então reforçados 10 a 12 dias depois com mais imunogénio emulsionado no adjuvante seleccionado. A partir daí, durante várias semanas, os ratinhos podem também ser reforçados com mais injecções de imunização. Podem ser periodicamente obtidas amostras de soro dos ratinhos através de sangria retro-orbital para testes em ensaios ELISA para detectar anticorpos dirigidos para a proteína ou o antigénio desejado.
Após ter sido detectado um título de anticorpo adequado, os animais "positivos" para os anticorpos podem ser injectados com uma injecção intravenosa final da proteína desejada ou do antigénio alvo. Três a quatro dias depois, os ratinhos são sacrificados e as células do baço são colhidas. As células do baço são então fundidas (utilizando polietilenoglicol a 35%) com uma linha celular de mieloma de murídeo seleccionada tal como P3X63AgU.l, disponível em ATCC, N.° CRL 1597. As fusões geram células de hibridoma que podem então ser plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços contendo meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina) para inibir a proliferação de células não fundidas, híbridos de mieloma e híbridos de células do baço.
As células de hibridoma serão pesquisadas num ELISA quanto à reactividade contra a proteína desejada ou o antigénio alvo. A determinação de células de hibridoma "positivas" segregando tais anticorpos monoclonais está dentro da perícia n arte.
As células de hibridoma positivas podem ser injectadas intraperitonealmente em ratinhos Balb/c singeneicos para produzir ascites contendo tais anticorpos monoclonais. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser criadas em frascos de cultura de tecidos ou garrafas rolantes. A purificação dos anticorpos monoclonais produzidos nas ascites pode ser alcançada utilizando precipitação em sulfato de amónio, seguida de cromatografia de exclusão em gel. Alternativamente, pode ser empregue cromatografia de afinidade com base na ligação do anticorpo a proteína A ou proteína G. 103 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ EXEMPLO 14
Purificação da Proteína Desejada Utilizando Anticorpos Específicos A proteína desejada, na sua forma nativa ou recombinante, pode ser purificada através de uma variedade de técnicas padrão na arte de purificação de proteínas. Por exemplo, as formas de pró-polipéptido, polipéptido maduro, ou pré-polipéptido da proteína desejada podem ser purificadas através de cromatografia de imunoafinidade utilizando anticorpos específicos para a proteína desejada. Em geral, uma cromatografia de imunoafinidade é construída através de ligação covalente do anticorpo que se liga especificamente à proteína desejada a uma resina cromatográfica activada.
As imunoglobulinas policlonais são preparadas a partir de soros imunes através de precipitação com sulfato de amónio ou através de purificação em Proteína A imobilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Do mesmo modo, os anticorpos monoclonais são preparados a partir de fluido de ascites de ratinho através de precipitação com sulfato de amónio ou cromatografia em Proteína A imobilizada. A imunoglobulina parcialmente purificada é ligada covalentemente a uma resina cromatográfica, tal como Sepharose™ activada com CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). O anticorpo é ligado à resina, a resina é bloqueada, e a resina derivada é lavada de acordo com as instruções do fabricante.
Tal coluna de imunoafinidade é utilizada na purificação da proteína desejada através da preparação de uma fracção de células que a expressam numa forma solúvel. Esta preparação é derivada através de solubilização da célula inteira ou de uma fracção subcelular obtida através de centrifugação diferencial através da adição de detergente ou através de outros métodos bem conhecidos na arte. Alternativamente, a proteína solúvel contendo uma sequência sinal pode ser segregada numa quantidade útil para o meio no qual as células são criadas. A preparação solubilizada contendo a proteína desejada é passada por uma coluna de imunoafinidade e a coluna é lavada sob condições que permitam a absorvância preferencial da ΕΡ 1 610 820/ΡΤ 104 proteína desejada (p.ex., tampões de elevada força iónica na presença de detergente). Depois, a coluna é eluída sob condições que rompam a ligação do anticorpo com a proteína (p.ex., um tampão de baixo pH tal como aproximadamente pH 2-3, ou uma elevada concentração de um caotrópico tal como ião de ureia ou tiocianato), e a proteína desejada é então recolhida.
Lisboa, 2010-12-07

Claims (27)

  1. ΕΡ 1 610 820/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Formulação líquida estável de baixa turbidez compreendendo (a) um anticorpo anti-igE numa quantidade de cerca de 150 a 260 mg/ml, em que o anticorpo anti-igE compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos identificada como E25 na Figura 10A e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos identificada como E25 na Figura 10B, (b) arginina-HCl numa quantidade de 100 a 200 mM, (c) histidina numa quantidade de 10 a 100 mM, (d) polissorbato numa quantidade de 0,01 a 0,1%, onde a formulação tem ainda um pH variando de 5,5 a 7,0, uma viscosidade cinemática de cerca de 50 cs ou menos e uma osmolaridade variando de 200 mOsm/kg a 450 mOsm/kg.
  2. 2. Formulação da reivindicação 1, em que a concentração de arginina-HCl varia de 150 mM a 200 mM.
  3. 3. Formulação da reivindicação 1, em que a concentração de arginina-HCl varia de 180 mM a 200 mM.
  4. 4. Formulação da reivindicação 1, em que a concentração de arginina-HCl é de 200 mM.
  5. 5. Formulação anteriores, em que: de qualquer uma das reivindicações (a) a concentração 260 mg/ml; ou do anticorpo varia de 180 mg/ml a (b) a concentração 260 mg/ml. do anticorpo varia de 200 mg/ml a
  6. 6. Formulação de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a concentração do anticorpo é de cerca de 150 mg/ml.
  7. 7. Formulação de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a osmolaridade varia de 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg.
  8. 8. Formulação de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo anti-igE compreende duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas. ΕΡ 1 610 820/ΡΤ 2/4
  9. 9. Formulação líquida estável de baixa turbidez compreendendo (a) um anticorpo anti-IgE numa quantidade de cerca de 150 mg/ml, em que o anticorpo anti-IgE compreende duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas, cada cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos identificada como E25 na Figura 10A e cada cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos identificada como E25 na Figura 10B, (b) arginina-HCl numa quantidade de 200 mM, (c) histidina numa quantidade de 20 mM, (d) polissorbato numa quantidade de 0,01 a 0,1%, onde a formulação tem ainda um pH de 6,0.
  10. 10. Formulação da reivindicação 9, em que o polissorbato está numa quantidade de 0,02%.
  11. 11. Artigo de fabrico compreendendo um recipiente encerrando a formulação de qualquer uma das reivindicações anteriores.
  12. 12. Artigo de fabrico da reivindicação 11, em que o recipiente é uma seringa.
  13. 13. Artigo de fabrico da reivindicação 12, em que a seringa está ainda contida dentro de um dispositivo de injecção.
  14. 14. Artigo de fabrico da reivindicação 13, em que o dispositivo de injecção é um auto-injector.
  15. 15. Utilização de uma formulação de qualquer uma das reivindicações 1 a 10 para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio mediado por IgE.
  16. 16. Formulação de qualquer uma das reivindicações 1 a 10 para utilização num método de tratamento para um distúrbio mediado por IgE.
  17. 17. Utilização da reivindicação 15 ou formulação para utilização de acordo com a reivindicação 16, em que o distúrbio mediado por IgE é seleccionado a partir do grupo que consiste em rinite alérgica, asma, asma alérgica, asma não alérgica, dermatite atópica e gastroenteropatia. 3/4 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ
  18. 18. Utilização da reivindicação 15 ou formulação para utilização de acordo com a reivindicação 16, em que o distúrbio mediado por IgE é rinite alérgica, asma alérgica, ou dermatite atópica.
  19. 19. Utilização da reivindicação 15 ou formulação para utilização de acordo com a reivindicação 16, em que o distúrbio mediado por IgE é seleccionado de entre o grupo que consiste em hipersensibilidade, aspergilose broncopulmonar alérgica, doenças parasitárias, cistite intersticial, síndroma de hiper-IgE, ataxia-telangiectasia, síndroma de Wiskott-Aldrich, alinfoplasia tímica, mieloma de IgE e reacção de enxerto versus hospedeiro.
  20. 20. Utilização da reivindicação 15 ou formulação para utilização de acordo com a reivindicação 16, em que o distúrbio mediado por IgE é hipersensibilidade.
  21. 21. Utilização ou formulação para utilização de acordo com a reivindicação 20, em que o distúrbio de hipersensibilidade é seleccionado de entre o grupo que consiste em anafilaxia, urticária e alergia alimentar.
  22. 22. Utilização ou formulação para utilização de acordo com a reivindicação 21, em que o distúrbio de hipersensibilidade é alergia alimentar.
  23. 23. Utilização ou formulação para utilização de acordo com a reivindicação 22, em que a alergia alimentar resulta de exposição a um legume.
  24. 24. Utilização ou formulação para utilização de acordo com a reivindicação 23, em que o legume é o amendoim.
  25. 25. Utilização da reivindicação 15 ou formulação para utilização de acordo com a reivindicação 16, em que a formulação está em combinação com um anti-histamínico, um broncodilatador, um glucocorticóide ou um ΑΙΝΕ.
  26. 26. Utilização da reivindicação 15 ou formulação para utilização de acordo com a reivindicação 16, em que o medicamento ou a formulação são para administração em 4/4 ΕΡ 1 610 820/ΡΤ combinação com a administração de um anti-histamínico, um broncodilatador, um glucocorticóide ou um ΑΙΝΕ.
  27. 27. Utilização da reivindicação 15 ou formulação para utilização de acordo com a reivindicação 16, em que o medicamento ou a formulação são para administração em combinação com a administração de dessensibilização a alergénios. Lisboa, 2010-12-07
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