MX2007000891A

MX2007000891A - Cristalizacion de anticuerpos o fragmentos de ellos.

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Publication number: MX2007000891A
Application number: MX2007000891A
Authority: MX
Inventors: Annette Marie Clas Hagewiesche; Julie Fukami; Mary E M Cromwell; Rachel Bulotsky
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2004-07-23
Filing date: 2005-07-22
Publication date: 2007-04-18
Also published as: IL180854A; WO2006012500A9; RU2442571C2; ES2531155T3; US20070258975A1; JP2012021016A; BRPI0513601A; NZ552713A; US8008447B2; CN101048427A; KR101320707B1; WO2006012500A3; HK1102821A1; CN101048427B; WO2006012500A2; JP2008507554A; ZA200700947B; CN101721701A; EP1771476B1; EP1771476A2

Abstract

La presente descripcion se refiere a metodos de cristalizacion y/o de concentracion de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos. Los metodos comprenden poner en contacto un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo con una solucion que contiene una sal de un cation divalente. Los cristales y/o geles de proteina de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos son utiles en composiciones y formulaciones.

Description

CRISTALIZACIÓN DE ANTICUERPOS O FRAGMENTOS DE ELLOS Referencia cruzada con solicitudes relacionadas La solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Estadounidense Número 60/590,707, presentada el 23 de julio del 2004, bajo la sección 1 1 9 (e) del U.S.C., cuya aplicación se incorpora aquí mediante referencia. Antecedentes de la invención Los anticuerpos monoclonales se están convirtiendo en agentes terapéuticos poderosos en el tratamiento de un número de enfermedades y condiciones, incluyendo, sin limitarse a ellas, cáncer, enfermedades respiratorias, enfermedades inflamatorias y enfermedades infecciosas. Generalmente, las terapias que incluyen anticuerpos requieren el suministro de entre 100 mg y 1 g de anticuerpo por dosis. Un enfoque comúnmente utilizado para dichos tratamientos es el uso de infusiones intravenosas de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mL de una solución a 50 mg/mL del anticuerpo. Dado que los métodos de introducción que no sean por vía de administración intravenosa, tales como inyección subcutánea, son deseables, resultaría ventajoso tener soluciones más concentradas de dichos anticuerpos. Sin embargo, las soluciones concentradas de anticuerpos pueden llevar a problemas, incluyendo, sin limitación a ellos, soluciones altamente viscosas, agregación proteínica y problemas con la estabilidad de las soluciones.

Se han cristalizado fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, para utilizarse en cristalografía de rayos X. Los métodos para cristalizar anticuerpos monoclonales reportados con anterioridad generalmente han utilizado la técnica de difusión de vapor. Las desventajas de esta técnica incluyen las cantidades diminutas de cristales que se producen , y el uso de agentes que en algunos casos son inaceptables para utilizarse con seres humanos. Los métodos de proceso de lote también pueden utilizarse para producir cantidades ligeramente mayores de cristales. Los métodos de proceso de lote típicamente usados utilizan precipitantes orgánicos o polímeros. Se han descrito ya procedimientos que utilizan precipitantes orgánicos para la cristalización de anticuerpos. Yang et al. , PNAS, vol. 100, no. 12, pp. 6934-6939 (2003) ; Kuzsnetsov eí al., J. Cristal Growth, vol. 232, pp. 30-39 (2001 ); Kuzsnetsov et al., J. Structural Biology, vol. 131 , pp. 108-1 15 (2000); Harris et al., Immunological Reviews, vol. 163, pp. 35-43 (1998); Harris ef al., J. Mol. Biol., vol. 275, pp. 861 -872, (1998) y Harris ef al. , Proteins, vol. 23, pp. 285-89 (1995). Los ejemplos de precipitantes orgánicos o poliméricos comúnmente utilizados incluyen polietilenglicol (PEG), isopropanol, Jeffamine ® (Huntsman Petrochemical Corps. , Salt Lake City, UT) y (+/-)-2-metil-2,4-pentanodiol (MPD). Dado que muchos anticuerpos se procesan hoy en día a gran escala para su administración a seres humanos, es deseable tener métodos para formar cristales y/o geles proteínicos concentrados a gran escala, especialmente aquellos que no incluyen precipitantes orgánicos o poliméricos. Los cristales y/o geles son útiles para almacenar y administrarse terapéuticamente. Breve descripción de la invención Un aspecto de la invención proporciona un método para producir cristales de un anticuerpo o fragmento de este que incluye los pasos de poner en contacto un anticuerpo o fragmento de este con una solución que incluye aproximadamente entre 1 a 500 milimolar (m M) de una sal de un catión divalente y aproximadamente de 1 a 100 mM de regulador de pH , e incubar al anticuerpo o fragmento de esta y la solución, hasta que se forman los cristales del anticuerpo o fragmento de este. En algunas modalidades, un método comprende poner en contacto un anticuerpo o fragmento de este con una solución que contiene entre 1 y 120 mM de sal de zinc e incubar al anticuerpo o fragmento de este, y la solución hasta que se formen los cristales y/o el gel proteínico del anticuerpo o de un fragmento de este. En algunas modalidades la incubación se realiza a temperatura ambiente. En algunas modalidades la temperatura es aproximadamente de entre 20 y 27° C. En otras modalidades, la incubación se encuentra a menos de aproximadamente 20° C, preferiblemente a partir de aproximadamente 0 a 20° C, más preferiblemente aproximadamente de 0 a 10° C. En algunas modalidades, un método comprende poner en contacto un anticuerpo o fragmento de este con una solución que consiste esencialmente de una sal de zinc y un regulador de pH; e incubar al anticuerpo o fragmento de este y la solución hasta que se formen los cristales y/o gel proteínico del anticuerpo o fragmento de este. Un método para producir cristales de un anticuerpo o fragmento de este incluye poner en contacto un anticuerpo o fragmento de este con una solución que incluye una sal de zinc y no tiene otros precipitantes; e incubar al anticuerpo o fragmento de este y la solución hasta que se formen los cristales del anticuerpo o fragmento de este. En algunas modalidades, la sal divalente es aproximadamente de 10 a 80 mM , más preferiblemente de 25 a 60 mM de cloruro de zinc (ZnCl2). En otras modalidades el regulador de pH es aproximadamente de 1 a 20 mM de NaOAc, más preferiblemente aproximadamente de 25 a 75 mM de acetato de sodio (NaOAc). En algunas modalidades, la solución contiene más de aproximadamente 10 mM de ZnCI2 y más de aproximadamente 5 mM de NaOAc. Por ejemplo, la solución contiene aproximadamente 100 mM de ZnCI2 y aproximadamente mM de NaOAc. En otras modalidades, el regulador de pH tiene un pH desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 9, más preferiblemente desde aproximadamente 4.7 hasta aproximadamente 5.7. También se proporciona un cristal de un anticuerpo o fragmento de este producido mediante los métodos descritos aqu í. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos humanos o anticuerpos humanizados. La invención también proporciona una composición q ue incluye u n cristal o un gel proteínico de anticuerpo, seleccionado del grupo que consiste en anticuerpo anti-VEG F, anti-CD20, ant¡-CD 1 1 a, anti-CD40, anti-Apo-2, anti-H ER2, anti-lgE y fragmentos de estos, además de un portador. Preferiblemente, los anticuerpos son anticuerpos glicosilados de longitud completa. Además se proporciona una formulación que incluye un cristal o gel proteínico de un anticuerpo seleccionado de un g rupo consistente de antí-VEG F, anti-Apo-2, anti-CD20, anti-CD1 1 a, anti- CD40, anti-HER2, anti-Apo-2, a nti-lgE y fragmentos de estos, y al menos un ingrediente. La invención también proporciona un método para tratar una condición en un mamífero, que comprende la administración al mam ífero de una cantidad efectiva de una de las composiciones o formulaciones mencionadas. Las condiciones incluyen aquellas asociadas con VEG F, CD20, CD1 1 a, CD40, Apo-2 y H ER2. También se proporciona un artículo de manufactura que incluye al menos una de las composiciones o formulaciones antes mencionadas y un envase. La invención proporciona métodos, composiciones y formulaciones útiles entre otras cosas, para concentrar, purificar, almacenar y entregar anticuerpos o fragmentos de estos. Breve descripción de los dibujos La Figura 1 es una gráfica que muestra la solubilidad del anti- VEGF en diversas concentraciones de ZnCI2 y NaOAc con pH de 5.7 a temperatu ra ambiente. La gráfica muestra la concentración de anti-VEG F soluble, g raficada como una función de la concentración de ZnCI2 y las concentraciones de NaOAc. Las diferentes concentraciones de NaOAc se muestran como sigue: x 1 0 mM de NaOAc; ? 25 mM NaOAc (línea blanca) ; * 50 mM de NaOAc; u 75 mM de NaOAc; * 1 00 m M de NaOAc. La Figura 2a es una imagen aumentada 200x de cristales anti-VEGF formados en la presencia de 5 mM de ZnCI2 y 1 00 mM de NaOAc con u n pH de 5.7, bajo luz no-birrefringente. La Figura 2b es una imagen aumentada 200x de cristales anti-VEGF formados en la presencia de 5 m M de ZnCI2 y 1 00 mM de NaOAc con u n pH de 5.7, bajo luz birrefringente. La Figura 2c es una imagen aumentada 200x de cristales anti-VEGF formados en la presencia de 25 mM de ZnCI2 y 1 0 mM de NaOAc con un pH de 5.7, bajo luz no-birrefringente. La Figura 2d es una ¡magen aumentada 200x de cristales antí-VEGF formados en la presencia de 25 mM de ZnCI2 y 10 mM de NaOAc con u n pH de 5.7, bajo luz birrefringente. La Figura 2e es una imagen aumentada 200x de cristales anti- VEGF formados en una solución de 1 0 mM de ZnCI2 y 1 00 mM de NaOAc con un pH de 5.7, bajo luz no-birrefringente. La Figura 2f es una ¡magen aumentada 200x de cristales anti-VEGF formados en una solución de 1 0 M de ZnCl2 y 100 mM de NaOAc con u n pH de 5.7, bajo luz birrefringente.

La Figura 3 muestra el mapa de fase de la condición estática generada graficando la concentración de ZnCI2 contra la concentración de NaOAc. Los siguientes símbolos identifican a * cristales libres; m transiciones de fase; ? cristales de gel (triángulos blancos). La figura 4 muestra el mapa de fase de condiciones de mezclado contra condiciones estáticas . Los símbolos representan lo siguiente: 0 mezclado libre; * mezclado de gel ; — — mezclado de transición; ~ m— estática de transición ; p estática libre; y * estática de gel. La Figura 5 muestra un SDS-PAGE de cristales de anti-VEGF q ue fueron aislados, lavados y re-sol ubilizados. La banda 1 es el marcador de peso molecular; La band a 2 es 5 µg de anti-VEG F; la banda 3 está vacío; la banda 4 es el supernadante; la banda 5 es el licor madre del lavado 1 ; la banda 6 es el licor madre del lavado 2; la banda 7 es el licor madre del lavado 3; la banda 8 está vacío; la banda 9 es 1 mL de cristal (disuelto en agua) ; la banda 10 es 5 mL de cristal (disuelto en agua); la banda 1 1 es 1 0 mL de cristal (disuelto en agua) ; la banda 12 es 1 5 mL de cristal (disuelto en agua) ; la banda 1 3 es 20 mL de cristal (d isuelto en agua). La Figura 6 muestra adiciones de precipitantes para las condiciones de cristalización de anti-VEGF de 1 0 mM de ZnCI2 y 1 0 mM de NaOAc con pH de 5.7. La cantidad de anti-VEGF soluble se gráfico contra el porcentaje de precipitante añadido. La Figura 7 muestra el análisis de espectrometría de masa de la solución inicial de anti-VEGF (D), soluciones de cristal anti-VEGF (A, C) y solución de lavado de cristales (B). La cadena ligera reducida de anti-VEGF tiene una masa de aproximadamente 23,449 D. Descripción detallada de las modalidades preferidas Descripción detallada Definiciones Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan indistintamente en el sentido más amplio, e incluyen anticuerpos mo'noclonales (anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos madurados por afinidad, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, humanizados, anticuerpos multivalentes y anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos bi-específicos siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada) así como fragmentos que ligan antígenos (por ejemplo, Fab, F(ab')2, scFv y Fv) , siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada. Un anticuerpo de longitud completa contiene cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos cadenas ligeras (L) idénticas interconectadas mediante enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada está formada de un dominio de región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1 , CH2 Y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de un dominio de región variable de cadena ligera (VL) y u n dominio de región constante de cadena ligera . La región constante de cadena ligera esta compuesta por un dominio C . Los dominios VH y VL pueden a su vez subdivid irse en regiones complementarias (CDR2) o aros h íper-variables (HVL) , entremezclados con reg iones que son más conservadas, conocidas como regiones de marco (FR) . Cada VH y VL típicamente está compuesta de tres CDR y cuatro FR, colocados desde el término amino hasta el término carboxilo en el siguiente orden : FR1 , CDR1 , FR2 , CDR2, FR3, CDR3 , FR4. Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas , los anticuerpos (¡nmunoglobulinas) se pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmu noglobulinas: IgA, Ig D , Ig E, IgG e Ig M , y muchas de estas pueden a su vez ser divididas en subclases (¡sotipos) , por ejemplo, lgG-1 , lgG-2, lgA-1 , lgA-2, etc. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de sub-unidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmu noglobulinas son bien conocidas y se describen de forma general , por ejemplo, en Abbas et al. , Cellular and Mol. Immunology, 4a ed. (2000). U n anticuerpo puede ser parte de una molécula grande de fusión , formada por asociación covalente o no-covalente del anticuerpo con uno o más proteínas o péptidos adicionales. Las cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de los dos tipos claramente distinguidos, llamados kappa (K) y lambda (?) , en base a las secuencias de aminoácido de sus dominios constantes. El término "anticuerpo de longitud completa" se refiere a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, incluyendo al menos 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras, y no fragmentos de anticuerpo como se define abajo. El término se refiere particularmente a un anticuerpo con cadenas pesadas que contiene una región Fc. Un anticuerpo de longitud completa puede ser un anticuerpo de secuencia nativa o un anticuerpo de recombinación. Un anticuerpo de longitud completa puede ser humano, humanizado y/o madurado por afinidad. El término "anticuerpo monoclonal", como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son esencialmente idénticos, con la excepción de variantes que pueden surgir durante la producción del anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales aquí incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa con las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular, o que pertenezcan a una clase o sub-clase de anticuerpo particular, mientras que las cadenas restantes son idénticas u homologas con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenezcan a otra clase o sub-ciase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada (patente estadounidense número 4 ,81 6,567 y Morrison et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :6851 -6855 (1 984)) . Las formas "humanizadas" de anticuerpos no-humanos (por ejemplo, murinas) son anticuerpos q uiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de u na inmunoglobulina no-humana. En su mayoría , los anticuerpos h umanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) a las cuales los residuos de un CDR o un lazo hipervariable (HVL) del receptor son reemplazados por los residuos de un CDR o HVL de una especie no humana (anticuerpo donador) como puede ser un ratón, rata, conejo o un primate no humano que tenga la especificidad , afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de marco (FR) de la inmunoglobu lina humana son reemplazados por residuos no-h umanos correspondientes para mejorar la afinidad de enlazamiento de antígenos. Más au n , los anticuerpos humanizados pueden contener residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones pueden hacerse para mejorar la afinidad o la actividad funcional del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado contend rá sustancialmente todos, o al menos u no y típicamente dos de los dominios variables, en los cuales todas, o sustancialmente todas las regiones hipar-variables corresponden a las de la inmunoglobulina no-humana, y todas o sustancialmente todas las FR son las correspondientes a una secuencia de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanizados también pueden producirse como fragmentos de enlace de antígeno, como se describe aquí. El anticuerpo humanizado opcionalmente puede también contener al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente de, o dividida de inmunoglobulina humana. Para detalles posteriores, ver Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann et al. , Nature 32:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Ver también los siguientes artículos de revisión y referencias citadas ahí: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 : 105-1 15 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech 5:428-433 (1994). Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácido que corresponde a la de un procedimiento de anticuerpo producida por un humano y/o ha sido hecha utilizando cualquiera de las técnicas para hacer anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que contiene residuos de enlace de un antígeno no-humano. Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más regiones híper-variables que resultan de una mejora en la afinidad del anticuerpo para antígeno, en comparación con un anticuerpo originario, que no posee dichas alteraciones. Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendrán afinidades nano-molares o hasta pico-molares para el antígeno objetivo. Los anticuerpos madurados por afinidad son producidos mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) describen la maduración por afinidad por mezclado de dominio de VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos de marco es descrita por: Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Scier et al., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. immunol 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. immunol. 154(7):3310-9 (1995) y Hawkins et al., J. Mol. Biol.226:889-896 (1992). Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden solamente una parte de un anticuerpo intacto, generalmente incluyendo un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo intacto, y por lo tanto mantienen la capacidad de enlazase al antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo abarcados por la definición presente incluyen: (i) el fragmento de Fab, que tiene dominios VL, CL, VH y CH1 con un enlace disulfuro inter-cadena entre las cadenas pesada y ligera; (ii) el fragmento de Fab', el cual es un fragmento de Fab que tiene uno o más residuos de cisteína en la terminación C del dominio CH1; (iii) el fragmento de Fd que tiene dominios VH y CH1; (iv) el fragmento de Fd que tiene dominios VH y CH1 y uno o más residuos de cisteina en la terminación C del dominio CH1; (v) el fragmento de Fv que tiene los dominios de VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (vi) el fragmento dAb que consiste de un dominio VH; (vii) anticuerpos sin bisagra que incluyen al menos dominios VL, VH, CL, CH1 y carecen de una región de bisagra; (viii) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente incluyendo dos fragmentos de Fab' enlazados por un puente de disulfuro en la región de bisagra; (ix) moléculas de anticuerpo de una sola cadena (por ejemplo, cadena sencilla Fv; scFv); (x) "dia-cuerpos" con dos sitios de enlazamiento de antígenos, que contienen un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos; (xi) "anticuerpos lineales" que contienen un par de segmentos Fd en tándem (VH-Ch1 -VH-CH 1 ), los cuales, junto con lo polipéptidos complementarios de cadena ligera forman un par de regiones enlazantes de antígenos. Como se utiliza aquí, "cristal" se refiere a una forma de un estado sólido de materia en el cual los átomos están acomodados en un patrón que se repite periódicamente en tres dimensiones, típicamente, formando una estructura reticular. Como se utiliza aquí, "gel" se refiere a una forma concentrada de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es una solución visco-elástica que es más sólida que una solución coloidal líquida. Opcionalmente, los geles pueden contener cristales. Los geles que se forman utilizando métodos de la invención, generalmente contienen una alta concentración de anticuerpo o fragmentos de este, y pueden, opcionalmente, contener cristales. Como se utiliza aquí, "Precipitante" se refiere a un agente que causa que un compuesto o molécula se vuelve insoluble. En algunos casos, el compuesto o molécula forma un cristal. Los precipitantes que pueden ser utilizados para formar cristales de compuestos o moléculas son, típicamente, sales, polímeros o moléculas orgánicas. Los precipitantes orgánicos incluyen isopropanol, etanol, hexanediol y 2-metil-2,4-pentanodiol (MPD). Los precipitantes poliméricos incluyen polietilenglicol y poliaminas tales como Jeffamine®. Las sales utilizadas incluyen sulfato de amonio, citrato de amonio, acetato de sodio, cloruro de amonio, cloruro de sodio y formato de magnesio, típicamente en concentraciones de 0.2 M o mayores. Un "trastorno" o "condición" es cualquier condición que se beneficiaría de un tratamiento con un anticuerpo. Esto incluye los trastornos crónicos o agudos, o enfermedades que incluyen las condiciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no-limitantes de trastornos a tratarse aquí, incluyen tumores malignos y benignos, tumores malignos no leucémicos o linfáticos, neuronal, glial, astrocital y otros trastornos glandulares, macrofagales, epiteliales, estromales y blastocoélicos; e inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos. Como se utiliza aquí, "tratamiento" se refiere a la intervención clínica en intento para alterar el curso natural del individuo o célula a tratar. Los efectos deseables del tratamiento incluyen el alivio de síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevenir metástasis, disminuir la tasa de avance de la enfermedad , alivio o paliación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. Modalidades para llevar a cabo la invención Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo se han vuelto muy útiles, especialmente de forma terapéutica. Muchos anticuerpos se están investigando actualmente para su uso terapéutico. El uso terapéutico con frecuencia requiere producción de gran escala de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. Un aspecto de la invención incluye un método para concentrar, purificar y almacenar anticuerpos o fragmentos de estos, especialmente los producidos en gran escala. Los métodos de la invención proporcionan cristales, geles y geles con cristales. Los cristales y/o geles de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos son útiles, por ejemplo, para la caracterización de estructura tridimensional difracción de rayos X, para almacenamiento, para concentración, para purificación y para el suministro de un anticuerpo o fragmento de este. Muchas proteínas, debido a su tamaño y sus configuraciones tridimensionales, pueden ser difíciles de cristalizar. Típicamente, muchas combinaciones de precipitantes, reguladores de pH y el pH mismo pueden ser monitoreados con la finalidad de identificar la combinación de condiciones que se proporcionan para cristalización. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos han resultado especialmente difíciles de cristalizar debido a su tamaño y al hecho de que la región de bisagra hace a la molécula más flexible y menos rígida. Adicionalmente, los anticuerpos o fragmentos de estos pueden ser glicosilados dependiendo de ia fuente del anticuerpo. En algunas modalidades, un método comprende poner en contacto a un anticuerpo o fragmento de este con una solución que contiene, que consiste esencialmente en, o que consiste en una sal o un catión divalente. En algunas modalidades, la presencia de una sal de catión divalente se encuentra a baja concentración, por ejemplo, aproximadamente de 1 a 500 mM. Una solución también puede contener, consistir esencialmente de, o consistir en un regulador de pH , como puede ser el acetato de sodio. En algunas modalidades, el regulador de pH tiene una fortaleza iónica baja, por ejemplo, aproximadamente de 1 a 100 mM . Los ejemplos de cationes divalentes incluyen, pero no se limitan a zinc, magnesio y calcio. Aunque no se pretende limitar a la invención en ninguna forma, la sal del catión divalente actúa como un precipitante y contribuye a la formación de cristales proteínicos. En algunos casos, la solución no incluye otros precipitantes, como pueden ser los precipitantes orgánicos o poliméricos. En algunas modalidades, un método comprende poner en contacto a un anticuerpo o fragmento de este con una solución que contiene, que consiste esencialmente en, o que consiste en una sal de zinc. En algunas modalidades, la presencia de la sal de zinc se encuentra en baja concentración, por ejemplo, a aproximadamente de 1 a 120 mM, preferiblemente de 10 a 80 mM y más preferiblemente de 25 a 60 mM. En algunas modalidades, la sal de zinc es ZnCI2. Una solución puede contener, consistir esencialmente de, o consistir de un regulador de pH, como puede ser el acetato de sodio. En algunas modalidades, el regulador de pH tiene una baja fortaleza iónica, como por ejemplo, aproximadamente de 1 a 100 mM, preferiblemente de 1 a 20 m M y más preferiblemente de 25 a 75 mM. En algunas modalidades, la solución contiene aproximadamente 100 mM de ZnCI2 y aproximadamente 1 0 mM de NaOAc. En algunos casos, la solución no incluye otros precipitantes, como pueden ser los precipitantes orgánicos o poliméricos. Los métodos proporcionan la formación de cristales y/o geles proteínicos. Opcionalmente, los geles de proteína pueden contener cristales. En algunas modalidades, la solución contiene aproximadamente más de 1 0 mM ZnCI2 y aproximadamente más de 5 mM de NaOAc. En otras modalidades , la solución contiene 1 00 mM de ZnCI2 y 1 0 mM de NaOAc. En alg unas modalidades, un método comprende poner en contacto a un anticuerpo o fragmento de este con una solución que contiene, q ue consiste esencialmente en, o q ue consiste en una sal de magnesio. En algunas modalidades se utiliza cloruro de magnesio (MgCI2) en bajas concentraciones, por ejemplo, aproximadamente de 1 a 500 mM , más preferiblemente aproximadamente de 200 a 500 mM y mucho más preferiblemente de 1 a 1 00 m M . Una solución puede contener, consistir esencialmente de, o consistir de un reg ulador de pH , como puede ser el acetato de sodio o tris. En algunas modalidades, el reg ulador de pH tiene una fortaleza iónica baja, por ejemplo, aproximadamente de 1 a 1 00 mM . En algunos casos, la solución no incluye otros precipitantes, como pueden ser los precipitantes orgánicos o poliméricos. En algu nos casos, el pH de la solución es alto, por ejemplo desde aproximadamente 7.5 hasta aproximadamente 9. Los métodos proporcionan la formación de cristales y/o geles proteínicos. Opcionalmente, los geles proteínicos pueden contener cristales. En algunas modalidades, la sal de zinc se encuentra en baja concentración , como por ejemplo, aproximadamente de 1 a 120 mM . Una solución puede contener, consistir esencialmente en , o consistir en un regulador de pH, como el acetato de sodio. En algunas modalidades, el regulador de pH posee baja resistencia iónica, como por ejemplo, aproximadamente de 1 a 100 mM. En algunos casos, la solución no incluye a otros precipitantes, como pueden ser los precipitantes orgánicos o poliméricos. Los métodos de la invención proporcionan una forma de bajo costo para cristalizar, concentrar o purificar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. En algunos casos, los métodos de la invención proporcionan métodos que no incluyen el uso de otros precipitantes, como pueden ser los precipitantes orgánicos o poliméricos, que pueden resultar indeseables en el producto. Los cristales y/o geles proteínicos de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden combinarse con portadores u otros ingredientes para almacenamiento y/o para administración. Anticuerpos o fragmentos de ellos Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se utilizan en los métodos de la invención. Los anticuerpos incluyen , sin limitación, anticuerpos policlonales, monoclonales, anticuerpos madurados por afinidad, anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos h umanizados, anticuerpos h umanos, anticuerpos q uiméricos y anticuerpos específicos. En algunos casos, los anticuerpos se producen como anticuerpos de longitud completa. Los anticuerpos de cadena completa típicamente contienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Existen 5 clases principales de inmu nog lobulinas y estas incluyen IgA, IgD , IgE, IgG e Ig M . M uchas de estas pueden a su vez ser divididas en subclases como por ejemplo, lgG 1 , lgG2, lgG3, IgG4, lg M 1 , lgM2, lgA1 o IgA2. Los anticuerpos de una o más de estas clases se pueden utilizar en los métodos de la invención. En algun as modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo IgG . Los fragmentos de anticuerpos también pueden utilizarse en los métodos de la invención . Los fragmentos de anticuerpos contienen fragmentos de enlace de antígeno e incluyen a Fab, Fab' , Fab2, Fab'2, Fd, Fv de cadena ú nica, scFv2, dAb, anticuerpos sin bisag ra, dia-cuerpos y anticuerpos lineales. Dependiendo de la fuente del anticuerpo o fragmento de anticuerpo, los anticuerpos pueden ser glicosilados. Típicamente, los anticuerpos recombinados obtenidos o producidos en células de mam íferos o insectos son glicosilados. Los anticuerpos o fragmentos de estos, obtenidos o producidos en células procarióticas carecen de g licosación o son aglicosilados. La glicolisación de anticuerpos también puede modificarse o eliminarse mediante secuencias de mutación en el sitio de glicosilación . Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos son específicos para un antígeno. Los anticuerpos útiles en los métodos de la invención incluyen anticuerpos para antígenos que incluyen moléculas como la renina; una hormona del crecimiento, incluyendo la hormona humana de crecimiento y la hormona bovina de crecimiento; factor de liberación de la hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante de la tiroides; lipoproteínas; alfa-l-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimulante de folículo; calcitocina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación como el factor VI I IC, el factor IX, el factor de tejido (TP) y el factor de von Willebrands; factores anti-coagulantes como la Proteína C; factor natriurético atrial; tensoactivo pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como uroquinasa u activador de plasminógeno de orina humana o de tipo tejido (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hepático; factores alfa y beta de necrosis tumoral; encefalinasa; RANTES (regulado en activación, normalmente expresado en célula T y secretado); proteína inflamatoria de macrófago humano (M IP-1 -aIfa); una albúmina de suero tal como albúmina de suero humano; la sustancia inhibidora Mulleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorelaxina; péptido de ratón asociado con gonadotropina; una proteína microbiana, como puede ser la beta-lactamasa; DNasa; un antígeno citotóxico asociado con T-Iinfocita (CTLA), como el CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico como puede ser el factor neurotrófico de origen óseo (BDNE); neurotrofina-3, -A, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso como el NGF-ß; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblasto, como puede ser el FGF y el bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGE); factor de crecimiento transformante (TGF), tal como TGP-alfa y TGP-beta, incluyendo TGF-ß1 , TGF-ß2, TGF-ß3, TGF-ß4 o TGF-ß5; factor de crecimiento I y l l similar a insulina (IGF-I e IGF-II); des(1 -3)-IG F-l (ÍGF-I cerebral), proteínas fijadoras de factor de crecimiento similar a insulina; proteínas CD, tales como CD3, CD4, CD8, CD1 9, CD20 y CD40; eritropoyetina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas, una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón, tal como interferón-alfa, -beta y gama; factores estimulantes de colonia (CSF), como por ejemplo el M-CSF, GM-CSF y el G-CSF; interieucinas (IL), por ejemplo IL-1 hasta I L-10; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de membrana superficial; factor acelerador de desintegración; un antígeno viral, tal como por ejemplo, una porción de la envoltura del SIDA; proteínas de transporte; receptores de ubicación; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas tales como CD1 1 a, CD1 1 b, CD1 1 c, CD18, ICAM , VLA-4 y VCAM ; un antígeno asociado a tumor tal como receptor HER2, HER3 ó HER4; y fragmentos de cualquiera de los péptidos mencionados con anterioridad. Los antígenos preferidos para los anticuerpos que comprende la presente invención incluyen a las proteínas CD, tales como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD40, CD34 y CD46; los miembros de la familia de receptores ErbB, tales como el receptor EGF, el receptor HER2, HER3 o HER4; las moléculas de adhesión celular tales como LFA-1 , Macl , p150.95, VLA-4, 1CAM-1 , integrina a4/ß7, e integrina av/ß3, incluyendo cualquiera de las subunidades o ß de ella (por ejemplo, anticuerpos anti-CD1 1 a, anti-CD18 o anti-CD1 1 b); factores de crecimiento como el VEGF; factor de tejido como (TF); TG F-ß interferón alfa ( -I FN); una interleucina, tal como IL-8; antígenos de grupo sanguíneo; receptor de muerte Apo-2; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor mpl; CTLA-4; proteína C; etc. Los objetivos preferidos aquí son el VEGF, TF, CD19, CD40, TGF-ß, CD1 1 a, CD18, el receptor de muerte Apo-2 y C24. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de estos contienen anti-VEGF, anti-Apo-2, anti-lgE, anti-HER2, anti-CD1 1 a o anti-CD20. Un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo se puede obtener a partir de una fuente natural, puede preparase sintéticamente o mediante métodos de recombinación. Los métodos para producir anticuerpos son conocidos para los expertos en la materia, e incluyen producir el anticuerpo o fragmento de anticuerpo mediante manifestación de fagos. Los métodos de producción a gran escala son conocidos, e incluyen la producción de anticuerpos o fragmentos de estos en cantidades de 10 litros o mayores. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se purifican mediante métodos conocidos para los expertos en la materia. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento producido es pu rificado para obtener preparaciones que son sustancialmente homogéneas para análisis y usos posteriores. Se pueden emplear los métodos de purificación proteínica estánda r conocidos en la técnica. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o intercambio iónico, precipitación de etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice o en una resina de intercambio de catión tal como DEAE, enfoque cromatog ráfico, SDS-PAGE, precipitación de sulfato de amonio, y filtración con gel, utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75. Por ejemplo, como primer paso de purificación , el anticuerpo o fragmento de este, derivado del cultivo celular se aplica a la proteína A en fase sólida inmovilizada, para permitir la fijación específica del anticuerpo a la proteína A. Luego se lava la fase sólida para retirar los contaminantes que se han fijado de forma no específica a la fase sólida. Finalmente el anticuerpo se recupera de la fase sólida mediante elusión . En algunas modalidades de la invención, la concentración del anticuerpo en la solución va de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 g/L. En otras modalidades de la invención, la concentración del anticuerpo va aproximadamente de 20 a 1 00 g/L. Aun en otras modalidades de la invención , la concentración del anticuerpo va aproximadamente de 40 a 90 g/L. Métodos Los métodos de la invención involucran métodos para cristalizar o concentrar un anticuerpo o u n fragmento de anticuerpo a partir de una solución . Los cristales o geles proteínicos son útiles, por ejemplo, para caracterizar la estructura, para almacenar, concentrar, pu rificar y suministrar, el anticuerpo o un fragmento de este. En algunas modalidades, la concentración del anticuerpo es de al menos 1 gm/L, y más preferiblemente de al menos 40 a 90 gm/L. Los métodos de la invención proporcionan u n método de bajo costo para producir cristales de anticuerpo o fragmentos de este. En un aspecto de la invención, u n método comprende poner en contacto a un anticuerpo o fragmento de este con una solución que contiene, q ue consiste esencialmente en , o que consiste en una sal o un catión divalente e incubar al anticuerpo o frag mento de esta y la solución, hasta que se forman los cristales del anticuerpo o parte de este. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto a un anticuerpo o fragmento de este con una solución que contiene, que consiste esencialmente en , o que consiste en una sal de zinc a una concentración aproximadamente de 1 a 1 20 mM , más preferiblemente de 1 0 a 80 mM y mucho más preferiblemente de 25 a 60 mM de sal de zinc. Las sales de zinc incluyen cloruro de zinc, fosfato de zinc, citrato de zinc, acetato de zinc o sulfato de zinc. En alg unas modalidades, la solución contiene, consiste esencialmente de, o consiste aproximadamente de 1 a 1 00 mM de ZnCI2. En modalidades específicas, la solución contiene más de 10 mM de ZnCI2 y más de 5 mM de NaOAc, y preferiblemente aproximadamente 1 00 mM de ZnCI2 y aproximadamente 1 0 mM de NaOAc. En algunas modalidades, el método proporciona un gel proteínico que puede, opcionalmente, contener cristales. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto un anticuerpo de anti-VEGF o un fragmento de este con una solución que contiene, consiste esencialmente en, o consiste en una sal de magnesio a una concentración desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 mM, más preferiblemente desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 500 mM y mucho más preferiblemente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 mM de sales de magnesio. Las sales de magnesio son aquellas que son solubles y pueden desasociarse en el solvente. Las sales de magnesio incluyen al cloruro de magnesio, fosfato de magnesio, citrato de magnesio, acetato de magnesio y sulfato de magnesio. En algunas modalidades, la solución contiene, consiste esencialmente en, o consiste en, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mM de cloruro de magnesio. En algunas modalidades, la solución tiene un pH alto, por ejemplo un pH desde aproximadamente 7.5 hasta aproximadamente 9. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto un anti-VEGF o un fragmento de este con una solución que contiene, consiste esencialmente en, o consiste en, una sal de calcio en una concentración desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 mM, más preferiblemente desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 500 mM y mucho más preferiblemente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 mM de sales de calcio. Las sales de calcio son aquellas que son solubles y pueden desasociarse en el solvente. Las sales de calcio incluyen cloruro de calcio, fosfato de calcio, citrato de calcio, acetato de calcio y sulfato de calcio. En algunas modalidades, la solución contiene, consiste esencialmente en, o consiste en desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mM de cloruro de calcio. En algunas modalidades, la solución tiene un pH alto, por ejemplo un pH desde aproximadamente 7.5 hasta aproximadamente 9. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto a un anticuerpo o un fragmento de este con una solución que contiene, consiste esencialmente en , o consiste en, sal de zinc, pero carece de otros precipitantes. En algunos casos, puede resultar deseable reducir al mínimo el uso de otros precipitantes, tales como moléculas orgánicas que incluyen 2-metil-2,4-pentanodiol, isopropanol o compuestos poliméricos, incluyendo polietilenglicoles o poliaminas. Estas modalidades pueden ofrecer una ventaja sobre la técnica anterior de métodos de cristalización, debido a que no se utilizan otros precipitantes. Una ventaja posible es que al no utilizar otros precipitantes orgánicos o poliméricos, resulta más económico, es decir, en una operación de gran escala, por ejemplo, el costo de los precipitantes orgánicos podría ser considerable, por lo que un método que no los utilice sería más económicamente eficiente. Otra ventaja posible para no utilizar precipitantes orgánicos sería que no existiría ningún residuo del precipitante orgánico en los cristales finales. Esto podría resultar una ventaja debido al deseo de utilizar anticuerpos de cristalización para formular soluciones que se administran a mamíferos. Algu nos de los precipitantes orgánicos que son utilizados que pueden no resultar deseables para administrarse a mamíferos, como los seres humanos. Los métodos de la invención también incluyen una solución que contiene, consiste esencialmente en, o consiste en una sal de un catión divalente y un regulador de pH . Los reguladores de pH que pueden utilizarse en la invención incluyen cualquier comúnmente utilizado por los expertos en la materia. Los ejemplos de estos incluyen, pero no se limitan a ácido acético, carbonato de amonio, fosfato de amonio, ácido bórico, ácido cítrico, HEPES (ácido 4-(2-hidroxietíl)-1 -piperazinetano-sulfónico), bicina, MES, cacodilato de sodio, imidazol, cloruro de amonio, formato de magnesio, ácido láctico, ácido fosfórico, citrato de potasio, metafosfato de potasio, fosfato monobásico de potasio, acetato de sodio, citrato de sodio, lactato de sodio, fosfato dibásico de sodio, fosfato monobásico de sodio y Tris (tris hidroximetilamino-etano). En algunas modalidades de la invención, el acetato de sodio (NaOAc) se utiliza como regulador de pH. En algunas modalidades, la concentración del regulador de pH en la solución puede ir desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mM . En otra modalidad de la invención, la concentración del regulador de pH en la solución puede variar desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 1 00 mM , más preferiblemente desde 1 hasta 20 mM , y mucho más preferiblemente desde 25 hasta 75 mM . En alg unas modalidades, el regulador de pH se combina con la sal de un catión divalente y el a nticuerpo o fragmento de este como un sólido. En otra modalidad de la invención , el reg ulador de pH se combina con una sal de catión divalente y el anticuerpo como una solución. En otra modalidad de la invención , un reg ulador de pH sólido y una sal divalente sólida se pueden poner dentro de la solución y luego combinarse con el anticuerpo, ya sea en una solución o en forma sólida. Típicamente, el pH de la solución depende, al menos en parte, del regulador de pH específico utilizado. En una modalidad , el pH deseado de la solución depende al menos en parte de la sal de catión divalente y la solubilidad de la sal a diferentes pH . En algunas modalidades, el pH del regulador puede ir aproximadamente de 4.5 a aproximadamente 9. En modalidades donde el catión divalente es Zn, el pH de la solución es aproximadamente de entre 4 y 6. En otras modalidades de la invención donde el catión divalente es Zn , la concentración del acetato de sodio en la solución es aproximadamente entre 1 y 100 mM , y el pH de la solución es aproximadamente entre 4.7 y 5.7. En otras modalidades, el catión divalente es Mg , el reg ulador de pH es Tris y el pH de la solución es aproximadamente de 7.5 a 9. En una modalidad , el pH de la solución , el reg ulador de pH utilizado y la sal divalente utilizada pueden depender al menos en parte de que un anticuerpo sea cristalizado. En algunas modalidades de la invención puede existir una interacción entre estos factores debido a que el anticuerpo puede ser estable dentro de un rango específico de pH , el cual dictaría, al menos en una parte, el regulador de pH a utilizarse, y de forma similar puede dictar al menos en parte la sal divalente a utilizarse (debido a cuestiones de solubilidad , por ejemplo). U n experto en la materia puede determinar la concentración de regulador de pH y la concentración de sal de catión divalente, llevando a cabo una curva de solubilidad e identificando los rangos de concentración o el reg u lador, sal divalente y pH , que dan como resultado u n cambio de fase. En algun as modalidades, los anticuerpos o fragmentos de estos se cristalizan con al menos 25 M de sal de zinc y al menos 50 mM de regulador de pH , tal como acetato de sodio. En otras modalidades es preferible una combinación aproximadamente de 1 0 a 80 mM de sal de zinc y aproximadamente de 25 a 75 mM de regulador de pH , como puede ser el acetato de sodio. Los métodos de la invención comprenden poner en contacto una solución y el anticuerpo, o un fragmento de este. En alg unas modalidades el anticuerpo o fragmento de este se pone en contacto con la solución en un método de difusión de vapor. En la difusión de vapor, un pequeño volumen (es decir, alg unos milímetros) de solución de anticuerpo o un fragmento de este se mezcla con la solución. Se suspende la mezcla encima de un receptáculo que contiene una pequeña cantidad de solución. En otras modalidades, el método de poner en contacto involucra una diálisis. La diálisis involucra una membrana de exclusión de tamaño semi-permeable que retiene al anticuerpo o fragmento de este, pero permite a las pequeñas moléculas, como pueden ser las de los reguladores de pH y precipitantes, difundirse adentro y afuera. Los precipitantes se difunden lentamente a través de la membrana y esto reduce la solubilidad del anticuerpo o fragmento de este. Otra modalidad es un método tipo lote. En el método de lote, la solución se añade a la solución del anticuerpo o fragmento de este. Los métodos de la invención comprenden incubar al anticuerpo o fragmento de este con una solución hasta que se formen los cristales o geles proteínicos. En algunas modalidades, la solución se puede mezclar suavemente una o dos veces al día durante la incubación. En otras modalidades, la solución se puede mezclar continuamente. Si se desean cristales grandes, se debe minimizar el mezclado. La incubación se puede llevar a cabo en un rango de temperatura desde aproximadamente 0 ° C hasta aproximadamente 27° C, más preferiblemente desde aproximadamente 2 hasta 25° C.

En algunas modalidades, la temperatura se mantiene a temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente a 25° C). En otros casos, la incubación se lleva a cabo desde aproximadamente 2 hasta 8° C. Una solución y anticuerpo, o un fragmento de este, se incuban hasta que se forman cristales o geles proteínicos. Típicamente, el tiempo de incubación es aproxi madamente desde 1 hora hasta 30 días, más preferiblemente de 1 a 5 días. Se pueden formar cristales como sólidos libres o en un gel. En algunas modalidades de la invención , los cristales de anticuerpos o fragmentos de estos son parte de un gel. Generalmente, los geles formados en métodos de la invención tienen una alta concentración de anticuerpos o fragmentos de estos. En una modalidad, un gel que se forma utilizando un método de la invención tiene una concentración aproximadamente de 200 a 250 mg de anticuerpo por mL. Com posiciones o form ulaciones Los métodos de la invención involucran la formación de cristales o geles proteínicos de anticuerpos o fragmentos de estos. Los cristales tienen una estructura regular tridimensional, típicamente conocida como estructu ra reticular. Esto es en contraste con u n sólido amorfo que es u n sólido no cristalino que no tiene estructu ra reticular molecular regu lar y que tiene una estructura heterogénea o no molecular. U n gel es una solución proteínica concentrada que puede ser suave y viscosa o dura y quebradiza. Los cristales descritos en los métodos descritos aquí pueden tener una variedad de formas, incluyendo forma de aguja, figuras cónicas, esféricas y como flor. El tamaño de los cristales puede estar en el orden de mm o µm. En algunas modalidades, los cristales son de al menos 1 0 µm de tamaño, de modo que sean visibles para el ojo comú n . Para su administración terapéutica el tamaño de los cristales variará dependiendo de la ruta de administración, por ejemplo, para administración subcutánea, el tamaño de los cristales puede ser un poco mayor que para administración intravenosa. En algunos casos, puede resultar deseable verificar que los cristales son cristales de anticuerpo, o fragmentos de anticuerpo. Los cristales de anticuerpo o fragmentos de estos pueden analizarse microscópicamente bajo luz birrefringente. Los cristales permitirán que la luz birrefringente pase a través de ellos, mientras los materiales no cristalinos no. En aun otro método, los cristales pueden aislarse, lavarse, resolubílízarse y correr en gel SDS-PAGE y opcionalmente, mancharse con un anticuerpo de receptor de anti-Fc. Opcionalmente, el anticuerpo resolubilizado, o un fragmento de este también puede ser analizado en enlazamiento con su antígeno específico utilizando análisis estándar. El anticuerpo resolubilizado o un fragmento de este también se puede analizar mediante espectrometría de masa. En algunos casos, los cristales pueden ser reticulados uno con otro. Dicha reticulación puede aumentar la estabilidad del cristal. Los métodos para reticular los cristales son conocidos para los expertos en la materia y han sido descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense número 5,849,296. Los cristales pueden ser reticulados utilizando un re-agente bifuncional como puede ser el glutaraldehido. Una vez reticulados, los cristales pueden ser liofilizados y almacenados para su uso, por ejemplo, en aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas. En algunos casos, puede resultar deseable secar los cristales o geles proteínicos. Los cristales o geles proteínicos pueden secarse con N2 y/o gases inertes, secado mediante horno de vacío, iiofilización, evaporación, secado en charola, secado en lecho fluido, secado por rociado, secado al vacío o secado con rodillos. Los cristales pueden mantenerse en la solución, o se pueden lavar y combinar con otros portadores y/o ingredientes para formar composiciones y/o formulaciones de los cristales. Las composiciones y formulaciones pueden utilizarse, por ejemplo, en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas. Otro aspecto de la invención involucra a composiciones y/o formulaciones de cristales o geles proteínicos del anticuerpo o un fragmento de este. Una composición contiene un cristal o gel proteínico de un anticuerpo, o un fragmento de este, además de un portador. Una formulación contiene un cristal o gel proteínico de un anticuerpo o un fragmento de este, y al menos un ingrediente. En algunas modalidades, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en anti-VEGF, anti-Apo-2, anti-CD20, anti-CD1 1 a, anti-HER2, anti-lgE y fragmentos de estos. Las formulaciones o composiciones del cristal o gel proteínico del anticuerpo o fragmento enlazante de antígeno se preparan para almacenamiento mezclando a dicho anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Science 16 ed , Osol , A. Ed . (1 980)) , en forma de soluciones acuosas, lioilizados u otras formulaciones secas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no-tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen reguladores de pH como fosfato, citrato, hístid ina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (como el cloruro octadecildimetiibencílico de amonio; cloru ro de hexametonio; cloru ro de benzalconio; cloruro de benzetonio; alcohol fenílico, butílico o bencílico; parabenos de alquilo como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menor que aproximadamente 1 0 residuos); proteínas como suero de albúmina, gelatina o ¡nmu noglobulinas; polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; aminoácidos como la glicina, g lutamina, asparagina, histidina , arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, dextrinas; azúcares tales como sacarosa, manitol, trealosa o sorbitol; y/o agentes tensoactivos no-iónicos tales como TWEEN ™ , PLURON I CS™ o polietilenglicol (PEG). En alg u nas modalidades, los cristales o geles proteínicos pueden combinarse con un portador polimérico para proporcionar estabilidad y liberación sostenida. Dichos polímeros incluyen polímeros biocompaíibles o biodegradables. Un portador polimérico puede ser de un solo tipo de pol ímero o puede estar compuesto por una mezcla de tipos de pol ímeros. Los ejemplos no limitantes de portadores poliméricos incluyen , por ejemplo, po!i(ácido acrílico), poli(cianoacrilatos), poli(aminoácidos), poli(anhídridos), poli(depsipéptidos), poli(ésteres), tales como poli(ácido láctico) o PLA, poli(ácido láctico-co-glicólico) o PLGA, poli (ß-hidroxibutriato), poli(caprolactona) y poli(dioxanona); poli(etilenglicol), poli(hidroxipropil)metacriIamida, poli[(organo)fosfaceno], poli (orto esteres), alcohol polivinílico, poli(vinilpirrolidona), copolímeros de anhídrido maleico y éter alquilvinílico, polioles plurónicos, albúmina, polipéptidos naturales y sintéticos, alginato, celulosa y derivados de esta, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glicaminoglícanos, polisacáridos sulfatados, almidones modificados como el almidón de amilosa, almidón de amilopectina, almidón hidroxietílico, almidón de metacrilato y otros almidones, y cualquier material convencional que encapsule los cristales de proteína. Las formulaciones de cristales de anticuerpos, o fragmentos de estos, incluyen al menos un ingrediente o excipiente. Los ingredientes o excipientes son conocidos por los expertos en la materia e incluyen agentes acidificantes, propulsores de aerosol, desnaturalizantes de alcohol, agentes alcalizantes, agentes anti-compactantes, agentes antiespumantes, conservadores microbianos, anti-oxidantes, agentes reguladores de pH, lubricantes, colores, disecantes, agentes emulsificantes, facilitadores de filtración, sabores y perfumes, humectantes, ungüentos, plastificadores, solventes (por ejemplo, aceites y orgánicos), absorbentes, absorbentes de dióxido de carbono, agentes rigidizantes, bases de supositorio, agentes suspensores o de aumento de viscosidad, agentes edulcorantes, diluyentes de tableta o cápsula, desintegradores de tabletas, lubricantes de tableta o cápsula, agente de tonicidad, vehículos saborizado o endulzados, vehículos oleaginosos, vehículos portadores sólidos, agentes repelentes de agua y agentes humectantes o solubilizantes. En algunas modalidades, el ingrediente mejora la estabilidad en almacenamiento. En otras modalidades, el ingrediente o excipiente es preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en albúmina, sucrosa, trealosa, lactitol, gelatina e hidroxipropil-ß-ciclodextrina. Las composiciones o formulaciones descritas aquí también contienen una cantidad efectiva de anticuerpo cristalino o un fragmento de este. Las dosis se pueden determinar fácilmente utilizando metodología estándar. El anticuerpo es adecuadamente administrado al paciente una sola vez o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente de 1 µg/kg a aproximadamente 50 mg/kg (por ejemplo, de 0.1 a 20 mg/kg) de anticuerpo es una dosis candidata inicial para administrarse al paciente, por ejemplo, ya sea mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosis típica diaria o semanal puede ir aproximadamente de 1 µg/kg a aproximadamente 20 mg/kg o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se repite que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regimenes de dosis pueden resultar útiles. En algunos casos, las composiciones o formulaciones contienen una concentración de anticuerpo, o un fragmento de este, al menos aproximadamente de 1 g/L o más cuando son resolubilizadas. En otras modalidades, la concentración del anticuerpo es de al menos aproximadamente 1 g/L a 100 g/L cuando se le resolubiliza. Los cristales y/o geles proteínicos de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, o formulaciones o composiciones que contienen dichos cristales o geles proteínicos, pueden administrarse solos, como parte de un fármaco, preparación de cuidado personal o veterinaria o como parte de una preparación profiláctica, con o sin adyuvante. Se pueden administrar por ruta parenteral, oral o tópica. Por ejemplo, se pueden administrar por ruta oral, pulmonar, nasal, aural, anal, termal, ocular, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, mucosal, sublingual, subcutánea, transdermal, tópica o intracraneal, o dentro de la cavidad bucal. Ya sea en aplicaciones farmacéutica, de cuidado personal o veterinaria, los cristales de anticuerpos, o fragmentos de estos, o las formulaciones de cristales o composiciones de estos pueden administrarse de forma tópica a una superficie epitelial. Dichas superficies epiteliales incluyen superficies oral, ocular, aural, anal y nasal, las cuales pueden ser tratadas, protegidas, reparadas o desintoxicadas mediante la aplicación de cristales de un anticuerpo o un fragmento de este, o formulaciones o composiciones de cristal. Otro aspecío de la invención incluye arlículos de manufactura. Los artículos de manufactura contienen una composición o formulación que contiene a su vez un cristal o gel proteínico de un anticuerpo o fragmento de este y un envase. Los anticuerpos o fragmentos de estos son preferiblemente aníi-VEGF, aníi-CD20, anti-Apo-2, anti-CD11 a, anti-HER2, anti-lgE y fragmentos de esíos. Opcionalmente, el artículo de manufacíura puede incluir insírucciones para la administración a un ser humano para uso terapéuíico. Los aríículos de manufactura también pueden contener una composición o formulación de un crisfal o gel proíeínico de un anficuerpo, o un fragmenío de un anficuerpo, y una variedad de re-ageníes de diagnósíico para deíecíar al aníicuerpo enlazaníe, o fragmeníos de esíe, con su aníígeno específico. Los ageníes para deíecfar el enlazamienío del aníicuerpo con su anfígeno específico incluyen aníicuerpos para el aníicuerpo, que esfán marcados con un ageníe deíecíable. El ageníe defecíable puede incluir una porción fluoresceníe, una porción radioacíiva y una porción enzimáíica. En algunas modalidades, un aríículo de manufacíura contiene una composición o una formulación de un cristal o gel profeínico de un aníicuerpo o un fragmenío de esíe, y un envase. El artículo de manufactura además puede contener instrucciones para adminisírar la composición o formulación a un ser humano. En oirás modalidades, el aríículo de manufacíura además contiene un ageníe para detecfar al aníicuerpo enlazaníe, o fragmeníos de esíe, con su aníígeno específico. Usos de las composiciones o formulaciones Las composiciones o formulaciones de la invención que coníienen crisíales o gel proíeínico de un aníicuerpo o fragmeníos de esíe, pueden ufilizarse para cualquier propósifo para el cual se ufilicen las preparaciones de anficuerpos convencionales. Por ejemplo, se pueden uíilizar las composiciones o formulaciones para purificación, conceníración, imagen, diagnósíico y/o aplicaciones íerapéuíicas. En algunas modalidades, los geles profeínicos o los crisíales que se encueníran présenles en los geles pueden uíilizarse para adminisíración fópica, como una solución a paríir de la cual se lleva a cabo más crislalización o purificación, o como una solución para almacenar los crisíales. En algunas modalidades, las composiciones o formulaciones conííenen un anticuerpo o un fragmento de este, de anti-VEGF en cristal, cristalino o en gel proteínico. Estas composiciones o formulaciones son útiles para métodos de diagnóstico y métodos de traíamienío de írasíornos o condiciones asociadas con VEGF, y se han descrifo análisis de diagnósíico, por ejemplo, en WO 98/45331 . Los aníicuerpos de aníi-VEGF son útiles en el traíamienío de diversas enfermedades y írasíornos neoplásíicos y no-neoplásíicos. Los neoplasmas y condiciones relacionadas que son susceptibles a trafamienío incluyen carcinomas mamarios, carcinomas pulmonares, carcinomas gástricos, carcinomas esofágicos, carcinomas coló- rectales, carcinomas hepáticos, carcinomas ováricos, fecomas, arrenoblasíomas, carcinomas cervicales, carcinomas endomeíriales, hiperplasia endometrial, endomeíriosis, fibrosarcomas, coriocarcinomas , cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo, carcinomas laríngeos, hepaíoblasfoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas cuíáneos, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblasíoma , carcinomas pancreáíicos, relinoblasíoma, asírociíoma, gioblasíoma, Schwannoma, oligodendroglioma, medu loblasíoma, neuroblasíomas, rabdomiosarcoma, sarcoma osfeogén ico, leiomiosarcomas, carcinomas del íracto u rinario, carcinomas de la tiroides, íumor de Wilm, carcinoma de célula renal , carcinoma prosíáíico, proliferación vascular anormal asociada con facomafosis, edema (como puede ser el asociado con fumores cerebrales) y el síndrome de Meig. Las condiciones no-neoplásíicas que son suscepfibles a írafamienío incluyen aríriíis reumaíoide, soriasis, aríeriosclerosis, rinopafía diabética y otras rinopatías proliferatívas incluyendo la rinopatía de pre-madu rez, fibroplasias refroleníales, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad , hiperplasias íiroidales(incIuyendo la enfermedad de Grave) , íransplanle de córnea y oíros íejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, sínd rome nefrííico, pre-eclampsia, asciíis, derrame pericárdico (como la asociada con pericardiíis) y derrame pleu ral. La degeneración macular relacionada con ía edad (AMD) es una de las principales causas de pérdida grave de la visión en la población de edad avanzada. El exudado de un AMD se caracíeriza por la neovascularización coroidal y el desprendimienfo de células epiíeliales de pigmenío reíiniano. Dado que la neovascularización coroidal se asocia con un pronóstico de marcado empeoramiento, se espera que los anticuerpos de VEGF de la presente invención resulten especialmente útiles para reducir la gravedad de la AMD. En algunas modalidades, las composiciones o formulaciones de la invención confienen un crisíal, crisíalino o un gel profeínico de aníi-CD1 1 a. Esías composiciones o formulaciones son úfiles en méíodos de diagnóstico y métodos de tratamiento de trastornos o condiciones asociadas con CD1 1 a. Los trasíornos y condiciones asociados con CD1 1 a y los análisis de diagnósíico se describen en la paíeníe esíadounidense número 6,037,454, la cual se incorpora aquí medianíe referencia. El aníicuerpo de anfi-CD1 1 a (la sub-unidad a de LFA-1 ) puede uíilizarse para írafar diversos frasíornos mediados por LFA-1 . El aníígeno 1 asociado con la función de linfocifo (LFA-1 ; CD1 1 a/CD18) está involucrado en la adhesión de leucocitos durante las interacciones celulares esenciales para la respuesía inmunológica y la inflamación. El lérmino "írasíorno mediado por LFA-1 " se refiere a un esíado paíológico ocasionado por íníeracciones de adherencia celular que involucran al recepfor de LFA-1 en linfociíos. Los ejemplos de dichos írasíornos incluyen respuesías inflamaíorias de células T como pueden ser las enfermedades inflamaíorias cuíáneas que incluyen a la soriasis, respuestas asociadas con enfermedad inflamatoria inteslinal (como la enfermedad de Crohn y la coliíis ulcerosa); el síndrome de estrés respiraíorio adulfo; dermaíiíis; meningifis; encefalifis; uveiíis; condiciones alérgicas como el eczema, y el asma; condiciones que involucran infilíración de células T y respuesías inflamaíorias crónicas; reacciones de hipersensibilidad cuíánea (incluyendo la hiedra venenosa y el roble venenoso); aríeroesclerosis; deficiencia de adhesión de leucociíos; enfermedades auíoinmunes como la aríriíis reumafoide, lupus eritematoso sisíémico (SLE), diabefes mellifus, esclerosis múltiple, síndrome de Reynaud, tiroiditis autoinmuniíaria, encefalomieliíis experimenfal auíoinmuniíaria, síndrome de Sjorgen, diabetes juvenil y respuestas inmunitarias asociadas con la hipersensibilidad retardada mediada por ciíocinas y linfociíos T que se encuentran típicameníe en la fuberculosis, sarcoidosis, polimíositis, granulomatosis y vasculifis; anemia perniciosa; enfermedad obsfrucíiva pulmonar crónica (COPD); bronquiíis; insuliniíis; rinitis; urticaria; glomerulonefriíis; enfermedades que involucran diapédesis de leucociíos; írasíorno de CNS inflamaíorio; síndrome de lesión de órganos múlíiples poslerior a sepíicemia o írauma; anemia hemolífica aufoinmune; síndrome nefróíico; íumores malignos (por ejemplo, íumores malignos de célula B como la leucemia linfocííica crónica o leucemia de células pilosas); iodo íipo de íransplaníes, incluyendo enfermedades injerío coníra huésped o huésped coníra injerío; HIV e infección por rinovirus; fibrosis pulmonar; invasión de células de íumor en órganos secundarios, etc. En algunas modalidades, las composiciones o formulaciones de la invención contienen un crisíal, crisíalino o gel proíeínico de aníi-HER2. Esías composiciones o formulaciones son útiles en métodos de diagnóstico y métodos de tratamiento de trasíornos o condiciones asociadas con HER2. Los írastornos y condiciones asociados con HER2 y los análisis de diagnóslico se describen en la palente estadounidense número 6,387,371 , la cual se incorpora aquí mediante referencia. La administración a un paciente de una cantidad terapéuíicamente efectiva de anticuerpos de receptor aníi-HER2 inhiben el crecimiento de células de tumor mediante la inhibición de la función del receptor HER2. El Trastuzumab (Genetech, Inc.) es un aníicuerpo recombinanle, humanizado monoclonal dirigido al dominio extracelular HER2 para el traíamienío del cáncer amplificado en el gen HER2 sobreexpresado/gen HER2, parficularmente el cáncer de mama metasíáíico (MBC). El gen de HER2 íambién se puede amplificar en el adenocarcinoma de la glándula salival, adenocarcinoma renal, carcinoma de glándula mamaria y línea celular de cáncer gásírico. El anticuerpo también se puede adminisírar a pacieníes en combinación con oirás terapias, como por ejemplo, el paclitaxel o Tarceva ®. En algunas modalidades, las composiciones o formulaciones de la invención coníienen un crisíal, crisíalino o gel proíeínico de anli-CD20. Esías composiciones o formulaciones son úíiles en méíodos de diagnóstico y métodos de Irafamienlo de írasíornos o condiciones asociadas con CD20. Los írastornos y condiciones asociados con CD20 y los análisis de diagnósíico se describen en las patentes estadounidenses números 6,387,371 y 5,736,137, las cuales se incorporan aquí mediante referencia. El CD20, también conocido como Bp35) es un antígeno de interés para atacar enfermedades relacionadas con neoplasmas de célula B, debido a su expresión a niveles muy altos. El CD20 es un marcador celular humano que se expresa durante el desarrollo temprano previo a la célula B y permanece hasta la diferenciación de célula de plasma. La molécula de CD20 puede regular un paso en el proceso de activación que se requiere para la iniciación y diferenciación del ciclo celular. Por esto, el antígeno superficial CD20 puede aíacarse para íratar el linfoma de célula B. El C2B8 es un anticuerpo quimérico de anti-CD20, específico e inmunológicameníe acíivo. La iníervención terapéutica con anticuerpo C2B8 expulsa o elimina las células B en la sangre periférica y en el lejido linfáíico como medio para reíirar los linfomas de célula B, dado que los sisíemas de mamíferos rápida y eficieníemente recuperan células B de sangre periférica. Cuando el sistema inmune tiene una deficiencia de células B en la sangre periférica, no existe la necesidad de precauciones "extraordinarias" (es decir, aislamienío del paciente, etc) dado que la principal respuesta inmunitara de los primates es regulada por las células T. El C2B8 también se marcar con etiquetas radioactivas para desíruir células de lumor objelivo. En algunas modalidades, las composiciones o formulaciones de la invención coníienen un crisíal, crisíalino o gel proteínico de anticuerpo anti-Apo-2. Estas composiciones o formulaciones son útiles en el traíamiento de íraslornos tales como el cáncer. El uso terapéuíico del aníicuerpo aníi-Apo-2 se describe en la paíeníe esíadounidense número 6,252,050, la cual se incorpora aquí mediante referencia. De acuerdo con esto, la invención proporciona métodos para tratar cáncer utilizando aníicuerpos, íales como los aníicuerpos de recepíor de Apo-2L de reacción cruzada. Los anlicuerpos agonísticos Apo-2, por ejemplo, pueden utilizarse para activar o estimular la apoptosis en la células cancerígenas. Por supuesto se contempla que los méíodos de la invención puedan ulilizarse en combinación con aun otras técnicas terapéuticas, como la cirugía. En algunas modalidades, las composiciones o formulaciones de la invención contienen un crisíal, crisíalino o gel proleínico de anticuerpo anti-lgE. (Estas composiciones o formulaciones son útiles en el tratamienío de írastornos mediados por IgE, como por ejemplo los traslornos alérgicos o las inflamaciones. El uso terapéutico del anticuerpo anti-lgE se describe en las paíeníes esladounidenses números 6,329,509 y 5,994,51 1 , las cuales se incorporan aquí medianíe referencia. Los anlicuerpos y anticuerpos etiquetados se pueden utilizar en una variedad de procedimieníos de inmuno-imagen o inmuno-análisis para detectar la presencia de cáncer en un paciente, o monitorear el estalus de dicho cáncer en un paciente que ya ha sido diagnosticado con este. Cuando se le utiliza para moniíorear el esíado del cáncer, se puede uíilizar un procedimienío de análisis inmune cuaníitativo. Si dichos análisis de monitoreo se llevan a cabo periódicamente y se comparan los resultados, se puede tomar una delerminación tomando en cuenta si es que la carga del tumor del paciente ha aumentado o ha disminuido. Las íécnicas comunes de análisis que pueden utilizarse incluyen análisis directos e indirectos. Si la muestra incluye células cancerosas, el anticuerpo eíiquetado se enlazará a dichas células. Después de lavar el tejido o células, y retirar el anticuerpo etiquetado que no se enlazó, se lee la muestra de tejido para identificar la presencia de complejos inmunes etiquetados. En análisis directos la muestra de tejido o célula se incuba con anficuerpos monoclonales sin eíiqueía. Luego se íraía la mueslra con un anticuerpo etiquetado contra el aníicuerpo monoclonal (por ejemplo, aníicuerpo etiquetado antimurina), se lava y se lee para idenlificar la presencia de complejos ternarios. A pesar de las anteriores referencias a modalidades particulares, se entenderá que la presente invención no se limita. Se le ocurrirá a aquellos con conocimiento ordinario en la materia que diversas modificaciones pueden llevarse a cabo a las modalidades descritas sin cambiar el concepfo general de la invención. Todas esas modificaciones se pretende que se encuentren dentro del alcance de la invención. Todas las referencias ciíadas a lo largo de la especificación expresamente se incorporan aq uí mediante referencia. Eiem plo 1 Sol ubilidad de anticuerpo de anti-VEGF en diversas concentraciones de cloruro de zinc y acetato de sodio La cristalización de anticuerpos de longitud completa y/o glicosilados puede resultar difíci l . El tamaño, forma y presencia de porciones de azúcar contribuye a ia dificultad de obtener cristales de anticuerpo. Se pueden investigar muchas combinaciones diferentes de precipitantes orgánicos y no-orgánicos, reguladores de pH y cosolutos para enconírar las condiciones adecuadas para la cristalización de anticuerpos. Se investigó la solubilidad de un anticuerpo de VEG F glicosilado de longitud completa en soluciones de conceníraciones variables de ZnCI2 y NaOAc para determinar si es que se pod rían formar o n o los cristales de proteína del aníicuerpo bajo estas condiciones. Materiales v métodos Preparación y purificación de anticuerpo anti-VEGF El anticuerpo anti-VEG F (bevacizumab) se puede preparar generalmente como se describe en WO 98/45331 y Presta et al., Can. Res. , 57:4593-4599, cuyo coníenido se incorpora aq uí mediante referencia. El procedimiento además se describe de forma general abajo. Se clonó y secuenció un anlicuerpo murina específico para VEGF, designado A4.6.1 (Kunkel et al. , 1985, Proc. Nati. Acad. Sci.

USA, 82:488-492) . Se usó una secuencia de consenso sintéíico para dominios variables de de cadena ligera y pesada humana, con la finalidad de generar un modelo g ráfico computacional en el cual se pudieran importar los CDR de mu rina utilizando el programa I nsight™ (Accelrys, I nc. San Diego CA). También se generaron los modelos compuíacionales de las regiones VH y VL del aníicuerpo murina A4.5.1 para deferminar la confirmación de los CDR. Se consíruyeron plásmidos que codificaron todas las variantes humanizadas de F(ab) de de A4.6.1 a partir de la plantilla de plásmido para F(ab)-1 . El plásmido pEMX1 (Kunkel et al . , 1 985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA , 82:488-492) contiene un fragmento de ADN que codifica mediante consenso al V P humano de subgrupo I y al VH subg rupo l l l . El ant-VEGF h umanizado se consíruyó medianíe muíogénesis dirigida en el siíio de pEMX1 (Kunkel eí al. , 1 985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:488-492). Las secuencias de ácido nucleico que codifican a los anticuerpos anti-VEGF sé proporcionan en WO 98/45331 . Un ejemplo de un método para producir anti-VEGF se describe aquí. Para la expresión de variantes humanizadas estables de lgG 1 (rhu MAb VEG F) se transfecíaron células de ovario de hámsíer chino (CHO) con vectores dicistrónicos diseñados para co-expresar tanío las cadenas pesadas como las ligeras (Lucas et al. , 1 996 Nucleic Acid Res. , 24: 1 774-1 779). Se introdujeron plásmidos denfro de las células DP 12, un derivado propieíario de la línea celular CHO-K1 DUX B 1 1 desarrollada por L. Chasin (Columbia Universiíy, Nueva York, NY), mediante lipofectina, y se seleccionaron para crecimiento en un medio de glicina/hipoxanfina/limidina libre de (G HT) (Chisolm eí al. , 1996 DNA Cloning 4. Mammalian sysíems, pp.1 -41 , Oxford: Oxford Universiíy Press). Se eligieron de manera aleatoria 20 clones no amplificados y se resembraron en placas de receptáculo 96. La productividad específica relativa de cada colonia se vigiló usando ELISA para cuaníificar el IgG de longiíud complefa acumulado en cada receptáculo después de tres días. Se usó un tinte fluorescente, Calceina AM , como marcador susfiíuto de número de célula variable por receptáculo. En base a estos datos, se eligieron muchos clones no amplificados para su amplificación posterior en presencia de concentraciones en aumento de metotrexato. Los clones individuales que sobrevivieron a 10, 50 y 100 mM de metoírexato fueron elegidos y transferidos a placas de 96 receptáculos para determinar la productividad . Uno clon que mostró una alta productividad específica en reproducción se expandió en recipieníes T y se utilizó para inocular a un cultivo en centrifugadora. Después de muchos pases, las células adapíadas a la suspensión se usaron para inocular cultivos de producción en medio libre de suero con GHT suplementado con diversas hormonas e hidrolisados de proteína. El fluido de cultivo celular cosechado que contiene VEGF rhuMAb (anticuerpo monoclonal humanizado recombinante) se purificó utilizando la proteína A-Sepharose® CL-4B. La pureza después de este paso fue ~99% . La purificación subsigu iente para homogeneidad se llevó a cabo usando un paso de cromatografía de intercambio iónico que usa Q Sepharose® seguida de C M Sepharose®. El contenido de endotoxinas del anticuerpo pu rificado final fue <0.1 eu/mg . El anticuerpo pu rificado se concentró y se realizó otra purificación usando ultrafilíración y diafilíración . Los méíodos allernativos para purificación y/o concentración incluyen la filtración de flujo tangencial. Condiciones de cristalización El anti-VEG F preparado como se describió arriba se dializó en agua Milli-Q® y se concentró a 84.4 g/L. Se ajustó el pH de una solución base de 1 M de NaOAc a un pH de 5.7 con HCl 6 N . Los reg uladores de pH se prepararo n sig uiendo un esquema de dilución en serie y se ajusíó el pH a 5.7 con NaOH 1 N. Las conceníraciones de ZnCL2 fueron de 5 a 1 00 mM y la conceníración de NaOAc varió de 1 0 a 1 00 mM . El méíodo de crisíalización por diálisis utilizó una membrana de exclusión de tamaño semipermeable que retiene a la proteína pero permite que las moléculas peq ueñas (es decir, los reg uladores de pH y los precipitantes) se difundan libremente a través de la membrana. El método de diálisis incluyó usar un (1 ) L de la solución base de anti-VEG F inyectado dentro de u n cartucho de diálisis Slide-a-Lyzer® (Pierce, Rockford , I I) y se dializó dentro de cada solución base durante la noche a 5° C. Los reguladores de pH de la diálisis se cambiaron en un total de tres ocasiones durante un periodo de tres días. Los aparatos de diálisis se mezclaron continuameníe en cada solución base y el material resultante se recuperó después de tres días. El material se recuperó rebanando cuidadosamente la membrana del cariucho de diálisis y transfiriendo la solución de gel dentro de un tubo utilizando una espáíula estéril. Las curvas de solubilidad se generaron midiendo la concentración proteínica del material recuperado del cartucho de diálisis. La concentración proteínica se gráfico coníra la conceníración de ZnCI2. Resultados La curva de solubilidad de anli-VEGF en ZnCI2 y NaOAc, con un pH de 5.7 se muestra en la Figura 1. Al aumentarse la concentración de ZnCI2, se puede observar una disminución en la solubilidad del anti-VEGF. Durante la diálisis del aníi-VEGF en diversas concenfraciones de ZnCl2 se observó la formación de geles en los cartuchos de diálisis. Inicialmente el gel era nebuloso. El gel con cristales formado aníes de 25 minutos de diálisis, de reguladores de pH que contenían tan poco como 2 mM de ZnCI2 a temperatura ambiente y a 4° C. Los geles se analizaron posteriormente mediante microscopio, y se pudo observar material cristalino en ellos. Los crisíales dentro del gel eran muy pequeños y uniformes. Al observarlos bajo un microscopio, los cristales dentro del gel mostraron birrefringencia al observárseles bajo polarizadores cruzados, indicando que se trata de material cristalino. Muchas condiciones, incluyendo los precipitantes orgánicos e inorgánicos con una variedad de reguladores de pH y co-solutos, se investigaron con anterioridad para determinar su capacidad para cristalizar un anticuerpo glicosílado de longiíud completa. Muchas de las condiciones investigadas no dieron como resultado la formación de crisíales del aníicuerpo (no se muestran los datos). Fue deseable diseñar un proceso de cristalización que evife el uso de precipitantes orgánicos, especialmente para anticuerpos que se han de utilizar íerapéuticamente. N uestros esludios indicaron que una combinación de un catión divalente, como puede ser en la forma de una sal como ZnCI2 en un reg ulador de pH de NaOAc puede usarse para formar cristales de anticuerpos de longitud completa sin necesidad de un precipitante orgánico . La solubilidad del anticuerpo anti-VEG F concentraciones variantes de ZnCI2 en un regulador de pH de NaOAc permite determinar la concentración de ZnCI2 en NaOAc, en la cual el anti-VEGF se vuelve insoluble, dando como resultado la formación de crisíales. En conceníraciones bajas de ZnCI2, se observan cristales libres. Aumentar las concentraciones de ZnCI2 da como resultado la formación de un gel que contiene cristales. Los resultados del estudio de solubilidad determinaron el rango de concentración uíilizado para el análisis de crisíalización de lote en el siguiente ejemplo. Eiemplo 2 Cristalización de anti-VEGF con cloruro de zinc y acetato de sodio Como se describió en el ejemplo 1 , las soluciones de anti-VEGF dializadas con soluciones de concentraciones variantes de ZnCI2 y NaOAc se volvieron insolubles a ciertas conceníraciones y dieron como resullado la formación de cristales y/o geles. La cristalización de anti-VEGF con sol uciones de ZnCI2 y NaOAc sin precipitaníes orgánicos se analizó bajo condiciones fanto de diálisis como de lote. Los cristales obtenidos fueron después caracterizados. La cristalización bajo condiciones de lote es deseable debido a q ue dichas condiciones pueden ajustarse para una producción en g ran escala. Material y métodos Métodos de cristalización y análisis Se preparó anti-VEG F a partir de 36 g/L hasta 84.4 g/L mediante ultrafiltración centrífuga y se dializó en agua Milli-Q®. La concentración resultante de anti-VEG F fue de 84.4 g/L y se incubó con diversas conceníraciones de ZnCI2 y NaOAc, ya sea medianíe diálisis o en loíe. La concentración de anti-VEG F se determinó midiendo la absorbencia a 280 nm . Se prepararon además 4 soluciones base de cristalización de ZnCI2 y NaOAc, como sigue: 1 : 1 0 mM de ZnCI2 y 1 00 mM de NaOAc, pH de 5.7 2: 50 mM de ZnCI2 y 1 00 mM de NaOAc, pH de 5.7 3: 50 mM de ZnCI2 y 1 0 mM de NaOAc, pH de 5.7 4: 50 mM de ZnCI2 y pH ajusfado a 5.7, con hidróxido de sodio. Las combinaciones de conceníraciones de ZnCI2 y NaOAc se muestran en la Tabla 1 a. El método de diálisis se llevó a cabo utilizando un (1 ) mL de la solución base de anti-VEGF colocándola dentro de un cartucho de diálisis Slide-a-Lyzer® (Pierce, Rockford , II) y se dializó dentro de cada solución base. Los dispositivos de diálisis se mezclaron contin uamente en cada solución base y el material resultante se reti ró del dispositivo y se colocó en un tubo Eppendorf después de 5 d ías. El experimento también se llevó a cabo utilizando el método de "lotes". El método de lotes se inició añadiendo 0.75 mL de la solución base de anti-VEG F en una proporción de 1 : 1 (es decir, 0.75 m L) con cada una de las soluciones base de cristalización en tubos Eppendorf. Cada tubo fue volteado dos veces al día para proporcionar un mezclado con suavidad. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente y se voltearon dos veces al d ía d urante cinco d ías. Tabla l a Análisis microscópico de los cristales Después de recuperar el material, se analizaron los crisíales microscópicameníe en su morfolog ía, en la presencia o ausencia de luz birrefringeníe. El uso de luz birrefringeníe disting ue entre sólidos crisíalinos y precipiíados sólidos. El análisis se logró haciendo pasar luz eníre dos filtros polarizantes. . Se colocó un filtro debajo de la muestra y el otro filfro se colocó encima de la muesíra. Si la muestra no es cristalina , ambos filíros polarizaníes eviíarán que la luz alcance al observador. Si la muesfra es crisíalina, esta mezclará la luz, permitiéndole a esta pasar a través del segu ndo filíro y hacia el ojo del observador. Los crisíales se analizaron microscópicameníe colocando u na muesfra en una placa de vidrio y observando los crisfales a diversos aumeníos. Se uíilizaron otros métodos para probar al material sólido, incluyendo el manchado con íiníe Izií y los análisis de pulverización y rompimienío. El análisis de pulverización y rompimienfo no fue concluyeníe debido a que la mayoría del maferial crisíalino era demasiado pequeño para permifir la determinación de pulverización contra rompimiento . Los resultados del tiníe Izií íampoco fueron consisíeníes, debido a que se observaron muchos negaíivos y posiíivos falsos. Resultados Los resulíados se muesíran en las Tablas 1 b y 1 c. La Tabla 1 muesíra las observaciones visuales hechas en los días 1 , 2 y 5 de las mueslras bajo las condiciones diversas, como se presentan en la Tabla 1 a. Tabla 1 b La íabla 1 c muesfra las medidas analííicas que se llevaron a cabo en el maíerial recuperado de las muesíras bajo diversas condiciones, como se presenían en la íabla 1 a. Los sólidos formados mosíraron birrefringencia cuando se les observó bajo polarizantes cruzados, pero en la mayoría de los casos fueron muy pequeños para reconocerles una forma o morfología regular. Tabla 1 c Estos resulfados muesíran que el aníi-VEGF fue crisfalizado utilizando combinaciones de ZnCI2 y NaOAc, tanío en el méíodo de diálisis como en el méíodo de lofe. Toda condición analizada ocasionó que el aníi-VEGF cambiara su fase inmediafamenle después de poner en contacto la solución precipitante. Los sólidos que muestran birrefringencia se observaron en toda condición que contuviera ZnCI2 y NaOAc, indicando que los crisíales se formaron en cada una de esías condiciones. En algunos casos, se observaron los cristales dentro de una fase tipo gel de anfi-VEGF. En algunos casos, no fue posible aislar los crisíales del gel , de modo que no se pudo demostrar definitivamente q ue fueran cristales de anti-VEG F. Los cristales forman estrucfuras íipo cono o íipo flor. Esíe ejemplo mosfró q ue los cristales de anti-VEGF pueden producirse ya sea mediante método de diálisis o medianíe méíodo de lofe, uíilizando ZnCI2 y NaOAc, sin necesidad de uíilizar precipiíantes orgánicos. Las imágenes representativas bajo luz birrefringente y no-birrefringeníe se muesíran en las Figuras 2a-2f. La figura 2a es una imagen a ampliación de 200x de crisfales de aníi-VEG F formados en la presencia de 5 m M de ZnCI2 y 1 00 mM de NaOAc, pH de 5.7, bajo luz no birrefringente. La figu ra 2b es una imagen a ampliación de 200x de crisíales de anti-VEG F formados en la presencia de 5 mM de ZnCI2 y 100 mM de NaOAc, pH de 5.7, bajo luz birrefringente. La figura 2c es una imagen a ampl iación de 200x de cristales de anti-VEGF formados en la presencia de 25 mM de ZnCI2 y 1 0 mM de NaOAc, pH de 5.7, bajo luz no birrefringente. La figura 2d es una imagen a ampliación de 200x de cristales de anti-VEG F formados en la presencia de 25 mM de ZnCI2 y 1 0 mM de NaOAc, pH de 5.7, bajo luz birrefringente. La figura 2e es u na imagen a ampliación de 200x de cristales de anti-VEG F formados en la presencia de 1 0 mM de ZnCl2 y 1 00 m M de NaOAc, pH de 5.7, bajo luz no birrefringente. La figu ra 2f es u na imagen a ampliación de 200x de cristales de anti-VEGF formados en una solución de 1 0 mM de ZnCI2, 1 00 mM de NaOAc, pH de 5.7, bajo luz birrefringente.

Eiemplo 3 Condiciones de cristalización variantes Como se describió con anterioridad, se cristalizó él anticuerpo anti-VEGF en una variedad de concentraciones de ZnCI2 y NaOAc. Oirás condiciones de cristalización pueden afectar la habilidad para cristalizar el anti-VEGF o que resulten cristales de anti-VEGF. Se examinó el efecto de cambiar el pH, temperaíura y la identidad del catión divalente en la crisfalización del anfi-VEGF. Materiales y métodos La solución base de aníi-VEGF a 87 g/L en agua Milli-Q® se preparó medianíe ulfrafilíración y diafillración en una membrana de celulosa regenerada de 10 kD. Cada muesfra estaba compuesta por una razón de 1 : 1 de solución de proíeína a regulador de pH, dando como resulíado una conceníración final de anti-VEGF de 43.5 g/L. Las soluciones base de 1 M de ZnCI2, cloruro de calcio (CaCI2) y MgCI2 se prepararon disolviendo la cantidad apropiada de sólidos en agua Milli-Q y filírando las soluciones con un filtro de grado de esterilización. Las soluciones base de 1 mol de NaOAc, con un pH de 4.7, y NaOAc con un pH de 5.7 se prepararon añadiendo la caníidad apropiada de írihidraío aceíaío de sodio y ácido acéíico glacial a agua Milli-Q® y filfrando a íravés de un filtro de grado de esíerilización. Las condiciones de la solución se prepararon añadiendo la caníidad apropiada de agua, solución base iónica divaleníe, solución base de regulador de pH y solución base proíeínica. La solución base proíeínica siempre se añadió al final. Las combinaciones de conceníraciones de ZnCI2, MgCI2, CaCI2 y NaOAc se examinaron en dos pH y femperafuras difereníes. Las conceníraciones de ZnCI2 fueron de 5 a 1 00 mM y el NaOAc fue de 1 0 a 1 00 mM . La conceníración de MgCI2 fue de 5 a 1 00 mM en 1 0 mM de NaOAc. La conceníración de CaCl2 fue de 5 a 1 00 mM en 1 0 mM de NaOAc. La crisíalización usando el méíodo de loíe se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 2, excepío que cada loíe íen ía un volumen de m uesfra de 1 mL. Resultados Los resultados se muestran en la Tabla 2. Las combinaciones de ZnCI2 y NaOAc resultaron efectivas para formar cristales y/o geles con cristales de longifud completa de anti-VEGF. El material sólido resultó positivo como maíerial crisíalino, como se determinó mediante la refracción de la luz bírrefringente. La concentración de anti-VEG F en el supernadante se determinó midiendo las absorbencias a '280 nm. Tabla 2 Todas las combinaciones de ZnCl2/NaOAc produjeron crisíales de aníi-VEG F en gel, o libres en la solución . Las soluciones de cloru ro de magnesio y aceíaío de sodio no mosíraron ningún efecto en el anti-VEGF bajo estas cond iciones (no se muesíran los daíos) .

Una solución de cloruro de calcio y aceíato de sodio prod ujo cristales con aníi-VEGF cuando el CaCI2 fue de 1 00 mM y el NaOAc fue de 1 0 mM , con un pH de 4.7 y se incubó a 4° C (no se muesíran los daíos) .

El malerial crisíalino se aisló de la solución formada con 1 00 m M de ZnCI2 y 10 mM de NaOAc con un pH de 5.7, incubada a íemperafura ambieníe. Los cristales se lavaron tres veces con 20 mM de NaOAc y 20 mM de ZnCI2, con un pH de 5.7 y dichos cristales se disolvieron en ag ua. Diferentes cantidades de cristales resolubilizados en agua se hicieron pasar por SDS PAGE y se compararon con el ant-VEGF antes de la cristalización. Los lavados de los cristales también se probaron para determinar la presencia de anti-VEGF. Los resultados se muestran en la figura 5. Los resultados muestran que los lavados resultaron negaíivos en antí-VEGF, mienfras que los cristales resolubilizados si tenían antí-VEGF. En un aumenío en aníi-VEGF deíectado, se enocntraron cantidades aumentadas de los cristales. El anti-VEGF resolubilizado también fue analizado mediante espectroscopia de masa, y se le comparó con el anti-VEGF de conírol. El especíro de masa MALDI-TOFF de anficuerpos iníactos generalmente da un pico ancho a 150 kDa y no es fácil distinguir un anticuerpo de otro. Sin embargo, el especlro de masa de anlicuerpos reducidos muesíra una alia sensibilidad para la cadena ligera. Dado que la masa de la cadena ligera es única para cada producío de aníicuerpo, las muesíras se redujeron con TCEP y se analizaron en el modo lineal posiíivo. Para explicar las diferencias de conceníraciones, las dos primeras muesíras se diluyeron 50 veces y las siguientes dos se diluyeron solo 10 veces con una solución matriz de ácido sinapínico y se redujeron con TCEP a temperaíura ambieníe (2 horas). Las muesíras fueron colocadas en la placa, secadas al aire, lavadas con TFA frío al 0.1 % y se obtuvieron los espectros de masa. La masa molecular de la cadena ligera de aníi-VEGF es 23433 y el especíro de masa de MALDI-TOFF íípicamente exhibe una precisión de masa de +/- 0.05% en este rango de masa. El espectro de la solución base y del supernadaníe exhiben patrones similares, esto es, un pico fuerte de las cadenas ligeras protonadas individual y doblemente, y una cadena pesada con doble carga débil. (Figuras 7D, A y C). La solución de lavado (bajo las condiciones analizadas) no mostró la presencia de cadena ligera (Figura 7B), mientras la solución de cristal si mostró los picos de cadena ligera. El análisis de digesto Lys-C de los cristales mediante MALDI-TOFMS mostró muchos picos relacionados con aníi-VEGF (así como producios de auíodigesíión de Lys-C). Sin embargo, el digesto de la solución de primer lavado también mostró algunos de los picos relacionados con antí-VEGF. (No se muestran los datos). Generalmente se observa una mayor sensibilidad con los digestos mediante MALDI-TOFMS en comparación con la proteína intacta. En resumen , el anti-VEGF se puede apreciar claramente en los cristales, pero el primer lavado también puede contener una pequeña cantidad de anti-VEGF. Los resultados muestran que el anti-VEGF resolubilizado a partir de cristales tuvo el mismo perfil de espectroscopia de masa que el anti-VEGF de control. Eiemplo 4 Investigación de fases de gel-líquido de soluciones anti-VEGF Se han identificado dos fases en soluciones que coníienen crisíales de anti-VEGF. Estas incluyen crisíales libres en solución y geles que podrían coníener cristales. La concentración del supernadante de aníi-VEGF se relaciona direcíamente a la fase de crisíal preseníe. Cuando el gel esíá preseníe, las concenfraciones de aníi-VEG F soluble son íípicamente menores a aproximadameníe 1 0 g/L. Cuando el gel no se encueníra preseníe, las conceníraciones de aníi-VEG F soluble se elevan por encima de 40 g/L. Las condiciones del espacio de fase de cristalización del anti- VEGF se analizaron variando las conceníraciones de NaOAc y ZnCI2 a un pH de 5.7. Medianíe la exploración del espacio de fase puede ser posible identificar donde la sol ución hace la transición de un gel a u na fase l íquida. Esto puede ayudar a encontrar las condiciones de cristalización óptimas para mejorar la entrega de cristal. Materiales v métodos Se usó una solución base de anti-VEGF de 84.4 g/L en agua Milli-Q® con un 1 M de soluciones base de ZnCI2 y NaOAc, con u n pH de 5.7 como ingredientes para esfos experimeníos de lofe de 1 mL. Se crearon veiníidós (22) remesas, cada una de las cuales con una conceníración de anfi-VEG F de 42.2 g/L y conceníraciones de ZnCI2 y NaOAc que van de los 5 a los 1 00 mM , respecíivameníe (ver Tabla 3) . Las soluciones se realizaron en íubos de polipropileno q ue se almacenaron a íemperafura ambiente. Existieron dos juegos difereníes de 22 llevados a cabo, uno de los juegos no estaba mezclado, y el otro juego se volteó dos veces al día para proporcionar un mezclado suave. Los íubos fueron observados a lo largo de íres semanas. El porcenfaje de gel formado fue deíerminó de forma visual en el juego no-mezclado al principio y al final de las tres semanas. Después de 21 días los tubos se centrifugaron y la concentración anti-VEGF en el supernadante se analizó mediante A280. Resultados La Tabla 3 muestra los resu líados del conjunío de 22 muesíras no mezclado o esíálico. Tabla 3 En el juego de íu bos mezclados, el porcenfaje de gel no se pudo cuaníificar debido a que la fase de gel estaba distribuida a lo largo de los lados de los tubos. Sin embargo, una indicación visual del esíado de la solución , clara , gel, sólidos libres o gel + sólidos libres fue deíerminada al inicio y al final de los 21 días. Después de 21 días, los lubos fueron cenírifugados y se analizó la concenfración de anfi-VEG F en el supernadaníe medianíe A280. La tabla 4 muesíra los resulíados del conjunto de 22 muestras inclinadas dos veces al día (mezcladas). Tabla 4 Los crisíales se formaron en todos los tubos. Algunos de los crisfales fueron libres en la solución y oíros esfaban en gel. El mapa de fase de las muestras no mezcladas se generó graficando la conceníración de ZnCI2 coníra la concentración de NaOAc. Esta gráfica puede verse en la Figura 3. La Figura 4 compara los mapas de fase de los experimentos mezclado y no mezclado. Tomadas en conjunto, la Fig u ra 1 (del Ejemplo 1 ), 3 y 4 muesíran que conforme el sistema se acerca al punto de transición de fase, el anti-VEG F soluble se reduce a aproximadamente 1 0-22 g/L cuando el ZnCl2 se encuentra por encima de 40 mM y los tubos se están mezclando. Cuando los tubos están estáficos y las concentraciones de ZnCI2 son de 40 mM o menores, existe poca o nula disminución en las concentraciones de anti-VEGF soluble. Esto podría llevar a creer que el ZnCI2 es el factor dominante en la pérdida de anti-VEGF soluble . Cuando la concentración de ZnCI2 es menor a 1 0 mM o mayor a 80 mM , el efecto del NaOAc disminuye. Dado que las concentraciones de ZnCI2 se acercad a los puntos de transición (25-60 mM) , las conceníraciones de NaOAc parecen íener un efecto mayor en la concentración de anti-VEG F soluble. Eiemplo 5 Cristalización de otros anticuerpos Las condiciones de cristalización de la técnica anterior para anticuerpos de longitud completa íípicamente uíilizan un precipiíante orgánico, como puede ser el PEG , MPD o el propanol. Hemos descubierío (ver ejemplos previos) que los anticuerpos de longitud completa, como puede ser en anfi-VEG F se pueden crisíaíizar en ausencia de esíos precipiíantes orgánicos. Examinamos si es que oíros aníicuerpos de longiíud complefa pueden crisfalizarse con un catión divalente en la presencia de N aOAc (pH de 4.7; pH de 5.7), H EPES (pH 7.5) o Tris (pH 9.0). Materiales y métodos Los anticuerpos monoclonales que se probaron fueron : anti- H ER2, aníí-CD U a, aníi-CD20 (C2B8) y el aníi-VEG F (Genetech , South San Francisco, CA). La preparación y caracterización de un anticuerpo con estas especificidades han sido descritas en las Pateníes Estadou nidenses Número 5,736, 1 37; 6,387,371 ; 6,037,454; y en la WO 98/45331 . Los anticuerpos fueron pu rificados utilizando tres tipos de cromaíografía, seg uido de ultrafiltración y diafiltración similares a los pasos de pu rificación descritos en el Ejemplo 1 . Los anticuerpos monoclonales se dializaron en agua M illi-Q® para dar concentraciones resultaníes aproximadamenfe de entre 80 y 1 00 mg/mL. Los experimentos se llevaron a cabo en forma de lote, combinando 1 parte de solución de anticuerpo con 1 parte de cada solución apropiada. Los volúmenes de muestra finales fueron de 1 a 2 mL. Las muestras se almacenaron en tubos de polipropileno de 6 mL. Las sales divaleníes que se utilizaron fueron ZnCI2, CaCI2 y MgCI2. Los reg uladores de pH utilizado íuvieron concentraciones finales y pH respectivamente de: 1 0 mM de NaOAc, con pH de 4.7; 1 0 m M de NaOAc, con pH de 5.7; 1 0 mM de H EPES (ácido de 4-(2-hidroxieíilo)-1 -piperazineeíano-sulfóníco) , con pH de 7.5 y 1 0 mM de Tris (iris hidroximeíilamino-efano), con un pH de 9.0. Las muesíras que contenían la solución de reg ulador de pH Tris se almacenaron a temperaíura ambieníe, y las muesíras con las oirás soluciones de regulador de pH se almacenaron a 2-8° C. Las muestras se sometieron a inspección visual diariamente. Si no se observaba material sólido después de 3 días de almacenamienío, la íemperaíura de almacenamíenío era cambiada radicalmente: las muestras fueron transferidas a 2-8° C o temperafura ambiente, dependiendo de las condiciones iniciales de almacenamiento. Si no se observaba material sólido después de 3 días adicionales, las muesfras se almacenaban a 2-8° C y se vigilaban semanalmente. Las muestras con material sólido fueron sometidas a observación bajo polarizantes cruzados para determinar la birrefringencia. Resultados No se observaron cristales bajo las condiciones probadas para la molécula de anti-CD40 (no se muestran los datos). Los resulíados para la molécula de aníi-CD20 (C2B8) con ZnCI2 se muestran en la Tabla 5. Cualquiera sólido observado no fue cristalino, en base a la birrefringencia. Sin embargo, en algunos casos se formaron geles proteínicos. No se observaron cristales bajo las condiciones probadas para la molécu la de anfi-CD20 (C2B8) con CaCI2 y MgCI2 (no se muestran los datos) . N/A en la tabla indica que la absorbencia del supernadante a 280 nm no fue probada. Tabla 5 Los resulíados para la molécula de anti-HER2 con ZnCl2 se muesíran en la Tabla 6 abajo. Cualquier sólido formado bajo las condiciones mostradas abajo no fue cristalino, lo cual se determinó mediante birrefringencia. No se observaron cristales bajo las condiciones probadas para la molécula de anti-HER2 con CaCI2 o MgCI2 (los daíos no se muestran). Tabla 6 Los resultados para la molécula de anti-CD11a con ZnCI2 se muesíran en la Tabla 7, abajo. Cualquier sólido formado bajo las condiciones mostradas abajo resultó negativo en formación de cristales, como lo determinó la birrefringencia. No se observaron cristales bajo las condiciones probadas para la molécula anti-CD11a con CaCl2 y MgCI2 (no se muestran los datos).

Tabla 7 Los resultados para la molécula de anti-VEGF con ZnCI2 se muestran en la Tabla 8 y para MgCI2 en la Tabla 9, abajo. Se formaron cristales y geles bajo estas condiciones. No todos los precipifantes fueron posiíivos en material cristalino según la birrefringencia. No se observaron crisíales bajo las condiciones probadas para la molécula de anti-VEGF con CaCI2 (no se muesíran los daíos) . Tabla 8 Tabla 9 A partir de los resultados de arriba, parece que las combinaciones de concentraciones más alias de ZnCI2 y NaOAc y los pH de 4.7 y 5.7 inducen cambios en la fase de aníi-H ER2, anti-CD20 (C2B8) y anti-CD 1 1 a de anticuerpo soluble a geles de anticuerpo. Todas las combinaciones de ZnCI2/NaOAc prod ujeron cristales cuando se les añadió a anti-VEG F. Sólo se investigaron el MgCI2 y el CaCI2 a pH de 7.5 y 9.0 (los resultados para CaCI2 no se muestran). En base a los resu ltados de arriba, la cristalización de anti-VEGF se observó en 10 mM de Tris, 50 mM de MgCI2 con un pH de 9.0 a temperaíura ambieníe; y en 10 mM de Tris, 1 00 mM de MgCI2 con un pH de 9.0 íanto a temperatura ambiente como a 2-8° C. Eiemplo 6 Uso de precipitantes en condiciones de cristalización Examinamos si es que podíamos incorporar aditivos en las condiciones de cristalización de anti-VEGF. Las condiciones de crisíalización que se usaron fueron 1 0 mM de ZnCI2 y 1 0 mM de NaOAc, con un pH de 5.7. Con anterioridad se ha demostrado que la crisfalízacíón uíilizando 1 0 mM de ZnCI2 y 1 0 m M de NaOAc, con un pH de 5.7 produce cristales de anti-VEGF. En un intento por aumentar el resultante, se añadieron los tres precipitaníes orgánicos más efectivos (determinados mediante monitoreo) a los reguladores de de pH . Los precipitaníes q ue se probaron fueron (+/-)-2-metil-2,4-pentanodiol (M PD) adquirido en Hampíon Research, polietilenglicol (PEG) 3350 adquirido en Hampton Research y propano adquirido en Hampton Research .

Cada uno de los precipitanles se añadió a un tubo de polipropileno que contiene una solución de anti-VEG F (Genetech, Souíh San Francisco, CA) en agua Milli-Q® para obíener una conceníración resulíaníe de 42.4 g/L de aníi-VEG F, 1 0 mM de ZnCI2 y 1 0 mM de NaOAc, con un pH de 5.7, y los porceníajes de los precipiíaníes dados en la Tabla 1 0, abajo. Los íubos de polipropileno se colocaron a íemperaíura ambieníe y se volíearon dos veces al día para proporcionar un mezclado suave. Después de dos semanas se íomaron muesíras de floíanfe y la conceníración de aníi-VEG F se analizó medianfe A280. Resultados Los resultados se muestran en la Tabla 1 0. Tabla 1 0 Los crisíales se observaron visualmeníe en iodos los fubos de lofe. Las concenlraciones de floíaníe medidas fueron de eníre 41 y 53 g/L en iodos los lubos de polipropileno. La cristalización ocurrió, pero no pareció aumentarse por la adición de estos precipiíantes. La Figura 6 m uestra la concentración de flotaníe como una función de conceníración de precipiíaníe para los íres precipiíaníes diferentes. Se determinó que añadir M PD , PEG 3350 o propanol no parece mejorar significativamente el resultante utilizando 1 0 mM de ZnCI2 y 1 0 mM de NaOAc, con un pH de 5.7. Eiem plo 7 Cristalización de otros anticuerpos monoclonales Examinamos si es que las mezclas de ZnCI2 y NaOAc pueden utilizarse como condiciones genéricas de cristalización para los aníicuerpos monoclonales . Las condiciones de crisíalización que han sido ideníificadas aquí para aníi-VEGF no conlienen polieíilenglicol. Todas las demás condiciones reporíadas en la Iiíeratura ufíiizan polieíileng licol en su proceso de crisfalización . En experimeníos pasados otros anticuerpos han sido afectados por estas cond iciones mediante la formación de gel o la precipitación de la solución. En este experimento , las concentraciones más altas de ZnCI2 se estudiaron con la finalidad de estudiar el espacio de fase del anticuerpo e identificar las condiciones de cristalización. Materiales y métodos Los anticuerpos q ue fueron comparados son aníi-HER2, aníi- CD1 1 a, anti-2C4 (2H7) , anfi-CD20 (C2B8) y anti-VEGF. Todos los anticuerpos fueron diafiltrados en agua Milli-Q® y concentrados a -1 00 mg/mL. Los experimentos se llevaron a cabo en modalidad de lote, combinando 1 parte de solución de anticuerpo con 1 parte de solución . El volumen de muestra final fue aproximadamente de 3 a 5 mL, y las muestras se almacenaron en tubos de polipropileno de 6 mL sin ningún confrol proteínico. Las m uestras se almacenaron a temperatura ambiente y a aproximadamente 2-8° C. Las muestras se inspeccionaron diariamente. Si no se observaba cristal o precipitado después de 3 d ías de almacenamienío, se cambiaba la íemperatu ra radicalmente: las muestras fueron transferidas a 2-8° C o temperatura ambieníe, dependiendo de las condiciones iniciales de almacenamienío. Si no se observaba maíerial sólido después de 3 días adicionales, las muesíras se almacenaban a 2-8° C y se vigilaban semanalmeníe. Las soluciones íen ían conceníraciones variables de ZnCI2, CaCI2 y MgCI2, y fodas tenían 0.01 M de NaOAc y un pH de ya sea 4.7 ó 5.7. Resultados Los resultados de la molécula de anti-VEG F en ZnCI2 se muestran en la Tabla 1 1 . No se observaron crisíales uíilizando CaCl2 y MgCI2 bajo esías condiciones (no se muesíran los datos) . Tabla 1 1 Los resulíados para las moléculas de aníi-CD20 (C2B8) y anti- 2C4 no mosíraron formación de crisíales o geles bajo ninguna de las condiciones probadas (no se m uesíran los daíos).

Los resulíados para la molécula de anfi-CD20 (2H7) se muesíran en la Tabla 12 (ZnCI2) , Tabla 13 (CaCI2), Tabla 14 (MgCI2) , abajo. En muchos casos se formaron geles proteínicos. El material precipitado n o fue cristalino, lo cual se deíerminó medianfe birrefringencia. Tabla 1 2 Tabla 1 3 Tabla 14 Los resultados para la molécula de anti-HER2 se muesíran en la íabla 1 5 (ZnCI2) , abajo. No se observaron crisfales uíilizando MgCI2 o CaCI2 bajo esías condiciones (no se muestran los datos). Tabla 15 Los resultados para la molécula de aníi-CD11a se muesíran en la Tabla 16 (ZnCl2), abajo. No se observaron crislales utilizando MgCl2 o CaCl2 bajo estas condiciones (no se muestran los daíos). Tabla 16 Estos resultados muestran que diferentes anticuerpos pueden formar cristales o geles cuando entran en contacto con ZnCI2 y NaOAc.

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Un método para prod ucir cristales de un anticuerpo o u n fragmento de este, que comprende: a) poner en contacto un anticuerpo o fragmento de este con una solución que incluye aproximadamente entre 1 a 500 mM de una sal de un catión divalente y aproximadamente de 1 a 1 00 mM de regulador de pH; y b) incubar el anticuerpo o fragmento de este y la solución, hasla que se forman los cristales del anticuerpo o fragmento de este. 2. El método de la reivindicación 1 , caracterizado además porque la sal de un catión divalente es aproximadamente de 1 0 a 80 mM de ZnCI2. 3. El método de la reivindicación 2, caracferizado además porque la sal de un catión divalente es aproximadamente de 25 a 60 mM de ZnCI2. 4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracferizado además porque el regulador de pH contiene acetato de sodio (NaOAc) . 5. El método de la reivindicación 4, caracterizado además porque el regulador de pH coníiene aproximadameníe de 1 a 20 mM de NaOAc. 6. El méíodo de la reivindicación 5, caracferizado además porque el reg ulador de pH contiene aproximadamente de 25 a 75 mM de NaOAc. 7. El méíodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracferizado además porque la solución conliene más de aproximadameníe 10 mM de ZnCI2 y más de aproximadameníe 5 mM de NaOAc. 8. El méíodo de la reivindicación 7, caracíerizado además porque la solución coníiene aproximadameníe 100 mM de ZnCI2 y aproximadamente 10 mM de NaOAc. 9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es anti-VEGF, anti-CD20, aníi-CD1 1 a, aníi-H ER2, aníi-Apo-2, anti-lgE o un fragmento de ellos. 10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracíerizado además porque el contacto se da a temperatura ambiente. 1 1 . El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado además porque el regulador de pH tiene un pH de al menos 4.7. 12. El método de la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque el regulador de pH tiene un pH de aproximadamente 4.7 hasía 5.7. 13. El méíodo de la reivindicación 1 , caracíerizado además porque la sal del calión divalenfe es aproximadamente de 200 a 500 mM de MgCI2. 14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo madurado por afinidad, anticuerpo biespecífico, anticuerpo multiespecífico, aníicuerpo humano o anticuerpo humanizado. 15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el anticuerpo es un aníicuerpo aníi-VEGF de longitud completa. 16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado además porque el contacto se lleva a cabo a 2 - 8° C. 17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado además porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab', Fab2, Fab'2, Fd, Fd', scFv, scFv2, dAb, un anticuerpo sin bisagra, un anticuerpo lineal y un diacuerpo. 18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracíerizado porque el aníicuerpo es lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgM1, lgM2, IgA o lgA2. 19. Una composición que contiene un cristal de un anticuerpo anti-VEGF, anti-CD20, aníi-CD11a, aníi-HER2, anti-Apo-2, anti-lgE o un fragmento de esíos, además de un porlador. 20. La composición de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizada además porque el portador es un portador polimérico. 21. La composición de la reivindicación 19, caracterizada además porque el cristal es un cristal de un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de este. 22. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 , caracterizada además porque el portador es un portador polimérico. 23. Una composición que contiene un gel de un anticuerpo aníi-VEGF, aníí-CD20, aníi-CD1 1 a, anli-HER2, aníi-Apo-2 o anti-lgE, o un fragmento de estos, y un portador. 24. La composición de la reivindicación 22, caracterizada además porque el portador es un portador polimérico. 25. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, caracterizado porque el portador polimérico se selecciona de un grupo que consisíe en poli(ácido acrílico), poli(cianoacrilafos), poli(aminoácidos), poliaminas, poli(anhídridos), poli(depsipépfidos), poli(ésteres), poli(lácíico), poli(ácido lácíico-co-glicólico) o PLGA, poli (ß-hidroxibutriato), poli(caprolactona) y poli(dioxanona); pol i (eti len glicol), pol i ((hidroxipropil) metacrilamida, poli(organofosfazeno), poli (orto esteres), alcohol polivinílico, poli(vinilpirrolidona), anhídrido maléico, copolímeros de alquilo y éler vinílico, polioles plurónicos, albúmina, alginaío, celulosa y derivados de celulosa, colágeno, fibrina, gelaíina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glicosaminoglicanos, polisacáridos sulfatados, mezclas y copolímeros de ellos. 26. Una formulación que contiene un gel de un anticuerpo aníi-VEGF, aníi-CD20, aníi-CD1 1 a, aníi-HER2, aníi-Apo-2, aníi-lgE o un fragmenío de ellos, y al menos un ingredieníe. 27. La formulación de la reivindicación 26, caracterizada además porque el gel es un gel de un anticuerpo de aníi-VEGF o un fragmenío de él. 28. La formulación o composición de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27, caracterizada además porque la formulación o composición tiene una concentración de anticuerpo o fragmento de anticuerpo de 1 mg/mL o mayor. 29. La formulación o composición de la reivindicación 28, caracterizada además porque la formulación o composición tiene una concentración de aníicuerpo o de un fragmento de anticuerpo de 3 mg/mL o mayor. 30. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, caracterizada además porque dicho un ingrediente es albúmina. 31 . La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, caracíerizada además porque el ingredieníe se selecciona del grupo que consisle en sacarosa, írehalosa, lactitol, gelatina e hidroxipropil-B-cidodextrina. 32. Un cristal de un anticuerpo o fragmenío de este producido mediante el método de la reivindicación 1 . 33. Una composición o formulación de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31 , caracterizada además porque el cristal está reticulado. 34. Un método para traíar una condición asociada con VEGF en un mamífero, que comprende adminisírar a dicho mamífero una caníídad efecíiva de la composición o formulación de la reivindicación 21 . 35. Un méfodo para prod ucir crisíales de un anticuerpo o fragmento de este, que comprende: a) poner en contacfo un anticuerpo o fragmento de este con una solución que contiene aproximadamente 1 hasfa 120 mM de sal de zinc; y b) incubar el anticuerpo o fragmento de él y la solución, hasta que se forman los cristales del anticuerpo o fragmento de él. 36. Un método para prod ucir crisíales de un aníicuerpo o fragmenío de él, que comprende: a) poner en coníacto un anticuerpo o fragmento de este con una solución que consiste esencialmente en sal de zinc y un reg ulador de pH ; y b) incubar al aníicuerpo o fragmento de él y la solución , hasta que se forman los cristales del aníicuerpo o fragmento de él. 37. Un método para prod ucir cristales de un anticuerpo o fragmento de este, que comprende: a) poner en contacío un anficuerpo o fragmenío de esíe con u na solución que confiene una sal de zinc y carece de oíros precipiíaníes; y b) incubar al aníicuerpo o fragmento de él y la solución, hasta que se forman los cristales del anticuerpo o fragmento de él . 38. U n método para producir un gel proíeínico de un anticuerpo o fragmento de él, que comprende: a) poner en contacto un anticuerpo o fragmento de este con una solución que contiene aproximadamente de 1 a 1 20 mM de sal de un caíión divaleníe y aproximadameníe de 1 a 100 mM de reg ulador de pH; y b) incubar el anticuerpo o fragmento de él y la solución, hasta que se forme un gel proteínico del anticuerpo o fragmento de este. 39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo anti-VEGF, anti-CD20, aníi-CD20, aníi-CD1 1 a, anti-HER2, anli-lgE o un fragmento de ellos. 40. El método de cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, aníicuerpo quimérico, aníicuerpo biespecífico, aníicuerpo humano o aníicuerpo humanizado. 41 . El méfodo de cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, caracterizado además porque el anticuerpo es un fragmenlo de aníicuerpo seleccionado del grupo que consisfe en Fab, Fab', Fab2, Fab'2 l Fd, Fd', scFv, scFv2, dAb, un anticuerpo sin bisagra, un anticuerpo lineal y un diacuerpo.