TW202000891A

TW202000891A - 純化抗體之方法

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Publication number: TW202000891A
Application number: TW108107181A
Authority: TW
Inventors: 安卓杜梅茲; 肯特高克連; 尼可拉斯李維; 潔西卡莫里克; 安竹湯森; 肯尼斯彥西
Original assignee: 英商葛蘭素史克智慧財產發展有限公司
Priority date: 2018-03-07
Filing date: 2019-03-05
Publication date: 2020-01-01
Also published as: US20210054023A1; CN111819195A; SG11202007710UA; KR20200129133A; IL277056A; JP2021515764A; EP3762412A1; RU2020132716A; WO2019171294A1

Abstract

本發明係關於從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，該方法包括：(a)將包括重組多肽和HCP之溶液施用於超級抗原層析固體載體，(b)以包括辛酸鹽和精胺酸的清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離重組的多肽，其中該重組多肽為一抗-ICOS抗體或其抗原結合片段。

Description

純化抗體之方法

本發明係關於蛋白純化領域，特言之使用超級抗原，例如固定於固體載體之A蛋白、G蛋白或L蛋白，純化抗-ICOS抗體。特言之，本發明係關於清洗緩衝液組成份及使用清洗緩衝液在清洗步驟期間移除宿主細胞雜質，將所欲的蛋白產物之損失降至最低。

促進抗-腫瘤T細胞功能和引發T細胞增生為一種強力和新穎的腫瘤治療方法。目前市面上有三種免疫-腫瘤抗體(例如免疫-調節劑)。抗-CTLA-4(YERVOY/伊匹單抗(pilimumab))被認為在T細胞引動點加強免疫反應，而抗-PD-1抗體(OPDIVO/納武單抗(nivolumab)和KEYTRUDA/帕博利珠單抗(pembrolizumab))被認為係藉由在已引動和活化的腫瘤專一性T細胞中舒緩一抑制檢查點，作用在局部的腫瘤微環境。

ICOS為一種帶有與CD28/CTLA-4-Ig超家族有關之結構和功能的共刺激T細胞受體(Hutloff,et al.,"ICOS is an inducible T-cell co-stimulator structurally and functionally related to CD28",Nature,397：263-266(1999))。ICOS之活化係經由與ICOS-L(B7RP-1/B7-H2)結合而發生。B7-1或B7-2(CD28和CTLA4之配體)並不會結合或活化ICOS。然而，ICOS-L已顯現與CD28和CTLA-4二者微弱結合(Yao S et al.,“B7-H2 is a costimulatory ligand for CD28 in human”,Immunity,34(5)；729-40(2011))。ICOS的表現似乎受限在T細胞。ICOS表現程度隨著不同的T細胞亞群及T細胞的活化狀態而變。ICOS表現已顯現在休眠的TH17、T濾泡輔助(TFH)細胞和調節T(Treg)細胞上；然而，與CD28不同；其並不會高度表現在初始T_H1和T_H2效應子T細胞群族(Paulos CM et al.,“The inducible costimulator(ICOS)is critical for the development of human Th17 cells”,Sci Transl Med,2(55)；55ra78(2010))。 ICOS表現係在經由TCR接合活化後，於CD4+和CD8+效應子T細胞上高度引發(Wakamatsu E,et al.,“Convergent and divergent effects of costimulatory molecules in conventional and regulatory CD4+ T cells”,Proc Natal Acad Sci USA,110(3)；1023-8(2013))。經由ICOS受體之共刺激訊號傳遞僅在同時接受TCR活化訊號時發生(Sharpe AH and Freeman GJ.“The B7-CD28 Superfamily”,Nat.Rev Immunol,2(2)；116-26(2002))。在活化的抗原專一性T細胞中，ICOS係調節T_H1和T_H2細胞激素二者之產生，包括IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-4、IL-13和其他。僅管程度上比CD28低，但ICOS亦刺激效應子T細胞增生(Sharpe AH and Freeman GJ.“The B7-CD28 Superfamily”,Nat.Rev Immunol,2(2)；116-26(2002))。

有越來越多的文獻支持在CD4+和CD8+效應子T細胞上活化ICOS具有抗腫瘤潛力之理念。在帶有SA-1(肉瘤)、Meth A(纖維肉瘤)、EMT6(胸部)和P815(肥胖細胞瘤)及EL-4(漿細胞瘤)同基因腫瘤的小鼠中，ICOS-L-Fc融合蛋白造成腫瘤生長延遲及完全根除腫瘤，而在已知為致免疫性差的B16-F10(黑色素瘤)腫瘤模型中並未觀察到活性(Ara G et al.,“Potent activity of soluble B7RP-1-Fc in therapy of murine tumors in syngeneic hosts”,Int.J Cancer,103(4)；501-7(2003))。ICOS-L-Fc的抗腫瘤活性係依照固有的免疫反應而定，因為在長有腫瘤的裸小鼠中此活性完全喪失。從經ICOS-L-Fc治療的小鼠之腫瘤分析驗證了，在腫瘤對治療的反應中CD4+和CD8+ T細胞浸潤明顯增加，其支持的這些模型中ICOS-L-Fc的免疫刺激效應。

另外使用ICOS^-/-和ICOS-L^-/-小鼠之報告驗證了在B16/B16黑色素瘤同基因腫瘤模型中，媒介抗-CTLA4抗體之抗腫瘤活性需要ICOS訊號傳遞(Fu T et al.,“The ICOS/ICOSL pathway is required for optimal antitumor responses mediated by anti-CTLA-4 therapy”,Cancer Res,71(16)；5445-54(2011))。在抗-CTLA4抗體治療後，相較於野生型小鼠，缺乏ICOS或ICOS-L的小鼠明顯地存活率下降。在一個別的研究中，轉導B16/B16腫瘤細胞使重組的鼠科ICOS-L過度表現。已發現，相較於經對照蛋白轉導的B16/B16腫瘤細胞，這些腫瘤對於抗-CTLA4治療明顯較敏感(Allison J et al.,“Combination immunotherapy for the treatment of cancer”,WO2011/041613 A2(2009))。這些研究提供了ICOS促效劑(單獨或與其他免疫調節抗體組合)之抗腫瘤潛力的證據。

來自經抗-CTLA4抗體治療之病患的新數據亦指出ICOS+效應子T細胞在調節抗-腫瘤免疫反應中的正面角色。患有轉移黑色素瘤(Giacomo AMD et al.,“Long-term survival and immunological parameters in metastatic melanoma patients who respond to ipilimumab 10mg/kg within an expanded access program”,Cancer Immunol Immunother.,62(6)；1021-8(2013))；泌尿上皮癌(Carthon BC et al.,“Preoperative CTLA-4 blockade：Tolerability and immune monitoring in the setting of a presurgical clinical trial”Clin Cancer Res.,16(10)；2861-71(2010))；乳癌(Vonderheide RH et al.,“Tremelimumab in combination with exemestane in patients with advanced breast cancer and treatment-associated modulation of inducible costimulator expression on patient T cells”,Clin Cancer Res.,16(13)；3485-94(2010))；及前列腺癌之病患，其在伊匹單抗治療後具有增加的循環絕對計數和腫瘤浸潤CD4⁺ICOS⁺及CD8⁺ICOS⁺ T細胞，比其中觀察到極少或無增加的病患具有顯著較佳的治療相關結果。重要地，其顯示伊匹單抗改變ICOS⁺ T效應子：T_reg比率，在治療後將T_regs治療前的豐度反轉至顯著T效應子豐度對T_regs(Liakou CI et al.,“CTLA-4 blockade increases IFN-gamma producing CD4+ICOShi cells to shift the ratio of effector to regulatory T cells in cancer patients”,Proc Natl Acad Sci USA.105(39)；14987-92(2008))和(Vonderheide RH et al.,Clin Cancer Res.,16(13)；3485-94(2010))。因此，ICOS陽性T效應子細胞為伊匹單抗反應之陽性預測生物標記，其指出了以促效劑ICOS抗體活化此群族細胞的潛在利益。因此，在癌症治療上對於另外的T細胞增生引發分子，例如抗-ICOS抗體有其需求。

在某些情況下，抗體的純化，例如抗-ICOS抗體可能涉及移除宿主細胞蛋白(HCP)雜質。宿主細胞蛋白(HCP)雜質-以FDA分類為「製程相關的」雜質-必須在生物醫藥下游處理中移除至夠低的量。在典型的下游處理期間充份的清除HCP對於某些單株抗體(mAb)產物可能特別具挑戰。大多數的mAb下游處理係利用「平台」法；典型的mAb下游平台係由A蛋白親和層析捕捉，接著一至三個非親和性精緻純化(polishing)步驟所組成。A蛋白親和捕捉步驟為平台的主力元件並提供大多數的HCP清除。後續的精緻純化步驟一般為離子交換、疏水性交互作用或多模式層析。

對於許多mAb產物，在第一次精緻純化層析步驟後HCP濃度即夠低。然而，有許多的mAb係特別進行第二次精緻純化層析步驟以移除額外的HCP；此項可能需要有特殊意義的製程開發努力並產生較複雜的製程。先前的研究已鑑定出HCP雜質的亞群族與mAb產物分子具有吸引交互作用(Levy et al.,(2014)Biotechnol.Bioeng.111(5)：904-912：Aboulaich et al.,(2014)Biotechnol.Prog.30(5)：1114-1124)。大多數躲開A蛋白清除的HCP係由於產物-結合而非共溶離或吸附A蛋白配體或基質。難以移除的HCP群族相當小-相較於存在細胞培養中的各種HCP群族-且對於不同的mAb產物為類似的。

雖然難除的HCP雜質群族對於所有的mAb產物大多相同，但不同程度的HCP-mAb相互作用可能明顯影響HCP清除通過A蛋白步驟；非常小的mAb產物之胺基酸序列變化可能影響A蛋白和精緻純化步驟中HCP-mAb交互作用。載入A蛋白管柱上的HCP群族，其對HCP-mAb結合之可能性具有明顯影響，可能受到細胞年齡、收取方法和條件，且在不同的細胞株間已觀察到差異。除了產物-結合之外，就大多數的A蛋白樹脂具有與基質結合和與產物共溶離的低量HCP。受控孔洞玻璃樹脂具有高出很多與基質結合的HCP量。

一特定的清洗液添加劑辛酸鈉，先前已鑑別出為最成功破壞HCP-mAb結合的添加劑之一並在A蛋白溶離液中得到低HCP濃度。辛酸鈉為一種在小鼠中發現帶有大約360mM臨界微胞濃度的無毒8-碳飽和脂肪酸。先前的研究已使用50mM辛酸鈉(Aboulaich et al.,(2014)Biotechnol.Prog.30(5)：1114-1124)，帶有各種NaCl和pH之40mM辛酸鈉(Chollangi et al.,(2015)Biotechnol.Bioeng.112(11)：2292-2304)及至高80mM辛酸鈉(Herzer et al.,(2015)Biotechnol.Bioeng.112(7)：1417-1428)來提升HCP清除，以及以帶有NaCl具高pH的50mM辛酸鈉進行總HCP清除和移除蛋白分解的HCP雜質(Bee et al.,(2015)Biotechnol.Prog.31(5)：1360-1369)。先前已有針對含有至高100mM辛酸鈉之A蛋白清洗液之專利申請案提出申請 (WO2014/141150；WO2014/186350)。另外，在A蛋白捕捉步驟之前及之後，辛酸於非層析處理中已用於沉澱宿主細胞蛋白雜質(Brodsky et al.,(2012)Biotechnol.Bioeng.109(10)：2589-2598；Zheng et al.,(2015)Biotechnol.Prog.31(6)：1515-1525；Herzer et al.,(2015)Biotechnol.Bioeng.112(7)：1417-1428)。

在本項技術中就提供從宿主細胞蛋白純化蛋白，特別是抗-ICOS抗體的改良方法有其需求。

在一方面，本發明係提供從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，該方法包括：(a)將包括重組多肽和HCP之溶液施用於超級抗原層析固體載體，(b)以包括辛酸鹽和精胺酸的清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離重組的多肽，其中該重組多肽為一抗-ICOS抗體或其抗原結合片段。

在一實施例中，清洗緩衝液係包括大於約50mM辛酸鹽和大於約0.5M精胺酸。

在另外的實施例中，抗-ICOS抗體係包括一或多種：如SEQ ID NO：1中所述之CDRH1；如SEQ ID NO：2中所述之CDRH2；如SEQ ID NO：3中所述之CDRH3；如SEQ ID NO：4中所述之CDRL1；如SEQ ID NO：5中所述之CDRL2及/或如SEQ ID NO：6中所述之CDRL3，或各CDR之直接同等物，其中直接同等物在該CDR中係具有不超過二個胺基酸取代。

在另外的實施例中，抗-ICOS抗體係包括一V_H區，該區係包含與SEQ ID NO：7中所示的胺基酸序列為至少90%相同之胺基酸序列，及/或一V_L區，該區係包含與SEQ ID NO：8中所述的胺基酸序列為至少90%相同之胺基酸序列，其中該抗-ICOS抗體係專一與人類ICOS結合。

又在另外的實施例中，抗-ICOS抗體為一ICOS促效劑。在另外的實施例中，該辛酸鹽為辛酸鈉。

又在另外的實施例中，清洗緩衝液係包括約75mM至約300mM辛酸鹽。

在另外的實施例中，清洗緩衝液係包括約0.75M至約1.5M精胺酸。

在另外的實施例中，HCP係衍生自哺乳動物細胞。在一實施例中，HCP為類磷脂酶B 2蛋白。

在另外的實施例中，清洗緩衝液的pH係介於pH 7至pH 9。在一實施例中，清洗緩衝液的pH係介於pH 7.5至pH 8.5。

在一實施例中，抗-ICOS抗體為一單株抗體(mAb)。

在一實施例中，抗-ICOS抗體為IgG1或IgG4。在一實施例中，抗-ICOS抗體為IgG4。

在另外的實施例中，超級抗原係由A蛋白、G蛋白和L蛋白組成之群中選出。

在一實施例中，在從超級抗原層析固體載體溶離重組多肽步驟之後，HCP的量係低於約200ng HCP/每mg產物。

在另外方面，係提供從類磷脂酶B 2蛋白純化抗-ICOS抗體或或其抗原結合片段之方法，該方法係包括：(a)將包括抗-ICOS抗體或其抗原結合片段及類磷脂酶B 2蛋白之溶液施用於超級抗原層析固體載體，(b)以包括約100mM辛酸鈉和約1.1M精胺酸的清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離抗-ICOS抗體或其抗原結合片段。

圖1：使用mAb1作為模型，隨清洗液中辛酸鈉濃度改變之A蛋白溶離液中的產率百分比(三角形▲)和HCP濃度(正方形■)。

圖2：清洗緩衝液中5種辛酸鈉濃度之溶離液中載入的mAb1百分比、汽提(strip)和清洗溶離份。

圖3：在不同辛酸鈉濃度之溶液中，mAb1吸附MabSelect SuRe樹脂之朗繆爾(Langmuir)等溫擬合。

圖4：就5種mAb以100mM和250mM辛酸鈉清洗緩衝液之A蛋白溶離液HCP濃度。

圖5：以含有不同濃度的辛酸鈉和精胺酸於不同pH之清洗緩衝液對mAb2之A蛋白溶離液HCP濃度。注意：所有的清洗緩衝液係含有300mM乙酸鈉。

圖6：以含有不同濃度的辛酸鈉和精胺酸於不同pH之清洗緩衝液對2種不同mAb1原料流之A蛋白溶離液HCP濃度。注意：所有的清洗緩衝液係含有300mM乙酸鈉。

圖7：以含有不同濃度的辛酸鈉和精胺酸於不同pH之清洗緩衝液對mAb5原料流之A蛋白溶離液PLBL2濃度。

圖8：以含有不同濃度的辛酸鈉和精胺酸於不同pH之清洗緩衝液對mAb5原料流之A蛋白溶離液HCP濃度。

圖9：以含有不同濃度的辛酸鈉和精胺酸於不同pH之清洗緩衝液對mAb5原料流之A蛋白步驟產率。

圖10：對於含有辛酸鹽和精胺酸或離胺酸之清洗液，mAb3A蛋白溶離液中之組織蛋白酶L(Cathepsin L)活性。

圖11：單株抗體處理中間物之抗體片段百分比。

圖12：僅含有辛酸鹽與辛酸鹽加上精胺酸清洗緩衝之HCP濃度。

圖13：單株抗體原料藥物質於25℃放置至多10天之抗體片段百分比。

應了解，本發明不限於特定的方法、試劑、化合物、組成物或生物系統，其當然可能改變。亦應了解，文中所用的方法僅作為描述特定的實施例之目的，且不希望受限。除非內容中明確指出，否則如本說明書及所附的申請專利範圍中所用，單數型「一」和「此」係包括多數型參照物。因此，例如，有關「多肽」係包括二或多種多肽的組合，諸如此類。

術語「包括」係涵蓋「包含」或「由...組成」，例如「包括」X的組成物可能單獨地由X組成或可能包含額外的東西，例如X+Y。術語「基本上由...組成」係將內容範圍限制在特定的物質或步驟且對請求的內容的基本特性無重大影響。術語「由...組成」係排除任何額外組份之存在。

「約」如文中所用當係指一數值，例如數量、時間長度等，係指涵蓋所指數值之±20%或±10%的變異，包括±5%、±1%和±0.1%，而使得此變異對於表現所揭示的方法為適當的。

除非另有定義，否則文中所用的所有的技術和科學術語係具有與本發明所屬的技術中之一般技術者一般理解之意義。雖然任何類似或等同文中所述之方法和物質可用於試驗本發明之施行，但較佳的物質和方法係描述於本文中。在描述和請求本發明中，將使用下列術語。

「多肽」、「胜肽」和「蛋白」在文中可交換使用，係指胺基酸殘基之聚合物。多肽可為天然(組織-衍生的)來源、重組或由原核或真核細胞製備物自然表現，或經由合成方法化學上產生。此等術語係應用於其中一或多個胺基酸殘基為對應的天然生成胺基酸之人工化學模擬物的胺基酸聚合物，以及天然生成的胺基酸聚合物和非天然生成的胺基酸聚合物。胺基酸模擬物係指具有不同於一般胺基酸化學結構之結構，但以類似天然生成胺基酸之方式運作的化學化合物。非天然殘基已完整描述於科學和專利文獻中；一些可用作天然胺基酸殘基之模擬物的例示非天然組成物和指南係描述於下文。芳香系胺基酸之模擬物可藉由以下列置換來產生：例如D-或L-苯丙胺酸；D-或L-苯甘胺酸；D-或L-2噻吩基丙胺酸；D-或L-1、-2,3-或4-芘基丙胺酸；D-或L-3噻吩基丙胺酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙胺酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙胺酸；D-或L-(2-吡

基)-丙胺酸；D-或L-(4-異丙基)-苯甘胺酸：D-(三氟甲基)-苯甘胺酸；D-(三氟甲基)-苯丙胺酸：D-對-氟-苯丙胺酸；D-或L-對-二苯基苯丙胺酸；K-或L-對甲氧基-二苯基苯丙胺酸：D-或L-2-吲哚(烷基)丙胺酸；及D-或L-烷基丙胺酸，其中烷基可為經取代或未經取代之甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、異丙基、異丁基、二級-isotyl、異戊基，或非酸性胺基酸。非天然胺基酸之芳香環包括，例如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳香環。

「胜肽」如文中所用係包括該等文中特別作為例示之胜肽的保守性變異之胜肽。「保守性變異」如文中所用係指一胺基酸殘基被另一生物上類似的殘基所置換。保守性變異之實例包括(但不限於)以疏水性殘基例如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、色胺酸、酪胺酸、正白胺酸或甲硫胺酸取代另外的胺基酸，或以一極性殘基取代另外胺基酸，例如以精胺酸取代離胺酸，以麩胺酸取代天門冬胺酸，或以麩醯胺酸取代天門冬醯胺酸等等。可取代另一種胺基酸之天然親水性胺基酸包括天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸和蘇胺酸。

「保守性變異」亦包括使用經取代的胺基酸置換未經取代的母胺基酸，其限制條件為此提升至經取代多肽之抗體亦能與未經取代的多肽進行免疫反應。此等保守性取代係在文中所述之胜肽種類之定義中。

「陽離子性」如文中所用係指在PH 7.4時具有淨正電荷之任何胜肽。胜肽之生物活性可藉由熟習本項技術者已知及文中所述的標準方法來測定。

「重組」當用於指蛋白時係表示此蛋白已藉由導入一異質性核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白作修改。

如文中所用「治療性蛋白」係指任何蛋白及/或多肽，其可投予哺乳動物引起例如研究人員或臨床醫師所尋求的組織、系統、動物或人類之生物或醫療反應。一治療性蛋白可引起一種以上的生物或醫療反應。再者，術語「治療上有效量」係指相較於未接受此量的對應患者，產生(但不限於)治癒、預防或改善疾病、病症或副作用，或降低疾病或病症的推進速率之任何量。此術語之範圍亦包括有效增進正常生理功能之量，以及有效使病患之生理功能得以增進或幫助第二種醫藥劑之治療效用的量。

文中所鑑定之所有「胺基酸」殘基皆為天然L-組態。與標準的多肽命名法一致，胺基酸殘基之縮寫係如下表中所示。

應注意，所有的胺基酸殘基序列在文中係以化學式表示，其由左至右的方向係為習知之胺基端至羧基端的方向。

純化方法

在一方面本發明係關於從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，該方法包括：(a)將包括重組多肽和HCP之溶液施用於超級抗原層析固體載體；(b)以包括辛酸鹽和精胺酸的清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離重組的多肽。

在一方面本發明係關於從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，該方法包括：(a)將包括重組多肽和HCP之溶液施用於超級抗原層析固體載體；(b)以包括大於約50mM辛酸鹽和大於約0.5M精胺酸的清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離重組的多肽。

在一方面本發明係關於從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，該方法包括：(a)將包括重組多肽和HCP之溶液施用於超級抗原層析固體載體；(b)以包括濃度大於250mM辛酸鹽的清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離重組的多肽。

在一方面本發明係關於從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，該方法包括：(a)將包括重組多肽和HCP之溶液施用於超級抗原層析固體載體；(b)以包括約150mM至約850mM辛酸鹽的清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離重組的多肽。

在另外方面本發明係關於從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，該方法包括：(a)將包括重組多肽和HCP之溶液施用於超級抗原層析固體載體；(b1)以包括辛酸鹽的第一清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；(b2)以包括精胺酸的第二清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離重組的多肽。

在另外方面本發明係關於從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，該方法包括：(a)將包括重組多肽和HCP之溶液施用於超級抗原層析固體載體；(b1)以包括精胺酸的第一清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；(b2)以包括辛酸鹽的第二清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離重組的多肽。

在步驟(a)中將溶液施用於(或載入)超級抗原層析固體載體後，重組多肽將吸附至固定在固體載體的超級抗原上。然後可藉由將含有吸附的重組多肽之固定超級抗原與如文中所述的清洗緩衝液接觸，移除HCP雜質。

「超級抗原」係指在一與這些蛋白之目標配體-結合位置不相同的位置，與免疫球蛋白超家族成員相互作用之通用配體。葡萄球菌腸毒素為與T細胞受體交互作用之超級抗原的實例。結合抗體的超級抗原包括，但不限於結合IgG恆定區的G蛋白(Bjorck and Kronvall(1984)J.Immunol.,133：969)；結合IgG恆定區和VH區的A蛋白(Forsgren and Sjoquist,(1966)J.Immunol.,97：822)；及結合VL區的L蛋白(Bjorck,(1988)J.Immunol.,140：1194)。因此，在一實施例中，超級抗原係由A蛋白、G蛋白和L蛋白組成之群中選出。

當用於文中時，術語「A蛋白」係涵蓋由其天然來源回收的A蛋白(例如金黃色葡萄球菌的細胞壁)，合成產生的A蛋白(例如藉由胜肽合成或藉由重組技術)，以及保留結合具有C_H2/C_H3區之蛋白能力的其變體。A蛋白可由市面上購得，例如來自Repligen或Pharmacia。

如文中所用，「親和層析」為利用生物分子間專一可逆的交互作用，而非一般的生物分子性質，例如等電點、疏水性、或大小進行層析分離之層析法。「A蛋白親和層析」或「A蛋白層析」係指專一親和層析法，其係利用A蛋白對免疫球蛋白分子之Fc部分的IgG結合區之親和力。此Fc部分係包括人類或動物免疫球蛋白恆定區C_H2和C_H3，或實質上與這些區類似的免疫球蛋白區。在施行上，A蛋白層析係涉及使用固定在一固體載體的A蛋白。參見Gagnon,Protein A Affinity Chromatography,Purification Tools for Monoclonal Antibodies,pp.155-198,Validated Biosystems,(1996)。亦可使用G蛋白和L蛋白進行親和層析。固體載體為在其上黏附A蛋白之非水性基質(例如，管柱、樹脂、基質、微珠、凝膠等)。此載體包括瓊脂糖(agarose)、sepharose、玻璃、矽氧、聚苯乙烯、膠棉(collodion)、活性碳、砂、聚甲基丙烯酸酯、交鏈聚(苯乙烯-二乙烯苯)及帶有右璇糖酐表面延伸劑之瓊脂糖及任何其他適合的物質。此等物質已為本項技術所熟知。可使用任何適合的方法將超級抗原固定至固體載體。將蛋白固定在適合的固體載體之方法已為本項技術所熟知。參見，例如Ostrove,in Guide to Protein Purification,Methods in Enzymology,(1990)182：357-371。此等固體載體，有或無固定的A蛋白或L蛋白，可從許多商業來源容易取得，例如Vector Laboratory(Burlingame,Calif.)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,Calif.)、BioRad(Hercules,Calif.)、Amersham Biosciences(part of GE Healthcare,Uppsala,Sweden)及Millipore(Billerica,Mass.)。

文中所述的方法可包括一或多個另外的純化步驟，例如一或多個另外的層析步驟。在一實施例中，此一或多個另外的層析步驟係由下列組成之群中選出：陰離子交換層析、陽離子交換層析和混合模式層析，特別是陰離子交換層析。

在一實施例中，此方法另外係包括將文中所述方法之步驟(c)所產生的溶離液過濾。

在一實施例中此方法在步驟(c)之後進一步係包括下列步驟：(d)將含有回收蛋白的溶液以乙酸30mM、100mM HCl滴定至約pH 3.5；(e)讓步驟(d)的溶液保持在約pH 3.5歷時30至約60分鐘；及(f)以1M Tris將步驟(e)溶液的pH調整至約pH 7.5。在一實施例中此方法進一步係包括過濾步驟(f)所產生的溶液。

在一實施例中，施用於步驟(a)管柱中之重組蛋白的量(亦即承載率)為35mg/ml或更低，例如30mg/ml或更低，20mg/ml或更低，15mg/ml或更低或10mg/ml或更低。應了解「承載率」係指每毫升(ml)樹脂之蛋白(例如單株抗體)的毫克數(mg)。

清洗緩衝液

「緩衝液」為藉由其酸-鹼共軛組份的作用，抵抗pH變化之緩衝溶液。「平衡緩衝液」係指用於製備層析用之固相的溶液。「承載緩衝液」係指用於將蛋白和雜質混合物承載至固相(亦即層析基質)上的溶液。平衡和承載緩衝亦可相同。「清洗緩衝液」係指在承載完成後用於從固相移除剩餘雜質的溶液。「溶離緩衝液」係用來從層析基質將目標蛋白移出。

「鹽」為由酸和鹼藉由相互作用所形成的化合物。

在本發明一方面，清洗緩衝液係包括一脂肪系羧酸鹽。此脂肪系羧酸鹽可為直鏈或支鏈。在特定的實施例中，此脂肪系羧酸鹽為脂肪系羧酸或其鹽。在特定的實施例中，此脂肪系羧酸鹽為直鏈且係由下列組成之群中選出：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸(天竺葵酸)、癸酸、十一烷酸、十二烷酸(月桂酸)、十三烷酸、十四烷酸(肉豆蔻酸)、十五烷酸、十六烷酸(棕櫚酸)、十七烷酸、十八烷酸(硬脂酸)、二十酸(花生酸)或其任何鹽類。因此，脂肪系羧酸鹽可包括長度1-20個碳之碳主鏈。在一實施例中此脂肪系羧酸鹽係包括6-12個碳之碳主鏈。在一實施例中此脂肪系羧酸鹽係由下列組成之群中選出：己酸鹽、庚酸鹽、辛酸鹽、癸酸鹽和十二烷酸鹽。在另一實施例中，此脂肪系羧酸鹽為辛酸鹽。

在一實施例中此脂肪系羧酸鹽的來源係由下列組成之群中選出：脂肪系羧酸、脂肪系羧酸的鈉鹽、脂肪系羧酸的鉀鹽及脂肪系羧酸的銨鹽。在另一實施例中，清洗緩衝液係包括辛酸鈉、癸酸鈉或十二烷酸鈉，特別是辛酸鈉。

在一實施例中此清洗緩衝液係包括大於約50mM辛酸鹽。在一實施例中此清洗緩衝液係包括大於約200mM辛酸鹽。在一實施例中此清洗緩衝液係包括大於約250mM辛酸鹽。在另一實施例中，此清洗緩衝液係包括至少約50mM辛酸鹽，例如至少約75mM，約100mM，約150mM，約200mM，約250mM或約300mM辛酸鹽。在一實施例中此清洗緩衝液係包括低於約850mM辛酸鹽，例如低於約800mM，約750mM，約700mM，約650mM，約600mM，約550mM，約500mM，約450mM，約400mM，約350mM，約300mM辛酸鹽。在另外的實施例中，此清洗緩衝液係包括約100mM，約125mM，約150mM，約175mM，約200mM或約250mM辛酸鹽。

在一實施例中此清洗緩衝液係包括大於約50mM辛酸鈉。在一實施例中此清洗緩衝液係包括大於約200mM辛酸鈉。在一實施例中此清洗緩衝液係包括大於約250mM辛酸鈉。在另一實施例中此清洗緩衝液係包括至少約50mM辛酸鈉，例如至少約75mM，約100mM，約150mM，約200mM，約250mM或約300mM辛酸鈉。在一實施例中此清洗緩衝液係包括低於約850mM辛酸鈉，例如低於約800mM，約750mM，約700mM，約650mM，約600mM，約550mM，約500mM，約450mM，約400mM，約350mM，約300mM辛酸鈉。在另一實施例中，此清洗緩衝液係包括約100mM，約125mM，約150mM，約175mM，約200mM，或約250mM辛酸鈉。

在一實施例中此清洗緩衝液係包括約50mM至約750mM辛酸鹽；約50mM至約500mM辛酸鹽；約75mM至約400mM辛酸鹽；約75mM至約350mM辛酸鹽；約75mM至約300mM辛酸鹽；約75mM至約200mM辛酸鹽；大於約250mM至約750mM辛酸鹽；大於約250mM至約500mM辛酸鹽；大於約250mM至約400mM辛酸鹽；大於約250mM至約350mM辛酸鹽；或大於約250mM至約300mM辛酸鹽。

在一實施例中此清洗緩衝液係包括約50mM至約750mM辛酸鈉；約50mM至約500mM辛酸鈉；約75mM至約400mM辛酸鈉；約75mM至約350mM辛酸鈉；約75mM至約300mM辛酸鈉；約75mM至約200mM辛酸鈉；大於約250mM至約750mM辛酸鈉；大於約250mM至約500mM辛酸鈉；大於約250mM至約400mM辛酸鈉；大於約250mM至約350mM辛酸鈉；或大於約250mM至約300mM辛酸鈉。

在一實施例中此清洗緩衝液係包括有機酸、該有機酸共軛鹼之鹼金屬或銨鹽及有機鹼。在一實施例中此清洗緩衝液並無添加NaCl。

在一實施例中，有機酸的共軛鹼為該有機酸共軛鹼的鈉、鉀或銨鹽。在一實施例中，此有機酸為乙酸而乙酸的共軛鹼為鈉鹽(亦即乙酸鈉)。

在一實施例中清洗緩衝液另外係包括約1mM至約500mM乙酸。在一實施例中此清洗緩衝液係包括約45mM乙酸。在一實施例中清洗緩衝液另外係包括約1mM至約500mM Tris鹼。在一實施例中此清洗緩衝液係包括約55mM Tris鹼。在一實施例中清洗緩衝液另外係包括約1mM至約500mM乙酸鈉。在一實施例中此清洗緩衝液係包括約300mM乙酸鈉。

在一實施例中，清洗緩衝液的pH係介於約pH 7至約pH 9；例如約pH 7.5至約pH 8.5。

在一實施例中，此清洗緩衝液係包括約0.25M至約1.5M精胺酸。在另一實施例中，此清洗緩衝液係包括約0.25M至約2M精胺酸。在另一實施例中，此清洗緩衝液係包括約0.5M至約2M精胺酸。又在另外的實施例中，此清洗緩衝液係包括約0.75M至約1.5M精胺酸。在另一實施例中，此清洗緩衝液係包括約1M，約1.1M，約1.2M，約1.3M，約1.4M，約1.5M，約1.6M，約1.7M，約1.8M，約1.9M或約2M精胺酸。在一實施例中，此清洗緩衝液係包括約0.5M至約2M精胺酸，特別是約0.75M至約2M精胺酸。在另一實施例中，此清洗緩衝液係包括大於約1M精胺酸。

應了解，有關「精胺酸」不僅係指天然的胺基酸，亦涵蓋精胺酸衍生物或其鹽類，例如精胺酸HCl、乙醯精胺酸、精胺、海藻酸、N-α-丁醯基-L-精胺酸或N-α-三甲基乙醯基精胺酸。

另一種選擇，精胺酸可包括在起初的清洗緩衝液中(亦即同時使用)。因此，在本發明一方面係提供從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽的方法，該方法係包括：(a)將包括重組多肽和HCP之溶液施用於超級抗原層析固體載體，(b)以包括大於約100mM至約850mM辛酸鹽和約0.25M至約1.5M精胺酸的清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離重組的多肽。如文中所述的實例中所示，包括辛酸鹽和精胺酸的超級抗原層析清洗液具有提升宿主細胞蛋白清除之意外的協同效應，特別是用於移除二種特別難以移除的宿主細胞蛋白PLBL2和組織蛋白酶L(cathepsin L)。

在一實施例中，此清洗緩衝液係包括約100mM至約750mM辛酸鹽；約100mM至約500mM辛酸鹽；約100mM至約400mM辛酸鹽；約100mM至約350mM辛酸鹽；或約100mM至約300mM辛酸鹽；及/或約0.25M至約2M精胺酸，約0.5M至約1.5M精胺酸；或約0.5M至約1M精胺酸。

在一實施例中，此清洗緩衝液係包括約100mM至約750mM辛酸鈉；約100mM至約500mM辛酸鈉；約100mM至約400mM辛酸鈉；約100mM至約350mM辛酸鈉；或約100mM至約300mM辛酸鈉；及/或約0.25M至約2M精胺酸；約0.5M至約1.5M精胺酸；或約0.5M至約1M精胺酸。

在一實施例中，此清洗緩衝液係包括約0.5M至約2M精胺酸及約50mM至約750mM辛酸鈉；約0.5M至約1.5M精胺酸及約50mM至約500mM辛酸鈉；或約0.5M至約1.5M精胺酸及約50mM至約250mM辛酸鈉。

在一實施例中，清洗緩衝液進一步係包括約0.5M至約1M離胺酸，例如約0.75M離胺酸。在此實施例中，離胺酸係包括在起初的清洗緩衝液中(亦即同時使用)。在一替代的實施例中，離胺酸係包括在一個別的清洗緩衝液中(亦即先後使用)。如文中所提供的實例中所述，添加離胺酸顯示成功地降低溶離體積。

重組多肽

術語「結合蛋白」如文中所用係指抗體和其他蛋白結構，例如能與抗原結合的區域。

術語「抗體」用於文中以最廣義而言係指帶有類免疫球蛋白區之分子(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)並包括單株抗、重組、多株、嵌合、人類、人源化、多專一性抗體(包括雙專一性抗體和異源接合抗體)；單一可變區(例如V_H、V_HH、VL、區域抗體(dAb^TM))、抗原結合抗體片段、Fab、F(ab’)₂、Fv、雙硫鍵連結的Fv、單鏈Fv、雙硫鍵連結的scFv、雙抗體、TANDABS^TM等，以及任何前述者之修飾體。

替代的抗體模式包括其中一或多個抗原結合蛋白之CDR可配置在適合的非免疫球蛋白架構或骨幹上之替代的架構，例如affibody、SpA架構、LDL受體A類區域、avimer或EGF區。

在一實施例中此多肽為抗原結合多肽。在一實施例中此抗原結合多肽係由下列組成之群中選出：抗體、抗體片段、免疫球蛋白單一可變區(dAb)、mAbdAb、Fab、F(ab)₂、Fv、雙硫鍵連結的Fv、scFv、緊密構形多專一性抗體、雙硫鍵連結的scFv、雙抗體或可溶性受體。在另一實施例中此抗原結合多肽為抗體，例如單株抗體(mAb)。術語重組多肽、產物分子和mAb在文中係交換使用。此抗體可為，例如嵌合、人源化或區域抗體。

術語Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)₂係以其標準意義來使用(參見，例如Harlow et al.,Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1988))。

「嵌合抗體」係指含有衍生自供體抗體之天然生成的可變區(輕鏈和重鏈)與衍生受體抗體之輕鏈和重鏈恆定區結合之工程化抗體類型。

「人源化抗體」係指一種基因工程抗體類型，其具有衍生自非人類供體免疫球蛋白之CDR，其餘的分子之免疫球蛋白-衍生部份係由一(或多種)人類免疫球蛋白所衍生。此外，框架支撐殘基可改變以便保留結合親和性(參見，例如Queen et al.,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86：10029-10032,Hodgson et al.,(1991)Bio/Technology,9：421)。適合的人類受體抗體可為一藉由與供體抗體之核苷酸和胺基酸序列的同源性從習知資料庫，例如KABAT.RTM.資料庫、Los Alamos資料庫和Swiss Protein資料庫選出之抗體。特徵為與供體抗體之框架區同源(以胺基酸為基礎)的人類抗體，可能適合提供重鏈恆定區及/或重鏈可變框架區供插入供體CDR。能提供輕鏈恆定或可變框架區之適合的受體抗體可以類似的方式來選擇。應注意，受體抗體重鏈和輕鏈不需要源自於相同的受體抗體。先前技術描述了數種製造此等人源化抗體之方法--參見例如EP-A-0239400和EP-A-054951。

術語「供體抗體」係指一抗體(單株及/或重組)，其係奉獻可變區、CDR或其他功能片段或其類似物的胺基酸序列給第一免疫球蛋白配偶體，以至於提供改變的免疫球蛋白編碼區及產生具有抗原專一性之表現改變的抗體及中和供體抗體之活性特徵。術語「受體抗體」係指與供體抗體異源之抗體(單株及/或重組)，其係貢獻全部(或任何蛋白，但在某些實施例中為全部)編碼其重鏈及/或輕鏈框架區及/或其重鏈及/或輕鏈恆定區之胺基酸序列給第一免疫球蛋白配偶體。在特定的實施例中，此受體抗體為人類抗體。

「CDR」係定義為抗體之互補決定區胺基酸序列，其為免疫球蛋白重鏈和輕鏈之高可變區。參見，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th Ed.,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)。在免疫球蛋白的可變部分有三條重鏈和三條輕鏈CDR(或CDR區)。因此，「CDR」如文中所用係指全部三條重鏈CDR，或全部三條輕鏈CDR(或若適當，全部重鏈和全部輕鏈CDR二者)。抗體之結構和蛋白摺疊可指其他殘基被視為抗原結合區之部份且應能為熟習技術者所了解(參見，例如Chothia et al.,(1989)Nature 342：877-883)。

術語「V_H」和「V_L」用於文中分別係指抗原結合蛋白的重鏈可變區和輕鏈可變區。

整個說明書，可變區序列和全長抗體序列中的胺基酸殘基係根據Kabat編碼規則來編號。同樣地，用於實例中的術語「CDR」、「CDRL1」、「CDRL2」、「CDRL3」、「CDRH1」、「CDRH2」、「CDRH3」係依循Kabat編碼規則。就進一步的資訊，請參見Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1991)。

可變區序列和全長抗體序列中的胺基酸殘基有替代的編碼規則，對於熟習本項技術者為顯而易見的。對於CDR序列亦有替代的編碼規則，例如該等Chothia et al.(1989)Nature 342：877-883中所述。抗體之結構和蛋白摺疊可指其他殘基被視為CDR序列的部份且應能為熟習技術者所了解。

熟習技術者可取得的CDR序列之其他編碼規則包括「AbM」法(University of Bath)和「contact」法(University College London)。使用至少二種Kabat、Chothia、AbM和contact法可決定最小重疊區，得到「最小結合單位」。最小結合單位可為CDR的子部分。

查詢的核酸序列和主體核酸序列間之「相同性百分比」為「相同性」數值，係以百分率表示，其係由BLASTP比對所計算，當主體核酸序列與查詢核酸序列在進行成對的BLASTP比對後，具有100%覆蓋率。藉由使用可從國家生物技術機構中心網站取得的BLASTP比對中的缺位設定，以低複雜區域關閉之過濾器，進行此查詢核酸序列和主體核酸序列間的逐對之比對。

查詢的胺基酸序列和主體胺基酸序列間之「相同性百分比」為「相同性」數值，係以百分率表示，其係由BLASTP比對所計算，當主體胺基酸序列與質詢胺基酸序列在進行成對的BLASTP比對後，具有100%覆蓋率。藉由使用可從國家生物技術機構中心網站取得的BLASTP比對中的缺位設定，以低複雜區域關閉之過濾器，進行此查詢胺基酸序列和主體胺基酸序列間的逐對之比對。

查詢的序列可與主體序列為100%相同，或當相較於主體序列時，其可包括至高特定整數數目的胺基酸或核酸改變，使得相同性%低於100%。例如查詢的序列與主體序列為至少50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%相同。此等改變包括至少一個胺基酸刪除、取代(包括保守性和非保守性取代)，或插入，且其中該改變可發生在查詢序列的胺基-或羧基端位置或該等端點位置之間的任何處，個別散落在查詢序列的胺基酸間或查詢序列內的一或多個連續基團中。

相同性%可遍及全長的查詢序列來測定，包括CDR。另一種選擇，相同性%可排除CDR，例如CDR與主體序列為100%相同，且相同性變異%係在查詢序列之其餘部份，所以此CDR序列為固定/完整的。

如文中所用術語「區域」係指具有三級結構，與其餘的蛋白無關之摺疊的蛋白結構。一般而言，區域係負責蛋白之離散的功能性質，且於許多的情況中，在無損失剩餘蛋白及/或其他區之功能下可加入、移除或轉移至其他蛋白。「抗體單一可變區」為包括抗體可變區之序列特性的摺疊多肽區。其因此係包括完整的抗體可變區及修飾的可變區，例如，其中一或多個環已被不具抗體可變區特性之序列取代，或抗體可變區已被截斷或包括 N-或C-端延伸，以及保留至少結合活性和全長區專一性之可變區的摺疊片段。

「免疫球蛋白單一可變區」一詞係指專一與抗原或表位結合，與不同的V區或區域無關之抗體可變區(V_H、V_HH、V_L)。免疫球蛋白單一可變區可以具有其他、不同可變區或可變區域之形式(例如同源或異源多聚體)存在，其中此其他區或區域並非與免疫球蛋白可變區結合之抗原所需(亦即，其中該免疫球蛋白單一可變區與抗原結合係與另外的可變區無關)。「區域抗體」或「dAb」係與「免疫球蛋白單一可變區」相同，其如同文中所用之術語，能與抗原相結合。免疫球蛋白單一可變區可為人類抗體可變區，但亦包括來自其他物種例如嚙齒類(例如，如WO 00/29004中所揭示)、護士鯊及駝科V_HH dAbs(奈米抗體)之單一抗體可變區。駝科V_HH為衍生自包括駱駝(camel)、大羊駝(llama)、羊駝(alpaca)、單峰駝(dromedary)和原駝(guanaco)物種之免疫球蛋白單一可變區多肽，其產生天然無輕鏈之重鏈抗體。此V_HH區域可根據可由本項技術取得之標準技術加以人源化，且此等區域根據本發明仍視為「區域抗體」。如文中所用，「V_H係包括駝科V_HH區。NARV為另一類型的免疫球蛋白單一可變區，其係在軟骨魚綱(包括護士鯊)中鑑別出。這些區域亦稱為新穎的抗原受體可變區(通常縮寫為V(NAR)或NARV)。就進一步的詳情請參見Mol.Immunol.(2006)44,656-665和US2005/0043519。

術語「mAbdAb」和「dAbmAb」用於文中係指包括至少一單株抗體和至少一單區域抗體之抗原-結合蛋白。二個術語可交換使用，且如用於文中係希望具有相同的意義。

通常，從宿主細胞蛋白純化重組多肽產生重組多肽的片段。申請人等已發現，當利用文中所述的純化方法時，重組多肽片段的量明顯減少。在一實施例中，溶離的重組多肽含有低於約10%，約9%，約8%，約7%，約6%，約5%，約4%，約3%，約2%或約1%破碎的重組多肽。在另外的實施例中，此重組多肽為一抗體且該溶離的抗體含有低於約10%，約9%，約8%，約7%，約6%，約5%，約4%，約3%，約2%，或約1%破碎的抗體。

ICOS抗體

如文中所用「ICOS」係指任何可誘發的T-細胞共刺激蛋白。ICOS(可誘發的T-細胞共刺激因子)的別名包括AILIM；CD278；CVID1、JTT-1或JTT-2、MGC39850或8F4。ICOS為一種表現在活化T細胞上的CD28-超家族共刺激分子。由此基因所編碼的蛋白屬於CD28和CTLA-4細胞-表面受體家族。其係形成同源二聚體並在細胞-細胞訊號傳遞、免疫反應和細胞增生調節上扮演重要角色。人類ICOS之胺基酸序列(同功型2)(登錄號：UniProtKB-Q9Y6W8-2)係如下述SEQ ID NO：9所示。

MKSGLWYFFLFCLRIKVLTGEINGSANYEMFIFHNGGVQILCKYPDIVQQFKMQLLKGGQILCDLTKTKGSGNTVSIKSLKFCHSQLSNNSVSFFLYNLDHSHANYYFCNLSIFDPPPFKVTLTGGYLHIYESQLCCQLKFWLPIGCAAFVVVCILGCILICWLTKKM(SEQ ID NO：9)

人類ICOS之胺基酸序列(同功型1)(登錄號：UniProtKB-Q9Y6W8-1)係如下述SEQ ID NO：10所示。

MKSGLWYFFL FCLRIKVLTG EINGSANYEM FIFHNGGVQI LCKYPDIVQQ FKMQLLKGGQ ILCDLTKTKG SGNTVSIKSL KFCHSQLSNN SVSFFLYNLD HSHANYYFCN LSIFDPPPFK VTLTGGYLHI YESQLCCQLK FWLPIGCAAF VVVCILGCIL ICWLTKKKYS SSVHDPNGEY MFMRAVNTAK KSRLTDVTL(SEQ ID NO：10)

經由與ICOS-L(B7RP-1/B7-H2)結合發生ICOS活化。B7-1及B7-2(CD28和CTLA4之配體)並不會結合或活化ICOS。然而，ICOS-L已顯現與CD28和CTLA-4二者微弱結合(Yao S et al.,“B7-H2 is a costimulatory ligand for CD28 in human”,Immunity,34(5)；729-40(2011))。ICOS之表現似乎受限在T細胞。ICOS表現程度隨著不同的T細胞亞群及T細胞的活化狀態而變。ICOS表現已顯現在休眠的TH17、T濾泡輔助(TFH)細胞和調節T(Treg)細胞上；然而，與CD28不同；其並不會高度表現在初始T_H1和T_H2效應子T細胞群族(Paulos CM et al.,“The inducible costimulator(ICOS)is critical for the development of human Th17 cells”,Sci Transl Med,2(55)；55ra78(2010))。ICOS表現係在經由TCR接合活化後，於CD4+和CD8+效應子T 細胞上高度引發(Wakamatsu E,et al.,“Convergent and divergent effects of costimulatory molecules in conventional and regulatory CD4+ T cells”,Proc Natal Acad Sci USA,110(3)；1023-8(2013))。經由ICOS受體之共刺激訊號傳遞僅在同時接受TCR活化訊號時發生(Sharpe AH and Freeman GJ.“The B7-CD28 Superfamily”,Nat.Rev Immunol,2(2)；116-26(2002))。在活化的抗原專一性T細胞中，ICOS係調節T_H1和T_H2細胞激素二者之產生，包括IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-4、IL-13和其他。僅管程度上比CD28低，但ICOS亦刺激效應子T細胞增生(Sharpe AH and Freeman GJ.“The B7-CD28 Superfamily”,Nat.Rev Immunol,2(2)；116-26(2002))。使用於疾病治療的ICOS抗體和方法已有描述，例如於WO 2012/131004、US20110243929、US20160304610和US20160215059中。US20160215059係以引用的方式併入文中。US20160304610中所描述的例示抗體包括37A10S71。37A10S713的重鏈、輕鏈和CDR序列係複製於下如SEQ ID Nos：11-18。

EVQLVESGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYWMDWVRQA PGKGLVWVSN IDEDGSITEY SPFVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTRWG RFGFDSWGQG TLVTVSS(SEQ.ID NO：11)

DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSLL SGSFNYLTWY QQKPGQPPKL LIFYASTRHT GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCHHHYNAPP TFGPGTKVDI K(SEQ.ID NO：12)

GFTFSDYWMD(SEQ.ID NO：13)

NIDEDGSITEYSPFVKG(SEQ.ID NO：14)

WGRFGFDS(SEQ.ID.NO：15)

KSSQSLLSGSFNYLT(SEQ.ID NO：16)

YASTRHT(SEQ.ID NO：17)

HHHYNAPPT(SEQ.ID NO：18)

術語「ICOS結合蛋白」如文中所用係指抗體和其他蛋白結構，例如能與ICOS結合的區域。在某些情況下，此ICOS為人類ICOS。術語「ICOS結合蛋白」可與「ICOS抗原結合蛋白」交換使用。因此，如在本項技術中所瞭解的，抗-ICOS抗體及/或ICOS抗原結合蛋白應視為ICOS結合蛋白。如文中所用，「抗原結合蛋白」為任何蛋白，包括，但不限於與抗原，例如ICOS結合之抗體、區域和其他文中所述的結構。如文中所用，ICOS結合蛋白之「抗原結合部分」應包括任何能與ICOS結合之ICOS結合蛋白的部分，其包括，但不限於抗原結合抗體片段。

在一實施例中，本發明之ICOS抗體包括任何一項或下列CDR之組合：

CDRH1：DYAMH(SEQ ID NO：1)

CDRH2：LISIYSDHTNYNQKFQG(SEQ ID NO：2)

CDRH3：NNYGNYGWYFDV(SEQ ID NO：3)

CDRL1：SASSSVSYMH(SEQ ID NO：4)

CDRL2：DTSKLAS(SEQ ID NO：5)

CDRL3：FQGSGYPYT(SEQ ID NO：6)

在某些實施例中，本發明之抗-ICOS抗體係包括與SEQ ID NO：7具有至少90%序列相同性之重鏈可變區。適當地，本發明之ICOS結合蛋白可包括與SEQ ID NO：7具有約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列相同性之重鏈可變區。

人源化重鏈(V _H )可變區(H2)：

QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFT DYAMHWVRQA PGQGLEWMGL　ISIYSDHTNY NOKFOGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCGRNN　YGNYGWYFDV WGQGTTVTVS S(SEQ ID NO：7)

在本發明一實施例中，ICOS抗體係在具有如SEQ ID NO：8中所述的胺基酸序列之輕鏈可變區中包括CDRL1(SEQ ID NO：4)、CDRL2(SEQ ID NO：5)和CDRL3(SEQ ID NO：6)。具有如SEQ ID NO：8中所述的人源化輕鏈可變區之本發明ICOS結合蛋白係以「L5」表示。因此，包括SEQ ID NO：7之重鏈可變區和SEQ ID NO：8之輕鏈可變區的本發明ICOS結合蛋白在文中可以H2L5表示。在文中的實例中，mAb5係包括SEQ I DNO：7之重鏈可變區和SEQ ID NO：8之輕鏈可變區。

在某些實施例中，本發明之ICOS結合蛋白係包括與SEQ ID NO：8中所示的胺基酸序列有至少90%相同性之輕鏈可變區。適當地，本發明之ICOS結合蛋白可包括與SEQ ID NO：8具有約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列相同性之輕鏈可變區。

人源化輕鏈(V _L )可變區(L5)

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSASSSVS　YMHWYQQKPG QAPRLLIYDT　SKLASGIPAR FSGSGSGTDY TLTISSLEPE DFAVYYCFQGSGYPYTFGQG TKLEIK(SEQ ID NO：8)

CDR或最小結合單位可藉由至少一個胺基酸取代、刪除或添加作修飾，其中變體抗原結合蛋白實質上係保留未修飾蛋白，例如包括SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8之抗體的生物特性。

應了解，各CDR H1、H2、H3、L1、L2、L3可單獨經修飾或與任何其他CDR以任何排列或組合加以組合。在一實施例中，一CDR係經取代、刪除或添加至高3個胺基酸，例如1或2個胺基酸，例如1個胺基酸作修飾。典型地，此修飾為一取代作用，特別是保守性取代，例如，如下表1中所示。

抗體的亞型部分決定了第二效應子功能，例如補體活性或Fc受體(FcR)結合和抗體依賴的細胞毒性(ADCC)(Huber,et al.,Nature 229(5284)：419-20(1971)；Brunhouse,et al.,Mol Immunol 16(11)：907-17(1979))。在鑑別就特定應用之最佳抗體類型中，抗體的效應子功能可列入考量。例如，hIgG1 抗體具有相當長的半衰期，在固定補體上非常有效，且其係與FcγRI和FcγRII二者結合。相反的，人類IgG4抗體具有較短的半衰期，無法固定補體且對FcRs具有較低的親和力。在IgG4的Fc區中以脯胺酸(S228P)替代絲胺酸228降低了hIgG4所觀察到的異質性並延長血清半衰期(Kabat,et al.,“Sequences of proteins of immunological interest”5.sup.thEdition(1991)；Angal,et al.,Mol Immunol 30(1)：105-8(1993))。以麩胺酸(L235E)替代白胺酸235之第二突變消除了殘餘FcR結合和補體結合活性(Alegre,et al.,J Immunol 148(11)：3461-8(1992))。由二種突變所產生的抗體係稱為IgG4PE。hIgG4胺基酸之編碼係衍生自EU編碼參照：Edelman,G.M.et al.,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969).PMID：5257969。在本發明一實施例中，此ICOS抗體為IgG4同型。在一實施例中，此ICOS抗體係包括一包含S228P和L235E取代之IgG4 Fc區，可用IgG4PE表示。在文中的實例中，mAb5係包括一包含S228P和L235E突變之IgG4 Fc區。

如文中所用，「ICOS-L」和「ICOS配體」可交換使用且係指人類ICOS之膜結合天然配體。ICOS配體為一種在人類中由ICOSLG基因編碼之蛋白。ICOSLG已被定名為CD275(分化群275)。ICOS-L的別名包括B7RP-1和B7-H2。

宿主細胞蛋白

「雜質」係指在超級抗原層析之前存在承載樣本中或在超級抗原層析後存在溶離液中之任何外來或不欲的分子。可能有「製程雜質」存在。這些係由於在製造感興趣蛋白之製程中所存在的雜質。例如，這些包括宿主細胞蛋白(HCP)、RNA和DNA。「HCP」係指與感性趣蛋白無關，由宿主細胞在細胞培養或發酵期間所產生的蛋白，包括細胞內及/或分泌的蛋白。宿主細胞蛋白之實例有蛋白酶，若其在純化期間或之後仍存在的話，可能對感興趣蛋白造成損害。例如，若蛋白醇留在包括感興趣蛋白的樣本中，則其可能產生非原來存在的產物-相關物質或雜質。蛋白酶的存在可能造成衰變，例如感興趣蛋白在純化處理期間及/或在最終的調配物中隨時間發酵。

在一實施例中，宿主細胞蛋白係由哺乳動物細胞或細菌細胞所產生/衍生。在另一實施例中哺乳動物細胞係選自人類或鼠科(例如倉鼠或小鼠)細胞。又在另一實施例中，此人類細胞為HEK細胞，此倉鼠細胞為CHO細胞或此小鼠細胞為NS0細胞。

在特定的實施例中，宿主細胞蛋白係由下列組成之群中選出：CHO細胞、NS0系細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、K562細胞、BHK細胞、PER.C6細胞和HEK細胞(亦即宿主細胞蛋白係衍生自這些宿主)。另一種選擇，此宿主細胞蛋白可為由下列組成之群中選出的細菌細胞：大腸桿菌(E.coli)(例如W3110,BL21)、枯草桿菌(B.subtilis)及/或其他適合的細菌；真核細胞，例如真菌或酵母菌細胞(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、麴菌屬(Aspergillus sp.)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、粉色麵包黴菌(Neurospora crassa)。

「溶液」可為細胞培養基，例如細胞培養進料流。此進料流可經過濾。此溶液可為澄清未處理培養液(CUB)(或澄清發酵培養液/上清液)。此CUB已知為藉由澄清移除任何細胞及/或細胞片段之細胞培養上清液。此溶液可為表現此蛋白之細胞的解離製備物(例如溶液為一解離液)。

製程雜質亦包括用於生長細胞或確保感興趣蛋白表現之組份，例如溶劑(用於培養酵母菌細胞的甲醇)、抗生素、甲胺喋呤(MTX)、媒劑組份、凝聚劑等。亦包括在步驟之前滲入樣本中，為超級抗原固相之部分的分子，例如A蛋白、G蛋白或L蛋白。

雜質亦包括「產物-相關變體」，其係包括保留其活性但其結構上不同之蛋白，及因為其結構上的差異已喪失活性的蛋白。這些產物-相關變體包括，例如高分子量物類(HMW)、低分子量物類(LMWs)、聚集蛋白、前驅物、降解蛋白、錯誤摺疊蛋白、雙硫鍵結鍵結的蛋白和去醯胺化的物類。

可測量溶離物中任何一項這些雜質的存在以確立清洗步驟是否成功。例如，吾等已顯示HCP的量下降，以每毫克(mg)產物之ng HCP表示(參見實例)。另一種選擇，偵測到的HCP可以等同ng/mg之「百萬分之一」或「ppm」，或等同pg/mg之「ppb」(「十億分之一」)表示。

在一實施例中，步驟(c)之後，HCP的量係低於約200ng HCP/每mg產物(亦即ng/mg)；低於約150ng/mg；低於約100ng/mg；低於約50ng/mg；或低於約20ng/mg。

當相較於無脂肪系羧酸鹽之對照清洗步驟時，及/或當相較於純化前的溶液時(例如澄清未處理培養液)，亦可能顯示下降低。

在一實施例中，在步驟(c)之後HCP的相對折減因數-相較於先前所公開的100mM辛酸鹽清洗液(參見，例如2014/141150)-為約2-倍至約50-倍。因此，在一實施例中，相較於基本上由100mM辛酸鹽所組成的清洗緩衝液，在步驟(c)之後HCP的相對折減因數為約2-倍至約50-倍。在另一實施例中，相對折減因數為至少約2-倍、5-倍、10-倍、15-倍、20-倍、25-倍、30-倍、35-倍、40-倍、45-倍或50-倍。為了避免疑慮，有關「基本上由100mM辛酸鹽所組成的清洗緩衝液」不排除有不會對100mM辛酸鹽清洗液之鹼性特徵有重大影響之組份存在，例如緩衝鹽類及/或乙酸鈉。

在一實施例中，在本發明清洗步驟之後，從溶離液回收的感興趣蛋白為100%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、70%、60%、50%或更低，包括在100%至50%範圍內的任何離散值或在此範圍內之成對離散值所定義的任何子範圍，在一實施例中，從溶離液回收的感興趣蛋白係大於70%，例如75%、80%、85%、90%95%或99%。溶離液中的回收百分比(%)係藉由測定溶離液中感興趣蛋白之量為載入管柱之感興趣蛋白的百分率，依照下列方程式所計算：回收百分比=溶離液中產物的量÷載入管柱中產物的量X 100

存在溶離液中雜質(亦即宿主細胞蛋白)的量可藉由ELISA、OCTET或其他方法來測定一或多種上述雜質之量。在文中所述的實例中，係使用ELISA法來測定樣本中HCP的量。

在一實施例中，宿主細胞蛋白係選自PLBL2(類磷脂酶B 2蛋白)及/或組織蛋白酶L(cathepsin L)。

在一實施例中，此宿主細胞蛋白為PLBL2。因此，在本發明一方面係提供從類磷脂酶B 2蛋白(PLBL2)純化重組多肽的方法，該方法係包括：(a)將包括重組多肽和PLBL2之溶液施用於超級抗原層析固體載體；(b)以包括約150mM至約850mM辛酸鹽的清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離重組的多肽。

在本發明另外的方面，係提供從類磷脂酶B 2蛋白(PLBL2)純化重組多肽的方法，該方法係包括：(a)將包括重組多肽和PLBL2之溶液施用於超級抗原層析固體載體，(b)以包括約55mM至約850mM辛酸鹽和約0.25M至約1.5M精胺酸的清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離重組的多肽。

在本發明另外的方面，係提供從類磷脂酶B 2蛋白(PLBL2)純化重組多肽的方法，該方法係包括：(a)將包括重組多肽和PLBL2之溶液施用於超級抗原層析固體載體，(b)以包括約100mM辛酸鹽和約1.1M精胺酸的清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離重組的多肽。

已發現PLBL2為在下游抗體處理期間難以移除的HCP雜質，特別是mAb5(參見實例)，由於與產物分子表觀結合。因此，在一實施例中此重組的多肽為抗體，例如IgG抗體，特別是IgG4抗體。PLBL2量可使用本項技術中已知的方法來測量，例如藉由ELISA，例如實例中所述或WO2015/038884中所揭示的PLBL2-專一性ELISA，組織蛋白酶L(Cathepsin L)蛋白酶係在CHO細胞培養其間所產生，且其可能降解抗體，例如mAb3產物分子(參見實例)。因此，在一實施例中，此重組多肽為一抗體，例如IgG抗體，特別是IgG1抗體。

在一實施例中此宿主細胞蛋白為組織蛋白酶L。在此實施例中，從組織蛋白酶L純化重組多肽可藉由步驟(c)溶離液中降低的組織蛋白酶L活性來測量(例如以PromoKine PK-CA577-K142)。

在本發明一方面，係提供從組織蛋白酶L純化重組多肽的方法，該方法係包括：(a)將包括重組多肽和組織蛋白酶L之溶液施用於超級抗原層析固體載體，(b)以包括約150mM至約850mM辛酸鹽的清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離重組的多肽。

在本發明另外的方面，係提供從組織蛋白酶L純化重組多肽的方法，該方法係包括：(a)將包括重組多肽和組織蛋白酶L之溶液施用於超級抗原層析固體載體，(b)以包括約55mM至約850mM辛酸鹽和約0.25M至約1.5M精胺酸的清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離重組的多肽。

在本發明另外的方面，係提供從組織蛋白酶L純化重組多肽的方法，該方法係包括：(a)將包括重組多肽和組織蛋白酶L之溶液施用於超級抗原層析固體載體，(b)以包括約150mM辛酸鹽和約1.1M精胺酸的清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離重組的多肽。

在本發明一方面，係提供藉由其中一種文中所定義的純化法所得到的純化重組多肽。

本發明現在將參照下列非限定實例加以描述。

聚山梨醇酯降解

聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80為廣泛用於最終調配物產品中安定蛋白醫藥的非離子界面活性劑。聚山梨醇酯可被醫藥產物中殘餘的酵素降解，其可能影響產品的最終保存期限。不希望受限於理論，文中所述的方法係藉由減少最終產物中殘餘的宿主細胞蛋白來減低降解的聚山梨醇酯之量。在一實施例中，降解的聚山梨醇酯之量係低於約50%，約40%，約30%，約20%，約10%，約5%，約4%，約3%，約2%或約1%。

實例1：篩選和最適化A蛋白清洗液中的pH和辛酸鹽濃度 導論

在文中所述的操作中係將A蛋白清洗液最適化以達到對所有產物mAb以雙-管柱處理(A蛋白接著陰離子交換)有效移除HCP。現有的平台法常常需要第二精緻純化步驟以達到所要求的HCP程度。刪減一層析步驟簡化了此方法，且可減輕設備帶來的風險。清洗液最適化的策略係藉由破壞HCP-mAb相互作用來提升HCP清除。篩選各種清洗液添加劑和清洗液pH及然後通過A蛋白程序就總HCP移除最適化。

材料與方法

正辛酸鈉、冰乙酸、乙酸鈉、氫氧化鈉、苯甲醇和trizma鹼係購自Sigma-Aldrich Chemical Co.(St.Louis,MO)。使用進一步使用Millipore Milli-Q®系統純化的水來配製溶液。使用3M tris鹼或3M乙酸來進行任何pH調整。

用於mAb製造之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞培養

澄清未過濾培養液(CUB)係含有數種GSK mAb產品，例如mAb1(IgG1,pI=8.7,MW=149kDa)、mAb2(IgG1,pI=8.3,MW=149kDa)、mAb3(IgG1,pI=7.9,MW=149kDa)、mAb4(IgG1,pI=8.6,MW=148kDa)或mAb5(IgG4,pI=7.1,MW=145kDa)其中之一。mAb5係包括SEQ ID NO：7的重鏈可變區和SEQ ID NO：8的輕鏈可變區並包括一含有S228P和L235E突變之IgG4 Fc區。使用類似的方法製造和收取用於本研究的所有mAb。例如，mAb1係藉由將mAb1-表現DG44細胞以1.23-1.24MM/mL的活細胞數及~93.8%的存活性，植入2公升的反應器中。然後將培養維持在~34℃、pH~6.9和6g/L的葡萄糖歷時16天。攪動速率維持在~300rpm。培養後，將未澄清的細胞和含mAb的培養液以10,000g分批離心20分鐘。然後將培養液經由Nalgene之0.45μM和0.2μM SFCA過濾器，真空過濾。

A蛋白純化

將來自GE Healthcare之MabSelect SuRe^TM(MSS)A蛋白樹脂充填入0.5cm直徑的管柱至25cm的最終柱床高度。待重力沉降後，以0.4M NaCl使用ÄKTA Avant 25於475cm/hr的直線流速，將樹脂流動充填2小時。充填品質係以注射100μL的2M NaCl評估來確認不對稱性為1.0 +/- 0.2及每公尺至少1000盤。所有的A蛋白實驗使用35mg mAb/mL樹脂之承載率且所有處理流速係等於300cm/hr的線性速度。A蛋白層析法和緩衝液係如表2中所述。

清洗液最適化

先前的研究已顯示，許多難以移除的HCP雜質係直接與mAb連結(Levy et al.,(2014)Biotechnol.Bioeng.111(5)：904-912；Aboulaich et al.,(2014)Biotechnol.Prog.30(5)：1114-1124)；可能提供破壞HCP-mAb相互作用的溶液條件來提升A蛋白清洗步驟期間的HCP清除並在此操作中篩選各種清洗溶液及針對此目的作最適化。特言之，在載入樣本從A蛋白-吸附的mAb清除HCP之後，於溶離前，使用含有不同濃度辛酸鹽之各種pH的清洗溶液。為了評估和定量各清洗液的HCP移除效能，係如下文ELISA法章節中所述開發一內部HCP ELISA。先前已發現，當用於A蛋白清洗液中時，辛酸鈉提供強大的HCP清除。然而，先前的研究將辛酸鹽濃度限制在100mM以下及pH 7.5；在起初的範圍研究之後接著一個球形中央合成設計研究用來定性辛酸鈉A蛋白清洗在整個濃度範圍和pH之行為。這些設計係如下表3和4中所示。統計模型試驗係根據下面章節的統計分析法完成。

分析 A蛋白產率

A蛋白產率係藉由使用Nanodrop 2000c(Thermo Scientific)測量溶離液中的mAb濃度所測定。將各溶離液樣本的3個Nanodrop讀數平均，測定蛋白濃度；A蛋白溶離液中總mAb含量係藉由將mAb濃度乘以溶離液體積(從層析圖測定)所計算。承載的mAb濃度係使用POROS^® A 20μM管柱於Agilent 1100系列HPLC上測定。就各特定的mAb，係將各CUB樣本於分析式A蛋白上之原始數據與已知濃度的標準相比較，用以計算效價。將總承載體積乘以所測量的效價，計算承載的mAb總質量，產率係以溶離液中的總mAb除以承載的總mAb來計算。

宿主細胞蛋白(HCP)濃度測量：HCP ELISA

內部開發一使用HCP ELISA之宿主細胞蛋白分析，用以定量CHO-衍生的產物樣本中致免疫HCP的總量(Mihara et al.,(2015)J.Pharm.Sci.104：3991-3996)。此HCP ELISA係使用習知的山羊抗-CHO HCP多株抗體及內部製造的HCP參照標準就整個CHO-衍生的產物之多產物用途所開發。

統計分析

為了根據HCP清除和產率來分析清洗效能，係進行一範圍實驗和中央合成設計研究。二種因數係量裁為-1，將1單位規模和廣義線性模型與數據擬合。一旦選定最終模型，則評估殘差上的模型假設及若適當進行轉換。所有的模型項係按5%顯著水準作評估並進行向後消去，由全模型開始，包括所有二次因數項。

MabSelect SuRe平衡等溫測量

將MabSelect SuRe^TM樹脂進行緩衝液交換成去離子水，產生~50%漿液。將漿液加入ResiQuot，以內部真空線乾燥，及將20.8μL樹脂塞分散於96-孔深孔盤。在一個別的96-孔盤中，製作介於0至10mg/mL含有100、250和500mM辛酸鈉的蛋白溶液。測量各溶液的蛋白濃度，接著加入1mL至各樹脂塞。將樹脂-蛋白混合物以攪拌平衡至隔夜。以直接過濾至一UV 96-孔盤移除樹脂，並測量最終濃度。吸附的蛋白濃度q係依照下列方程式所計算：

結果和討論

本章節所示的結果顯現高濃度辛酸鈉(>100mM)在A蛋白層析期間，明顯比以前公開的辛酸鈉基底之A蛋白清洗緩衝液移除更多的宿主細胞蛋白(HCP)。此項係使用數種mAb以相當高量的HCP作為模型來驗證並藉由統計實驗設計來確認；受試的mAb之CUB(A蛋白承載)具有介於10⁶至10⁷ng/mg之HCP濃度。

此項工作的主要目標為評估清洗緩衝液之辛酸鈉濃度和pH在整個A蛋白層析步驟中對HCP清除的影響。主要目標為2-倍。首先請瞭解整個操作範圍的辛酸鈉濃度和pH對HCP的影像。使用一範圍設計來探索二種參數的整體範圍(表3)；最大辛酸鈉濃度為1M，而pH範圍為7-9。第二個目標為最適化用於HCP清除的辛酸鈉濃度和pH，同時維持可接受的步驟產率。使用一球形中央合成設計(CCD，表4)進行此項最適化。範圍和CCD研究二者係使用mAb1作為模型mAb。將這些最初研究的發現結果以另外的mAb進行檢測。範圍和CCD之結果係如下所示。

從CCD研究所得到的結果係如表5中所示。整體而言，A蛋白清洗緩衝液的pH對HCP清除影響輕微。在整個受試的pH範圍中，含有500mM或750mM辛酸鈉的清洗液具有幾乎相同的HCP量。如方法章節中所述，進行統計分析。簡言之，將個別模型與各反應(產率和HCP)擬合，並將各模型項目按5%顯著性使用F-試驗(F-test)作評估。F-試驗確認了清洗液pH對HCP濃度並不具有統計上顯著效應。類似的分析亦確認了pH並非產率%之顯著因數。

CCD的統計分析結果確認了辛酸鈉濃度-以線性及二次項-對於HCP清除和產率百分比為一顯著因數。當辛酸鈉濃度從0增加至1M時，HCP濃度(ng/mg)下降二個數量級(圖1-產率百分比(三角形▲)和HCP濃度(正方形■))。然而，當辛酸鈉濃度增加超過250mM，產率從超過90%下降至70%(圖1)。此超過250mM之步驟產率的大幅下降可能是由於形成辛酸鹽微胞。A蛋白清洗緩衝液中辛酸鹽臨界微胞濃度(CMC)經實驗測定為340mM。當辛酸鹽濃度從250mM增加至500mM時，產率下降15%而HCP僅下降2.8%。此項指出，游離形式的辛酸鹽為移除HCP的有效形式，而任何超過CMC的濃度顯示產量減少，因為辛酸鹽微胞造成產量流失。

實例2：產量流失及可能的疏緩策略之研究

超過CMC的產率百分比下降顯示，辛酸鹽微胞-而非游離形式的辛酸鹽-可能降低整個A蛋白步驟的產率。為了測定產率流失之性質，係就帶有各種辛酸鈉清洗液之A蛋白處理，測量溶離液、剝離液和清洗溶離份中mAb的濃度(圖2)。此項結果驗證了在高辛酸鹽濃度時之產率流失係由於清洗步驟期間的去吸附所致。

為了進一步找出高辛酸鈉清洗期間產率流失的特性，係測量平衡結合等溫線以測定在高的辛酸鈉濃度時之mAb能力損失(圖3)。先前公開的辛酸鹽清洗液-含有100mM辛酸鈉-當與朗繆爾等溫線擬合時，具有57g/L的最大結合能力。在250mM辛酸鈉時，吸附等溫線相類似，但在500mM辛酸鈉時朗繆爾等溫線則擬合度差。此項結果確認了高濃度的辛酸鹽清洗液降低了A蛋白樹脂之結合能力並導致產率流失。

在測定產率流失的來源後，研究降低產率流失的方法。研究的二種策略為降低清洗液體積和降低承載比率。以4、6和8CV檢測250mM辛酸鈉清洗液。將清洗長度從8CV降低至4CV僅提供增加2%產率(表6)，而HCP濃度僅從31.0ng/mg增加至35.8ng/mg。此項係顯示高辛酸鈉清洗液，以小於起初範圍和CCD研究期間所檢測的體積，可達到可接受的HCP量，且其亦驗證了較小的清洗液體積無法彌補高辛酸鈉濃度之下降的結合能力。

亦研究在A蛋白捕捉期間降低承載比率作為疏緩高濃度辛酸鈉清洗液期間的產率流失(表7)。當承載比率從30mg/ml下降至10mg/ml時，就250 mM和500mM辛酸鈉清洗液，產率分別增加4.7%和7.7%。承載比率對A蛋白溶離液中的HCP濃度影響輕微。

實例3：另外mAb之提升的清洗液效能

僅使用mAb1作為模型產物完成先前的A蛋白清洗液最適化研究。CCD研究確認了pH並非HCP移除的顯著因數。統計分析和後續的產率研究指出，辛酸鈉濃度最佳至高400mM。為了確認250mM辛酸鈉清洗液之提升HCP移除優於先前所開發的100mM辛酸鹽清洗液，在本章節中進行另外的mAb研究。就含有100或250mM辛酸鈉之清洗液，將5種mAb之A蛋白溶離液中HCP濃度作比較(圖4)。一種mAb(mAb3)係源自二種個別的上游處理：較高量的HCP之高細胞密度處理及與其他分子研究相當的標準處理。

當使用250mM辛酸鹽清洗液時，除了mAb2之外，本處所有的受試mAb在A蛋白溶離液中具有低於100ng/mg。在大部分的情況下，僅藉由增加清洗液中的辛酸鈉濃度，HCP濃度即提升大約一個數量級。另外，以提高的辛酸鈉濃度，這些mAb具有可接受的步驟產率和產物品質。

實例4：添加精胺酸至辛酸鈉為基底的A蛋白清洗液

精胺酸-一種胺基酸-具有相較於辛酸鈉(一種脂肪酸)非常不同的物理和化學性質。假設這二種添加劑間的結構差異可能導致正交的HCP移除機制，亦即精胺酸和辛酸鹽混合物可能比僅含有單一組份之清洗液具有更佳的HCP移除。進行下列研究，就辛酸鹽/精胺酸混合物評估總HCP移除和特定的HCP移除二者。

辛酸鹽/精胺酸A蛋白清洗緩衝液之總HCP清除

以mAb1和mAb2檢測含有辛酸鹽鈉和精胺酸組和物的A蛋白清洗緩衝液。mAb2的結果係如圖5所示。僅含有100mM辛酸鈉或750mM精胺酸的A蛋白清洗緩衝液造成介於700至1300ng/mg.的HCP濃度。辛酸鈉濃度增加至250mM造成HCP清除大大提升-與前文中所論述的「高辛酸鈉」結果一致。含有250mM辛酸鈉pH 8.5的清洗液造成A蛋白溶離液中273ng/mg HCP。添加精胺酸至辛酸鹽為基底的A蛋白清洗液進一步提升HCP移除：250mM辛酸鈉與750mM精胺酸pH 7.5或8.5分別造成209和144ng/mg之HCP濃度。

以mAb1進行類似的辛酸鹽/精胺酸研究。mAb1係源自二種個別的上游處理：一「標準的」批式給料生物反應器和高細胞密度處理。高細胞密度處理造成較高的產物效價及HCP濃度。其係包括在本研究中最為「最壞案例」給料物。結果係如圖6所示。

整體而言，mAb1結果係與圖5中所示的mAb2發現相似。就標準的mAb1進料流和高密度材料，藉由將辛酸鈉從100增加至250mM提升HCP清除。另外，500mM精胺酸比僅含辛酸鈉的清洗液具有較佳的HC清除。然而，以辛酸鈉和精胺酸二者清洗-作為混合物或先後施用於清洗液-顯現優於個別組份之提升的HCP清除。最佳效能為含有250mM辛酸鈉和750mM精胺酸pH 8.5的清洗液。此高辛酸鈉和精胺酸的組合就高密度和標準mAb1分別產生113和67ng/mg之A蛋白溶離液。

實例5：辛酸鹽/精胺酸A蛋白清洗液移除PLBL2

PLBL2為一種特定的HCP雜質，其由於與產物分子表觀結合因此在mAb5(一種IgG4)下游處理期間難以移除。mAb5係包括SEQ ID NO：7的重鏈可變區和EQ ID NO：8之輕鏈可變區，以及包括一包含S228P和L235E突變的IgG4 Fc區。此特別的雜質之前已發現係在下游處理期間與IgG4產物結合。PLBL2亦在HCP ELISA分析期間造成「稀釋性非線性」。在mAb5之A蛋白步驟期間以含有高辛酸鈉濃度及/或精胺酸的A蛋白清洗液檢測PLBL2移除。

以辛酸鈉濃度至高750mM，pH從7.5至8.5，及精胺酸濃度至高1M檢測清洗液。就各A蛋白清洗液試驗，提出的報告為總PLBL2濃度(圖7，使用PLBL2-專一性ELISA測量)以及總HCP(圖8)和步驟產率(圖9)。

就不同受試的清洗液，PLBL2濃度從近乎1至600ng/mg。不含有精胺酸及低於100mM辛酸鈉的清洗液表現最差且產生帶有大約600ng/mgPLBL2的A蛋白溶離液。辛酸鈉濃度增加至250mM，PLBL2下降至~100ng/mg；辛酸鈉濃度大於250mM持續將PLBL2下降至~50ng/mg，但亦造成產率流失。總HCP一般亦隨著辛酸鈉增加而下降。

含有精胺酸的A蛋白清洗液就PLBL2清除而言為最成功，且其亦展現良好的總HCP移除。1000mM精胺酸不含有辛酸鈉產生~10ng/mg PLBL2和62ng/mg HCP。高濃度精胺酸並不會顯著造成顯著的產率流失。

對於mAb5，辛酸鈉和精胺酸的組合為最有效的清洗液。特言之，250mM辛酸鈉與1M精胺酸在pH 7.5或8.5造成2-3ng/mg PLBL2和~20-30ng/mg HCP，同時保持~90%步驟產率。含有1M精胺酸和100mM辛酸鈉之清洗液亦為成功的，但造成稍高的PLBL2和HCP濃度。

實例6：用於降低組織蛋白酶L(Cathepsin L)活性之辛酸鹽/精胺酸清洗液

以mAb3檢測含有辛酸鈉和精胺酸的A蛋白清洗液的組織蛋白酶L清除能力。cathepsin L蛋白酶係在CHO細胞培養期間所產生且其可能降解mAb3產物分子。在A蛋白處理期間已展現無法移除組織蛋白酶L。就含有100mM辛酸鈉、250mM辛酸鈉、100mM辛酸鈉與1000mM精胺酸，以及100mM辛酸鈉與750mM離胺酸的清洗液進行試驗。

含有250mM辛酸鈉的清洗液對此特定的產物造成意外的的A蛋白溶離行為：低pH溶離-正常以~2個管柱體積來進行-延展超過10個管柱體積。另外，當以250mM辛酸鈉試驗時，mAb3的A蛋白溶離液具有非常高的聚集物(以SEC測量)。此行為在任何以高辛酸鈉清洗液試驗的其他產物中並未觀察到。

含有精胺酸活離胺酸的A蛋白清洗液並不具有此延展的溶離行為，其僅在250mM辛酸鈉中觀察到。就三種不同的清洗液(100mM辛酸鹽(「平台mss樹脂溶離液」)；250mM辛酸鹽、1M精胺酸(「辛酸鹽/精胺酸mss樹脂溶離液」)；250mM辛酸鹽、750mM離胺酸(「辛酸鹽/離胺酸mss樹脂溶離液」))，在A蛋白溶離液中測量到的組織蛋白酶L活性係記述於圖10中；A蛋白溶離體積係列於表8中。100mM辛酸鈉、1000mM精胺酸清洗液所測量到的活性顯著下降，及一後續的安定性研究顯現，使用此清洗液所製備的材料，相較於100mM辛酸鈉清洗液，其片段降低。添加750mM離胺酸而非精胺酸，成功地降低大量溶離體積，但並未顯著降低組織蛋白酶L活性。辛酸鈉和1000mM精胺酸的組合提供提升的組織蛋白酶L和總HCP清除，同時維持合理的溶離體積及可接受的產物品質屬性。

實例7：辛酸鹽/精胺酸A蛋白清洗液移除HCP

以mAb3試驗含有辛酸鈉和精胺酸之A蛋白清洗液的HCP清除能力。清洗緩衝液濃度和所生成的HCP濃度係概述於下表9中。就mAb3將精胺酸/辛酸鹽清洗液與僅含有辛酸鹽的清洗液相比較。

150mM辛酸鹽清洗液提供明顯比100mM辛酸鹽清洗液更高的HCP清除。1.1M精胺酸和150mM辛酸鹽的組合以顯著因數進一步提升HCP 清除。在A蛋白步驟期間提升HCP清除能免除在僅含辛酸處理中所需要的最終精緻純化層析步驟。

實例8：減少mAb3片段

以含有辛酸鈉和精胺酸之清洗液的mAb3之A蛋白純化檢測純化期間的抗體片段。產生的數據(圖11-13)，包括3批含有100mM辛酸鹽清洗液的清洗緩衝液，及2批含有150M辛酸鹽加上1.1M精胺酸的清洗緩衝液。

圖11係顯示整個下游處理期間抗體片段的百分比(以SEC HPLC測量)。圖12係顯現整個過程的HCP濃度。辛酸鹽/精胺酸批次在處理期間並無顯著的抗體片段形成，而僅含辛酸鹽的批次在第三次精緻純化步驟(使用辛酸鹽/精胺酸清洗液者不需要)之後具有明顯的抗體片段產生。

此外，比較由二種方法(僅含辛酸鹽以及辛酸鹽+精胺酸)所產生的原料藥物質之安定性。來自辛酸鹽+精胺酸處理之原料藥物質在25℃下10天內並無產生抗體片段；來自僅含辛酸鹽處理之原料藥物質在25℃下10天期間產生顯著的抗體片段(圖13)。

在整個下游處理中由於組織蛋白酶L的清除提升，清洗緩衝液中辛酸鹽和精胺酸的組合顯著降低抗體片段的產生。

結論

整個A蛋白步驟係藉由修改清洗緩衝液，將HCP-mAb的相互作用最小化而最佳化HCP清除。起初的篩選研究結論出A蛋白清洗緩衝液的pH-從7至9-並不會顯著影響HCP清除或步驟產率。辛酸鈉濃度對步驟產率和HCP移除二者皆具有強力效應。非常高的辛酸鈉濃度(超過CMC)HCP清除為最佳，但步驟產率非常低。此研究發現，相較於先前使用100mM辛酸鈉清洗液，利用含有250mM辛酸鈉的A蛋白清洗液提供HCP清除較大的提升，同時維持可接受的步驟產率。此研究亦發現，相較於僅含辛酸鈉的清洗液，含有250mM辛酸鈉和500-1000mM精胺酸組合之A蛋白清洗液具有較大的HCP清除。發現，含有辛酸鈉和精胺酸的A蛋白清洗液-分別從mAb3和mAb5-成功地移除組織蛋白酶L和PLBL2-二種特別困難的HCP雜質。

應了解，文中所述的實施例可適用本發明所有方面。再者，本說明書中所引述的所有出版刊物，包括(但不限於)專利和專利申請案，係以引用的方式併入文中如同闡述全文。

<110> 英商葛蘭素史克智慧財產發展有限公司

<120> 純化抗體之方法

<130> PU66535

<150> 62/639592

<151> 2018-03-07

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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

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Claims

一種從宿主細胞蛋白(HCP)純化重組多肽之方法，該方法包括：(a)將包括重組多肽和HCP之溶液施用於超級抗原層析固體載體，(b)以包括辛酸鹽和精胺酸的清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離重組的多肽，其中該重組多肽為抗-ICOS抗體或其抗原結合片段。
根據請求項1之方法，其中該清洗緩衝液係包括大於約50mM辛酸鹽和大於約0.5M精胺酸。
根據請求項1或2之方法，其中該抗-ICOS抗體係包括一或多個：如SEQ ID NO：1中所述之CDRH1；如SEQ ID NO：2中所述之CDRH2；如SEQ ID NO：3中所述之CDRH3；如SEQ ID NO：4中所述之CDRL1；如SEQ ID NO：5中所述之CDRL2及/或如SEQ ID NO：6中所述之CDRL3，或各CDR之直接同等物，其中直接同等物在該CDR中係具有不超過二個胺基酸取代。
根據請求項1至3任一項中之方法，其中該抗-ICOS抗體係包括一V _H區，該區係包含與SEQ ID NO：7中所示的胺基酸序列為至少90%相同之胺基酸序列，及/或一V _L區，該區係包含與SEQ ID NO：8中所述的胺基酸序列為至少90%相同之胺基酸序列，其中該抗-ICOS抗體係專一與人類ICOS結合。
根據請求項1至4任一項中之方法，其中該抗-ICOS抗體為一ICOS促效劑。
根據請求項1至5任一項中之方法，其中該辛酸鹽為辛酸鈉。
根據請求項1至6任一項中之方法，其中該清洗緩衝液係包括約75mM至約300mM辛酸鹽。
根據請求項1至7任一項中之方法，其中該清洗緩衝液係包括約0.75M至約1.5M精胺酸。
根據請求項1至8任一項中之方法，其中該HCP係衍生自哺乳動物細胞。
根據請求項1至9任一項中之方法，其中該HCP為類磷脂酶B 2蛋白。
根據請求項1至10任一項中之方法，其中該清洗緩衝液的pH係介於pH 7至pH 9。
根據請求項1至11任一項中之方法，其中該清洗緩衝液的pH係介於pH 7.5至pH 8.5。
根據請求項1至12任一項中之方法，其中該抗-ICOS抗體為一單株抗體(mAb)。
根據請求項1至13任一項中之方法，其中該抗-ICOS抗體為IgG1或IgG4。
根據請求項1至14任一項中之方法，其中該抗-ICOS抗體為IgG4。
根據請求項1至15任一項中之方法，其中該超級抗原係由A蛋白、G蛋白和L蛋白組成之群中選出。
根據請求項1至16任一項中之方法，其中在步驟(c)之後，HCP的量係低於約200ng HCP/每mg產物。
一種從類磷脂酶B 2蛋白純化抗-ICOS抗體或或其抗原結合片段之方法，該方法係包括：(a)將包括抗-ICOS抗體或其抗原結合片段及類磷脂酶B 2蛋白之溶液施用於超級抗原層析固體載體，(b)以包括約100mM辛酸鈉和約1.1M精胺酸的清洗緩衝液清洗該超級抗原層析固體載體；及(c)從超級抗原層析固體載體溶離抗-ICOS抗體或其抗原結合片段。