CN113975385A - 新型双特异性抗cd3/cd20多肽复合物配制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种含有第一抗原结合部分和第二抗原结合部分的新型双特异性抗CD3/CD20多肽复合物配制剂，具体而言，其包括液体配制剂和冻干配制剂。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体而言涉及双特异性抗CD3/CD20多肽复合物配制剂及其用途。
背景技术
背景技术的陈述仅提供与本发明有关的信息，不必然地构成现有技术。
随着生物药的不断发展，治疗性抗体已经成为癌症、自身免疫疾病、炎症等疾病患者的主要选择药物。然而单克隆抗体针对单一的靶标，而癌症等疾病的发生是多因素的，由多种信号通路参与疾病发生，单一靶点的免疫疗法似乎并不足以摧毁癌细胞。
CD20是B淋巴细胞表面表达的活化的糖基化磷酸蛋白。早在1997年FDA核准使用利妥昔单抗(Rituximab，一种嵌合的抗CD20单克隆抗体(以下也称为“mAb”))治疗淋巴增生性病症。随着对CD20的蛋白质结构和分子功能研究的发展，产生了新一代的靶向CD20治疗性抗体奥法木单抗(Ofatumumab，一种全人抗CD20治疗性抗体)，与利妥昔单抗相比，其靶向更邻近细胞表面的不同CD20表位，导致比利妥昔单抗更慢的解离速率和更稳定的结合(Laurenti L,Innocenti I,Autore F,et al.New developments in the management ofchronic lymphocytic leukemia:role of ofatumumab.Onco Targets Ther.2016Jan 20；9:421-9)。然而，对于抗CD20 mAb治疗，几乎所有滤泡性淋巴瘤患者和CLL患者以及约一半侵袭性B细胞淋巴瘤(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤)患者仍然将发生疾病复发或再发生(LimSH,Beers SA,French RR,et al.Anti-CD20 monoclonal antibodies:historical andfuture perspectives.Haematologica.2010Jan；95(1):135-43)。
T细胞CD3受体是由四条不同的链(CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链)组成的蛋白质复合物。这四条链与被称为T细胞受体(TCR)的分子和胞内ζ链缔合从而在T淋巴细胞中产生激活信号。TCR、ζ链和CD3分子组成TCR复合物，其中TCR作为亚基用于识别和结合抗原，CD3作为亚基负责将抗原刺激传递至信号传导途径，并最终调节T细胞活性。CD3蛋白几乎存在于所有T细胞中。CD3-TCR复合物调节固有和适应性免疫应答中的T细胞功能，以及细胞和体液免疫功能，包括通过细胞毒性作用消除病原生物和控制肿瘤生长。靶向人CD3的小鼠单克隆抗体，例如OKT3(Kung等，Science，206：347-9(1979))，是开发用于治疗的第一代CD3抗体。尽管OKT3具有强免疫抑制效力，但其临床应用因其免疫原性和促有丝分裂潜能相关的严重副作用而受到阻碍(Chatenoud，Nature Reviews，3：123-132(2003))。OKT3诱导抗抗体反应，促进其自身的快速清除和中和(Chatenoud等，Eur.J.Immunol.，137：830-8(1982))。另外，OKT3在体内诱导细胞因子的大规模释放(Hirsch等，J.Immunol，142：737-43(1989))。
靶向CD3和CD20的双特异性抗体可以同时结合T细胞和B细胞。一旦双特异性抗体同时与CD3阳性T细胞和CD20阳性B细胞结合就会促进溶细胞突触的形成，细胞毒性T细胞从而释放穿孔素和颗粒酶诱导B细胞的细胞凋亡。但双特异性抗体药物的分子量大，结构复杂，容易降解、聚合或发生不希望发生的化学修饰等而变得不稳定，特别是在高温条件或在切应力期间(例如在运输过程中)发生。为了使双特异性抗体适合于生产和给药，并且在储存及随后使用过程中能保持生物学活性和稳定性，因此，开发稳定的双特异性抗体药物制剂研究显得尤为重要。
发明内容
根据本发明，双特异性抗CD3/CD20多肽复合物可以配制成液体或冻干粉末的形式。本发明的配制剂能够达到稳定的效果，其中双特异性抗CD3/CD20多肽复合物在储存后，基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性。具体地，本发明的配制剂具有低水平双特异性抗CD3/CD20多肽复合物聚集，且MFI微粒和不溶性微粒较少，并具有较好的生物学活性，适合在受试者中施用。
一方面，本发明提供了一种液体配制剂，其包含双特异性抗CD3/CD20多肽复合物和缓冲液，其中，所述缓冲液包括组氨酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲溶液中的一种或多种组合。
在一些实施方案中，所述组氨酸盐缓冲液是组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液，所述琥珀酸盐缓冲液是琥珀酸-琥珀酸钠缓冲液，所述枸橼酸盐缓冲液是枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。
在一些实施方案中，前述液体配制剂中的缓冲液是组氨酸-盐酸组氨酸，琥珀酸-琥珀酸钠，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，前述液体配制剂中缓冲液是枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。
在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为约0.1mg/ml至约50mg/ml。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为约0.5mg/ml至约20mg/ml，例如约0.5mg/ml，约1mg/ml，约1.5mg/ml，约2mg/ml，约2.5mg/ml，约3mg/ml，约3.5mg/ml，约4mg/ml，约4.5mg/ml，约5mg/ml，约5.5mg/ml，约6mg/ml，约6.5mg/ml，约7mg/ml，约7.5mg/ml，约8mg/ml，约8.5mg/ml，约9mg/ml，约9.5mg/ml，约10mg/ml，约11mg/ml，约12mg/ml，约13mg/ml，约14mg/ml，约15mg/ml，约16mg/ml，约17mg/ml，约18mg/ml，约19mg/ml，约20mg/ml。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为约1mg/ml至约20mg/ml，约2mg/ml至约10mg/ml，约2mg/ml至约5mg/ml，或约2mg/ml至约3mg/ml。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为约2mg/ml。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为约3mg/ml。
在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为0.1mg/ml至50mg/ml。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为0.5mg/ml至20mg/ml，例如为0.5mg/ml，1mg/ml，1.5mg/ml，2mg/ml，2.5mg/ml，3mg/ml，3.5mg/ml，4mg/ml，4.5mg/ml，5mg/ml，5.5mg/ml，6mg/ml，6.5mg/ml，7mg/ml，7.5mg/ml，8mg/ml，8.5mg/ml，9mg/ml，9.5mg/ml，10mg/ml，11mg/ml，12mg/ml，13mg/ml，14mg/ml，15mg/ml，16mg/ml，17mg/ml，18mg/ml，19mg/ml，20mg/ml。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为1mg/ml至20mg/ml，2mg/ml至10mg/ml，2mg/ml至5mg/ml，或2mg/ml至3mg/ml。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为2mg/ml。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为3mg/ml。
在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的pH为约5.0至约7.5。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的pH为约5.0至约6.5，例如为约5.0，约5.1，约5.2，约5.3，约5.4，约5.5，约5.6，约5.7，约5.8，约5.9，约6.0，约6.1，约6.2，约6.3，约6.4，约6.5。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的pH为约6.0至约6.5。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的pH为约6。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的pH为约6.2。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的pH为约6.5。
在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的pH为5.0至7.5。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的pH为5.0至6.5，例如为5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的pH为6.0至6.5。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的pH为6。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的pH为6.2。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的pH为6.5。
在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的浓度为约1mM至约30mM。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的浓度为约5mM至约20mM，例如为约5mM，约6mM，约7mM，约8mM，约9mM，约10mM，约11mM，约12mM，约13mM，约14mM，约15mM，约16mM，约17mM，约18mM，约19mM，约20mM。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的浓度为约10mM。
在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的浓度为1mM至30mM。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的浓度为5mM至20mM，例如为5mM，6mM，7mM，8mM，9mM，10mM，11mM，12mM，13mM，14mM，15mM，16mM，17mM，18mM，19mM，20mM。在一些实施方案中，前述液体配制剂中所述缓冲液的浓度为10mM。
在一些实施方案中，前述液体配制剂的pH为约5.0至约7.5。在一些实施方案中，前述液体配制剂的pH为约5.0至约6.5，例如为约5.0，约5.1，约5.2，约5.3，约5.4，约5.5，约5.6，约5.7，约5.8，约5.9，约6.0，约6.1，约6.2，约6.3，约6.4，约6.5。在一些实施方案中，前述液体配制剂的pH为约6.0至约6.5。在一些实施方案中，前述液体配制剂的pH为约6。在一些实施方案中，前述液体配制剂的pH为约6.2。在一些实施方案中，前述液体配制剂的pH为约6.5。
在一些实施方案中，前述液体配制剂的pH为5.0至7.5。在一些实施方案中，前述液体配制剂的pH为5.0至6.5，例如为5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5。在一些实施方案中，前述液体配制剂的pH为6.0至6.5。在一些实施方案中，前述液体配制剂的pH为6。在一些实施方案中，前述液体配制剂的pH为6.2。在一些实施方案中，前述液体配制剂的pH为6.5。
在一些实施方案中，前述液体配制剂还包含渗透压调节剂和/或稳定剂。在一些实施方案中，所述渗透压调节剂和/或稳定剂包含糖。本发明使用的“糖”可为单糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、还原性糖和非还原性糖，例如葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、右旋糖苷、甘油、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、密里二糖、松三糖、蜜三糖、甘露三糖、水苏糖、麦芽糖、乳果糖、麦芽酮糖、山梨醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异-麦芽酮糖等。在一些实施方案中，前述液体配制剂中的渗透压调节剂和/或稳定剂是二糖，例如是海藻糖或蔗糖。在一些实施方案中，前述液体配制剂中含有海藻糖。在本申请的配制剂中，糖包括糖和/或其水合物，例如海藻糖包括海藻糖和/或其水合物，例如二水合海藻糖。
在一些实施方案中，前述液体配制剂中糖的浓度为约150mM至约320mM。在一些实施方案中，前述液体配制剂中糖的浓度为约180mM至约265mM，例如为约180mM，约185mM，约198mM，约211mM，约214mM，约217mM，约219mM，约222mM，约225mM，约227mM，约230mM，约233mM，约235mM，约238mM，约241mM，约243mM，约246mM，约248mM，约251mM，254mM，约256mM，约259mM，约262mM，约264mM。在一些实施方案中，前述液体配制剂中糖的浓度为约230mM至约240mM，或约230mM至约235mM。在一些实施方案中，前述液体配制剂中糖的浓度为约233mM。在一些实施方案中，前述液体配制剂中糖的浓度为约234mM。在一些实施方案中，前述液体配制剂中糖的浓度为约180mM至约265mM，例如为约180mM，约185.02mM，约198.24mM，约211.46mM，约214.1mM，约216.74mM，约219.39mM，约222.03mM，约224.67mM，约227.31mM，约229.96mM，约232.6mM，约235.24mM，约237.89mM，约240.53mM，约243.17mM，约245.82mM，约248.46mM，约251.1mM，253.75mM，约256.39mM，约259.03mM，约261.68mM，约264.32mM。在一些实施方案中，前述液体配制剂中糖的浓度为约232.6mM。在一些实施方案中，前述液体配制剂中糖的浓度为约233.7mM。
在一些实施方案中，前述液体配制剂中海藻糖的浓度为约150mM至约320mM。在一些实施方案中，前述液体配制剂中海藻糖的浓度为约180mM至约265mM，例如为约180mM，约185mM，约198mM，约211mM，约214mM，约217mM，约219mM，约222mM，约225mM，约227mM，约230mM，约233mM，约235mM，约238mM，约241mM，约243mM，约246mM，约248mM，约251mM，254mM，约256mM，约259mM，约262mM，约264mM。在一些实施方案中，前述液体配制剂中海藻糖的浓度为约230mM至约240mM，或约230mM至约235mM。在一些实施方案中，前述液体配制剂中海藻糖的浓度为约233mM。在一些实施方案中，前述液体配制剂中海藻糖的浓度为约180mM至约265mM，例如为约180mM，约185.02mM，约198.24mM，约211.46mM，约214.1mM，约216.74mM，约219.39mM，约222.03mM，约224.67mM，约227.31mM，约229.96mM，约232.6mM，约235.24mM，约237.89mM，约240.53mM，约243.17mM，约245.82mM，约248.46mM，约251.1mM，253.75mM，约256.39mM，约259.03mM，约261.68mM，约264.32mM。在一些实施方案中，前述液体配制剂中海藻糖的浓度为约232.6mM。
在一些实施方案中，前述液体配制剂还包含表面活性剂，可选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚羟亚烃、Triton、十二烷基磺酸钠、月桂基磺酸钠、辛基糖甙钠、月桂基-磺基甜菜碱、肉豆蔻基-磺基甜菜碱、亚油基-磺基甜菜碱、硬脂基-磺基甜菜碱、月桂基-肌氨酸、肉豆蔻基-肌氨酸、亚油基-肌氨酸、硬脂基-肌氨酸、亚油基-甜菜碱、肉豆蔻基-甜菜碱、鲸蜡基-甜菜碱、月桂酰胺基丙基-甜菜碱、柯卡酰胺基丙基-甜菜碱、亚油酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-甜菜碱、棕榈酰胺基丙基-甜菜碱、异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-二甲基胺、棕榈酰胺基丙基-二甲基胺、异硬脂酰胺基丙基-二甲基胺、甲基可可酰基钠、甲基油基牛磺酸钠、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯与丙烯二醇的共聚物等。优选的表面活性剂是聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20。在一些实施方案中，前述液体配制剂包含聚山梨醇酯80(又称为吐温80)。
在一些实施方案中，前述液体配制剂中聚山梨醇酯80的浓度为约0.001％至约0.1％(w/v)。在一些实施方案中，前述液体配制剂中聚山梨醇酯80的浓度为约0.005％至约0.08％(w/v)，例如约0.005％(w/v)，约0.006％(w/v)，约0.007％(w/v)，约0.008％(w/v)，约0.009％(w/v)，约0.01％(w/v)，约0.015％(w/v)，约0.02％(w/v)，约0.025％(w/v)，约0.03％(w/v)，约0.035％(w/v)，约0.04％(w/v)，约0.045％(w/v)，约0.05％(w/v)，约0.06％(w/v)，约0.07％(w/v)，约0.08％(w/v)。在一些实施方案中，前述液体配制剂中聚山梨醇酯80的浓度为约0.02％(w/v)。
在一些实施方案中，前述液体配制剂中聚山梨醇酯80的浓度为0.001％至0.1％(w/v)。在一些实施方案中，前述液体配制剂中聚山梨醇酯80的浓度为0.005％至0.08％(w/v)，例如为0.005％(w/v)，0.006％(w/v)，0.007％(w/v)，0.008％(w/v)，0.009％(w/v)，0.01％(w/v)，0.015％(w/v)，0.02％(w/v)，0.025％(w/v)，0.03％(w/v)，0.035％(w/v)，0.04％(w/v)，0.045％(w/v)，0.05％(w/v)，0.06％(w/v)，0.07％(w/v)，0.08％(w/v)。在一些实施方案中，前述液体配制剂中聚山梨醇酯80的浓度为约0.02％(w/v)。
一方面，本发明提供了一种液体配制剂，其包含双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，以及缓冲液，渗透压调节剂和/或稳定剂，和/或表面活性剂中的一种或几种。在一些实施方案中，本发明的液体配制剂其包含双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，以及缓冲液，渗透压调节剂和/或稳定剂，和表面活性剂。
在一些实施方案中，前述液体配制剂包含：
(a)约0.1mg/ml至约50mg/ml的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约1mM至约30mM的枸橼酸盐缓冲液，
(c)约150mM至约320mM的糖，和
(d)约0.001％至约0.1％(w/v)的表面活性剂，
其中所述液体配制剂的pH约5.0至约7.5，优选为约6.0至约6.5。
在一些实施方案中，前述液体配制剂包含：
(a)约0.1mg/ml至约50mg/ml的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约1mM至约30mM枸橼酸盐缓冲液，
(c)约150mM至约320mM的海藻糖，和
(d)约0.001％至约0.1％(w/v)的聚山梨醇酯80，
其中所述液体配制剂的pH约5.0至约7.5，优选为约6.0至约6.5。
在一些实施方案中，前述液体配制剂包含：
(a)约0.5mg/ml至约20mg/ml双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约5mM至约20mM枸橼酸盐缓冲液，
(c)约180mM至约265mM海藻糖，和
(d)约0.005％至约0.08％(w/v)的聚山梨醇酯80，
其中所述液体配制剂的pH为约6.0至约6.5。
在一些实施方案中，前述液体配制剂包含：
(a)约0.5mg/ml至约20mg/ml双特异性抗CD3/CD20多肽复合物(例如，约0.5mg/ml，约1mg/ml，约1.5mg/ml，约2mg/ml，约2.5mg/ml，约3mg/ml，约3.5mg/ml，约4mg/ml，约4.5mg/ml，约5mg/ml，约5.5mg/ml，约6mg/ml，约6.5mg/ml，约7mg/ml，约7.5mg/ml，约8mg/ml，约8.5mg/ml，约9mg/ml，约9.5mg/ml，约10mg/ml，约11mg/ml，约12mg/ml，约13mg/ml，约14mg/ml，约15mg/ml，约16mg/ml，约17mg/ml，约18mg/ml，约19mg/ml，约20mg/ml)，
(b)约5mM至约20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(例如，约5mM，约6mM，约7mM，约8mM，约9mM，约10mM，约11mM，约12mM，约13mM，约14mM，约15mM，约16mM，约17mM，约18mM，约19mM，约20mM)，
(c)约180mM至约265mM海藻糖(例如，约180mM，约185mM，约198mM，约211mM，约214mM，约217mM，约219mM，约222mM，约225mM，约227mM，约230mM，约233mM，约235mM，约238mM，约241mM，约243mM，约246mM，约248mM，约251mM，254mM，约256mM，约259mM，约262mM，约264mM；或约180mM，约185.02mM，约198.24mM，约211.46mM，约214.1mM，约216.74mM，约219.39mM，约222.03mM，约224.67mM，约227.31mM，约229.96mM，约232.6mM，约235.24mM，约237.89mM，约240.53mM，约243.17mM，约245.82mM，约248.46mM，约251.1mM，253.75mM，约256.39mM，约259.03mM，约261.68mM，约264.32mM)，和
(d)约0.005％至约0.08％(w/v)的聚山梨醇酯80(例如，约0.005％(w/v)，约0.006％(w/v)，约0.007％(w/v)，约0.008％(w/v)，约0.009％(w/v)，约0.01％(w/v)，约0.015％(w/v)，约0.02％(w/v)，约0.025％(w/v)，约0.03％(w/v)，约0.035％(w/v)，约0.04％(w/v)，约0.045％(w/v)，约0.05％(w/v)，约0.06％(w/v)，约0.07％(w/v)，约0.08％(w/v))，
其中所述液体配制剂的pH为约6.0至约6.5(例如约6.0，约6.1，约6.2，约6.3，约6.4，约6.5)。
在一些实施方案中，前述液体配制剂包含：
(a)约2mg/ml至约3mg/ml双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，
(c)约233mM的海藻糖，和
(d)约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80，
其中所述液体配制剂的pH为约6.2。
在一些实施方案中，前述液体配制剂包含：
(a)约2mg/ml至约3mg/ml的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约10mM的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，
(c)约232.6mM的海藻糖，和
(d)约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80，
其中所述液体配制剂的pH约6.2。
本发明还提供一种制备前述液体配制剂的方法，其包括使上述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物和缓冲液接触的步骤，例如将双特异性抗CD3/CD20多肽复合物置换至缓冲液中，所述缓冲液优选枸橼酸盐缓冲液，更优选为枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，所述缓冲液的浓度为约5mM至约20mM，例如约5mM，约6mM，约7mM，约8mM，约9mM，约10mM，约11mM，约12mM，约13mM，约14mM，约15mM，约16mM，约17mM，约18mM，约19mM，约20mM。在一些实施方案中，所述液体的浓度为约10mM。所述缓冲液的pH为约5.0至约6.5，例如为约5.0，约5.1，约5.2，约5.3，约5.4，约5.5，约5.6，约5.7，约5.8，约5.9，约6.0，约6.1，约6.2，约6.3，约6.4，约6.5。在一些实施方案中，所述缓冲液的pH为约6。在一些实施方案中，所述缓冲液的pH为约6.2。在一些实施方案中，所述缓冲液的pH为约6.5。
本发明还提供一种制备前述液体配制剂的方法，其包括使上述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物和缓冲液接触，进一步地还包括向所得溶液中加入渗透压调节剂和/或稳定剂以及表面活性剂，例如海藻糖和聚山梨醇酯80，两者不区分先后顺序，其中缓冲液的浓度优选为约5mM至约20mM，例如约5mM，约6mM，约7mM，约8mM，约9mM，约10mM，约11mM，约12mM，约13mM，约14mM，约15mM，约16mM，约17mM，约18mM，约19mM，约20mM。在一些实施方案中，所述缓冲液的浓度为约10mM。所述缓冲液的pH为约5.0至约6.5，例如为约5.0，约5.1，约5.2，约5.3，约5.4，约5.5，约5.6，约5.7，约5.8，约5.9，约6.0，约6.1，约6.2，约6.3，约6.4，约6.5。在一些实施方案中，所述缓冲液的pH为约6。在一些实施方案中，所述缓冲液的pH为约6.2。在一些实施方案中，所述缓冲液的pH为约6.5。
本发明还提供一种制备含双特异性抗CD3/CD20多肽复合物冻干剂的方法，其中包括将前述液体配制剂经冷冻干燥的步骤。在一些实施方案中，所述冷冻干燥按照本领域公知的方法进行，包括但不限于包括预冻、一次干燥和二次干燥的步骤。技术人员理解，任何将水从本发明所述液体配制剂中移除的方法均适用于本发明。
本发明还提供一种含双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的冻干剂，其是经前述的制备冻干剂的方法制备所得。
本发明还提供一种含双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的冻干剂，所述冻干剂经复溶后可形成前述液体配制剂。
在一些实施方案中，前述冻干剂包含：
(a)约2mg的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约0.0013mmoL或约0.0014mmoL的枸橼酸，
(c)约0.0086mmoL的枸橼酸钠，
(d)约0.233mmoL的海藻糖，和
(e)约0.2mg的聚山梨醇酯80；
或包含(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的倍数，例如：包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的各成分含量的整数倍或小数倍，或者包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的各成分含量的1.5倍，2倍，3倍，4倍，再或者包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的各成分含量的5以上的整数倍，
其中所述冻干剂的pH约6.2。
在一些实施方案中，前述冻干剂包含：
(a)约2mg的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约0.0013mmoL或约0.0014mmoL的枸橼酸，
(c)约0.0086mmoL的枸橼酸钠，
(d)约0.2326mmoL的海藻糖，和
(e)约0.2mg的聚山梨醇酯80；
或包含(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的倍数，例如：包含(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的各成分含量的整数倍或小数倍，或者包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的各成分含量的1.5倍，2倍，3倍，4倍，再或者包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的各成分含量的5以上的整数倍，
其中所述冻干剂的pH约6.2。
在一些实施方案中，前述冻干剂包含：
(a)约2mg的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约0.001mmoL的枸橼酸，
(c)约0.009mmoL的枸橼酸钠，
(d)约0.23mmoL的海藻糖，和
(e)约0.2mg的聚山梨醇酯80；
或包含(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的倍数，例如：包含(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的各成分含量的整数倍或小数倍，或者包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的各成分含量的1.5倍，2倍，3倍，4倍，再或者包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的各成分含量的5以上的整数倍，
其中所述冻干剂的pH约6.2。
在一些实施方案中，所述冻干剂于2-8℃稳定至少1个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。在一些实施方案中，该冻干剂于25℃稳定至少1个月，至少6个月。在一些实施方案中，该冻干剂于40℃稳定至少7天，至少14天或至少28天。
本发明还提供一种含双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的药物组合物，其是通过将前述冻干剂复溶获得的溶液。
本发明还提供一种前述药物组合物的制备方法，其包括将前述冻干剂经复溶的步骤，复溶所用溶液包括但不限于注射用水、生理盐水或葡萄糖溶液，优选注射用水。
本发明还提供一种制品，其包括容器，该容器中装有本发明的液体配制剂、或其冻干剂、或冻干剂复溶的药物组合物。
本发明的液体配制剂、或其冻干剂、或冻干剂复溶的药物组合物可以经静脉内(例如静脉滴注)、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。本发明的液体配制剂、或其冻干剂、或冻干剂复溶的药物组合物在施用前可以用合适的稀释液稀释成合适的浓度，以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。
本发明还提供本发明所述的液体配制剂，或冻干剂，或冻干剂复溶的药物组合物，或制品在制备用于治疗CD20相关的疾病或病况的药物的用途。
在一些实施方案中，所述CD20相关的疾病或病况是癌症，优选地，所述癌症选自，但不限于，淋巴癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、食道癌或胃癌。
在一些实施方案中，所述CD20相关的疾病或病况是B细胞淋巴癌，可选地为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，其中所述非霍奇金淋巴瘤包括：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞性淋巴瘤(慢性淋巴细胞白血病，CLL)、或套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，所述药物组合物还包含缓冲剂，渗透压调节剂和/或稳定剂，和/或表面活性剂中的一种或几种。在一些实施方案中，本发明的药物组合物是冻干配制剂，其包含双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，以及缓冲剂，渗透压调节剂和/或稳定剂，和表面活性剂。
另一方面，本发明提供了一种稳定的冻干配制剂，其包含双特异性抗CD3/CD20多肽复合物和缓冲剂，其中，所述缓冲剂包括组氨酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、枸橼酸盐缓冲剂中的一种或多种组合。
在一些实施方案中，所述组氨酸盐缓冲剂是组氨酸-盐酸组氨酸，所述琥珀酸盐缓冲剂是琥珀酸-琥珀酸钠，所述枸橼酸盐缓冲剂是枸橼酸-枸橼酸钠。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂中缓冲剂是组氨酸-盐酸组氨酸，琥珀酸-琥珀酸钠，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲剂中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中缓冲剂是枸橼酸-枸橼酸钠缓冲剂。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为约0.1mg/ml至约50mg/ml。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为约0.5mg/ml至约20mg/ml，例如约0.5mg/ml，约1mg/ml，约1.5mg/ml，约2mg/ml，约2.5mg/ml，约3mg/ml，约3.5mg/ml，约4mg/ml，约4.5mg/ml，约5mg/ml，约5.5mg/ml，约6mg/ml，约6.5mg/ml，约7mg/ml，约7.5mg/ml，约8mg/ml，约8.5mg/ml，约9mg/ml，约9.5mg/ml，约10mg/ml，约11mg/ml，约12mg/ml，约13mg/ml，约14mg/ml，约15mg/ml，约16mg/ml，约17mg/ml，约18mg/ml，约19mg/ml，约20mg/ml。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为约1mg/ml至约20mg/ml，约2mg/ml至约10mg/ml，约2mg/ml至约5mg/ml，或约2mg/ml至约3mg/ml。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为约2mg/ml。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为约3mg/ml。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为0.1mg/ml至50mg/ml。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为0.5mg/ml至20mg/ml，例如0.5mg/ml，1mg/ml，1.5mg/ml，2mg/ml，2.5mg/ml，3mg/ml，3.5mg/ml，4mg/ml，4.5mg/ml，5mg/ml，5.5mg/ml，6mg/ml，6.5mg/ml，7mg/ml，7.5mg/ml，8mg/ml，8.5mg/ml，9mg/ml，9.5mg/ml，10mg/ml，11mg/ml，12mg/ml，13mg/ml，14mg/ml，15mg/ml，16mg/ml，17mg/ml，18mg/ml，19mg/ml，20mg/ml。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为1mg/ml至20mg/ml，2mg/ml至10mg/ml，2mg/ml至5mg/ml，或2mg/ml至3mg/ml。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为2mg/ml。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述双特异性抗CD3/C20多肽复合物的浓度为3mg/ml。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂使该冻干配制剂的pH维持在约5.0至约7.5。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂使该冻干配制剂的pH维持在约5.0至约6.5，例如为约5.0，约5.1，约5.2，约5.3，约5.4，约5.5，约5.6，约5.7，约5.8，约5.9，约6.0，约6.1，约6.2，约6.3，约6.4，约6.5。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂使该冻干配制剂的pH维持在约6.0至约6.5。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂使该冻干配制剂的pH维持在约6。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂使该冻干配制剂的pH维持在约6.2。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂使该冻干配制剂的pH维持在约6.5。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂使该冻干配制剂的pH维持在5.0至7.5。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂使该冻干配制剂的pH维持在5.0至6.5，例如为5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂使该冻干配制剂的pH维持在6.0至6.5。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂使该冻干配制剂的pH维持在6。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂使该冻干配制剂的pH维持在6.2。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂使该冻干配制剂的pH维持在6.5。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂的浓度为约1mM至约30mM。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂的浓度为约5mM至约20mM，例如为约5mM，约6mM，约7mM，约8mM，约9mM，约10mM，约11mM，约12mM，约13mM，约14mM，约15mM，约16mM，约17mM，约18mM，约19mM，约20mM。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂的浓度为约10mM。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂的浓度为1mM至30mM。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂的浓度为5mM至20mM，例如为5mM，6mM，7mM，8mM，9mM，10mM，11mM，12mM，13mM，14mM，15mM，16mM，17mM，18mM，19mM，20mM。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中所述缓冲剂的浓度为10mM。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂的pH为约5.0至约7.5。在一些实施方案中，前述冻干配制剂的pH为约5.0至约6.5，例如为约5.0，约5.1，约5.2，约5.3，约5.4，约5.5，约5.6，约5.7，约5.8，约5.9，约6.0，约6.1，约6.2，约6.3，约6.4，约6.5。在一些实施方案中，前述冻干配制剂的pH为约6.0至约6.5。在一些实施方案中，前述冻干配制剂的pH为约6。在一些实施方案中，前述冻干配制剂的pH为约6.2。在一些实施方案中，前述冻干配制剂的pH为约6.5。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂的pH为5.0至7.5。在一些实施方案中，前述冻干配制剂的pH为5.0至6.5，例如为5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5。在一些实施方案中，前述冻干配制剂的pH为6.0至6.5。在一些实施方案中，前述冻干配制剂的pH为6。在一些实施方案中，前述冻干配制剂的pH为6.2。在一些实施方案中，前述冻干配制剂的pH为6.5。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂还包含渗透压调节剂和/或稳定剂。其中，渗透压调节剂和/或稳定剂可以包含糖。本发明使用的“糖”可为单糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、还原性糖和非还原性糖，例如葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、右旋糖苷、甘油、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、密里二糖、松三糖、蜜三糖、甘露三糖、水苏糖、麦芽糖、乳果糖、麦芽酮糖、山梨醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异-麦芽酮糖等。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中的渗透压调节剂和/或稳定剂是二糖，例如是海藻糖或蔗糖。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中含有海藻糖。在本申请的配制剂中，糖包括糖和/或其水合物，例如海藻糖包括海藻糖和/或其水合物，例如二水合海藻糖。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂中糖的浓度为约150mM至约320mM。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中糖的浓度为约180mM至约265mM，例如为约180mM，约185mM，约198mM，约211mM，约214mM，约217mM，约219mM，约222mM，约225mM，约227mM，约230mM，约233mM，约235mM，约238mM，约241mM，约243mM，约246mM，约248mM，约251mM，254mM，约256mM，约259mM，约262mM，约264mM。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中糖的浓度为约230mM至约240mM，或约230mM至约235mM。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中糖的浓度为约233mM。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中糖的浓度为约234mM。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中糖的浓度为约180mM至约265mM，例如为约180mM，约185.02mM，约198.24mM，约211.46mM，约214.1mM，约216.74mM，约219.39mM，约222.03mM，约224.67mM，约227.31mM，约229.96mM，约232.6mM，约235.24mM，约237.89mM，约240.53mM，约243.17mM，约245.82mM，约248.46mM，约251.1mM，253.75mM，约256.39mM，约259.03mM，约261.68mM，约264.32mM。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中糖的浓度为约232.6mM。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中糖的浓度为约233.7mM。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂中海藻糖的浓度为约150mM至约320mM。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中海藻糖的浓度为约180mM至约265mM，例如为约180mM，约185mM，约198mM，约211mM，约214mM，约217mM，约219mM，约222mM，约225mM，约227mM，约230mM，约233mM，约235mM，约238mM，约241mM，约243mM，约246mM，约248mM，约251mM，254mM，约256mM，约259mM，约262mM，约264mM。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中海藻糖的浓度为约230mM至约240mM，或约230mM至约235mM。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中海藻糖的浓度为约233mM。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中海藻糖的浓度为约180mM至约265mM，例如为约180mM，约185.02mM，约198.24mM，约211.46mM，约214.1mM，约216.74mM，约219.39mM，约222.03mM，约224.67mM，约227.31mM，约229.96mM，约232.6mM，约235.24mM，约237.89mM，约240.53mM，约243.17mM，约245.82mM，约248.46mM，约251.1mM，253.75mM，约256.39mM，约259.03mM，约261.68mM，约264.32mM。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中海藻糖的浓度为约232.6mM。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂还包含表面活性剂，可选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚羟亚烃、Triton、十二烷基磺酸钠、月桂基磺酸钠、辛基糖甙钠、月桂基-磺基甜菜碱、肉豆蔻基-磺基甜菜碱、亚油基-磺基甜菜碱、硬脂基-磺基甜菜碱、月桂基-肌氨酸、肉豆蔻基-肌氨酸、亚油基-肌氨酸、硬脂基-肌氨酸、亚油基-甜菜碱、肉豆蔻基-甜菜碱、鲸蜡基-甜菜碱、月桂酰胺基丙基-甜菜碱、柯卡酰胺基丙基-甜菜碱、亚油酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-甜菜碱、棕榈酰胺基丙基-甜菜碱、异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-二甲基胺、棕榈酰胺基丙基-二甲基胺、异硬脂酰胺基丙基-二甲基胺、甲基可可酰基钠、甲基油基牛磺酸钠、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯与丙烯二醇的共聚物等。优选的表面活性剂是聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20。在一些实施方案中，前述冻干配制剂包含聚山梨醇酯80(又称为吐温80)。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂中聚山梨醇酯80的浓度为约0.001％至约0.1％(w/v)。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中聚山梨醇酯80的浓度为约0.005％至约0.08％(w/v)，例如约0.005％(w/v)，约0.006％(w/v)，约0.007％(w/v)，约0.008％(w/v)，约0.009％(w/v)，约0.01％(w/v)，约0.015％(w/v)，约0.02％(w/v)，约0.025％(w/v)，约0.03％(w/v)，约0.035％(w/v)，约0.04％(w/v)，约0.045％(w/v)，约0.05％(w/v)，约0.06％(w/v)，约0.07％(w/v)，约0.08％(w/v)。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中聚山梨醇酯80的浓度为约0.01％至约0.04％(w/v)。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中聚山梨醇酯80的浓度为约0.02％(w/v)。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂中聚山梨醇酯80的浓度为0.001％至0.1％(w/v)。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中聚山梨醇酯80的浓度为0.005％至0.08％(w/v)，例如为0.005％(w/v)，0.006％(w/v)，0.007％(w/v)，0.008％(w/v)，0.009％(w/v)，0.01％(w/v)，0.015％(w/v)，0.02％(w/v)，0.025％(w/v)，0.03％(w/v)，0.035％(w/v)，0.04％(w/v)，0.045％(w/v)，0.05％(w/v)，0.06％(w/v)，0.07％(w/v)，0.08％(w/v)。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中聚山梨醇酯80的浓度为0.01％至0.04％(w/v)。在一些实施方案中，前述冻干配制剂中聚山梨醇酯80的浓度为0.02％(w/v)。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂包含：
(a)约0.1mg/ml至约50mg/ml的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约1mM至约30mM的枸橼酸盐缓冲剂，
(c)约150mM至约320mM的糖，和
(d)约0.001％至约0.1％(w/v)的表面活性剂，
其中所述冻干配制剂的pH约5.0至约7.5，优选为约6.0至约6.5。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂包含：
(a)约0.1mg/ml至约50mg/ml的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约1mM至约30mM枸橼酸盐缓冲剂，
(c)约150mM至约320mM的海藻糖，和
(d)约0.001％至约0.1％(w/v)的聚山梨醇酯80，
其中所述冻干配制剂的pH约5.0至约7.5，优选为约6.0至约6.5。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂包含：
(a)约0.5mg/ml至约20mg/ml双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约5mM至约20mM枸橼酸盐缓冲剂，
(c)约180mM至约265mM海藻糖，和
(d)约0.005％至约0.08％(w/v)的聚山梨醇酯80，
其中所述冻干配制剂的pH为约6.0至约6.5。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂包含：
(a)约0.5mg/ml至约20mg/ml双特异性抗CD3/CD20多肽复合物(例如，约0.5mg/ml，约1mg/ml，约1.5mg/ml，约2mg/ml，约2.5mg/ml，约3mg/ml，约3.5mg/ml，约4mg/ml，约4.5mg/ml，约5mg/ml，约5.5mg/ml，约6mg/ml，约6.5mg/ml，约7mg/ml，约7.5mg/ml，约8mg/ml，约8.5mg/ml，约9mg/ml，约9.5mg/ml，约10mg/ml，约11mg/ml，约12mg/ml，约13mg/ml，约14mg/ml，约15mg/ml，约16mg/ml，约17mg/ml，约18mg/ml，约19mg/ml，约20mg/ml)，
(b)约5mM至约20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲剂(例如，约5mM，约6mM，约7mM，约8mM，约9mM，约10mM，约11mM，约12mM，约13mM，约14mM，约15mM，约16mM，约17mM，约18mM，约19mM，约20mM)，
(c)约180mM至约265mM海藻糖(例如约180mM，约185mM，约198mM，约211mM，约214mM，约217mM，约219mM，约222mM，约225mM，约227mM，约230mM，约233mM，约235mM，约238mM，约241mM，约243mM，约246mM，约248mM，约251mM，254mM，约256mM，约259mM，约262mM，约264mM；或约180mM，约185.02mM，约198.24mM，约211.46mM，约214.1mM，约216.74mM，约219.39mM，约222.03mM，约224.67mM，约227.31mM，约229.96mM，约232.6mM，约235.24mM，约237.89mM，约240.53mM，约243.17mM，约245.82mM，约248.46mM，约251.1mM，253.75mM，约256.39mM，约259.03mM，约261.68mM，约264.32mM)，和
(d)约0.005％至约0.08％(w/v)的聚山梨醇酯80(例如，约0.005％(w/v)，约0.006％(w/v)，约0.007％(w/v)，约0.008％(w/v)，约0.009％(w/v)，约0.01％(w/v)，约0.015％(w/v)，约0.02％(w/v)，约0.025％(w/v)，约0.03％(w/v)，约0.035％(w/v)，约0.04％(w/v)，约0.045％(w/v)，约0.05％(w/v)，约0.06％(w/v)，约0.07％(w/v)，约0.08％(w/v)，
其中所述冻干配制剂的pH为约6.0至约6.5(例如约6.0，约6.1，约6.2，约6.3，约6.4，约6.5)。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂包含：
(a)约2mg/ml至约3mg/ml双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲剂，
(c)约233mM的海藻糖，和
(d)约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80，
其中所述冻干配制剂的pH为约6.2。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂包含：
(a)约2mg/ml至约3mg/ml的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约10mM的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲剂，
(c)约232.6mM的海藻糖，和
(d)约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80，
其中所述冻干配制剂的pH约6.2。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂包含：
(a)约2mg的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约0.0013mmoL或约0.0014mmoL的枸橼酸，
(c)约0.0086mmoL的枸橼酸钠，
(d)约0.233mmoL的海藻糖，和
(e)约0.2mg的聚山梨醇酯80；
或包含(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的倍数，例如：包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的各成分含量的整数倍或小数倍，或者包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的各成分含量的1.5倍，2倍，3倍，4倍，再或者包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的各成分含量的5以上的整数倍，
其中所述冻干配制剂的pH约6.2。
在一些实施方案中，前述冻干配制剂包含：
(a)约2mg的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约0.0013mmoL或约0.0014mmoL的枸橼酸，
(c)约0.0086mmoL的枸橼酸钠，
(d)约0.2326mmoL的海藻糖，和
(e)约0.2mg的聚山梨酯80；
或包含(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的倍数，例如：包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的各成分含量的整数倍或小数倍，或者包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的各成分含量的1.5倍，2倍，3倍，4倍，再或者包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的各成分含量的5以上的整数倍，
其中所述冻干配制剂的pH约6.2。
在一些实施方案中，前述冻干剂包含：
(a)约2mg的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约0.001mmoL的枸橼酸，
(c)约0.009mmoL的枸橼酸钠，
(d)约0.23mmoL的海藻糖，和
(e)约0.2mg的聚山梨醇酯80；
或包含(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的倍数，例如：包含(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的各成分含量的整数倍或小数倍，或者包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的各成分含量的1.5倍，2倍，3倍，4倍，再或者包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的各成分含量的5以上的整数倍，
其中所述冻干剂的pH约6.2。
在一些实施方案中，所述冻干配制剂于2-8℃稳定至少1个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。在一些实施方案中，该冻干配制剂于25℃稳定至少1个月，至少6个月。在一些实施方案中，该冻干配制剂于40℃稳定至少7天，至少14天或至少28天。
本发明还提供一种含双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的药物组合物，其是通过将前述冻干配制剂复溶获得的溶液。
本发明还提供一种前述药物组合物的制备方法，其包括将前述冻干配制剂经复溶的步骤，复溶所用溶液包括但不限于注射用水、生理盐水或葡萄糖溶液，优选注射用水。
本发明还提供一种制品，其包括容器，该容器中装有本发明的冻干配制剂、或其复溶的药物组合物。
本发明的冻干配制剂、或其复溶的药物组合物可以经静脉内(例如静脉滴注)、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。本发明的冻干配制剂、或其复溶的药物组合物在施用前可以用合适的稀释液稀释成合适的浓度，以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。
另一个方面，本发明提供本发明所述的冻干配制剂、或其复溶的药物组合物，或制品在制备用于治疗CD20相关的疾病或病况的药物的用途。
在一些实施方案中，所述CD20相关的疾病或病况是癌症，优选地，所述癌症选自，但不限于，淋巴癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、食道癌或胃癌。
在一些实施方案中，所述CD20相关的疾病或病况是B细胞淋巴癌，可选地为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，其中所述非霍奇金淋巴瘤包括：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞性淋巴瘤(慢性淋巴细胞白血病，CLL)、或套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。
在可选的实施方案中，前述液体配制剂，或冻干剂或其复溶的药物组合物，或冻干配制剂或其复溶的药物组合物，或制品中所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含与第二抗原结合部分相缔合的第一抗原结合部分，其中：
所述第一抗原结合部分包含：
第一多肽，所述第一多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一重链可变结构域(VH)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，和
第二多肽，所述第二多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一轻链可变结构域(VL)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)，
其中，C1和C2能够形成包含至少一个在C1和C2之间的非天然的链间键的二聚体，并且所述非天然的链间键能够稳定所述二聚体，以及
所述第二抗原结合部分包含：
第二抗体的第二重链可变结构域(VH2)，其可操作地连接至抗体重链CH1结构域，和
第二抗体的第二轻链可变结构域(VL2)，其可操作地连接至抗体轻链恒定(CL)结构域，
其中，所述第一和所述第二抗原结合部分中的一个是抗CD3结合部分，并且另一个是抗CD20结合部分，
抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含：
a)包含选自SEQ ID NO：1和13的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含选自SEQ ID NO：2和14的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含选自SEQ ID NO：3和15的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含选自SEQ ID NO：4和16的氨基酸序列的κ轻链CDR1，
e)包含选自SEQ ID NO：5和17的氨基酸序列的κ轻链CDR2，和
f)包含选自SEQ ID NO：6和18的氨基酸序列的κ轻链CDR3，
抗CD20结合部分来源于抗CD20抗体，其包含：
a)包含选自SEQ ID NO：7和19的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含选自SEQ ID NO：8和20的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含选自SEQ ID NO：9和21的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含选自SEQ ID NO：10和22的氨基酸序列的κ轻链CDR1，
e)包含选自SEQ ID NO：11和23的氨基酸序列的κ轻链CDR2，和
f)包含选自SEQ ID NO：12和24的氨基酸序列的κ轻链CDR3。
在一些实施方案中，所述抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含：
a)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的κ轻链CDR1，
e)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的κ轻链CDR2，和
f)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的κ轻链CDR3。
在一些实施方案中，所述抗CD20结合部分来源于抗CD20抗体，其包含：
a)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的κ轻链CDR1，
e)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的κ轻链CDR2，和
f)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的κ轻链CDR3。
在可选的实施方案中，前述液体配制剂，或冻干剂或其复溶的药物组合物，或冻干配制剂或其复溶的药物组合物，或制品中所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含含有选自SEQ ID NO：25和27的氨基酸序列的重链可变结构域序列和含有选自SEQ ID NO：26和28的氨基酸序列的轻链可变结构域序列。在一些实施方案中，所述抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含含有选自SEQ ID NO：25和27的氨基酸序列变体的重链可变结构域序列，例如，在SEQ ID NO：25或27的C末端缺失氨基酸SS的氨基酸序列的重链可变结构域序列，和含有选自SEQ ID NO：26和28的氨基酸序列的轻链可变结构域序列。在一些实施方案中，所述抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含含有SEQ IDNO：27的氨基酸序列的重链可变结构域序列和含有SEQ ID NO：28的氨基酸序列的轻链可变结构域序列。在一些实施方案中，所述抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含含有SEQ IDNO：27的氨基酸序列变体的重链可变结构域序列，例如，在SEQ ID NO：27的C末端缺失氨基酸SS的氨基酸序列的重链可变结构域序列，和含有SEQ ID NO：28的氨基酸序列的轻链可变结构域序列。
在可选的实施方案中，前述液体配制剂，或冻干剂或其复溶的药物组合物，或冻干配制剂或其复溶的药物组合物，或制品中所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的抗CD20结合部分来源于抗CD20抗体，其包含含有SEQ ID NO：29和31的氨基酸序列的重链可变结构域序列和含有SEQ ID NO：30和32的氨基酸序列的轻链可变结构域序列。在一些实施方案中，所述抗CD20结合部分来源于抗CD20抗体，其包含含有SEQ ID NO：31的氨基酸序列的重链可变结构域序列和含有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链可变结构域序列。
在可选的实施方案中，所述第一抗原结合部分连接至第一二聚化结构域，并且所述第二抗原结合部分连接至第二二聚化结构域，其中所述第一和所述第二二聚化结构域是相缔合的。在可选的实施方案中，所述缔合是经由连接子、二硫键、氢键、静电相互作用、盐桥或疏水-亲水相互作用或其组合实现的。
在可选的实施方案中，所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含抗体铰链区的至少一部分，其可选地来源于IgG1、IgG2或IgG4。
在可选的实施方案中，所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含抗体CH2结构域，和/或抗体CH3结构域。
在可选的实施方案中，所述第一二聚化结构域在第三接合结构域可操作地连接至所述第一TCR恒定区(C1)。
在可选的实施方案中，所述第二二聚化结构域可操作地连接至所述第二抗原结合部分的重链可变结构域。
在可选的实施方案中，所述第一和所述第二二聚化结构域是不同的，并且以不利于同源二聚化和/或有利于异源二聚化的方式相缔合。
在可选的实施方案中，所述第一和所述第二二聚化结构域能够经由把手入孔、疏水相互作用、静电相互作用、亲水相互作用或增加的柔性而缔合成为异源二聚体。
在可选的实施方案中，前述液体配制剂，或冻干剂或其复溶的药物组合物，或冻干配制剂或其复溶的药物组合物，或制品中所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含以下四个多肽序列的组合：SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:35，和SEQ ID NO:36。
在可选的实施方案中，前述液体配制剂，或冻干剂或其复溶的药物组合物，或冻干配制剂或其复溶的药物组合物，或制品中所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含以下四个多肽序列的组合：SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40。
在可选的实施方案中，前述液体配制剂，或冻干剂或其复溶的药物组合物，或冻干配制剂或其复溶的药物组合物，或制品中所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含以下四个多肽序列的组合：SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:43，和SEQ ID NO:44。
在可选的实施方案中，前述液体配制剂，或冻干剂或其复溶的药物组合物，或冻干配制剂或其复溶的药物组合物，或制品中所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含以下四个多肽序列的组合：SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48。
在可选的实施方案中，前述液体配制剂，或冻干剂或其复溶的药物组合物，或冻干配制剂或其复溶的药物组合物，或制品中所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含以下四个多肽序列的组合：SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52。
在可选的实施方案中，其中SEQ ID NO：44所示的多肽的第193、182、203、206或207位的一个或多个氨基酸被修饰为除丝氨酸和/苏氨酸以外的任意氨基酸，从而消除糖基化位点，优选地，第193位的氨基酸被修饰。
在可选的实施方案中，其中SEQ ID NO：44所示的多肽第193位氨基酸被修饰为丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸或缬氨酸。
本发明的前述和其他特征以及优势在下文引用附图进行的对几个实施方式的详述中将变得明显。
附图说明
图1呈现了所研究的抗体形式的示意图，其中“E17R-1”、“F16-1”和“F17R-1”分别示意性表示双特异性抗体W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP、W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP和W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP的形式，“F18R-1”示意性表示双特异性抗体W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP和W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP的形式。在本公开的上下文中，双特异性抗体命名中的“U”是指抗CD20抗体或抗CD20结合部分，双特异性抗体命名中的“T”是指抗CD3抗体或抗CD3结合部分。“T”的恒定区(CL和CH1)被TCR的恒定结构域取代以设计与常规抗体正交的独特的轻-重链界面。将TCR修饰的“T”和天然的“U”与Fc结构域中的“把手入孔”突变共同用于设计双特异性抗体形式“E17R-1”、“F16-1”、“F17R-1”和“F18R-1”。
图2显示了通过FACS检测的靶标结合：(A)本公开的双特异性抗体(WBP3278 BsAb)与Jurkat细胞的结合检测，(B)本公开的双特异性抗体(WBP3278 BsAb)与Raji细胞的结合检测。
图3显示了通过FACS检测的同时双靶标结合。
图4显示了T细胞杀伤。
图5A和5B分别显示了以CD25表达和CD69表达所示的T细胞激活。
图6显示了CD4+T细胞的IL-2(A)和TNF-α(B)释放。
图7显示了血清稳定性的结果。
图8显示了本发明的BsAb在体内治疗性治疗模型中的剂量依赖性的抗肿瘤活性。
图9显示了对首次用于免疫的雄性食蟹猴施用WBP3278 lead Ab(即,W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4)后外周血循环B细胞的消耗。
图10A、10B和10C显示了用WBP3278 lead Ab治疗后外周血循环T细胞水平的变化。
图11显示了用WBP3278 lead Ab治疗后循环细胞因子水平的变化。
图12显示了WBP3278 lead Ab的血清浓度随时间的变化。
具体实施方式
本发明的以下描述只为说明本发明的多种实施方式。
定义
“组氨酸盐缓冲液”是包含组氨酸根离子的缓冲液，或包含组氨酸和/或组氨酸盐的缓冲液，其中组氨酸包括组氨酸和/或其水合物，组氨酸盐包括组氨酸盐和/或其水合物。组氨酸盐缓冲液的示例包括组氨酸-盐酸盐，组氨酸-醋酸盐，组氨酸-磷酸盐，组氨酸-硫酸盐，组氨酸-盐酸组氨酸等缓冲液，优选组氨酸-盐酸组氨酸。组氨酸-盐酸组氨酸是指组氨酸和盐酸组氨酸的组合，其中组氨酸包括组氨酸和/或其水合物，盐酸组氨酸包括盐酸组氨酸和/或其水合物，其中一个实例，组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液是由组氨酸与一水合盐酸组氨酸(C6H9N3O2·HCl·H2O)配制而成。
“琥珀酸盐缓冲液”是包括琥珀酸根离子的缓冲液，或包含琥珀酸和/或琥珀酸盐的缓冲液，其中琥珀酸包括琥珀酸和/或其水合物，琥珀酸盐包括琥珀酸盐和/或其水合物。琥珀酸盐缓冲液的示例包括琥珀酸-琥珀酸钠、琥珀酸-琥珀酸钾、琥珀酸-琥珀酸钙盐等，优选的琥珀酸盐缓冲液是琥珀酸-琥珀酸钠。琥珀酸-琥珀酸钠是指琥珀酸和琥珀酸钠的组合，其中琥珀酸包括琥珀酸和/或其水合物，琥珀酸钠包括琥珀酸钠和/或其水合物。
“枸橼酸盐缓冲液”是包括枸橼酸根离子的缓冲液，或包含枸橼酸和/或枸橼酸盐的缓冲液，其中枸橼酸包括枸橼酸和/或其水合物，枸橼酸盐包括枸橼酸盐和/或其水合物。枸橼酸盐缓冲液的示例包括枸橼酸-枸橼酸钠、枸橼酸-枸橼酸钾、枸橼酸-枸橼酸钙、枸橼酸-枸橼酸镁等，优选的枸橼酸盐缓冲液是枸橼酸-枸橼酸钠。枸橼酸-枸橼酸钠是指枸橼酸和枸橼酸钠的组合，其中枸橼酸包括枸橼酸和/或其水合物，枸橼酸钠包括枸橼酸钠和/或其水合物，其中一个实例，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液是一水合枸橼酸酸(C6H8O7·H2O)与二水合枸橼酸钠(C6H5 Na3O7·2H2O)配制而成。
“缓冲液”和“缓冲剂”是帮助维持配制剂的pH在接近生理条件的范围，适用于本发明使用的缓冲液/剂包括成对的无机酸及其盐或有机酸及其盐，如枸橼酸盐缓冲液/剂(例如枸橼酸-枸橼酸钾混合物、或枸橼酸-枸橼酸钠混合物等)，琥珀酸盐缓冲液/剂(例如琥珀酸-琥珀酸钠混合物、或琥珀酸-氢氧化钠混合物等)，组氨酸盐缓冲液/剂(例如组氨酸-盐酸组氨酸混合物)。其中一个实例，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液/剂是一水合枸橼酸酸(C6H8O7·H2O)与二水合枸橼酸钠(C6H5 Na3O7·2H2O)配制而成。
“药物组合物”和“配制剂”意在涵盖以任选地特定的量包含特定成分(例如双特异性抗CD3/CD20多肽复合物)的产物，以及任何通过以任选地特定的量组合特定成分直接或间接产生的任何产物。“稳定的”或“稳定化的”药物组合物或配制剂是其中活性成分(例如蛋白或抗体)保存时在其中基本保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的药物组合物或配制剂。本领域已有多种用于测量活性成分稳定性的分析技术例如在Peptideand ProteinDrug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中进行了综述。稳定性可在所选温度和其他保存条件下在所选时间段测量。举例来说，如果在目检颜色和/或澄清度后，或者通过UV光散射、尺寸排阻色谱法(SEC)和差示扫描量热法(DSC)测得，活性成分没有显示出显著的聚集增加、沉淀和/或变性，那么所述活性成分在药物配制剂中“保留它的物理稳定性”。优选地，当使用本发明的配制剂时，如通过SEC-HPLC或任何其他合适的用于测量聚集形成的方法时，5％或更少，4％或更少，优选地3％或更少的活性成分形成聚集物。如果活性成分(例如蛋白或抗体)没有显示出显著的化学改变，那么所述活性成分(例如蛋白或抗体)在药物配制剂中“保留它的化学稳定性”。通过检测和定量化学上改变的形式的蛋白或抗体，可以评估化学稳定性。经常改变蛋白化学结构的降解过程包括水解或截短(通过诸如尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE等方法来评价)、氧化(通过诸如与质谱法或MALDI/TOF/MS结合的肽谱法等方法来评价)、脱酰胺作用(通过诸如离子交换色谱法、毛细管等电聚焦、肽谱法、异天冬氨酸测量等方法来评价)和异构化(通过测量异天冬氨酸含量、肽谱法等来评价)。如果活性成分(例如蛋白或抗体)在给定时间的生物学活性为制备药物配制剂时的生物学活性的至少约90％(在测定误差内)，则活性成分(例如蛋白或抗体)在药物配制剂中于给定时间“保持其生物学活性”，例如通过抗原结合测定来确定。在一些方案中，所述药物组合物或所述配制剂为水溶性注射液，所述水溶性注射液包括但不限于未经冻干的水溶性制剂或冻干粉重构的水溶性制剂。在另一些方案中，所述药物组合物或所述配制剂为冻干制剂。所述冻干制剂是指水溶液经历冻干过程制备制剂，冻干是一个稳定化过程，其中物质首先被冷冻，然后先通过升华降低溶剂数量(初级干燥过程)，然后通过脱附作用降低溶剂数量(二级干燥过程)，直到溶剂数量为不再支持生物学活性或化学反应的值。本发明的冻干制剂还可以通过本领域已知的其它方法干燥，如喷雾干燥和鼓泡干燥(bubbledrying)。
冠词“一种”、“一个”和“所述”在此用于指代该冠词的语法对象的一个/种或多于一个/种(即至少一个/种)。举例来说，“一种/个配制剂”指一种/个配制剂或多于一种/个配制剂。
术语“约”或“大约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，在本领域中“约”或“大约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者“约”或“大约”或“表示所述值加上或减去15％、10％、5％或1％的范围。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。本发明中除另外说明，否则“约XX”或“大约XX”或“基本上包含XX”的含义是该具体值“XX”的可接受误差范围内的数值(包括数值“XX”本身，以及本领域一般技术人员测定该数值的可接受误差范围内的数值)。在本申请全文中，除非上下文另有规定，词语“包含”、“包括”和“含有”将被理解为表示包括所述的步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其他步骤或要素或一组步骤或要素。“由……组成”所表示的是包括并且限于短语“由……组成”之后的内容。因此，短语“由……组成”表示所列出的要素是需要的或必需的，并且没有其他要素可存在。“基本由……组成”所表示的是包括列于此短语之后的任意要素，并且限于不妨碍或有助于所列的要素的如在本申请中详述的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本由……组成”表示所列出的要素是需要的或必需的，但其他要素是可选的并可取决于其是否影响所列出的要素的活性或作用而存在或不存在。
在本申请全文中提及的“一个实施方式”、“实施方式”、“特定实施方式”、“相关实施方式”、“某种实施方式”、“另外的实施方式”或“进一步的实施方式”或其组合表示所描述的与所述实施方式相关的特定特征、结构或特性包含于本申请的至少一个实施方式中。因此，在本说明书全文各处出现前述用语未必都指同一实施方式。此外，所述特定特征、结构或特性可在一个或多个实施方式中以任意适宜方式组合。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本申请中可互换使用，其指氨基酸残基的聚合物，或多个氨基酸残基聚合物的集合体。这些术语应用于其中的一个或多个氨基酸残基为对应的天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸为由遗传密码编码的氨基酸，以及之后经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即α碳结合至氢、羧基、氨基和R基)的化合物，例如高丝氨酸、去甲亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这样的类似物具有经修饰的R基(例如去甲亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。α-碳是指附接至官能团(如羰基)的第一个碳原子。β碳是指连接至α碳的第二个碳原子，并且此体系依希腊字母的字母排列顺序继续命名碳原子。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但以与天然存在的氨基酸相似的方式作用的化学化合物。术语“蛋白”通常是指大多肽。术语“肽”通常是指短多肽。多肽序列通常记述为多肽序列的左手端为氨基末端(N末端)；多肽序列的右手端为羧基末端(C末端)。用于本申请的“多肽复合物”是指包含一个或多个与实现某些功能相关的多肽的复合物。在某些实施方式中，所述多肽是免疫相关的。
本发明中使用的术语“抗体”涵盖任意可结合某特定抗原的免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或双特异性(双价)抗体。一个天然的完整抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由一个可变区(“HCVR”)以及第一、第二和第三恒定区(分别为CH1、CH2、CH3)组成，而每条轻链由一个可变区(“LCVR”)以及一个恒定区(CL)组成。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ，哺乳动物的轻链可分为λ或κ。抗体呈“Y”型，“Y”型结构的主干由两条重链的第二和第三恒定区组成，其通过二硫键结合。“Y”型结构的每条臂包含其中一条重链的可变区和第一恒定区，其与一条轻链的可变区和恒定区结合。轻链和重链的可变区负责抗原的结合。每条链的可变区均含有三个高变环，称互补决定区(CDR)(轻(L)链的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重(H)链的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。抗体的CDR边界可通过Kabat、Chothia或Al-Lazikani命名法命名或识别(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，273(4)，927(1997)；Chothia,C.等，J Mol Biol.Dec 5；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，196,901(1987)；Chothia,C.等，Nature.Dec 21-28；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等，National Institutes ofHealth，Bethesda,Md.(1991))。其中，三个CDR由被称为框架区(FR)的侧面连续部分间隔开，框架区比CDR更加高度保守并形成一个支架支撑超变环。HCVR和LCVR各包含4个FR，并且CDR和FR自氨基端至羧基端依以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。根据是否含有α、δ、ε、γ和μ重链，抗体可分别分为五个主要的分类或同种型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。几个主要的抗体分类还可分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)等。
用于本申请的术语“可变结构域”用于抗体时，是指包含一个或多个CDR的抗体可变区或其片段。尽管可变结构域可包含完整可变区(如HCVR或LCVR)，其也可能包含小于完整可变区但仍保持与抗原结合或形成抗原结合位点的能力。
用于本申请的术语“抗原结合部分”是指由含有一个或多个CDR的抗体部分所形成的抗体片段或者任何其他结合抗原但不具有完整抗体结构的抗体片段。抗原结合部分的例子包含但不限于可变结构域、可变区、双功能抗体(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv－dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds diabody)、多特异性抗体、骆驼化单域抗体(camelized single domainantibody)、纳米抗体、域抗体和双价域抗体。抗原结合部分可以与母体抗体结合相同的抗原。在某些实施方式中，抗原结合部分可包含移接至来自一个或多个不同的人抗体的框架区的来自特定人抗体的一个或多个CDR。抗原结合部分的更多详细的形式记述于Spiess等，2015(同上)和Brinkman等，mAbs，9(2)，pp.182–212(2017)，其全部内容通过引用并入本文。
抗体的“Fab”是指由一条轻链(包含可变区和恒定区)和一条重链的可变区和第一恒定区经二硫键结合起来的那部分抗体。在某些实施方式中，轻链和重链的恒定区均由TCR恒定区取代。
“Fab'”是指包含了部分铰链区的Fab片段。
“F(ab')2”指的是Fab的二聚体。
抗体的“fragment difficult(Fd)”是指可以与轻链组合以形成Fab的重链片段氨基末端的半段。
抗体的“Fc”指的是由第一重链的第二(CH2)、第三(CH3)恒定区经二硫键结合第二重链的第二和第三恒定区而组成的抗体的部分。抗体的Fc部分负责多种不同的效应功能，如ADCC和CDC，但不参与抗原的结合。
就抗体而言的“铰链区”包含将CH1结构域连接至CH2结构域的重链分子的部分。此铰链区包含大约25个氨基酸残基且是柔性的，从而使得两个N末端抗原结合区可以独立移动。
用于本申请的术语“CH2域”是指包含重链分子自IgG抗体的例如约氨基酸244延伸至氨基酸360的部分，使用常规编号方案(氨基酸244至360，Kabat编号系统；以及氨基酸231-340，EU编号系统；参见Kabat,E.等，U.S.Department of Health and Human Services(1983))。
“CH3结构域”自IgG分子的CH2结构域延伸至C末端，并且包含大约108个氨基酸。某些免疫球蛋白类别，例如IgM，进一步包含CH4区。
抗体的“Fv”指的是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由一条轻链的可变区结合一条重链的可变区组成。提供了数种Fv设计，包含dsFv，其中两个结构域之间的连接通过引入的二硫键增强；并且可以使用肽连接子将两个结构域结合在一起成为单个多肽而形成scFv。已产生了含有重免疫球蛋白链或轻免疫球蛋白链的可变结构域连接至对应的免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域和恒定结构域的Fv构建体。还已将Fv多聚化以形成双功能抗体和三功能抗体(Maynard等，Annu Rev Biomed Eng 2 339-376(2000))。
“ScFab”是指具有经由多肽连接子将Fd连接至轻链的融合多肽，产生了单链Fab片段(scFab)。
“TriFab”是指由3个具有Fab功能的单位组成的三价、双特异性的融合蛋白。TriFab容纳两个普通Fab融合至不对称的类Fab部分。
“Fab-Fab”是指通过将第一Fab臂的Fd链融合至第二Fab臂的Fd链的N末端形成的融合蛋白。
“Fab-Fv”是指通过将HCVR融合至Fd链的C末端，且将LCVR融合至轻链的C末端形成的融合蛋白。“Fab-dsFv”分子可以通过在HCVR结构域和LCVR结构域间引入域间二硫键而形成。
“MAb-Fv”或“IgG-Fv”是指通过HCVR结构域融合至一条Fc链的C末端和LCVR结构域单独表达或融合至另一条Fc链的C末端而形成的融合蛋白，从而产生双特异性、三价的IgG-Fv(mAb-Fv)融合蛋白，其Fv通过域间二硫键稳定。
“ScFab-Fc-scFv2”和“ScFab-Fc-scFv”是指单链Fab与Fc和二硫键稳定的Fv结构域融合形成的融合蛋白。
“附接IgG”是指Fab臂融合至IgG以形成双特异性(Fab)2-Fc的形式的融合蛋白。其可以形成Fab融合至IgG分子的C末端或N末端的“IgG-Fab”或“Fab-IgG”，无论是否存在连接子。在某些实施方式中，附接IgG可以被进一步修饰为IgG-Fab4的形式(参见Brinkman等，2017，同上)。
“DVD-Ig”是指双可变结构域抗体，其通过将第二特异性的另外的HCVR结构域和LCVR结构域融合至IgG重链和轻链形成。“CODV-Ig”是指其中两个HCVR和两个LCVR结构域以允许可变HCVR-LCVR结构域交叉配对的方式连接的相关形式，其(自N至C末端)以HCVRA-HCVRB和LCVRB-LCVRA的顺序，或以HCVRB-HCVRA和LCVRA-LCVRB的顺序排列。
“CrossMab”是指将未经修饰的轻链与对应的未经修饰的重链配对，以及将经修饰的轻链与对应的经修饰的重链配对，从而产生轻链中错配减少的抗体的技术。
“BiTE”是双特异性的T-细胞参与分子，包含具有LCVR-HCVR方向上的第一抗原特异性的第一scFv连接至具有HCVR-LCVR方向上的第二抗原特异性的第二scFv。
“WuXiBody”是包含可溶性嵌合蛋白的双特异性抗体，其具有抗体的可变结构域和TCR的恒定结构域，其中TCR恒定结构域的亚基(例如α和β结构域)通过工程化的二硫键连接。
当“百分比序列同一性”用于氨基酸序列(或核酸序列)时，是指在进行序列比对，并且必要时引入间隔使相同氨基酸(或核酸)数目达到最多后，在候选序列中，与参比序列相同的氨基酸(或核酸)残基占所述候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。所述氨基酸残基的保守取代可认为或可不认为是相同残基。可以通过本领域公开的工具，例如BLASTN、BLASTp(美国国家生物技术信息中心网站(NCBI)，也可参见Altschul S.F.等，J.Mol.Biol.，215:403–410(1990)；Stephen F.等，Nucleic Acids Res.，25:3389–3402(1997))、ClustalW2(欧洲生物信息研究所网站，还可参见Higgins D.G.等，Methods inEnzymology，266:383-402(1996)；Larkin M.A.等，Bioinformatics(英国牛津)，23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，对序列进行比对以确定氨基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。本领域技术人员可使用所述工具的默认参数或可根据比对的需要适当调整参数，例如通过挑选适宜的算法。
用于本申请的“抗原”或“Ag”是指可以在细胞培养或在动物体内刺激产生抗体或T细胞应答的化合物、组合物、肽、多肽、蛋白或物质，包含加入细胞培养物(如杂交瘤)中，或经注射或吸收进入动物的组合物(如包含癌特异性蛋白的组合物)。抗原与特异性的体液或细胞免疫的产物(如抗体，包含由异源抗原诱导的产物)反应。
“表位”或“抗原决定簇”是指抗原中与结合剂(如抗体)结合的区域。表位可以形成自连续的氨基酸(也称为线性或顺序表位)或通过蛋白的三级折叠而并列的非连续的氨基酸(也称为构型或构象表位)。形成自连续的氨基酸的表位通常在蛋白上沿着一级氨基酸残基线性排列，且连续的氨基酸的小段可以由与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原消化，或在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位在一个独特的空间构象中通常包含至少3个，更常见地包含至少5个、约7个或约8-10个氨基酸。
本申请中的“特异性结合”或“特异性的结合”是指两分子间的非随机结合反应，如抗体和抗原间的反应。在某些实施方式中，本申请所提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物与抗原特异性结合，并且其结合亲和力(KD)≤10-6M(例如≤5×10-7M、≤2×10-7M、≤10- 7M、≤5×10-8M、≤2×10-8M、≤10-8M、≤5×10-9M、≤2×10-9M、≤10-9M或≤10-10M)。用于本申请的KD是指解离速率与结合速率的比值(koff/kon)，可通过使用表面等离子共振法，例如使用如Biacore的仪器确定。
术语“可操作地连接”或“可操作地连接的”是指两个或更多个目标生物学序列的以使其处于使其以目的方式作用的关系的方式并列，无论是否存在间隔子或接头。当用于多肽时，该术语旨在表示多肽序列以使所连接的产物具有目的生物学功能的方式连接。例如，可将抗体可变区可操作地连接至恒定区，以形成具有抗原结合活性的稳定产物。所述术语还可用于多核苷酸。举例来说，当编码多肽的多核苷酸可操作地连接至调控序列(例如启动子、增强子、沉默子序列等)时，该术语旨在表示所述多核苷酸序列以允许所述多肽由所述多核苷酸调控表达的方式连接。
术语“融合”或“融合的”在用于氨基酸序列(例如肽、多肽或蛋白)时，是指例如通过化学键合或重组手段，将两个或更多个氨基酸序列组合成为非天然存在的单一氨基酸序列。融合氨基酸序列可通过两个编码多核苷酸序列的基因重组产生，并且可以通过将含有重组的多核苷酸的构建体引入宿主细胞的方法来表达。
用于本申请的术语“间隔子”是指具有1、2、3、4或5个氨基酸残基，或长度为5至15、20、30、50或更多个氨基酸残基的通过肽键连接且用于连接一个或多个多肽的人造氨基酸序列。间隔子可具有或可不具有二级结构。间隔子序列是本领域公知的，参见例如Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)；Poljak等，Structure 2:1121-1123(1994)。可以使用本领域公知的任意适宜的间隔子。
术语“抗原特异性”是指被抗原结合分子选择性地识别的特定抗原或其表位。
用于本申请的术语“取代”在用于氨基酸残基时是指在肽、多肽或蛋白中将天然存在的或引入的一个或多个氨基酸用另一个取代。多肽中的取代可导致多肽功能的减弱、增强或消除。
取代还可以是“保守取代”，其针对氨基酸序列时是指将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的不同氨基酸残基取代，或者对那些对多肽的活性并非至关重要的氨基酸的取代。例如，可以在非极性侧链氨基酸残基间(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile、Pro、Phe、Trp)、不带电的极性侧链残基间(例如Cys、Ser、Thr、Asn、Gly和Gln)、酸性侧链残基间(例如Asp、Glu)、碱性侧链氨基酸间(例如His、Lys和Arg)、β分支侧链氨基酸间(例如Thr、Val和Ile)、含硫侧链氨基酸间(例如Cys和Met)或芳香侧链残基间(例如Trp、Tyr、His和Phe)进行保守取代。在某些实施方式中，取代、删除或添加也可以认为是“保守取代”。插入或删除的氨基酸的数量的范围可以为约1至5。保守取代通常不引起蛋白构象结构上的显著变化，并且因此能保持蛋白的生物学活性。
本申请使用的术语“突变”或“突变的”在用于氨基酸残基时是指氨基酸残基的取代、插入或添加。
本申请使用的术语“T细胞”是指在细胞介导的免疫中起着重要作用的一类淋巴细胞，包含辅助性T细胞(例如CD4+T细胞、T辅助性1型T细胞、T辅助性2型T细胞、T辅助性3型T细胞、T辅助性17型T细胞)、细胞毒性T细胞(例如CD8+T细胞)、记忆T细胞(例如中央型记忆T细胞(TCM细胞)、效应型记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)和常驻型记忆T细胞(TRM)，其为CD8+或CD4+)、自然杀伤T(NKT)细胞和抑制性T细胞。
天然“T细胞受体”或天然“TCR”是与不变的CD3链结合以形成能够介导信号转导的复合物的异二聚T细胞表面蛋白。TCR属于免疫球蛋白超家族，且与具有单一重链和单一轻链的半抗体相似。天然TCR具有胞外部分、跨膜部分和胞内部分。TCR的胞外结构域具有近膜恒定区和远膜可变区。
本申请使用的术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”是指需要诊断、预后、缓解、预防和/或治疗疾病或病症的人或非人动物，包含哺乳动物或灵长类。哺乳类受试者包含人、畜养动物、农场动物，以及动物园、竞技或宠物动物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、牛、熊等。
“治疗”或“疗法”包括预防或减轻某种病况，降低某种病况兴起或发展的速度，减少发展出某种病况的风险，预防或延迟与某种病况相关的症状发展，减少或终止与某种病况相关的症状，产生某种病况的完全或部分的逆转，治愈某种病况，或以上的组合。对于癌症，“治疗”或“疗法”可指抑制或减缓肿瘤性或恶性的细胞生长、增生或转移，预防或延缓肿瘤性或恶性的细胞生长、增生或转移的发展，或其一些组合。对于肿瘤，“治疗”或“疗法”包含除掉全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延缓肿瘤的发展，或其一些组合。
双特异性抗CD3/CD20多肽复合物
用于本申请的术语“双特异性”表示存在两个抗原结合部分，其各自能够与不同抗原或相同抗原上的不同表位特异性结合。本申请提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含与第二抗原结合部分相缔合的第一抗原结合部分，并且其中之一与CD3特异性结合，另一个与CD20特异性结合。也就是说，所述第一抗原结合部分可与CD3特异性结合，且所述第二抗原结合部分可与CD20特异性结合。或者，所述第一抗原结合部分可与CD20特异性结合，且所述第二抗原结合部分可与CD3特异性结合。在本发明中，术语“双特异性抗CD3xCD20多肽复合物”与“靶向CD3和CD20的多肽复合物”或“抗CD3和CD20多肽复合物”或“双特异性抗CD3/CD20多肽复合物”可互换使用。
在某些实施方式中，本申请提供一种双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，其包含与第二抗原结合部分相缔合的第一抗原结合部分，其中：
所述第一抗原结合部分包含：
第一多肽，所述第一多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一重链可变结构域(VH)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，和
第二多肽，所述第二多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一轻链可变结构域(VL)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)，
其中：
C1和C2能够形成包含至少一个在C1和C2之间的非天然的链间键的二聚体，并且所述非天然的链间键能够稳定所述二聚体，以及
所述第二抗原结合部分包含：
第二抗体的第二重链可变结构域(VH2)，其可操作地连接至抗体重链CH1结构域，和
第二抗体的第二轻链可变结构域(VL2)，其可操作地连接至抗体轻链恒定(CL)结构域，
其中：所述第一和所述第二抗原结合部分中的一个是抗CD3结合部分，并且另一个是抗CD20结合部分，
抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含：
a)包含选自SEQ ID NO：1和13的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含选自SEQ ID NO：2和14的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含选自SEQ ID NO：3和15的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含选自SEQ ID NO：4和16的氨基酸序列的κ轻链CDR1，
e)包含选自SEQ ID NO：5和17的氨基酸序列的κ轻链CDR2，和
f)包含选自SEQ ID NO：6和18的氨基酸序列的κ轻链CDR3，
抗CD20结合部分来源于抗CD20抗体，其包含：
a)包含选自SEQ ID NO：7和19的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含选自SEQ ID NO：8和20的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含选自SEQ ID NO：9和21的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含选自SEQ ID NO：10和22的氨基酸序列的κ轻链CDR1，
e)包含选自SEQ ID NO：11和23的氨基酸序列的κ轻链CDR2，和
f)包含选自SEQ ID NO：12和24的氨基酸序列的κ轻链CDR3。
在某些实施方式中，本申请提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含含有来源于TCR恒定区的序列的第一抗原结合部分，但所述第二抗原结合部分不含有来源于TCR恒定区的序列。
本申请提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物显著地更不容易具有错配的重链和轻链可变结构域。不希望受限于任何理论，据信所述第一抗原结合部分中的稳定的TCR恒定区可以彼此特异性连接，并因此有助于目标VH1和VL1的高度特异性的配对，同时阻碍VH1或VL1与不提供目标抗原结合位点的其他可变区形成不想要的错配。
在某些实施方式中，所述第二抗原结合部分进一步包含可操作地连接至VH2的抗体恒定CH1结构域，以及可操作地连接至VL2的抗体轻链恒定结构域。因此，所述第二抗原结合部分包含Fab。
当第一、第二、第三和第四可变结构域(例如VH1、VH2、VL1和VL2)在一个细胞中表达时，高度期望的是VH1与VL1特异性配对且VH2与VL2特异性配对，以使得到的双特异性蛋白产物会具有正确的抗原结合特异性。然而，在诸如杂交-杂交瘤(或四源杂交瘤)的现有技术中，VH1、VH2、VL1和VL2发生随机配对，从而导致多达10种不同分子的生成，其中仅有一种为有功能的双特异性抗原结合分子。这不仅降低了产率，还使目标产物的纯化变得复杂。
相比于第一和第二抗原结合部分均为天然Fab的对应部分的情况，由于可变结构域更不容易发生错配，因而本申请所提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物是优越的。在一个示例性的实例中，所述第一抗原结合结构域包含与VL1-C2配对的VH1-C1，且所述第二抗原结合结构域包含与VL2-CL配对的VH2-CH1。已出人意料地发现C1和C2优先与彼此相缔合，而且不太容易与CL或CH1相缔合，由此阻碍并显著减少诸如C1-CH、C1-CL、C2-CH和C2-CL的不想要的配对的形成。由于C1-C2的特异性缔合，VH1与VL1特异性配对并且从而形成所述第一抗原结合位点，以及CH1与CL特异性配对，从而允许提供所述第二抗原结合位点的VH2-VL2的特异性配对。相应地，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分更不容易错配，并且相比于所述第一和所述第二抗原结合部分均为天然Fab的对应部分(例如为VH1-CH1、VL1-CL、VH2-CH1和VL2-CL的形式)的情况，例如VH1-VL2、VH2-VL1、VH1-VH2、VL1-VL2之间的错配显著减少。
在某些实施方式中，本申请所提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物自细胞表达时，相比于在可比的条件下表达的参照分子，具有显著更少的错配产物(例如减少至少1、2、3、4、5或更多种错配产物)和/或显著更高的产率(例如提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或更多的产率)，其中所述参照分子除了以天然CH1取代C1和以天然CL取代C2之外，在其他方面与所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物相同。
包含工程化的Cα和Cβ的抗原结合部分
本申请所提供的第一抗原结合部分包含可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区的第一抗体重链可变结构域，以及可操作地连接至第二TCR恒定区的第一抗体轻链可变结构域，其中所述第一TCR恒定区和第二TCR恒定区经由至少一个非天然链间二硫键相缔合。所述第一抗原结合部分包含至少两条多肽链，其各自包含来源于抗体的可变结构域和来源于TCR的恒定区。因此，所述第一抗原结合部分包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其分别可操作地连接至一对TCR恒定区。在某些实施方式中，第一抗原结合部分中的TCR恒定区的配对是α/βTCR恒定区。本申请所提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的TCR恒定区能够通过至少一个非天然的二硫键彼此缔合以形成二聚体。
出人意料地发现，可以将本申请所提供的具有至少一个非天然二硫键的第一抗原结合部分重组表达，并组装成所需的构象，其稳定化TCR恒定区二聚体并提供抗体可变区的良好的抗原结合活性。另外，发现所述第一抗原结合部分良好地承受常规的抗体工程化，例如糖基化位点的修饰和一些天然序列的移除。此外，本申请所提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物可以被并入双异特性形式，其由于在所述第一抗原结合部分中存在TCR恒定区，可以容易地以抗原结合序列的最少错配或几乎无错配被表达和组装。本申请所提供的第一抗原结合部分和构建体的其他优势在以下公开的内容中将更加明显。
总而言之，本申请提供的第一抗原结合部分包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一重链可变结构域(VH)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，所述第二多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一轻链可变结构域(VL)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)，其中：C1和C2能够形成二聚体，并且C1和C2之间的非天然的链间二硫键能够稳定所述二聚体。
TCR恒定区
本申请所述的第一抗原结合部分包含来源于TCR的α或β恒定区。
人TCRα链恒定区被称为TRAC，其NCBI登录号为P01848。
人TCRβ链恒定区有两个不同的变体，称为TRBC1和TRBC2(IMGT命名法)(亦参见Toyonaga B等，PNAs，Vol.82，pp.8624-8628，Immunology(1985))。
在本申请中，本申请所提供的第一抗原结合部分的所述第一和所述第二TCR恒定区能够形成二聚体，所述二聚体包含所述TCR恒定区之间的至少一个能够稳定所述二聚体的非天然链间二硫键。
用于本申请的术语“二聚体”是指由两个分子(如多肽或蛋白)经由共价或非共价的相互作用形成的相缔合的结构。同源二聚体或同源二聚化由两个相同的分子形成，而异源二聚体或异源二聚化由两个不同的分子形成。由所述第一和所述第二TCR恒定区形成的二聚体为异源二聚体。
“突变的”氨基酸残基是指被取代、插入或添加并且不同于其对应的天然TCR恒定区中对应的天然残基的氨基酸残基。例如，如果将野生型TCR恒定区中特定位点处的氨基酸残基称为“天然”残基，那么其对应的突变残基为不同于所述天然残基但位于所述TCR恒定区上的相同位置的任何残基。突变残基可以是在相同位置取代天然残基的不同残基，或在天然残基之前插入并因此占据其原位置的不同残基。
在本文提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中，所述第一和/或所述第二TCR恒定区已被工程化以包含一个或多个负责形成所述非天然链间二硫键的突变氨基酸残基。为了将这样的突变残基引入所述TCR恒定区，可以操纵TCR区的编码序列，以例如将编码天然残基的密码子取代为编码突变残基的密码子，或者以将编码突变残基的密码子插入天然残基的密码子之前。
在本文提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中，所述第一和/或所述第二TCR恒定区已被工程化以包含一个或多个突变的半胱氨酸残基，使得在取代半胱氨酸残基之后，在两个TCR恒定区之间能形成非天然链间二硫键。
非天然链间二硫键能够稳定所述第一抗原结合部分。这种稳定方面的效果可以以各种方式体现。例如，突变氨基酸残基或非天然链间二硫键的存在可以使所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物能够稳定表达，和/或以高水平表达，和/或缔合至具有理想的生物活性(例如抗原结合活性)的稳定复合物，和/或表达并组装为高水平的具有理想的生物活性的理想的稳定复合物。可以使用本领域公知的适宜方法(如在SDS-PAGE上显示分子量，或通过差示扫描量热法(DSC)或差示扫描荧光法(DSF)测量热稳定性)来评估链间二硫键稳定所述第一和第二TCR恒定区的能力。在一个示例性的实例中，如果产物显示分子量与所述第一和所述第二多肽的组合的分子量相当，则可以通过SDS-PAGE确认形成了稳定的本申请所提供的第一抗原结合部分。在某些实施方式中，本申请所述的第一抗原结合部分是稳定的，体现于其热稳定性不少于天然Fab的50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施方式中，本申请所述的第一抗原结合部分是稳定的，体现于其热稳定性可与天然Fab相当。
不希望受到任何理论的限制，据信形成于所述第一抗原结合部分中的所述第一和所述第二TCR恒定区之间的所述非天然链间二硫键能够稳定TCR恒定区的异二聚体，从而增强所述异二聚体的和所述第一抗原结合部分的正确折叠水平、结构稳定性和/或表达水平。不同于T细胞表面的细胞膜上锚定的天然TCR，发现天然TCR胞外结构域的异二聚体更不稳定，尽管其在3D结构上与抗体Fab相似。事实上，天然TCR在溶解状态中的不稳定性曾是使其晶体结构难以阐明的显著阻碍(参见Wang，Protein Cell，5(9)，pp.649–652(2014))。通过将一对半胱氨酸(Cys)突变引入TCR恒定区并且从而使链间非天然二硫键能够形成，可以稳定表达所述第一抗原结合部分同时保留抗体可变区的抗原结合能力。
包含突变残基的TCR恒定区在本申请中也称为“工程化的”TCR恒定区。在某些实施方式中，所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的第一TCR恒定区(C1)包含工程化的TCRα链(Cα)，并且所述第二TCR恒定区(C2)包含工程化的TCRβ链(Cβ)。在本文提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中，C1包含工程化的Cβ，且C2包含工程化的Cα。
在本文提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中，所述工程化的TCR恒定区包含一个或多个突变的半胱氨酸残基，所述一个或多个突变的残基包含于所述第一和/或所述第二工程化的恒定区的接触界面内。
用于本申请的术语“接触界面”是指在所述多肽上所述多肽彼此相互作用/相缔合的特定区域。接触界面包含一个或多个氨基酸残基，其能够在相互作用发生时与接触或缔合的对应的氨基酸残基相互作用。接触界面中的氨基酸残基可处于或可不处于连续的序列中。例如，当所述界面是三维的时，所述界面内的氨基酸残基可以在线性序列上的不同位置彼此分开。
在某些实施方式中，所述工程化的Cα与所述工程化的Cβ之间可以形成一个或多个二硫键。在某些实施方式中，所述半胱氨酸残基的配对能够形成非天然链间二硫键。
用于本申请全文的关于TCR恒定区的“XnY”旨在表示TCR恒定区上的第n个氨基酸残基X被取代为氨基酸残基Y，其中X和Y分别为特定氨基酸残基的单字母缩写。
在本文提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中，所述工程化的Cβ包含或为SEQID NO:61，并且所述工程化的Cα包含或为SEQ ID NO:62。
SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62的序列提供于下文：
LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA(SEQ ID NO:61)
PDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS(SEQ ID NO:62)
在本申请所提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中，在本申请提供的第一抗原结合部分中，天然TCR恒定区中存在的一个或多个天然糖基化位点可被修饰(例如移除)。用于本申请的术语“糖基化位点”用于多肽序列时是指带有碳水化合物部分(例如寡糖结构)可以附接至其的侧链的氨基酸残基。多肽(诸如抗体)的糖基化通常是N连接的或O连接的。N连接的是指碳水化合物部分附接至天冬酰胺残基的侧链，例如三肽序列如天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸中的天冬酰胺残基，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。O连接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附接至羟基氨基酸，最常见的是附接至丝氨酸或苏氨酸。通过改变氨基酸序列，使得存在于该序列中的上述三肽序列(对于N连接的糖基化位点)中的一个或多个或者丝氨酸或苏氨酸残基(对于O连接的糖基化位点)中的一个或多个被取代，可以方便地实现对天然糖基化位点的移除。
在本申请所提供的第一抗原结合部分中，至少一个天然糖基化位点在所述工程化的TCR恒定区中(例如在所述第一和/或所述第二TCR恒定区中)不存在。不希望受限于任何理论，据信本申请所述的第一抗原结合部分可以允许移除全部或部分糖基化位点，而不影响蛋白表达和稳定性，这与现有教导相反，即N连接的糖基化位点在TCR恒定区如Cα(即N34、N68和N79)和Cβ(即N69)上的存在对于蛋白表达和稳定性是必要的(参见Wu等，Mabs，7:2，364-376，2015)。
在本申请所提供的第一抗原结合部分中，来源于TCR的恒定区可操作地连接至来源于抗体的可变区。
在某些实施方式中，所述第一抗体可变结构域(VH)在第一接合结构域融合至所述第一TCR恒定区(C1)，所述第一抗体可变结构域(VL)在第二接合结构域融合至所述第二TCR恒定区(C2)。
用于本申请的术语“接合结构域”是指两个氨基酸序列融合或组合的交界或边界区。在某些实施方式中，所述第一接合结构域包含抗体V/C接合子的C末端片段的至少一部分，以及第二接合结构域包含TCR V/C接合子的N末端片段的至少一部分。
用于本申请的术语“抗体V/C接合子”是指抗体可变结构域和恒定结构域的交界，例如重链可变结构域与CH1结构域之间或轻链可变结构域与轻链恒定结构域之间的交界。相似地，术语“TCR V/C接合子”是指TCR可变结构域和恒定结构域的交界，例如TCRα可变结构域与恒定结构域之间或TCRβ可变结构域与恒定结构域之间的交界。
在某些实施方式中，所述第一多肽包含序列，所述序列包含如式(I)可操作连接的结构域：VH-HCJ-C1，且所述第二多肽包含序列，所述序列包含如式(II)可操作连接的结构域：VL-LCJ-C2，其中：
VH为抗体的重链可变结构域；HCJ为如上文定义的第一接合结构域；C1为如上文定义的第一TCR恒定结构域；VL为抗体的轻链可变结构域；LCJ为如上文定义的第二接合结构域；C2为如上文定义的第二TCR恒定结构域。
抗体可变区
本申请所提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含与第二抗原结合部分缔合的第一抗原结合部分，且其中的一个特异性地与CD3结合，另一个特异性地与CD20结合。在本申请提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中，所述第一抗原结合部分包含第一抗体的第一重链可变结构域(VH1)和第一轻链可变结构域(VL1)，并且所述第二抗原结合部分包含第二抗体的第二重链可变结构域(VH2)和第二轻链可变结构域(VL2)，其中所述第一抗体和所述第二抗体是不同的并且选自由抗CD3抗体和抗CD20抗体组成的组。在某些实施方式中，所述第一抗体是抗CD3抗体，第二抗体是抗CD20抗体。在某些其他实施方式中，所述第一抗体为抗CD20抗体，且所述第二抗体为抗CD3抗体。
在常规的天然抗体中，可变区包含由侧翼的框架(FR)区间隔开的3个CDR区，例如自N末端至C末端以下式所列出的：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
a)抗-CD3结合部分
在本文提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中，所述第一抗原结合部分或所述第二抗原结合部分为抗CD3结合部分。
在某些实施方式中，所述抗CD3结合部分来源于下表A显示的抗体W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP和W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP。以下提供了W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP和W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD3结合部分的CDR序列。
表A
以下提供了W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP和W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD3结合部分的重链和κ轻链可变区序列。
VH-氨基酸序列(SEQ ID NO:25)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTTYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIFPGNDNIKYSEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIDSVSIYYFDYWGQGTLVTVSS
VH-核酸序列(SEQ ID NO:53)：
caggtgcaactcgtgcagtctggagctgaagtgaagaagcctgggtcttcagtcaaggtcagttgcaaggccagtgggtattccttcactacctactacatccactgggtgcggcaggcaccaggacaggggcttgagtggatgggctggatctttcccggcaacgataatattaagtacagcgagaagttcaaagggagggtcaccattaccgccgacaaatccacttccacagcctacatggagttgagcagcctgagatccgaggatacagccgtgtactactgtgccattgacagcgtgtccatctactactttgactactggggccagggcacactggtcacagtgagcagc
Vκ-氨基酸序列(SEQ ID NO:26)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGGGTKVEIK
Vκ-核酸序列(SEQ ID NO:54)：
gacatcgtcatgacccagtccccagactctttggcagtgtctctcggggaaagagctaccatcaactgcaagagcagccagtcccttctgaacagcaggaccaggaagaattacctcgcctggtaccaacagaagcccggacagcctcctaagctcctgatctactgggcctcaacccggaagagtggagtgcccgatcgctttagcgggagcggctccgggacagatttcacactgacaatttcctccctgcaggccgaggacgtcgccgtgtattactgtactcagagcttcattctgcggacatttggcggcgggactaaagtggagattaag
在一些实施方案中，W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP和W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD3结合部分的重链可变区序列为SEQ ID NO：25的氨基酸序列变体，例如，在SEQ ID NO：25的C末端缺失氨基酸SS的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗CD3结合部分来源于下表B显示的抗体W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP，W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP和W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP。以下提供了W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP，W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP和W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD3结合部分的CDR序列。
表B
以下提供了W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP，W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP和W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD3结合部分的重链和κ轻链可变区序列。
VH-氨基酸序列(SEQ ID NO:27)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSS
VH-核酸序列(SEQ ID NO:55)：
caggtgcagcttgtgcagtctggggcagaagtgaagaagcctgggtctagtgtcaaggtgtcatgcaaggctagcgggttcgcctttactgactactacatccactgggtgcggcaggctcccggacaagggttggagtggatgggatggatctccccaggcaatgtcaacacaaagtacaacgagaacttcaaaggccgcgtcaccattaccgccgacaagagcacctccacagcctacatggagctgtccagcctcagaagcgaggacactgccgtctactactgtgccagggatgggtactccctgtattactttgattactggggccagggcacactggtgacagtgagctcc
Vκ-氨基酸序列(SEQ ID NO:28)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK
Vκ-核酸序列(SEQ ID NO:56)：
gatatcgtgatgacccagagcccagactcccttgctgtctccctcggcgaaagagcaaccatcaactgcaagagctcccaaagcctgctgaactccaggaccaggaagaattacctggcctggtatcagcagaagcccggccagcctcctaagctgctcatctactgggcctccacccggcagtctggggtgcccgatcggtttagtggatctgggagcgggacagacttcacattgacaattagctcactgcaggccgaggacgtggccgtctactactgtactcagagccacactctccgcacattcggcggagggactaaagtggagattaag
本文提供的抗CD3结合部分还包含合适的框架区(FR)序列，只要所述抗CD3结合部分可以特异性结合CD3。
在一些实施方案中，W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP，W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP和W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD3结合部分的重链可变区序列为SEQ ID NO：27的氨基酸序列变体，例如，在SEQ ID NO：27的C末端缺失氨基酸SS的氨基酸序列。
本申请的抗CD3抗体对表达CD3的细胞(例如CD4+T细胞)具有特异性结合亲和力，并且可以激活人T细胞并触发TNFα和IFNγ的细胞因子释放。
本申请所提供的抗CD3结合部分的结合亲和力可以由KD值表示，其表示当抗原和抗原结合分子之间的结合达到平衡时解离速率与缔合速率的比值(koff/kon)。使用本领域公知的适宜方法，包括例如流式细胞术测定，可以恰当地确定抗原结合亲和力(例如KD)。在一些实施方式中，可以通过流式细胞术确定不同浓度下抗体与抗原的结合，可以首先将确定的平均荧光强度(MFI)对抗体浓度制图，随后可以通过使用Prism版本5(GraphPadSoftware，圣地亚哥，加利福尼亚)将特异性结合荧光强度(Y)与抗体浓度(X)的依赖性拟合至单位点饱和方程式：Y＝Bmax*X/(KD+X)，从而计算出KD值，其中Bmax是指待测抗体与抗原的最大特异性结合。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD3结合部分能够特异性地与表达在细胞表面上的人CD3或重组人CD3结合。CD3为在细胞上表达的受体。重组CD3为重组表达且不与细胞膜缔合的可溶性CD3。重组CD3可以通过多种重组技术制备。在一个实例中，编码人CD3胞外结构域(NP_000724.1)(Met1-Asp126)的CD3 DNA序列可在表达载体中在C末端处与聚组氨酸标签融合，并随后在293E细胞中被转染与表达，并通过镍亲和层析纯化。
在一些实施方式中，本申请所提供的抗CD3结合部分能够以不超过5×10-9M、不超过4×10-9M、不超过3×10-9M、不超过2×10-9M、不超过10-9M、不超过5×10-10M、不超过4×10-10M、不超过3×10-10M、不超过2×10-10M、不超过10-10M、不超过5×10-11M或不超过4×10-11M、不超过3×10-11M或不超过2×10-11M或不超过10-11M的结合亲和力(KD)特异性地与表达在细胞表面上的人CD3结合，所述KD值是通过流式细胞术测定的。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD3结合部分与食蟹猴CD3(例如表达在细胞表面上的食蟹猴CD3，或可溶性的重组食蟹猴CD3)交叉反应。
抗CD3结合部分与重组CD3或表达在细胞表面上的CD3的结合可以通过本领域公知的方法测定，例如夹心法(如ELISA)、Western印迹、流式细胞术和其他结合试验。在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD3结合部分以不超过0.01nM、不超过0.02nM、不超过0.03nM、不超过0.04nM、不超过0.05nM、不超过0.06nM、不超过0.07nM或不超过0.08nM的EC50(即50％结合浓度)特异性地与重组人CD3结合，所述EC50值通过ELISA测定。在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD3结合部分以不超过0.5nM、不超过0.6nM、不超过0.7nM、不超过0.8nM、不超过0.9nM、不超过1nM、不超过2nM、不超过3nM、不超过4nM、不超过5nM、不超过6nM、不超过7nM、不超过8nM、不超过9nM或不超过10nM的EC50特异性地与表达在细胞表面上的人CD3结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，所述抗CD3结合部分以与人CD3相似的结合亲和力与食蟹猴CD3结合。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD3结合部分以不超过0.001nM、不超过0.005nM、不超过0.01nM、不超过0.02nM、不超过0.03nM、不超过0.04nM或不超过0.05nM的EC50特异性地与重组食蟹猴CD3结合，所述EC50值通过ELISA测定。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD3结合部分具有足以用于诊断性和/或治疗性应用的与人CD3的特异性结合亲和力。许多治疗方案通过靶向TCR信号传导，特别是通过临床使用的抗人CD3单克隆抗体调节T细胞免疫力。
b)抗CD20抗体
在本文提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中，所述第一抗原结合部分或所述第二抗原结合部分为抗CD20结合部分。
在某些实施方案中，抗CD20结合部分来源于下表A’显示的抗体W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP和W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP。以下提供了W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP和W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD20结合部分的CDR序列。
表A’
以下提供了W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP和W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD20结合部分的重链和κ轻链可变区序列。
VH-氨基酸序列(SEQ ID NO:29)：
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSS
VH-核酸序列(SEQ ID NO:57)：
gaggtgcaattggtggagagcggaggagggctcgtgcagcctggaagatctcttaggctgagttgcgctgcatctgggttcacattcaacgactacgccatgcactgggtgaggcaggctcccggcaaagggctggaatgggtgtcaactatctcctggaactccggcagcatcggctacgccgatagcgtcaagggccggtttacaatttcccgcgataacgccaagaagtccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggatactgccctctactactgtgccaaggacattcagtacgggaattactattacgggatggacgtctggggccaggggaccaccgtgacagtcagctcc
Vκ-氨基酸序列(SEQ ID NO:30)：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIK
Vκ-核酸序列(SEQ ID NO:58)：
gaaatcgtgctgacccagtccccagcaaccctctccctttctcctggagagagagctaccctcagctgtagggcctcacagtctgtctccagttacctggcttggtaccagcagaaacccgggcaggcccctaggttgctgatctacgacgccagcaatagggccactggcatcccagcccggttttccggaagcggcagcgggacagatttcacactcactattagcagcctggagcccgaggacttcgccgtgtactattgccagcagcggtccaactggcccattacatttggccaagggacacgcctggagattaag
在某些实施方案中，抗CD20结合部分来源于下表B’显示的抗体W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP，W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP和W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP。以下提供了W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP，W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP和W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD20结合部分的CDR序列。
表B’
以下提供了W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP，W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP和W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD20结合部分的重链和κ轻链可变区序列。
VH-氨基酸序列(SEQ ID NO:31)：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA
VH-核酸序列(SEQ ID NO:59)：
caggtccagctgcagcagcccggagccgaactggtcaaacccggggctagcgtgaaaatgtcttgcaaagcaagtggttacacattcacttcctataacatgcactgggtgaagcagacacctgggcgaggtctggaatggatcggcgccatctacccaggcaacggagacactagctataatcagaagtttaaaggaaaggccaccctgacagctgataagtccagctctaccgcttacatgcagctgagttcactgacaagtgaggactcagcagtgtactattgcgcccgttctacctactatggcggagattggtatttcaatgtgtggggcgccggtaccacagtcaccgtgtccgcc
Vκ-氨基酸序列(SEQ ID NO:32)：
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK
Vκ-核酸序列(SEQ ID NO:60)：
cagattgtcctgagccagagccctgccatcctgtctgctagtcccggcgagaaggtgaccatgacatgcagggcatccagctctgtctcctacatccactggttccagcagaagcccgggagttcacctaaaccatggatctacgctacatccaacctggcaagcggtgtgcctgtcaggttttcaggttccggcagcggaacatcttacagtctgactatttctcgggtggaggccgaagacgccgctacctactattgccagcagtggacctccaatccccctacattcggcggagggactaagctggagatcaaa
本文提供的抗CD20结合部分还包含合适的框架区(FR)序列，只要所述抗CD20结合部分可以特异性结合CD20。
在一些实施方式中，本申请所提供的抗CD20结合部分能够以不超过5×10-9M、不超过1×10-9M、不超过9×10-10M、不超过8×10-10M、不超过7×10-10M、不超过6×10-10M、不超过5×10-10M、不超过4×10-10M、不超过3×10-10M、不超过2×10-10M或不超过1×10-10M的结合亲和力(KD)，特异性地与表达在细胞表面上的人CD20结合，所述KD值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD20结合部分与食蟹猴CD20(例如在细胞表面表达的食蟹猴CD20或可溶性重组食蟹猴CD20)交叉反应。
所述抗CD20结合部分与表达在细胞上的CD20的结合可以通过本领域公知的方法测定，例如夹心法(如ELISA)、Western印迹、流式细胞测定和其他结合试验。在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD20结合部分以不超过0.01nM、不超过0.02nM、不超过0.03nM、不超过0.04nM、不超过0.05nM、不超过0.1nM、不超过0.2nM、不超过0.3nM、不超过0.4nM、不超过0.5nM、不超过0.6nM、不超过0.7nM、不超过0.8nM、不超过0.9nM或不超过1nM的EC50特异性地与表达在细胞上的人CD20结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，抗CD20结合部分以与人CD20相似的结合亲和力结合食蟹猴CD20。在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD20结合部分以不超过0.2nM、不超过0.5nM、不超过0.8nM、不超过1nM、不超过2nM或不超过3nM的EC50特异性地与表达在细胞上的食蟹猴CD20结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD20结合部分以不超过1pM、不超过2pM、不超过3pM、不超过4pM、不超过5pM、不超过6pM、不超过7pM、不超过8pM、不超过9pM、不超过10pM、不超过11pM、不超过12pM、不超过13pM、不超过14pM、不超过15pM、不超过16pM、不超过17pM、不超过18pM、不超过19pM、不超过20pM、不超过21pM、不超过22pM、不超过23pM、不超过24pM、不超过25pM、不超过30pM、不超过35pM、不超过40pM、不超过45pM或不超过50pM的EC50被CD20表达细胞内化，所述EC50值通过Fab-Zap试验测定。
双特异性抗CD3/CD20多肽复合物
在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二抗原结合部分是多价的，如二价、三价、四价的。用于本申请的术语“价”是指给定分子中存在指定数量的抗原结合位点。由此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗原结合分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。如果两个结合位点都用于与同一抗原或同一表位特异性结合，则二价分子可以是单特异性的。同样，三价分子可以是双特异性的，例如当两个结合位点是针对第一抗原(或表位)单特异性的，而第三个结合位点是针对第二抗原(或表位)特异性的。在某些实施方式中，本申请所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中的所述第一和/或所述第二抗原结合部分可以是二价、三价或四价的，其具有至少两个针对同一抗原或表位的结合位点。在某些实施方式中，这提供了比单价的对应抗体更强的与所述抗原或表位的结合。在某些实施方式中，在二价抗原结合部分中，结合位点的第一价和结合位点的第二价在结构上相同(即具有相同序列)或在结构上不同(即具有不同序列但特异性相同)。
在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二抗原结合部分是多价的，并且包括两个或更多个可操作地互相缔合在一起(具有或不具有间隔子)的抗原结合位点。
在某些实施方式中，所述第二抗原结合部分包含所述第二抗体的两个或更多个Fab。两个Fab可以可操作地互相缔合，例如，第一Fab可以经由重链共价附接至第二Fab，之间存在或不存在间隔子。
在某些实施方式中，所述第一抗原结合部分连接至第一二聚化结构域，且所述第二抗原结合部分连接至第二二聚化结构域。用于本申请的术语“二聚化结构域”是指能够相互缔合以形成二聚体的肽结构域，或者在一些示例中，使两个肽能够自发二聚化的肽结构域。
在某些实施方式中，所述第一二聚化结构域可以与所述第二二聚化结构域相缔合。所述缔合可以经由任何适宜的相互作用或联接或键合(例如经由连接子、二硫键、氢键、静电相互作用、盐桥，或疏水-亲水相互作用，或其组合)实现。示例性的二聚化结构域包括但不限于抗体铰链区、抗体CH2结构域、抗体CH3结构域，以及其他能够二聚化及互相缔合的适宜的蛋白单体。铰链区、CH2和/或CH3结构域可以来源于任何抗体同种型，如IgG1、IgG2和IgG4。
“二硫键”是指具有R-S-S-R’结构的共价键。氨基酸半胱氨酸包含巯基，其可以与例如来自另一半胱氨酸残基的第二巯基形成二硫键。所述二硫键可以在分别存在于两个多肽链上的两个半胱氨酸残基的巯基之间形成，从而形成链间桥或链间键。
氢键是当氢原子共价结合至高度电负性的原子(如氮、氧或氟)时，由两个极性基团之间的静电相互作用形成。氢键可以在多肽中两个残基各自的骨架氧(例如硫族基团)与酰胺氢(氮基团)之间形成，如Asn中的氮基团与His中的氧基团，或Asn中的氧基团与Lys中的氮基团。氢键强于范德瓦尔斯相互作用，但弱于共价键或离子键，对于维持二级结构和三级结构十分关键。例如，当氨基酸残基的间隔在位置i和i+4之间规律发生时，形成α螺旋，而β折叠为当两条肽段通过至少两个或三个骨架氢键连接时形成的长度为3-10个氨基酸的肽链段，其形成扭转、褶皱的片层。
静电相互作用为非共价相互作用，在蛋白折叠、稳定性、柔性和功能中十分重要，包含离子相互作用、氢键合和卤键合。静电相互作用可以形成于多肽中，例如在Lys与Asp之间、在Lys与Glu之间、在Glu与Arg之间，或在第一链上的Glu、Trp与第二链上的Arg、Val或Thr之间。
盐桥为近距离的静电相互作用，其主要产生于Asp或Glu的阴离子羧酸根和来自Lys的阳离子铵或来自Arg的胍
根，其为天然蛋白结构中空间上靠近的带相反电荷的残基对。主要疏水的界面中的带电和极性残基可作为用于结合的热点。包含具有可电离的侧链的残基(如His、Tyr和Ser)在内的其他残基也可以参与盐桥的形成。
疏水相互作用可以在第一链上的一个或多个Val、Tyr和Ala与第二链上的一个或多个Val、Leu和Trp之间形成，或第一链上的His和Ala与第二链上的Thr和Phe之间形成(参见Brinkmann等，2017，同上)。
在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含抗体铰链区的至少一部分。在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二二聚化结构域可进一步包含抗体CH2结构域和/或抗体CH3结构域。在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含铰链-Fc区的至少一部分，即铰链-CH2-CH3结构域。在某些实施方式中，所述第一二聚化结构域可以可操作地连接至第一TCR恒定区的C末端。在某些实施方式中，所述第二二聚化结构域可以可操作地连接至第二抗原结合部分的抗体CH1恒定区的C末端。
在本文提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中，所述第一二聚化结构域可操作地连接至工程化的TCR恒定区的C末端，并且一起形成嵌合恒定区。也就是说，所述嵌合恒定区包括所述第一二聚化结构域与所述工程化的TCR恒定区可操作地连接。
在某些实施方式中，所述嵌合恒定区包括附接至来源于IgG1、IgG2或IgG4的第一铰链-Fc区的工程化的Cβ。
在某些实施方式中，所述嵌合恒定区进一步包含第一抗体CH2结构域和/或第一抗体CH3结构域。例如，所述嵌合恒定区进一步包含附接至所述第三接合结构域的C末端的第一抗体CH2-CH3结构域。
这些嵌合恒定区和第二TCR恒定区对是有用的，因为其可以被操作以融合至理想的抗体可变区，以提供本申请所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物。例如，抗体重链可变区可以融合至所述嵌合恒定区(包括C1)，从而提供本申请所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的所述第一多肽链；并且相似地，抗体轻链可变区可以融合至所述第二TCR恒定区(包括C2)，从而提供本申请所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的所述第二多肽链。
在某些实施方式中，所述第二二聚化结构域包括铰链区。所述铰链区可来源于抗体，如IgG1、IgG2或IgG4。在某些实施方式中，所述第二二聚化结构域可选地可进一步包括抗体CH2结构域和/或抗体CH3结构域，例如铰链-Fc区。所述铰链区可附接至所述第二抗原结合位点的抗体重链(例如Fab)。
在所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中，所述第一和所述第二二聚化结构域能够缔合成为二聚体。在某些实施方式中，所述第一和所述第二二聚化结构域是不同的，并且以不利于同源二聚化和/或有利于异源二聚化的方式相缔合。例如，可以选择所述第一和所述第二二聚化结构域，使得其不相同，且其优先在彼此之间形成异源二聚体，而不是与自身形成同源二聚体。在某些实施方式中，所述第一和所述第二二聚化结构域能够经由形成把手入孔、疏水相互作用、静电相互作用、亲水相互作用或增加的柔性而缔合成为异源二聚体，所述“把手入孔”(knobs-into-holes)参见Ridgway等，Protein Engineering，9(7)，pp.617–21(1996)；Merchant等，Nature Biotechnology，16(7)，pp.677–681(1998)等。
在某些实施方式中，所述第一和所述第二二聚化结构域包含CH2和/或CH3结构域，其分别突变为能够形成把手入孔。可以通过在第一CH2/CH3多肽用大氨基酸残基取代小氨基酸残基来获得把手，并且可以通过用小氨基酸残基取代大氨基酸残基来获得孔。关于把手入孔的突变位点的详情请参见Ridgway等，1996，同上，Spiess等，2015，同上，以及Brinkmann等，2017，同上。
双特异性形式
在本文所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中，所述第一抗原结合部分和所述第二结合部分可以缔合成为Ig样结构。Ig样结构类似天然抗体，具有Y型构造，有两条用于抗原结合的臂和一个用于缔合和稳定的茎部。与天然抗体的相似性可以提供多种优势，如良好的体内药代动力学、理想的免疫应答和稳定性等。已发现包括本申请所提供的第一抗原结合部分与本申请所提供的第二抗原结合部分相缔合的Ig样结构具有与Ig(例如IgG)相当的热稳定性。在某些实施方式中，本申请所提供的Ig样结构为天然IgG的至少70％、80％、90％、95％或100％。
在某些实施方式中，所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包括4条多肽链：i)VH1-C1-铰链-CH2-CH3；ii)VL1-C2；iii)VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，和iv)VL2-CL，其中C1和C2能够形成包括至少一个非天然链间键的二聚体，并且两个铰链区和/或两个CH3结构域能够形成一个或多个可以协助二聚化的链间键。
当与其他形式的双特异性多肽复合物相比较时，本申请所提供的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物具有更长的体内半衰期并且相对容易地制造。
双特异性抗CD3/CD20多肽复合物序列
在一些实施方案中，双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的第一抗原结合部分能够特异性结合CD3，并且第二抗原结合部分能够特异性结合CD20。在其他实施方式中，所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的所述第一抗原结合部分能够特异性地与CD20结合，且所述第二抗原结合部分能够特异性地与CD3结合。
在某些实施方案中，双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36(W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP抗体)，如实施例2所示。在某些实施方案中，双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40(W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP抗体)，如实施例2所示。在某些实施方案中，双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44，如实施例2所示。在某一实施方案中，所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含五条多肽链：a)具有如SEQ ID NO：41所示序列的第一多肽链；b)具有如SEQ ID NO：42所示序列的第二多肽链；c)具有如SEQ ID NO：43所示序列的第三多肽链；d)具有如SEQ IDNO：43所示序列的第四多肽链；和e)具有如SEQ ID NO：44所示序列的第五多肽链。例如，在具体的实施方案中，所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物为W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP抗体，其包含两个抗CD20结合部分，其中一个的重链VH-CH1结构域与抗CD3结合部分的重链VH结构域可操作地连接，如实施例2所示。在某些实施方案中，双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48(W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP抗体)，如实施例2所示。在某些实施方案中，双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52(W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP抗体)，如实施例2所示。在这样的实施方案中，所述第一抗原结合部分与CD3结合，且所述第二抗原结合部分与CD20结合。
在某些实施方式中，所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含4个多肽链，其包含：i)可操作地连接至第一嵌合恒定区的VH1；ii)可操作地连接至第二嵌合恒定区的VL1；iii)可操作地连接至常规抗体重链恒定区的VH2，以及iv)可操作地连接至常规抗体轻链恒定区的VL2。在某些实施方式中，所述第一嵌合恒定区可以包含C1-铰链-CH2-CH3，其各部分如上文所定义。在某些实施方式中，所述第二嵌合恒定区可以包含C2，其如上文所定义。在某些实施方式中，所述常规抗体重链恒定区可以包含CH1-铰链-CH2-CH3，其各部分如上文所定义。在某些实施方式中，所述常规抗体轻链恒定区可以包含CL，其如上文所定义。
在本发明的某些实施方案中，对SEQ ID NO：44所示的多肽链的第193、182、203、206、207位的天然糖基化位点中的一个或多个氨基酸进行了修饰，优选对第193位氨基酸进行修饰。在本发明的某些实施方案中，所述的修饰包括S193X、S182X、S203X、S206X、S207X中的一个或多个，其中X为丝氨酸(Ser)和/苏氨酸(Thr)以外的任意氨基酸。在本发明的某些优选实施方案中，所述的修饰为S193X，其中X为丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)或缬氨酸(Val)。在本发明的某些实施方案中，突变消除的是O-糖基化位点，所述O-糖基化类型为Core1构型的O-糖，结构式为NeuAc-Gal-GalNAc或NeuAc-Gal-(NeuAc)GalNAc。
如上所述，在本发明的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中对相应的多肽链中的天然糖基化位点进行修饰，与未进行修饰的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物相比，所得到的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物更接近天然抗体，免疫原性显著降低，提高半衰期，提升成药性。
制备方法
本申请提供了编码本申请所述的双特异性抗CD3 x CD20多肽复合物的分离的核酸或多核苷酸。
用于本申请的术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单或双链形式的多聚物。除非经明确限制，该术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的多核苷酸，所述天然核苷酸类似物具有与参照核酸相似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢。除非另外指出，特定的多核苷酸序列还暗含其经保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、同源基因、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可通过生成序列实现，其中一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位置用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
可以使用重组技术构建编码本申请所述双特异性抗CD3 x CD20多肽复合物的核酸或多核苷酸。为此，编码亲本抗体的抗原结合部分(如CDR或可变区)的DNA可以使用常规步骤分离和测序(例如通过使用能够特异性地与编码所述抗体的重链和轻链的基因结合的寡核苷酸探针)。编码TCR恒定区的DNA也可以同样地获取。作为示例，获取并可操作地连接编码所述可变结构域(VH)的多核苷酸序列和编码所述第一TCR恒定区(C1)的多核苷酸序列，以允许宿主细胞中的转录和表达，以产生所述第一多肽。相似地，编码VL的多核苷酸序列可操作地连接至编码C1的多核苷酸序列，以使得允许所述第二多核苷酸在宿主细胞中的表达。如果需要，一个或多个间隔子的编码多核苷酸序列也可操作地连接至其他编码序列，以使所需产物表达。
所述编码多核苷酸序列可以进一步可操作地连接至一个或多个调控序列，可选地在表达载体中，以使得所述第一和所述第二多肽的表达或产生是可行的，且在适宜的控制下进行。
使用本领域公知的重组技术，可以将所述编码多核苷酸序列插入载体，用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。在另一个实施方式中，本申请所述多肽复合物和双特异性抗CD3 x CD20多肽复合物可通过本领域公知的同源重组产生。多种载体可供选择。载体组分通常包含但不限于以下的一种或多种：信号序列、复制起始点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)和转录终止序列。
包含本申请所述的多核苷酸序列的载体可以导入宿主细胞用于克隆或基因表达。用于本申请的用语“宿主细胞”是指导入外源多核苷酸和/或载体的细胞。用于上述的表达或克隆载体转化宿主细胞，将其在培养基中培养。在一个方面，本公开提供了一种表达本申请所述的双特异性抗CD3 x CD20多肽复合物的方法，其包含在所述双特异性抗CD3 x CD20多肽复合物被表达的条件下培养本申请所述的宿主细胞。
在某些实施方式中，本公开提供了一种产生本申请所述的双特异性抗CD3 x CD20多肽复合物的方法，其包含a)将编码第一抗原结合部分的一个或多个多核苷酸包括编码第一多肽的第一多核苷酸(所述第一多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一重链可变结构域(VH)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1))，编码第二多肽的第二多核苷酸(所述第二多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一轻链可变结构域(VL)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2))以及编码第二抗原结合部分的一个或多个另外的多核苷酸导入宿主细胞，其中：C1和C2能够形成二聚体，并且所述非天然的链间键能够稳定C1和C2的二聚体，相比于第一抗原结合部分和第二抗原结合部分均为天然Fab的对应部分的情况，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分具有减少的错配，并且所述第一抗体具有第一抗原特异性且所述第二抗体具有第二抗原特异性，b)使所述宿主细胞表达所述双特异性抗CD3 x CD20多肽复合物。
在某些实施方式中，所述方法进一步包含分离所述双特异性抗CD3 x CD20多肽复合物。
从所述宿主细胞中制得的本申请所述的双特异性抗CD3 x CD20多肽复合物可以采用以下方法进行纯化，例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱柱、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱，其中亲合色谱为优选的纯化技术。
当本申请所述的双特异性抗CD3 x CD20多肽复合物包含免疫球蛋白Fc结构域时，则依赖于存在于所述多肽复合物中的Fc结构域的种类和同种型，蛋白A可以用作亲和配体。蛋白A可以用于基于人γ1，γ2或γ4重链的多肽复合物的纯化(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G适用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBOJ.5:1567 1575(1986))。琼脂糖是最常用的亲和配体附着基质，但也可选用其他基质。机械力稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯与用琼脂糖相比可以实现更快的流速和更短的处理时间。
当本申请所述的双特异性抗CD3 x CD20多肽复合物包含CH3结构域时，则可用Bakerbond ABX.TM树脂进行纯化(J.T.Baker，新泽西菲利普斯堡)。根据需要回收的抗体，其他蛋白纯化的技术也可使用，如离子交换柱中的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、基于阴离子或阳离子交换树脂的肝素琼脂糖凝胶色谱(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。
在任意初步纯化步骤之后，可用低pH疏水相互作用色谱的方法处理含有关注的多肽复合物和杂质的混合物，用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选地在低盐浓度下进行(例如从约0到0.25M盐浓度)。
在某些实施方式中，可以容易地使用常规方法以高产率纯化本申请所述的双特异性抗CD3 x CD20多肽复合物。所述双特异性抗CD3 x CD20多肽复合物的一个优势为重链和轻链可变结构域序列之间的错配显著减少。这减少了不要的副产物的产生，并且使得使用相对简单的纯化过程以高产率获得高纯度产物成为可能。
提供以下实施例以便更好地说明本发明，它们不应被理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分，都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为了举例说明落入本发明范围内的特定实施方式。本领域熟练技术人员在不发挥创造性及不偏离本发明范围的情况下可以开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，在对本发明的方法作出的多种改动可以仍然包括在本发明范围内。发明人意在将这样的变动包括在本发明的范围内。
实施例
实施例1
材料准备和基准抗体
1.材料准备
实施例中所用的可商购的材料的信息提供在表1中。
表1.可商购的材料
| 材料 | 载体 | Cat. |
| CD4<sup>+</sup>T细胞分离试剂盒(人) | Stemcell | 19052 |
| CD8<sup>+</sup>T细胞分离试剂盒(人) | Stemcell | 19053 |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3099 |
| CellTracker<sup>TM</sup> FarRed | Invitrogen | C34572 |
| 碘化丙啶(PI) | Invitrogen | P3566 |
| Alexa Fluor647缀合的山羊抗人IgG Fc | Jackson | 109-605-098 |
| FITC标记的抗人CD4 | BD Pharmingen | 550628 |
| PerCP-Cy5.5标记的抗人CD8 | BD Pharmingen | 565310 |
| PE标记的抗人CD69 | BD Pharmingen | 555531 |
| APC标记的抗人CD25 | BD Pharmingen | 555434 |
| 捕获抗体纯化的抗人TNF | BD Pharmingen | 555212(51-26371E) |
| 检测抗体生物素化的抗人TNF单克隆抗体 | BD Pharmingen | 555212(51-26372E) |
| 酶试剂链霉抗生物素蛋白-HRP | BD Pharmingen | 555212(51-9002813) |
| 重组人TNF标准品 | BD Pharmingen | 555212(51-26376E) |
| 人/灵长动物IL-2抗体mAb小鼠IgG2A | R&D | MAB602 |
| 人/灵长动物IL-2生物素化的抗体 | R&D | BAF202 |
| 重组的人IL-2 | R&D | 202-IL |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 |
| Raji | ATCC | CCL-86 |
| NAMALWA | ATCC | CRL-1432 |
| Ramos | ATCC | CRL-1596 |
| SU-DHL-1 | ATCC | CRL-2955 |
2.产生基准抗体
两种基准抗体W327-BMK1和W327-BMK4在实施例中用作参比抗体。
基于来自美国专利申请US 20140004037 A1的克隆C2B8的序列产生抗人CD20基准抗体BMK1(利妥昔单抗)。按照美国专利申请US 20150266966 A1中的序列合成抗CD3×CD20参比双特异性抗体BMK4(REGN1979)基因。BMK抗体由Expi293细胞表达，然后利用蛋白A层析纯化。
实施例2
制备本申请的双特异性抗体
1.抗体和TCR嵌合蛋白的设计和工程化
TCR序列
TCR为由两条链构成的异二聚蛋白。约95％的人T细胞具有由α和β链构成的TCR。考虑到更多的晶体结构对于β链TRBC1是可获得的，因此选择TRBC1序列作为设计本申请公开的多肽复合物(“WuXiBody”)的主骨架。TRBC1的典型氨基酸序列可见于Protein Data Bank(PDB)结构4L4T。
TCR的链间二硫键
使用TCR晶体结构来引导我们的WuXiBody设计。不同于T细胞表面膜上锚定的天然TCR，可溶性TCR分子较不稳定，尽管其3D结构非常近似于抗体Fab。事实上，TCR在溶解状态中的不稳定性曾是使其晶体结构难以阐明的很大阻碍(参见Wang，Protein Cell,5(9),pp.649–652(2014))。我们采用了在TCR恒定区中引入一对Cys突变的方案，并发现其可以显著地改善链组装并增强表达。
连接抗体可变结构域和TCR恒定结构域的接合区、其相对的融合定向以及连接Fc的接合区都经过仔细的精细调制。由于TCR结构非常近似于抗体Fab，我们将抗体Fv同源模型叠加在TCR可变区上(PDB 4L4T)。经叠加的结构表明抗体Fv在结构上与TCR恒定结构域兼容。全部相关的工程化参数基于这一结构比对以及对应的序列设计。
2.制备本申请的双特异性抗体
以把手入孔格式产生作为人IgG4的W3278 BsAbs(S.Atwell,J.B.Ridgway,J.A.Wells,P.Carter,Stable heterodimers from remodeling the domain interfaceof a homodimer using a phage display library.J.Mol.Biol.270,26–35(1997)；C.Spiess,M.Merchant,A.Huang,et al.D.G.Yansura,J.M.Scheer,Bispecificantibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteriaexpressing two distinct half-antibodies.Nat.Biotechnol.31,753–758(2013))。人IgG4 Fc区序列设计有S228P突变。由内部方案经由杂交瘤技术，通过用人CD3ε和CD3δECD蛋白免疫小鼠，产生抗CD3单克隆抗体。抗CD20臂可变区序列是基于奥法木单抗(PCT公布号WO2010083365A1的克隆2F2)或利妥昔单抗(美国专利申请US 20140004037 A1的克隆C2B8)的序列。W3278 BsAb候选子的序列列在表2中，它们的DNA序列在Genewiz(上海)合成并且克隆到改良的pcDNA3.3表达载体中。通过使用ExpiFectamine293转染试剂盒(Invitrogen-A14524)将抗CD20臂和抗CD3臂的表达载体共转染到Expi293(Invitrogen-A14527)中。将细胞在含有8％CO2的湿润气氛的37℃培养箱中在以135rpm旋转的有轨摇床平台上在Expi293表达培养基(Invitrogen-A1435101)中培养。收集培养上清，使用蛋白A柱(GE Healthcare,17543802)进行蛋白纯化。通过UV-Vis分光光度计(NanoDrop 2000,Thermo Scientific)测量蛋白浓度。通过SDS-PAGE和分析级HPLC-SEC估测蛋白纯度。图1描述了W3278-BsAb候选子的示意图。
表2.每个BsAb中重链和/或轻链的序列
注：TCR序列以斜体表示。
进一步地，在双特异性抗体W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP中，本发明人对SEQ IDNO：44所示的轻链的第193、182、203、206、207位的天然糖基化位点中的一个或多个氨基酸进行了修饰，优选对第193位氨基酸进行修饰。在某些实施方案中，所述的修饰包括S193X、S182X、S203X、S206X、S207X中的一个或多个，其中X为丝氨酸(Ser)和/苏氨酸(Thr)以外的任意氨基酸。在某些优选实施方案中，所述的修饰为S193X，其中X为丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)或缬氨酸(Val)。上述突变消除的是O-糖基化位点，所述O-糖基化类型为Core1构型的O-糖，结构式为NeuAc-Gal-GalNAc或NeuAc-Gal-(NeuAc)GalNAc。
如上所述，在本发明的双特异性抗体中对相应的多肽链中的天然糖基化位点进行修饰，与未进行修饰的双特异性抗体相比，所得到的双特异性抗体更接近天然抗体，免疫原性显著降低，提高半衰期，提升成药性。
实施例3
体外表征
1.细胞系和原代细胞分离
使用在完全培养基(补充有10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640)中培养的下述细胞系：Jurkat(CD3+/CD20-细胞)；Raji,Ramos和NAMALWA(CD20+/CD3-细胞),SU-DHL-1(CD20-/CD3-细胞)。
通过Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare-17-1440-03)密度离心从来自健康的正常献血者的肝素化静脉血新鲜分离人外周血单核细胞(PBMC)。通过EasySep试剂盒(Stemcell-19053)从新鲜的人PBMC分离原代人CD8+T细胞，并且通过EasySep(Stemcell-19052)柱纯化CD4+T细胞。
2.W3278 BsAb与靶细胞的结合
W3278 BsAb与靶细胞的结合通过流式细胞术确定。简言之，将1×105个/孔的靶细胞(CD3+/CD20-细胞或CD20+/CD3-细胞)用W3278 BsAb或人IgG4同种型对照抗体的连续稀释液在4℃温育60分钟。温育后，将细胞用冷1％BSA/1×PBS洗涤两次，然后加入AlexaFluor647缀合的山羊抗人IgG Fc(Jackson-109-605-098)并在4℃温育30分钟。在洗涤两次后，使用FACS Canto II血细胞计数器(BD Biosciences)测量被染色细胞的几何平均荧光(MFI)。不包含抗体或仅含有荧光二抗的孔用于建立背景荧光。使用GraphPad Prism 5软件(GraphPad Software,La Jolla,CA)确定细胞结合的EC50值，使用四参数非线性回归分析计算各值。W3278 BsAb与靶细胞的FACS结合显示在图2中，并结合EC50显示在下表3中。
表3.W3278 BsAbs和亲本抗体与细胞表面靶标的FACS结合EC50
为了检测W3278 BsAb与CD3和CD20表达细胞的同时结合，将1×106个/ml Raji细胞和1×106个/ml Jurkat细胞分别用50nM Calcein-AM(Invitrogen-C3099)和20nMFarRed(Invitrogen-C34572)标记。用冷1％BSA/1XPBS洗涤后，将标记的Raji和Jurkat细胞重悬并以1:1的比例混合至终浓度为1×106个/ml。用1x105个/孔混合的细胞涂布，然后添加W3278 BsAb的连续稀释液。在4℃温育60分钟后，通过FACS分析Calcein-AM和FarRed双阳性细胞的百分数。
图3的结果表明W3278 lead BsAb表现出剂量依赖性的同时双靶标结合，所述同时双靶标结合比BMK4更有效。
3.体外细胞毒性测定
经由基于FACS的细胞毒性测定确定BsAb通过CD8+T淋巴细胞调控肿瘤细胞溶解的功效。简言之，将新鲜分离的人CD8+T细胞在含有50IU/ml重组人IL-2和10ng/ml OKT-3的完全培养基中培养3至5天。在次日，将靶细胞、Raji、Ramos、NAMALWA和SU-DHL-1(1×106个细胞/ml)用在DPBS中的20nM Far-Red(Invitrogen-C34572)在37℃标记30分钟，然后用测定缓冲液(无酚红的RPMI 1640培养基+10％FBS)洗涤两次。Far-Red标记的靶细胞(2x104个/孔)涂布在110μl/孔包含效应CD8+T细胞(效应子/靶细胞比例为5:1)和BsAbs或hIgG4同种型对照的连续稀释液的完全培养基中，并在37℃温育过夜。最后，添加碘化丙啶(PI)(Invitrogen-P3566)并在室温温育15分钟，然后通过流式细胞术分析。使用下述等式计算细胞毒性百分数：细胞毒性％＝100*Far Red+PI+/(Far Red+PI++Far Red+PI-)*100％。使用Prism四参数非线性回归分析确定体外细胞毒性的EC50值。
图4的结果表明W3278 lead Ab“W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4”不杀伤CD20阴性SU-DHL-1细胞。与BMK4相比，W3278 lead Ab“W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4”更有效地诱导CD20阳性细胞的细胞杀伤，并且杀伤效率EC50与细胞表面CD20表达水平成比例增加。BsAb介导的细胞毒性EC50和最大细胞毒性(Max Cyto)％显示在表4中。
表4.W3278 lead BsAb和BMK4 BsAb对不同B细胞系的细胞毒性EC50和最大细胞毒性％
4.细胞激活和细胞因子释放测定
通过流式细胞术测量效应细胞CD69或CD25的表达评估·BsAb介导的T细胞激活。新鲜分离的纯化的CD4+T细胞和CD8+T细胞分别作为效应细胞进行检验。简言之，将5x104个CD4+或CD8+T细胞涂布在110μl/孔包含BsAbs或hIgG4同种型对照抗体的连续稀释液的完全培养基中，在1x104个Raji或SU-DHL-1细胞/孔的存在下在37℃24小时。温育后，将细胞用1％BSA/1XDPBS洗涤两次，然后用抗人Ab组(FITC标记的抗人CD4(BD Pharmingen-550628)；PerCP-Cy5.5标记的抗人CD8(BD Pharmingen-565310)；PE标记的抗人CD69(BDPharmingen-555531)和APC标记的抗人CD25(BD Pharmingen-555434))在4℃染色30分钟。通过FACS分析经由CD69或CD25表达评估的T细胞激活。通过使用四参数非线性回归分析确定T细胞激活的EC50。
不存在靶细胞时，W3278 lead Ab不诱导T细胞激活。仅在存在靶细胞时，W3278lead Ab诱导CD4+和CD8+ T细胞激活，由CD25表达(图5A)和CD69表达(图5B)所示，并且比BMK4更有效。激活EC50显示在表5A和5B中。
表5A.在Raji细胞存在下由W3278 BsAb和BMK4 BsAb介导的T细胞CD25表达EC50
表5B.在Raji细胞存在下由W3278 BsAb和BMK4 BsAb介导的T细胞CD69表达EC50
对于细胞因子释放(TNF-α和IL-2)测定，将5x104个新鲜分离的CD4+T细胞涂布在110μl/孔包含BsAbs或hIgG4同种型对照抗体的连续稀释液的完全培养基中，在1x104个Raji或SU-DHL-1细胞/孔的存在下在37℃24小时。24小时温育后，将平板离心并收集上清保存在-80℃用于通过ELISA进行细胞因子浓度测量。
对于通过ELISA的TNF-α检测，将96孔ELISA平板(Nunc MaxiSorp,ThermoFisher)用50μl在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(20 mM Na2CO3,180 mM NaHCO3,pH9.2)中的捕获抗体纯化的抗人TNF(BD Pharmingen-51-26371E)在4℃包被过夜。次日，将平板用洗涤缓冲液(1XPBST缓冲液,0.05％吐温-20)洗涤，然后用200μl测定稀释剂(PBS+10％FBS)封闭。封闭后，加入50μl测试样品和重组人TNF标准品(BD Pharmingen-51-26376E)，并将平板在室温温育2小时。通过检测抗体生物素化抗人TNF(BD Pharmingen-51-26372E)检测TNF-α与平板的结合。链霉抗生物素蛋白-HRP试剂(BD Pharmingen-51-9002813))和四甲基联苯胺(TMB)底物(Sigma-860336-5G)用于颜色反应。在各步骤之间用洗涤缓冲液洗涤。约30分钟后用2 MHCl终止颜色反应。使用多功能平板读取仪(
M5e)在450 nm测量各孔的吸光度。
类似地，通过ELISA检测培养物上清中的IL-2浓度。抗人IL-2抗体mAb(R&D-MAB602)用作捕获抗体，生物素化抗人IL-2抗体(R&D-BAF202)用作检测抗体。
如图6所示，在CD20阴性SU-DHL-1细胞存在下，W3278 lead Ab不诱导T细胞的细胞因子释放。仅在存在靶标Raji细胞时，W3278 lead Ab能够诱导与BMK4相比更低水平的细胞因子释放。并且由W3278Ab引起的EC50窗口(以细胞因子释放和细胞杀伤之间的EC50比所示)大于BMK4(表6)。
表6.BsAb介导的CD4+T细胞的细胞因子释放EC50和最大水平以及细胞因子释放与Raji细胞杀伤的EC50比
5.血清稳定性检测
将抗体与新鲜采集的人血清混合，并且确保混合样品中血清比例>95％。将混合样品的等份分装并在37℃温育0-14天。在图7所示的每个时间点，将样品在液氮中快速冷冻，并且在分析之前保存在-80℃。通过FACS分析每份样品与Raji或Jurkat细胞的结合。
如图7所示，人血清处理的W3278 Ab与Jurkat(图7A)和Raji(图7B)两种细胞的结合与刚解冻的Ab(第0天)相似。这些结果表明W3278 Ab在人血清中稳定至少14天(图7)。
6.DSF测定和热稳定性检测
使用实时荧光定量PCR(QuantStudio 7 Flex,Thermo Fisher Scientific)进行DSF测定。简言之，将19μL抗体溶液与1μL 62.5 X SYPRO Orange溶液(Invitrogen)混合并添加到96孔平板(Biosystems)中。将平板以2℃/min的速率从26℃加热到95℃，并采集所产生的荧光数据。计算荧光变化相对于不同温度的负导数，并且最大值定义为解链温度Th。如果蛋白质具有多个解折叠过渡态，则报告前两个Th，称为Tm1和Tm2。Tm1总是解释为正式的解链温度Tm，以方便不同蛋白质之间的比较。数据采集和Th计算由操作软件(QuantStudioReal-Time PCR PCR Software v1.3)自动进行。W3278 Ab在不同缓冲液中的Tm1和Tm2值显示在表7中。W3278的Tm为约61℃，表示W3278 Ab良好的热稳定性。
表7.通过DSF测定检测的热稳定性(Tm值由表中的Tm1所示)
实施例4
体内抗肿瘤功效
在PBMC人源化NOG小鼠的Raji肿瘤模型中检测抗体体内抗肿瘤功效。在研究中使用6-8周龄的雌性NOG小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。将Raji肿瘤细胞(
CCL-86TM)在37℃含5％CO2的孵育箱中以及在含有10％胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的1640培养基中单层培养。将肿瘤细胞常规每周传代两次。收集处在指数生长期生长的细胞并计数，以用于肿瘤接种。按照制造商的使用说明，使用Ficoll-PaquePlus从健康献血个体的肝素全血分离人PBMC。
对于治疗模型，将每只小鼠在右上侧腹共同皮下注射预先混合的Raji肿瘤细胞(2.0×106个)和PBMC(3.0×106个)。当平均肿瘤体积达到约60 mm3时，将动物随机分组并接受第一次抗体注射。对于功效研究，小鼠每周接受所示量的抗体静脉内注射两次一共3周。研究中所有涉及动物处理、护理和治疗的程序都按照WuXi AppTec机构动物护理和应用委员会(IACUC)遵循实验室动物护理评估和鉴定协会(AAALAC)的指南核准的指导进行。对于所有的肿瘤研究，将小鼠称重，并且使用卡尺每周测量肿瘤生长两次。肿瘤体积以1/2(长×宽2)估算。
如图8所示，W3278 lead Ab治疗展示出剂量依赖性抗肿瘤活性，其比BMK4更有效(图8A)。在实验期间小鼠体重正常(图8B)。
实施例5
在首次用于免疫的食蟹猴中用WBP3278双特异性抗体进行的单剂量研究
为了确定使用WBP3278双特异性抗体治疗是否能够消耗灵长类动物中的循环B细胞，并确定是否导致任何意料不到的毒性，本发明人在食蟹猴(食蟹猕猴(MacacaFascicularis))中进行了探索性的非GLP药理学研究。4只首次用于免疫的雄性食蟹猴(年龄3～4岁，体重约4kg)由广东肇庆创药生物科技有限公司提供。研究中所有与动物的处理、护理和治疗相关的步骤均按照PharmaLegacy实验室机构动物护理和使用委员会(IACUC)遵循实验动物护理评估和认可委员会(AAALAC)的指导核准的指南进行。
四只动物分成两组(每组2只)，分别通过缓慢静脉内注射在60秒内施用WBP3278lead抗体(即,W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4,下文中简称为WBP3278 lead Ab)1 mg/kg(组1)和10 mg/kg(组2)，施用一次。针对下述淋巴细胞，通过FACS监测外周血循环B细胞和T细胞的水平，监测4周：B淋巴细胞(CD45+/CD20+)；T淋巴细胞(CD45+/CD3+)；CD4+ T淋巴细胞(CD4+/CD45+/CD3+)和CD8+T淋巴细胞(CD8+/CD45+/CD3+)。通过使用BDTM细胞计数微珠阵列(Cytometric Bead Array，CBA)非人灵长类动物Th1/Th2细胞因子试剂盒(BD Bioscience，Cat:557800)分析循环炎性细胞因子的水平。使用WBP3278 lead Ab治疗导致立即且完全的循环B细胞消耗，持续至少4周(图9)。在WBP3278 lead Ab治疗后，循环T细胞的水平最初也被降低，在72小时后恢复到基线水平或略高的水平并且持续至少4周(图10A)。72小时后，CD8+T细胞水平升高(图10B)，CD4+T细胞水平恢复至正常水平(图10C)，并且均持续至少4周。在用WBP3278 lead Ab治疗后，观察到循环细胞因子水平快速升高，并且24小时后所有细胞因子恢复至正常水平(图11)。
血清中WBP3278 lead Ab的浓度通过ELISA测定。简言之，将ELISA板用抗人IgG(SouthernBiotech,#2049-01)包被，然后加入血清样品的连续稀释物。结合信号用山羊抗人IgG生物素(SouthernBiotech,#2049-08)和链霉抗生物素蛋白-HRP(Life,#SNN1004)检测。使用多孔板读数器(
M5e)在(450-540)nm测量吸光度。使用PhoenixWinNonlin软件(version 8.1,Pharsight,Mountain View,CA)，对食蟹猴中WBP3278 leadAb的浓度进行非房室模型药代动力学分析。应用线性/对数梯形法则获得PK参数。在计算平均浓度时排除个体BLQ。在计算所有的药代动力学参数时使用正常剂量水平和标称取样次数。PK参数的总结列在表8中并显示在图12中。由此可见，当剂量从1 mg/kg增加至10 mg/kg时，系统暴露C0由19.9μg/mL增加至282μg/mL(约14倍)，AUC0-last由259μg.h/mL增加至5788μg.h/mL(约22倍)。WBP3278双特异性抗体的血清半衰期(T1/2)在1 mg/kg和10 mg/kg时分别为43.3小时和89.8小时。
表8.WBP3278 lead Ab的PK参数总结
| PK参数 | 1mg/kg(平均) | 10mg/kg(平均) |
| C<sub>0</sub>(μg/mL) | 19.9 | 282 |
| T<sub>1/2</sub>(h) | 43.3 | 89.8 |
| AUC<sub>0-last</sub>(μg.h/mL) | 259 | 5788 |
此外，实验过程中笼边观察显示，对于高剂量和低剂量水平的WBP3278 lead Ab，都没有观察到意料不到的毒性(数据未显示)。
本实验的结果表明，WBP3278 lead Ab能够有效清除体内B细胞，并且没有细胞因子风暴等不良反应，在食蟹猴中有足够的半衰期。这些实验结果支持将WBP3278 lead Ab推进做临床前药物开发。
配制剂的实施例
体积排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)：用于测定样品中抗体的纯度，实施例6采用Agilent 1260高效液相色谱，TSK G3000SWXL(TOSOH)凝胶色谱柱，以50 mM磷酸盐缓冲液+300 mM氯化钠(pH6.8)的缓冲液为流动相进行洗脱，检测波长为280nm。实施例7、8.1和8.2采用Waters I-Class高效液相色谱，Agilent AdvanceBio SEC
凝胶色谱柱，以17.8mM磷酸二氢钠+32.2mM磷酸氢二钠+200mM L-精氨酸盐酸盐的缓冲液为流动相进行洗脱，检测波长为280nm。按面积归一化法计算高聚物、主峰、降解片段的百分含量。
差示扫描量热法(DSC)：采用SYS12907(Malvern)分析样品的拐点温度(Tmonset)和解折叠温度(Tm)，将样品稀释至浓度为1mg/mL，程序如下：扫描开始温度为10℃，扫描结束温度为95℃，升温速率为200℃/h。
使用dynaproplate ReaderII(Wyatt)检测样品的聚集温度(Tagg)，取20μL样品加入到384孔样品盘中，并在样品上加入20μL石蜡油，再将384孔样品盘离心去除气泡，程序如下：升温程序从25℃到60℃，扫描时间为5秒，扫描5次。
调制差示扫描量热法(mDSC)：采用DSC Q2000(TA Instruments)分析样品在冻干过程中的玻璃化转变温度(Tg’)，程序如下：降温至-60℃，保持5分钟，以5℃/min的升温速率升温至20℃。
采用微粒检测仪GWJ-8(天津市天大天发GWJ-8科技有限公司)分析不溶性微粒数量；采用微流成像颗粒分析系统MFI5100(ProteinSimple)分析MFI微粒的数量，数据使用仪器配套MVAS软件进行分析。
采用水分滴定仪C30(METTLER TOLEDO)检测样品中的水分。
实施例6
缓冲体系及pH值
通过透析换液的方式，将WBP3278 lead Ab置换到目标缓冲液中，蛋白浓度为2mg/mL，在生物安全柜中使用0.22μm PVDF滤膜过滤，并分装至2mL西林瓶中，规格为2mg/mL/瓶，加塞并压盖。在35℃条件下进行稳定性考察，Tm值、Tagg值和SEC-HPLC的检测结果分别如表9、表10和表11所示。
表9.Tm值检测结果
| 样品 | TmOnset(℃) | Tm1(℃) | Tm2(℃) | Tm3(℃) |
| 20mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH 5.0 | 49.4 | 57.8 | 64.4 | 75.6 |
| 20mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH 5.5 | 53.1 | 62.3 | 75.5 | - |
| 20mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH 6.0 | 55.1 | 64.4 | 75.3 | - |
| 20mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH 6.5 | 56.0 | 65.1 | 75.2 | - |
| 10mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH 6.0 | 55.2 | 64.2 | 75.0 | - |
| 20mM组氨酸-盐酸组氨酸，pH 5.5 | 49.9 | 58.9 | 65.1 | 77.1 |
| 20mM组氨酸-盐酸组氨酸，pH 6.0 | 52.4 | 61.8 | 77.0 | - |
| 20mM组氨酸-盐酸组氨酸，pH 6.5 | 53.0 | 62.2 | 75.4 | - |
注：“-”表示未检测到数据
表10.Tagg值检测结果
表11.SEC-HPLC检测结果
注：“T0”表示0时；“ND”表示未检测到数据；(+X)表示相对于T0增加X，(-X)表示相对于T0减少X，例如，高聚物＝17.9(+17.1)，表示高聚物为17.9％，相对于T0增加17.1％
实施例7
糖和表面活性剂
制备1Kg的10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(pH6.2)，称取0.282g一水合枸橼酸(C6H8O7·H2O)，2.547g二水合枸橼酸钠(C6H5 Na3O7·2H2O)，加水定容至1Kg，并将缓冲液进行过滤。
通过透析换液的方式，将WBP3278 lead Ab置换到上述制备的10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液中，分别加入蔗糖母液、二水合海藻糖母液或甘露醇母液，并加入吐温80母液配制成目标配制剂，蛋白浓度为2mg/mL，在生物安全柜中使用0.22μm PVDF滤膜过滤后分装至4mL西林瓶中，规格为2mg/mL/瓶，加塞并压盖。其中，8％(w/v)蔗糖即80mg/ml蔗糖；8.8％(w/v)二水合海藻糖即88mg/ml二水合海藻糖；0.02％(w/v)吐温80即0.2mg/mL吐温80。三种配制剂的Tm值、SEC-HPLC及pH检测结果分别见表12，表13。
表12.Tm值检测结果
表13.SEC-HPLC及pH检测结果
注：“T0”表示0时；冻融的条件为-70℃至室温
实施例8.1
糖和表面活性剂
通过透析换液的方式，将WBP3278 lead Ab置换到10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(参见实施例7所示的制备方法制备)中，分别加入蔗糖母液、二水合海藻糖母液或甘露醇母液，并加入吐温80母液配制成目标配制剂，蛋白浓度为2mg/mL，在生物安全柜中使用0.22μmPVDF滤膜过滤后分装至4mL西林瓶中，规格为2mg/mL/瓶，半加塞后，放至冻干机中冷冻干燥，冻干程序为预冻、一次干燥和二次干燥，步骤例如表14所示。将三种配制剂用水复溶后，复溶后外观、复溶时间和水分含量见表15；Tg’值和SEC-HPLC检测结果分别如表16和表17所示。
表14.冻干步骤
表15.冻干配制剂复溶后外观、复溶时间和水分含量的检测结果
注：“T0”表示0时
表16.Tg’值检测结果
表17.SEC-HPLC及pH检测结果
注：“T0”表示0时
实施例8.2
糖和表面活性剂
通过超滤换液的方式，将WBP3278 lead Ab置换到10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(参见实施例7所示的制备方法制备)中，分别加入蔗糖母液或二水合海藻糖母液，并加入吐温80母液配制成目标配制剂，蛋白浓度为2mg/mL，0.22μm PVDF滤膜二级过滤后分装至6mL西林瓶中，规格为2mg/mL/瓶，半加塞后，放至冻干机中冷冻干燥，步骤例如表14所示。两种配制剂的SEC-HPLC检测结果如表18所示。此外，两种配制剂的MFI微粒和不溶性微粒都正常范围内，但含蔗糖的配制剂中处于2≤X＜5μm范围的MFI微粒远多于含海藻糖的配制剂，处于2≤X＜5μm范围的不溶性微粒也略多于含海藻糖的配制剂；于40℃放置4周、25℃放置6月及2～8℃放置6月后，两种配制剂的微粒未发生明显变化。
表18.SEC-HPLC检测结果
注：“T0”表示0时
实施例9
生物学活性
通过体外T细胞激活实验进行生物学活性测定。其中靶细胞为Raji(CD3-、CD20+人类B细胞系)，效应细胞为表达荧光素酶的工程化Jurkat(CD3+、CD20-人类T细胞系)，当WBP3278 lead Ab的CD3和CD20结合部分分别与Raji细胞和Jurkat细胞结合时，会激活Jurkat细胞并引起下游信号转导，表达荧光素酶，通过检测试剂Bio-Glo检测荧光信号。将参比品(具有工艺代表性批次的药物组合物样品)和供试品(待测试的药物组合物样品)梯度稀释(初始浓度为9000ng/mL，4倍梯度稀释，共11个稀释梯度)，然后将稀释液以25μl/孔加入到96孔细胞培养板中。取生长至对数期的Raji和Jurkat细胞均调整至2×106个细胞/ml，等体积混匀，以50μl/孔加入到上述96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2二氧化碳细胞培养箱中孵育4-5小时。加入75μl/孔Bio-Lite Luciferase试剂，室温避光孵育3～5分钟。用多功能读板仪的化学发光检测模块读取RLU值。
供试品生物学活性(％)＝(参比品EC50值/供试品EC50值)×100％
实验结果显示在经过40℃放置4周、25℃放置6月及2～8℃放置6月后，冻干配制剂中WBP3278 lead Ab仍保持较好的生物学活性。
表19.生物学活性检测结果
注：“T0”表示0时
本领域技术人员应该进一步理解，本发明可以在不背离其精神和核心属性的前提下以其他具体形式实施。在前述说明书中，本发明仅公开了示例性的实施方案，应该理解其他的变化也被包括在本发明的范围之内。因此，本发明不限于本文详细描述的具体实施方案。相反，关于本发明的范围和内容，应该参考后附的权利要求。
序列表
<110> 正大天晴药业集团股份有限公司
<120> 新型双特异性抗CD3/CD20多肽复合物配制剂
<150> CN202010733598.0
<151> 2020-07-27
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 32
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Asp Ser Val Ser Ile Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 34
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe
115 120 125
Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His
130 135 140
Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp
145 150 155 160
His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly
165 170 175
Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp
180 185 190
Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp
195 200 205
Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu
210 215 220
Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln
225 230 235 240
Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
245 250 255
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
260 265 270
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
275 280 285
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
290 295 300
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
305 310 315 320
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
325 330 335
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
340 345 350
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
355 360 365
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
370 375 380
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
385 390 395 400
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
405 410 415
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
420 425 430
Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
435 440 445
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
450 455 460
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
465 470
<210> 35
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 36
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Pro Asp Ile Gln Asn
100 105 110
Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys
115 120 125
Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Gln Val Ser Gln
130 135 140
Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met
145 150 155 160
Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Gln Lys
165 170 175
Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn Ser Ile Ile Pro Glu
180 185 190
Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200
<210> 37
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu
115 120 125
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
130 135 140
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu
145 150 155 160
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr
165 170 175
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr
180 185 190
Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
195 200 205
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
210 215 220
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
225 230 235 240
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
340 345 350
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
465 470
<210> 38
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu
225 230 235 240
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
245 250 255
Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg
260 265 270
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser
275 280 285
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
290 295 300
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
305 310 315 320
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr
325 330 335
Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser
340 345 350
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
355 360 365
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
370 375 380
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
385 390 395 400
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
405 410 415
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr
420 425 430
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
435 440 445
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
450 455 460
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
465 470 475 480
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
485 490 495
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
500 505 510
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
515 520 525
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
530 535 540
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
545 550 555 560
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
565 570 575
Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
580 585 590
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
595 600 605
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
610 615 620
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu
625 630 635 640
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
645 650 655
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
660 665 670
Leu Ser Leu Gly
675
<210> 39
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser His Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
130 135 140
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
145 150 155 160
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
165 170 175
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
180 185 190
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 40
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 41
<211> 700
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
225 230 235 240
Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe
245 250 255
Ala Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
260 265 270
Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys
275 280 285
Tyr Asn Glu Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser
290 295 300
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
305 310 315 320
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp
325 330 335
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn
340 345 350
Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile
355 360 365
Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His
385 390 395 400
Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu
405 410 415
Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr
420 425 430
Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr
435 440 445
Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val
450 455 460
Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Tyr Gly Pro Pro Cys
465 470 475 480
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
485 490 495
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
500 505 510
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
515 520 525
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
530 535 540
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
545 550 555 560
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
565 570 575
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
580 585 590
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys
595 600 605
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
610 615 620
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
625 630 635 640
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
645 650 655
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
660 665 670
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
675 680 685
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
690 695 700
<210> 42
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
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<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
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1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
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50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
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Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
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130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
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165 170 175
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195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 44
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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100 105 110
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130 135 140
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
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Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
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Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
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Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
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Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
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Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
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Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
245 250 255
Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
260 265 270
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asn Asp Asn Ile
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Lys Tyr Ser Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
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Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ile Asp Ser Val Ser Ile Tyr Tyr Phe
325 330 335
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys
340 345 350
Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu
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Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe
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Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val
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His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala
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Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
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Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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625 630 635 640
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645 650 655
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
660 665 670
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
675 680 685
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
690 695 700
<210> 46
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr
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Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 47
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 48
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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65 70 75 80
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Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
130 135 140
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
145 150 155 160
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
165 170 175
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
180 185 190
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 49
<211> 703
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu
115 120 125
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
130 135 140
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu
145 150 155 160
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr
165 170 175
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr
180 185 190
Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
195 200 205
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
210 215 220
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
225 230 235 240
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
260 265 270
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
275 280 285
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
290 295 300
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
305 310 315 320
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
325 330 335
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
340 345 350
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
355 360 365
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
370 375 380
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
385 390 395 400
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
405 410 415
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
420 425 430
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
435 440 445
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
450 455 460
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
465 470 475 480
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
485 490 495
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
500 505 510
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
515 520 525
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
530 535 540
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
545 550 555 560
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
565 570 575
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
580 585 590
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
595 600 605
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645 650 655
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
660 665 670
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
675 680 685
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
690 695 700
<210> 50
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
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370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 51
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
145 150 155 160
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
165 170 175
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
180 185 190
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 52
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 53
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
caggtgcaac tcgtgcagtc tggagctgaa gtgaagaagc ctgggtcttc agtcaaggtc 60
agttgcaagg ccagtgggta ttccttcact acctactaca tccactgggt gcggcaggca 120
ccaggacagg ggcttgagtg gatgggctgg atctttcccg gcaacgataa tattaagtac 180
agcgagaagt tcaaagggag ggtcaccatt accgccgaca aatccacttc cacagcctac 240
atggagttga gcagcctgag atccgaggat acagccgtgt actactgtgc cattgacagc 300
gtgtccatct actactttga ctactggggc cagggcacac tggtcacagt gagcagc 357
<210> 54
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gacatcgtca tgacccagtc cccagactct ttggcagtgt ctctcgggga aagagctacc 60
atcaactgca agagcagcca gtcccttctg aacagcagga ccaggaagaa ttacctcgcc 120
tggtaccaac agaagcccgg acagcctcct aagctcctga tctactgggc ctcaacccgg 180
aagagtggag tgcccgatcg ctttagcggg agcggctccg ggacagattt cacactgaca 240
atttcctccc tgcaggccga ggacgtcgcc gtgtattact gtactcagag cttcattctg 300
cggacatttg gcggcgggac taaagtggag attaag 336
<210> 55
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
caggtgcagc ttgtgcagtc tggggcagaa gtgaagaagc ctgggtctag tgtcaaggtg 60
tcatgcaagg ctagcgggtt cgcctttact gactactaca tccactgggt gcggcaggct 120
cccggacaag ggttggagtg gatgggatgg atctccccag gcaatgtcaa cacaaagtac 180
aacgagaact tcaaaggccg cgtcaccatt accgccgaca agagcacctc cacagcctac 240
atggagctgt ccagcctcag aagcgaggac actgccgtct actactgtgc cagggatggg 300
tactccctgt attactttga ttactggggc cagggcacac tggtgacagt gagctcc 357
<210> 56
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gatatcgtga tgacccagag cccagactcc cttgctgtct ccctcggcga aagagcaacc 60
atcaactgca agagctccca aagcctgctg aactccagga ccaggaagaa ttacctggcc 120
tggtatcagc agaagcccgg ccagcctcct aagctgctca tctactgggc ctccacccgg 180
cagtctgggg tgcccgatcg gtttagtgga tctgggagcg ggacagactt cacattgaca 240
attagctcac tgcaggccga ggacgtggcc gtctactact gtactcagag ccacactctc 300
cgcacattcg gcggagggac taaagtggag attaag 336
<210> 57
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gaggtgcaat tggtggagag cggaggaggg ctcgtgcagc ctggaagatc tcttaggctg 60
agttgcgctg catctgggtt cacattcaac gactacgcca tgcactgggt gaggcaggct 120
cccggcaaag ggctggaatg ggtgtcaact atctcctgga actccggcag catcggctac 180
gccgatagcg tcaagggccg gtttacaatt tcccgcgata acgccaagaa gtccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggat actgccctct actactgtgc caaggacatt 300
cagtacggga attactatta cgggatggac gtctggggcc aggggaccac cgtgacagtc 360
agctcc 366
<210> 58
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gaaatcgtgc tgacccagtc cccagcaacc ctctcccttt ctcctggaga gagagctacc 60
ctcagctgta gggcctcaca gtctgtctcc agttacctgg cttggtacca gcagaaaccc 120
gggcaggccc ctaggttgct gatctacgac gccagcaata gggccactgg catcccagcc 180
cggttttccg gaagcggcag cgggacagat ttcacactca ctattagcag cctggagccc 240
gaggacttcg ccgtgtacta ttgccagcag cggtccaact ggcccattac atttggccaa 300
gggacacgcc tggagattaa g 321
<210> 59
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
caggtccagc tgcagcagcc cggagccgaa ctggtcaaac ccggggctag cgtgaaaatg 60
tcttgcaaag caagtggtta cacattcact tcctataaca tgcactgggt gaagcagaca 120
cctgggcgag gtctggaatg gatcggcgcc atctacccag gcaacggaga cactagctat 180
aatcagaagt ttaaaggaaa ggccaccctg acagctgata agtccagctc taccgcttac 240
atgcagctga gttcactgac aagtgaggac tcagcagtgt actattgcgc ccgttctacc 300
tactatggcg gagattggta tttcaatgtg tggggcgccg gtaccacagt caccgtgtcc 360
gcc 363
<210> 60
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
cagattgtcc tgagccagag ccctgccatc ctgtctgcta gtcccggcga gaaggtgacc 60
atgacatgca gggcatccag ctctgtctcc tacatccact ggttccagca gaagcccggg 120
agttcaccta aaccatggat ctacgctaca tccaacctgg caagcggtgt gcctgtcagg 180
ttttcaggtt ccggcagcgg aacatcttac agtctgacta tttctcgggt ggaggccgaa 240
gacgccgcta cctactattg ccagcagtgg acctccaatc cccctacatt cggcggaggg 300
actaagctgg agatcaaa 318
<210> 61
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
115 120 125
<210> 62
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
85 90 95
Claims (27)
1.一种液体配制剂，其包含双特异性抗CD3/CD20多肽复合物和缓冲液，其中，所述缓冲液包括组氨酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液中的一种或多种组合。
2.根据权利要求1所述的液体配制剂，其中所述缓冲液包含组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液，琥珀酸-琥珀酸钠缓冲液，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液中的一种或几种，优选地，所述缓冲液是枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。
3.根据权利要求1-2任一项所述的液体配制剂，其中所述缓冲液的浓度为约1mM至约30mM，优选为约5mM至约20mM，更优选为约10mM。
4.根据权利要求1-3任一项所述的液体配制剂，其中所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的浓度为约0.1mg/ml至约50mg/ml，优选为约0.5mg/ml至20mg/ml，约1mg/ml至约20mg/ml，或约2mg/ml至约10mg/ml，更优选为约2mg/ml至约5mg/ml，或约2mg/ml至约3mg/ml。
5.根据权利要求1-4任一项所述的液体配制剂，其中所述液体配制剂的pH为约5.0至约7.5，或约5.0至约6.5，优选为约6.0至约6.5，更优选为约6.2。
6.根据权利要求1-5任一项所述的液体配制剂，其中所述液体配制剂还包含渗透压调节剂和/或稳定剂；
优选的，所述渗透压调节剂和/或稳定剂包含糖；
更优选的，所述糖为海藻糖或蔗糖；
最优选的，所述糖为海藻糖。
7.根据权利要求6所述的液体配制剂，其中所述糖的浓度为150mM至约320mM，优选为约180mM至约265mM，约230mM至约240mM，或约230mM至约235mM，更优选为约233mM或约232.6mM。
8.根据权利要求1-7任一项所述的液体配制剂，其中所述液体配制剂还包含表面活性剂；
优选的，所述表面活性剂是聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，优选为聚山梨醇酯80；
优选的，所述表面活性剂的浓度为约0.001％至约0.1％(w/v)，优选为约0.005％至约0.08％(w/v)，或约0.01％至约0.04％(w/v)，更优选为约0.02％(w/v)。
9.根据权利要求1-8任一项所述的液体配制剂，其中所述液体配制剂包含：
(a)约0.1mg/ml至约50mg/ml的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约1mM至约30mM的枸橼酸盐缓冲液，
(c)约150mM至约320mM的糖，和
(d)约0.001％至约0.1％(w/v)的表面活性剂，
其中所述液体配制剂的pH为约5.0至约7.5，优选为约6.0至约6.5；
可选的，所述液体配制剂包含：
(a)约0.1mg/ml至约50mg/ml的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约1mM至约30mM枸橼酸盐缓冲液，
(c)约150mM至约320mM的海藻糖，和
(d)约0.001％至约0.1％(w/v)的聚山梨酯80，
其中所述液体配制剂的pH为约5.0至约7.5，优选为约6.0至约6.5；
可选的，所述液体配制剂包含：
(a)约0.5mg/ml至约20mg/ml双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约5mM至约20mM枸橼酸盐缓冲液，
(c)约180mM至约265mM海藻糖，和
(d)约0.005％至约0.08％(w/v)的聚山梨酯80，
其中所述液体配制剂的pH为约5.0至约7.5，优选为约6.0至约6.5；
可选的，所述液体配制剂包含：
(a)约0.5mg/ml至约20mg/ml双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约5mM至约20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，
(c)约180mM至约265mM海藻糖，和
(d)约0.005％至约0.08％(w/v)的聚山梨酯80，
其中所述液体配制剂的pH为约5.0至约7.5，优选为约6.0至约6.5；
可选的，所述液体配制剂包含：
(a)约2mg/ml至约3mg/ml双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，
(c)约233mM的海藻糖，和
(d)约0.02％(w/v)的聚山梨酯80，
其中所述液体配制剂的pH为约6.2；
可选的，所述液体配制剂包含：
(a)约2mg/ml至约3mg/ml的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约10mM的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，
(c)约232.6mM的海藻糖，和
(d)约0.02％(w/v)的聚山梨酯80，
其中所述液体配制剂的pH约6.2。
10.一种含有双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的冻干剂，所述冻干剂通过将权利要求1-9任一项所述的液体配制剂经冷冻干燥获得；或者
所述冻干剂经复溶后可形成权利要求1-9中任一项所述的液体配制剂。
11.一种含有双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的药物组合物，所述药物组合物是由权利要求10所述的冻干剂经复溶获得的溶液。
12.一种冻干配制剂，其包含双特异性抗CD3/CD20多肽复合物和缓冲剂，其中，所述缓冲剂包括组氨酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、枸橼酸盐缓冲剂中的一种或多种组合。
13.根据权利要求12所述的冻干配制剂，其中所述缓冲剂包含组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂，琥珀酸-琥珀酸钠缓冲剂，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲剂中的一种或几种，优选地，所述缓冲剂是枸橼酸-枸橼酸钠缓冲剂。
14.根据权利要求12-13任一项所述的冻干配制剂，其中所述缓冲剂的浓度为约1mM至约30mM，优选约5mM至约20mM，更优选为约10mM。
15.根据权利要求12-14任一项所述的冻干配制剂，其中所述双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的浓度为约0.1mg/ml至约50mg/ml，优选为约0.5mg/ml至20mg/ml，约1mg/ml至约20mg/ml，或约2mg/ml至约10mg/ml，更优选为约2mg/ml至约5mg/ml，或约2mg/ml至约3mg/ml。
16.根据权利要求12-15任一项所述的冻干配制剂，其中所述冻干配制剂的pH为约5.0至约7.5，或约5.0至约6.5，优选为约6.0至约6.5，更优选为约6.2。
17.根据权利要求12-16任一项所述的冻干配制剂，其中所述冻干配制剂还包含渗透压调节剂和/或稳定剂；
优选的，所述渗透压调节剂和/或稳定剂包含糖；
更优选的，所述糖为海藻糖或蔗糖；
最优选的，所述糖为海藻糖。
18.根据权利要求17所述的冻干配制剂，其中所述糖的浓度为150mM至约320mM，优选为约180mM至约265mM，约230mM至约240mM，或约230mM至约235mM，更优选为约233mM或约232.6mM。
19.根据权利要求12-18任一项所述的冻干配制剂，其中所述冻干配制剂还包含表面活性剂；
优选的，所述表面活性剂是聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，优选为聚山梨醇酯80；
优选的，所述表面活性剂的浓度为约0.001％至约0.1％(w/v)，优选为约0.005％至约0.08％(w/v)，或约0.01％至约0.04％(w/v)，更优选为约0.02％(w/v)。
20.根据权利要求12-19任一项所述的冻干配制剂，其中所述冻干配制剂包含：
(a)约0.1mg/ml至约50mg/ml的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约1mM至约30mM的枸橼酸盐缓冲剂，
(c)约150mM至约320mM的糖，和
(d)约0.001％至约0.1％(w/v)的表面活性剂，其中所述冻干配制剂的pH为约5.0至约7.5，优选为约6.0至约6.5；
可选的，所述冻干配制剂包含：
(a)约0.1mg/ml至约50mg/ml的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约1mM至约30mM枸橼酸盐缓冲剂，
(c)约150mM至约320mM的海藻糖，和
(d)约0.001％至约0.1％(w/v)的聚山梨酯80，
其中所述冻干配制剂的pH为约5.0至约7.5，优选为约6.0至约6.5；
可选的，所述冻干配制剂包含：
(a)约0.5mg/ml至约20mg/ml双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约5mM至约20mM枸橼酸盐缓冲剂，
(c)约180mM至约265mM海藻糖，和
(d)约0.005％至约0.08％(w/v)的聚山梨酯80，
其中所述冻干配制剂的pH为约5.0至约7.5，优选为约6.0至约6.5；
可选的，所述冻干配制剂包含：
(a)约0.5mg/ml至约20mg/ml双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约5mM至约20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲剂，
(c)约180mM至约265mM海藻糖，和
(d)约0.005％至约0.08％(w/v)的聚山梨酯80，
其中所述冻干配制剂的pH为约5.0至约7.5，优选为约6.0至约6.5；
可选的，所述冻干配制剂包含：
(a)约2mg/ml至约3mg/ml双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲剂，
(c)约233mM的海藻糖，和
(d)约0.02％(w/v)的聚山梨酯80，
其中所述冻干配制剂的pH为约6.2；
可选的，所述冻干配制剂包含：
(a)约2mg/ml至约3mg/ml的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物，
(b)约10mM的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲剂，
(c)约232.6mM的海藻糖，和
(d)约0.02％(w/v)的聚山梨酯80，
其中所述冻干配制剂的pH约6.2。
21.一种含有双特异性抗CD3/CD20多肽复合物的药物组合物，其是通过将权利要求12-20任一项所述的冻干配制剂经复溶获得的溶液。
22.根据权利要求1-9任一项所述的液体配制剂、权利要求12-20任一项所述的冻干配制剂、权利要求10所述的冻干剂、或权利要求11或21所述的药物组合物，其中所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含与第二抗原结合部分相缔合的第一抗原结合部分，其中：
所述第一抗原结合部分包含：
第一多肽，所述第一多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一重链可变结构域(VH)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，和
第二多肽，所述第二多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一轻链可变结构域(VL)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)，
其中：
C1和C2能够形成包含至少一个在C1和C2之间的非天然的链间键的二聚体，并且所述非天然的链间键能够稳定所述二聚体，以及
所述第二抗原结合部分包含：
第二抗体的第二重链可变结构域(VH2)，其可操作地连接至抗体重链CH1结构域，和
第二抗体的第二轻链可变结构域(VL2)，其可操作地连接至抗体轻链恒定(CL)结构域，
其中：
所述第一和所述第二抗原结合部分中的一个是抗CD3结合部分，并且另一个是抗CD20结合部分，
抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含：
a)包含选自SEQ ID NO：1和13的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含选自SEQ ID NO：2和14的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含选自SEQ ID NO：3和15的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含选自SEQ ID NO：4和16的氨基酸序列的κ轻链CDR1，
e)包含选自SEQ ID NO：5和17的氨基酸序列的κ轻链CDR2，和
f)包含选自SEQ ID NO：6和18的氨基酸序列的κ轻链CDR3，
抗CD20结合部分来源于抗CD20抗体，其包含：
a)包含选自SEQ ID NO：7和19的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含选自SEQ ID NO：8和20的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含选自SEQ ID NO：9和21的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含选自SEQ ID NO：10和22的氨基酸序列的κ轻链CDR1，
e)包含选自SEQ ID NO：11和23的氨基酸序列的κ轻链CDR2，和
f)包含选自SEQ ID NO：12和24的氨基酸序列的κ轻链CDR3。
23.根据权利要求22所述的液体配制剂、冻干配制剂、冻干剂或药物组合物，其中，
所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中所述抗CD3结合部分包含含有选自SEQ IDNO：25和27的重链可变结构域序列和含有选自SEQ ID NO：26和28的轻链可变结构域序列，或包含含有选自SEQ ID NO：25和27的C末端缺失氨基酸SS的重链可变结构域序列和含有选自SEQ ID NO：26和28的轻链可变结构域序列；
所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中所述抗CD20结合部分包含含有选自SEQ IDNO：29和31的重链可变结构域序列和含有选自SEQ ID NO：30和32的轻链可变结构域序列。
24.根据权利要求22或23所述的液体配制剂、冻干配制剂、冻干剂或药物组合物，其中，所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中所述第一抗原结合部分与第一二聚化结构域连接，所述第二抗原结合部分与第二二聚化结构域连接，并且所述第一和第二二聚化结构域是相缔合的；
可选的，所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中所述缔合是经由连接子、二硫键、氢键、静电相互作用、盐桥或疏水-亲水相互作用或其组合实现的；
可选的，所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中所述第一和所述第二二聚化结构域是不同的，并且以不利于同源二聚化和/或有利于异源二聚化的方式相缔合；
可选的，所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中所述第一和所述第二二聚化结构域能够经由把手入孔、疏水相互作用、静电相互作用、亲水相互作用或增加的柔性而缔合成为异源二聚体。
25.根据权利要求24所述的液体配制剂、冻干配制剂、冻干剂或药物组合物，其中所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含抗体铰链区的至少一部分，其可选地来源于IgG1、IgG2或IgG4；
可选的，所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含抗体CH2结构域，和/或抗体CH3结构域；
可选的，所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中所述第一二聚化结构域在第三接合结构域可操作地连接至所述第一TCR恒定区(C1)；
可选的，所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中所述第二二聚化结构域可操作地连接至所述第二抗原结合部分的重链可变结构域。
26.根据权利要求22-25任一项所述的液体配制剂、冻干配制剂、冻干剂或药物组合物，其中所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物包含四种多肽序列的组合：a)SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；
b)SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40；
c)SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44；
d)SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48；或
e)SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52。
27.根据权利要求26所述的液体配制剂、冻干配制剂、冻干剂或药物组合物，其中，所述的双特异性抗CD3/CD20多肽复合物中SEQ ID NO：44所示的多肽选自第193、182、203、206或207位的一个或多个氨基酸被修饰为除丝氨酸和/苏氨酸以外的任意氨基酸，从而消除糖基化位点，优选地，第193位的氨基酸被修饰，更优选的，第193位氨基酸被修饰为丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸或缬氨酸。
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