TWI734916B - 一種pd-l1抗體藥物組合物及其用途 - Google Patents

一種pd-l1抗體藥物組合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明涉及一種PD-L1抗體藥物組合物及其用途。具體而言，本發明涉及一種藥物組合物，其包含在琥珀酸鹽緩衝劑中的PD-L1抗體或其抗原結合片段。除此之外，該藥物組合物還可含有糖和非離子型表面活性劑。本發明之藥物組合物在儲存數月之後展現了很高的抗體穩定性。

Description

一種PD-L1抗體藥物組合物及其用途
本發明屬於藥物製劑領域，具體涉及一種包含PD-L1抗體及其抗原結合片段的藥物組合物，以及其作為抗癌藥物的用途。
程序性死亡分子1（programmed death-l, PD- l ）是1992年發現的表現在T細胞表面的一個蛋白受體，參與到細胞的凋亡過程之中。PD-1有兩個配體，分別為PD-L1和PD-L2。PD-L1主要表現於T細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞（dendritic cell, DC）上，在活化後細胞上的表現能夠進行上調。而PD-L2的表現相對較侷限，主要表現在抗原呈現細胞上，如活化的巨噬細胞和樹突狀細胞。
PD-L1藉由和PD-1及B7-1的結合抑制免疫系統，很多腫瘤細胞及腫瘤組織微環境的免疫細胞表現PD-L1。新的研究發現乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌及肝癌等人類腫瘤組織中檢測到高PD-L1蛋白的表現，且PD-L1的表現水平和患者的臨床及預後緊密相關。由於PD-L1起到第二信號通路抑制T細胞增殖的作用，所以阻斷PD-L1 / PD-1之間結合成為了腫瘤免疫治療領域一個非常有潛力的新興靶點。
抗體藥物與其他的化學藥物相比，其分子量更大，結構更複雜，容易降解、聚合或發生不希望發生的化學修飾等而變得不穩定。為了使抗體分子適合於給藥，並且在儲存及隨後使用過程中能保持穩定性，發揮更好的效果，抗體藥物的製劑研究顯得尤為重要。
目前有多家跨國製藥公司在研發包含PD-L1/PD-1抗體的藥物組合物，相關專利如：CN105793288A、CN103429264A、CN105960415A。
本發明提供足夠穩定且適於給藥的包含PD-L1抗體及其抗原結合片段的藥物組合物。
本發明提供一種藥物組合物，其包含PD-L1抗體及其抗原結合片段，以及緩衝劑，所述緩衝劑優選為琥珀酸鹽或醋酸鹽緩衝劑，更優選為琥珀酸鹽緩衝劑。
在本發明的實施例中，緩衝劑的濃度為約5mM至50 mM，優選為大約10mM至30mM，更優選為10mM至20mM，非限制性實施例包括10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM。
在本發明的實施例中，藥物組合物的pH值約為4.5到6.0，優選約為4.8到5.7，更優選為5.0到5.5，可為5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5。
在本發明的實施例中，藥物組合物中抗體的濃度為約30mg/ml至約80mg/ml，優選為約40mg/ml至約60mg/ml，更優選為45mg/ml至約55mg/ml，非限制性實施例包括45mg/ml、46mg/ml、47mg/ml、48mg/ml、49mg/ml、50mg/ml、51mg/ml、52mg/ml、53mg/ml、54mg/ml、55mg/ml。
進一步的，本發明的藥物組合物還包含糖。本發明的「糖」包含常規組合物（CH2 O）n 及其衍生物，包括單醣、二糖、三糖、多醣、糖醇、還原性糖、非還原性糖等等。可選自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麥芽糖、右旋糖苷、甘油、右旋糖苷、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、sylitol、山梨糖醇、甘露醇、密裡二糖、松三糖、蜜三糖、甘露三糖、水蘇糖、麥芽糖、乳果糖、麥芽酮糖、山梨醇、麥芽糖醇、乳糖醇、異-麥芽酮糖等等。優選的糖是非還原性二糖，更優選為海藻糖或蔗糖。
在本發明的實施例中，藥物組合物中糖的濃度為約30mg/ml至約90mg/ml，優選為50mg/ml至約70mg/ml，更優選為55mg/ml至約65mg/ml，非限制性實施例包括55mg/ml、57mg/ml、59mg/ml、60mg/ml、61mg/ml、63mg/ml、65 mg/ml。
進一步的，本發明的藥物組合物還包含表面活性劑。可選自聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚羥亞烴、Triton、十二烷基磺酸鈉、月桂基磺酸鈉、辛基糖苷鈉、月桂基-磺基甜菜鹼、肉荳蔻基-磺基甜菜鹼、亞油基-磺基甜菜鹼、硬脂基-磺基甜菜鹼、月桂基-肌胺酸、肉荳蔻基-肌胺酸、亞油基-肌胺酸、硬脂基-肌胺酸、亞油基-甜菜鹼、肉荳蔻基-甜菜鹼、鯨蠟基-甜菜鹼、月桂醯胺基丙基-甜菜鹼、柯卡醯胺基丙基-甜菜鹼、亞油醯胺基丙基-甜菜鹼、肉荳蔻醯胺基丙基-甜菜鹼、棕櫚醯胺基丙基-甜菜鹼、異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼、肉荳蔻醯胺基丙基-二甲基胺、棕櫚醯胺基丙基-二甲基胺、異硬脂醯胺基丙基-二甲基胺、甲基可可醯基鈉、甲基油基牛磺酸鈉、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯與丙烯二醇的共聚物等等。優選的表面活性劑是聚山梨酯80或聚山梨酯20，更優選為聚山梨酯80。
在本發明的實施例中，藥物組合物中表面活性劑的濃度為約0.1 mg/ml 至1.0 mg/ml，優選為0.2 mg/ml 至0.8 mg/ml，更優選為0.4 mg/ml至0.8 mg/ml，非限制性實施例包括0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml、0.6 mg/ml、0.7 mg/ml和0.8 mg/ml。
在本發明的實施例中，藥物組合物中所述抗體或其抗原結合片段包含任意1個選自以下的CDR區序列或其突變序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：SEQ ID NO：1 -3，SEQ ID NO：7-9；和/或，抗體輕鏈可變區LCDR區序列：SEQ ID NO：4-6，SEQ ID NO：10-12； 具體如下： HCDR1選自：NDYWX1 SEQ ID NO：1 或 SYWMH SEQ ID NO：7， HCDR2選自：YISYTGSTYYNPSLKS SEQ ID NO：2 或 RI X4 PNSG X5 TSYNEKFKN SEQ ID NO：8，和/或 HCDR3選自：SGGWLAPFDY SEQ ID NO：3 或 GGSSYDYFDY SEQ ID NO：9；和/或 LCDR1選自：KSSQSLFY X2 SNQK X3 SLA SEQ ID NO：4 或 RASESVSIHGTHLMH SEQ ID NO：10， LCDR2選自：GASTRES SEQ ID NO：5 或 AASNLES SEQ ID NO：11，和/或 LCDR3選自：QQYYGYPYT SEQ ID NO：6 或 QQSFEDPLT SEQ ID NO：12； 其中X1 選自N或T，X2 選自R或H，X3 選自N或H，X4 選自H或G，X5 選自G或F。
在本發明的實施例中，優選地，藥物組合物中所述的抗體或其抗原結合片段包含選自：SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12的輕鏈可變區CDR序列或其突變序列，和選自：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8 和SEQ ID NO：9的重鏈可變區CDR序列或其突變序列；更優選地，所述的抗體或其抗原結合片段包含分別如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，以及分別如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列； 或，優選地，藥物組合物中所述的抗體或其抗原結合片段包含選自：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3的重鏈可變區CDR序列或其突變序列，和選自：SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5 和SEQ ID NO：6的輕鏈可變區CDR序列或其突變序列；更優選地，所述的抗體或其抗原結合片段包含分別如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分別如SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在本發明的實施例中，藥物組合物中所述抗體或其抗原結合片段包含與胺基酸序列：SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12具有至少85％，86％， 87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列一致性的輕鏈可變區CDR序列，和與胺基酸序列：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8 和SEQ ID NO：9具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93 ％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列一致性的重鏈可變區CDR序列。
在本發明的實施例中，藥物組合物中所述抗體或其抗原結合片段可選自鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，人抗體，優選人源化抗體。
在本發明的實施例中，藥物組合物中所述抗體或其抗原結合片段包含與胺基酸序列SEQ ID NO：13具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91 ％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列一致性的重鏈可變區序列，和與胺基酸序列SEQ ID NO：14具有至少85％ ，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列一致性的輕鏈可變區序列。
在本發明的實施例中，藥物組合物中所述抗體或其抗原結合片段包含與胺基酸序列SEQ ID NO：15具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91 ％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列一致性的重鏈可變區序列，和與胺基酸序列SEQ ID NO：17具有至少85％ ，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列一致性的輕鏈序列。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含濃度為約30mg/ml至約80mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，濃度為約5mM至約50mM的琥珀酸鹽緩衝劑，pH5.0-6.0，濃度為約30 mg/ml至約90 mg/ml的二糖，濃度為約0.1 mg/ml至約1.0 mg/ml的聚山梨酯80。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含40-60mg/ml的PD-L1抗體或抗原結合片段，10-30mM的琥珀酸鹽緩衝劑，pH5.0-5.5，40-80 mg /ml的蔗糖，0.4-0.8 mg/ml的聚山梨酯80。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含45-55mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，10-20mM的琥珀酸鹽緩衝劑，pH5.0-5.5，55-65 mg/ml的蔗糖，0.5-0.7 mg/ml的聚山梨酯80。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含濃度為約30mg/ml至約80mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，濃度為約5mM至約50mM的醋酸鹽緩衝劑，pH5.0-6.0，濃度為約30 mg/ml至約90 mg/ml的二糖，濃度為約0.1 mg/ml至約1.0 mg/ml的聚山梨酯80。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，10mM的琥珀酸鹽緩衝劑，pH5.3，60 mg/ml的蔗糖。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，10mM的醋酸鹽緩衝劑，pH5，90 mg/ml的蔗糖。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，30mM的醋酸鹽緩衝劑，pH5，60 mg/ml的海藻糖。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，30mM的醋酸鹽緩衝劑，pH5，60 mg/ml的海藻糖。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，30mM的醋酸鹽緩衝劑，pH5.6，90 mg/ml的蔗糖。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，10 mM琥珀酸鹽緩衝體系，pH5.0-5.5，60 mg/ml蔗糖，0.2 mg /ml的聚山梨醇酯20。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，10-20 mM琥珀酸鹽緩衝體系，pH5.2，60 mg/ml蔗糖，0.2 mg /ml的聚山梨醇酯20。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，20mM的醋酸鹽緩衝劑，pH5.2，60 mg/ml的蔗糖，0.1-0.3 mg/ml的聚山梨酯20。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，20mM的醋酸鹽緩衝劑，pH5.2，60 mg/ml的蔗糖，0.1-0.3 mg/ml的聚山梨酯80。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，20mM的琥珀酸鹽緩衝劑，pH5.2，60 mg/ml的蔗糖，0.2- 0.6mg/ml的聚山梨酯20。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，20mM的琥珀酸鹽緩衝劑，pH5.2，60 mg/ml的蔗糖，0.4- 0.8 mg/ml的聚山梨酯80。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，20mM的琥珀酸鹽緩衝劑，pH5.2，60 mg/ml的蔗糖，0.4 mg /ml的聚山梨酯80。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，20mM的琥珀酸鹽緩衝劑，pH5.2，60 mg/ml的蔗糖，0.6 mg /ml的聚山梨酯80。
本發明進一步提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，20mM的琥珀酸鹽緩衝劑，pH5.2，60 mg/ml的蔗糖，0.8 mg /ml的聚山梨酯80。
在一些實施例中，該藥物組合物中的琥珀酸鹽緩衝劑的濃度為約5mM至50 mM。在一些實施例中，該藥物組合物中的琥珀酸鹽緩衝劑的濃度為約10mM至30mM。在一些實施例中，該藥物組合物中的琥珀酸鹽緩衝劑的濃度為約20mM。
在一些實施例中，該藥物組合物中的醋酸鹽緩衝劑的濃度為約5mM至50 mM。在一些實施例中，該藥物組合物中的醋酸鹽緩衝劑的濃度為約10mM至30mM。在一些實施例中，該藥物組合物中的醋酸鹽緩衝劑的濃度為約20mM。
在一些實施例中，該藥物組合物的pH 值約為5.0到6.0。在一些實施例中，該藥物組合物的pH 值約為5.0到5.5。在一些實施例中，該藥物組合物的pH 值約為5.2或5.5。
在一些實施例中，該藥物組合物中抗體的濃度為約30mg/ml至約80mg/ml。在一些實施例中，該藥物組合物中抗體的濃度為約40mg/ml至約60mg/ml。在一些實施例中，該藥物組合物中抗體的濃度為約50 mg/ml。 在一些實施例中，該藥物組合物中包含所述二糖的濃度為約30mg/ml至約90mg/ml。在一些實施例中，該藥物組合物中的所述二糖的濃度為約40mg/ml至約80mg/ml。在一些實施例中，該藥物組合物中的所述二糖的濃度為約60mg/ml。
在一些實施例中，該藥物組合物中所述聚山梨酯為聚山梨酯20或聚山梨酯80。在一些實施例中，該藥物組合物中所述聚山梨酯為聚山梨酯80。在一些實施例中，該藥物組合物中所述聚山梨酯的濃度為約0.1 mg/ml 至1.0 mg/ml。在一些實施例中，該藥物組合物中所述聚山梨酯的濃度為約0.4 mg/ml 至0.8 mg/ml。在一些實施例中，該藥物組合物中所述聚山梨酯的濃度為約0.6 mg/ml。
在一些實施例中，該配製劑於2-8℃穩定至少3個月，至少6個月，至少12個月，至少18個月或至少24個月。在一些實施例中，該配製劑於40℃穩定至少7天，至少14天或至少28天。
本發明進一步提供一種製品或試劑盒，其包含裝有本文所述任何穩定的藥物組合物的容器。在一些實施例中，該容器為玻璃瓶，該玻璃瓶為中性硼矽玻璃管制注射劑瓶。
本發明進一步提供一種製備以上任一項所述的藥物組合物的方法，包括將PD-L1抗體或其抗原結合片段與藥學上可接受的賦形劑混合。
本發明進一步提供以上任一項所述藥物組合物在製備用於治療PD-L1介導的疾病或病症的藥物中的用途，其中所述的疾病或病症優選為癌症；更優選為表現PD-L1的癌症；最優選為乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌；進一步優選為非小細胞肺癌、黑色素瘤、膀胱癌和腎癌。
本發明進一步提供一種治療和預防PD-L1介導的疾病或病症的方法，該方法包括給予所需患者有效量的包含PD-L1抗體或其抗原結合片段的藥物組合物；其中所述的疾病優選為癌症；更優選為表現PD-L1的癌症；所述的癌症最優選為乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌、膀胱癌；最優選為非小細胞肺癌、黑色素瘤、膀胱癌和腎癌。
如本領域技術人員所熟知的，本公開中所述各個實施例的一項、一些或所有特性可以進一步組合以形成本發明的其它實施例。本發明的以上實施例和藉由組合得到的其他實施例藉由下面的詳述進一步說明。
[術語]
為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
「緩衝劑」指藉由其酸-鹼共軛組分的作用而耐受pH變化的緩衝劑。本發明的緩衝劑pH約為4.5到6.0，優選為大約5.0至6.0，更優選為大約5.0至5.5，最優選為5.2。將pH控制在此範圍中的緩衝劑的例子包括醋酸鹽、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、組胺酸、草酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、甘胺醯甘胺酸和其它有機酸緩衝劑。本發明優選的緩衝劑是琥珀酸鹽緩衝劑或醋酸鹽緩衝劑，更優選為琥珀酸鹽緩衝劑。
「琥珀酸鹽緩衝劑」是包括琥珀酸離子的緩衝劑。琥珀酸鹽緩衝劑的實例包括琥珀酸-琥珀酸鈉、琥珀酸組胺酸鹽、琥珀酸-琥珀酸鉀、琥珀酸-琥珀酸鈣鹽等。本發明優選的琥珀酸鹽緩衝劑是琥珀酸-琥珀酸鈉。
「醋酸鹽緩衝劑」是包括醋酸根離子的緩衝劑。醋酸鹽緩衝劑的實例包括醋酸-醋酸鈉、醋酸組胺酸鹽、醋酸-醋酸鉀、醋酸醋酸鈣、醋酸-醋酸鎂等。本發明優選的醋酸鹽緩衝劑是醋酸-醋酸鈉。
「藥物組合物」表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物（prodrug）與其他化學組分的混合物，所述其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
本發明所述的藥物組合物能夠達到一種穩定的效果：其中的抗體在貯藏後基本上保留其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物學活性的藥物組合物，優選地，藥物組合物在貯藏後基本上保留其物理和化學穩定性以及其生物學活性。貯藏期一般基於藥物組合物的預定保存期來選擇。目前有多種測量蛋白質穩定性的分析技術，可測量在選定溫度貯藏選定時間段後的穩定性。
穩定的藥物抗體製劑是在下述情況下沒有觀察到顯著變化的製劑：在冷藏溫度（2-8℃）保存至少3個月、優選6個月、更優選1年，且甚至更優選地最多達2年。另外，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括25℃和40℃在內的溫度保存包括1個月、3個月、6個月在內的時段後表現出期望的特徵。穩定性的典型的可接受的標準如下：藉由SEC-HPLC測得，通常不超過約10%、優選不超過約5%的抗體單體發生降解。藉由視覺分析，藥物抗體製劑是無色的，或澄清至稍微乳白色。所述製劑的濃度、pH和重量克分子滲透壓濃度具有不超過±10%變化。通常觀察到不超過約10%、優選不超過約5%的截短。通常形成不超過約10%、優選不超過約5%的聚集。
如果在目檢顏色和/或澄清度後，或者藉由UV光散射、粒徑排阻層析法（SEC）和動態光散射（DLS）測得，抗體沒有顯示出顯著的聚集增加、沉澱和/或變性，那麼所述抗體在藥物製劑中「保留它的物理穩定性」。蛋白構象的變化可以藉由螢光光譜法（其確定蛋白三級結構）和藉由FTIR光譜法（其確定蛋白二級結構）來評價。
如果抗體沒有顯示出顯著的化學改變，那麼所述抗體在藥物製劑中「保留它的化學穩定性」。藉由檢測和定量化學上改變的形式的蛋白，可以評估化學穩定性。經常改變蛋白化學結構的降解過程包括水解或截短（藉由諸如粒徑排阻層析法和SDS-PAGE等方法來評價）、氧化（藉由諸如與質譜法或MALDI/TOF/MS結合的肽譜法等方法來評價）、脫醯胺作用（藉由諸如離子交換色譜法、毛細管等電聚焦、肽譜法、異天門冬胺酸測量等方法來評價）和異構化（藉由測量異天門冬胺酸含量、肽譜法等來評價）。
如果抗體在給定時間的生物活性是在製備藥物製劑時表現出的生物活性的預定範圍內，那麼所述抗體在藥物製劑中「保留它的生物活性」。抗體的生物活性可以例如藉由抗原結合測定來確定。
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J. biol. chem, 243, p3558 （1968）中所述。
本發明所述的「抗體」指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為µ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鍊或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鍊或λ鏈。
在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恆定區，所述的輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鍊或其變體。
在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恆定區，所述的重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區（Fv區）；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區（HVR）和4個序列相對保守的骨架區（FR）。 3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區（CDR）。每條輕鏈可變區（LCVR）和重鏈可變區（HCVR）由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2， FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本發明所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則（LCDR1-3，HCDE2-3），或者符合kabat和chothia的編號規則（HCDR1）。
本發明的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，優選人源化抗體。
術語「鼠源抗體」在本發明中為根據本領域知識和技能製備的對人PD-L1的單株抗體。製備時用PD-L1抗原注射試驗對象，然後分離表現具有所需序列或功能特性的抗體的雜交瘤。在本發明一個優選的實施例中，所述的鼠源PD-L1抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鍊或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恆定區。
術語「嵌合抗體（chimeric antibody）」，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的雜交瘤，然後從小鼠雜交瘤細胞中複製可變區基因，再根據需要複製人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表現嵌合抗體分子。在本發明一個優選的實施例中，所述的PD-L1嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鍊或其變體的輕鏈恆定區。所述的PD-L1嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區。人抗體的恆定區可選自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，優選包含人源IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後無ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用）毒性的IgG4。
術語「人源化抗體（humanized antibody）」，也稱為CDR移植抗體（CDR-grafted antibody），是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的抗體可變抗體反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在「VBase」人種系序列數據庫（http://www.mrccpe.com.ac.uk/vbase）獲得，以及在Kabat，EA等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對所述的人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本發明的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。
本發明中所述的「抗原結合片段」，指具有抗原結合活性的Fab片段，Fab'片段，F（ab'）2片段，以及與人PD-L1結合的Fv片段ScFv片段；其包含本發明所述抗體的選自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12中的一個或多個CDR區。 Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體（single chain antibody）或單鏈Fv（sFv）。本發明的術語「與PD-L1結合」，指能與人PD-L1相互作用。本發明的術語「抗原結合位點」指抗原上不連續的，由本發明抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，老鼠可以用人PD-L1或其片段免疫，所得到的抗體能被復性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟件，從ImMunoGeneTics（IMGT）的網站http://imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的CDNA序列，可以複製並重組至GS表現載體。重組的免疫球蛋白表現載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表現系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表現與人PD-L1特異性結合的抗體得到穩定的複製。陽性的複製在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝劑的A或G Sepharose FF柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法洗脫結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
「保守修飾」或「保守置換或取代」是指具有類似特徵（例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等）的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性（參見例如Watson 等（1987）Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224頁，（第4版））。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破壞生物學活性。
「一致性」是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼所述分子在該位置是一致的。兩個序列之間的一致性百分率是兩個序列共有的匹配或一致位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或一致，那麼兩個序列為60%一致性。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的一致性百分率時進行比較。
「給予」和「處理」當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。 「給予」和「處理」可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中所述流體與細胞接觸。「給予」和「處理」還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。「處理」當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
「治療」意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本發明的任一種結合化合物的組合物，所述患者俱有一種或多種疾病症狀，而已知所述治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量（也稱作「治療有效量」）可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本發明的實施例（例如治療方法或製品）在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗（H檢驗）、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
「有效量」包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
「Tm值」是指蛋白質熱變性溫度，即一半蛋白去折疊時的溫度，此時蛋白的空間結構被破壞，所以Tm值越高，蛋白熱穩定性越高。
以下結合實施例進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例中SEC-HPLC和IEC-HPLC的檢測使用安捷倫-HPLC1260高壓液相色譜儀（Waters Xbridge® BEH 200Å SEC 3.5μm 7.8*300mm色譜柱和Thermo ProPacTM WCX-10 BioLC TM , 250×4mm色譜柱） 。還原CE-SDS及非還原CE-SDS的檢測使用Beckman公司的PA 800plus毛細管電泳儀。蛋白熱變性溫度（Tm）的測定使用GE公司MicroCal VP-Capillary DSC差示掃描熱量計。 DLS（Dynamic Light Scattering）平均粒徑的測定用馬爾文Zetasizer Nano ZS奈米粒度電位儀。
實施例1 PD-L1抗體的製備
（1）PD-L1抗原及檢測用蛋白的製備
以UniProt Programmed Cell Death1 Ligand1（PD-L1） isoform1（SEQ ID NO：19）的人PD-L1全長基因（義翹神州生物技術有限公司，HG10084-M），作為本發明PD-L1的模板，獲得編碼本發明抗原及檢測用蛋白的基因序列，可選地與抗體重鏈Fc片段（如human IgG1）重組，分別複製到pTT5載體上（Biovector，Cat#：102762）或pTargeT 載體上（ promega, A1410），在293F細胞（Invitrogen，R79007）瞬轉表現或CHO-S 細胞（Invitrogen, k9000-20）穩定表現，純化，獲得編碼本發明抗原及檢測用蛋白。人PD-1基因購自ORIGENE，貨號SC117011，NCBI Reference Sequence: NM_005018.1。
1、人PD-L1全長胺基酸序列MRIFAVFIFM TYWHLLNA FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPELP LAHPPNER TH LVILGAILLC LGVALTFIF R LRKGRMMDVK KCGIQDTNSK KQSDTHLEET SEQ ID NO：19 註釋：雙橫線部分為信號肽（Signal peptide: 1-18）；劃橫線部分為PD-L1胞外區（Extracellular domain：19-238），其中19-127為Ig-like V-type Domain，133-225為Ig-like C2-type Domain；點劃線部分為跨膜區部分（Transmembrane domain: 239-259）；斜體部分為胞內區（Cytoplasmic domain: 260-290）。
2、免疫原：帶His、PADRE標簽的PD-L1：PD-L1（Extra Cellular Domain，簡稱ECD） -PADRE-His6FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPELP LAHPPNER GS GAKFVAAWTL KAAA HHHHHH SEQ ID NO：20 註釋： 劃橫線部分為PD-L1胞外區；點劃線部分為PADRE標記；斜體部分為His6-tag標記。
3、得到帶FLAG、HIS標簽的PD-L1：PD-L1（ECD）-Flag-His6，用於本發明抗體的性能測試。FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPELP LAHPPNER DY KDDDDK HHHH HH SEQ ID NO：21 註釋：劃橫線部分為PD-L1胞外區；點劃線部分為FLAG-Tag標記；斜體部分為His6-tag標記。
4、PD-L1的Fc融合蛋白：PD-L1（ECD）-Fc，用作本發明的免疫抗原或檢測試劑。 VKL-PD-L1（ECD）-Fc（human IgG1）FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNER DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO：22 註釋：劃橫線部分為PD-L1胞外區；斜體部分為human IgG1 Fc 部分。
5、PD-1的Fc融合蛋白：PD-1（ECD）-Fc，用於本發明抗體的性能測試。PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO：23 註釋：劃橫線部分為PD-1（ECD）胞外區；斜體部分為hFC（human IgG1）部分。
（2）PD-L1、PD-1重組蛋白以及雜交瘤抗體、重組抗體的純化
1、「帶His、PADRE標籤的PD-L1」：PD-L1（ECD）-PADRE-His6（SEQ ID NO：20）重組蛋白的純化步驟
將細胞表現上清樣品高速離心去除雜質，並將緩衝液換置換為PBS，加入咪唑至終濃度為5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡鎳柱，沖洗2-5倍柱體積。將置換後的上清樣品裝載於Ni柱（GE，17-5318-01）上。用含有5mM咪唑的PBS溶液沖洗柱子，至A280讀數降至基線。後用PBS+10mM咪唑沖洗層析柱，除去非特異結合的雜蛋白，並收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脫目的蛋白，並收集洗脫峰。收集的洗脫液濃縮後用凝膠層析Superdex200（GE）進一步純化，流動相為PBS。去聚體峰，收集洗脫峰。所得到的蛋白經電泳、肽圖（安捷倫，6530 Q-TOF）、LC-MS（安捷倫，6530 Q-TOF）鑑定為正確後分裝備用。得到帶His、PADRE標籤的PD-L1：PD-L1（ECD）-PADRE-His6 （SEQ ID NO：2）用於本發明抗體的免疫原。
2、帶His標籤和Flag標籤的PD-L1（ECD）-Flag-His6（SEQ ID NO：21）重組蛋白的純化步驟
將樣品高速離心去除雜質，並濃縮至適當體積。將如上IMAC柱洗出的蛋白峰裝載於0.5×PBS平衡的flag親和柱（Sigma，A2220）上，沖洗2-5倍柱體積。將除雜後的細胞表現上清樣品裝載於柱上。用0.5×PBS沖洗柱子，至A280讀數降至基線。用含有0.3M NaCl的PBS沖洗柱子，沖洗雜蛋白，並收集。用0.1M乙酸（pH3.5-4.0）洗脫目的蛋白，並收集，調節pH至中性。收集的洗脫液濃縮後用凝膠層析Superdex200（GE）進一步純化，流動相為PBS。去聚體峰，收集洗脫峰收集樣品經電泳、肽圖、LC-MS鑑定正確後分裝備用。得到帶His標籤和Flag標籤的PD-L1：PD-L1（ECD）-Flag-His6（SEQ ID NO：3），用於本發明抗體的性能測試。
3、PD-L1和PD-1的Fc融合蛋白的純化步驟
將細胞表現上清樣品高速離心去除雜質，濃縮至適當體積後裝載於Protein A 柱（GE，17-5438-01）上。用PBS沖洗柱子，至A280讀數降至基線。用100mM 醋酸鈉 pH3.0洗脫目的蛋白。 1M TrisHCl中和後的蛋白上PBS平衡好的凝膠層析Superdex200（GE）進一步純化。去聚體峰，收集洗脫峰後，分裝備用。此方法用來純化PD-L1（ECD）-Fc（SEQ ID NO：4）和PD-1（ECD）-Fc（SEQ ID NO：5）。 PD-L1（ECD）-Fc可用作本發明的免疫抗原或檢測試劑，PD-1（ECD）-Fc用於本發明抗體的性能測試。
（3）抗人PD-L1雜交瘤單株抗體的製備
1、免疫
抗人PD-L1單株抗體藉由免疫小鼠產生，實驗用SJL白小鼠，雌性，6週齡（北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2012- 0001）。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1週，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60 %。將已適應環境的小鼠按兩種方案（方案A和方案B）免疫，每組6-10隻。免疫抗原為帶His、PADRE標籤的PD-L1：PD-L1（ECD）-PADRE-His6（SEQ ID NO：20）。
方案A用弗氏佐劑（sigma Lot Num：F5881/F5506）乳化：首免用弗氏完全佐劑（CFA），其餘加強免疫用弗氏不完全佐劑（IFA）。抗原與佐劑比例為1:1，100μg/隻（首免），50μg/隻（加強免疫）。第0天腹膜內（IP）注射100μg/隻的乳化後抗原，首免後每兩週一次，共6-8週。
方案B用Titermax（sigma Lot Num：T2684）與Alum（Thremo Lot Num：77161） 交叉免疫。抗原與佐劑（titermax）比例為1:1，抗原與佐劑（Alum）比例為3:1，10-20μg/隻（首免），5μg/隻（加強免疫）。第0天腹膜內（IP）注射20/10μg/隻的乳化後抗原，首免後每週一次，Titermax和Alum交替使用，共6-11週。免疫四周後，根據背部結塊和腹部腫脹情況，選擇背部或腹膜內注射抗原。
2、細胞融合 選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平台的小鼠進行脾細胞融合，融合前72小時衝刺免疫所選小鼠，腹腔注射。採用優化的PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞（ATCC® CRL-8287™）進行融合得到雜交瘤細胞。融合好的雜交瘤細胞用HAT完全培養基（含20%FBS、1×HAT和1×OPI的RPMI-1640培養基）重懸，分裝於96孔細胞培養板中（1×105/150μl/孔），37℃、5%CO2 孵育。融合後的第5天加入HAT完全培養基，50μl/孔，37℃、5%CO2 孵育。融合後第7天~8天，根據細胞生長密度，全換液，培養基為HT完全培養基（含20%FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培養基），200μl/孔， 37℃、5%CO2 孵育。
3、雜交瘤細胞篩選
融合後第10-11天，根據細胞生長密度，進行結合PD-L1的ELISA方法檢測。並將結合ELISA檢測的陽性孔細胞進行PD-L1/PD-1結合的阻斷ELISA檢測，陽性孔換液，並根據細胞密度及時擴大至24孔板中。移入24孔板的細胞株經過複測後進行保種和第一次亞複製（subcloning）。第一次亞複製篩選為陽性的進行保種，並進行第二次亞複製。第二次亞複製為陽性的進行保種和蛋白表現。多次融合獲得有阻斷PD-L1和PD-1結合效果的雜交瘤細胞。
藉由阻斷實驗和結合實驗篩選得到雜交瘤複製1和2，用腹水法或用無血清細胞培養法進一步製備抗體，按純化實例純化抗體，供在檢測例中使用。
測序獲得鼠源抗體的可變區序列，其中測得雜交瘤複製的CDR可變區序列如下表1所示： 表1
Figure 107116620-A0304-0001
 其中X1 選自N或T，X2 選自R或H，X3 選自N或H，X4 選自H或G，X5 選自G或F。
（4）抗人PD-L1雜交瘤單株抗體的人源化
藉由比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫和MOE軟件，挑選同源性高的重輕鏈可變區種系基因作為模板，將鼠源抗體1和2的CDR分別移植到相應的人源模板中，經親和力成熟後形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。
鼠源抗體1的人源化輕鏈模板為IGKV4-1*01和hjk4.1，人源化重鏈模板為IGHV4-30-4*01和hjh2，人源化可變區序列如下： ＞1 hVH- CDR graftQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIS NDYWN WIRQHPGKGLEWIG YISYTGSTYYNPSLKS RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR SGGWLAPFDY WGRGTLVTVSS SEQ ID NO：24 ＞1 hVL CDR graftDIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSLFYRSNQKNSLA WYQQKPGQPPKLLIY GASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQYYGYPYT FGGGTKVEIK SEQ ID NO：25
鼠源抗體2的人源化輕鏈模板為IGKV7-3*01和hjk2.1，人源化重鏈模板為IGHV1-46*01和hjh6.1，人源化可變區序列如下： ＞2- hVH.1QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SYWMH WVRQAPGQGLEWMG RIHPNSGGTSYNEKFKN RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR GGSSYDYFDY WGQGTTVTVSS SEQ ID NO：26 ＞2-hVL.1DIVLTQSPASLAVSPGQRATITC RASESVSIHGTHLMH WYQQKPGQPPKLLIY AASNLES GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYC QQSFEDPLT FGQGTKLEIK SEQ ID NO：27 註：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下劃線為CDR序列。
（5）人源化複製構建
設計引物PCR搭建各人源化抗體VH/VK基因片段，再與表現載體pHr（帶信號肽及恆定區基因（CH1-FC/CL）片段）進行同源重組，構建抗體全長表現載體VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr。
1、引物設計：利用在線軟件DNAWorks （v3.2.2） （ http://helixweb.nih.gov/dnaworks/ ） 設計多條引物合成VH/VK含重組所需基因片段：5'-30bp 信號肽+ VH/VK + 30bp CH1/CL-3'。引物設計原則：目的基因2與目的基因1有2個aa不一樣，則另設突變位點所在引物，如圖1所示。
2、片段拼接：按照TaKaRa公司Primer STAR GXL DNA聚合酶操作說明書，用上面設計的多條引物，分兩步PCR擴增得到VH/VK含重組所需基因片段。
3、表現載體pHr（帶信號肽及恆定區基因（CH1-FC/CL）片段）構建及酶切
利用一些特殊的限制性內切酶，如BsmBI，識別序列與酶切位點不同的特性設計構建表現載體pHr（帶信號肽及恆定區基因（CH1-FC/CL）片段），構建示意圖如圖2所示。 BsmBI酶切載體，切膠回收備用。
4、重組構建表現載體VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr
VH/VK含重組所需基因片段與BsmBI酶切回收表現載體pHr（帶信號肽及恆定區基因（CH1-FC/CL）片段）按摩爾比3:1比例分別加入DH5H感受態細胞中，0℃冰浴30min，42℃熱擊90s，加入5倍體積LB介質，37℃孵育45min，塗佈LB-Amp平板，37℃培養過夜，挑取單株送測序得到各目的複製。
（6）抗-PD-L1人源化抗體親和力成熟
1、構建人源化PD-L1抗體1和2噬菌粒載體
人源化後的PD-L1抗體1和2分別以scFv模式（VH-3個GGGGS-VL）構建到噬菌粒載體中，作為野生型序列（即相對於親和力成熟篩選得到的突變序列，作為原始或起始序列）。利用over-lap PCR拼接VH、（GGGGS）3 linker、VL，採用NcoI和NotI酶切位點連接入噬菌粒載體。
2、構建噬菌體展示文庫
利用構建好的野生型scFv為模板，採用codon-based引物，在引物合成過程中，突變區域每個密碼子都有50%野生型的密碼子和50%的NNK（反向引物為MNN））在所有CDR區引入突變構建突變文庫。 PCR片段經過NcoI和NotI酶切，連接到噬菌粒體載體中，最後電轉化大腸桿菌TG1。每條codon-based引物建立一個獨立的文庫，其中抗體1分為7個文庫，抗體2分為8個文庫。
3、文庫淘篩
文庫經過拯救包裝出淘篩用的噬菌體顆粒後，利用生物素化的人PD-L1 （ECD） 抗原和鏈黴親和素磁珠進行液相法淘篩，並且每一輪篩選相對於上一輪都降低抗原濃度。三輪淘篩之後，抗體1和抗體2分別挑取250複製進行噬菌體 ELISA檢測結合活性，陽性複製進行測序。
4、表面等離子體共振（SPR）檢測親合力
經過對測序複製進行比對分析，去除冗餘序列之後，將非冗餘序列轉換成全長IG（γ1, κ）進行哺乳動物細胞表現。 親和純化之後的全長IG採用BIAcoreTM X-100 instrument （GE Life Sciences）進行親合力測定。
親和力成熟後的人源化抗體2的可變區序列如下：
重鏈可變區QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SYWMH WVRQAPGQGLEWMG RI G PNSG F TSYNEKFKN RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR GGSSYDYFDY WGQGTTVTVSS SEQ ID NO：13 其中，CDR2的X4 為G，X5 為F。
輕鏈可變區DIVLTQSPASLAVSPGQRATITC RASESVSIHGTHLMH WYQQKPGQPPKLLIY AASNLES GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYC QQSFEDPLT FGQGTKLEIK SEQ ID NO：14 註：序列中斜體為FR序列；下劃線為CDR序列，其中雙下劃線的位點為親和力成熟篩選後得到的位點。
親和力成熟後的人源化抗體1的可變區序列如下：
重鏈可變區QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIS NDYW T WIRQHPGKGLEYIG YISYTGSTYYNPSLKS RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR SGGWLAPFDY WGRGTLVTVSS SEQ ID NO：28 其中，CDR1的X1 為T。
輕鏈可變區DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSLFY H SNQK H SLA WYQQKPGQPPKLLIY GASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQYYGYPYT FGGGTKVEIK SEQ ID NO：29 其中，CDR1 X2 為H，X3 為H。
將親合力成熟得到的複製轉換成IgG4類型，選擇核心鉸鏈區包含S228P突變的IgG4以得到無ADCC和CDC的抗體，其中由抗體2得到的抗體命名為HRP00052。
下述基因序列SEQ ID NO: 16和18的最後三位核苷酸「TGA」為終止密碼子，不編碼任何胺基酸。
HRP00052抗體重鏈序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO：15
HRP00052抗體重鏈序列編碼基因序列CAGGTGCAACTGGTGCAGAGCGGTGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCAAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATCGGGCCCAACAGTGGTTTCACTAGCTACAATGAAAAGTTCAAGAACAGGGTAACCATGACCAGGGACACCTCCACCAGCACAGTGTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGCAGCAGCTACGACTACTTCGACTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGT GCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCTGCTGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA SEQ ID NO：16
HRP00052抗體輕鏈序列DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO：17
HRP00052抗體輕鏈序列編碼基因序列：GACATCGTGCTGACCCAGAGTCCCGCCTCACTTGCCGTGAGCCCCGGTCAGAGGGCCACCATCACCTGTAGGGCCAGCGAGAGCGTGAGCATCCACGGCACCCACCTGATGCACTGGTATCAACAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAACTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTCACTATCAACCCCGTGGAGGCCGAGGACACCGCCAACTACTACTGCCAGCAGAGCTTCGAGGACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA SEQ ID NO：18 註：劃線部分為抗體重鏈或輕鏈的可變區序列，或編碼其的核苷酸序列；未劃線部分為抗體恒定區序列及其相應的編碼核苷酸序列。
構建用於表達PD-L1抗體HRP00052的表達質粒，藉由DNA序列分析，確認了編碼重鏈和輕鏈的核苷酸序列以及它們各自的啟動子和聚腺苷酸信號序列，隨後使用所述表達載體轉染CHO細胞系。基於生長和生產穩定性選擇表達抗體的複製，製備主種子庫，然後使用該種子庫來製備抗體和產生主細胞庫。
在搖瓶、培養袋和種子生物反應器中繁殖來自主細胞庫的細胞，將所得的種細胞利用生物反應器生產抗體產物。得到的抗體進一步藉由蛋白A親和色譜法、陽離子交換色譜法和陰離子交換色譜法純化，以及低pH病毒滅活和過濾步驟清除病毒。具體純化步驟如下：將細胞表達上清樣品裝載於PBS緩衝液平衡的Protein A 柱（Merck，175118824）上，用PBS沖洗柱子，至A280讀數降至基線，後用PB緩衝液沖洗柱子，洗去雜蛋白，再用50mM 檸檬酸鈉 pH3.5洗脫目的蛋白並收集洗脫峰。用1M Tris中和後的蛋白上PB緩衝液平衡好的陰離子層析柱（GE，17-5316-10）進行純化，收集流穿峰，用1M檸檬酸回調至pH5.0。陰離子層析後蛋白上檸檬酸緩衝液（pH5.0）平衡好的陽離子層析柱（Merck，1.16882）進一步純化，用含0.18M氯化鈉的檸檬酸緩衝液（pH5.0）洗脫目的蛋白並收集洗脫峰，分裝備用。
實施例2
以PD-L1製劑（1mg/ml）緩衝體系、緩衝劑濃度、pH值、糖種類以及糖濃度進行實驗設計，利用DSC技術測定樣品的Tm值，初步篩選製劑的處方。
以緩衝體系、緩衝劑濃度、pH值、糖種類以及糖濃度為因子，以Tm值為響應值設計試驗，生成設計表，根據設計表實驗組進行實驗，測定Tm值。 表2. 以Tm值為響應值的DSC結果
Figure 107116620-A0304-0002
以Tm值為響應值，根據實驗結果，對模型進行擬合，R2 為0.999877，調整R2 為0.997913，方差分析P =0.0348＜ 0.05，模型有效，結果可靠。 註：糖的濃度單位為g/100mL。
根據Tm值最大化原則，由Tm各因子主效應圖（圖3）初步篩選出的處方為：緩衝體系，醋酸（鈉）較好，其次是琥珀酸（鈉）；緩衝劑濃度20-30mM時，Tm值較高；pH5-5.6對Tm值無顯著影響；糖濃度6%最好。
實施例3
將抗PD-L1抗體（HRP00052）分別配製為pH5.0-5.5的含10 mM琥珀酸（鈉）、醋酸（鈉），60 mg/ml蔗糖，0.2 mg/ml聚山梨醇酯20的製劑，蛋白濃度為50 mg/ml。過濾並灌裝每種製劑於中性硼矽玻璃管制注射劑瓶中，所述玻璃瓶用注射液用溴化丁基橡膠塞封口，進行2 ~ 8℃長期穩定性考察，樣品穩定性藉由表3所示的多種特徵進行說明。
對樣品於室溫下以黑色背景在白色螢光燈下藉由目測檢查確定樣品顏色，外觀和清澈度。藉由高效粒徑排阻層析法（HP-SEC） 進一步評估樣品的純度，其中測定單體的百分比以及高分子量物質（可能為聚集體）和晚期洗脫峰（可能為降解產物）的百分比。使用高效離子交換色譜法 （HP-IEX），藉由揭示酸性或鹼性變體的存在來評估純度，將結果表示為總觀察物質的百分比。藉由CE-SDS技術分析樣品，其中在還原和非還原條件下用十二烷基硫酸鈉（SDS）將蛋白變性，並使用毛細管電泳（CE）進行分離。所述蛋白基於它們的表觀分子量而分離。在非還原條件下，除了主要IgG峰以外的所有物質被歸類為雜質。在還原條件下，IgG被拆分為重鏈和輕鏈，所有其它物質被歸類為雜質。
結果顯示抗PD-L1抗體在琥珀酸緩衝鹽體系中的穩定性明顯優於醋酸鹽緩衝體系；抗PD-L1抗體在pH 5.0–5.5均非常穩定。 表3. pH及緩衝鹽體系對抗PD-L1抗體的2~8℃長期穩定性的影響
Figure 107116620-A0304-0003
實施例4
將抗PD-L1抗體分別配製為10 mM及20mM琥珀酸（鈉），pH5.2，60 mg/ml蔗糖，0.2 mg/ml聚山梨醇酯20的製劑，蛋白濃度為50 mg/ml。過濾並灌裝每種製劑於中性硼矽玻璃管制注射劑瓶中，所述玻璃瓶用注射液用溴化丁基橡膠塞封口，進行40℃加速和2 ~ 8℃長期穩定性研究考察。結果顯示抗PD-L1抗體在10 ~ 20 mM的琥珀酸緩衝體系中均非常穩定。 表4. 不同緩衝體系濃度的製劑處方40 ℃穩定性結果
Figure 107116620-A0304-0004
 表5. 不同緩衝體系濃度的製劑處方2~8 ℃穩定性結果
Figure 107116620-A0304-0005
實施例5
製備PD-L1抗體（HRP00052）濃度為50 mg/ml，含20 mM醋酸（鈉），pH 5.2，60 mg/ml蔗糖，含不同種類及濃度表面活性劑的抗PD-L1抗體製劑，過濾並灌裝每種製劑於中性硼矽玻璃管制注射劑瓶中，所述玻璃瓶用注射液用溴化丁基橡膠塞封口，置於25℃恆溫搖床上，以200 rpm的速度振搖。
使用DLS（Dynamic Light Scattering）測量平均擴散係數，用於表徵溶液中奈米級粒子的粒徑大小和粒徑分佈，PDI（particle dispersion index）分佈係數體現了粒子粒徑均一程度，PDI越小，則粒徑分佈越窄，粒徑越均一。
穩定性結果表明，0.1 - 0.3 mg/ml聚山梨酯20或聚山梨酯80，有效防止了抗PD-L1抗體的聚集和團聚大顆粒物的形成。 表6. 不同種類和濃度的聚山梨酯振搖實驗結果
Figure 107116620-A0304-0006
實施例6
製備PD-LI抗體（HRP00052）濃度為50 mg/ml，含20 mM琥珀酸（鈉），pH 5.2，60 mg/ml蔗糖，含不同種類及濃度表面活性劑的抗PD-L1抗體製劑，過濾並灌裝每種製劑於中性硼矽玻璃管制注射劑瓶中，所述玻璃瓶用注射液用溴化丁基橡膠塞封口，置於2 ~ 8 ℃條件下進行穩定性實驗。結果表明聚山梨酯80明顯優於聚山梨酯20，且各個濃度之間無明顯差異。 表7. 不同聚山梨酯種類及濃度的製劑處方2 ~ 8℃穩定性結果
Figure 107116620-A0304-0007
圖1：人源化複製構建時引物設計示意圖。 圖2：人源化複製構建的載體構建示意圖。 圖3：Tm各因子主效應圖（包括緩衝體系、緩衝液濃度、藥物組合物的pH、糖濃度和糖的種類）。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019

Claims (16)

  1. 一種藥物組合物，其包含抗PD-L1抗體或其抗原結合片段以及緩衝劑，所述藥物組合物包含：40mg/ml至60mg/ml的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：13所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區，pH5.0-5.5、10mM至30mM的琥珀酸鹽緩衝劑，40mg/ml至80mg/ml的蔗糖，和0.4mg/ml至0.8mg/ml的聚山梨酯80。
  2. 如請求項1所述之藥物組合物，其包含：45mg/ml至55mg/ml的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，pH5.0-5.5、10mM至30mM的琥珀酸鹽緩衝劑，55mg/ml至80mg/ml的蔗糖，0.4mg/ml至0.8mg/ml的聚山梨酯80。
  3. 如請求項1所述之藥物組合物，其中所述緩衝劑pH為約5.2。
  4. 如請求項1所述之藥物組合物，其中所述緩衝劑濃度為約20mM。
  5. 如請求項1所述之藥物組合物，其中所述抗體濃度為約50mg/ml。
  6. 如請求項1所述之藥物組合物，其中所述蔗糖濃度為約60mg/ml。
  7. 如請求項1所述之藥物組合物，其中所述聚山梨酯80濃度為約0.6mg/ml。
  8. 如請求項1所述之藥物組合物，其可選自以下組合物中的一種：藥物組合物A，包含：50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，pH5.2、20mM的琥珀酸鹽緩衝劑，60mg/ml的蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨酯80；藥物組合物B，包含：50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，pH5.2、20mM的琥珀酸鹽緩衝劑，60mg/ml的蔗糖，0.6mg/ml的聚山梨酯80；藥物組合物C，包含：50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，pH5.2、20mM的琥珀酸鹽緩衝劑，60mg/ml的蔗糖，0.8mg/ml的聚山梨酯80； 藥物組合物D，包含：50mg/ml的PD-L1抗體或其抗原結合片段，pH5.5、20mM的琥珀酸鹽緩衝劑，60mg/ml的蔗糖，0.6mg/ml的聚山梨酯80。
  9. 如請求項1所述之藥物組合物，其中所述的抗體或其抗原結合片段選自人源化抗體。
  10. 如請求項1所述之藥物組合物，其中所述的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段重鏈序列為SEQ ID NO：15，輕鏈序列為SEQ ID NO：17。
  11. 如請求項1所述之藥物組合物，其中所述的琥珀酸鹽緩衝劑為琥珀酸-琥珀酸鈉緩衝劑。
  12. 一種製備如請求項1至11任一項所述之藥物組合物的方法，包括將抗PD-L1抗體或抗原結合片段與藥學上可接受的賦形劑混合。
  13. 一種如請求項1至11任一項所述之藥物組合物在製備用於治療PD-L1介導的疾病或病症的藥物中的用途。
  14. 如請求項13所述之用途，其中所述的疾病或病症為癌症。
  15. 如請求項14所述之用途，其中所述癌症為表現PD-L1的癌症。
  16. 如請求項13所述之用途，其中所述癌症為乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌和膀胱癌。
TW107116620A 2017-05-16 2018-05-16 一種pd-l1抗體藥物組合物及其用途 TWI734916B (zh)

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