CN112618482A - 新型蛋白制剂 - Google Patents

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岳丽云
李皓
颜贞
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Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd
Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd
Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本公开涉及新型蛋白制剂。具体而言，本公开涉及的新型蛋白制剂包含蛋白质(例如抗体或抗原结合片段)，以及聚氧乙烯烷基醚(例如聚乙二醇十六烷基醚)。本公开还涉及制备所述药物制剂的方法。

Description

新型蛋白制剂
技术领域
本公开属于生物制剂领域，具体涉及一种蛋白制剂，包含蛋白质以及聚氧乙烯烷基醚。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，不必然构成现有技术。
单克隆抗体(mAb)类药物是当今生物制药研发领域的热点。单克隆抗体作为一种生物活性分子，其结构容易发生物理/化学降解，使得活性发生改变，从而影响抗体的治疗效果。同小分子化合物一样，抗体类药物同样需要添加其他的辅料来维持其货架期的有效性，提高其生物利用度。常用的辅料有糖类，氨基酸，盐，表面活性剂等。
表面活性剂是同时具有极性的亲水基团和非极性的疏水基团的两亲性分子，可以降低液面的表面张力。根据其是否可以在水溶液中解离分为离子型表面活性剂和非离子型表面活性。离子型表面活性剂在水溶液中电离出带电粒子可能会影响蛋白表面的电荷分布，从而使蛋白发生变性；非离子型表面活性剂在水中不会发生解离，性质相对温和，对蛋白结构的影响较小，因此在选择候选表面活性剂时以非离子表面活性剂作为主要的选择标准。
非离子型表面活性剂在水溶液中不电离，其亲水基主要是由具有一定数量的含氧基团(一般为醚基和羟基)构成，广泛应用于蛋白制剂中用于保护蛋白在振摇或运输等过程中的稳定。非离子活性剂中同时存在亲水基团和疏水基团，使其更倾向于分布在气-液表面，固-液表面，从而形成一个对蛋白的保护层，防止了固体和气体液面对于蛋白的吸附，从而降低了蛋白在气-液表面，固-液表面的聚集，维持其稳定性。亦有报道称非离子型表面活性剂可以结合在蛋白的疏水位点，起到分子伴侣的作用防止其错误折叠，或分子间的碰撞，从而稳定其结构。
常用的非离子表面活性剂有吐温80和吐温20。吐温80(Tween 80；polysorbate80)是聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯，吐温20(Tween 20；polysorbate 20)是聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，二者都是药物制剂中常用的辅料。由于其结构中具有较长的碳链结构,对亲脂性药物有较好的助溶作用,在制备难溶性药物制剂时,常用作助溶剂、乳化剂和稳定剂等。但吐温自身结构不稳定，一方面其结构中存在酯键，在溶液中容易发生水解，其水解产物为长链脂肪酸，由于长链脂肪酸的水溶性差，在溶液中容易形成微核，使得蛋白吸附到微核上，引起蛋白的聚集，在长期放置过程中容易形成颗粒，这些放样过程中形成的聚体和颗粒注射入体内后会引起体内的免疫反应；另一方面，吐温结构中的环氧乙烯结构容易发生氧化，从而产生自由基，这些自由基可能进一步引起蛋白结构的氧化。
随着人们对吐温研究的不断深入,以及对其药理活性、临床安全性的进一步了解,必将对人们的安全用药产生影响,也将慎用含吐温80的静脉注射剂。因此,研发更加安全、有效的新型注射用助溶剂，包括研究新型表面活性剂在制剂中的应用，以避免临床严重不良反应的发生，是本领域的需求。
公开内容
本公开通过对一些未应用于抗体制剂中的表面活性剂进行考察，主要通过评估在强制降解条件下制剂的外观、蛋白纯度相及表面活性剂的稳定性，以期望找到更有效的保护蛋白纯度及活性的，起效浓度更低、自身稳定性好的同时在使用剂量下安全的表面活性剂，扩大可选择辅料的范围。
第一方面，本公开提供一种药物制剂，其包含蛋白质，和聚氧乙烯烷基醚。
在一些实施方案中，聚氧乙烯烷基醚是聚乙二醇十六烷基醚。
在一些实施方案中，聚氧乙烯烷基醚或聚乙二醇十六烷基醚浓度为约0.001mg/mL至1.0mg/mL，0.001mg/mL至0.9mg/mL，0.001mg/mL至0.8mg/mL，0.001mg/mL至0.7mg/mL，0.001mg/mL至0.6mg/mL，0.001mg/mL至0.5mg/mL，约0.002mg/mL至0.5mg/mL，约0.005mg/mL至0.5mg/mL，约0.0075mg/mL至0.5mg/mL，约0.01mg/mL至0.5mg/mL，约0.0125mg/mL至0.5mg/mL，约0.015mg/mL至0.5mg/mL，约0.0175mg/mL至0.5mg/mL，约0.02mg/mL至0.5mg/mL，约0.0225mg/mL至0.5mg/mL，约0.025mg/mL至0.5mg/mL，约0.0275mg/mL至0.5mg/mL，约0.03mg/mL至0.25mg/mL，约0.0325mg/mL至0.225mg/mL，约0.035mg/mL至0.2mg/mL，约0.0375mg/mL至0.175mg/mL，约0.04mg/mL至0.15mg/mL，约0.0425mg/mL至0.15mg/mL，约0.045mg/mL至0.5mg/mL，约0.0475mg/mL至0.5mg/mL，约0.05mg/mL至0.5mg/mL，约0.0525mg/mL至0.5mg/mL，约0.055mg/mL至0.5mg/mL，约0.0575mg/mL至0.5mg/mL，约0.06至0.5mg/mL，约0.0625mg/mL至0.5mg/mL，约0.065mg/mL至0.5mg/mL，约0.0675mg/mL至0.5mg/mL，约0.07mg/mL至0.5mg/mL，约0.0725mg/mL至0.5mg/mL，约0.075mg/mL至0.5mg/mL，约0.0775mg/mL至0.5mg/mL，约0.08mg/mL至0.5mg/mL，约0.0825mg/mL至0.5mg/mL，约0.085mg/mL至0.5mg/mL，约0.0875mg/mL至0.5mg/mL，约0.09mg/mL至0.5mg/mL，约0.0925mg/mL至0.5mg/mL，约0.095mg/mL至0.5mg/mL，约0.0975mg/mL至0.5mg/mL，约0.1mg/mL至0.5mg/mL。在一些实施方案中，其浓度为约0.001mg/mL至0.4mg/mL，约0.002mg/mL至0.4mg/mL，约0.005mg/mL至0.4mg/mL，约0.0075mg/mL至0.4mg/mL，约0.01mg/mL至0.4mg/mL，约0.0125mg/mL至0.4mg/mL，约0.015mg/mL至0.4mg/mL，约0.0175mg/mL至0.4mg/mL，约0.02mg/mL至0.4mg/mL，约0.0225mg/mL至0.4mg/mL，约0.025mg/mL至0.4mg/mL，约0.0275mg/mL至0.4mg/mL，约0.03mg/mL至0.25mg/mL，约0.0325mg/mL至0.225mg/mL，约0.035mg/mL至0.2mg/mL，约0.0375mg/mL至0.175mg/mL，约0.04mg/mL至0.15mg/mL，约0.0425mg/mL至0.15mg/mL，约0.045mg/mL至0.4mg/mL，约0.0475mg/mL至0.4mg/mL，约0.05mg/mL至0.4mg/mL，约0.0525mg/mL至0.4mg/mL，约0.055mg/mL至0.4mg/mL，约0.0575mg/mL至0.4mg/mL，约0.06至0.4mg/mL，约0.0625mg/mL至0.4mg/mL，约0.065mg/mL至0.4mg/mL，约0.0675mg/mL至0.4mg/mL，约0.07mg/mL至0.4mg/mL，约0.0725mg/mL至0.4mg/mL，约0.075mg/mL至0.4mg/mL，约0.0775mg/mL至0.4mg/mL，约0.08mg/mL至0.4mg/mL，约0.0825mg/mL至0.4mg/mL，约0.085mg/mL至0.4mg/mL，约0.0875mg/mL至0.4mg/mL，约0.09mg/mL至0.4mg/mL，约0.0925mg/mL至0.4mg/mL，约0.095mg/mL至0.4mg/mL，约0.0975mg/mL至0.4mg/mL，约0.1mg/mL至0.4mg/mL。在一些实施方案中，其浓度为约0.001mg/mL至0.3mg/mL，约0.002mg/mL至0.3mg/mL，约0.005mg/mL至0.3mg/mL，约0.0075mg/mL至0.3mg/mL，约0.01mg/mL至0.3mg/mL，约0.0125mg/mL至0.3mg/mL，约0.015mg/mL至0.3mg/mL，约0.0175mg/mL至0.3mg/mL，约0.02mg/mL至0.3mg/mL，约0.0225mg/mL至0.3mg/mL，约0.025mg/mL至0.3mg/mL，约0.0275mg/mL至0.3mg/mL，约0.03mg/mL至0.25mg/mL，约0.0325mg/mL至0.225mg/mL，约0.035mg/mL至0.2mg/mL，约0.0375mg/mL至0.175mg/mL，约0.04mg/mL至0.15mg/mL，约0.0425mg/mL至0.15mg/mL，约0.045mg/mL至0.3mg/mL，约0.0475mg/mL至0.3mg/mL，约0.05mg/mL至0.3mg/mL，约0.0525mg/mL至0.3mg/mL，约0.055mg/mL至0.3mg/mL，约0.0575mg/mL至0.3mg/mL，约0.06至0.3mg/mL，约0.0625mg/mL至0.3mg/mL，约0.065mg/mL至0.3mg/mL，约0.0675mg/mL至0.3mg/mL，约0.07mg/mL至0.3mg/mL，约0.0725mg/mL至0.3mg/mL，约0.075mg/mL至0.3mg/mL，约0.0775mg/mL至0.3mg/mL，约0.08mg/mL至0.3mg/mL，约0.0825mg/mL至0.3mg/mL，约0.085mg/mL至0.3mg/mL，约0.0875mg/mL至0.3mg/mL，约0.09mg/mL至0.3mg/mL，约0.0925mg/mL至0.3mg/mL，约0.095mg/mL至0.3mg/mL，约0.0975mg/mL至0.3mg/mL，约0.1mg/mL至0.3mg/mL。在一些实施方案中，其浓度为约0.001mg/mL至0.2mg/mL，约0.002mg/mL至0.2mg/mL，约0.005mg/mL至0.2mg/mL，约0.0075mg/mL至0.2mg/mL，约0.01mg/mL至0.2mg/mL，约0.0125mg/mL至0.2mg/mL，约0.015mg/mL至0.2mg/mL，约0.0175mg/mL至0.2mg/mL，约0.02mg/mL至0.2mg/mL，约0.0225mg/mL至0.2mg/mL，约0.025mg/mL至0.2mg/mL，约0.0275mg/mL至0.2mg/mL，约0.03mg/mL至0.25mg/mL，约0.0325mg/mL至0.225mg/mL，约0.035mg/mL至0.2mg/mL，约0.0375mg/mL至0.175mg/mL，约0.04mg/mL至0.15mg/mL，约0.0425mg/mL至0.15mg/mL，约0.045mg/mL至0.2mg/mL，约0.0475mg/mL至0.2mg/mL，约0.05mg/mL至0.2mg/mL，约0.0525mg/mL至0.2mg/mL，约0.055mg/mL至0.2mg/mL，约0.0575mg/mL至0.2mg/mL，约0.06至0.2mg/mL，约0.0625mg/mL至0.2mg/mL，约0.065mg/mL至0.2mg/mL，约0.0675mg/mL至0.2mg/mL，约0.07mg/mL至0.2mg/mL，约0.0725mg/mL至0.2mg/mL，约0.075mg/mL至0.2mg/mL，约0.0775mg/mL至0.2mg/mL，约0.08mg/mL至0.2mg/mL，约0.0825mg/mL至0.2mg/mL，约0.085mg/mL至0.2mg/mL，约0.0875mg/mL至0.2mg/mL，约0.09mg/mL至0.2mg/mL，约0.0925mg/mL至0.2mg/mL，约0.095mg/mL至0.2mg/mL，约0.0975mg/mL至0.2mg/mL，约0.1mg/mL至0.2mg/mL。在一些具体实施方案中，其浓度为约0.001mg/mL，0.002mg/mL，0.003mg/mL，0.004mg/mL，0.005mg/mL，0.006mg/mL，0.007mg/mL，0.008mg/mL，0.009mg/mL，0.01mg/mL，0.011mg/mL，0.012mg/mL，0.013mg/mL，0.014mg/mL，0.015mg/mL，0.016mg/mL，0.017mg/mL，0.018mg/mL，0.019mg/mL，0.02mg/mL，0.021mg/mL，0.022mg/mL，0.023mg/mL，0.024mg/mL，0.025mg/mL，0.026mg/mL，0.027mg/mL，0.028mg/mL，0.029mg/mL，0.030mg/mL，0.031mg/mL，0.032mg/mL，0.033mg/mL，0.034mg/mL，0.035mg/mL，0.036mg/mL，0.037mg/mL，0.038mg/mL，0.039mg/mL，0.04mg/mL，0.041mg/mL，0.042mg/mL，0.043mg/mL，0.044mg/mL，0.045mg/mL，0.046mg/mL，0.047mg/mL，0.048mg/mL，0.049mg/mL，0.05mg/mL。。
在一些实施方案中，蛋白质选自多肽或其片段、抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述蛋白质是氧化敏感的和/或聚集敏感的。
在一些实施方案中，所述制剂是水性的。
在一些实施方案中，所述制剂适于胃肠外注射。
在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体，优选的，所述单克隆抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、骆驼抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段靶向的抗原包括但不限于如下分子：血管内皮生长因子(VEGF)；ox-LDL；ox-ApoB100；肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体化激素；高血糖素；凝固因子，例如因子VIIIC、因子IX、组织因子、和(冯)维勒布兰德(von Willebrand)氏因子；抗凝固因子，例如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原活化剂，例如尿激酶或人尿型或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；林蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(活化时受到调节，正常情况由T-细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清清蛋白，例如人血清清蛋白；穆勒(Muellerian)抑制性物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白质，例如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；抑制素；活化素；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，例如骨衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5、或-6(NT-3、NT-4、NT-5、或NT-6)，或神经生长因子，例如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，例如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态生成蛋白(BMP)；干扰素，例如干扰素-α、-β、和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF、和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS被膜的一部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，例如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，例如HER2、HER3或HER4受体；免疫点蛋白，例如B7家族分子、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-1-PD-L1、PD-1-PD-L2、介白素2(IL-2)、吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)、IL-10、T细胞免疫球蛋白及黏蛋白3(TIM3或HAVCR2)、半乳糖凝集素9-TIM3、磷脂醯丝胺酸-TIM3、淋巴球活化基因3蛋白(LAG3)、MHC II类-LAG3、41BB、41BBL、OX40-OX40L、GITR、GITRL-GITR、CD25、CD27、CD70-CD27、TNFRSF25、TNFRSF25-TL1A、CD40L、CD40、HVEM-LIGHT-LTA、HVEM、HVEM-BTLA、HVEM-CD160、HVEM-LIGHT、HVEM-BTLA-CD160、CD80、CD80-PD-L1、PDL2-CD80、CD244、CD48-CD244、CD244、ICOS、ICOS-ICOSL、B7 H3、B7 H4、VISTA、TMIGD2、HHLA2-TMIGD2、嗜乳脂蛋白(包括BTNL2)、Siglec家族、TIGIT及PVR家族成员、KIRs、ILTs及LIRs、NKG2D及NKG2A、MICA及MICB、CD244、CD28、CD86-CD28、CD86-CTLA、CD80-CD28、CD39、CD73腺苷-CD39-CD73、CXCR4-CXCL12、磷脂醯丝胺酸、TIM3、磷脂醯丝胺酸-TIM3、SIRPA-CD47、CD79、GARP、GITR、PSMA、神经纤毛蛋白(Neuropilin)、CD160、CD30及CD155；和任何以上多肽的片段。在一些具体实施方案中，抗体靶向的抗原为VEGF、PD-1或PD-L1/TGFβ。在一些具体实施方案中，抗体为一种抗VEGF单抗、抗PD-L1抗体，或抗PD-L1抗体与TGFβ的融合蛋白。
在一些具体实施方案中，所述蛋白质为贝伐单抗。所述蛋白质也可以为贝伐单抗的变体，所述变体的重链CDR 1较之贝伐单抗的重链CDR 1有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或重链CDR 2较之贝伐单抗的重链CDR 2有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或重链CDR 3较之贝伐单抗的重链CDR 3有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链CDR 1较之贝伐单抗的轻链CDR 1有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链CDR 2较之贝伐单抗的轻链CDR 2有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链CDR 3较之贝伐单抗的轻链CDR 3有4、3、2、1个氨基酸突变。在一些实施方案中，变体的重链或重链可变区较之贝伐单抗的重链或重链可变区具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链或轻链可变区较之贝伐单抗的轻链或轻链可变区具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。
在一些具体实施方案中，所述蛋白质为抗PD-L1抗体。在一些具体实施方案中，所述抗PD-L1抗体的重链CDR1-3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-3所示，轻链CDR1-3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4-6所示；重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；重链氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，轻链氨基酸序列如SEQ IDNO：10所示。当前述药物制剂中的蛋白质为抗体或其抗原结合片段时，在一些实施方案中，药物制剂中的蛋白质可以为上述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的变体，在一些实施方案中，变体的重链CDR 1-3分别与SEQ ID NO：1-3具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链CDR1-3分别与SEQ ID NO：4-6具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体的重链可变区与SEQ ID NO：7具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链可变区与SEQ ID NO：8具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体的重链与SEQ ID NO：9具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链与SEQ ID NO：10具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体的重链CDR 1较之SEQ IDNO：1有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或重链CDR 2较之SEQ ID NO：2有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或重链CDR 3较之SEQ ID NO：3有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链CDR 1较之SEQ IDNO：4有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链CDR 2较之SEQ ID NO：5有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链CDR3较之SEQ ID NO：6有4、3、2、1个氨基酸突变。
在一些具体实施方案中，所述蛋白质为抗PD-L1抗体TGFβ融合蛋白。在一些具体实施方案中，所述融合蛋白中抗PD-L1抗体的重链CDR1-3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-3所示，轻链CDR1-3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4-6所示；融合蛋白中抗PD-L1抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；融合蛋白的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。在一些实施方案中，药物制剂中的蛋白质可以为上述抗PD-L1抗体TGFβ融合蛋白的变体，变体的重链CDR1-3分别与SEQ ID NO：1-3具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链CDR1-3分别与SEQ ID NO：4-6具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体的重链可变区与SEQ ID NO：7具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链可变区与SEQ ID NO：8具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体的重链与SEQ ID NO：11具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链与SEQ ID NO：10具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体的重链CDR 1较之SEQ ID NO：1有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或重链CDR 2较之SEQ ID NO：2有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或重链CDR 3较之SEQ ID NO：3有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链CDR 1较之SEQ ID NO：4有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链CDR 2较之SEQ ID NO：5有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链CDR 3较之SEQ ID NO：6有4、3、2、1个氨基酸突变。
在一些实施方案中，所述的制剂还含有缓冲液，缓冲液可选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、枸橼酸-枸橼酸钠、组氨酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液等。在一些具体实施方案中，缓冲液选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、琥珀酸盐、枸橼酸-枸橼酸钠。
在一些实施方案中，所述醋酸盐缓冲液的pH约为5.0至6.0；在一些具体实施方案中，醋酸盐缓冲液的pH约为5.0至5.5，或约为5.5至6.0；在更多一些具体实施方案中，醋酸盐缓冲液的pH约为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0，例如pH约为5.5。
在一些实施方案中，组氨酸缓冲液的pH约为5.5至6.5；在一些具体实施方案中，组氨酸缓冲液的pH约为5.5至6.0，或pH约为6.0至6.5；在更多一些具体实施方案中，组氨酸缓冲液的pH约为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5，例如pH约为6.0或约为5.8。
在一些实施方案中，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH约为5.5至6.8；在一些具体实施方案中，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的pH约为5.8至6.5，或约为6.0至6.4；在一些具体实施方案中，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH约为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5，例如pH约为6.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠冲液缓冲液。
在一些实施方案中，琥珀酸盐缓冲液的pH约为4.2至6.2；在一些具体实施方案中，琥珀酸盐缓冲液的pH约为5.0至5.4，或pH约为4.8至5.6；在更多一些具体实施方案中，琥珀酸盐缓冲液的pH约为4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5，例如pH约为5.2的琥珀酸盐缓冲液缓冲液。
在一些实施方案中，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液的pH约为5.5至6.8；在一些具体实施方案中，枸橼酸-枸橼酸钠的pH约为5.8至6.5，或约为6.0至6.4；在更多一些具体实施方案中，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液的pH约为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5，例如pH约为6.2的枸橼酸-枸橼酸钠冲液缓冲液。
在一些实施方案中，缓冲液浓度为约5mM至约80mM，约5mM至约75mM，约5mM至约70mM，约5mM至约65mM，约5mM至约约60mM，约5mM至约约55mM，约5mM至约约50mM，约5mM至约约45mM，约5mM至约约40mM，约5mM至约35mM，约5mM至约30mM，约5mM至约25mM，约5mM至约20mM，约5mM至约15mM，约5mM至约10mM，约10mM至约80mM，约10mM至约75mM，约10mM至约70mM，约10mM至约65mM，约10mM至约60mM，约10mM至约55mM，约10mM至约50mM，约10mM至约45mM，约10mM至约40mM，约10mM至约35mM，约10mM至约30mM，约10mM至约25mM，约10mM至约20mM，约10mM至约15mM，约15mM至约80mM，约15mM至约75mM，约15mM至约70mM，约15mM至约65mM，约15mM至约60mM，约15mM至约55mM，约15mM至约50mM，约15mM至约45mM，约15mM至约40mM，约15mM至约35mM，约15mM至约30mM，约15mM至约25mM，约15mM至约20mM，约20mM至约80mM，约20mM至约75mM，约20mM至约70mM，约20mM至约65mM，约20mM至约60mM，约20mM至约55mM，约20mM至约50mM，约20mM至约45mM，约20mM至约40mM，约20mM至约35mM，约20mM至约30mM，约20mM至约25mM，约25mM至约80mM，约25mM至约75mM，约25mM至约70mM，约25mM至约65mM，约25mM至约60mM，约25mM至约55mM，约25mM至约50mM，约25mM至约45mM，约25mM至约40mM，约25mM至约35mM，约25mM至约30mM，约30mM至约80mM，约30mM至约75mM，约30mM至约70mM，约30mM至约65mM，约30mM至约60mM，约30mM至约55mM，约30mM至约50mM，约30mM至约45mM，约30mM至约40mM，约30mM至约35mM，约35mM至约80mM，约35mM至约75mM，约35mM至约70mM，约35mM至约65mM，约35mM至约60mM，约35mM至约55mM，约35mM至约50mM，约35mM至约45mM，约35mM至约40mM，约40mM至约80mM，约40mM至约75mM，约40mM至约70mM，约40mM至约65mM，约40mM至约60mM，约40mM至约55mM，约40mM至约50mM，约40mM至约45mM，约45mM至约80mM，约45mM至约75mM，约45mM至约70mM，约45mM至约65mM，约45mM至约60mM，约45mM至约55mM，约45mM至约50mM，约50mM至约80mM，约50mM至约75mM，约50mM至约70mM，约50mM至约65mM，约50mM至约60mM，约50mM至约55mM，约55mM至约80mM，约55mM至约75mM，约55mM至约70mM，约55mM至约65mM，约55mM至约60mM，约60mM至约80mM，约60mM至约75mM，约60mM至约70mM，约60mM至约65mM，约65mM至约80mM，约65mM至约75mM，约65mM至约70mM，约70mM至约80mM，约70mM至约75mM。在一些具体实施方案中，所述缓冲液浓度为约5mM、7mM、8mM、9mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM、22mM、24mM、26mM、28mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM，更例如为10mM、50mM。
在一些实施方案中，药物制剂中的蛋白质浓度为约0.1mg/mL至250mg/mL，约10mg/mL至约200mg/mL，约50mg/mL至约175mg/mL约5mg/mL至约100mg/mL，约10mg/mL至约100mg/mL，约10mg/mL至约90mg/mL，约10mg/mL至约80mg/mL，约10mg/mL至约70mg/mL，约10mg/mL至约60mg/mL，约10mg/mL至约50mg/mL，约10mg/mL至约40mg/mL，约10mg/mL至约30mg/mL，约10mg/mL至约20mg/mL，约20mg/mL至约100mg/mL，约20mg/mL至约90mg/mL，约20mg/mL至约80mg/mL，约20mg/mL至约70mg/mL，约20mg/mL至约60mg/mL，约20mg/mL至约50mg/mL，约20mg/mL至约40mg/mL，约20mg/mL至约30mg/mL，约30mg/mL至约100mg/mL，约30mg/mL至约90mg/mL，约30mg/mL至约80mg/mL，约30mg/mL至约70mg/mL，约30mg/mL至约60mg/mL，约30mg/mL至约50mg/mL，约30mg/mL至约40mg/mL，约40mg/mL至约100mg/mL，约40mg/mL至约90mg/mL，约40mg/mL至约80mg/mL，约40mg/mL至约70mg/mL，约40mg/mL至约60mg/mL，约40mg/mL至约50mg/mL，约50mg/mL至约100mg/mL，约50mg/mL至约90mg/mL，约50mg/mL至约80mg/mL，约50mg/mL至约70mg/mL，约50mg/mL至约60mg/mL，约60mg/mL至约100mg/mL，约60mg/mL至约90mg/mL，约60mg/mL至约80mg/mL，约60mg/mL至约70mg/mL，约70mg/mL至约100mg/mL，约70mg/mL至约90mg/mL，约70mg/mL至约80mg/mL，约80mg/mL至约100mg/mL，约80mg/mL至约90mg/mL，约90mg/mL至约100mg/mL。在一些具体实施方案中，所述蛋白浓度为约0.5mg/mL、1mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL或100mg/mL，例如约为25mg/mL或50mg/mL。在一些具体实施方案中，上述药物制剂中的蛋白质为多肽或其片段、抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，药物制剂中还包括糖(还原和非还原糖)、糖醇和糖酸。多元醇可任选地包括在配制剂中。在一些实施方案中，还原糖可以选自果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖；非还原糖可以选自蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖和棉子糖；糖醇可以选自甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏糖醇、山梨醇和甘油；糖酸，可以选自L-葡萄糖酸及其金属盐。在一些具体实施方案中，糖为海藻糖或蔗糖。在一些实施方案中，所述糖浓度为约30mg/mL至约120mg/mL，约30mg/mL至约110mg/mL，约30mg/mL至约100mg/mL，约30mg/mL至约90mg/mL，约30mg/mL至约80mg/mL，约30mg/mL至约70mg/mL，约30mg/mL至约60mg/mL，约30mg/mL至约50mg/mL，约30mg/mL至约40mg/mL，约40mg/mL至约120mg/mL，约40mg/mL至约110mg/mL，约40mg/mL至约100mg/mL，约40mg/mL至约90mg/mL，约40mg/mL至约80mg/mL，约40mg/mL至约70mg/mL，约40mg/mL至约60mg/mL，约40mg/mL至约50mg/mL，约50mg/mL至约120mg/mL，约50mg/mL至约110mg/mL，约50mg/mL至约100mg/mL，约50mg/mL至约90mg/mL，约50mg/mL至约80mg/mL，约50mg/mL至约70mg/mL，约50mg/mL至约60mg/mL，约60mg/mL至约120mg/mL，约60mg/mL至约110mg/mL，约60mg/mL至约100mg/mL，约60mg/mL至约90mg/mL，约60mg/mL至约80mg/mL，约60mg/mL至约70mg/mL，约70mg/mL至约120mg/mL，约70mg/mL至约110mg/mL，约70mg/mL至约100mg/mL，约70mg/mL至约90mg/mL，约70mg/mL至约80mg/mL，约80mg/mL至约120mg/mL，约80mg/mL至约110mg/mL，约80mg/mL至约100mg/mL，约80mg/mL至约90mg/mL，约90mg/mL至约120mg/mL，约90mg/mL至约110mg/mL，约90mg/mL至约100mg/mL，约100mg/mL至约120mg/mL，约100mg/mL至约110mg/mL，约110mg/mL至约120mg/mL。在一些具体实施方案中，所述糖浓度为约10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL或150mg/mL，例如为60mg/mL、80mg/mL。
在一些实施方案中，药物制剂中还可含有表面活性剂，例如自聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚羟亚烃、Triton、十二烷基磺酸钠、月桂基磺酸钠、辛基糖甙钠、月桂基-磺基甜菜碱、肉豆蔻基-磺基甜菜碱、亚油基-磺基甜菜碱、硬脂基-磺基甜菜碱、月桂基-肌氨酸、肉豆蔻基-肌氨酸、亚油基-肌氨酸、硬脂基-肌氨酸、亚油基-甜菜碱、肉豆蔻基-甜菜碱、鲸蜡基-甜菜碱、月桂酰胺基丙基-甜菜碱、柯卡酰胺基丙基-甜菜碱、亚油酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-甜菜碱、棕榈酰胺基丙基-甜菜碱、异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-二甲基胺、棕榈酰胺基丙基-二甲基胺、异硬脂酰胺基丙基-二甲基胺、甲基可可酰基钠、甲基油基牛磺酸钠、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯与丙烯二醇的共聚物等等。
在一些具体的实施方案中，药物制剂中的表面活性剂是非离子表面活性剂，例如为聚氧乙烯辛基酚(如TritonX-100)；烷基苯氧基聚乙氧基(3)乙醇，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween20)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单棕榈酸酯(Tween40)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单硬脂酸酯(Tween60)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇三硬脂酸酯(Tween65)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯(Tween80)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇三油酸酯(Tween85)，聚氧乙烯(20)棕榈酸酯(G2079)，聚氧乙烯(20)月桂醇醚；聚氧乙烯(23)、聚氧乙烯(25)氢化蓖麻油(G1292)和聚氧乙烯(25)氧丙烯单硬脂酸酯(G2162)；以商标Brij销售的化合物，比如聚氧乙烯(4)月桂醇醚(Brij-30)，聚氧乙烯月桂醚(Brij-35)，聚氧乙烯(20)硬脂醇醚(Brij-78)和聚氧乙烯(20)油醇醚(Brij-92))。
在一些实施方案中，药物制剂中含20nM至100mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，20mg/mL至100mg/mL的α,α至二水合海藻糖，5mg/mL至100mg/mL的蛋白质，0.005mg/mL至0.5mg/mL的聚乙二醇十六烷基醚，pH为5.5至6.8。在一些实施方案中，药物制剂中含30nM至80mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，30mg/mL至90mg/mL的α,α至二水合海藻糖，10mg/mL至60mg/mL的蛋白质，0.0075mg/mL至0.3mg/mL的聚乙二醇十六烷基醚，pH为5.8至6.5。在一些实施方案中，药物制剂中含40nM至70mM磷酸氢二钠至磷酸二氢钠，40mg/mL至80mg/mL的α,α至二水合海藻糖，20mg/mL至50mg/mL的蛋白质，0.01mg/mL至0.2mg/mL的聚乙二醇十六烷基醚，pH为6.0至6.4。在一些实施方案中，药物制剂中含40nM至60mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，50mg/mL至70mg/mL的α,α至二水合海藻糖，15mg/mL至35mg/mL的蛋白质，0.01mg/mL至0.1mg/mL的聚乙二醇十六烷基醚，pH为6.1至6.3。在一些具体实施方案中，药物制剂中含50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，60mg/mL的α,α至二水合海藻糖，25mg/mL的蛋白质，0.0125mg/mL至0.075mg/mL的聚乙二醇十六烷基醚，pH为6.2。上述实施方案中的蛋白质可以为抗体或抗原结合片段。例如，在一些具体实施方案中，药物制剂中含50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，60mg/mL的α,α至二水合海藻糖，25mg/mL的贝伐单抗，0.0125mg/mL至0.075mg/mL聚乙二醇十六烷基醚，pH为6.2。
在一些实施方案中，药物制剂中含1mM至50mM的琥珀酸盐，20mg/mL至100mg/mL的蔗糖，10mg/mL至100mg/mL的蛋白质，0.005mg/mL至0.5mg/mL的聚乙二醇十六烷基醚，pH为4.0至6.5。在一些实施方案中，药物制剂中含5mM至40mM的琥珀酸盐，30mg/mL至90mg/mL的蔗糖，20mg/mL至80mg/mL的蛋白质，0.0075mg/mL至0.3mg/mL的聚乙二醇十六烷基醚，pH为4.5至6.2。在一些实施方案中，药物制剂中含5mM至30mM的琥珀酸盐，40mg/mL至80mg/mL的蔗糖，30mg/mL至70mg/mL的蛋白质，0.01mg/mL至0.2mg/mL的聚乙二醇十六烷基醚，pH为4.8至pH6.0。在一些实施方案中，药物制剂中含5mM至20mM的琥珀酸盐，50mg/mL至70mg/mL的蔗糖，40mg/mL至60mg/mL的蛋白质，0.01mg/mL至0.1mg/mL的聚乙二醇十六烷基醚，pH为5.0至pH5.5。在一些具体实施方案中，药物制剂中含10mM的琥珀酸盐，60mg/mL的蔗糖，50mg/mL的蛋白质，0.0125mg/mL至0.075mg/mL的聚乙二醇十六烷基醚，pH为5.2。上述实施方案中的蛋白质可以为抗体或抗原结合片段。例如，在一些具体实施方案中，药物制剂中含10mM琥珀酸盐，60mg/mL蔗糖，50mg/mL的PD-L1抗体，0.0125mg/mL至0.075mg/mL的聚乙二醇十六烷基醚，pH为5.2。
在一些实施方案中，药物制剂中含1mM至50mM的枸橼酸-枸橼酸钠，40mg/mL至120mg/mL的蔗糖，10mg/mL至100mg/mL的蛋白质，0.005mg/mL至0.5mg/mL的聚乙二醇十六烷基醚，pH为5.5至6.8。在一些实施方案中，药物制剂中含5mM至40mM的枸橼酸-枸橼酸钠，50mg/mL至110mg/mL的蔗糖，20mg/mL至80mg/mL的蛋白质，0.0075mg/mL至0.3mg/mL的聚乙二醇十六烷基醚，pH为5.8至6.5。在一些实施方案中，药物制剂中含5mM至30mM的枸橼酸-枸橼酸钠，60mg/mL至100mg/mL的蔗糖，30mg/mL至70mg/mL的蛋白质，0.01mg/mL至0.2mg/mL的聚乙二醇十六烷基醚，pH为6.0至6.4。在一些实施方案中，药物制剂中含5mM至20mM的枸橼酸-枸橼酸钠，70mg/mL至90mg/mL的蔗糖，40mg/mL至60mg/mL蛋白质，0.01mg/mL至0.1mg/mL聚乙二醇十六烷基醚，pH为6.1至6.3。在一些具体实施方案中，药物制剂中含10mM的枸橼酸-枸橼酸钠，80mg/mL的蔗糖，50mg/mL的蛋白质，0.0125mg/mL-0.075mg/mL的聚乙二醇十六烷基醚，pH为6.2。上述实施方案中的蛋白质可以为抗体或抗原结合片段。例如，在一些具体实施方案中，药物制剂中含10mM枸橼酸-枸橼酸钠，80mg/mL蔗糖，pH6.2，50mg/mL抗PD-L1抗体与TGFβ的融合蛋白，0.0125mg/mL-0.075mg/mL聚乙二醇十六烷基醚。
在一些实施方案中，药物制剂中含有上文所述药剂(例如抗体、缓冲液、和/或表面活性剂)且基本上没有一种或多种防腐剂，例如苯甲醇、酚、间甲酚、氯丁醇和苄索氯铵。在另一些实施方案中，药物制剂中可包括防腐剂，特别是药物制剂为多剂药物制剂的情况。防腐剂的浓度可以在约0.1％至约2％，约0.5％至约1％的范围中。药物制剂中可包括一种或多种其它药学可接受载体、赋形剂或稳定剂，只要它们对药物制剂的期望特征没有不利影响。可接受载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括别的缓冲剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂，例如EDTA；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；生物可降解聚合物，例如聚酯；和/或成盐反荷离子。本公开中的示例性药学可接受载体进一步包括间质药物分散剂例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白。在一些实施方案中，sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
一些实施方案中，药物制剂中的螯合剂为金属离子螯合剂，例如，包括但不必然限于氨基聚羧酸酯、EDTA、EGTA、NTA、EDDS、PDTA、DTPA、ADA、MGCA等。另外，本公开中的一些实施方案包含膦酸盐/膦酸螯合剂。
一些实施方案中，药物制剂中还可含有超过一种对所治疗的特定适应证必需的蛋白质，优选那些具有互补活性的、对其它蛋白质没有不利影响的。例如，在抗体是抗VEGF抗体的情况中，可将它与另一药剂(例如化疗剂和抗肿瘤剂)组合。
一些实施方案中，药物制剂是用于体内施用，该药物制剂是无菌的，所述无菌可以通过在制备药物制剂之前或之后经由无菌过滤膜过滤来实现。
第二方面，本公开提供如上所述药物制剂的制备方法。
在一些实施方案中，制备蛋白质(例如抗体或其抗原结合片段)之后，制备包含它的药物制剂，包括将表面活性剂添加到药物制剂中。
在一些实施方案中，制剂是含水制剂。
一些实施方案提供冻干制剂，由上述的药物制剂经冻干后得到。
另一些实施方案提供冻干制剂，其经复溶后可得到如前所述的药物制剂。一些具体方案中，所述复溶使用注射用水或生理性水性介质。
在一些实施方案中，抗体为全长抗体。另一些实施方案中，抗原结合片段为Fab，F(ab′)2，Fab’，Fv，包含抗体的一个或多个CDR的区域，双、多特异性抗体。
在一些实施方案中，表面活性剂为非离子表面活性剂，例如以商标Brij销售的化合物，包括：聚氧乙烯(4)月桂醇醚(Brij-30)，聚氧乙烯月桂醚(Brij-35)，聚乙二醇十六烷基醚(Brij-58)，聚氧乙烯(20)硬脂醇醚(Brij-78)和聚氧乙烯(20)油醇醚(Brij-92))。在一些具体实施方案中，表面活性剂为聚乙二醇十六烷基醚。
在一些实施方案中，所添加的表面活性剂的量使得它降低所配制的抗体的聚集和/或使制剂中的颗粒形成降至最低和/或降低吸附，例如，制剂中存在的表面活性剂的量可以为约0.005mg/mL至约0.5mg/mL，约0.0075mg/mL至约0.3mg/mL，约0.01mg/mL至约0.2mg/mL，约0.01mg/mL至约0.1mg/mL。在一些具体实施方案中，表面活性剂为聚乙二醇十六烷基醚，其在药物制剂中的含量为约0.0125mg/mL至约0.75mg/mL。
本公开中的抗体或其抗原结合片段的制备、纯化方法是在现有技术中熟知和能找到的，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。如，老鼠可以用例如人的抗原或其片段免疫，所得到的抗体能被复性，纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。本公开所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人FR区。人FR种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，(2001)ISBN：012441351上获得。具体的，本公开所述的抗体或抗原结合片段所用的轻链FR种系包括Vk3-11和Vk4-1。本公开所述的抗体或抗原结合片段所用的具体的重链FR种系包括VH3-48和VH1-2。全文引入CN200980136837.6、CN201080064451.1中的抗体制备方法。
第三和第四方面，本公开提供一种降低蛋白质(例如抗体或其抗原结合片段)聚集的方法，以及提供一种提高药物制剂中蛋白质(例如抗体或其抗原结合片段)稳定性的方法，包括在如上所述的药物制剂中添加表面活性剂。
在一些实施方案中，表面活性剂为非离子表面活性剂，例如以商标Brij销售的化合物，包括：聚氧乙烯(4)月桂醇醚(Brij-30)，聚氧乙烯月桂醚(Brij-35)，聚乙二醇十六烷基醚(Brij-58)，聚氧乙烯(20)硬脂醇醚(Brij-78)和聚氧乙烯(20)油醇醚(Brij-92))。在一些具体实施方案中，所述非离子表面活性剂为聚乙二醇十六烷基醚。
在一些实施方案中，所添加的表面活性剂的量使得它降低所配制的抗体的聚集和/或使制剂中的颗粒形成降至最低和/或降低吸附，例如，制剂中存在的表面活性剂的量可以为约0.005mg/mL至约0.5mg/mL，约0.0075mg/mL至约0.3mg/mL，约0.01mg/mL至约0.2mg/mL，约0.01mg/mL至约0.1mg/mL。在一些具体实施方案中，表面活性剂为聚乙二醇十六烷基醚，其在药物制剂中的含量为约0.0125mg/mL至约0.75mg/mL。
第五方面，本公开提供一种在受试者中治疗疾病或病症的方法，包括向受试者施用上述述药物制剂。
一些实施方案中，所述的疾病或病症为细胞增殖性疾病，例如癌症。
一些具体实施方案中，所述的癌症选自：黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、食管癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴癌、胆囊癌和胶质母细胞瘤。
一些实施方案中，将药物制剂施用于需要用抗体治疗的哺乳动物(例如人)，推注(bolus)或通过一段时间里的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径。在一些实施方案中，通过静脉内施用将药物制剂施用于哺乳动物。在一些实施方案中，使用注射器或经IV线注射药物制剂。在一些实施方案中，通过皮下施用将药物制剂施用于哺乳动物。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段为适宜剂量(“治疗有效量”)，其取决于例如要治疗的状况、状况的严重性和过程、施用抗体是为了预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对抗体的响应、所使用的抗体的类型、和主治内科医师的判断。将抗体以一次或在一系列治疗中合适地施用于患者，而且可在诊断后的任何时间施用于患者。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可作为唯一治疗或与在治疗所讨论的状况中有用的其它药物或疗法联合施用抗体。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段治疗有效量会在约0.1至约50mg/kg患者体重的范围中，通过一次或多次施用，所使用的抗体的典型范围为约0.3至约20mg/kg，约0.3至约15mg/kg，约1mg/kg，约2mg/kg，约3mg/kg，约4mg/kg，约5mg/kg，例如每日施用。然而，其它剂量方案也是有用的。在一些实施方案中，拮抗剂是抗VEGF抗体、抗PD-L1抗体或抗PD-L1抗体与TGFβ的融合蛋白，以每1、2、3、或4周约100或400mg的剂量施用，或以每1、2、3或4周约1、3、5、7.5、10、15或20mg/kg的剂量施用。剂量可以作为单剂或作为多剂(例如2或3剂)施用。
第六方面，本公开提供前述药物制剂在制备预防或治疗疾病或病症的药物中的用途。
一些实施方案中，所述的疾病或病症为细胞增殖性疾病，例如癌症。
一些具体实施方案中，所述的癌症选自：黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、食管癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴癌、胆囊癌和胶质母细胞瘤。
本公开全文引入CN201680027181.4和CN201880004344.6中的抗体及其抗原结合片段、融合蛋白作为本公开药品制剂中的蛋白质。
附图说明
图1：振摇前后SEC检测的贝伐单抗制剂中单体百分比的变化。
图2：强制降解(振摇及高温)前后贝伐单抗制剂中表面活性剂含量的变化。
图3：加入不同表面活性剂对贝伐单抗活性的影响。
图4A-4C：分别是L4T、Brij-58、C12E9的溶血实验结果。
术语
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本公开中的它处另有明确定义，否则本公开使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
“缓冲液”指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受pH变化的缓冲液。将pH控制在适当范围中的缓冲液的例子包括醋酸盐、琥珀酸盐盐、葡萄糖酸盐、组氨酸、草酸盐、乳酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、甘氨酰甘氨酸和其它有机酸缓冲液。
“组氨酸缓冲液”是包含组氨酸离子的缓冲液。组氨酸缓冲液的示例包括组氨酸-盐酸，组氨酸-醋酸，组氨酸-磷酸盐，组氨酸-硫酸盐等缓冲液，优选组氨酸-盐酸缓冲液。组氨酸-醋酸缓冲液是组氨酸与醋酸或组氨酸与组氨酸-醋酸盐配制而成。
“柠檬酸盐缓冲液”是包括柠檬酸根离子的缓冲液。柠檬酸盐缓冲液的示例包括柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-柠檬酸钾、柠檬酸-柠檬酸钙、柠檬酸-柠檬酸镁等。优选的柠檬酸盐缓冲液是柠檬酸-柠檬酸钠。
“琥珀酸盐盐缓冲液”是包括琥珀酸盐离子的缓冲液。琥珀酸盐盐缓冲液的示例包括琥珀酸盐-琥珀酸盐、琥珀酸盐-琥珀酸盐钾、琥珀酸盐-琥珀酸盐钙盐等。优选的琥珀酸盐盐缓冲液是琥珀酸盐-琥珀酸盐。
“醋酸盐缓冲液”是包括醋酸根离子的缓冲液。醋酸盐缓冲液的示例包括醋酸-醋酸钠、醋酸组氨酸盐、醋酸-醋酸钾、醋酸醋酸钙、醋酸-醋酸镁等。优选的醋酸盐缓冲液是醋酸-醋酸钠。
“多元醇”为具有多个羟基的物质，而且包括糖(还原和非还原糖)、糖醇和糖酸。多元醇可任选地包括在配制剂中。在一些方案中，本公开的多元醇具有小于约600kD的分子量(例如在约120至约400kD的范围中)。“还原糖”为含有能还原金属离子或与蛋白质中的赖氨酸和其它氨基共价反应的半缩醛基团的糖，而“非含有糖”为不具有还原糖的这些特性的糖。还原糖的例子有果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖。非还原糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖和棉子糖。甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏糖醇、山梨醇和甘油是糖醇的例子。至于糖酸，这些包括L-葡萄糖酸及其金属盐。在期望配制剂为冻融稳定的情况中，多元醇优选为在冷冻温度(例如-20℃)不结晶的多元醇，使得它使配制剂中的抗体失稳。在一些实施方案中，非还原糖诸如蔗糖和海藻糖是多元醇的例子。
“聚乙二醇十六烷基醚(Polyethylene glycol hexadecylether)”又称Brij C20，Brij-58，Anapoe-58，聚乙烯(20)十六烷基醚(Polyethylene(20)cetyl ether)，聚乙二醇(20)单十六烷基醚(Polyethylene Glycol(20)Monohexadecyl Ether)。聚乙二醇十六烷基醚是乙氧基化(20)天然脂肪醇，基于鲸蜡醇。
“吐温(Tween)”又称聚山梨酯，Polysorbate。吐温是一种非离子表面活性剂。有吐温20(Tween 20)、吐温21(Tween 21)、吐温40(Tween 40)、吐温60(Tween 60)、吐温61(Tween 61)、吐温80(Tween 80)、吐温81(Tween 81)、吐温85(Tween 85)。
“药物制剂”表示含有一种或多种本公开所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是保持抗体活性成分的稳定性，促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。本公开中，“药物制剂”和“药物组合物”、“制剂”并不互相排斥。
本公开中所述药物组合物的溶液形式，若无特殊说明，其中的溶剂均为水。
“冻干制剂”表示液体或溶液形式的药物组合物或液体或溶液制剂经真空冷冻干燥步骤之后获得的制剂或药物组合物。
本公开所用术语“约”、“约”或“基本上包含”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，在本领域每一次实行中“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”、“约”或“基本上包含”可意味着至多20％的范围。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”、“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。
本公开所述的药物组合物能够达到一种稳定的效果：其中的蛋白或抗体在贮藏后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的药物组合物，优选地，药物组合物在贮藏后基本上保留其物理和化学稳定性以及其生物学活性。贮藏期一般基于药物组合物的预定保存期来选择。目前有多种测量蛋白质稳定性的分析技术，可测量在选定温度贮藏选定时间段后的稳定性。
稳定的药物抗体制剂是在下述情况下没有观察到显著变化的制剂：在冷藏温度(2-8℃)保存至少3个月、优选6个月、更优选1年，且甚至更优选地最多达2年。另外，稳定的液体制剂包括这样的液体制剂：其在包括25℃和40℃在内的温度保存包括1个月、3个月、6个月在内的时段后表现出期望的特征。稳定性的典型的可接受的标准如下：通过视觉分析，药物抗体制剂是无色的，或澄清至稍微乳白色。所述制剂的浓度、pH和重量克分子渗透压浓度具有不超过±10％变化。通常观察到不超过约10％、优选不超过约5％的截短。通常形成不超过约10％、优选不超过约5％的聚集。
如果在目检颜色和/或澄清度后，或者通过UV光散射、尺寸排阻色谱法(SEC)和动态光散射(DLS)测得，蛋白或抗体没有显示出显著的聚集增加、沉淀和/或变性，那么所述蛋白或抗体在药物制剂中“保留它的物理稳定性”。蛋白构象的变化可以通过荧光光谱法(其确定蛋白三级结构)和通过FTIR光谱法(其确定蛋白二级结构)来评价。
如果蛋白或抗体没有显示出显著的化学改变，那么所述蛋白或抗体在药物制剂中“保留它的化学稳定性”。通过检测和定量化学上改变的形式的蛋白，可以评估化学稳定性。经常改变蛋白化学结构的降解过程包括水解或截短(通过例如尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE等方法来评价)、氧化(通过例如与质谱法或MALDI/TOF/MS结合的肽谱法等方法来评价)、脱酰胺作用(通过例如离子交换色谱法、毛细管等电聚焦、肽谱法、异天冬氨酸测量等方法来评价)和异构化(通过测量异天冬氨酸含量、肽谱法等来评价)。
如果蛋白或抗体在给定时间的生物活性是在制备药物制剂时表现出的生物活性的预定范围内，那么所述蛋白或抗体在药物制剂中“保留它的生物活性”。抗体的生物活性可以例如通过抗原结合测定来确定。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.Biol.Chem,243,p3558(1968)中所述。
本公开所述的术语“抗体”包括具有适合并识别表位的特定形状的任何包含多肽链的分子结构，其中一种或多种非共价结合相互作用使分子结构和表位之间的复合物稳定化。原型抗体分子为免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链，δ链，γ链，α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。抗体还包括双、多特异性抗体。
在本公开中，所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
在本公开中，所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL或LCVR)和重链可变区(VH或HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创建或分离的人抗体，所涉及的技术和方法在本领域中是熟知的，例如(1)从人免疫球蛋白基因的转基因、转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；(2)从经转化以表达抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体；(3)从重组组合人抗体文库中分离的抗体；以及(4)通过将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法制备、表达、创建或分离的抗体。此类重组人抗体包含可变区和恒定区，这些区域利用特定的由种系基因编码的人种系免疫球蛋白序列，但也包括随后例如在抗体成熟过程中发生的重排和突变。
术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的单克隆抗体。制备时用抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本公开一个优选的实施方案中，所述的鼠源抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的免疫应答反应。为避免在免疫原性下降的同时引起活性的下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变(回复突变，即将人抗体来源的FR区氨基酸残基突变成原始来源抗体对应位置的氨基酸残基)，以保持活性。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。人抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG1。
本公开中所述的“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，以及与抗原结合的Fv片段(sFv片段)；包含本公开所述抗体中的一个或多个CDR区的蛋白，例如融合蛋白。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chain antibody)或单链Fv(sFv)。抗体及其抗原结合片段的例子包括嵌合抗体、人抗体以及其他非人类哺乳动物抗体、人源化抗体、单链抗体(例如scFv)、骆驼抗体、纳米抗体、IgNAR(源自鲨鱼的单链抗体)、小模块免疫药物(SMIP)。
“同源性”或“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100％的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。本文所述“至少85％序列同一性”是指变体与亲本序列相比，两序列具有至少85％同源，在一些方案中，其具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同源；在一些具体的方案中，其具有90％、95％或99％以上；在另一些具体的方案中，其具有至少95％序列同源。所述具有至少85％序列同一性的氨基酸序列包括通过对亲本序列进行一个或者多个氨基酸缺失、插入或替换突变获得。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本公开的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床不可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个患者都有的目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
本公开要治疗的病症的非限制性例子包括增殖性病症，如恶性和良性肿瘤，非白血病和淋巴样恶性肿瘤，肿瘤(癌症)转移。
“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症是肿瘤。
本公开的“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本公开中并不互相排斥。
“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端黑素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulky disease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(例如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖、脑瘤和脑癌、以及头颈癌、及相关转移。在某些实施方案中，适合于通过本公开的抗体来治疗的癌症包括乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、成胶质细胞瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西(Kaposi)氏肉瘤、类癌癌(carcinoid carcinoma)、头颈癌、卵巢癌、间皮瘤、和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症选自：小细胞肺癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌(CRC)、和肝细胞癌。还有，在一些实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌，包括那些癌症的转移性形式。
“有效量”包含足以改善或预防医字病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。
“药物组合物”表示含有一种或多种本公开所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述本公开，但这些实施例并非限制着本公开的范围。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1：候选表面活性剂的选择
本实施例选择了8种尚未应用于药用制剂中，且临界胶束浓度(CMC，ClinicalMicelle Concentration)与吐温(Tween)相当的，溶解度较好的非离子型表面活性剂作为筛选的目标。所述用作筛选的候选表面活性剂均购自美国Anatrace公司，例如Tween 20是Avantor公司生产。其具体名称及结构信息列于表1。CMC是衡量表面活性剂表面活性强度的重要参数，CMC越低，表面活性剂发挥作用的浓度越低。
表1.候选表面活性剂的名称及结构
Figure BDA0002696921060000211
Figure BDA0002696921060000221
实施例2.在与Tween 20相同质量浓度的条件下对候选表面活性剂进行筛选
为了优选出可以稳定蛋白结构的表面活性剂，在含有25mg/mL贝伐单抗(bevacizumab)、50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(PB)、60mg/mLα,α-二水合海藻糖(Trehalose)、pH6.2的溶液中，分别加入以下表面活性剂(浓度均为0.2mg/mL的浓度)，考察其对蛋白外观及纯度相的影响：
1)Tween 20；
2)Tween 80；
3)CYMAL-7；
4)DDM；
5)TDM；
6)十二烷基-4-海藻糖苷；
7)Brij-58；
8)CYMAL-6；
9)MNA-C13；
10)C12E9。
将制剂以1.34mL/支，置于2mL肖特西林瓶中，用覆膜氯化丁基橡胶塞封口后，进行25℃/300rpm 19天的振摇，监测振摇前后制剂外观和纯度相的变化。结果参见表2。其中，空白对照是仅缺失表面活性剂，辅料、蛋白质均相同的制剂。
结果显示，振摇19天后(D19)，DDM、TDM、十二烷基-4-海藻糖苷、Brij-58、CYMAL-6和C12E9依然能够保持外观的澄清透明，CYMAL-7外观表现为大量细小颗粒，MNA-C13外观浑浊。
用分子排阻色谱来检测振摇前后的抗体单体含量的改变，从图1可以看出，抗体单体百分比的变化与外观变差呈现相关性，Tween 20、Tween 80的单体百分比都有一定量的降低。CYMAL-7的单体百分比变化不大，经微流成像颗粒分析系统(Micro Flow Image，MFI)检测验证其颗粒主要为硅油颗粒，推测该表面活性剂更容易将包材(如胶塞)中的硅油溶出，从而对外观产生影响。MNA-C13由于外观太差无法用分子排阻色谱检测振摇后抗体的单体含量。DDM、TDM、十二烷基-4-海藻糖苷、Brij-58、CYMAL-6和C12E9纯度相与放样0时(D0)无明显变化，因此，认为是有潜力替代Tween的表面活性剂。
表2.振摇前后贝伐单抗制剂外观、纯度相变化统计表
Figure BDA0002696921060000231
实施例3.等摩尔浓度下强制降解前后蛋白纯度相的变化
为了排除优选表面活性剂由于本身分子量的差异造成的分子数量的差异，在含有25mg/mL贝伐单抗，50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，60mg/mLα,α-二水合海藻糖、pH6.2的溶液中，分别加入以下表面活性剂，在0.075mg/mL的浓度下考察其对蛋白外观及纯度相的影响：
1)Tween 20；
2)DDM；
3)TDM；
4)十二烷基-4-海藻糖苷；
5)Brij-58；
6)CYMAL-6；
7)C12E9。
将制剂以1.34mL/支，置于2mL肖特西林瓶中，用覆膜氯化丁基橡胶塞封口后，进行25℃/300rpm/19天的振摇。同时以1mL/支，置于2mL肖特西林瓶中，用覆膜氯化丁基橡胶塞封口后，进行40℃/1月(M1)的稳定性检测。结果参见表3。
结果显示，与0.2mg/mL浓度相比，含有0.075mg/mL DDM、正十三烷基-β-D-麦芽糖苷的制剂处方在振摇19天后出现了细小颗粒，含有0.075mg/mL CYMAL-6的制剂处方40℃放样1个月也出现了细小颗粒，表明这三种表面活性剂在与吐温相同摩尔浓度的情况下其对蛋白制剂的保护作用并无明显优势。十二烷基-4-海藻糖苷、Brij-58和C12E9三种表面活性在0.075mg/mL的条件下依然可以维持贝伐单抗的制剂外观的澄明和纯度相的稳定，显示出其优于Tween的特性。
表3.振摇前后贝伐单抗制剂外观、纯度相变化统计表
Figure BDA0002696921060000241
Figure BDA0002696921060000251
实施例4.表面活性剂起效浓度的筛选
为了进一步了解优选表面活性剂的最低起效浓度，在含不同浓度及种类的表面活性剂的缓冲液中，制备含50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、60mg/mLα,α-二水合海藻糖，pH6.2，25mg/mL贝伐单抗的抗体制剂。表面活性剂种类与范围如下：
1)表面活性剂种类：十二烷基-4-海藻糖苷或Brij-58；
2)表面活性剂浓度：0.001～0.075mg/mL。
将制剂以1.34mL/支，置于2mL肖特西林瓶中，用覆膜氯化丁基橡胶塞封口后，进行25℃/300rpm/19天的振摇，对振摇前后制剂外观和纯度相进行检测。结果参见表4。
结果显示，含有Brij-58的制剂处方中，当Brij-58的含量不低于0.0125mg/mL抗体制剂在振摇7天后能够维持外观的澄明，当含量降到0.005mg/mL时，振摇7天后样品外观出现烟雾状颗粒，伴随单体含量的下降；在含有十二烷基-4-海藻糖苷的制剂处方中，当十二烷基-4-海藻糖苷的含量不低于0.025mg/mL抗体制剂在振摇7天后能够维持外观的澄明，当含量降到0.015mg/mL时，振摇7天后样品外观出现絮状沉淀。经试验验证，Brij-58维持贝伐单抗稳定的最低使用剂量为0.0125mg/mL，十二烷基-4-海藻糖苷维持贝伐单抗稳定的最低使用剂量为0.025mg/mL。
表4.不同浓度的表面活性剂对蛋白外观及纯度相影响统计表
Figure BDA0002696921060000252
Figure BDA0002696921060000261
实施例5.表面活性剂的稳定性检测
为了了解优选表面活性剂自身的稳定性，在含不同种类的表面活性剂的缓冲液中，制备含50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，60mg/mLα,α-二水合海藻糖，pH6.2，25mg/mL贝伐单抗的抗体制剂。表面活性剂种类与范围如下：
1)表面活性剂种类：十二烷基-4-海藻糖苷，Brij-58，C12E9，Tween 20，Tween80；
2)表面活性剂浓度：0.2mg/mL。
将制剂以1.34mL/支，置于2mL肖特西林瓶中，用覆膜氯化丁基橡胶塞封口后，进行25℃/300rpm/19天的振摇。同时，将制剂以1mL/支，置于2mL肖特西林瓶中，用覆膜氯化丁基橡胶塞封口后，进行40℃/30天的放样。用UPLC偶联电喷雾检测器(Charged AerosolDetector，CAD)的方法检测振摇及高温放样前后制剂样品中表面活性剂的含量。
UPLC-CAD检测方法如下：
仪器：Waters Acquity H Class Bio ultra performance liquidchromatograph with an CoronaTMVeoTMCharged Aerosol Detector(CAD)
色谱柱：Waters Oasis MAX column(20mm×2.1mm,30μm particle size)
柱温：30℃
流动相：A：2％fomic acid in H2O(18.2MΩ)
B：2％fomic acid in IPA
色谱条件：0-1min；10％-20％B
1.0-3.4min；20％B
3.4-3.5min；20％-100％B
3.5-4.5min；100％B
4.5-4.6min；100％-10％B
4.6-6.6min；10％B
进样量：10μL
流速：1mL/min
检测条件：蒸发温度(evaporation temperature)35℃
样品无需处理，直接上样。
表面活性剂含量计算：
Figure BDA0002696921060000271
不同表面活性剂强制降解前后含量变化如图2所示。结果显示，相比于高温，振摇对表面活性剂的稳定性影响更大。Tween 20和Tween 80对高温和振摇两个条件都比较敏感，最不稳定。十二烷基-4-海藻糖苷、Brij-58、C12E9在强制降解前后含量无明显变化，表明其结构在实验条件下较稳定。该结果提示，十二烷基-4-海藻糖苷、Brij-58、C12E9能够更好地保持蛋白结构的稳定是由于其自身良好的稳定性。
实施例6.表面活性剂对抗体活性的影响
为了验证优选表面活性剂的添加不会影响制剂中蛋白成分贝伐单抗的活性，在含不同种类的表面活性剂的缓冲液中，制备含50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、60mg/mLα,α-二水合海藻糖、pH6.2、25mg/mL
Figure BDA0002696921060000272
抗体的抗体制剂。表面活性剂种类与范围如下：
1)表面活性剂种类：十二烷基-4-海藻糖苷，Brij-58，C12E9，Tween 20，Tween80；
2)表面活性剂浓度：0.2mg/mL。
在细胞水平上，采用报告基因的方法对各制剂中抗体活性进行评价。实验中首先将80μL浓度为5×105个/mL的稳定转染KDR-NFAT-Luciferase基因的293细胞接种于细胞板上，其次将各抗体制剂、贝伐单抗标准品(阳性对照)和空白细胞培养液(阴性对照)以1:3的比例梯度稀释至100、33、10.9、3.59、1.19、0.39、0.13、0.04、0.01μg/mL，各取10μL加入细胞板中，最后向各孔中加入10μL 1μg/mL的VEGF后置于培养箱中孵育，5小时后，在加入40μLBio-Glow试剂，酶标仪读板检测luciferase荧光。通过计算拟合出各个蛋白试剂的EC50值，通过样品EC50和标准品EC50的比值来反映样品的活性大小。各制剂中贝伐单抗的活性如图3所示。
结果显示，含不同表面活性剂的抗体制剂中贝伐单抗的活性均值在91.47％左右，落在实验误差内，由此可以推断表面活性剂的加入不影响贝伐单抗的生物学活性。
实施例7.表面活性剂的安全性检测
1)表面活性剂溶血浓度的测定
取健康家兔血液5mL，放入含转子的西林瓶中搅拌3分钟以除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入50mL0.9％氯化钠溶液，摇匀，每分钟1500转离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9％氯化钠溶液按上述方法洗涤3～4次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9％氯化钠溶液制成2％的混悬液(1.5mL红细胞加到75mL生理盐水)，供试验用。
将2％红细胞悬液与相应浓度的表面活性剂、0.9％氯化钠溶液(NC)或蒸馏水(PC)，混匀后，立即置37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育，3小时后对溶血情况进行观察拍照，取上清离心后检测样品在545nm下的吸光值A545nm，计算溶血率。
溶血率计算公式：溶血率(％)＝(As-Anc)/(Apc-Anc)
其中As为加入样品溶液在545nm下的吸光值；Anc为加入0.9％氯化钠溶液在545nm下的吸光值；Apc为加入蒸馏水的溶液在545nm下的吸光值。
以溶血率大于>5％作为溶血的判断标准。
结果如图4A-4C所示。
结果显示，十二烷基-4-海藻糖苷溶血浓度为0.2mg/mL，Brij-58溶血浓度为0.04mg/mL，C12E9溶血浓度为0.1mg/mL，从溶血的安全性考虑L4T>C12E9>Brij-58。通过与其在制剂中的应用浓度相比，这三种表面活性剂作为辅料时，以静脉注射给药时发生溶血的概率较小。
2)表面活性剂急性毒性实验
按剂量组购买试验用小鼠(ICR小鼠，上海杰思捷实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2018-0004)，体重20-22g，随机分组，每组小鼠各10只，雌雄各半。各组按小鼠10mL/kg尾静脉注射不同剂量的Brij-58或十二烷基-4-海藻糖苷，并观察记录各组别小鼠的中毒、死亡及恢复情况，观察一周，通过比较不同组别小鼠出现死亡的数量来计算LD50。在预实验中，C12E9在较低的浓度剂量(10mg/mL)下受试动物全部猝死，表明其毒性较大，在预实验阶段将其剔除，不作为候选表面活性剂考察其LD50。Brij-58和十二烷基-4-海藻糖苷的结果如表5所示。
表5.表面活性剂的小鼠急性毒性实验
Figure BDA0002696921060000291
结果显示，Brij-58和十二烷基-4-海藻糖苷两种表面活性剂急性毒性的LD50分别为343.435mg/kg和97.428mg/kg，换算为浓度分别为34.3435mg/mL和9.7428mg/mL，远大于其在生物制剂中的起效浓度0.005mg/mL和0.025mg/mL。由此可以证明这两种表面活性剂在注射用制剂中是安全的。
基于以上，在本实施例的表面活性剂的安全性的评估中，细胞水平的实验验证了含有新型表面活性剂的制剂不会对其活性造成影响。在动物水平的实验中，其溶血浓度均高于工作浓度。在急毒实验中，十二烷基-4-海藻糖苷和Brij-58的半数致死量远远大于其最低起效浓度。因此，十二烷基-4-海藻糖苷及Brij-58作为注射级辅料是安全的。
实施例8.Brij-58在不同蛋白中应用的试验
为了探讨Brij-58应用的范围，在不同的抗体制剂中进行实验。在含不同浓度的Brij-58的缓冲液中，分别制备如下制剂：
1)含50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(PB)，60mg/mLα,α-二水合海藻糖(Trehalose)，pH6.2，25mg/mL贝伐单抗抗体制剂；
2)含10mM琥珀酸(SA)、60mg/mL蔗糖(sucrose)，50mg/mL抗PD-L1抗体(序列如后所示)的抗体制剂，用NaOH调节至pH5.2；
3)含10mM枸橼酸-枸橼酸钠(CA)，80mg/mL蔗糖，pH6.2，50mg/mL抗PD-L1抗体与TGFβ的融合蛋白(序列如后所示)的抗体制剂。
以上制剂中表面活性剂的浓度范围为：0.0125-0.075mg/mL。将制剂以1.34mL/支，置于2mL肖特西林瓶中，用覆膜氯化丁基橡胶塞封口后，进行25℃/300rpm/7天的振摇。振摇结束后以蛋白制剂的外观和抗体单体含量对Brij-58对抗体稳定性进行评价。结果参见表6。
结果显示，在三种抗体制剂中，振摇前后制剂外观无变换，抗体单体含量无明显变化，表明Brij-58在实验浓度下可以保护抗体振摇条件下的稳定性。
表6.
Figure BDA0002696921060000301
抗PD-L1抗体的序列信息如下。
CDR序列：
Figure BDA0002696921060000302
抗PD-L1抗体的重链可变区：
Figure BDA0002696921060000311
抗PD-L1抗体的轻链可变区：
Figure BDA0002696921060000312
抗PD-L1抗体的重链：
Figure BDA0002696921060000313
抗PD-L1抗体的轻链：
Figure BDA0002696921060000314
抗PD-L1抗体与TGFβ的融合蛋白的序列信息如下。
融合蛋白重链：
Figure BDA0002696921060000315
(其中，单下划线为抗PD-L1抗体的重链可变区，双下划线为连接子)
SEQ ID NO：11
融合蛋白轻链：氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
序列表
<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司
上海恒瑞医药有限公司
<120> 新型蛋白制剂
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(5)
<223> 抗PD-L1抗体HCDR1
<400> 1
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(17)
<223> 抗PD-L1抗体HCDR2
<400> 2
Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(10)
<223> 抗PD-L1抗体HCDR3
<400> 3
Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(15)
<223> 抗PD-L1抗体LCDR1
<400> 4
Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His Gly Thr His Leu Met His
1 5 10 15
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(7)
<223> 抗PD-L1抗体LCDR2
<400> 5
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(9)
<223> 抗PD-L1抗体LCDR3
<400> 6
Gln Gln Ser Phe Glu Asp Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(119)
<223> 抗PD-L1抗体的重链可变区
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(111)
<223> 抗PD-L1抗体的轻链可变区
<400> 8
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His
20 25 30
Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(446)
<223> 抗PD-L1抗体的重链
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 10
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(218)
<223> 抗PD-L1抗体的轻链
<400> 10
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His
20 25 30
Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 11
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(584)
<223> 抗PD-L1抗体与TGFβ融合蛋白的重链
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Ala Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gly Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
465 470 475 480
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
485 490 495
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
500 505 510
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
515 520 525
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
530 535 540
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
545 550 555 560
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
565 570 575
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
580

Claims (14)

1.一种药物制剂，其包含蛋白质和0.001mg/mL至1.0mg/mL的聚乙二醇十六烷基醚，聚乙二醇十六烷基醚含量选自0.005mg/mL至0.5mg/mL，或0.01mg/mL至0.1mg/mL，或0.0125mg/mL至0.075mg/mL，所述蛋白质是氧化敏感的和/或聚集敏感的。
2.如权利要求1所述的制剂，所述蛋白质选自多肽或其片段、抗体或其抗原结合片段，优选所述抗体选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体或骆驼抗体。
3.如权利要求1-2任一项所述的制剂，所述抗体靶向的抗原选自：血管内皮生长因子(VEGF)；ox-LDL；ox-ApoB100；肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体化激素；高血糖素；凝固因子，例如因子VIIIC、因子IX、组织因子、和(冯)维勒布兰德(von Willebrand)氏因子；抗凝固因子，例如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原活化剂，例如尿激酶或人尿型或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；林蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(活化时受到调节，正常情况由T-细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清清蛋白，例如人血清清蛋白；穆勒(Muellerian)抑制性物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白质，例如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；抑制素；活化素；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，例如骨衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5、或-6(NT-3、NT-4、NT-5、或NT-6)，或神经生长因子，例如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，例如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态生成蛋白(BMP)；干扰素，例如干扰素-α、-β、和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF、和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS被膜的一部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，例如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，例如HER2、HER3或HER4受体；免疫点蛋白，例如B7家族分子、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-1-PD-L1、PD-1-PD-L2、吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)、IL-10、T细胞免疫球蛋白及黏蛋白3(TIM3或HAVCR2)、半乳糖凝集素9-TIM3、磷脂醯丝胺酸-TIM3、淋巴球活化基因3蛋白、MHC II类-LAG3、41BB、41BBL、OX40-OX40L、GITR、GITRL-GITR、CD25、CD27、CD70-CD27、TNFRSF25、TNFRSF25-TL1A、CD40L、CD40、HVEM-LIGHT-LTA、HVEM、HVEM-BTLA、HVEM-CD160、HVEM-LIGHT、HVEM-BTLA-CD160、CD80、CD80-PD-L1、PDL2-CD80、CD244、CD48-CD244、CD244、ICOS、ICOS-ICOSL、B7 H3、B7 H4、VISTA、TMIGD2、HHLA2-TMIGD2、嗜乳脂蛋白(包括BTNL2)、Siglec家族、TIGIT及PVR家族成员、KIRs、ILTs及LIRs、NKG2D及NKG2A、MICA及MICB、CD244、CD28、CD86-CD28、CD86-CTLA、CD80-CD28、CD39、CD73腺苷-CD39-CD73、CXCR4-CXCL12、磷脂醯丝胺酸、TIM3、磷脂醯丝胺酸-TIM3、SIRPA-CD47、CD79、GARP、GITR、PSMA、神经纤毛蛋白(Neuropilin)、CD160、CD30及CD155；和任何以上多肽的片段。
4.如权利要求1所述的制剂，所述蛋白质选自：
1)贝伐单抗；
2)抗PD-L1抗体，
优选地，所述抗PD-L1抗体的重链CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-3所示，轻链CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4-6所示；
更优选地，所述抗PD-L1抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；
最优选地，所述抗PD-L1抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；
3)抗PD-L1抗体TGFβ融合蛋白，
优选地，所述融合蛋白中抗PD-L1抗体的重链CDR1-3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-3所示，轻链CDR1-3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4-6所示；
更优选地，所述融合蛋白中抗PD-L1抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；
最优选地，所述融合蛋白的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
5.如权利要求1-4任一项所述的制剂，所述蛋白质的浓度为约1mg/mL至约250mg/mL、约25mg/mL至约200mg/mL、约50mg/mL至约150mg/mL，约75mg/mL至约125mg/mL。
6.如权利要求1-5任一项所述的制剂，其还含有缓冲液，优选所述缓冲液选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、琥珀酸盐、枸橼酸-枸橼酸钠、组氨酸缓冲液、醋酸盐缓冲液。
7.如权利要求6所述的制剂，缓冲液浓度为约5mM至约80mM，约10mM至约70mM，约20mM至约50mM。
8.如权利要求1-7任一项所述的制剂，其还含有糖，优选所述糖选自海藻糖或蔗糖。
9.如权利要求11所述的制剂，所述糖的浓度为约30mg/mL至120mg/mL，约40mg/mL至110mg/mL，约50mg/mL至100mg/mL，约60mg/mL至80mg/mL。
10.一种药物制剂，其中含有20nM至100mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，20mg/mL至100mg/mL的α,α至二水合海藻糖，5mg/mL至100mg/mL的蛋白质，0.005mg/mL至0.5mg/mL聚乙二醇十六烷基醚，pH为5.5至6.8；
优选地，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的含量为40nM至60mM，α,α至二水合海藻糖的含量为50至70mg/mL，聚乙二醇十六烷基醚含量为0.01mg/mL至0.1mg/mL，蛋白质含量为15mg/mL至35mg/mL，pH为6.0至pH6.4；
更优选地，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的含量为50mM，α,α至二水合海藻糖的含量为60mg/mL，聚乙二醇十六烷基醚含量为0.0125mg/mL至0.075mg/mL，蛋白质为含量为25mg/mL的贝伐单抗，pH为约6.2。
11.一种药物制剂，其中含有1nM至50mM琥珀酸盐，20mg/mL至100mg/mL的蔗糖，10mg/mL至100mg/mL的蛋白质，0.005mg/mL至0.5mg/mL聚乙二醇十六烷基醚，pH为4至6.5；
优选地，琥珀酸盐的含量为40nM至60mM，蔗糖的含量为50至70mg/mL，聚乙二醇十六烷基醚含量为0.01mg/mL至0.1mg/mL，蛋白质含量为40mg/mL至60mg/mL，pH为5.0至pH5.4；
更优选地，琥珀酸盐的含量为10mM，蔗糖的含量为60mg/mL，聚乙二醇十六烷基醚含量为0.0125mg/mL至0.075mg/mL，蛋白质为含量为50mg/mL的PD-L1抗体，pH为约5.2。
12.一种药物制剂，其中含有1nM至50mM枸橼酸-枸橼酸钠，40mg/mL至120mg/mL的蔗糖，10mg/mL至100mg/mL的蛋白质，0.005mg/mL至0.5mg/mL聚乙二醇十六烷基醚，pH为5.5至6.8；
优选地，枸橼酸-枸橼酸钠的含量为40nM至60mM，蔗糖的含量为70至90mg/mL，聚乙二醇十六烷基醚含量为0.01mg/mL至0.1mg/mL，蛋白质含量为40mg/mL至60mg/mL，pH为6.0至pH6.4；
更优选地，枸橼酸-枸橼酸钠的含量为10mM，蔗糖的含量为80mg/mL，聚乙二醇十六烷基醚含量为0.0125mg/mL至0.075mg/mL，蛋白质为含量为50mg/mL的抗PD-L1抗体与TGFβ的融合蛋白，pH为约6.2。
13.如权利要求1-12任一项所述的制剂，其适于胃肠外注射，优选为水性制剂。
14.一种冻干制剂，由权利要求13所述的制剂经冻干后得到；或经复溶后可得到如权利要求1-13任一项所述的制剂，优选所述复溶使用注射用水或生理性水性介质。
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