CN116254315A - 一种vegf/vegfr抑制剂生物学活性的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，提供了一种VEGF/VEGFR抑制剂生物学活性的检测方法，包括：构建效应细胞HEK293‑KDR‑NFAT‑Lus；样品与效应细胞HEK293‑KDR‑NFAT‑Lus作用；裂解效应细胞HEK293‑KDR‑NFAT‑Lus，加入荧光素酶底物显色，该方法通过效应细胞HEK293‑KDR‑NFAT‑Lus，不仅保证实验结果的稳定性和准确性，而且操作简便，缩短了检测时间，最快可在24小时内完成检测，灵敏度更高，大大降低边缘效应对检测结果的影响，提高了细胞板的使用效率，降低了检测成本，无需使用放射性同位素，适用于VEGF/VEGFR抑制剂的质量控制以及批次放行检测中使用。

Description

一种VEGF/VEGFR抑制剂生物学活性的检测方法
技术领域
本发明涉及生物医药检测技术领域，特别涉及一种VEGF/VEGFR抑制剂生物学活性的检测方法。
背景技术
随着发病率和死亡率的增加，癌症已经成为中国人群死亡的首要原因和主要的公共健康问题。血管生成是恶性肿瘤一大生物学特征，肿瘤可以通过血管生成来获取氧气和养分，与肿瘤生长、浸润及转移密切相关。肿瘤组织中尤其是晚期肿瘤组织中存在着较高的血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表达或血管内皮生长因子受体(Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)的异常活化，这被证实为不良预后，因此，以VEGF/VEGFR为靶点的药物在肿瘤治疗中发挥重要作用，目前已有数个VEGF/VEGFR抑制剂进入临床使用，其中，第一个被FDA批准的抗血管新生试剂是以VEGF为靶点的贝伐珠单抗(bevacizumab，商品名：Avastin)。因此，为了满足临床前研究或临床需求，用于VEGF/VEGFR抑制剂生物活性分析的方法在该类药物研发过程中至关重要。
目前常用的贝伐珠单抗的生物活性分析方法为人脐静脉内皮细胞(HumanUmbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)增值抑制法，例如专利号为201710632748.7公开的一种血管内皮生长因子生物学活性的检测方法及应用，这种方法所使用的细胞为人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)，HUVEC细胞是从新鲜的健康产妇新生儿脐带血采用胶原酶Ⅰ型消化分离得到的原代细胞，这类细胞生命周期有限，生长缓慢，一般传代至10代左右细胞生长就会停滞，细胞极其不稳定，不易于得到和保存，同时使用这种原代细胞进行生物学活性检测会有较大的批间差异，检测周期较长，从准备至得到实验结果共历经5天，实验耗时比较长，并且长时间的培养导致的96孔板中溶液挥发速度不一致的现象尤为明显，因此造成的边缘效应不易排除，所以开发更加准确、方便且专门用来检测VEGF/VEGFR抑制剂生物学活性的方法非常必要。
发明内容
为了解决现有的生物学活性检测方法存在的使用原代细胞极其不稳定，且检测不准确，批间差异大，检测周期长等问题，本发明公开了一种能够批量、稳定检测，检测周期大大缩短，且专门适用于VEGF/VEGFR抑制剂生物学活性的检测方法。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种VEGF/VEGFR抑制剂生物学活性的检测方法，所述检测方法包括：
S1、构建稳定传代的效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus，所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus为稳定表达KDR基因和荧光素酶报告基因的HEK293细胞；
S2、将VEGF/VEGFR抑制剂通过稀释液稀释后与所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus相互作用，所述稀释液中含有VEGF；
S3、裂解所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus，加入荧光素酶底物，测定所述VEGF/VEGFR抑制剂的报告基因信号值，根据信号值拟合四参数曲线计算IC50值，即检测所述VEGF/VEGFR抑制剂的生物学活性。
本发明作用原理是通过VEGF刺激效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Luc，并与细胞表面KDR基因结合后，细胞内的Ca2+浓度增加，导致NFAT脱磷酸，激活荧光素酶表达，使荧光值升高，当VEGF/VEGFR抑制剂与VEGF结合或与效应细胞上的KDR结合，阻断效应细胞被激活，从而抑制荧光素酶的表达，荧光信号值强度降低，VEGF/VEGFR抑制剂活性越高，荧光信号值强度降低的越多，VEGF/VEGFR抑制剂活性越低，荧光信号值强度降低的越少，为此，以荧光信号值降低的程度可以反应VEGF/VEGFR抑制剂的生物学活性。
进一步的，步骤S1中构建稳定传代的效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus，包括以下方法：
S11、构建质粒pDH-EF1-MB-KDR-FL和质粒pGL4.15-NFAT-RE-6x；
S12、将所述质粒pDH-EF1-MB-KDR-FL和所述质粒pGL4.15-NFAT-RE-6x转染至所述HEK293细胞中；
S13、通过添加潮霉素和嘌呤霉素杀死未稳定转染的细胞，筛选获得稳定传代的单克隆细胞株，即得到所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus。
进一步的，步骤S12中，转染前，所述HEK293细胞以1×106个/ml的接种密度进行接种并置于培养箱中培养过夜。
进一步的，所述质粒pDH-EF1-MB-KDR-FL的构建方法：
采用MluⅠ和Bstz17Ⅰ酶切位点将KDR-FL连接至pDH-EF1-MB载体上，即得到pDH-EF1-MB-KDR-FL，其中，所述KDR-FL的序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步的，所述质粒pGL4.15-NFAT-RE-6x的构建方法：
采用kpnⅠ和HindⅢ酶切位点将NFAT-RE-6x启动子插入至pGL4.15载体上，即得到所述质粒pGL4.15-NFAT-RE-6x，其中，所述NFAT-RE-6x启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步的，所述步骤S2中，具体方法如下：将所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus消化重悬后通过基础培养基进行稀释，并培养过夜，其中，所述基础培养基为含有10％FBS的DMEM培养基；
将所述VEGF/VEGFR抑制剂通过所述稀释液稀释后加入至所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus中共孵育5小时，并对共孵育后的细胞进行裂解，其中，所述稀释液包括10％的FBS、90％的DMEM和100ng/ml的VEGF。
进一步的，所述稀释液中的所述VEGF刺激所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus，并与所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus表面的所述KDR基因结合，同时激活所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus中所述荧光素酶报告基因的表达。
进一步的，所述VEGF刺激所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus的终浓度为100ng/ml。
进一步的，所述VEGF/VEGFR抑制剂为靶向VEGF的单克隆抗体或靶向VEGFR的单克隆抗体；
优选的，靶向VEGF的所述单克隆抗体为贝伐珠单抗；
优选的，靶向VEGFR的所述单克隆抗体为雷莫芦单抗。
优选的，靶向VEGFR的所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQNO.3，其轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ NO.4、SEQ NO.5或SEQ NO.6。
本发明的有益效果如下：本发明提供了专门适用于VEGF/VEGFR抑制剂生物学活性的检测方法，与现有的检测方法相比，该方法通过采用稳定传代的效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus作为实验细胞，不仅能够更有效的保证实验结果的稳定性和准确性，而且操作简便，缩短了检测时间，最快可在24小时内完成检测，灵敏度更高，大大降低边缘效应对检测结果的影响，因此提高了细胞板的使用效率，降低了检测成本，无需使用放射性同位素，适用于VEGF/VEGFR抑制剂的质量控制以及批次放行检测中使用。
附图说明
图1为本发明实施例2中pDH-EF1-MB载体图谱；
图2为本发明实施例2中pDH-EF1-MB-KDR-FL质粒图谱；
图3为本发明实施例2中pGL4.15-pac载体图谱；
图4为本发明实施例2中pGL4.15-NFAT-RE-6x质粒图谱；
图5为本发明实验例1中阳性表达克隆对VEGF的响应性测试图；
图6为本发明实验例1中阳性表达克隆对测试药物(雷莫芦单抗)的响应测试图；
图7为本发明实验例1中阳性表达克隆对测试药物(贝伐珠单抗)的响应测试图；
图8为本发明实验例2中细胞铺板浓度优化后响应测试图；
图9为本发明实验例2中孵育时间优化后响应测试图；
图10为本发明实验例3中专属性响应测试图；
图11为本发明实验例3中重复性响应测试图；
图12为本发明实验例3中准确度的曲线图；
图13为本发明实验例3中方法系统适用性的曲线图。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1方法的构建
本发明实施例1提供了一种VEGF/VEGFR抑制剂生物学活性的检测方法，检测方法包括：
S1、构建稳定传代的效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus，效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus为稳定表达KDR基因和荧光素酶报告基因的HEK293细胞；
S2、将VEGF/VEGFR抑制剂通过稀释液稀释后与效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus相互作用，稀释液中含有VEGF；
S3、裂解所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus，加入荧光素酶底物，测定所述VEGF/VEGFR抑制剂的报告基因信号值，根据信号值拟合四参数曲线计算IC50值，即检测所述VEGF/VEGFR抑制剂的生物学活性。
由于稀释液中含有VEGF，所以VEGF与VEGF/VEGFR抑制剂同时与效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus相互作用，形成竞争关系，VEGF能够激活效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus，并能够促进显色底物显色，而VEGF/VEGFR抑制剂能够阻止效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus激活，所以，通过显色情况，能够有效检测VEGF/VEGFR抑制剂的生物学活性。
实施例2
本发明实施例2在实施例1的基础上进一步限定了，步骤S1中构建稳定传代的效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus，包括以下方法：
S11、构建质粒pDH-EF1-MB-KDR-FL和质粒pGL4.15-NFAT-RE-6x；
S12、将表达KDR的质粒pDH-EF1-MB-KDR-FL和表达NFAT-LUC的质粒pGL4.15-NFAT-RE-6x转染至HEK293细胞中，继续培养24小时；用胰酶消化处理HEK293细胞，按1：10，1：100：1：1000不同比例稀释HEK293细胞接种至10cm的培养皿中，继续培养过夜；
S13、第二天加入125μg/mL的潮霉素Hygromycin(购买自invitrogen)和0.5μg/ml的嘌呤霉素Puromycin(购买自Gibco)杀死未稳定转染的细胞，筛选获得稳定传代的单克隆细胞株，通过筛选获得稳定传代的单克隆细胞株，即得到效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus。
步骤S12中，转染前一天，将胰酶处理的HEK293细胞以1×106个/mL的接种密度进行接种至6孔板中，并置于培养箱中培养过夜。
质粒pDH-EF1-MB-KDR-FL的构建方法：
使用PCR技术对KDR-FL进行扩增，得到扩增产物KDR-FL；
扩增引物为MluⅠ-KDRFL-F和Bstz17Ⅰ-KDRFL-R，MluⅠ-KDRFL-F的核苷酸序列为SEQID NO:7所示，Bstz17Ⅰ-KDRFL-R的核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示。
SEQ ID NO:7：GACCACGCGTGCCACCATGCAGAGCAAGGTGCTGC；
SEQ ID NO:8：CCGGTATACTTAAACAGGAGGAGAGCTCAGTGT；
PCR技术反应条件：96℃变性5分钟，96℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，22个循环，72℃延伸5分钟。
采用MluⅠ和Bstz17Ⅰ酶切位点将扩增后的KDR-FL连接至pDH-EF1-MB载体上(载体图谱如图1所示)，即得到pDH-EF1-MB-KDR-FL，其中，KDR-FL的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
SEQ ID NO:1(KDR-FL的核苷酸序列)：
atgcagagcaaggtgctgctggccgtcgccctgtggctctgcgtggagacccgggccgcctctgtgggtttgcctagtgtttctcttgatctgcccaggctcagcatacaaaaagacatacttacaattaaggctaatacaactcttcaaattacttgcaggggacagagggacttggactggctttggcccaataatcagagtggcagtgagcaaagggtggaggtgactgagtgcagcgatggcctcttctgtaagacactcacaattccaaaagtgatcggaaatgacactggagcctacaagtgcttctaccgggaaactgacttggcctcggtcatttatgtctatgttcaagattacagatctccatttattgcttctgttagtgaccaacatggagtcgtgtacattactgagaacaaaaacaaaactgtggtgattccatgtctcgggtccatttcaaatctcaacgtgtcactttgtgcaagatacccagaaaagagatttgttcctgatggtaacagaatttcctgggacagcaagaagggctttactattcccagctacatgatcagctatgctggcatggtcttctgtgaagcaaaaattaatgatgaaagttaccagtctattatgtacatagttgtcgttgtagggtataggatttatgatgtggttctgagtccgtctcatggaattgaactatctgttggagaaaagcttgtcttaaattgtacagcaagaactgaactaaatgtggggattgacttcaactgggaatacccttcttcgaagcatcagcataagaaacttgtaaaccgagacctaaaaacccagtctgggagtgagatgaagaaatttttgagcaccttaactatagatggtgtaacccggagtgaccaaggattgtacacctgtgcagcatccagtgggctgatgaccaagaagaacagcacatttgtcagggtccatgaaaaaccttttgttgcttttggaagtggcatggaatctctggtggaagccacggtgggggagcgtgtcagaatccctgcgaagtaccttggttacccacccccagaaataaaatggtataaaaatggaataccccttgagtccaatcacacaattaaagcggggcatgtactgacgattatggaagtgagtgaaagagacacaggaaattacactgtcatccttaccaatcccatttcaaaggagaagcagagccatgtggtctctctggttgtgtatgtcccaccccagattggtgagaaatctctaatctctcctgtggattcctaccagtacggcaccactcaaacgctgacatgtacggtctatgccattcctcccccgcatcacatccactggtattggcagttggaggaagagtgcgccaacgagcccagccaagctgtctcagtgacaaacccatacccttgtgaagaatggagaagtgtggaggacttccagggaggaaataaaattgaagttaataaaaatcaatttgctctaattgaaggaaaaaacaaaactgtaagtacccttgttatccaagcggcaaatgtgtcagctttgtacaaatgtgaagcggtcaacaaagtcgggagaggagagagggtgatctccttccacgtgaccaggggtcctgaaattactttgcaacctgacatgcagcccactgagcaggagagcgtgtctttgtggtgcactgcagacagatctacgtttgagaacctcacatggtacaagcttggcccacagcctctgccaatccatgtgggagagttgcccacacctgtttgcaagaacttggatactctttggaaattgaatgccaccatgttctctaatagcacaaatgacattttgatcatggagcttaagaatgcatccttgcaggaccaaggagactatgtctgccttgctcaagacaggaagaccaagaaaagacattgcgtggtcaggcagctcacagtcctagagcgtgtggcacccacgatcacaggaaacctggagaatcagacgacaagtattggggaaag。
具体的，将扩增产物KDR-FL与载体pDH-EF1-MB使用MluⅠ和Bstz17Ⅰ进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用核酸凝胶回收试剂盒(购买自OMEGA)对目标条带进行回收，将酶切产物进行连接；
转化(感受态TOP10)大肠杆菌，涂布LB(A+)平板，培养，挑取单克隆鉴定：①PCR鉴定：扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，条带干净明亮，与目标大小相符。②送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，测序结果正确，随后进行质粒大量提取，即得到质粒pDH-EF1-MB-KDR-FL(质粒图谱如图2所示)。
质粒pGL4.15-NFAT-RE-6x的构建方法：
采用kpnⅠ和HindⅢ酶切位点将NFAT-RE-6x启动子插入至pGL4.15载体上，即得到质粒pGL4.15-NFAT-RE-6x，其中，NFAT-RE-6x启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2。
SEQ ID NO:2(NFAT-RE-6x启动子的核苷酸序列)：
ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtagatctagactctagagggtatataatggaagctcgaattccagcttggcattccggtactgttggtaaa；
具体的，在pGL4.15[luc2p/Hygro]载体(购买自北京泽平科技有限责任公司)的基础上将筛选标记Hygromycin替换为puromycin。
通过PCR技术扩增puromycin及其相应序列：ppac2GS-PD1-EUD-Mfc1基因的扩增，扩增引物为AvvⅡ-F和PAC-overlap-R；AvvⅡ-F的核苷酸序列为SEQ IDNO:9所示，PAC-overlap-R的核苷酸序列为SEQ ID NO:10所示。
SEQ ID NO:9：
GGACCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCGATTCTTCTGACACTAGCGCCACCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTG；
SEQ ID NO:10：
GCGGCCATGACCGGTTCTAGAGTTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTCATG。
通过PCR技术对pGL4.15[luc2p/Hygro]载体相应序列的扩增。扩增引物为PAC-overlap-F和NotⅠ-R，PAC-overlap-F的核苷酸序列为SEQ ID NO:11所示，NotⅠ-R的核苷酸序列为SEQ ID NO:12所示。
SEQ ID NO:11：
CATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAACTCTAGAACCGGTCATGGC；
SEQ ID NO:12：ATGCGGCCGCTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATAC；
上述PCR技术反应条件均为：94℃变性5分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，18个循环，72℃延伸5分钟。
将包含pac基因的目的片段，与pGL4.15[luc2p/Hygro]载体使用AvvⅡ和NotⅠ-HF进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用核酸凝胶回收试剂盒对目标条带进行回收。将酶切产物进行连接。转化(感受态TOP10)大肠杆菌，涂布LB(A+)平板，培养。挑取单克隆鉴定：①PCR鉴定：扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，条带干净明亮，与目标大小相符。②送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，测序结果正确。随后进行质粒小量提取，得到pGL4.15-pac质粒(质粒图谱如图3所示)。
将NFAT-RE-6x与pGL4.15-pac质粒使用kpnI和HindIII酶切位点进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用核酸凝胶回收试剂盒对目标条带进行回收。将酶切产物进行连接。转化(感受态TOP10)大肠杆菌，涂布LB(A+)平板，培养。挑取单克隆鉴定：①PCR鉴定：扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，条带干净明亮，与目标大小相符。②送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，测序结果正确，得到质粒pGL4.15-NFAT-RE-6x(质粒图谱如图4所示)。
实施例3
本发明实施例3在实施例1的基础上进一步限定了步骤S2中，具体方法如下：将效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus消化重悬后通过基础培养基进行稀释，并培养过夜，其中，基础培养基为含有10％FBS的DMEM培养基；
将VEGF/VEGFR抑制剂通过稀释液稀释后加入至效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus中共孵育5小时，并对共孵育后的细胞进行裂解，其中，稀释液包括10％的FBS、90％的DMEM和100ng/ml的VEGF。
稀释液中的VEGF刺激效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus，并与效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus表面的KDR基因结合，同时激活效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus中荧光素酶报告基因的表达。
VEGF刺激效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus的终浓度为100ng/mL。
实施例4
本发明实施例4在实施例1的基础上进一步限定了VEGF/VEGFR抑制剂为靶向VEGF的单克隆抗体或靶向VEGFR的单克隆抗体；
优选的，靶向VEGF的所述单克隆抗体为贝伐珠单抗；
优选的，靶向VEGFR的所述单克隆抗体为雷莫芦单抗。
优选的，靶向VEGFR的所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQNO.3，其轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ NO.4、SEQ NO.5或SEQ NO.6。
SEQ ID NO:3(重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASAFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSI SSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDLW GQGTMVTVSS；
SEQ ID NO:4(轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQAIDNWLGWYQQKPGKAPKLLIYEGS NLNTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCQQAKSFPPTFGGGTKVDIK；
SEQ ID NO:5(轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASDAIDQWLGWYQQKPGKAPKLLIYEAS NLDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQANQFAVYFCQQAKSFPPTFGGGTKVDIK；
SEQ ID NO:6(轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQGIDQWLGWYQQKPGKAPKLLIYEGS NLNTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQANQFAVYFCQQAKSFPPTFGGGTKVDIK。
实验例1阳性克隆的活性分析
(一)阳性表达克隆对VEGF的响应性测试
表达KDR的阳性单克隆细胞(HEK293-KDR-NFAT-Lus)对VEGF的响应：将待分析鉴定的HEK293-KDR-NFAT-Lus单克隆细胞用胰酶消化，按5×105cell/mL的密度接种96孔板，每孔100μL，每个克隆各两孔。第二天每个克隆的两孔中，一孔加入含100ng/mLVEGF(VEGF-165蛋白，购买自SinoBiological公司)的完全培养基代替原培养上清，另一孔加入新鲜的完全培养基替代原培养上清。放入CO2培养箱，孵育6小时。完毕后，弃细胞上清，加入50μL裂解液，裂解10分钟，离心取裂解上清进行荧光素酶活性测试。
提前一天将前面测试筛选的对VEGF响应的效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus按5×105cell/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL；取一定用量的稀释液(稀释液包括10％的FBS、90％的DMEM和100ng/ml的VEGF，VEGF为VEGF-165蛋白)，进行浓度梯度稀释，然后加入至细胞中，孵育6小时后，加入裂解液裂解细胞，进行荧光素酶活性测试。
结果如图5所示，使用软件做四参数剂量-响应曲线，可以拟合出较好的“S”型曲线。
(二)阳性表达克隆对测试药物的响应
VEGF/VEGFR抑制剂为雷莫芦单抗cyramza和贝伐珠单抗Avastin，具体如下：
先配制稀释液，其中，稀释液包括10％的FBS、90％的DMEM和100ng/mL的VEGF(VEGF-165蛋白)，然后用其对抗VEGF单克隆抗体-贝伐珠单抗Avastin和抗VEGFR单克隆抗体-雷莫芦单抗cyramza进行梯度稀释，加入到提前一天接种好的细胞中。孵育6小时后，加入裂解液，裂解细胞，进行荧光素酶活性测试。
结果如图6和图7所示，使用软件做四参数剂量-响应曲线，可以拟合出较好的“S”型曲线。
实验例2活性分析方法的优化
(一)细胞铺板浓度的优化：
VEGF/VEGFR抑制剂为雷莫芦单抗cyramza。
将效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus提前一天按5×105cell/mL的密度接和1×106cell/mL的密度接种96孔板，每孔100μL，即5万/孔，10万/孔，37℃培养过夜；
先配制稀释液，其中，稀释液包括10％的FBS、90％的DMEM和100ng/mL的VEGF(VEGF-165蛋白)，然后用其对雷莫芦单抗cyramza进行梯度稀释，加入到提前一天接种好的细胞中。孵育6小时后，加入裂解液，裂解细胞，进行荧光素酶活性测试，结果如图8所示。
实验结果：10万/孔曲线荧光值更高，优选细胞浓度为1×106(cells/mL)。
(二)孵育时间优化：
VEGF/VEGFR抑制剂为雷莫芦单抗cyramza。
将效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus提前一天按1×106cell/mL的密度接种96孔板，每孔100μL，37℃培养过夜；
先配制稀释液，其中，稀释液包括10％的FBS、90％的DMEM和100ng/mL的VEGF(VEGF-165蛋白)，然后用其对雷莫芦单抗cyramza进行梯度稀释，加入到提前一天接种好的细胞中。孵育3、4、5、6小时、过夜后，加入裂解液，裂解细胞，进行荧光素酶活性测试，结果如图9所示。
实验结果显示：5小时和6小时测试结果基本一致且优于其他孵育时间，出于节省时间的考虑，优选的细胞孵育时间为5小时。
实验例3方法验证
(一)专属性
检测样品为cyramza、PS、Humira HR3和ORENCIA。
将效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus提前一天按1×106cell/mL的密度接种96孔板，每孔100μL，37℃培养过夜；
先配制稀释液，其中，稀释液包括10％的FBS、90％的DMEM和100ng/mL的VEGF(VEGF-165蛋白)，然后用其对cyramza、PS、Humira HR3、ORENCIA进行梯度稀释，加入到提前一天接种好的细胞中。孵育5小时后，加入裂解液，裂解细胞，进行荧光素酶活性测试，结果如图10所示。
实验结果：本发明的方法专属性良好，能够准确测出VEGF/VEGFR抑制剂，不受干扰。
(二)重复性
将效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus提前一天按1×106cell/mL的密度接种96孔板，每孔100μL，37℃培养过夜；
先配制稀释液，其中，稀释液包括10％的FBS、90％的DMEM和100ng/mL的VEGF(VEGF-165蛋白)，然后用其对抗VEGFR单抗进行梯度稀释，加入到提前一天接种好的细胞中。孵育5小时后，加入裂解液，裂解细胞，同时进行6次荧光素酶活性测试，结果如图11所示。
实验结果显示：本发明的方法重复性良好，6次结果的RSD值为6.9％。
(三)准确度
将效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus提前一天按1×106cell/mL的密度接种96孔板，每孔100μL，37℃培养过夜；
先配制稀释液，其中，稀释液包括10％的FBS、90％的DMEM和100ng/mL的VEGF(VEGF-165蛋白)，然后用其对抗VEGFR单克隆抗体进行稀释，先预稀释至原始浓度的64％、80％、100％、125％、156％，再进行梯度稀释，加入到提前一天接种好的细胞中。孵育5小时后，加入裂解液，裂解细胞，进行荧光素酶活性测试。
实验结果显示：本发明的方法在样本浓度偏离64％～156％范围内的准确度在90％～115％之间，准确度置信区间为95.6％～102.6％，均具有良好的准确性。使用准确度数据以预期值为横坐标，实测值为纵座标作图，结果如图12所示。线性图斜率为0.974，R2为0.995，Y轴截距不应该是零。R2越接近1表明线性关系越好。
线形图公式：y＝0.974x+0.014R2＝0.995。
(四)方法系统适用性
将效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus提前一天按1×106cell/mL的密度接种96孔板，每孔100μL，37℃培养过夜；
先配制稀释液，其中，稀释液包括10％的FBS、90％的DMEM和100ng/mL的VEGF(VEGF-165蛋白)，然后用其对抗VEGFR单抗进行梯度稀释，重复稀释5次，雷莫芦单抗为标准品，加入到提前一天接种好的效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus中。孵育5小时后，加入裂解液，裂解细胞，进行荧光素酶活性测试。结果如图13所示。
实验结果：①每条拟合曲线的相关系数R2≥0.97；②(B参考品/B待测样品)×100％为80％～100％；③(D参考品/D待测样品)×100％为90％～110％；④(D参考品-A参考品)/(D待测样品-A待测样品)×100％为90％～110％；⑤两个复孔读数的RSD≤20％，为此，可以说明系统适用性良好。
(五)方法对比
将我公司近两年HUVEC增值抑制法与本发明所述方法实验数据对比，得出以下结果：
HUVEC增值抑制法检测参考品IC50值的RSD为37.39％。本发明所述方法检测参考品IC50值的RSD为23.76％，优于HUVEC增值抑制法。
HUVEC增值抑制法与本发明所述方法检测结果RSD＜30％，90％以上的检测结果RSD＜20％。
本发明荧光信号值的最小值平均为1000，荧光值的最大值平均为20000；而HUVEC增值抑制法响应值的最小值平均为0.7，响应值的最大值平均为1.3。本发明的试验方法本底很干净，基本不受任何干扰，因此数据可靠度更高。
由数据统计分析结果来看，效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Luc比HUVEC细胞更稳定，本发明的实验方法检测的数据不受实验本身的干扰，得出的结果更准确。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种VEGF/VEGFR抑制剂生物学活性的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
S1、构建稳定传代的效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus，所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus为稳定表达KDR基因和荧光素酶报告基因的HEK293细胞；
S2、将VEGF/VEGFR抑制剂通过稀释液稀释后与所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus相互作用，所述稀释液中含有VEGF；
S3、裂解所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus，加入荧光素酶底物，测定所述VEGF/VEGFR抑制剂的报告基因信号值，根据信号值拟合四参数曲线计算IC50值，即检测所述VEGF/VEGFR抑制剂的生物学活性。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S1中构建稳定传代的效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus，包括以下方法：
S11、构建质粒pDH-EF1-MB-KDR-FL和质粒pGL4.15-NFAT-RE-6x；
S12、将所述质粒pDH-EF1-MB-KDR-FL和所述质粒pGL4.15-NFAT-RE-6x转染至所述HEK293细胞中；
S13、通过添加潮霉素和嘌呤霉素杀死未稳定转染的细胞，筛选获得稳定传代的单克隆细胞株，即得到所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤S12中，转染前，所述HEK293细胞以1×106个/ml的接种密度进行接种并置于培养箱中培养过夜。
4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述质粒pDH-EF1-MB-KDR-FL的构建方法：
采用MluⅠ和Bstz17Ⅰ酶切位点将KDR-FL连接至pDH-EF1-MB载体上，即得到pDH-EF1-MB-KDR-FL，其中，所述KDR-FL的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述质粒pGL4.15-NFAT-RE-6x的构建方法：
采用kpnⅠ和HindⅢ酶切位点将NFAT-RE-6x启动子插入至pGL4.15载体上，即得到所述质粒pGL4.15-NFAT-RE-6x，其中，所述NFAT-RE-6x启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中，具体方法如下：将所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus消化重悬后通过基础培养基进行稀释，并培养过夜，其中，所述基础培养基为含有10％FBS的DMEM培养基；
将所述VEGF/VEGFR抑制剂通过所述稀释液稀释后加入至所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus中共孵育5小时，并对共孵育后的细胞进行裂解，其中，所述稀释液包括10％的FBS、90％的DMEM和100ng/ml的VEGF。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述稀释液中的所述VEGF刺激所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus，并与所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus表面的所述KDR基因结合，同时激活所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus中所述荧光素酶报告基因的表达。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述VEGF刺激所述效应细胞HEK293-KDR-NFAT-Lus的终浓度为100ng/ml。
9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述VEGF/VEGFR抑制剂为靶向VEGF的单克隆抗体或靶向VEGFR的单克隆抗体；
优选的，靶向VEGF的所述单克隆抗体为贝伐珠单抗；
优选的，靶向VEGFR的所述单克隆抗体为雷莫芦单抗。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，靶向VEGFR的所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQNO.3，其轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ NO.4、SEQ NO.5或SEQNO.6。
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