CN110161244B - 一种用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件，包括核酸适配体分子信标探针和通过DNA固相合成技术嵌入至所述核酸适配体分子信标探针环状区域的8‑17型DNA酶的活性中心序列。本发明还公开了该核酸器件的构建方法，该方法先通过将核酸适配体和分子信标串联制备核酸适配体分子信标探针，再将8‑17型DNA酶的活性中心序列通过DNA固相合成技术嵌入至制备的核酸适配体分子信标探针的环状区域制备核酸器件。本发明的核酸器件的构建方法操作简单，通过特异性识别肿瘤细胞中处于高水平表达的mRNA，通过DNA酶活性中心切割肿瘤mRNA，降低mRNA的含量，抑制肿瘤mRNA的表达，实现对肿瘤mRNA的检测和调控，实现肿瘤疾病的早期诊断与基因治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件及其构建方法。
背景技术
恶性肿瘤严重危及人类的生命健康。目前对恶性肿瘤的常规治疗仍为手术及放、化疗，这种常规治疗对极大多数肿瘤的疗效仍不十分理想，对与极大多数化疗药物而言，其治疗指数依然很低，即其治疗剂量与毒性剂量较为接近。故这种治疗手段通常伴有明显的毒性作用。因此，采用特异性识别和标记的肿瘤的基因靶向性治疗成为研究的热点。
核酸适配体是通过指数级富集配子系统进化（SELEX）技术，筛选得到与小分子、蛋白质分子和细胞等结合的DNA或RNA片段，其通过形成特定空间结构高亲和性高特异性结合识别靶分子而广泛用于靶向性治疗中。
分子信标探针就是一种典型的基于荧光能量共振转移（FRET）原理构建而成检测DNA或RNA的荧光探针：在长度约为15~30mer寡核苷酸探针的两端分别加上5~7mer互补序列和荧光基团及猝灭基团。在没有目标探针时，互补序列的杂交形成茎杆区，而寡核苷酸探针呈环状，使分子信标呈发夹状结构。在这种结构中，荧光基团与猝灭基团相互靠近，荧光发生能量转移，分子信标发出弱荧光信号。当存在目标链时，目标链与分子信标中寡核苷酸探针序列相互杂交，迫使茎杆区双链DNA解链。在这种结构中，荧光基团远离猝灭基团，荧光不能发生能量转移，分子信标发出强荧光信号。
现有技术中有采用核酸适配体-分子标记（AMB）进行识别鉴定肿瘤细胞的方法，但对于兼具诊断检测和调控肿瘤mRNA的方法还尚未报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件及其构建方法，该核酸器件能够特异性识别肿瘤mRNA并调控肿瘤mRNA的表达，为临床上实现肿瘤的高灵敏度检测诊断和抑制肿瘤mRNA的表达提供支持。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件，所述核酸器件包括核酸适配体分子信标探针和通过DNA固相合成技术嵌入至所述核酸适配体分子信标探针环状区域的8-17型DNA酶的活性中心序列，所述核酸器件的序列为5'-TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTT(Int6-FAM)CTGGCTCCCAGCTCCGAGCCGGTCGAATCCAGCTCCTTGGCCAGA-BHQ-1-3'。
进一步，所述核酸适配体分子信标探针包括核酸适配体和通过TTT序列与所述核酸适配体串联的分子信标，在所述分子信标的5'和3'端分别连接荧光基团和淬灭基团。
上述的核酸适配体分子信标探针可特异性识别肿瘤mRNA，其与肿瘤mRNA特异性结合后分子信标的荧光基团6-FAM远离淬灭基团BHQ-1，检测到荧光信号；当不存在肿瘤mRNA时，荧光基团6-FAM被淬灭基团BHQ-1淬灭，无荧光信号。
进一步，所述荧光基团为6-FAM，所述淬灭基团为BHQ-1。
进一步，所述核酸适配体分子信标探针的序列为5'-TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTT (Int6-FAM)CTGGCTCCCAGCTCCAGCT CCTTGGCCAGA-BHQ-1-3'。
进一步，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述分子信标的序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述8-17型DNA酶的活性中心序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述核酸器件的靶向肿瘤mRNA为survivin mRNA。
一种采用上述用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件的构建方法，包括以下步骤：
1）制备核酸适配体分子信标探针：先将SEQ ID NO.2所示的分子信标序列的5'端修饰荧光基团6-FAM，在其3'端修饰淬灭基团BHQ-1，再将SEQ ID NO.1所示的核酸适配体序列通过DNA固相合成技术串联至修饰有荧光基团和淬灭基团的分子信标上，并在核酸适配体的3'端和分子信标上的荧光基团之间嵌入TTT序列，得到单链的核酸适配体分子信标探针；
2）制备核酸器件：将8-17型DNA酶的活性中心序列通过DNA固相合成技术嵌入至步骤1）制备的核酸适配体分子信标探针的环状区域中，所述环状区域的序列为TCCCAGCTCCAGCTCCTTG，所述活性中心序列嵌入至环状区域序列中第7个碱基C和第8个碱基T之间，得到核酸器件。
一种采用上述用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件在用于肿瘤诊疗的试剂盒中的应用。
本发明一种用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件及其构建方法的有益效果：本发明的核酸器件易于制作、操作简单、实时监控、成本低廉、稳定性高，通过特异性识别肿瘤细胞中处于高水平表达且具有调控细胞周期、凋亡和迁移的肿瘤mRNA，并通过DNA酶活性中心切割肿瘤mRNA，降低肿瘤mRNA的含量，抑制肿瘤mRNA的表达，实现对肿瘤mRNA的检测和调控，从而实现肿瘤疾病的早期诊断与基因治疗。
附图说明
图1—为核酸适配体分子信标探针（AMB）检测不同浓度Survivin mRNA靶序列产生的荧光光谱图；
图2—为核酸适配体分子信标探针（AMB）在520 nm处荧光增强与Survivin mRNA靶序列浓度的线性相关图；
图3—为核酸适配体分子信标探针（AMB）特异性检测靶序列、错配序列、同源序列的荧光增强图；
图4-为A549肺腺癌细胞的荧光成像图；
图5-为A549细胞经不同预处理后与核酸器件（AMB）孵育2h后的荧光成像图；
图6-为A549肿瘤细胞与HFL1正常细胞分别于核酸器件（ADB）孵育后的荧光成像图；
图7-为A549肿瘤细胞与核酸器件（ADB）孵育后survivin mRNA的表达水平图；
图8-为A549肿瘤细胞与核酸器件（ADB）孵育后survivin蛋白的表达水平
其中，图4、图5和图6中亮白色为蓝色荧光，暗白色为绿色荧光。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例制备核酸适配体分子信标探针（AMB），具体操作为：先将分子信标序列5'-TCTGGCTCCCAGCTCCAGCTCCTTGGCCAGA-3'（SEQ ID NO.2）的5'端修饰荧光基团6-FAM，在其3'端修饰淬灭基团BHQ-1，得到修饰有荧光基团和淬灭基团的分子信标序列，该序列为5'-T (Int 6-FAM) CTGGCTCCCAGCTCCAGCTCCTTGGCCAGA-BHQ-1-3'；再将核酸适配体序列5'-TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'（SEQ ID NO.1）通过DNA固相合成技术串联至修饰有荧光基团和淬灭基团的分子信标上，并在核酸适配体的3'端和分子信标上的荧光基团之间嵌入TTT序列，得到单链的核酸适配体分子信标探针的序列5'- TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTT(Int6-FAM)CTGGCTCCCAGCTCCAGCTC CTTGGCCAGA-BHQ-1-3'。
核酸适配体为单链DNA序列，可特异性与肿瘤细胞膜表面高表达的受体结合，且不依赖于转染试剂主动入胞。分子信标（MB）为亲水负电荷结构的单链DNA序列。分子信标（MB）是由单链的环状区及双链的茎干区构成的，其环状区的序列为TCCCAGCTCCAGCTCCTTG，在初始状态下，荧光基团和淬灭基团靠近，荧光被淬灭；与目标mRNA 结合后，双链茎干打开，荧光恢复，能实现对mRNA的实时定量检测。
实施例2
本实施例采用实施例1制备的核酸适配体分子信标探针（AMB）检测目标SurvivinmRNA，检测其对目标Survivin mRNA的特异性识别效果。
向10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4，含10 mM NaCl和100mM KCl）中加入50 nM 核酸适配体分子信标探针（AMB）和0-100nM系列浓度的目标Survivin mRNA靶序列，于37°C下孵育30 min，测定核酸适配体分子信标探针（AMB）的荧光强度，测定结果如图1所示；记录在各浓度下AMB在520 nm处最大荧光强度的增加值，其结果如图2所示。
参见图1、图2，由图1可知，在同一波长处的荧光强度随Survivin mRNA靶序列浓度增加而逐渐增强，说明核酸适配体序列与分子信标（MB）结合形成的核酸适配体分子信标探针（AMB）对分子信标（MB）的性能影响不大，能够用于Survivin mRNA的检测。由图2可知，以最大荧光值的增加值为量化指标（520 nm处荧光值的改变），在0-50 nM Survivin mRNA靶序列浓度范围内，荧光增强与浓度呈线性关系，通过该探针的荧光强度可知靶序列的浓度，实现Survivin mRNA的检测。
为进一步鉴定核酸适配体分子信标探针（AMB）的特异性，向10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4，含10 mM NaCl和100mM KCl）中分别加入50 nM 核酸适配体分子信标探针（AMB）和50nM系列浓度的目标Survivin mRNA靶序列（Target）、错配序列（Mis1、Mis3）、同源序列（A15、T15与C15），于37°C下孵育30 min，以最大荧光值的增加值为量化指标，测定AMB在520nm处最大荧光强度的增加值，其结果如图3所示。
参见图3，由图3可知，核酸适配体分子信标探针（AMB）可区分单个错配碱基，与靶序列相比，错配后的荧光显著降低，显示出高特异性，说明核酸适配体分子信标探针（AMB）能快速并特异性识别肿瘤mRNA。
实施例3
本实施例采用实施例1制备的核酸适配体分子信标探针（AMB）用于细胞内成像。
选择A549肺腺癌细胞，分别与0.5μM 核酸适配体分子信标探针（AMB经细胞培养基稀释）、分子信标（MB经细胞培养基稀释）孵育2 h，洗涤细胞，然后用DAPI将细胞核染色定位，其检测结果如图4所示。
参见图4，FAM为绿色荧光（图中暗白色），DAPI染色后的细胞为蓝色荧光（图中亮白色），由图4可知，未处理组（不加AMB或MB）和MB组中均未出现绿色荧光，仅在AMB组中出现绿色荧光，说明只有AMB才能够特异性识别A549肺腺癌细胞中的mRNA，其与A549肺腺癌细胞中的mRNA结合后使分子信标上的FAM荧光基团远离淬灭基团BHQ-1，从而发出绿色荧光；在DAPI染色后的对照组、AMB组和MB组中都呈现蓝色荧光，且只有AMB组的蓝色荧光区域周边有绿色荧光，而只有与受体结合后才会发出绿色荧光，说明AMB在核酸适配体的介导下能够特异性与肿瘤细胞膜表面高表达的受体结合，且在不需要转染的情况下可直接选择性进入肿瘤细胞，实现目标mRNA的检测。
实施例4
本实施例采用实施例1制备的核酸适配体分子信标探针用于活细胞survivinmRNA不同表达水平的检测。
Survivin基因在大多数肿瘤细胞中高表达，而在健康组织中低表达。为了验证AMB能够用于检测不同表达水平的survivin mRNA，通过对A549肺腺癌细胞转染质粒或siRNA调节细胞中survivin mRNA的表达水平，转染质粒后的细胞中survivin mRNA表达上调，而转染siRNA后的细胞中survivin mRNA表达下调。将转染质粒或siRNA的A549肺腺癌细胞，分别与0.5μM 核酸适配体分子信标探针（AMB经细胞培养基稀释）孵育2 h，洗涤细胞，然后用DAPI将细胞核染色定位，其检测结果如图5所示。
参见图5，由图可知，被质粒转染后细胞内的AMB信号较未处理组（不转染质粒或siRNA）荧光强度明显增强（绿色荧光）；被siRNA处理后，荧光强度则减弱，说明AMB可以检测到A549肺腺癌细胞survivin mRNA的不同表达水平，从而推测疾病状态。
实施例5
本实施例制备核酸器件（ADB），具体操作为：将8-17型DNA酶的活性中心序列TCCGAGCCGGTCGAA （SEQ ID NO.3）通过DNA固相合成技术嵌入实施例1中制备的核酸适配体分子信标探针的环状区域中，所述环状区域的序列为TCCCAGCTCCAGCTCCTTG，所述活性中心序列嵌入至环状区域序列中第7个碱基C和第8个碱基T之间，得到序列为TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTT(Int6-FAM)CTGGCTCCCAGCTCCGAGCCGGTCGAATCCAGCTCCTTGGCCAGA-BHQ-1的核酸器件（ADB），该核酸器件在金属离子的辅助下可对靶mRNA进行切割，实现靶mRNA的调控。
实施例6
本实施例采用实施例5制备的核酸器件（ADB）用于survivin mRNA的检测。
选择A549肺腺癌细胞和HFL1正常细胞，分别与0.5μM核酸器件（ADB）（ADB经细胞培养基稀释）孵育2 h，洗涤细胞，然后用DAPI将细胞核染色定位，然后观察细胞内荧光成像，其结果如图6所示。
参见图6，由图可知，核酸器件（ADB）与A549肺腺癌细胞处理2h后，成功观察到荧光，核酸器件（ADB）能够进入A549肺腺癌细胞中并与survivin mRNA结合后，使荧光基团与淬灭基团分离，使绿色荧光信号出现，而在正常细胞中荧光保持在背景水平，由于正常细胞中无survivin mRNA，核酸器件不能与survivin mRNA结合，其中的荧光基团被淬灭基团淬灭表现为无绿色荧光信号，该结果表明核酸器件（ADB）对肿瘤细胞的选择性，且其可用于肿瘤细胞内mRNA的成像和检测。
实施例7
本实施例采用实施例5制备的核酸器件（ADB）用于survivin mRNA的调控。
选择A549肺腺癌细胞分别与5 μM ADB（ADB经细胞培养基稀释）孵育6h，洗涤细胞，并将细胞重新培养至RPMI-1640完全培养基，42 h后洗涤细胞，对照组不加ADB，以RT-PCR分析ADB对survivin mRNA的调控作用。核酸器件（ADB）与A549肺腺癌细胞孵育48h后以Western blot分析探索其对survivin蛋白的调控。
由图7和图8可知，与对照组相比，ADB组中survivin mRNA的表达量降低了34%，ADB组中survivin蛋白表达显著降低，说明核酸器件（ADB）对靶mRNA的表达有很好的调控作用。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 长沙医学院
<120> 一种用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件及其构建方法
<141> 2019-05-10
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttggtggtgg tggttgtggt ggtggtgg 28
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctggctccc agctccagct ccttggccag a 31
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccgagccgg tcgaa 15
Claims (9)
1.一种用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件，其特征在于：所述核酸器件包括核酸适配体分子信标探针和通过DNA固相合成技术嵌入至所述核酸适配体分子信标探针环状区域的8-17型DNA酶的活性中心序列，所述核酸器件的序列为：
5'-TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTT(Int6-FAM)
CTGGCTCCCAGCTCCGAGCCGGTCGAATCCAGCTCCTTGGCCAGA-BHQ-1-3'。
2.如权利要求1所述一种用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件，其特征在于：所述核酸适配体分子信标探针包括核酸适配体和通过TTT序列与所述核酸适配体串联的分子信标，在所述分子信标的5'和3'端分别连接荧光基团和淬灭基团。
3.如权利要求2所述一种用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件，其特征在于：所述荧光基团为6-FAM，所述淬灭基团为BHQ-1。
4.如权利要求2所述一种用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件，其特征在于：所述核酸适配体分子信标探针的序列为：
5'-TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTT(Int6-FAM)CTGGCTCCCAGCTCCAGCTCCTTGGCCAGA-BHQ-1-3'。
5.如权利要求2所述一种用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件，其特征在于：所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1所示。
6.如权利要求2所述一种用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件，其特征在于：所述分子信标的序列如SEQ ID NO.2所示。
7.如权利要求2所述一种用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件，其特征在于： 所述8-17型DNA酶的活性中心序列如SEQ ID NO.3所示。
8.一种如权利要求1-7任一项所述用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）制备核酸适配体分子信标探针：先将SEQ ID NO.2所示的分子信标序列的5'端修饰荧光基团6-FAM，在其3'端修饰淬灭基团BHQ-1，再将SEQ ID NO.1所示的核酸适配体序列通过DNA固相合成技术串联至修饰有荧光基团和淬灭基团的分子信标上，并在核酸适配体的3'端和分子信标上的荧光基团之间嵌入TTT序列，得到核酸适配体分子信标探针；
2）制备核酸器件：将8-17型DNA酶的活性中心序列通过DNA固相合成技术嵌入至步骤1）制备的核酸适配体分子信标探针的环状区域中，所述环状区域的序列为：TCCCAGCTCCAGCTCCTTG，所述活性中心序列嵌入至环状区域序列中第7个碱基C和第8个碱基T之间，得到核酸器件。
9.如权利要求1-8任一项所述用于检测和调控肿瘤mRNA的核酸器件在制备肿瘤诊疗的试剂盒中的应用。
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