KR102027248B1 - 유방암 줄기세포 검출용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기존 암 및 암 줄기세포 치료 및 세포들간의 이질성과 상이함을 해결하기 위한 특정 암 줄기세포 표면 신규 바이오마커 발굴 및 동정에 관한 것이다. 구체적으로 암 세포 중 유방암인 MCF-7 세포주 유래 mammosphere인 유방암 줄기세포 (Breast cancer stem cell, BCSC)을 제작하여 proteomics 분석기법인 Tandem Mass Spectrometry (MS/MS)을 통해 얻은 바이오 마커 후보군들 중 세포표면 막 단백질인 CD66c (Carcinoembryonic Antigen Related Cell Adhesion Molecule 6, CEACAM6)을 발굴 및 암줄기세포에서의 특이적 발현을 유전체와 단백체에서 증명하였다. 이를 통하여 본원에 따른 신규 바이오마커는 유방암 유래 암줄기세포를 선별적으로 공략함으로 유방암 완치를 위한 암줄기세포의 세포면역치료제 개발 및 약물전달시스템 (drug delivery system, DDS)에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

Description

유방암 줄기세포 검출용 바이오마커 및 이의 용도 {Biomarker for detecting breast cancer stem cell(BCSC) and use thereof}

본 발명은 유방암 줄기세포 특이적 바이오마커 발굴 및 이를 이용한 유방암 줄기세포 표적 치료제를 발굴하는 것에 관한 것이다.

2017년 글로벌 헬스케어 시장은 총 1조 7,686억 달러 규모를 형성, 2018년은 전년대비 4.8% 성장하여 1조 8,538억 달러로 확대될 전망이다. 바이오헬스 연구에 대한 분야 중 암은 여전히 서구사회에서 심장질환 다음으로 사망률이 높은 인류의 최대 질병 중 하나로 지난 수십년간 생명공학과 의학 기술의 놀라운 발전에도 불구하고 여전히 정복하기 어려운 질환으로 계속 증가하는 추세이다. 우리나라의 경우 암으로 인한 사망은 전 국민 사망 원인의 1위를 차지하고 있다. 최근 OECD 가입회원국의 대부분은 유방암과 대장암이 가장 높은 발생률을 보이고 있는데, 우리나라의 경우도 비만의 증가 및 식생활의 서구화에 따른 발생이 증가될 것으로 보인다. 2016년 기준 우리나라 성별 암 발생률은 인구 10만명당 남자 286.5명, 여자 236.3명이었다. 남자는 위암, 폐암, 대장암 순, 여자는 갑상선암, 유방암, 대장암 순으로 발생했다.

유방암은 2012년 세계보건기구(WHO) 자료에 따르면 전세계 여성암 중 1위(25.2%)이며 비만, 모유수유감소, 식습관의 서구화에 따라 우리나라에서도 유방암 발병률이 높아져 여성암 발병률 2위를 차지한다. 한국 유방암 발생환자는 2011~2015년 건강보험 진료비 지급자료를 분석하여 발표한 내용에 따르면, '유방암' 질환으로 인한 진료인원은 10만 4,293명 (2011년)에서 14만 1,379명 (2015)으로 4년간 3만 7,086aud 증가 (35.6%)한 것으로 나타났다.

유방암은 유방에 발생한 암세포로 이루어진 덩어리를 위미하며, 일반적으로 유방의 유관과 유엽에서 발생하는 암을 일컫는다. 유방조직은 유선과 유선조직을 지지하는 지방, 결체조직, 림프관으로 이루어진다. 유선조직은 유즙을 생성하는 유엽, 유엽과 유두를 연결하는 유관으로 구성된다. 유방암은 유방구성조직 어디에서든 발생할 수 있어 다른 암에 비해 종류가 다양하다. 유방암 대부분은 유관과 유엽에 있는 세포, 그 중에서도 유관의 상피세포에서 기원한다. 유방암도 다른 암과 마찬가지로 적절한 치료가 이루어지지 않을 경우 혈류와 림프관을 따라 전신으로 전이하여 심각한 결과를 초래한다.

그러나 다양한 항암 치료법 후 재발되는 암에 대한 원인이 암줄기세포에 의한 것이며, 암 발병원인 65%가 암줄기세포에 의한 것이라는 보고에 의해 (Science, 2015) 암줄기세포를 치료하고자 하는 다양한 치료방법들이 개발되고 있다. 이 암줄기세포는 줄기세포로서의 특성을 가지고 있으며, 다른 암세포와 달리 세포주기 중 휴지기에 있으므로 항암제의 공격에 저항하여 소수로 살아남아 있다가 양호한 환경이 되면 다시 빠른 속도로 증식하여 암을 재발시키는 가장 큰 원인으로 작용한다. 이러한 암줄기세포를 치료하기 위해 선별적으로 집중 공략해야 한다는 새로운 관점의 치료방향을 제시할 수 있다.

또한, 암줄기세포의 제거는 치료효과를 평가하는 중요 인자로, 치료 후 잔류 암줄기세포가 어느정도 남아 있는지를 평가함으로써 암치료의 예후를 판단하는 좋은 지표가 된다. 따라서 각 종양 유형에 대한 신뢰성 있고 특이적인 암줄기세포 바이오마커를 찾는 것이 중요한 요인임을 보여준다. 대표적인 유방암 줄기세포의 표면 마커로는 ESA⁺, CD44⁺, CD24^-/low, Lineage^-, ALDH-1^high가 있다. 그러나 암 줄기세포는 개인마다 많은 이질성이 있고, 항암제나 방사선치료에 대해 저항성을 가진다는데 가장 큰 문제로 작용하고 있기에 치료에 어려움을 가진다. 암 줄기세포 인지는 임상에서 중요한 암 치료 예후 평가의 인자로 작용하기에 이를 선별하여 인지하고 추적할 수 있는 기술 개발이 필요하다. 암 줄기세포 치료제 개발 기반기술은 아직 초기 연구단계로 표적화를 위한 연구 보다는 암 줄기세포의 특성 규명에 대한 연구에 치중되어 있다. 암세포 및 암 줄기세포에 대한 치료효과를 극대화시키기 위해서는 세포 기능조절물질 발굴 외에 암 줄기세포 추적기술과 세포 특이 추적용 마커의 개발이 절실히 요구되어진다.

대한민국 공개특허 제 10-2012-0094173 호 대한민국 공개특허 제 10-2016-0026624 호

(연구논문 0001) Shao, J., Fan, W., Ma, B., & Wu, Y., Breast cancer stem cells expressing different stem cell markers exhibit distinct biological characteristics. Molecular medicine reports, 2016, 14(6), 4991-4998. (연구논문 0002) D. Bonnet, J.E. Dick, Human acute myeloid leukemia is organized as hierachy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med 3(1997)730- 737. (연구논문 0003) M. Al-Hajj, M.F. Clarke, Self-renewal and tumor stem cells. Oncogene 23(2003)7274-7284.

이에 본 발명자들은 유방암 줄기세포를 검출할 수 있는 단백체를 탐색한 결과, 세포의 표면에 특이적인 바이오마커 CD66c(CEACAM6)를 발견하였고, 유방암 줄기세포에서 유전자와 단백질 수준에서의 검출과 치료를 위한 상기 바이오마커의 용도를 규명하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 CD66c의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유방암 줄기세포 검출을 위한 바이오 마커용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 CD66c 유전자 또는 단백질의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 유방암 줄기세포 억제용 조성물 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기와 같은 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 CD66c의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유방암 줄기세포(BCSC) 검출을 위한 바이오 마커 조성물을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 암 줄기세포(Breast cancer stem cell, BCSC) 검출을 위한 바이오 마커용 조성물은 유효성분으로서 CD66c의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 암 진단 또는 예후 분석용 조성물의 유효성분으로는 CD66c의 유전자 mRNA 발현수준 또는 이의 단백질 수준을 검출할 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 CD66c유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 상기 CD66c의 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다. 본 발명에서 CD66c의 유전자는 CD66c의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응의 예로는 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다. 본 발명에서, 상기 프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 CD66c는 서열번호 1의 염기서열로 이루어져 있으며, 이의 발현수준을 검출하기 위한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 내지 3으로 이루어진 염기서열 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 CD66c의 유전자 발현을 분석하기 위한 용도인 것을 특징으로 하며, 상기 CD66c의 발현이 유방암 세포에서보다 유방암 줄기세포(BCSC)에서 고발현되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 상기 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 본 발명의 CD66c 마커 유전자로부터 발현된 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다. 상기 “항체”는 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 바이오마커 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 그 목적이 있다. 본 발명의 암 진단 또는 예후 분석용 키트는 상기 마커 유전자인 CD66c 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예로, CD66c 유전자 또는 단백질의 발현을 억제할 수 있는 억제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 줄기세포 성장 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 CD66c 유전자 발현 억제제는 CD66c 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하여 단백질의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA이고, 가장 바람직하게는 shRNA이다.

상기 “shRNA”란 small hairpin RNA 혹은 short hairpin RNA으로 불리며, RNA 간섭으로 유전자를 침묵시킬 수 있는 용도로 사용되는 것이다. 보통 벡터를 이용하여 목적 세포로 도입한다. 이러한 shRNA hairpin 구조는 세포내 다른 물질에 의하여 절단되어 siRNA가 되기도 한다. 본 발명의 일실시예에서는 CD66c 유전자의 knock-down을 위해 CD66c에 대한 shRNA을 사용하였고, 본 발명의 shRNA는 서열번호 6 내지 8 중 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 8이다.

상기 “안티센스 뉴클레오타이드”란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 상기 유전자의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 CD66c 단백질 억제제는 CD66c 단백질에 결합하여 그 기능을 소멸시키는 것이면 어느 것이든 가능하며, 예로 펩티드, 앱타머, 항체 및 기질유사체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 마커 단백질의 발현 및 활성을 감소시키기 위해서 펩티드-펩티드간 결합, 항원-항체반응, 효소반응 등을 이용할 수 있으며, 상기 단백질에 특이적인 항체를 사용할 경우, 상기 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 방사성핵종(radionuclide), 약물, 독소, 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포(예를 들면, T세포와 같은 K 세포(killer cell)) 모두에 결합하는 항체 등이 있다.

또한 본 발명은 상기 유방암 줄기세포 성장 억제용 조성물을 유효성분으로 포함하는, 항암용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다. 상기 항암용 조성물에는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예로, (a) 생물학적 시료로부터 CD66c 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 유전자 또는 단백질의 발현수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계;를 포함하는 암의 발병 또는 중증도를 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응((reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 노던 블럿, 웨스턴 블럿, ELISAA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응((reverse transcriptase-polymerase chain reaction)), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, (a) CD66c 유전자 또는 단백질을 발현하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 CD66c 유전자 또는 단백질의 발현양을 측정하는 단계; (c) 상기 단계 (B)의 결과 CD66c 유전자 또는 단백질의 발현이 감소되는 경우 상기 시료를 암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응((reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 노던 블럿, 웨스턴 블럿, ELISAA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 먼저 상기 유전자 또는 단백질을 포함하는 암 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기 시료는 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 올리고뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA), shRNA 또는 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 증가 또는 감소되는 것이 측정되면 상기 시료는 암을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판단할 수 있다.

본 발명은 유방암 줄기세포 검출을 위한 바이오마커로서 CD66c(CEACAM6) 및 이의 용도에 관한 것으로, CD66c의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유방암 줄기세포(BCSC) 검출을 위한 바이오 마커 조성물을 발굴하였고, 상기 바이오마커를 이용하여 암줄기세포를 검출하고 표적치료 함으로서 보다 근본적인 암의 진단과 치료를 가능하게 할 수 있다.

도 1은 proteomic 분석기법을 이용한 유방암 유래 암줄기세포(Breast cancer stem cell, BCSC) 표면 신규 바이오마커 발굴 및 증명 절차를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 유방암 세포인 MCF-7에서 유방암 줄기세포를 제작하여 기존에 알려진 유방암 줄기세포 마커인 CD24^-/CD44⁺ 을 통해 유방암 줄기세포를 확인하였다. (A)BCSC을 각 7, 14, 21일로 배양시기에 따른 세포 모양을 광학현미경으로 관찰한 결과이다. (B) BCSC을 각 배양시기에 따른 암 줄기세포 표면 마커인 CD24^-/CD44⁺의 발현 양상을 FACS로 확인하였다.
도 3은 유방암 세포주인 MCF-7과 유방암 유래 암줄기세포인 BCSC를 Tandem mass spectrometry (MS/MS)를 이용한 단백질체 분석 결과를 나타낸 것이다. (A) Proteomics 분석 결과를 나타낸 그래프이다. (B) Proteomics 분석 결과, gene ontology (GO)에서 분자 기능(molecular function)을 분류한 그래프이다.
도 4는 MCF-7와 유방암 유래 암줄기세포를 제작하는 과정의 각 배양시기에 따른 CD66c mRNA의 발현유무를 RT-PCR로 검증한 결과이다.
도 5는 MCF-7와 유방암 유래 암줄기세포를 제작하는 과정의 각 배양시기에 따른 CD66c 단백질의 발현유무를 웨스턴블랏과 Flow cytometry를 통해 검증한 결과이다.
도 6은 CD66c의 발현을 감소시키기 위한 최적의 shRNA를 선정한 결과이다.
도 7은 유방암 유래 암줄기세포에 shRNA를 처리한 후 세포 부착능 및 세포 생존능을 평가한 결과이다.
도 8은 최적의 CD66c 발현 감소를 보인 shRNA-c가 삽입된 BCSC가 산화스트레스 조건 하에서 세포의 생존능을 감소 및 유지시키는지에 대한 결과로 CD66c의 저발현은 산화스트레스에 대한 저항성 상실로 증가된 세포사멸을 유도한 결과이다.

본 발명은 유방암 암줄기세포(Breast cancer stem cell, BCSC) 검출을 위한 바이오마커로서 CD66c(Carcinoembryonic Antigen Related Cell Adhesion Molecule 6, CEACAM6)의 용도를 제공함에 그 특징이 있다.

최근 암 연구는 과학적 기술 발전에 따라 암의 발병원인과 기전이 보다 구체적으로 밝혀지고 있으며, 다양한 발암 원인들이 발견되고 있다. 그 중, 최근 연구는 암세포에 존재하는 암줄기세포가 다시 암을 유발 및 진행시킬 수 있다고 알려지고 있으며, 암 줄기세포는 무제한 재생능력을 가지고 있으며 항암제에 대해서 약물 저항성이 강하여 약물처리 등에 의한 항암요법에 의해서도 쉽게 사멸되지 못하고 있다.

따라서 근본적인 암의 치료를 위해서는 암 세포내에 존재하는 암줄기세포를 타겟으로 하여 이의 사멸을 유도할 수 있는 치료제의 개발이 필요하여 암줄기세포의 존재 여부를 사전에 미리 검출 및 진단할 수 있는 기술 개발이 필요하다.

본 기술은 유방암 줄기세포를 검출할 수 있는 바이오마커로서 CD66c를 사용할 수 있음을 최초로 규명한 점에 특징이 있다.

특히 본 발명에서 분리한 암줄기세포는 유방암 세포로부터 유래되고, 유방암 줄기세포 특이적 표면항원(CD24^-/CD44⁺)에 양성인 mammosphere 형태의 구형의 밀집 형태로 배양된 세포임을 확인하였다.

하기 본 발명의 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 유방암 세포와 유방암 세포로부터 유래된 암줄기세포를 대상으로 단백체 분석기법을 통해 발현양상이 다른 단백질을 확인한 결과 유방암 세포로부터 유래된 암줄기세포에서 CD66c가 현저하게 과발현되어 있음을 확인하였다.

본 발명자들은 암줄기세포 표적치료를 통한 유방암 등의 치료를 위하여 CD66c 유전자의 발현을 억제할 수 있는 억제제를 처리하여 암줄기세포에 대한 특이적 항암 활성 및 그 기전을 확인하였다.

그 결과 CD66c 발현 억제제 처리에 의해 CD66c의 고유기능인 세포와 세포의 결합능 및 부착능이 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 CD66c에 의해 나타나는 oxidative stress 조건하에서의 세포자살내성 기능에 있어서도 암줄기세포에 억제제를 처리하였을 경우 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 유방암 유래 암줄기세포(BCSC)에서 CD66c의 발현억제는 높은 항암효과를 유도할 수 있고, 암줄기세포에 대한 선택적 치료제 개발을 위한 표적물질로 사용될 수 있을 것이다.

이하 실시예를 바탕으로 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명에 사용된 용어, 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고 통상의 기술자의 이해를 돕기 위하여 예시된 것에 불과할 뿐이며, 본 발명의 권리범위 등이 이에 한정되어 해석되어서는 안 된다.

본 발명에 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 다른 정의가 없다면 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 나타낸다.

(시험예)

1. 세포배양

종양세포주인 유방암 세포주 MCF-7(ATCC, USA)을 37도, 5% CO₂ 조건에서 DMEM/ high glucose (Dulbeco's Modified Eagle Medium; Hyclone)에 10% 태아 소혈청(fetal bovine serum,FBS; Hyclone)과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여 배양하였다.

2. MCF-7 유래 유방암 줄기세포 제작

유방암 줄기세포인 BCSC(Breast cancer stem cell)는 종양세포주인 유방암 세포주 MCF-7으로부터 유래한 것으로 2×10⁴ cells/well 농도로 하여 Ultra-Low Attachment 6-Well Plate (Corning)에 분주하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 7일 마다 sub-culture 하여 총 14일을 배양하였다. 암줄기세포는 도 2(A)에서 보듯 mammosphere형태의 구형의 밀집 형태로 배양된다. 이를 single cell로 분리하기 위해 trypsin 처리와 함께 23G syringe을 활용한 물리적 방법을 통해 뭉친 암 줄기세포를 single cell로 만들어 준다. 배지는 DMEM/F12 (Gibco)에 10% 태아 소혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신(hyclone)와 성장인자들인 insulin (Gibco), B27 supplement (serum free; Gibco), hEGF (Human Epidermal Growth Factor; Sigma), bFGF (Basic Human Fibroblast Growth Factor; Gibco)을 첨가하여 배양하였다.

3. BCSC의 CD24^-/CD44⁺ isolation

배양한 BCSC을 기존에 알려진 암줄기세포 마커인 CD24^-/CD44⁺을 이용하여 확인하고 분리하였다. 이를 위해 MagCellect CD24^-/CD44⁺breast cancer stem cell isolation kit(R&D)를 사용하였다. 기본적인 방법은 15 ml conical tube에 single cell (5×10⁵ ~ 1×10⁷ cells)을 cold 1X MagCellect plus buffer로 현탁한다. 1200 rpm, 4분 원심분리하여 상층액 제거 후 500 ul plus buffer와 human CD24 biotinylated antibody 25 ul를 첨가하고 조심스레 현탁한 후 2~8℃에 15분 정도 incubation 한다. 그 후 plus buffer 3 ml로 다시 현탁한 후 1200 rpm, 4분 원심분리한다. 상층액을 제거하고 streptavidin Ferrofluid 50 ul을 첨가하여 조심스레 섞어준 다음 2-8℃에 15분 정도 incubation 한다. 그 후 plus buffer 3 ml로 현탁하여 1200 rpm, 4분 원심분리 한다. 상층액을 제거하고 plus buffer 2 ml로 다시 현탁한 후 5 ml round bottom tube로 옮긴다. Tube를 Magcellect magnet에 끼워넣고 실온에서 6분간 incubation한다. Tube가 magnet에 확실히 끼어져 있는 상태에서, CD24^-cells가 있는 상층액을 조심스럽게 빨아들이고 새로운 tube에 분주한 후 2번 더 반복한다. 모이게 된 CD24^-cells는 다시 1200 rpm, 4분 원심분리 한 후 상층액을 제거하고 500 ul plus buffer와 human CD44 biotinylated antibody 10 ul를 첨가하여 2-8℃에 15분 정도 incubation 한다. 그 후 plus buffer 3 ml로 suspension 한 후 1200 rpm, 4분 원심분리한다. 상층액을 제거하고 streptavidin Ferrofluid 20 ul을 첨가하여 조심스레 suspension 후 2-8℃에 15분 정도 incubation 한다. 그 후 plus buffer 3 ml로 suspension 한 후 1200 rpm, 4분 원심분리한다. 상층액을 제거하고 plus buffer 2 ml로 suspension 한 후 5 ml round bottom tube로 옮긴다. Tube를 Magcellect magnet에 끼워넣고 실온에서 6분간 incubation한다. Tube가 magnet에 확실히 끼어져 있는 상태에서, CD44^-cells가 있는 상층액을 조심스럽게 빨아들이고 새로운 tube에 분주한 후 2번 더 반복한다. Magnet에 의해 magnetically 선택된 cell이 포함되어있는 tube를 제거하기 위해 1 ml plus buffer로 suspension 한다. 분리된 CD24^-/CD44⁺cells를 원하는 실험에 적용한다.

4. Flow cytometry analysis

유방암 세포주 MCF-7와 MCF-7 유래 BCSC를 각 2×10⁵ cells씩 single cell로 준비하여 round tube에 담는다. 유방암 유래 줄기세포 (BCSC)의 특성을 증명하기 위해 Magcellect CD24^-/CD44⁺ breast cancer stem cell isolation kit (R&D)에서 제공한 Human CD24 Detection Antibody (R&D), Human CD44 Detection Antibody (R&D)를 처리하고 제공된 프로토콜에 의해 실험을 수행하였다. 또한, CD66c의 발현을 확인하기 위해 1차 항체인 CEACAM6 (#439424, Thermo Scientific)와 2차 항체 goat anti-Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor™ Plus 488 (Thermo Scientific)을 처리한 뒤, novocyte flow cytometry (ACEA biosciences inc.)로 분석하였다.

5. DATABASE SEARCHING

모든 MS/MS 샘플은 Sequest (XCorr Only) (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA; version v.27, rev. 11)와 X1 Tandem (The GPM, thegpm.org; version CYCLONE (2010.12.01.1))를 이용하여 분석하였다. Sequest (XCorr Only)와 X1 Tandem (162716 entries)은 완전한 트립신 처리를 가정하여 2014 uniprot human database을 검색하도록 설정하였다. MS/MS 스펙트럼은 Sequest (XCorr Only)와 X1 Tandem의 매개변수에 의해 평가되었다: 펩티드 질량 내성(mass tolerance), 1.0 Da; 단편 이온 내성(ion tolerance), 0.032 (only BCSC_1), 0.034 Da (only MCF-7_2), 0.036 Da (only MCF-7_1), 0.089 Da(only BCSC_2). Cysteine의 carbamidomethyl은 고정된 modification으로 Sequest (XCorr only)와 X1 Tanderm에 지정되었다. Glu->pyro-Glu of the n-terminus, ammonia-loss of the n-terminus, gln->pyro-Glu of the n-terminus 와 methionine의 산화는 다양한 modification으로 X1 Tanderm에 지정되었다. Methionine의 산화는 다양한 modification으로 Sequest (XCorr only)에 지정되었다.

6. 단백질 확인 척도

Scaffold (version Scaffold_4.8.7, Proteome Software Inc., Portland, OR)는 MS/MS 기반 펩티드 및 단백질 동정을 검증하는데 사용되었다. Scaffold delta-mass correction이 있는 Peptide Prophet 알고리즘(Keller, A et al Anal. Chem. 2002;74(20):5383-92)에 의해 90.0% 이상의 확률로 확립 될 수 있다면 펩티드를 식별하였으며, 90% 이상의 확률로 확립 될 수 있고 적어도 1 개의 확인된 펩티드를 함유한 단백질을 동정하였다. 동정된 단백질은 Protein Prophet 알고리즘(Nesvizhskii, Al et al Anal. Chem. 2003;75(17):4646-58)에 의해 지정되었다. 유사한 펩티드를 함유하고 MS/MS 분석만으로는 구별할 수 없었던 단백질을 pasimony의 원리를 만족시키기 위해 그룹화 하였다. 동정된 단백질은 goa_human.gaf (downloaded 2017. 3. 16)의 GO 조건이 주석 처리되었다. (Ashburner, M et al. Nat. Genet. 2000; 25 (1) : 25-9).

7. Real time-polymerase chain reaction (RT-PCR)

Total RNA는 TRIzol reagent로 추출하여 Nano-drop One spectrophotometer (Thermo Scientific)에서 농도를 측정하였다. Reverse transcription reaction은 DiaStar™ 2X RT Pre-Mix (Solgent)로 수행하였으며 제조회사 프로토콜을 이용하였다. Conventional PCR은 Solg™2x Taq PCR Pre-Mix (Solgent)로 수행하였으며 사용한 PCR primer sequence는 표 1에 나타내었다.

사용된 CD66c와 GAPDH를 검출하기 위해 사용된 각각의 primer는 다음과 같다.

서열번호	프라이머	시퀀스
2	CEACAM6(F)	GAT CTT GTG AAT GAA GAA GCA AC
3	CEACAM6(R)	GTC ATG TTG CCA TTG GAC AG
4	GAPDH(F)	AGG GCT GCT TTT AAC TCT GGT
5	GAPDH(R)	CCC CAC TTG ATT TTG GAG GGA

8. Western blotting

각 세포로부터 추출한 단백질은 10% SDS-PAGE gel에서 전기영동에 의해 분리되었다. Immune blot을 위한 1차 항체는 CEACAM6 (#439424, 2:5000, Thermo Scientific), β-actin (#47778, 1:10000, Santa Cruz Biotechnology)을 사용하여 4℃에서 overnight하였다. 이후 2차 항체(Thermo Scientific)를 1 시간 처리 후 Clarity Max Western ECL Substrate (Bio-Rad)을 처리하여 Chemiluminescent Image system (Fusion SL, Vilber)에서 확인하였다.

9. Cell viability assay

MCF-유래 유방암 줄기세포를 12-well plate에 1 X 10⁵ cells/well씩 seeding하여 24 시간 후 short hairpin-RNA (sh-RNA) 발현 벡터 500 ng와 TransIT-X2 Dynamic Delivery System (Mirus Bio LLC) 1.5 ul를 처리하여 transfection하였다. 이 후 2-3일 동안 37℃에서 배양하였다. 이후 각 well에 Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (Sigma-Aldrich) 2mg/mL을 3 시간 동안 37℃에서 배양하고 DMSO (Sigma-Aldrich)로 녹여 결과를 확인하였다. VersaMax microplate reader (Molecular Devices)로 흡광도 450 nm를 측정하였다. DMSO에 녹아 나온 formazan의 양은 MCF-7 유래 유방암 줄기세포의 생존율을 의미한다. Control은 sh-RNA을 처리하지 않은 MCF-7 유래 유방암 줄기세포 sample로 선정하였다. 최종적인 MCF-7 유래 유방암 줄기세포의 생존율은 각 sample의 OD 값/ control의 OD 값으로 측정하였다.

10. Crystal Violet staining assay

MCF-7 유래 유방암 줄기세포 (BCSC)를 12-well plate에 1 X 10⁵ cells/well씩 seeding하여 24 시간 후 sh-RNA 발현 벡터 500 ng와 TransIT-X2 Dynamic Delivery System (Mirus Bio LLC) 1.5 uL을 처리하여 transfection한 후 2-3일 동안 37℃에서 배양하였다. Crystal violet (sigma)으로 6시간 동안 염색한 뒤, 이후 washing을 하고 methanol을 처리하여 30분 뒤 microplate reader에서 그 흡광도 595nm로 측정하였다.

11. Cell apoptosis analysis

유방암 줄기세포를 12-well에 1 X 10⁵ cells/well씩 seeding하였다. 24시간 후 sh-RNA 발현 벡터 500 ng의 농도로 transfection 하였다. 이 후 2 일 동안 37℃에서 배양 후 H₂O₂ (Sigma-Aldrich) 50mM을 3-4시간 처리 후 1 일 배양하였다. DPBS로 세척 후 V-FITC/PI (BD Biosciences)에서 제공한 프로토콜을 사용하였으며 binding buffer 500 uL에 희석하여 Flow cytometry로 분석하였다.

배양기간에 따른 유방암 세포주 유래 암줄기세포(BCSC)의 특성확인

유방암 세포주로부터 암줄기세포를 배양하기 위해 기존의 알려진 방법으로 배양을 수행하였고, 그 후 유방암 세포에서 유방암 유래 암줄기세포의 특성을 가장 잘 나타내는 기간 선정을 위해 배양기간별 암줄기세포의 마커발현 확인을 통해 최적의 배양기간 및 세포를 배양하였다. 도 2에서 관찰할 수 있듯이 외관상의 세포 형태학적으로 암줄기세포의 특성을 나타내게 될수록 sphere의 형태가 좀 더 커지는 것을 확인할 수 있었으며(도 2A), 암줄기세포의 표면 바이오머커인 CD24-/CD44+의 발현을 분석한 결과 14일의 배양기간이 제일 높은 암줄기세포의 마커를 발현하는 것을 관찰하였다(도 2B). 이때의 세포를 최적의 유방암 유래 암줄기세포로 선정하여 이후의 모든 실험에서는 기본적으로 이 배양기간의 암줄기세포를 사용하였다.

BCSC를 Tandem mass spectrometry (MS/MS)를 이용한 단백질체 분석 결과

본 발명은 유방암 세포주인 MCF-7과 도 2에서 검증한 14일째의 BCSC를 이용하여 proteomics 분석 기법을 이용하여 암줄기세포 특이적 세포표면 바이오마커를 분석하였다. 먼저, 암줄기세포에서만 발현하는 단백질 분석결과, 총 587개 중 26개의 바이오마커 후보군을 선정하였다. 그 후, gene ontology(GO)를 바탕으로 세포 표면에만 발현하는 막 단백질로 후보군을 좁히기 위해 plasma membrane와 binding(도 3B)에만 해당되는 단백질만을 선별하였고, 그 중 암줄기세포 표면에서만 특이적으로 발현되는 CD66c(Carcinoembryonic Antigen Related Cell Adhesion Molecule 6, CEACAM6)를 최종적 후보물질로 선정하였다.

유전체 분석을 통한 유방암 유래 암줄기세포에서의 CD66c의 특이적 발현 확인

도 4를 통해 유방암 세포인 MCF-7와 MCF-7 유래 BCSC (14일째)에서 RNA를 추출한 후, total RNA에서 complementary DNA (cDNA)를 합성한 후 아래와 같이 primer를 제작한 후 CD66c와 GAPDH 유전자 발현을 PCR을 통해 확인하였다. 그 결과, MCF-7은 CD66c의 발현이 거의 되지 않았는데 반해 BCSC에서는 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 배양기간에 따른 BCSC에서의 CD66C의 발현은 암줄기세포로서의 특징을 가장 높게 나타내었던 14일째의 세포에서 가장 높게 발현되는 것으로 관찰되었다.

유방암 유래 암줄기세포에서 CD66c의 세포 내 혹은 세포표면 발현 확인

유전체에서의 유방암 유래 암줄기세포에서의 특이적 CD66c의 발현 확인 후 실질적으로 단백체 수준에서 CD66c가 발현되는지를 확인해 보고자 대조군 세포주인 MCF-7과 배양기간별 BCSC에서의 CD66c의 발현을 비교 평가하였다(도 5). 먼저, 세포 내 단백질의 발현을 비교하기 위해서 각 세포로부터 추출한 western blotting 실험에서 보듯이, 대조군 세포인 유방암 세포 MCF-7에서는 발현이 거의 되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 그에 비해, 배양시기별 BCSC에서는 배양 기간별로 14일째까지 CD66c의 발현이 증가하였다가 그 이후에는 줄어드는 것을 확인하였다. CD66c의 발현은 암줄기세포주의 최적 특성을 나타내는 14일째에서 가장 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 5A).

또한, 실질적으로 세포표면에 CD66c의 발현률을 확인해보고자 유세포분석 (FACS)을 진행하였다. 그 결과, 세포 내 단백질 발현 결과에서와 유사하게 대조군인 유방암 세포주에 비해 암줄기세포에서 발현률이 증가하는 것을 확인하였고, 암줄기세포 중 배양기간이 14일째인 세포에서의 CD66c 발현이 제일 높은 것을 확인할 수 있었다(도 5B). 따라서 유방암 유래 암줄기세포의 특이적 세포표면 바이오마커로 선정된 CD66c는 proteomic 분석 결과와 마찬가지로 암줄기세포에서 특이적으로 발현되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 유방암 유래 암줄기세포의 선택적 치료를 위한 바이오마커로 CD66c가 활용될 수 있음을 시사한다.

암줄기세포에서의 CD66c의 knock-down를 위한 shRNA 선정

유방암 세포와 달리 암줄기세포에서 특이적으로 발현되는 CD66c의 생물학적 기능 연구를 위해 이 단백질의 발현을 감소시킬 수 있는 GFP 형광유전자가 같이 발현되는 3 종류의 lentiviral vector를 제작하여 각 세포에 처리하였다. 그 후 실질적으로 CD66c의 발현을 제일 많이 감소시키는 shRNA를 선별하기 위해 RT-PCR을 수행하여 유전체 레벨에서의 발현 감소를 보이는 shRNA를 선정하였다(도 6A와 6B). 그 결과, 3종류의 shRNA 중 shRNA-c가 가장 좋은 CD66c의 knock-down 효능을 보였다. 상기 shRNA의 서열은 표 2와 같다. 또한, 단백체 수준에서도 CD66c의 knock-down을 유도하는지를 평가하기 위해 각 shRNA를 암줄기세포에 처리한 뒤 CD66c의 단백질 발현을 비교하였다(도 6C). 그 결과, 대조군 shRNA (shRNA-scramble)가 처리된 세포와 비교해 유전체 결과와 동일하게 shRNA 중 c가 제일 좋은 knock-down 효과를 보였고, 이를 세포에 처리 한 뒤 발현된 shRNA-c에 의한 것인지를 확인해 보고자 발현되어진 GFP를 관찰한 결과 대조군 shRNA가 처리된 세포에 비해 shRNA-c가 처리된 세포에서의 GFP가 감소되어 있는 것을 확인하였다(도 6D).

서열번호	shRNA	시퀀스
6	shRNA-a	ATC ACA GTC TCT GGA AGT GCT CCT GTCCT
7	shRNA-b	AAG GCG AAA GAG TGG ATG GCA ACA GTC TA
8	shRNA-c	AAG AAG CAA CCG GAC AGT TCC ATG TAT AC

유방암 유래 암줄기세포에서의 CD66c의 생물학적 기능평가

CD66c의 최고 knock-down 효과를 유도할 수 있는 shRNA-c를 이용하여 암줄기세포에서의 CD66c의 기능을 평가하였다(도 7). CD66c의 기존의 알려진 기능은 세포와 세포의 결합과 부착능을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 먼저, 세포 부착능에 대한 실험을 수행하고자 BCSC에 아무것도 처리하지 않은 대조군 BCSC와 shRNA-scramble, shRNA-c를 처리하여 세포용기에 얼마나 부착되었는지를 확인하였다(도 7A). 그 결과, well 이미지에서 볼 수 있듯이 대조군과 shRNA-scramble 이 처리된 세포들에 비해 shRNA-c가 처리된 세포 그룹에서 염색정도가 낮은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이를 다른 방법으로 확인해 보고자 수행한 MTT assay에서도 crystal violet 실험에서와 유사한 결과가 관찰된 것으로 보아 CD66c의 저발현에 의해 BCSC의 부착능이 현저히 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 7B). 이를 통해 암줄기세포에 shRNA-c를 처리한 결과 CD66c 고유의 기능이 상당히 감소된다는 것을 확인할 수 있었다.

Oxidative stress 조건 하에서 CD66c에 대한 shRNA가 처리된 암줄기세포의 생존능 평가

CD66c의 또 다른 생물학적 세포 내에서의 기능은 바로 apoptosis(세포자살)에 대한 내성을 갖는 것이다. 이는 암세포 및 암줄기세포가 산화조건에서 사멸하는 것을 예방해주는 역할을 하게 되어 치료에 저해가 된다. 따라서 이 CD66c가 발현되지 않는다면 암줄기세포에 어떤 영향이 미치게 되는지를 평가하기 위해 H₂O₂를 처리하여 oxidative stress에 의한 세포내 손상을 초래한 후 CD66c의 기능을 평가해 보았다. 대조군 세포와 shRNA-scramble 및 shRNA-c를 처리한 암줄기세포에 H₂O₂를 처리하여 oxidative condition을 유도한 뒤 유발된 세포사멸 및 사멸 유도기작을 annexin-V와 PI를 이용한 double staining을 통해 FACS로 확인해 보았다(도 8). 그 결과, 대조군 세포나 shRNA-scramble이 처리된 세포에서는 세포사멸이 유도되지 않은데 비해, H₂O₂가 처리된 세포에서는 대조군 세포에 비해 유도된 초기 apoptosis와 necrosis를 통한 증가된 cell death가 유도되었다. 반면에, H₂O₂가 처리된 환경에서의 shRNA-c가 처리된 암줄기세포에서는 초기 apoptoic 세포들의 population 증가와 더불어 세포사멸된 세포가 가장 많은 것으로 평가되었다. 이를 통해, CD66c의 저발현은 oxidative stress에 연계된 세포내 손상이 증가함을 확인할 수 있었으며, BCSC에서의 CD66c의 저발현은 높은 항암치료로 유도된다는 것을 확인할 수 있었다.

<110> KONYANG UNIVERSITY industry-academic cooperation foundation <120> Biomarker for detecting breast cancer stem cell(BCSC) and use thereof <130> 1 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaggctcagc acagaaggag gaaggacagc agggccaaca gtcacagcag ccctgaccag 60 agcattcctg gagctcaagc tcctctacaa agaggtggac agagaagaca gcagagacca 120 tgggaccccc ctcagcccct ccctgcagat tgcatgtccc ctggaaggag gtcctgctca 180 cagcctcact tctaaccttc tggaacccac ccaccactgc caagctcact attgaatcca 240 cgccgttcaa tgtcgcagag gggaaggagg ttcttctact cgcccacaac ctgccccaga 300 atcgtattgg ttacagctgg tacaaaggcg aaagagtgga tggcaacagt ctaattgtag 360 gatatgtaat aggaactcaa caagctaccc cagggcccgc atacagtggt cgagagacaa 420 tataccccaa tgcatccctg ctgatccaga acgtcaccca gaatgacaca ggattctata 480 ccctacaagt cataaagtca gatcttgtga atgaagaagc aaccggacag ttccatgtat 540 acccggagct gcccaagccc tccatctcca gcaacaactc caaccccgtg gaggacaagg 600 atgctgtggc cttcacctgt gaacctgagg ttcagaacac aacctacctg tggtgggtaa 660 atggtcagag cctcccggtc agtcccaggc tgcagctgtc caatggcaac atgaccctca 720 ctctactcag cgtcaaaagg aacgatgcag gatcctatga atgtgaaata cagaacccag 780 cgagtgccaa ccgcagtgac ccagtcaccc tgaatgtcct ctatggccca gatgtcccca 840 ccatttcccc ctcaaaggcc aattaccgtc caggggaaaa tctgaacctc tcctgccacg 900 cagcctctaa cccacctgca cagtactctt ggtttatcaa tgggacgttc cagcaatcca 960 cacaagagct ctttatcccc aacatcactg tgaataatag cggatcctat atgtgccaag 1020 cccataactc agccactggc ctcaatagga ccacagtcac gatgatcaca gtctctggaa 1080 gtgctcctgt cctctcagct gtggccaccg tcggcatcac gattggagtg ctggccaggg 1140 tggctctgat atagcagccc tggtgtattt tcgatatttc aggaagactg gcagattgga 1200 ccagaccctg aattcttcta gctcctccaa tcccatttta tcccatggaa ccactaaaaa 1260 caaggtctgc tctgctcctg aagccctata tgctggagat ggacaactca atgaaaattt 1320 aaagggaaaa ccctcaggcc tgaggtgtgt gccactcaga gacttcacct aactagagac 1380 agtcaaactg caaaccatgg tgagaaattg acgacttcac actatggaca gcttttccca 1440 agatgtcaaa acaagactcc tcatcatgat aaggctctta ccccctttta atttgtcctt 1500 gcttatgcct gcctctttcg cttggcagga tgatgctgtc attagtattt cacaagaagt 1560 agcttcagag ggtaacttaa cagagtgtca gatctatctt gtcaatccca acgttttaca 1620 taaaataaga gatcctttag tgcacccagt gactgacatt agcagcatct ttaacacagc 1680 cgtgtgttca aatgtacagt ggtccttttc agagttggac ttctagactc acctgttctc 1740 actccctgtt ttaattcaac ccagccatgc aatgccaaat aatagaattg ctccctacca 1800 gctgaacagg gaggagtctg tgcagtttct gacacttgtt gttgaacatg gctaaataca 1860 atgggtatcg ctgagactaa gttgtagaaa ttaacaaatg tgctgcttgg ttaaaatggc 1920 tacactcatc tgactcattc tttattctat tttagttggt ttgtatcttg cctaaggtgc 1980 gtagtccaac tcttggtatt accctcctaa tagtcatact agtagtcata ctccctggtg 2040 tagtgtattc tctaaaagct ttaaatgtct gcatgcagcc agccatcaaa tagtgaatgg 2100 tctctctttg gctggaatta caaaactcag agaaatgtgt catcaggaga acatcataac 2160 ccatgaagga taaaagcccc aaatggtggt aactgataat agcactaatg ctttaagatt 2220 tggtcacact ctcacctagg tgagcgcatt gagccagtgg tgctaaatgc tacatactcc 2280 aactgaaatg ttaaggaaga agatagatcc aattaaaaaa aattaaaacc aatttaaaaa 2340 aaaaaagaac acaggagatt ccagtctact tgagttagca taatacagaa gtcccctcta 2400 ctttaacttt tacaaaaaag taacctgaac taatctgatg ttaaccaatg tatttatttc 2460 tgtggttctg tttccttgtt ccaatttgac aaaacccact gttcttgtat tgtattgccc 2520 agggggagct atcactgtac ttgtagagtg gtgctgcttt aattcataaa tcacaaataa 2580 aagccaatta gctctataac t 2601 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6(F) <400> 2 gatcttgtga atgaagaagc aac 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6(R) <400> 3 gtcatgttgc cattggacag 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH(F) <400> 4 agggctgctt ttaactctgg t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH(R) <400> 5 ccccacttga ttttggaggg a 21 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-a <400> 6 atcacagtct ctggaagtgc tcctgtcct 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-b <400> 7 aaggcgaaag agtggatggc aacagtcta 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-c <400> 8 aagaagcaac cggacagttc catgtatac 29

Claims (14)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 서열번호 6 내지 8 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 shRNA를 유효성분으로 포함하는, 유방암 줄기세포(BCSC) 성장 억제용 조성물.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 6 항에 있어서,
   상기 shRNA는 서열번호 8인 것을 특징으로 하는, 유방암 줄기세포(BCSC) 성장 억제용 조성물.
   
10. 삭제
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