CN107893101B - 一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒、方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肿瘤疾病诊断试剂技术领域，具体公开了一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒、方法及应用。所述试剂盒包括肿瘤外泌体的特异性捕获检测系统和分子信标荧光检测系统；其中，所述肿瘤外泌体的特异性捕获检测系统包括肿瘤外泌体特异性配体修饰的四氧化三铁核心的磁性金纳米球复合物溶液和外泌体特异性配体修饰的金纳米笼溶液；所述分子信标荧光检测系统包括带有荧光基团的分子信标探针、带有荧光基团的荧光扩增底物杂交链、缓冲液。本发明的试剂盒及检测方法将肿瘤外泌体的特异性捕获分析和分子信标荧光检测方法结合使用，大大提高了肿瘤早期诊断的精准度与可靠性。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤疾病诊断试剂技术领域，具体涉及一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒、制备和检测方法及应用。
背景技术
目前，很多疾病的诊断依然面临着严峻的挑战。肿瘤是导致病死的主要原因之一，也是目前研究的热点和难点。一般癌症早期，患者症状不明显，难以察觉和检测。而确诊癌症时，往往病情已进展至中晚期，预后均较差，生存期较短。因此，早期发现、及时治疗是有效防治肿瘤疾病的关键所在。
外泌体（exosomes）是直径约为50-150 nm的纳米级囊泡，存在于血液和其他体液中。2015年《Nature》报道胰腺癌患者血清中存在GPC1高表达的源于胰腺癌细胞的外泌体（GPC1+ crExos），其含量与胰腺癌的发生发展密切相关。因此肿瘤细胞分泌的外泌体也可作为癌症诊断的生物标志物，这对外泌体用于癌症早期诊断的研究具有重要的意义。
研究表明肿瘤源性外泌体中异常表达的microRNAs也可以作为一种可靠的生物标志物用于肿瘤的诊断，尤其对肿瘤的早期诊断具有更重要的意义，同时还可以监测肿瘤的发展进程。不同肿瘤具有不同的核酸和蛋白表达模式，通过核酸和蛋白表达谱的分析，将有助于临床上对肿瘤进行诊断、分期及预后的估计。比如miR-122是肝脏特异表达的miRNA，且在肝癌发生的早期就发生显著性变化，同时结合其他相关的标志物，如miR-224，miR-26a，LncSox4，AFP，GPC3蛋白等的分析，将更加有助于临床上对肝癌的准确诊断。然而，常规的microRNAs的检测方法需要昂贵、复杂的仪器，耗时繁琐的样品预处理，高技能的操作人员等。与这些方法相比，具有独特组合性能的分子信标（molecular beacons，MBs）因具有简便、高效、低成本等特点，广泛应用在生物学和医学等多个领域。
目前肿瘤癌症外泌体的特异性捕获及检测仍然较为困难，且费时费力。因此需要寻求一种有效的肿瘤癌症外泌体捕获检测试剂盒。
发明内容
本发明提供的一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒、方法及应用，是一种将分子信标荧光检测系统与外泌体捕获系统相结合的检测技术，可以特异性的捕获癌症外泌体，在癌症早期诊断治疗中有较好的应用前景。
本发明的第一个目的是提供一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒，所述试剂盒包括肿瘤外泌体的特异性捕获检测系统和分子信标荧光检测系统；所述肿瘤外泌体的特异性捕获检测系统包括磁性金纳米球复合物溶液和金纳米笼溶液，其中所述磁性金纳米球复合物溶液是肿瘤外泌体特异性配体修饰的四氧化三铁核心的磁性金纳米球复合物溶液，所述金纳米笼溶液是经DTNB、外泌体特异性配体两种物质修饰的金纳米笼溶液；
所述分子信标荧光检测系统包括带有荧光基团的分子信标探针、带有荧光基团的荧光扩增底物杂交链、缓冲液，所述分子信标探针是将带有荧光基团的分子信标寡核苷酸序列与磁性金纳米球结合后制成的，其中，分子信标寡核苷酸序列为能够与靶分子结合的稳定型发夹结构，所述磁性金纳米球由NaCl溶液、(NH4)2Fe(SO4)2•6H2O溶液、HAuCl4水溶液、柠檬酸钠水溶液和H2O2溶液制备而成；所述荧光扩增底物杂交链包括杂交链H和H’，其中杂交链H的5’端与分子信标寡核苷酸序列的5’端序列互补，杂交链H的3’端与杂交链H’的3’端互补，杂交链H’的5’端与杂交链H的5’端互补。
本发明的第二个目的是提供一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备肿瘤外泌体的特异性捕获系统，包括肿瘤外泌体特异性配体修饰的四氧化三铁核心的磁性金纳米球复合物溶液和外泌体特异性配体修饰的金纳米笼溶液：
S11，制备磁性金纳米球
S111，向40-80℃、pH 7-9、0.2-1 nM的NaCl溶液中，加入11-14 mM的(NH4)2Fe(SO4)2•6H2O溶液5-10 mL，搅拌；然后再加入4.17×10-2-4.17 mM H2O2溶液，并使溶液中H2O2与Fe2+的摩尔比为1:1-8；继续加入(NH4)2Fe(SO4)2•6H2O，调控Fe3O4纳米粒的粒径至5-100nm，控制老化时间为3-5 h，8000-10000 g离心10-20 min，即得四氧化三铁，用超纯水将四氧化三铁复溶分散，得到四氧化三铁溶液，备用；
S112，制备磁性金纳米球
将质量分数为0.005-0.5%的HAuCl4水溶液与S111制备的四氧化三铁溶液混合加热至沸腾，搅拌的同时加入质量分数为1%的柠檬酸钠水溶液，HAuCl4水溶液与柠檬酸钠水溶液的体积比例为50:1-4，溶液变为酒红色时，在沸腾条件下反应10-15 min后停止加热，继续搅拌15-20 min，溶液在室温下冷却，将得到的磁性金纳米球溶液用滤膜过滤，磁性分离出磁性金纳米球；
S12，制备肿瘤外泌体特异性配体修饰的四氧化三铁核心的磁性金纳米球复合物溶液
使用活化剂对S11制备的磁性金纳米球进行活化，将肿瘤外泌体特异性配体加入到活化后的磁性金纳米球中，反应2 h，透析处理24 h，即得肿瘤外泌体特异性配体修饰的四氧化三铁核心的磁性金纳米球复合物溶液；
S13，制备金纳米笼
以银纳米立方为模板，加入0.05 mM的HAuCl4水溶液5-15 mL，制备粒径为10-200nm的中空多孔的金纳米笼；
S14，制备经DTNB、外泌体特异性配体两种物质修饰的金纳米笼溶液
使用十一巯基烷酸对S13制备的金纳米笼进行羧基化，得到羧基化金纳米笼，然后使用活化剂对羧基化金纳米笼进行活化，将外泌体特异性配体加入到活化后的金纳米笼溶液中，反应2 h，透析处理24 h，即得修饰的金纳米笼溶液；将10-40μL 10 mM的DTNB加入到1-10 mL的修饰的金纳米笼溶液中，室温搅拌2 h，得到经DTNB、外泌体特异性配体两种物质修饰的金纳米笼溶液；
S2，制备分子信标荧光检测系统，包括带有荧光基团的分子信标探针、带有荧光基团的荧光扩增底物杂交链和缓冲液；
S21，制备带有荧光基团的分子信标探针
S211，设计合成带有荧光基团的分子信标寡核苷酸序列；
筛选用于肿瘤早期诊断的靶分子，靶分子为生物标志物DNA或RNA；
根据上述靶分子的核苷酸序列设计合成分子信标寡核苷酸序列，且分子信标寡核苷酸序列为稳定型发夹结构，分子信标寡核苷酸序列的3’端和5’端茎部序列互补，所述分子信标寡核苷酸序列的通用序列为5’-荧光基团-W-E-O-F-SH-3’；其中，O是发夹结构的环状序列，与靶分子的核苷酸序列互补；F序列为发夹结构的茎部序列，长度为4-8bp，O部分和F部分有共用的序列；E序列包括两部分，一部分序列与3’端F序列互补，构成发夹型结构的茎部，另一部分序列为靠近序列O的一段随机序列，该随机序列根据下一步荧光扩增的需要而设计，该随机序列与O序列的长度之和为F序列的1.9-2.1倍；W为0-8个脱氧核苷酸的随机序列，该随机序列根据下一步荧光扩增的需要而设计，且长度小于F序列的长度；SH为巯基；
S212，制备带有荧光基团的分子信标探针溶液
将S211的分子信标寡核苷酸序列用10 mmol/L的三（2-羧乙基）膦活化后与S112制备的磁性金纳米球进行连接反应，避光反应10-24 h后，通过1-3 mol/L NaCl溶液对上述反应后溶液进行盐化作用，静置老化10-24 h后外加磁场分离弃去上清，将收集的沉淀复溶后得到的带有荧光基团的分子信标探针溶液，分子信标探针简称MBn-MAuNP，其中，n表示有n种类型的分子信标寡核苷酸序列同时连接到磁性金纳米球表面；
S22，设计合成带有荧光基团的荧光扩增底物杂交链
荧光扩增底物杂交链包括H：5’-Z-X-Y-荧光基团-3’和H’：5’-荧光基团-Z’-P-Y’-3’；其中，Z是与分子信标寡核苷酸序列的5’端E和W互补的序列，且Y’与Y序列互补，Z与Z’序列互补，X、P和Y为一段随机序列，Z和Y的序列长度分别≥10 nt，Z和X序列之和、X和Y序列之和均≥30 nt，H和H’均为亚稳定型发夹结构；
S23，缓冲液
采用pH 7.2-7.4的PBS缓冲液，每升PBS缓冲液的配方如下：NaCl 137 mmol，KCl2.7 mmol，Na2HPO4 10 mmol，KH2PO4 2 mmol，双蒸水定容至1L；
或采用pH 7.4的Tris-HCl缓冲液，每升Tris-HCl缓冲液的配方如下：Tris-HCl 20mmol，KCl 5 mmol，MgCl21 mmol，CaCl2 1 mmol，双蒸水定容至1L。
优选的，上述用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒的制备方法中，S112中，磁性金纳米球的粒径为10-500 nm，滤膜的孔径φ为0.22-0.65μm，S12中，磁性金纳米球与肿瘤外泌体特异性配体的质量比为0.05-100:1；S13中，所述金纳米笼的粒径为10-500 nm；S14中，金纳米笼与外泌体特异性配体的质量比为0.05-100:1；S212中，分子信标寡核苷酸序列与磁性金纳米球的投料摩尔比为80-800:1。
优选的，用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒的制备方法，S12和S14中的活化剂相同，所述的活化剂为碳二亚胺、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的一种或任两种的组合；
所述的肿瘤外泌体特异性配体为GPC3单克隆抗体、GPC1单克隆抗体，GPC3多克隆抗体、GPC1多克隆抗体、GPC3的适配体、GPC1的适配体中的一种；
所述的外泌体特异性配体为CD63单克隆抗体、CD81单克隆抗体、CD63多克隆抗体、CD81多克隆抗体、CD63的适配体、CD81的适配体中的一种。
优选的，用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒的制备方法，S211中，所述荧光基团是有机荧光染料或量子点无机荧光染料的任一种，且一种分子信标寡核苷酸序列与其对应的扩增链连接同一种荧光分子；
S212中，与磁性金纳米球连接的分子信标寡核苷酸序列是一种或多种，做成单色或多色分子信标探针MBn-MAuNP，n≥1，荧光信号之间不能相互干扰，多色分子信标探针的所有分子信标寡核苷酸序列同时修饰在同一个磁性金纳米球表面上。
优选的，用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒的制备方法，所述荧光基团为HEX、TET、FITC、Cy3、FAM、cy5、cy5.5、ROX、TexasRed、Alexa dye、PE、JOE中的任一种。
优选的，用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒的制备方法，当用于肝癌疾病早期诊断时，选用的靶分子为miR-122和miR-224，相应的分子信标寡核苷酸序列包括：
MB-224：5’-FAM-CTCGCCCAAGATATATATAACGGAACCACTAGTGA CTTGGG-SH-3’
MB-122：
5’-Cy5-CTCGCTGGAGATTATTATCAAACACCATTGTCACA CTCCAG-SH-3’，
其中，虚线下划线部分为W序列；黑体加粗部分为E序列；曲线下划线部分为发夹结构的茎部序列，靠近3’端的曲线下划线部分为F序列；斜体部分序列为O序列；SH为巯基；Cy5和FAM为荧光基团；
若MB-224、MB-122同时与磁性金纳米球连接制成双色分子信标探针，简称MB2-MAuNP，则荧光扩增底物杂交链包括：
H1：5’-ATATATATCTTGGGCGAGATCAATCAATCAATCAATCAATCACTCGCCCAAG-FAM-3’
H1’：5’-FAM-CTCGCCCAAGATATATATAGTCAGTCAGTCAGTCCTTGGGCGAGTGATTGAT-3’
H2：
5’-ATAATAATCTCCAGCGAGTAGTTAGTTAGTTAGTTAGTTAGTCTCGCTGGAG –Cy5-3’
H2’：
5’-Cy5-CTCGCTGGAGATTATTATGTCAGTCAGTCAGTCACTCCAGCGAGACTAACTA-3’
其中，靶分子为miR-224对应的分子信标寡核苷酸序列MB-224结合的扩增杂交链H1序列中直线下划线为Z序列；曲线下划线序列为Y序列，其余为X序列；H1’链中的曲线下划线为Y’序列，即与H1链中Y序列互补的序列，直线下划线为Z’序列与H1链中Z序列互补，其余序列为P序列；
靶分子为miR-122对应的分子信标寡核苷酸序列MB-122结合的扩增杂交链H2序列中直线下划线为Z序列，曲线下划线序列为Y序列，其余为X序列；H2’链中的曲线下划线为Y’序列，即与H2链中Y序列互补的序列，直线下划线为Z’序列与H2链中Z序列互补，其余序列为P序列；
所述缓冲液为S23所述的Tris-HCl缓冲液或PBS缓冲液。
本发明的第三个目的是提供一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
（1）将肿瘤外泌体的特异性捕获系统中50-200 μL肿瘤外泌体特异性配体修饰的四氧化三铁核心的磁性金纳米球复合物溶液，50-200 μL经DTNB、外泌体特异性配体两种物质修饰的金纳米笼溶液以及100 μL含有肿瘤外泌体的体液混合，得到样品混合物；磁性分离此样品混合物，得到捕获的肿瘤外泌体样本，再将此捕获的肿瘤外泌体样本混合物用拉曼散射光谱仪进行分析，根据分析出的拉曼光谱峰面积计算捕捉到的肿瘤外泌体的量；
（2）将（1）中捕获的肿瘤外泌体样本中提取的靶分子与合成的分子信标探针在缓冲液中混合，避光孵育1-3h，使分子信标探针与靶分子杂交释放荧光信号，得到杂交溶液；
（3）往上述杂交溶液中加入带有荧光基团的荧光扩增底物杂交链，进行荧光信号扩增反应，避光孵育0.5-10h后，利用外加磁场分离弃去杂交链，沉淀洗涤后重悬，测定重悬液的荧光强度，根据荧光强度值计算靶分子的量。
本发明的第四个目的是提供一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒在体液中或体外培养的细胞液中的肿瘤外泌体的捕获、定量检测及生物标志物的可视化分析、抗癌药物制备或者去除血液中特异性外泌体的应用。
本发明的第五个目的是，提供一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒的制备方法在体液中或体外培养的细胞液中的肿瘤外泌体的捕获、定量检测及生物标志物的可视化分析或者去除血液中特异性外泌体的应用。
与现有技术相比，本发明的一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒、方法及应用，具有以下有益效果：
（1）本发明基于表面增强拉曼散射（SERS）原理，利用金纳米笼具有增强拉曼特性，将拉曼分子DTNB、识别外泌体膜标记物外泌体特异性蛋白配体与金纳米笼结合，识别肿瘤外泌体膜表面的特异性标志物肿瘤外泌体特异性蛋白配体与磁性金纳米球结合，二者共同捕获到的外泌体即为肿瘤外泌体。利用金纳米球增强DTNB的拉曼信号，同时结合磁性金纳米球的磁性富集能力，实现了肿瘤外泌体的准确定量及有效分离，大大简化外泌体及其内部miRNA检测的步骤，同时提高检测结果的可靠性。
（2）本发明证明体液中肿瘤外泌体可以作为一种新型肿瘤标志物，区别于传统肿瘤标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，血浆或血清或尿液或胸腔积液或脊髓液或脑髓液或唾液或乳液或关节液或精液或阴道液或羊水等体液；测试对象为人、大鼠、小鼠等哺乳动物。该类肿瘤标志物的成功开发有助于肿瘤的辅助诊断，尤其对其早期诊断具有更重要的意义。
（3）分子信标探针（MBn-MAuNP）的应用包括但不仅限于提取的生物样本中标志物（DNA、RNA、标志蛋白）的定量测定，还可以应用于体外培养的细胞的生物标志物的可视化分析；利用其与靶分子结合发出荧光的特性，可以用于可视化检测靶部位的特定生物标志物的表达，体内可视化研究制剂对靶细胞的靶向作用和细胞的内吞效果；另外分子信标也可以载抗癌药物（如：阿霉素），实现抗癌、荧光成像和核磁共振成像的多重功效。测试样本可以是血液，唾液、尿液等各种体液样本，组织生物样品，体外培养的细胞及细胞培养上清液。生物样本的来源可以是大鼠，小鼠，家兔，人等，包括但不限于哺乳动物，此外，与商业活动有关的任何动物种类也都被包括在内。
通过分子信标恒温级联扩增的荧光检测技术准确测定生物标志物的异常表达水平来诊断人类癌症等疾病是否发生的方法或试剂盒，有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
分子信标探针法对癌症等疾病相关的生物标志物进行分析，并设计带有荧光基团的杂交链用于恒温级联扩增反应，灵敏快速地对低丰度的靶分子进行测定。且此级联恒温扩增反应检测试剂盒及方法，体系复杂性降低，探针序列合成容易，成本较低，分子信标能保持稳定的发夹结构，背景信号极低。靶分子存在时，荧光信号几乎100%恢复。且对靶分子具有较强的特异性。相应的荧光检测方法高效，简便，省时省力，成本低，不需昂贵复杂的仪器设备，不仅能有效快速的分析靶分子的异常表达用于诊断癌症等疾病，还可用于可靠的生物标志物的筛选。
（4）本发明的试剂盒及检测方法将肿瘤外泌体的特异性捕获分析和分子信标荧光检测方法结合使用，大大提高了肿瘤早期诊断的精准度与可靠性。
附图说明
图1是实施例1中肿瘤外泌体中的靶分子miRNAs检测流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下面实例中未注明具体条件的实验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行。
本发明提供的一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒，所述试剂盒包括肿瘤外泌体的特异性捕获检测系统和分子信标荧光检测系统；所述肿瘤外泌体的特异性捕获检测系统包括磁性金纳米球复合物溶液和金纳米笼溶液，其中所述磁性金纳米球复合物溶液是肿瘤外泌体特异性配体修饰的四氧化三铁核心的磁性金纳米球复合物溶液，所述金纳米笼溶液是经DTNB、外泌体特异性配体两种物质修饰的金纳米笼溶液；
所述分子信标荧光检测系统包括带有荧光基团的分子信标探针、带有荧光基团的荧光扩增底物杂交链、缓冲液，所述分子信标探针是将带有荧光基团的分子信标寡核苷酸序列与磁性金纳米球结合后制成的，其中，分子信标寡核苷酸序列为稳定型发夹结构，所述磁性金纳米球由NaCl溶液、(NH4)2Fe(SO4)2•6H2O溶液、HAuCl4水溶液、柠檬酸钠水溶液和H2O2溶液制备而成；所述荧光扩增底物杂交链包括杂交链H和H’，其中杂交链H的5’端与分子信标寡核苷酸序列的5’端序列互补，杂交链H的3’端与杂交链H’的3’端互补，杂交链H’的5’端与杂交链H的5’端互补。
实施例1
下面以肝癌为例，提供一种用于肝癌肿瘤疾病早期诊断的试剂盒的制备方法和利用该试剂盒的检测方法，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
S1，制备肿瘤外泌体的特异性捕获系统，包括肿瘤外泌体特异性配体修饰的四氧化三铁核心的磁性金纳米球复合物溶液和外泌体特异性配体修饰的金纳米笼溶液；本实施例1中，肿瘤外泌体是指GPC3高表达肝癌外泌体GPC3+ crExos；
S11，制备磁性金纳米球
S111，向65℃、pH 8.5的0.2 nM的NaCl溶液中，加入12 mM的(NH4)2Fe(SO4)2•6H2O溶液6 mL，快速搅拌溶液，然后再快速加入新鲜配制的4.17 mM H2O2溶液，并使溶液中H2O2与Fe2+的摩尔比为1:8，通过优化反应条件加入的(NH4)2Fe(SO4)2•6H2O，调控Fe3O4纳米粒的粒径为10 nm。控制老化时间为3 h，然后10000 g离心10 min，除去上清液，即得固体四氧化三铁，然后用超纯水将四氧化三铁复溶分散至10 mL，得到四氧化三铁溶液，4℃保存，备用。
S112，制备磁性金纳米球
将100 μL质量分数为0.01%的HAuCl4（氯金酸）水溶液与100 μL S111制备的四氧化三铁溶液混合加热至沸腾，搅拌的同时加入质量分数为1%的柠檬酸钠水溶液，HAuCl4水溶液与柠檬酸钠水溶液的体积比例为50:1，溶液变为酒红色时，在沸腾条件下反应15 min后停止加热，继续搅拌15 min，溶液在室温下冷却，将得到的磁性金纳米球溶液用0.22 μm滤膜过滤。磁性分离出磁性金纳米球，即可得到粒径均匀的磁性金纳米球MAuNP；
S12，制备肿瘤外泌体特异性配体修饰的四氧化三铁核心的磁性金纳米球复合物溶液；本实施例1中，采用的肿瘤外泌体特异性配体为anti-GPC3（购自Merck-MilliporeMABC667）；
（1）首先将70 μg S11制备的MAuNP溶于100 ml水中，加入活化剂碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）各6 mg，磁力搅拌4 h，7000 r，10 min离心去除副产物，收集的沉淀为活化后的磁性金纳米球，然后将活化后的磁性金纳米球分散在100 ml水中得到磁性金纳米球水分散液。
（2）将100 μg anti-GPC3加入到磁性金纳米球水分散液中，磁性金纳米球与anti-GPC3的质量比为100:1，反应2 h，使用截留分子量为90 KD的透析袋透析处理24 h，即得肿瘤外泌体特异性配体（anti-GPC3）修饰的四氧化三铁核心的磁性金纳米球复合物溶液（透析袋内液体），简写为G-MAuNP。
S13，制备金纳米笼
以银纳米立方为牺牲模板，滴加0.05 mM的HAuCl4水溶液15 ml，刻蚀银纳米立方，紫外监控反应进程，至紫外可见光谱峰达到800 nm，即可制备出粒径为50 nm的中空多孔的金纳米笼（AuNC）；其中银纳米立方的制备方法参考Huang S, Duan S, Wang J, et al.Folic-Acid-Mediated Functionalized Gold Nanocages for Targeted Delivery ofAnti-miR-181b in Combination of Gene Therapy and Photothermal Therapy againstHepatocellular Carcinoma[J]. Advanced Functional Materials, 2016, 26(15):2532-2544。
S14，制备经DTNB（5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸）)、外泌体特异性配体两种物质修饰的金纳米笼溶液；本实施例1中采用给的外泌体特异性配体为anti-CD63（购自Merck-Millipore）；
（1）首先将5 mg十一巯基烷酸与50 μg S13制备的AuNC反应24 h，使金纳米笼表面羧基化，7500 r、10 min离心去除副产物，得到表面羧基化的金纳米笼。使用活化剂EDC（碳二亚胺）和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）对上述制备的羧基化金纳米笼进行活化，加入活化剂EDC和NHS各6 mg，磁力搅拌4 h，7000 r、10 min离心去除副产物，收集的沉淀为活化后的羧基化金纳米笼，然后将活化后的金纳米笼分散在10 ml水中得到金纳米笼水分散液。
（2）将100 μg anti-CD63加入到金纳米笼水分散液中，金纳米笼与anti-CD63体的质量比为100:1，反应2h，使用截留分子量为90 KD的透析处理24h，即得外泌体特异性配体anti-CD63修饰的金纳米笼复合物溶液（透析袋内液体），简写为C-AuNC。
（3）将20 μL 10 mM的DTNB加入到10 mL制备的C-AuNC中，室温磁力搅拌2 h，即可。7000 r、10 min离心去上清，10 mL水分散所得沉淀即可得到经DTNB、外泌体特异性配体anti-CD63两种物质修饰的金纳米笼溶液，简写为C-DAuNC。
S2，制备分子信标荧光检测系统，该分子信标荧光检测系统基于恒温级联扩增反应，包括带有荧光基团的分子信标探针、带有荧光基团的荧光扩增底物杂交链和缓冲液；
S21，设计带有荧光基团的分子信标探针；
S211，设计合成带有荧光基团的分子信标寡核苷酸序列；
筛选用于肝癌早期诊断的相关靶分子miRNA：在众多的miRNA中，miR-122、miR-224与肝癌的发生发展密切相关。我们选用肝癌源外泌体内的miR-122、miR-224作为肝癌早期及分期诊断的生物标志物。具体序列为：
miR-224序列为5’-CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU-3’;
miR-122序列为5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’。
根据用于诊断的上述靶分子设计合成分子信标环部序列，分子信标的具体设计依据网站(www.molecμLar-beacons.org)中分子信标的设计原则来进行，且分子信标寡核苷酸序列为稳定型发夹结构，分子信标寡核苷酸序列的3’和5’端茎部序列互补。通用序列为5’-荧光基团-W-E-O-F-SH-3’；其中，O是发夹结构的环状序列，与靶分子的核苷酸序列互补；F序列为发夹结构的茎部序列，长度为4-8bp，O部分和F部分可有共用的序列；E序列包括两部分，一部分序列与3’端F序列互补，构成发夹型结构的茎部，另一部分序列为靠近序列O的一段随机序列，该随机序列根据下一步荧光扩增的需要而设计，该随机序列与O序列的长度之和为F序列的1.9-2.1倍；W为0-8个脱氧核苷酸的随机序列，该随机序列根据下一步荧光扩增的需要而设计，且长度小于F序列的长度；SH为巯基。针对肝癌源外泌体内的miR-122、miR-224，我们设计的分子信标寡核苷酸序列为：
MB-224：5’-FAM-CTCGCCCAAGATATATATAACGGAACCACTAGTGA CTTGGG-SH-3’
MB-122：
5’-Cy5-CTCGCTGGAGATTATTATCAAACACCATTGTCACA CTCCAG-SH-3’，
其中，虚线下划线部分为W序列；黑体加粗部分为E序列；曲线下划线部分为发夹结构的茎部序列，靠近3’端的曲线下划线部分为F序列；斜体部分序列为O序列；SH为巯基；Cy5和FAM为荧光基团；
上述分子信标序列可采用分子生物学技术进行合成，也可以在DNA合成仪上采用化学合成方式进行合成。
S212，制备茎环结构的带有荧光基团的分子信标探针
向S211的分子信标寡核苷酸序列MB-122和MB-224（两者比例1:1）中加入10 mmol/L的TCEP（三(2-氯乙基)磷酸酯）进行活化，活化后与S11制备的MAuNP进行连接反应，分子信标寡核苷酸序列与MAuNP的投料摩尔比为100:1，避光反应24 h后，通过1mol/L NaCl溶液对上述反应后溶液进行盐化作用，最后通过MAuNP的磁响应性或离心法收集分子信标沉淀，该沉淀即为发夹结构的带有荧光基团的分子信标探针MB2-MauNP；将收集的沉淀用超纯水复溶后得到稳定的带有荧光基团的分子信标探针MB2-MAuNP溶液。
相比于MAuNP，MB2-MAuNP紫外波长均发生了红移，透射电镜图可见表面模糊层，表明分子信标序列成功修饰在磁性金纳米球表面。MB2-MAuNP表面的两种信标序列的数目可以通过巯基乙醇（ME）分离两者的连接，测定荧光的方法确定。
S22，设计合成带有荧光基团的荧光扩增底物杂交链，用于荧光信号级联恒温扩增反应
设计扩增底物杂交链H：5’-Z-X-Y-荧光基团-3’和H’：5’-荧光基团-Z’-P-Y’-3’，并考察荧光信号放大能力；其中，Z是与分子信标序列的5’端E和W互补的序列，且Y’与Y序列互补，Z与Z’序列互补，X和P为一段随机序列，Z和Y的序列长度分别≥10nt，Z和X序列之和、X和Y序列之和均≥30nt，H和H’均为亚稳定型发夹结构；
基于MB-224设计的杂交链为H1和H1’，基于MB-122设计的杂交链为H2和H2’，序列如下：
H1：5’-ATATATATCTTGGGCGAGATCAATCAATCAATCAATCAATCACTCGCCCAAG-FAM-3’
H1’：5’-FAM-CTCGCCCAAGATATATATAGTCAGTCAGTCAGTCCTTGGGCGAGTGATTGAT-3’
H2:
5’-ATAATAATCTCCAGCGAGTAGTTAGTTAGTTAGTTAGTTAGTCTCGCTGGAG–Cy5-3’
H2’:
5’-Cy5-CTCGCTGGAGATTATTATGTCAGTCAGTCAGTCACTCCAGCGAGACTAACTA-3’
其中，靶分子为miR-224对应的分子信标寡核苷酸序列MB-224结合的扩增杂交链H1序列中直线下划线为Z序列（即与MB-224链W和E序列互补的序列），曲线下划线序列为Y序列，其余为X序列，H1’链中的曲线下划线为Y’序列，即与H1链中Y序列互补的序列，直线下划线为Z’序列与H1链中Z序列互补，其余序列为P序列。FAM为荧光基团。
H2与H2’与MB-122对应，原理和以上H1和H1’类似，直线下划线为Z序列（即与MB-224链W和E序列互补的序列），曲线下划线序列为Y序列，其余为X序列，H1’链中的曲线下划线为Y’序列，即与H1链中Y序列互补的序列，直线下划线为Z’序列与H1链中Z序列互补，其余序列为P序列。Cy5为荧光基团。
在此实施例1中，分子信标探针MB-224的发夹结构被靶分子miR-224打开后，H1的5’端与MB-224的5’末端互补配对18对碱基，在之后的循环扩增过程中H1和H1’配对18对碱基。类似的MB-122与H2，H2和H2’分别配对18对碱基。包括但不限于此实施例1的序列设计，符合设计原则即可。
需要说明的是，所述荧光基团是有机荧光染料或量子点无机荧光染料的任一种，且一种分子信标寡核苷酸序列与其对应的扩增链连接同一种荧光分子；与磁性金纳米球连接的分子信标序列是用于检测的一种或多种，即n≥1，可以做成单色或者多色（多靶）分子信标探针，荧光信号之间不能相互干扰，多色分子信标探针对应的所有分子信标寡核苷酸序列同时修饰在同一个磁性金纳米球表面上，从而实现多种标志物（可以是与癌症等疾病相关的外泌体，循环肿瘤细胞及体液和细胞组织中的DNA、RNA、标志蛋白等）的同时检测。
S23，缓冲液的选择
采用pH 7.2-7.4的PBS缓冲液，每升PBS缓冲液的配方如下：NaCl 137 mmol、KCl2.7 mmol、Na2HPO4 10 mmol，KH2PO4 2 mmol，溶剂为双蒸水；
或采用pH 7.4的Tris-HCl缓冲液，每升Tris-HCl缓冲液的配方如下：Tris-HCl 20mmol、KCl 5 mmol、MgCl2 1 mmol、CaCl2 1 mmol，溶剂为双蒸水。
下面以肝癌外泌体的捕获分析为例，说明本发明提供的一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒的检测方法，用以检测肿瘤外泌体及其miRNAs的含量，包括以下步骤：
（1）将肿瘤外泌体的特异性捕获系统中50 μL肿瘤外泌体特异性配体修饰的四氧化三铁核心的磁性金纳米球复合物溶液，50 μL DTNB、外泌体特异性配体修饰的金纳米笼溶液以及含有肿瘤外泌体的100 μL体液混合，得到样品混合物；利用16孔可分离磁力架（深圳市博尔熙科技发展有限公司）磁性分离此样品混合物，得到捕获的肿瘤外泌体样本，再将此捕获的肿瘤外泌体样本用拉曼散射光谱仪进行分析，根据分析出的拉曼光谱峰面积计算捕捉到的肿瘤外泌体的量；
（2）从（1）中捕获的肿瘤外泌体样本中提取RNA样品，得到RNA靶分子；将合成的MB2-MAuNP在PBS缓冲液中稀释至5 nM，然后加入提取的RNA样品，使靶分子与分子信标探针在缓冲液中混合。充分混合后，避光孵育1 h，使MB2-MAuNP与靶分子杂交释放荧光信号，得到杂交溶液；
（3）往上述杂交溶液中加入两端带有荧光分子的杂交链H1和H1’、H2和H2’进行荧光信号扩增反应（其原理如图1所示），避光孵育0.5 h后，利用外加磁场分离除去扩增杂交链，沉淀洗涤后用超纯水重悬，测定重悬液的荧光强度，根据荧光强度值计算确定靶分子miRNAs的量。根据（1）和（3）的值评价肿瘤疾病状况即可。
本发明实施例中磁性分离的步骤均采用16孔可分离磁力架（深圳市博尔熙科技发展有限公司）。
本发明以肝癌外泌体的捕获分析为具体实例，经多次反复试验，均取得了相同的试验效果，具体实例如下：
实验一、肝癌外泌体膜表面GPC3蛋白标志物的确定
分别收集HepG2，7702细胞上清液，超速离心法收集外泌体。然后加入300 μL的裂解液（RIPA:PMSF =100:1）,在冰上裂解30 min（每隔10 min用移液枪混匀一次），12000 r/min、4℃离心15 min取上清液，用BCA蛋白检测试剂盒测定上清液中蛋白浓度，蛋白上样量为30 μg，将蛋白经SDS-PAGE法（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离，电泳条件（80 V 300 mA 40min后换120 V 300 mA 1h），经电转（电转条件：120 V 300 mA 2 h）将蛋白转移到NC膜（硝酸纤维素膜）上，用5%的脱脂牛奶封闭两个小时，分别封GPC3，CD63，内参蛋白的一抗（1:1000）、4℃过夜孵育，第二天用PBST将NC膜洗3次，每次10 min。封二抗（1:10000）室温孵育2h，PBST洗3次，每次10 min。将NC膜上加ECL超敏发光液孵育1 min，暗室曝光。实验重复三次。
结果表明肝癌外泌体富含GPC3、CD63蛋白。
实验二、肝癌外泌体捕获检测系统对皮下肝癌的异种移植裸鼠的早期诊断能力
步骤1．肝癌模型的建立：裸鼠，SPF级，6-7周龄，体重20±2 g。用稳定表达CD63-GFP的人源肝癌细胞系HepG2建立裸鼠皮下肝癌的异种移植瘤模型。
步骤2．肝癌外泌体捕获检测系统测定。设置未种瘤裸鼠为空白对照组，当裸鼠瘤体积达到10 mm3、20 mm3、50 mm3、100 mm3、300 mm3、600 mm3、900 mm3时，裸鼠眼眶取血，静置离心，得到血清。利用本发明提供的一种试剂盒的检测方法对裸鼠血清中的肝癌源外泌体进行捕获，其中，含有肿瘤外泌体的体液为裸鼠血清，测定GPC3高表达外泌体浓度。
实验结果表明GPC3高表达外泌体浓度与肿瘤体积呈正比例关系。GPC3高表达外泌体对于肝癌的早期诊断具有很好的特异性和敏感性。因此，GPC3高表达外泌体作为肝癌诊断标志物具有一定的应用价值。
步骤3. 分子信标荧光检测系统检测分析外泌体中miR-122、miR-224的表达水平与肝肿瘤大小的相关性
步骤3.1 收集步骤2中捕获到的外泌体，按照mirVana™ miRNA Isolation Kit试剂盒说明提取样本总RNA，用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，结果表明OD260/0D280范围在1.8-2.0，说明提取的RNA纯度较高。之后样品冻存于-80℃冰箱中。
步骤3.2 500 μL PBS缓冲液中加入终浓度为2 nM的分子信标（MB2-MAuNC），3 μg的提取的总RNA样品，然后分别加入500 μL的500 nmol/L的杂交链H1和H1’、H2和H2’的PBS缓冲液（比例为1:1：1:1），用于级联扩增。反应液加入96孔黑板中，每孔200 μL，平行设定5个复孔。避光孵育4 h。反应结束后，外加磁场吸附MAuNP，用PBS缓冲液洗涤3次后，每孔加入100 μL的PBS缓冲液重悬，震荡混匀后用Varioskan Flash多功能酶标仪测定荧光强度F。根据绘制的标准曲线计算miR-122和miR-224的含量。
Mann-Whitney法计算空白对照裸鼠，荷瘤裸鼠肿瘤不同大小的miRNA表达水平的显著性差异。P水平，差异倍数等参数均表明miR-122和miR-224在荷瘤裸鼠肿瘤不同大小时期的表达水平均具有显著性差异。ROC曲线得出miR-122和miR-224均具有较高的特异性和敏感度，且miR-122和miR-224联合具有优于单独miRNA的诊断效能。
实验三肝癌外泌体捕获检测系统对肝癌病人的早期诊断能力
本发明从郑州大学第一附属医院收集了肝癌患者和肝脏良性疾病患者的外周血样本（用于研究的样本为同期收集、采样、分装、保存条件均一）。并对其中同医院、同科室随机收集的肝癌病人血清（乙肝-肝硬化-肝癌）和20例同医院与实验组同一时期随机收集的肝脏良性疾病患者的血清进行分析处理。几组受试者一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
利用采用本发明的用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒的检测方法，计算肿瘤外泌体含量，对人血清中的肝癌外泌体进行捕获，并利用外泌体捕获分析方法对人血清中GPC3高表达外泌体的含量进行测定；分子信标探针（MB2-MAuNP）法检测外泌体中miR-122、miR-224的表达水平（方法同步骤3.2）。AFP试剂盒法检测AFP含量作对比。对不同肝癌进程病人血清中的GPC3+ crExos的浓度，miR-122和miR-224含量，AFP含量作ROC曲线，根据AUC、Cut-off值、CI、特异性和敏感性等参数，来评价此肝癌外泌体捕获系统诊断效能。
实验结果表明本检测系统在肝癌发生较早期时可以检测到GPC3高表达肝癌外泌体的含量，可以很好地诊断肝癌的发生。GPC3+ crExos作为新型肿瘤标志物具有很高的敏感性（85%）和特异性（100%），这对肝癌的早期诊断具有很重要的参考价值。多因素Logistic回归分析结果显示miR-122，miR-224的表达水平与肝癌的发生发展具有相关性；miR-122和miR-224在早期肝癌对比健康人和中晚期肝癌对比健康人中均有差异表达；且早期和中晚期肝癌患者的循环外泌体中miR-122和miR-224的表达水平均具有显著性差异。ROC曲线得出miR-122和miR-224单独组及联合组的曲线下面积AUC及特异性和敏感度均高于AFP组，且miR-122和miR-224联合组的曲线下面积AUC及特异性和敏感度均高于单独组。
实验四利用肝癌外泌体捕获系统进行血液透析
取荷瘤裸鼠的血液，肝素化后向其中加入一定量的G-MAuNP纳米复合物，于37℃水浴恒温振荡器中进行吸附。利用外加磁场，将吸附的外泌体进行富集，分离。用0.05mol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液处理吸附有外泌体的G-MAuNP，通过外加磁场分离得到纯化的G-MAuNP，进行循环使用，以达到净化血液中外泌体的目的。
本发明提供的肝癌外泌体特异性捕获检测系统一方面能特异性的识别捕获肝癌外泌体，利用金纳米材料的散射特性高灵敏地检测和定量肝癌外泌体。另一方面磁性金纳米球的磁响应性又能分离富集捕获的肝癌外泌体。同时，分子信标恒温级联扩增荧光检测方法能更为便捷、高效、灵敏、成本低，方便实际应用的使用和推广。而且，此捕获系统也可通过用于血液透析等去除特异外泌体，达到干预肝癌的发生发展的目的。因此，本发明提供的肝癌外泌体特异性捕获检测系统对肝癌早期诊断及干预治疗的研究提供了新的研究思路。
需要说明的是，所述的活化剂为碳二亚胺、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的一种或任两种的组合；所述的肿瘤外泌体特异性配体为GPC3单克隆抗体、GPC1单克隆抗体，GPC3多克隆抗体、GPC1多克隆抗体、GPC3的适配体、GPC1的适配体中的一种；所述的外泌体特异性配体为CD63单克隆抗体、CD81单克隆抗体、CD63多克隆抗体、CD81多克隆抗体、CD63的适配体、CD81的适配体中的一种。本发明中所述荧光基团为HEX、TET、FITC、Cy3、FAM、cy5、cy5.5、ROX、TexasRed、Alexa dye、PE、JOE中的任一种。另外，本发明中涉及数值范围的，应当理解为该数值范围内任意数值均可实现相应的技术效果，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例，尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一种用于肝癌疾病早期诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括肿瘤外泌体的特异性捕获检测系统和分子信标荧光检测系统；所述肿瘤外泌体的特异性捕获检测系统包括磁性金纳米球复合物溶液和金纳米笼溶液，其中所述磁性金纳米球复合物溶液是肿瘤外泌体特异性配体修饰的四氧化三铁核心的磁性金纳米球复合物溶液，所述金纳米笼溶液是经DTNB、外泌体特异性配体两种物质修饰的金纳米笼溶液；
所述分子信标荧光检测系统包括带有荧光基团的分子信标探针、带有荧光基团的荧光扩增底物杂交链、缓冲液，所述分子信标探针是将带有荧光基团的分子信标寡核苷酸序列与磁性金纳米球结合后制成的，其中，分子信标寡核苷酸序列为能够与靶分子结合的稳定型发夹结构，所述磁性金纳米球由NaCl溶液、(NH4)2Fe(SO4)2•6H2O溶液、HAuCl4水溶液、柠檬酸钠水溶液和H2O2溶液制备而成；所述荧光扩增底物杂交链包括杂交链H和H’，其中杂交链H的5’端与分子信标寡核苷酸序列的5’端序列互补，杂交链H的3’端与杂交链H’的3’端互补，杂交链H’的5’端与杂交链H的5’端互补；
分子信标荧光检测系统的制备步骤包括制备带有荧光基团的分子信标探针和制备带有荧光基团的荧光扩增底物杂交链；
所述分子信标探针包括：
基于miR-224靶分子的MB-224：
5’-FAM-CTCGCCCAAGATATATATAACGGAACCACTAGTGACTTGGG-SH-3’
基于miR-122靶分子的MB-122：
5’-Cy5-CTCGCTGGAGATTATTATCAAACACCATTGTCACACTCCAG-SH-3’，
MB-224和MB-122中，SH为巯基；Cy5和FAM为荧光基团；
基于MB-224和MB-122的荧光扩增底物杂交链包括：
H1：
5’-ATATATATCTTGGGCGAGATCAATCAATCAATCAATCAATCACTCGCCCAAG-FAM-3’
H1’：
5’-FAM-CTCGCCCAAGATATATATAGTCAGTCAGTCAGTCCTTGGGCGAGTGATTGAT-3’
H2：
5’-ATAATAATCTCCAGCGAGTAGTTAGTTAGTTAGTTAGTTAGTCTCGCTGGAG –Cy5-3’
H2’：
5’-Cy5-CTCGCTGGAGATTATTATGTCAGTCAGTCAGTCACTCCAGCGAGACTAACTA-3’。
2.根据权利要求1所述的用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，制备肿瘤外泌体的特异性捕获系统，包括肿瘤外泌体特异性配体修饰的四氧化三铁核心的磁性金纳米球复合物溶液和外泌体特异性配体修饰的金纳米笼溶液：
S11，制备磁性金纳米球
S111，向40-80℃、pH 7-9、0.2-1 nM的NaCl溶液中，加入11-14 mM的(NH4)2Fe(SO4)2•6H2O溶液5-10 mL，搅拌；然后再加入4.17×10-2-4.17 mM H2O2溶液，并使溶液中H2O2与Fe2+的摩尔比为1:1-8；继续加入(NH4)2Fe(SO4)2•6H2O，调控Fe3O4纳米粒的粒径至5-100 nm，控制老化时间为3-5 h，8000-10000 g离心10-20 min，即得四氧化三铁，用超纯水将四氧化三铁复溶分散，得到四氧化三铁溶液，备用；
S112，制备磁性金纳米球
将质量分数为0.005-0.5%的HAuCl4水溶液与S111制备的四氧化三铁溶液混合加热至沸腾，搅拌的同时加入质量分数为1%的柠檬酸钠水溶液，HAuCl4水溶液与柠檬酸钠水溶液的体积比例为50:1-4，溶液变为酒红色时，在沸腾条件下反应10-15 min后停止加热，继续搅拌15-20 min，溶液在室温下冷却，将得到的磁性金纳米球溶液用滤膜过滤，磁性分离出磁性金纳米球；
S12，制备肿瘤外泌体特异性配体修饰的四氧化三铁核心的磁性金纳米球复合物溶液
使用活化剂对S11制备的磁性金纳米球进行活化，将肿瘤外泌体特异性配体加入到活化后的磁性金纳米球中，反应2 h，透析处理24 h，即得肿瘤外泌体特异性配体修饰的四氧化三铁核心的磁性金纳米球复合物溶液；
S13，制备金纳米笼
以银纳米立方为模板，加入0.05 mM的HAuCl4水溶液5-15 mL，制备粒径为10-200 nm的中空多孔的金纳米笼；
S14，制备经DTNB、外泌体特异性配体两种物质修饰的金纳米笼溶液
使用十一巯基烷酸对S13制备的金纳米笼进行羧基化，得到羧基化金纳米笼，然后使用活化剂对羧基化金纳米笼进行活化，将外泌体特异性配体加入到活化后的金纳米笼溶液中，反应2 h，透析处理24 h，即得修饰的金纳米笼溶液；将10-40μL 10 mM的DTNB加入到1-10 mL的修饰的金纳米笼溶液中，室温搅拌2 h，得到经DTNB、外泌体特异性配体两种物质修饰的金纳米笼溶液；
S2，制备分子信标荧光检测系统，包括带有荧光基团的分子信标探针、带有荧光基团的荧光扩增底物杂交链和缓冲液；
S21，制备带有荧光基团的分子信标探针
S211，设计合成带有荧光基团的分子信标寡核苷酸序列；
S212，制备带有荧光基团的分子信标探针溶液
将S211的分子信标寡核苷酸序列用10 mmol/L的三（2-羧乙基）膦活化后与S112制备的磁性金纳米球进行连接反应，避光反应10-24 h后，通过1-3 mol/L NaCl溶液对上述反应后溶液进行盐化作用，静置老化10-24 h后外加磁场分离弃去上清，将收集的沉淀复溶后得到的带有荧光基团的分子信标探针溶液，分子信标探针简称MBn-MAuNP，其中，n表示有n种类型的分子信标寡核苷酸序列同时连接到磁性金纳米球表面；
S22，设计合成带有荧光基团的荧光扩增底物杂交链
S23，缓冲液
采用pH 7.2-7.4的PBS缓冲液，每升PBS缓冲液的配方如下：NaCl 137 mmol，KCl 2.7mmol，Na2HPO4 10 mmol，KH2PO4 2 mmol，双蒸水定容至1L；
或采用pH 7.4的Tris-HCl缓冲液，每升Tris-HCl缓冲液的配方如下：Tris-HCl 20mmol，KCl 5 mmol，MgCl21 mmol，CaCl2 1 mmol，双蒸水定容至1L。
3.根据权利要求2所述的用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒的制备方法，其特征在于，S112中，磁性金纳米球的粒径为10-500 nm，滤膜的孔径φ为0.22-0.65μm，S12中，磁性金纳米球与肿瘤外泌体特异性配体的质量比为0.05-100:1；S13中，所述金纳米笼的粒径为10-500 nm；S14中，金纳米笼与外泌体特异性配体的质量比为0.05-100:1；S212中，分子信标寡核苷酸序列与磁性金纳米球的投料摩尔比为80-800:1。
4.根据权利要求2所述的用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒的制备方法，其特征在于，S12和S14中的活化剂相同，所述的活化剂为碳二亚胺、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的一种或任两种的组合；
所述的肿瘤外泌体特异性配体为GPC3单克隆抗体、GPC1单克隆抗体，GPC3多克隆抗体、GPC1多克隆抗体、GPC3的适配体、GPC1的适配体中的一种；
所述的外泌体特异性配体为CD63单克隆抗体、CD81单克隆抗体、CD63多克隆抗体、CD81多克隆抗体、CD63的适配体、CD81的适配体中的一种。
5.根据权利要求2所述的用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒的制备方法，其特征在于，S212中，与磁性金纳米球连接的分子信标寡核苷酸序列是一种或多种，做成单色或多色分子信标探针MBn-MAuNP，n≥1，荧光信号之间不能相互干扰，多色分子信标探针的所有分子信标寡核苷酸序列同时修饰在同一个磁性金纳米球表面上。
6.根据权利要求2所述的用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为S23所述的Tris-HCl缓冲液或PBS缓冲液。
7.根据权利要求1所述的用于肝癌疾病早期诊断的试剂盒在制备体液或体外培养的细胞液中肿瘤外泌体的捕获剂、定量检测剂及生物标志物的分析剂或者血液中特异性外泌体去除剂的应用。
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