CN112501173B - 一种gpc1 dna适配体及其应用 - Google Patents

一种gpc1 dna适配体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112501173B
CN112501173B CN202011238509.1A CN202011238509A CN112501173B CN 112501173 B CN112501173 B CN 112501173B CN 202011238509 A CN202011238509 A CN 202011238509A CN 112501173 B CN112501173 B CN 112501173B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gpc1
aptamer
sequence
dna
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011238509.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112501173A (zh
Inventor
段维
张佩琢
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deakin University
Suzhou Genepharma Co ltd
Original Assignee
Deakin University
Suzhou Genepharma Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deakin University, Suzhou Genepharma Co ltd filed Critical Deakin University
Priority to CN202011238509.1A priority Critical patent/CN112501173B/zh
Priority to PCT/CN2020/130517 priority patent/WO2022095141A1/zh
Publication of CN112501173A publication Critical patent/CN112501173A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112501173B publication Critical patent/CN112501173B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种GPC1 DNA适配体及其应用。本发明使用SELEX方法，进行严格的分子改照工程、筛选和深入表征，开发了针对经典外泌体生物标记物CD81和胰腺癌特异性生物标记GPC1的DNA分子作为适配体，并验证了该适配体特异结合GPC1蛋白，在此适配体的基础上建立了一个基于CD81适配体的外泌体检测系统，用于检测GPC1阳性外泌体，可成功检测出源自胰腺癌细胞的GPC1阳性外泌体。

Description

一种GPC1 DNA适配体及其应用
技术领域
本发明涉及一种GPC1 DNA适配体及其应用。
背景技术
Glypican-1(GPC1,磷脂酰基醇蛋白聚糖-1抗原)是一种膜锚定蛋白，在胰腺癌和乳腺癌中高表达。有研究人员发现，GPC1对于胰腺导管腺癌(PDAC)的早期检测至关重要。他们发现，随着肿瘤负荷的增加，循环系统中GPC1阳性外泌体的水平也随之增加。通过检测胰腺导管腺癌患者血液样本，可以在肿瘤恶变之前的早期PDAC中检测到高水平的GPC1阳性外泌体。此外，胰腺癌患者的生存率随着GPC1阳性外泌体群体的减少而提升，这表明GPC1阳性外泌体可以作为胰腺癌患者的预后指标(Nature.2015Jul 9；523(7559):177-82.)。不幸的是，有70-89％的胰腺癌患者在被诊断时胰腺癌已发展到晚期(IIb，III和IV)，而只有11-30％的患者在胰腺癌被发现时其胰腺癌尚为早期(I，IIa)。虽然使用超速离心分离外泌体是在科研时最常用的方法，但此方法无法应用在临床检验中用作筛选方法。
当前用于胰腺癌诊断的方法灵敏度和特异性不高。早期成功检测循环系统中的GPC1阳性外泌体生物标记物用于胰腺癌的诊断已引起人们的关注。近来有详尽的研究表明，循环系统中的GPC1阳性外泌体可能是临床环境中进行下一代诊断的突破性工具。因此，从癌症患者体液中检测GPC1阳性外泌体可能是早期诊断胰腺癌的一种有吸引力的方法。
与传统抗体相比，适配体已经成为一种独特而有效的诊断工具。与抗体相比，它们具有更好的检测敏感性，它们比常规抗体小25倍。故与抗体比较，核酸适配体具有大大降低了空间位阻击的优越性。正因如此，核酸适配体更容易进入肿瘤细胞，且在反应体系中有更大的随机扩散的能力。在对应于一个抗体所占的面积上，5-15个核酸适配体可以轻易地结合上去。基于适配体的癌症诊断方法非常灵敏，只需要少量靶标就能产生信号。基于其高稳定性，亲和力，易于化学操作的独特特征，已开发出不同类型的适配体。与靶标结合后，适配体会改变其构象，该特性也已被用于开发基于适配体的传感器来检测任何特定靶标。适配体的另一个吸引人的特征是对于适配体的筛选，不需要进行动物实验。因此，适配体可以非常经济地合成。有时因为合成过程确实非常昂贵且繁琐，导致无法获得针对所有癌症标志物的抗体，相反，可以以比较便宜的方式开发针对任何癌症生物标志物的适配体，这使其成为癌症诊断的诱人手段。由于适配体具有所有这些吸引人的特征，因此在申请人的研究中，申请人专注于基于适配体的液体活检癌检测系统，随后，申请人开发了针对胰腺癌特异性GPC1标记的适配体，以检测不同生物体液中的GPC1阳性外泌体。
在早期癌症的诊断中适配体-外泌体为基础的液体活检引起了极大的关注，因此它正在协助患者获得适当的治疗。癌细胞衍生的外泌体包含大量的癌症特异性标志物、蛋白质和核酸。基于外泌体的液体活检法已经取得了巨大的成功。最近，在2019年6月，FDA批准了首个基于外泌体的液体活检产品(ExoDx Prostate IntelliScore test)。针对这种基于血液的癌症诊断的研究和利用外泌体生物学的开发工作，并最终为癌症诊断和治疗打开新的窗口。因此，严格而谨慎的基于适配体-外泌体的检测系统将有助于早期诊断不同类型的癌症。早期诊断癌症对于实施有效精准治疗并随后提高癌症患者的生存率至关重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何开发一种新颖且有效的基于适配体-外泌体的液体活检方法，用于早期检测癌症。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种DNA分子(适配体)，所述DNA分子是如下A1-A40中任一种的单链DNA：
A1核苷酸序列为序列28的单链DNA；
A2核苷酸序列为序列25的单链DNA；
A3核苷酸序列为序列26的单链DNA；
A4核苷酸序列为序列27的单链DNA；
A5核苷酸序列为序列29的单链DNA；
A6核苷酸序列为序列30的单链DNA；
A7核苷酸序列为序列31的单链DNA；
A8核苷酸序列为序列32的单链DNA；
A9核苷酸序列为序列33的单链DNA；
A10核苷酸序列为序列34的单链DNA；
A11核苷酸序列为序列35的单链DNA；
A12核苷酸序列为序列36的单链DNA；
A13核苷酸序列为序列37的单链DNA；
A14核苷酸序列为序列38的单链DNA；
A15核苷酸序列为序列39的单链DNA；
A16核苷酸序列为序列40的单链DNA；
A17核苷酸序列为序列1的单链DNA；
A18核苷酸序列为序列2的单链DNA；
A19核苷酸序列为序列3的单链DNA；
A20核苷酸序列为序列4的单链DNA；
A21核苷酸序列为序列5的单链DNA；
A22核苷酸序列为序列6的单链DNA；
A23核苷酸序列为序列7的单链DNA；
A24核苷酸序列为序列8的单链DNA；
A25核苷酸序列为序列9的单链DNA；
A26核苷酸序列为序列10的单链DNA；
A27核苷酸序列为序列11的单链DNA；
A28核苷酸序列为序列12的单链DNA；
A29核苷酸序列为序列13的单链DNA；
A30核苷酸序列为序列14的单链DNA；
A31核苷酸序列为序列15的单链DNA；
A32核苷酸序列为序列16的单链DNA；
A33核苷酸序列为序列17的单链DNA；
A34核苷酸序列为序列18的单链DNA；
A35核苷酸序列为序列19的单链DNA；
A36核苷酸序列为序列20的单链DNA；
A37核苷酸序列为序列21的单链DNA；
A38核苷酸序列为序列22的单链DNA；
A39核苷酸序列为序列23的单链DNA；
A40核苷酸序列为序列24的单链DNA。
所述DNA分子为与GPC1蛋白质特异结合的化合物。
所述DNA分子优选为核苷酸序列为序列25、序列26、序列27、序列28、序列29、序列30、序列31、序列32、序列33、序列34、序列35、序列36、序列37、序列38、序列39、序列40中任一种的单链DNA。所述DNA分子更优选为核苷酸序列为序列25、序列26、序列27、序列28、序列29、序列30、序列31、序列32、序列33、序列34中任一种的单链DNA。最优选为核苷酸序列为序列28的单链DNA。
本发明还提供了一种探针，所述探针为上述DNA分子被标记物标记得到的物质。
所述标记物指可用于提供可检测的(优选可定量的)效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32P；共轭偶连基团，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(DIG)；化学发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、量子点，电化学，X射线衍射或吸收、磁性、免疫酶标反应，基于滤纸的免疫测定，亲和沉淀，亲和色谱法，酶活性，显微投射或扫描成像，超分辨力成像，细胞示踪，动物或人体的活体纳米颗粒追踪示踪成像，纳米流式，可调电阻脉冲感应，荧光相关光谱表面等离子体共振，荧光偏振，表面增强拉曼光谱，电化学感应，微流体或微流控，芯片分析，蛋白质组学，基因组学，代谢组学，微生物组学，RNA(mRNA,lnRNA,snRNA),miRNA等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可按需选定，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。所述标记物还可用于靶向给药。
在一些实施方式中，所述标记是荧光团、比色标记、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子(如用于拉曼衍射成像的炔烃基团，用于click反应的环烯烃，用于聚合物标记的引发基团)，也可以选自多肽/蛋白分子，LNA/PNA，非天然氨基酸及其类似物(比如拟肽)，非天然核酸及其类似物(拟核苷酸)和纳米结构(包括无机纳米颗粒，NV-center，聚集/组装诱导发光分子，稀土离子配体分子，多金属氧簇等)。
在一些实施方式中，所述荧光团可选自荧光素类染料、罗丹明类染料以及菁染料。
在一些实施方式中，所述荧光素类染料包括标准荧光素及其衍生物，如异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、cy5、cy3、Quasar 670、Alexa Fluor488/647等。
在一些实施方式中，所述罗丹明类染料包括R101、四乙基罗丹明(RB200)和羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等。
在一些实施方式中，所述菁染料主要选自两类，一类是噻唑橙(thiazole orange,TO)、噁唑橙(oxazole orange,YO)系列及其二聚体染料，另一类是多甲川系列菁染料。
在一些实施方式中，荧光团还可以选择下述染料：二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芘类等。
荧光团通常标记在探针序列的5'端，但通过改变修饰键(例如-OH或-NH键)也可以将其置于3'端。
为了解决以上技术问题，本发明还提供含有所述DNA分子或含有所述探针的传感器。
本发明还提供一种胰腺癌和/或乳腺癌和/或前列腺癌和/或结直肠癌和/或脑胶质瘤等癌症的诊断试剂，含有所述DNA分子。
上述胰腺癌和/或乳腺癌和/或前列腺癌和/或结直肠癌和/或脑胶质瘤等癌症的诊断试剂除含有所述DNA分子外，还可含有其它可诊断胰腺癌和/或乳腺癌和/或前列腺癌和/或结直肠癌和/或脑胶质瘤等癌症的物质。
上述胰腺癌和/或乳腺癌和/或前列腺癌和/或结直肠癌和/或脑胶质瘤等癌症的诊断试剂还含有与CD81特异结合的物质。
所述与CD81特异结合的物质可为与CD81特异结合的适配体或与CD81特异结合的适配体共轭的磁珠。
所述与CD81特异结合的适配体为核苷酸序列为序列41的单链DNA(5'-CATTTGACCATCCGGGTCTATG-3')。
所述与CD81特异结合的物质可为抗适配体CD81的抗体或与抗CD81的抗体共轭的磁珠。
本发明还提供一种用于检测外泌体GPC1蛋白质的试剂，所述试剂含有所述DNA分子和与CD81特异结合的物质。
所述与CD81特异结合的物质可为与CD81特异结合的适配体或与CD81特异结合的适配体共轭的磁珠。
所述与CD81特异结合的适配体可为CD81-2J-6适配体。
所述与CD81特异结合的物质可为抗CD81的抗体或与抗CD81的抗体共轭的磁珠。
本发明还提供所述DNA分子在作为GPC1蛋白质的适配体中的应用。
所述应用具体可为如下A1和/或A2：
A1、所述DNA分子在制备胰腺癌和/或乳腺癌和/或前列腺癌和/或结直肠癌和/或脑胶质瘤等癌症的诊断试剂中的应用；
A2、所述DNA分子在制备检测GPC1阳性外泌体试剂中的应用。
上述应用中，A2所述GPC1阳性外泌体可为体液中的GPC1阳性外泌体。
所述GPC1蛋白质可来源于哺乳动物，如人。
本发明中使用指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，SELEX)方法开发了针对经典外泌体生物标记CD81和胰腺癌特异性生物标记GPC1的DNA分子作为适配体：选择具有高结合亲和力和特异性的潜在GPC1适配体，进行严格的工程筛选和深入表征，得到了适配体的DNA分子。接下来，申请人建立了一个基于CD81适配体共轭磁珠的系统，以捕获细胞培养上清液中的外泌体。最后，申请人开发了一种有效的CD81适配体介导的外泌体检测系统，可成功检测出源自胰腺癌细胞的GPC1阳性外泌体。
附图说明
图1为实施例中所采用的分别用蛋白质的为靶标和用活细胞为靶标的二个不同但紧扣衔接的用于筛选GPC1核酸配适体的指数富集的配体系统进化技术示意图。
图2为实施例1中每一轮指数富集的配体系统进化(SELEX)结束时回收的结合靶DNA的PCR最佳循环数确定实验结果图。其中，图2中的A为琼脂糖凝胶电泳图，n为循环数；图2中的B为对凝胶电泳结果的DNA库的相对扩增程度的分析见图，所示数据为平均值±标准差，重复数为3，***表示显著性分析结果为P≤0.001。
图3为实施例1中以尿素-dPAGE分离目标单链DNA序列的流程和结果图片。图3中的左图为以不对称PCR扩增目标适配体的流程图，其中，dPAGE是指含8M尿素-12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；图3中的右图为分离目标单链DNA序列的尿素-dPAGE凝胶在蓝光下成像图，图中100核苷酸的那条DNA带为编码链或者反义链,下面那条80核苷酸的带是正义链，那些非常淡的DNA是非特异放大产物，图下方显示下游引物(40nt)以及上游引物(20nt)的电泳迁移位置。
图4为实施例1中确认链霉亲和素包被的微孔板对人GPC1蛋白的捕获能力，使用生物素标记的抗6X组氨酸抗体包被的板成功捕获用组氨酸表位标记的人GPC1蛋白的过程示意图。
图5为实施例1中确认链霉亲和素包被的微孔板对人GPC1蛋白的捕获能力，通过蛋白质印迹法分析了使用生物素标记的抗6X组氨酸抗体包被的板与组氨酸表位标记的人GPC1蛋白的结合能力结果图。
图6为实施例1中文库在指数富集的配体系统进化(SELEX)适配体对人GPC1蛋白的结合能力测定的流程和结果图。图6中的左图为如何检测用荧光素标记的随机DNA文库在指数富集的配体系统进化过程中检测与组氨酸表位标记的人GPC1蛋白结合的核酸配适体的逐步富集的实验过程示意图。图6中的右图为基于SELEX过程中富集与组氨酸表位标记的人GPC1蛋白结合的核酸配适体的测定结果，其中，空白对照为不加生物素标记的抗组氨酸抗体，不加GPC1重组蛋白及DNA配适体；抗体对照为不加DNA配适体，第0轮中配适体为用于指数富集的配体系统进化实验起始时未经富集的荧光素标记的随机DNA文库，第5轮中加的配适体为经过SELEX 5轮富集后的DNA配适体池，第6轮中加的配适体为经过SELEX 6轮富集后的DNA配适体池。配适体的折叠程序如下：在含2.5nM氯化镁的磷酸缓冲液中95℃5分钟，0℃5分钟，37℃15分钟。所示数据表示为平均值±标准差，重复数为3，*表示显著性分析结果为P≤0.05。
图7为实施例1中检测重组人GPC1蛋白在HEK293T细胞中的过表达示意图。图7中A为GPC1过表达质粒的结构图，其中，开放读码框(为GPC1的蛋白编码互补DNA，其长度为1722bp，pCMV3表达质粒载体的长度为6164bp。图7中B为对GPC1过表达质粒分别进行单(HindⅢ或XbaⅠ)和双(HindⅢ和XbaⅠ)限制性内切酶切得到的表达质粒DNA切开后的电泳图，其中，左边的是1kb DNA片断作为尺寸标准。图7中C为以抗抗组氨酸(6X His)抗体抗体对GPC1过表达质粒转染后的HEK293T细胞裂解液进行蛋白质印迹分析的结果图，以未转染的野生型HEK293T裂解液为对照。图7中D为用流式细胞仪对野生型HEK293T及GPC1过表达质粒转染后的HEK29T3细胞表面GPC1蛋白量的检测的半定量实验结果，所示数据表示为平均值±标准差，重复数为3，****表示显著性分析结果为P≤0.0001。
图8为实施例1中与GPC1蛋白结合核酸配适体池富集的检测。图8中A为在用细胞为靶标的指数富集的配适体系统进化实验中用流式细胞仪来检测核酸配适体与细胞表面GPC1结合的实验原理图。图8中B为实施例1中针对用细胞为靶标的指数富集的配适体系统进化实验第11轮中流式细胞术检测经富集的核酸配适体池与野生型HEK293T结合或与GPC1过表达细胞结合的分析结果图。其中，不加荧光素标记的抗GPC1核酸配适体作为别藻青蛋白标记的抗荧光素抗体(200nM)的背景对照，流式细胞术检测每个样品用了50万个细胞。所示数据表示为平均值±标准差，重复数为3，****表示显著性分析结果为P≤0.0001。
图9为最终富集适配体池的二代测序分析用细胞为靶标的指数富集的配适体系统进化实验中对最终富集的适配体池进行二代测序分析的流程图。在此过程里，核酸配适体在整个二代测序池中必须达到50个以上拷贝的才被收入。
图10为实施例1中用细胞为靶标的指数富集的配适体系统进化实验中的最终富集适配体池二代测序分析中正义链、反义链及所有链的原始重复次数的柱状图。
图11为实施例1中GPC1适配体的筛选和进一步改造的流程图。GPC1-17，GPC1-24，GPC1-35是从指数富集的配体系统进化实验中的15个克隆中选拔出来的。在第一轮中，GPC1-17是从原始的第17系列中选出，而GPC35-A是从原始的第35系列中选出,在第二轮中，选出GPC1-17A1和GPC1-35A1.最后改造优化后得到的是GPC1-17A-1d。
图12为实施例1中具有代表性的全长GPC1适配体的二级结构，其中的二级结构涵盖GPC1-1、GPC1-2、GPC1-3、GPC1-7、GPC1-10、GPC1-12、GPC1-15、GPC1-17、GPC1-22、GPC1-23、GPC1-24、GPC1-25、GPC1-35、GPC1-100和GPC1-300。二级结构是采用Mfold生成。
图13为实施例1中以流式细胞仪分析15种代表性全长GPC1适配体结合能力分析结果图，图中，黑色柱表示适配体与野生型HEK293T结合的荧光强度。灰色柱表示适配体与GPC1过表达的HEK293T结合的荧光强度。纵轴为荧光强度的中位数。所示数据表示为平均值±标准差，重复数为3，*表示显著性分析结果为P≤0.05，***表示显著性分析结果为P≤0.001。
图14为实施例1中GPC1蛋白质分别在使用小RNA干扰敲低GPC1后的Panc1细胞和野生型Panc1对照细胞中表达水平的测定结果。图14中A为用抗人GPC1抗体进行蛋白印迹(Western)的结果，图14中B为流式细胞术分析GPC1抗体与野生型Panc1细胞或使用小RNA干扰敲低GPC1后的Panc1细胞结合的半定量分析。所示数据为平均值±标准差，重复数为2。
图15为实施例1中第一轮适配体改造工程中所涉及的适配体的二级结构的图解。图15中A为第一轮适配体改造工程中GPC1-17的进化过程的二级结构的图解，图15中B为第一轮适配体改造工程中GPC1-24的进化过程的二级结构的图解，图15中C为第一轮适配体改造工程中GPC1-35的进化过程的二级结构的图解，有“×”的框内的核苷酸被截除。
图16为实施例1中第一轮适配体改造工程截短的适配体的序列及与GPC1阳性细胞结合活性的测定结果图。图16中A为原始全长适配体和第一轮工程截短适配体的序列；图16中B为对适配体GPC1-17、GPC1-24和G PC1-35产生的第一轮工程截短适配体与CPC1蛋白基于流式细胞术的结合能力分析结果。所用细胞为野生型Panc1对照细胞以及GPC1过表达的Panc1细胞。所示数据为平均值±标准差，重复数为3，***表示显著性分析结果为P≤0.001，**表示显著性分析结果为P≤0.01，*表示显著性分析结果为P≤0.05；ns表示统计上不显著。
图17为实施例1中GPC1-17A-1对GPC1过表达的HEK293T和GPC1敲低的Panc1细胞的表观解离常数。图17中A为GPC1-17A-1分别对GPC1过表达的HEK293T和GPC1敲低的Panc1的表观解离常数(Kd)。图17中B为GPC1-17A-1分别对GPC1过表达的HEK293T细胞和GPC1敲低的Panc1细胞的表观解离常数测定曲线。所示数据表示为平均值±标准差，重复数为2。流式细胞术检测每个样品用了50万个细胞。
图18为实施例1中第二轮适配体改造工程中适配体的二级结构的图解。图18中A为从GPC1-17A-1到五个亚克隆(GPC1-17A-1a、GPC1-17A-1b、GPC1-17A-1c、GPC1-17A-1d和GPC1-17A-1e)的二级结构进化图解；图18中B为从GPC1-35A-1到五个亚克隆(GPC1-35A-1a、GPC1-35A-1b、GPC1-35A-1c、GPC1-35A-1d和GPC1-35A-1e)的二级结构进化图解。在图中用大方框圈示的每一对配适体中有“×”的框内的核苷酸被截除，无“×”的框内的核苷酸从A-T碱基对被换成C-G碱基对。
图19为实施例1中第二轮适配体改造工程中适配体的序列及其基于流式细胞术的结合能力分析结果图。图19中A为从GPC1-17A-1到五个适配体(GPC1-17A-1a、GPC1-17A-1b、GPC1-17A-1c、GPC1-17A-1d和GPC1-17A-1e)的序列；图19中B为从GPC1-35A-1到五个适配体(GPC1-35A-1a、GPC1-35A-1b、GPC1-35A-1c、GPC1-35A-1d和GPC1-35A-1e)的序列。图19中C为GPC1-17A-1衍生的5种适配体与野生型HEK293T对照细胞以及GPC1过表达HEK29T细胞基于流式细胞术的结合能力分析结果；图19中D为GPC1-35A-1衍生的5种适配体与GPC1蛋白基于流式细胞术的结合能力分析结果。所示数据为平均值±标准差，重复数为3，****表示显著性分析结果为P≤0.0001，**表示显著性分析结果为P≤0.01，*表示显著性分析结果为P≤0.05；ns表示统计上不显著。适配体浓度均为500nM.纵轴为荧光强度的中位数.流式细胞术检测每个样品用了50万个细胞。
图20为实施例1中GPC1-17A-1d对GPC1过表达的HEK293T细胞和GPC1敲低的Panc1细胞的表观解离常数。其中，每个细胞种类GPC1适配体采用了五个不同的浓度(100nM,250nM,500nM,1000nM,2000nM,5000nM)与细胞孵育来计算表观解离常数。图20中A为GPC1-17A-1d分别对GPC1过表达的HEK293T细胞和GPC1敲低的Panc1细胞的表观解离常数(Kd)。图20中B为GPC1-17A-1d分别对GPC1过表达的HEK293T细胞和GPC1敲低的Panc1细胞的的表观解离常数测定曲线。纵轴为荧光强度的中位数.所示数据表示为平均值±标准差，重复数为2。流式细胞术检测每个样品用了50万个细胞。
图21为实施例1中第三轮适配体改造过程中涉及的适配体的二级结构的图解，从GPC1-17A-1d衍生得到六个新的适配体(GPC1-17A-1d-1、GPC1-17A-1d-2、GPC1-17A-1d-3、GPC1-17A-1d-4,GPC1-17A-d-5和GPC1-17A-d-6)。有“+”的框表示添加框内的核苷酸，圆圈和箭头表示将圆圈内的核苷酸替换为箭头指向的另一种核苷酸。
图22为实施例1中从GPC1-17A-1d衍生得到的六个适配体GPC1-17A-1d-1、GPC1-17A-1d-2、GPC1-17A-1d-3、GPC1-17A-1d-4、GPC1-17A-1d-5、GPC1-17A-1d-6的序列。
图23为实施例1中第三轮适配体改造中的配适体与细胞表面GPC1蛋白结合能力测定结果。适配体浓度均为500nM.纵轴为荧光强度的中位数。所示数据表示为平均值±标准差，重复数为2。不加适配体的细胞本身的荧光用来当做空白本底荧光对照。
图24为实施例2中GPC1-17A-1d适配体与细胞表面的GPC1结合的特异性的检测结果。图24中上图为各组氨酸表位标记的其他五个无关重组跨膜蛋白经转染后在HEK293T细胞里过表达的验证。所示的是用抗组氨酸表位标签抗体来检测的蛋白质印迹图。图24中下图为GPC1-17A-1d适配体与过表达组氨酸表位标签标记的重组跨膜蛋白转染后的HEK293T细胞结合的分析结果。显示的是用流式细胞术来进行检测用400nM类星体荧光基团-670(Quasar-670)标记的GPC1-17A-1d适配体与各种不同的细胞表面过表达的重组蛋白结合的结果，其中空白表达质粒转染的HEK293T细胞的荧光信号被用来标定本底荧光。所示数据为平均值±标准差，重复数为2，纵轴为荧光强度的中位数。*表示显著性分析结果为P≤0.05。
图25为实施例3中用生物素标记的抗CD81抗体从细胞培养上清液中捕获外泌体后用类星体荧光基团-670(Quasar-670)标记的GPC1-17A-1d适配体经流式细胞术来进行检测的原理图。
图26为实施例3中使用CD81抗体捕获源自GPC1下调后的Panc1或从野生型的Panc1细胞的的外泌体后用荧光标记的GPC1适配体来检测分析结果。CD81抗体与细胞培养上清液中在4℃孵育1小时后把外泌体捕获固定在链酶亲和素表面活化的磁珠(Agilent)上。然后加400nM类星体荧光基团-670(Quasar-670)标记的GPC1-17A-1d适配体4℃孵育1小时后用含0.1％Tween-20的磷酸缓冲液洗5次，经流式细胞术来进行检测。所示数据表示为平均值±标准差，重复数为2。纵轴为荧光强度的中位数。
图27为实施例4中用CD81适配体从细胞培养上清液中捕获外泌体并检测GPC1阳性外泌体的原理图。细胞培养上清液中的外泌体用生物素标记的抗CD81适配体捕获并固定在链酶亲和素表面活化的磁珠上，然后加类星体荧光基团-670(Quasar-670)标记的GPC1-17A-1d适配体经流式细胞术来进行检测。
图28为实施例4中从细胞培养上清液中用CD81适配体捕获来自GPC1敲低的Panc1细胞或野生型Panc1细胞的外泌体后用荧光标记的GPC1-17A-1d适配体用来测的的结果图。在本实验中，0.5ml的细胞培养上清液中的外泌体先用400nM生物素标记的CD81适配体捕获(4℃,1小时)固定在链酶亲和素表面活化的磁珠上，用洗涤液含0.1％ Tween-20的磷酸缓冲液PBS)洗三遍。然后加入400nM类星体荧光基团-670(Quasar-670)标记的GPC1-17A-1d适配体在4℃孵育1小时。洗涤三次后，经流式细胞术用来检测磁珠上捕获的外泌体上的GPC1。图28中A为来自GPC1敲低的Panc1细胞或野生型Panc1细胞的外泌体与然后用类星体荧光基团-670(Quasar-670)标记的GPC1-17A-1d适配体结合后在流式细胞术中的荧光强度结果显示。图28中B为用CD81亲和层析捕获的来自GPC1敲低的Panc1和Panc1细胞的外泌体上面的GPC1荧光强度定量分析条形图。图28中C为对来自GPC1敲低的Panc1和野生型Panc1细胞的外泌体以抗人GPC1抗体进行蛋白印迹(Western)的结果。图28中D为这二种CD81亲和层析捕获的来自不同细胞的外泌体上用GPC1蛋白印迹达来进行GPC1表达量的分析。所示数据表示为平均值±标准差，重复数为2。**表示显著性分析结果为P≤0.01。
图29为实施例4中以CD81适配体捕获外泌体后用抗GPC1抗体来检测GPC1在捕获外泌体上表达量的示意图和结果。图29A中为CD81适配体如图28所示捕获外泌体然后用GPC1抗体(Abcam,货号ab199343,1:70稀释)及荧光(Brilliant Violet 510TM)标记的抗免疫球蛋白(Biolegend,货号:406419,1:1600稀释)二级抗体来检测GPC1丰度的示意图。图29B中显示野生型Panc1细胞的外泌体的GPC1比来自GPC1敲低的Panc1细胞外泌体的GPC1表达量高3倍左右。
图30为实施例5中GPC1适配体在模拟液体活检中能够在500至1000个GPC1阴性外泌体的背景中检测到1个GGPC1阳性的外泌体的结果图。我们首先制备里来自与Panc1细胞培养上清液的外泌体作为胰腺癌分泌的GPC1高表达的代表性外泌体(GPC1阳性外泌体)。我们又从GPC1敲低的Panc1细胞细胞培养上清液制备了GPC1低表达或不表达的外泌体来模拟GPC1阴性的外泌体(GPC1-阴性外泌体)。外泌体是用金标准的分步超速离心方法制备，用纳米颗粒示踪仪(Nanosight NS300,Malvern Instrument,英国)计数。接下来，我们把这二种不同的外泌体以不同比例混合进行有限稀释，制备成五种不同比例的GPC1阳性外泌体相对于GPC1-阴性外泌体的混合物。这五个样品分别为GPC1阳性外泌体相对于GPC1-阴性外泌体的比列为1:500,1:1000；1:1000；1:2000；1:5000和1:8000。为了模仿癌症病人血液中外泌体的浓度，这五个样品都配成毎毫升3×1010外泌体的总浓度。这五种不同比例混合外泌体用生物素标记的抗CD81适配体捕获并固定在链酶亲和素表面活化的磁珠上，然后加类星体荧光基团-670(Quasar-670)标记的GPC1-17A-1d适配体经流式细胞术来进行检测。在此实验中，我们把一个样品中的总磁珠里有1％的磁珠呈现Quasar-670荧光阳性定为检测到GPC1阳性外泌体的诊断阈值。图中样品的GPC1阳性外泌体相对于GPC1-阴性外泌体的比例是标明在流式细胞术结果图框外的正上方，检测到的总磁珠中有呈现类星体荧光基团-670阳性的磁珠的百分比则标明在流式细胞术结果图框内的右上方。乱序对照是一个类星体荧光基团-670标记的随机序列的DNA适配体用来代表实验系统的本底荧光。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的验证实验仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的验证实验可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述验证实验中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述验证实验中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
HEK293T细胞(货号
Figure GDA0004043522240000111
CRL-3216)为the American Type Culture Collectioni公司产品。
Panc1细胞(货号
Figure GDA0004043522240000112
CRL-1469TM)为the American Type Culture Collectioni公司产品。
GPC1敲低的Panc1为(ED200001020)苏州吉玛基因股份有限公司产品。
带有His标签的GPC1质粒(货号HG10576-CH)为中国京义翘神州科技股份有限公司产品。
重组人GPC1蛋白(货号ab215589)为Abcam公司产品。抗人GPC1抗体(货号ab199343，单抗)为Abcam公司产品。
生物素标记的抗6X His抗体(货号ab106261，小鼠单抗)为Abcam公司产品。
生物素标记的CD81抗体(货号349514，小鼠单抗)为BioLegend公司产品。
抗β-actin抗体(货号ab6276，小鼠单抗)为Abcam公司产品。
亮紫罗兰510TM结合羊抗兔IgG(货号406419)为Biolegend公司产品。
别藻蓝蛋白标记的抗荧光素抗体(货号17-7691-82)为eBioscience公司产品。
FAM标记(货号E17001)为苏州吉玛基因股份有限公司产品。
Quasar 670(Q670)标记(货号11-4200-XX)为苏州吉玛基因股份有限公司产品。
链霉亲和素包被的2.7微米直径的磁珠(货号PL6827-103)为AgilentTechnologies公司的产品。
下述验证实验中的所有数据均采用Graphpad Prism 8.0.进行显著性分析。
实施例1、筛选针对GPC1的目标适配体
申请人的目的是采用基于蛋白质的指数富集的配适体系统进化实验(SELEX)(protein-based SELEX)和细胞SELEX(cell-SELEX)方法开发针对GPC1的DNA适配体(以下简称GPC1适配体)，两种技术的示意图见图1。首先，基于蛋白质的SELEX以市购的重组人GPC1蛋白为靶标，以富集GPC1适配体序列。基于蛋白质的SELEX的主要缺点是重组蛋白质可能不具有天然蛋白质的构象。考虑到这一点，申请人以重组的过量表达GPC1的HEK293T细胞为靶细胞，利用细胞SELEX促进GPC1适配体序列的进一步富集。这些富集的DNA序列能够与保持天然构象GPC1蛋白结合。因此，申请人确定所选的GPC1适配体能够成功结合到细胞或外泌体表达的天然GPC1蛋白上。具体过程如下：
1、建立SELEX期间有效扩增单链DNA的PCR系统
在每一轮SELEX期间，与靶蛋白结合的单链DNA序列仅占单链DNA库中的一小部分。如果将回收的靶标单链DNA直接应用于下一轮SELEX，由于数量少，大部分可能会丢失。因此，每一轮SELEX结束时回收的与靶蛋白结合的DNA必须使用专门设计的PCR进行扩增。每一轮SELEX的PCR最佳循环次数需要通过实验来确定。因此，在每一轮SELEX结束时，DNA以PCR回收并扩增，PCR条件：94℃下变性30s，在48.6℃下退火40s，在72℃下延长60s，循环数为12-18，以无模板DNA为阴性对照。不同循环数的PCR产物扩增的情况用4％琼脂糖凝胶凝胶电泳来分析，其代表性的结果见图2中的A，对凝胶电泳结果的相对扩增子强度的分析见图2中的B。结果表明：随着PCR循环数的增加，PCR产物产量逐渐增加，第18周期产生的产量相对较高且非特异性DNA的量最少，因此申请人选择了PCR产量最高的第18周期作为每一轮SELEX结束时回收的靶结合DNA的PCR最佳循环数。
2、建立用于分离扩增DNA正义链的尿素-dPAGE法
使用不同的正义链(sensestrand)和反义链(anti-sense strand)引物，通过不对称PCR扩增目标适配体，具体流程见图3中的左图：正义链合成的上游引物(20nt)用荧光素(FITC)标记，而反义链合成的下游引物(40nt)连接有多聚A(Poly A)尾巴(n＝20)，因此，长度为86nt的PCR产物的正义链(被FITC标记)含有的适配体为40nt，而与Poly A连接的反义链为106nt。详细实验细节见发明人的方法学论文“Human Gene Therapy Methods,30(1):1-16,2019”。为了分离富集的40nt序列用含12％尿素的聚丙烯酰胺凝胶变性电泳分离预先变性的PCR产物。为此，我们将预先变性了的PCR产物在12％尿素-dPAGE凝胶上电泳，以分离出富集的86nt正义链。单链DNA(86nt)用作分子大小标记。用Gel Star(Lonza,货号50535)染色后，将凝胶在蓝光(470nm波长)照明器(Major Science,货号MBE-300)下成像，以减少普通紫外线灯与DNA发生交联的机会。当反义链与Poly A尾端合成时，它在正义链后面迁移，正义链DNA(包含FITC结合的适配体40nt)的较低条带很容易定位并从凝胶中切除。分离目标单链DNA序列的聚丙烯酰胺凝胶变性电泳凝胶在蓝光下成像图具体见图3中的右图，正义链DNA的5’-端是用荧光素(FITC)标记的，所以正义链DNA可以很容易地在蓝光灯下被看到并从凝胶中回收。通过电洗脱和DNA沉淀回收凝胶片段中的DNA，并对回收的适配体正义链进行下一轮SELEX。
3、建立以链霉亲和素包被板测定对人GPC1蛋白的捕获能力的SELEX系统
本实验使用了重组的C末端-6X His标记的人GPC1蛋白。His标记的GPC1蛋白与生物素标记的抗6X His抗体的结合物在链霉亲和素包被的板捕获系统中发挥重要作用。为了确定链霉亲和素包被的板对人GPC1蛋白的捕获能力，进行了蛋白质印迹(WesternBlotting)分析，具体流程见图4。Western分析结果见图5，表明链霉亲和素包被的板在洗脱液中捕获的人GPC1蛋白的量显著高于上清液。因此，链霉亲和素包被的板可有效捕获人GPC1蛋白，从而为人GPC1蛋白建立了可靠而强大的基于链霉亲和素包被的板的SELEX系统。
4、基于SELEX测定人GPC1蛋白结合的核酸配适体的富集度
在SELEX过程中，用人GPC1蛋白来检测GPC1核酸配适体的富集度的流程见图6的左图：在GPC1 SELEX中，用生物素标记的抗6X His抗体固定在链霉亲和素包被微孔板上来形成一个用His标记的GPC1蛋白为固定靶标的检测系统，用以捕获通过SELEX富集的GPC1核酸配适体，这个系统被用作GPC1核酸配适体的阳性选择。在毎一轮SELEX开始时，首先用不加His-GPC1蛋白质的微孔板(链霉亲和素包被微孔板上仅含生物素标记的抗6X His抗体)适配体池进行阴性选择以去除与检测系统非特异性结合的适配体，然后将含有适配体池的上清液转移至阳性选择孔，与所需靶标一起温育后，加入HRP标记的抗FITC抗体，弃去上清液，结合在His-GPC1蛋白质的微孔板上的适配体池用尿素(8M)洗脱并通过PCR扩增，信号被放大，上述过程称为基于微孔板的GPC1核酸配适体的富集暨测定法。
为了检查针对人重组GPC1蛋白选择的适配体池的富集情况，如上所述的基于微孔板的GPC1核酸配适体的富集暨测定法被用来评估了从Round 0(文库)，Round-P5(人GPC1蛋白SELEX 5轮)，Round-P6(人GPC1蛋白SELEX 6轮)获得的适配体池中能与人GPC1蛋白结合的适配体富集的程度。我们PCR扩增和凝胶纯化的单链DNA池(100nmol)来进行结合试验，以加入不含GPC1蛋白的HRP标记的抗FITC抗体时的信号作为背景，用VICTOR X5平板阅读器(PerkinElmer Life and Analytical Sciences)检测荧光强度，测量结合能力，结果见图6中的右图。根据此分析，申请人可以阐明，对于Round-P5和Round-P6衍生的单链DNA，结合能力分别比Round 0高2倍和10.2倍。Round-P6适配体的结合能力明显高于Round 0(P≤0.05)。该结果最终表明，初始的完全随机的适配体池在Round-P6之后成功富集，并能够与人GPC1蛋白结合。
5、构建GPC1过表达的SELEX细胞
为了获得过量表达GPC1的HEK293T细胞，从中国京义翘神州科技股份有限公司购买了带有His标签的GPC1 cDNA表达质粒(货号HG10576-CH)(图7中的A)。pCMV-GPC1是将pCMV3-C-His的Hind III和Xba I识别位点间的核苷酸替换为全长为1722核苷酸的带有羧基端His标签的编码GPC1的cDNA(GenBank NCBI Reference Sequence:NM_002081.2)。
为了进一步确认GPC1过表达质粒pCMV-GPC1的结构正确，分别对其进行了一次和两次限制性酶切消化，并使用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行电泳，电泳结果见图7中的B：通过单限制性酶消化(Hind III或Xba I)，将GPC1过表达质粒pCMV-GPC1切成线性序列，同时通过双重限制性内切酶消化(Hind III+Xba I)，His标签的GPC1 cDNA插入片段的双链DNA(His-GPC1)从载体中释放出来，并且在双重消化组中出现了两个条带，出现在底部的带是His标记的GPC1 ORF区域(共1722bp，具体见序列表的序列42；该His标记的GPC1 ORF区域编码的氨基酸序列见序列表的序列43)，上面的带代表pCMV3-C-His载体(6164bp)。上述结果表明，GPC1过表达质粒是用于下游应用的正确表达构建体。
以上述的GPC1过表达质粒pCMV-GPC1转染HEK293T细胞。24小时后得到转染后的HEK293T细胞，将其命名为HEK293T/pCMV-GPC1。为了验证人GPC1蛋白在HEK293T细胞中的过表达，将HEK293T/pCMV-GPC1制备成细胞裂解物，以HEK293T(又称野生型HEK293T或HEK293T(WT))，图7中的C使用抗6X His抗体进行了蛋白质印迹分析重组His-GPC1的表达。首先用抗6X His抗体探测膜，然后用抗β-actin抗体作为加载对照，用10％SDS-PAGE进行解析如图7中的C所示，His标签的人GPC1蛋白在HEK293T细胞中成功地过表达，HEK293T/pCMV-GPC1又称为GPC1过表达的HEK293T。
将GPC1过表达的HEK293T作为阳性选择，而将HEK293T细胞(WT)作为阴性选择进行细胞SELEX富集的GPC1核酸配适体的结合亲和力测定。为了进一步验证重组GPC1蛋白进转染后的表达，GPC1过表达的HEK293T和野生型HEK293T系均用抗GPC1抗体孵育，加入亮紫罗兰510TM结合羊抗兔IgG的二抗，然后用流式细胞术分析。如图7中的D所示，GPC1过表达的HEK293T细胞的荧光强度中位数明显较高，与野生型HEK293T相比，GPC1表达质粒转染后的HEK293T细胞中GPC1的表达高10-20倍。
6、SELEX过程富集与GPC1过表达的HEK293T结合的适配体
对与HEK293T细胞结合的GPC1适配体用流式细胞术检测分析的原理图见图8的A。为了确定SELEX富集的效率并确定第11轮细胞SELEX的适配体池具有良好的结合能力，当SELEX进行到第11轮时的适配体池进行流式细胞术，以野生型HEK293T用作阴性对照，而上述获得的GPC1过表达的HEK293T用作阳性对照，抗FITC抗体作为背景对照，用一小部分200nmFITC标记的第11轮时适配体池于细胞孵育并洗涤后，行流式细胞术检测。结果如图8中B所示，来自经细胞-SELEX第11轮富集后的适配体池与GPC1过表达的HEK293T细胞的结合是其与野生型HEK293T细胞结合的4.5倍，这表明在细胞-SELEX第11轮后，适配体池的与GPC1结合效率提高了。所以综合这些数据，经过11轮细胞SELEX之后，针对天然人GPC1蛋白的GPC1适配体被成功地富集了。
7、通过下一代测序证实来自细胞SELEX的富集适配体池
为了确定最终富集池中适配体的原始序列，进行了适配体克隆的二代测序(NGS)。GPC1适配体最终利用获得的适配体序列来推断高结合序列。GPC1适配体经过11轮细胞SELEX程序后，对整个适配体池的DNA进行二代测序分析。GPC1适配体只有正向和反向引物以外的初始随机区域(位与正中)是申请人感兴趣的，具体流程见图9：从含有随机适配体序列的双链DNA拷贝开始，去除末端的引物序列、反义链的反向补体、序列插入、筛选和聚类后，记录50个拷贝以上的适配体序列。这样得到的潜在的GPC1适配体中，只有DNA拷贝数量≥50才被选入继续研究，而其他剩余序列则未评估。我们使用多序列比对工具ClustalX对于SELEX DNA库中相同的中央区域40个核苷酸序列进行了序列比对。图10显示了代表147524个重复的NGS结果，每个重复序列具有中央区域40个核苷酸相同序列被标出。GPC1适配体池中这40个核苷酸序列是申请人感兴趣的DNA插入序列，即潜在的适配体候选物库。
8、建立全长GPC1适配体细胞筛选-暨分子改造体系
GPC1适配体的筛选和分子改造工程的流程图见图11：
首先基于上述构建的细胞SELEX的系统，以针对天然构象中的靶标筛选全长GPC1适配体，筛选的过程使用流式细胞术分析。所用的天然构象中的靶标是GPC1胞外域，具体是以GPC1阴性或近似阴性和GPC1阳性的人类细胞系筛选SELEX后针对GPC1胞外域的GPC1DNA的适配体共15个。详细的筛选过程见步骤9。
再验证所初选的15个适配体是否具有与天然构象GPC1蛋白的胞外域的特异性结合的能力，将低表达的GPC1的野生型HEK293T和GPC1过表达的HEK293T分别用作阴性和阳性对照，鉴定后选出3个能结合GPC1的适配体。筛选过程见步骤10。
对入选的两个优胜的能结合GPC1的适配体进行多轮的短截工程，并测结合力筛选合适的候选序列，最后通过定点突变确定优化后的GPC1适配体。详细的分子改造工程及结合力测定筛选过程见步骤11-步骤16。
9、在候选适配体中筛选具有能与CD81结合的结构独特的全长适配体
针对步骤7中通过下一代测序确定最终富集的SELEX库中全长GPC1候选适配体的序列，申请人通过使用在线DNA折叠工具mfold来鉴定具有具有能与天然GPC1蛋白结合的独特二级结构的全长GPC1适配体。从理论上讲，具有不同二级结构的适配体可能具有不同的三级结构，因此可能与GPC1蛋白的不同细胞外表位相互作用。
利用在线DNA折叠工具mfold从排名最高的候选适配体中挑选出具有潜在能与天然GPC1蛋白结合的适配体共15个，包括GPC1-1、GPC1-2、GPC1-3、GPC1-7、GPC1-10、GPC1-12、GPC1-15、GPC1-17、GPC1-22、GPC1-23、GPC1-24、GPC1-25、GPC1-35、GPC1-100和GPC1-300，具体序列见表1，二级结构如图12所示，这些全长GPC1适配体是否真正能够与天然GPC1蛋白结合，将在下一步用实验来检验。
表1全长序列GPC1 DNA核酸配适体序列
Figure GDA0004043522240000171
10、测定15个初筛候选全长GPC1适配体的结合能力
为了评估作为代表性全长GPC1适配体的15个GPC1适配体与天然GPC1蛋白质的结合能力，以流式细胞术检测，将500nM FAM(荧光素)标记了的15种GPC1适配体分别与野生型HEK293T和GPC1过表达的HEK293T在4℃下与500000个细胞孵育1小时。经洗涤除去未结合的适配体序列后，通过流式细胞术分析这些细胞上的来自荧光素的信号。流式细胞术分析结果见图13，GPC1-17适配体、GPC1-24适配体和GPC1-35适配体分别与GPC1过表达的HEK293T结合的荧光强度显著高于与野生型HEK293T结合的荧光强度。这些数据表明，GPC1-17、GPC1-24和GPC1-35是有希望的GPC1蛋白结合物，而其它代表性全长GPC1适配体存在大量的非特异性结合，表明其它代表性全长GPC1适配体可以结合细胞表面上的其它无关分子，而不是GPC1。因此，选择了GPC1-17(序列表的序列8)、GPC1-24(序列表的序列11)和GPC1-35(序列表的序列13)这三个适配体进行进一步分析。
11、以GPC1敲低的Panc1建立GPC1适配体特异性检测系统
为了更好的验证初步筛选到的GPC1适配体是否能够与质膜表面的GPC1特异性的结合，我们用小RNA干扰来敲低下调Panc1细胞株的GPC1的表达。通过流式细胞术和蛋白质印迹分析来证实并定量GPC1在Panc1细胞里被下调的程度，结果如图14所示。图14中A是用GPC1抗体在蛋白质印迹分析的结果。在GPC1被下调Panc1细胞裂解液里，几乎很难检测到GPC1蛋白质的信号，而野生型Panc1细胞裂解液里则出现了轻易可见的对应与GPC1分子量的条带。基于流式细胞术适合研究适配体与细胞表面有天然构象的跨膜蛋白的结合，我们通过流式细胞术再次证实并进一步定量估测GPC1下调的程度。根据流式细胞仪分析，与野生型Panc1相比，经RNA干扰下调的Panc1中GPC1的表达被下调了约600％，具体见图14中B。这些数据表明，GPC1敲低的Panc1细胞株可以被用来检验候选的GPC1适配体与细胞或外泌体结合的特异性。
12、通过截短进行GPC1适配体序列的第一轮工程化
为了进一步改造适配体，申请人针对每一个全长适配体(GPC1-17、GPC1-24和GPC1-35)生成了两到三个截短的适配体，以选择具有最高结合能力和最短序列的适配体。适配体的截短是有利的，因为它降低了生产成本，最重要的是它可以提高结合亲和力。最初筛选的GPC1-17、GPC1-24和GPC1-35的最初长度均为40个核苷酸，通过截短减少到13-25个核苷酸。
在第一轮截短中，所有适配体的环保持完整，仅去除茎上的一些核苷酸。所有GPC1适配体的全长和截短形式也都被截断，以使所有截短的适配体都具有相同核苷酸序列的原始环区域，茎结构的截断希望能导致所有适配体的结合效率提高，一般来说，并不是原始全长适配体的所有核苷酸都是在与GPC1结合里是必不可缺的，多数情况下可能环区是主要参与了与GPC1的结合。对于每个显示出高结合能力的截短适配体，以Mfold程序生成具有不同热焓的2-4个可能的二级结构。例如，GPC1-17、GPC1-24和GPC1-35分别有4、2和3个可能的二级结构，分别表示为17A，17B，17C，17D(见图15中A)，24A，24B(见图15中B)，35A，35B和35C(见图15中C)。申请人试图验证所有截短适配体是否都具有相同的循环结构。考虑到这一点，申请人从全长适配体中产生了一系列截短适配体，表2和图16中A记载了原始全长GPC1适配体和各截短适配体的序列。
表2第一轮GPC1 DNA核酸配适体改造后的序列
Figure GDA0004043522240000181
Figure GDA0004043522240000191
在合成类星体染料-670(Quasar 670)标记的第一轮适配体改造后的适配体后，使用野生型HEK293T和GPC1过表达的HEK293T进行了基于流式细胞术的适配体结合力分析，结果如图16中B所示，GPC1-17、GPC1-17A-1和GPC1-35、GPC1-35A-1已显示出与GPC1的显著结合能力，而GPC1-24中，与和野生型HEK293T相比，和GPC1过表达的HEK293T缺乏有统计学意义的新增结合力。因此，申请人选择GPC1-17A-1(序列表的序列16)和GPC1-35A-1(序列表的序列22)作为申请人的未来目标。
13、第一轮工程化后GPC1-17A-1的动力学研究
确认GPC1-17A-1与天然GPC1蛋白结合能力良好后，申请人开始表征该GPC1适配体的结合动力学,所用方法详见发明人已发表的论文(PMID:21281402)。为了确定了GPC1-17A-1的平衡解离常数(Kd)，将至少六种不同浓度(100nM，250nM，500nM，1000nM，2000nM，5000nM)的类星体染料-670标记的GPC1-17A-1用于结合测定，使用GPC1敲低的Panc1作为阴性对照，GPC1过表达的HEK293T作为阳性对照。如图17所示，GPC1-17A-1对GPC1过表达的HEK293T表观解离常数(Kd)是494.1±13.57nM，而GPC1敲低的Panc1的对应Kd为1631±135.7nM。GPC1敲低的Panc1的GPC1适配体17A-1的(Kd)值比GPC1过表达的HEK293T的(Kd)值高约3.3倍。再者GPC1适配体17A-1与GPC1敲低的Panc1细胞的结合的动力学图是接近一条直线，提示这二者的结合是非特异性结合。这表明GPC1-17A-1是GPC1的有希望的结合物。因此，为了提高适配体的结合亲和力和选择性，申请人决定对GPC1-17A-1进行进一步的改造和截短。
14、通过截短或替换进行GPC1适配体序列的第二轮改造
为了提高适配体的结合亲和力，申请人进一步设计了对适配体的分子改造。由于茎的长度，茎的大小和组成都可影响适配体的结合亲和力，因此申请人对茎进行了一些更改，例如截短，或者将A和/或T分别变成C和/或G，但是保持功能环不变，如图18所示从GPC1-17A-1和GPC1-35A-1分别产生了五个新的适配体，具体适配体的核苷酸序列见表3以及图19的A和图19的B。
表3第2轮GPC1 DNA核酸配适体改造后的序列
配适体名称 长度 核酸配适体序列(5’to 3’) 序列表中的编号
GPC1-17A-1 15 CAATCCCCCTTTTTA 序列16
GPC1-17A-1a 15 CACTCCCCCTTTGTA 序列25
GPC1-17A-1b 15 CCCTCCCCCTTTGGA 序列26
GPC1-17A-1c 13 AATCCCCCTTTTT 序列27
GPC1-17A-1d 13 CATCCCCCTTTTG 序列28
GPC1-17A-1e 13 ACTCCCCCTTTGT 序列29
GPC1-35A-1 30 ACAAAACACACACCCCCTTATCCCATTT 序列22
GPC1-35A-1a 25 AAACACACACCCCCTTATCCCATTT 序列30
GPC1-35A-1b 25 ACACACACACCCCCTTATCCCATGT 序列31
GPC1-35A-1c 25 CCACACACACCCCCTTATCCCATGG 序列32
GPC1-35A-1d 25 AACCACACACCCCCTTATCCCAGTT 序列33
GPC1-35A-1e 25 CGCCACACACCCCCTTATCCCAGCG 序列34
假定茎中明显不成对的碱基可能对适配体的结合功效产生不利影响，将其截除。C-G碱基对包含3个氢键，它将比A-T碱基对键更强；假定在茎区中添加C-G对可以增强改造后的适配体的亲和力和特异性，申请人将茎的A-T碱基对转换为C-G碱基对。另一方面，茎中存在的C-G碱基对越多，环采用不同的3-D构象的灵活性可能就会减少，因此，在整个适配体群体中形成有效的三维环结构的最终比例可能会比原来的占优势，导致更好的靶标结合。经过一系列分子改造工程后，得到的第二轮适配体的长度约为15核苷酸左右。
结合实验结果见图19的C和D，浓度为500nM时，与野生型HEK293T相比，GPC1-17A-1d与其未经改造过的原型GPC1-17A-1相比，对GPC1过表达的HEK293T具有更高的结合能力。不过，在第二轮工程中操作的所有其它GPC1-17A-1衍生的适配体GPC1-17A-1a、GPC1-17A-1b、GPC1-17A-1c、GPC1-17A-1e均显示出比原始适配体GPC1-17A-1更低的结合能力，所有GPC1-35A-1衍生的适配体GPC1-35A-1a、GPC1-35A-1b、GPC1-35A-1c、GPC1-35A-1d、GPC1-35A-1e与原始GPC1-35A-1结合GPC1过表达的HEK293T细胞的能力无显著性差异。因此，选择已显示出荧光强度比原始适配体GPC1-17A-1显著增加的适配体GPC1-17A-1d(序列表的序列28)用于进一步的实验。
15、GPC1-17A-1d的动力学研究
在确认GPC1-17A-1d是细胞膜上天然GPC1蛋白的有前途的结合物后，申请人进一步进行了表征该GPC1适配体的结合动力学的研究。为了确定GPC1-17A-1d的平衡解离常数(Kd)，首先，制备不同浓度(100nM，250nM，500nM，1000nM，200 0nM，5000nM)的5'-Quasar670标记的GPC1-17A-1d，使用GPC1敲低的Panc1(作为阴性对照，步骤5的HEK293T/pCMV-GPC1(又称为GPC1过表达的HEK293T)作为阳性对照(PMID:21281402)。如图20所示，GPC1-17A-1d对GPC1过表达的HEK293T的GPC1的表观解离常数(Kd)为383.7±66nM，而对GPC1敲低的Panc1相应的Kd为5141±39.6nM。在进行第二轮工程设计之前，针对GPC1过表达的HEK293T和GPC1敲低的Panc1的GPC1，GPC1-17A-1的Kd分别约为494.1±13.57nM和1631±135.7nM；经过第二轮轮工程设计后，GPC1-17A-1d对GPC1过表达的HEK293T的GPC1的Kd值降低了(383.7±66nM)，提示其与GPC1的亲和力提高了20％以上。而针对GPC1敲低的Panc1的Kd急剧增加(5141±39.6nM)并且其动力学图仍然是接近一条直线，表明其特异性提高了至少二倍。
值得注意的是，GPC1-17A-1d对GPC1敲低的Panc1细胞的Kd值比其与GPC1过表达的HEK293T细胞结合的Kd高约13.4倍，这表明在分子改造过程里得到的GPC1-17A-1d是的一种能更特异性地与GPC1结合的有希望的适配体。为了提高适配体的结合亲和力和选择性，申请人决定对GPC1-17A-1d进行进一步的改造优化。
16、GPC1适配体序列的第三轮改造优化
从第二轮工程中选择GPC1-17A-1d后，为了提高适配体与天然GPC1蛋白的结合亲和力和选择性，申请人进一步设计了第三轮适配体。简要地说，申请人假设在GPC1-17A-1d适配体的二级结构中的环上进行一些更改，并在茎中添加了一些AT或CG碱基对，具体见图21，这些改造可能会导致显著的3D构象改变并增强适配体与GPC1的结合效率。
如图21所示，在进行工程设计后，申请人从以下位置产生了6个基于GPC1-17A-1d衍生得到的适配体，具体序列见表4和图22。
表4第3轮GPC1 DNA核酸配适体改造后的序列
配适体名称 长度 核酸配适体序列(5’to 3’) 序列表中的编号
GPC1-17A-1d 13 CATCCCCCTTTTG 序列28
GPC1-17A-1d-1 13 CAGCGCGCGGTTG 序列35
GPC1-17A-1d-2 15 CATGGCCCGGTTCTG 序列36
GPC1-17A-1d-3 15 GCATCCCCCTTTTGC 序列37
GPC1-17A-1d-4 17 GACATCCCCCTTTTGTC 序列38
GPC1-17A-1d-5 17 GGCATCCCCCTTTTGCC 序列39
GPC1-17A-1d-6 19 GGACATCCCCCTTTTGTCC 序列40
申请人在500nM类星体染料-670标记的适配体与细胞结合使用流式细胞仪进行了结合试验以检查其结合功效。不幸的是，与适配体GPC1-17A-1d相比，所有衍生的适配体均显示出与GPC1较低的结合能力，具体见图23。该结果表明，至少在第三定轮的工程中进行的环的改变或茎中碱基的添加不会有助于结合能力的提高，这些结果证实环的改变最可能改变适配体的结合功效。因此，将适配体GPC1-17A-1d作为最终选择的GPC1适配体。
实施例2、确认改造优化后的GPC1适配体GPC1-17A-1d的特异性
确认GPC1-17A-1d的结合亲和力后，申请人以多种带有His标签的过表达重组跨膜蛋白细胞进一步确定了该适配体的特异性和选择性：为了确定申请人的适配体的特异性，申请人随机选择了不相关的跨膜蛋白，特别选择了Glypican的其他两个成员，即GPC4和GPC6，以验证适配体即使过表达也不会与其他细胞表面膜蛋白结合。具体如下：
1材料与方法
带有His标签的野生型HEK293T：将而空白的pCMV3-C-His载体质粒转染HEK293T细胞，24小时后得到转染后的HEK293T细胞，将其命名为HEK293T/pCMV3-C。作为野生型HEK293T阴性对照。
带有His标签的CD9过表达的HEK293T：将His-CD9/pCMV3转染HEK293T细胞，24小时后得到转染后的HEK293T细胞，将其命名为HEK293T/pCMV-CD9。HEK293T/pCMV-CD9购于北京义翘神州科技股份有限公(货号RG80778-CH)。
带有His标签的CD81过表达的HEK293T：将pCMV-CD81转染HEK293T细胞，24小时后得到转染后的HEK293T细胞，将其命名为HEK293T/pCMV-CD81。HEK293T/pCMV-CD81购于北京义翘神州科技股份有限公(货号HG14244-CH)。
带有His标签的TGFβR3过表达的HEK293T：将pCMV-TGFβR3转染HEK293T细胞，24小时后得到转染后的HEK293T细胞，将其命名为HEK293T/pCMV-TGFβR3。HEK293T/pCMV-TGFβR3购于北京义翘神州科技股份有限公(货号HG10778-CH)。
带有His标签的GPC1过表达的HEK293T：将pCMV-GPC1转染HEK293T细胞，24小时后得到转染后的HEK293T细胞，将其命名为HEK293T/pCMV-GPC1。HEK293T/pCMV-GPC1即为带有His标签的GPC1过表达的HEK293T。pCMV-GPC1购于北京义翘神州科技股份有限公(货号HG10576-CH)。
带有His标签的GPC4过表达的HEK293T：将pCMV-GPC4转染HEK293T细胞，24小时后得到转染后的HEK293T细胞，将其命名为HEK293T/pCMV-GPC4。HEK293T/pCMV-GPC4即为带有His标签的GPC4过表达的HEK293T。pCMV-GPC4是购于北京义翘神州科技股份有限公(货号HG10090-CH)。
带有His标签的GPC6过表达的HEK293T：将pCMV-GPC6转染HEK293T细胞，24小时后得到转染后的HEK293T细胞，将其命名为HEK293T/pCMV-GPC6。HEK293T/pCMV-GPC6即为带有His标签的GPC6过表达的HEK293T。pCMV-GPC6购于北京义翘神州科技股份有限公(货号HG10102-CH)。
将野生型HEK293T、HEK293T/pCMV-GPC1(GPC1过表达的HEK293T)、pCMV-CD9(CD9过表达的HEK293T)、HEK293T/pCMV-CD81(CD81过表达的HEK293T)、pCMV-TGFβR3(TGFβR3过表达的HEK293T)、HEK293T/pCMV-GPC4(GPC4过表达的HEK293T)、HEK293T/pCMV-GPC6(GPC6过表达的HEK293T)分别制备成细胞裂解物，以抗6X His标签抗体进行蛋白质印迹分析，以野生型HEK293T为对照，用抗6X-His抗体对HEK293T细胞中His标记蛋白过度表达进行分析，结果见图24中的上图，证实了HEK293T中His标记蛋白的过表达，确认所有重组HEK293T细胞中蛋白的转染都是成功的，并且所有His标记的重组跨膜蛋白均在转染后成功表达。
以野生型HEK293T作为背景荧光对照，400nM类星体荧光基团-670(Quasar-670)标记的GPC1-17A-1d适配体与各种不同的细胞表面过表达的重组蛋白结合果用流式细胞术分析。
2结果
结合力分析的结果如图24中的下图所示，GPC1-17A-1d与野生型HEK293T的结合保持在背景水平，适配体GPC1-17A-1d与过表达CD9、CD81、TGFβR3、GPC4和GPC6的HEK293T细胞的结合与其野生型HEK293T的结合没有显着差异。与野生型HEK293T和过表达其他跨膜蛋白(包括过表达GPC4和GPC6的蛋白)相比，GPC1-17A-1d适配体与过表达GPC1的HEK293T细胞的结合明显要高出一倍，证明GPC1-17A-1d适配体与细胞表面的他跨膜蛋白的结合是有很强的选择性，适配体GPC1-17A-1d不会因为一个无关的跨膜蛋白在膜上大量表达就与此结合。这些数据表明申请人的GPC1-17A-1d适配体与在质膜表面有天然构象的GPC1特异性地结合。
实施例3、用GPC1-17A-1d适配体检测GPC1阳性的外泌体
GPC1已显示在胰腺癌细胞衍生的外泌体中高表达。为确保GPC1适配体能够捕获GPC1阳性外泌体，申请人使用了有前途的GPC1-17A-1d适配体进行了结合测定。过程如下：将生物素标记的CD81抗体在细胞培养上清液中成功捕获的外泌体固定在链霉亲和素包被的磁珠上，然后将Q670标记的GPC1-17A-1d适配体置于GPC1阳性外泌体中，洗涤后，通过流式细胞术进行分析，具体如图25所示。
1材料与方法
1.1材料
Panc1细胞(货号
Figure GDA0004043522240000241
CRL-1469TM)为the American Type Culture Collectioni公司产品。
GPC1敲低的Panc1为苏州吉玛基因股份有限公司产品。
Panc1的细胞培养上清液(CCM)以及GPC1敲低的Panc1的细胞培养上清液(CCM)按有详细描述的已经发表的了方法制备(Proc Natl Acad Sci USA.113(8):E968-E977,2016),唯一有变动的是在收集含外泌体的细胞培养上清液时，加入了0.5％的去外泌体的小牛血清。
生物素标记的CD81抗体(货号349514，小鼠单抗)为BioLegend公司产品。
链霉亲和素包被的2.7微米直径的磁珠(货号PL6827-103)为AgilentTechnologies公司的产品。
Quasar 670标记的GPC1适配体GPC1-17A-1d，是以Quasar 670在5'-端标记适配体GPC1-17A-1d得到的，GPC1-17A-1d的序列为5’-CATCCCCCTTTTG-3’(即序列表中的序列28)。
1.2方法
以GPC1敲低的Panc1和Panc1制备的两种细胞培养上清液(0.5毫升)分别在4℃下用生物素标记的CD81抗体孵育1h，让抗CD81抗体与外泌体结合，加入50微升的链霉亲和素包裹的磁珠(Agilent Technologies,货号PL6827-103)铺获固定，接下来申请人在4℃孵育Quasar 670标记的GPC1适配体GPC1-17A-1d 1h，洗涤后，最后进行流式细胞术。
2结果
结果如图26所示，来自野生型Panc1的外泌体的荧光强度比通过GPC1敲低的Panc1的外泌体的荧光强度高约2倍。该数据表明，GPC1-17A-1d适配体已成功检测到来自Panc1的GPC1阳性外泌体。因此可以预期GPC1适配体GPC1-17A-1d可以有效捕获存在于胰腺癌患者的不同体液中的GPC1阳性外泌体，最终将有助于开发基于外泌体的早期胰腺癌诊断方法。
实施例4、比较基于用GPC1抗体或GPC1核酸适配体在检测用CD81亲和捕获的胰腺癌细胞来源的外泌体上GPC1蛋白的效果
CD81是液体活检中外泌体的极好的标记蛋白，因为外周血中约有94％的细胞外囊泡(EVs)是由血小板产生的，而这些来自血小板的EV不表达或表达极其低的CD81。为了评估CD81适配体CD81-2J-6(5'-CATTTGACCATCCGGGTCTATG-3'，国家知识产权局ProvisionalPatent专利申请号201911098597.7)的外泌体捕获能力，申请人将生物素标记的CD81适配体CD81-2J-6在细胞培养上清液(CCM)中成功捕获的外泌体固定在链霉亲和素包被的磁珠上，然后将Q670标记的GPC1-17A-1d适配体置于GPC1阳性外泌体中，洗涤后，通过流式细胞术进行分析，具体如图27所示。具体来说，申请人已经使用CD81-2J-6适配体来捕获外泌体，因为在申请人的实验室中已经确定该适配体可以有效捕获CCM中的外泌体。
1材料与方法
1.1材料
Quasar 670标记的GPC1适配体：以Quasar 670标记适配体GPC1-17A-1d得到Quasar 670标记的GPC1适配体GPC1-17A-1d。
5'-端生物素标记的CD81适配体。
Panc1细胞(货号
Figure GDA0004043522240000251
CRL-1469TM)为the American Type Culture Collectioni公司产品。
GPC1敲低的Panc1为苏州吉玛基因股份有限公司产品。
Panc1的细胞培养上清液(CCM)以及GPC1敲低的Panc1的细胞培养上清液(CCM)按有详细描述的已经发表的了方法制备(Proc Natl Acad Sci USA.113(8):E968-E977,2016),唯一有变动的是在收集含外泌体的细胞培养上清液时，加入了0.5％的去外泌体的小牛血清。
链霉亲和素包被的2.7微米直径的磁珠(货号PL6827-103)为AgilentTechnologies公司的产品。
1.2方法
首先将800nM生物素标记的CD81-2J-6适配体与两种CCM(Panc1的细胞培养上清液和GPC1敲低的Panc1的细胞培养上清液)分别在4℃下孵育1小时后加入50微升的链霉亲和素包被的磁珠，孵育20分钟以捕获分离外泌体并将其固定到磁珠表面。接着加入500nM的Quasar 670标记的GPC1适配体GPC1-17A-1d在4℃下孵育1小时，最后进行分别用CD81和CD9抗体进行Western印迹(和流式细胞术分析。
2结果
结果如图28所示，图28中A显示来自Panc1的外泌体的荧光强度比通过GPC1敲低的Panc1的外泌体的荧光强度高约7倍。该数据表明，GPC1-17A-1d适配体已成功检测到来自Panc1的GPC1阳性外泌体。与使用CD81抗体提取外来体的结果比较，CD81适配体引导的外泌体捕获对于基于外来体的液体活检而言是一个更好的系统。令人惊奇的是，当使用相同的GPC1适配体检测时，与CD81-抗体固定的外泌体相比，与CD81-适配体固定的外泌体产生的信号最多高出2-3倍。这些数据可以用空间位阻来解释：单克隆抗体(IgG)CD81抗体为150kDa，而适配体CD81-2J-6仅为6.8kDa。对于一个蛋白质单克隆抗体覆盖的给定面积上，最多可以结合上14个核酸适配体，这是因为后者的体积比前者小近14倍。因此，当CD81蛋白质单克隆抗体覆盖外泌体的表面时，可用于随后结合GPC1适配体的空位区域要少得多。相反，当比抗体小至少十几倍倍的CD81-2J-6核酸适配体结合到外泌体表面时，这些已经结合到外泌体表面的CD81蛋白质上的CD81的适配体对随后的GPC1适配体的结合的空间位阻就小得多。
如图28中C所示，用GPC1抗体进行的蛋白质印迹分析结果表明，如图28中A和B中所用的外泌体里，野生型Panc1细胞产生的外泌体中有较高的GPC1的表达，相反，经RNA干扰技术敲低GPC1后的Panc1产生的外泌体，GPC1的蛋白水平非常低。综上所述，本申请建立了一个基于CD81适配体的新型系统，不仅可以通过CD81适配体有效地捕获外泌体，而且还可以使用此专利申请中的GPC1适配体来灵敏地检测GPC1阳性的外泌体。因此，此处提供的数据为将来开发强大的液体活检系统以检测外泌体GPC1进行胰腺癌早期诊断铺平了道路。
以上在图28中，我们通过CD81适配体捕获Panc1产生的EV/外泌体后，使用CD81-2J-6核酸适配体来检测的捕获的外泌体上的GPC1蛋白。接下来，我们用CD81适配体捕获Panc1产生的EV/外泌体后，用抗人GPC1单抗体来检测捕获的外泌体上的GPC1蛋白。其实验流程如图29中A所示。应为用的是没有标记的单抗，为我们用里荧光标记的二抗来用流式细胞仪来检测分析捕获的外泌体上的GPC1蛋白。如图29中B所示来自野生型Panc1的外泌体的GPC1荧光强度比来自经RNA干扰技术敲低GPC1后的Panc1的外泌体的GPC1荧光强度只高出约3倍。与如图28在A和B中的7倍荧光强度的差别的结果对比，用GPC1适配体来检测用CD81亲和捕获的外泌体上的GPC1蛋白的水平的敏感性可提高至少一倍以上。综合图28和图29所示的实验结果，本发明的GPC1核酸配适体在检测在GPC1阳性的外泌体上，比传统的单克隆抗体有显著优势。
实施例5、探索GPC1适配体在模拟液体活检中的检测灵敏度
基于EV的液体活检的主要挑战是需在大量来源于血液或正常上皮细胞来源的外泌体和细胞外囊泡的背景情况下检测极少量的癌细胞衍生的外泌体)。如Zhang等人已观察到在其研究的肺癌患者中细胞外囊泡的浓度约为(每毫升1.41±0.31)×1010个，而对于正常健康的个体，细胞外囊泡的浓度约为(3.37±0.39)×109个/ml。所以，在存在大量来自血液的正常健康细胞的背景情况下，有效第检测到微量的癌症来源的EV是一个很大的挑战(Lab Chip.,2019,19,1114-1140；Nanoscale,2019,11,10106-10113)。
为了探索GPC1适配体GPC1-17A-1d的细胞外囊泡检测系统的检测灵敏度(CancerCell.37(4):485-495,2020)，申请人建立了一个液体活检的模型。此模型把来自胰腺癌Panc1细胞的外泌体有限稀释后与来自GPC1敲低的Panc1细胞中产生的外泌体按特定的比例混合。用此二种外泌体的混合悬浮液来模仿来自胰腺癌细胞的少数GPC1阴性外泌体混匿于4×109/ml来自正常细胞的细胞外囊泡的背景下的情作为检验样品。
1材料与方法
1.1材料
GPC1阳性Panc1 EV、GPC1阴性Panc1 EV采用标准的超速离心或超滤方法提取外泌体，提取方法参见“Konoshenko MY,Lekchnov EA,Vlassov AV,Laktionov PP,Isolationof Extracellular Vesicles:General Methodologies and Latest Trends.Journal ofBiomedicine and Biotechnology,2018:8545347.”。
抗生蛋白链菌素包被的磁珠(货号PL6827-1030)为AGILENT TECHNOLOGIESAUSTRALIA PTY LTD公司产品。
生物素标记的CD81适配体：以生物素标记在5'-端标记适配体CD81-2J-6得到。
Quasar 670标记的GPC1适配体：以Quasar 670标记适配体GPC1-17A-1d得到Quasar 670标记的GPC1适配体GPC1-17A-1d。
1.2方法
首先，从二种不同的细胞，即野生型Panc1细胞和GPC1下调的含极低GPC1蛋白的Panc1细胞培养上清液中制备了外泌体。在此实验中，外泌体悬浮液的浓度特意地调整为每毫升3×1010外泌体，以模仿临床患者血液中存在的实际外泌体的浓度。然后，通过将GPC1阳性Panc1外泌体与GPC1低表达的Panc1外泌体仔细混合，以1：500至1：8000的比例(1:500,1:1000,1:2000,1:5000,1:8000)对GPC1阳性外泌体与GPC1低表达外泌体在保持总外泌体浓度不变的前提下进行了连续有限稀释。在这五种含不同GPC1高表达和GPC1低表达外泌体比例的连续稀释单但总外泌体浓度是相同的外泌体悬浮液样品中分别加入生物素标记的CD81适配体后捕获外泌体，然后把捕获的外泌体从悬浮液液中分离出来固定在链霉亲和素包被的磁珠上。最后加入用Quasar 670标记的GPC1适配体GPC1-17A-1d借助流式细胞术来检测外泌体后的总外泌体中有无GPC1阳性的来自胰腺癌细胞的外泌体。在被实验中，将荧光阳性的磁珠的百分比超过总珠子总数的1％作为检出GPC1阳性外泌体的阈值。
如图30所示，在1:500和1:1000组中，从Quasar 670标记的GPC1适配体GPC1-17A-1d获得的信号百分比分别为1.09％。he10.87％.该数据表明，在申请人当前基于CD81的适配体检测系统中，Quasar 670标记的GPC1适配体GPC1-17A-1d可在毎500个来自正常细胞的背景外泌体中，检测到一个来源于癌症细胞的GPC1阳性外泌体。值得注意的是，图30所展示的结果是在当前尚未完全优化的条件下得到的初步的检测敏感度。在进一步优化后，基于本发明的GPC1适配体的检测灵敏度可望进一步提高。譬如，图27中使用的使用的荧光团Quasar 670的荧光量子产率(fluorescence quantum yield)与Cy5相似，为0.28。将来，如果申请人使用具有更高量子产率的荧光团，例如量子产率为0.92的Alexa Fluor 488，则检测灵敏度会大大提高。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110>苏州吉玛基因股份有限公司、迪肯大学
<120> 一种GPC1 DNA适配体及其应用
<130> GNCSY200710
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgacccctgt tatcccatta tttttcgccg gttttttttt 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgaccacccc acctttaccc cctctcgctc gctccccact 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcgcccccc tctcctgttt tgcccctcta tcgctctttt 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taccaccagc cacacacccc cccactccct cctttttgaa 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagcagacac acacagacac caccactacc ttttttttat 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcacacaac ccccaacatc tctcagctac cccctcgatt 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaacatccca cgtacaaaaa aaaaaccacc tcacactcct 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cacaacacac acaatccccc tttttatcca ccaactctat 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tccccccctc ctacatgctc acctccacca ctctctatat 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgaccacacc ctcctgactt aaccccccct ctcctctcca 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
catccaccat tcacctcacc aacctccccc tcctctcttt 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcccgtgcac cccctctctc actctcactc ccccaactta 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cacaacacac acacaaaaca cacaccccct tatcccattt 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tttacccgct gataccacgc accaccccct cccctctttt 40
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttacacccca cctgcctaca ttaccagcct ttttgttttt 40
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caatccccct tttta 15
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttatccacca actctat 17
<210> 18
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caatccccct tt 12
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atcccccttt ttatc 15
<210> 20
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
catccaccat tca 13
<210> 21
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttcacctcac caac 14
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acaaaacaca caccccctta tcccattt 28
<210> 23
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cttatcccat tt 12
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caaaacacac acccccttat ccc 23
<210> 25
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cactccccct ttgta 15
<210> 26
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ccctccccct ttgga 15
<210> 27
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aatccccctt ttt 13
<210> 28
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
catccccctt ttg 13
<210> 29
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
actccccctt tgt 13
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aaacacacac ccccttatcc cattt 25
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acacacacac ccccttatcc catgt 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ccacacacac ccccttatcc catgg 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aaccacacac ccccttatcc cagtt 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cgccacacac ccccttatcc cagcg 25
<210> 35
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cagcgcgcgg ttg 13
<210> 36
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
catggcccgg ttctg 15
<210> 37
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gcatccccct tttgc 15
<210> 38
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gacatccccc ttttgtc 17
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ggcatccccc ttttgcc 17
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ggacatcccc cttttgtcc 19
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
catttgacca tccgggtcta tg 22
<210> 42
<211> 1722
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
atggagctcc gggcccgagg ctggtggctg ctatgtgcgg ccgcagcgct ggtcgcctgc 60
gcccgcgggg acccggccag caagagccgg agctgcggcg aggtccgcca gatctacgga 120
gccaagggct tcagcctgag cgacgtgccc caggcggaga tctcgggtga gcacctgcgg 180
atctgtcccc agggctacac ctgctgcacc agcgagatgg aggagaacct ggccaaccgc 240
agccatgccg agctggagac cgcgctccgg gacagcagcc gcgtcctgca ggccatgctt 300
gccacccagc tgcgcagctt cgatgaccac ttccagcacc tgctgaacga ctcggagcgg 360
acgctgcagg ccaccttccc cggcgccttc ggagagctgt acacgcagaa cgcgagggcc 420
ttccgggacc tgtactcaga gctgcgcctg tactaccgcg gtgccaacct gcacctggag 480
gagacgctgg ccgagttctg ggcccgcctg ctcgagcgcc tcttcaagca gctgcacccc 540
cagctgctgc tgcctgatga ctacctggac tgcctgggca agcaggccga ggcgctgcgg 600
cccttcgggg aggccccgag agagctgcgc ctgcgggcca cccgtgcctt cgtggctgct 660
cgctcctttg tgcagggcct gggcgtggcc agcgacgtgg tccggaaagt ggctcaggtc 720
cccctgggcc cggagtgctc gagagctgtc atgaagctgg tctactgtgc tcactgcctg 780
ggagtccccg gcgccaggcc ctgccctgac tattgccgaa atgtgctcaa gggctgcctt 840
gccaaccagg ccgacctgga cgccgagtgg aggaacctcc tggactccat ggtgctcatc 900
accgacaagt tctggggtac atcgggtgtg gagagtgtca tcggcagcgt gcacacgtgg 960
ctggcggagg ccatcaacgc cctccaggac aacagggaca cgctcacggc caaggtcatc 1020
cagggctgcg ggaaccccaa ggtcaacccc cagggccccg ggcctgagga gaagcggcgc 1080
cggggcaagc tggccccgcg ggagaggcca ccttcaggca cgctggagaa gctggtctcc 1140
gaagccaagg cccagctccg cgacgtccag gacttctgga tcagcctccc agggacactg 1200
tgcagtgaga agatggccct gagcactgcc agtgatgacc gctgctggaa cgggatggcc 1260
agaggccggt acctccccga ggtcatgggt gacggcctgg ccaaccagat caacaacccc 1320
gaggtggagg tggacatcac caagccggac atgaccatcc ggcagcagat catgcagctg 1380
aagatcatga ccaaccggct gcgcagcgcc tacaacggca acgacgtgga cttccaggac 1440
gccagtgacg acggcagcgg ctcgggcagc ggtgatggct gtctggatga cctctgcagc 1500
cggaaggtca gcaggaagag ctccagctcc cggacgccct tgacccatgc cctcccaggc 1560
ctgtcagagc aggaaggaca gaagacctcg gctgccagct gcccccagcc cccgaccttc 1620
ctcctgcccc tcctcctctt cctggccctt acagtagcca ggccccggtg gcgggggggt 1680
ggaggctctc accatcacca ccatcatcac caccatcact aa 1722
<210> 43
<211> 573
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Met Glu Leu Arg Ala Arg Gly Trp Trp Leu Leu Cys Ala Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
Leu Val Ala Cys Ala Arg Gly Asp Pro Ala Ser Lys Ser Arg Ser Cys
            20                  25                  30
Gly Glu Val Arg Gln Ile Tyr Gly Ala Lys Gly Phe Ser Leu Ser Asp
        35                  40                  45
Val Pro Gln Ala Glu Ile Ser Gly Glu His Leu Arg Ile Cys Pro Gln
    50                  55                  60
Gly Tyr Thr Cys Cys Thr Ser Glu Met Glu Glu Asn Leu Ala Asn Arg
65                  70                  75                  80
Ser His Ala Glu Leu Glu Thr Ala Leu Arg Asp Ser Ser Arg Val Leu
                85                  90                  95
Gln Ala Met Leu Ala Thr Gln Leu Arg Ser Phe Asp Asp His Phe Gln
            100                 105                 110
His Leu Leu Asn Asp Ser Glu Arg Thr Leu Gln Ala Thr Phe Pro Gly
        115                 120                 125
Ala Phe Gly Glu Leu Tyr Thr Gln Asn Ala Arg Ala Phe Arg Asp Leu
    130                 135                 140
Tyr Ser Glu Leu Arg Leu Tyr Tyr Arg Gly Ala Asn Leu His Leu Glu
145                 150                 155                 160
Glu Thr Leu Ala Glu Phe Trp Ala Arg Leu Leu Glu Arg Leu Phe Lys
                165                 170                 175
Gln Leu His Pro Gln Leu Leu Leu Pro Asp Asp Tyr Leu Asp Cys Leu
            180                 185                 190
Gly Lys Gln Ala Glu Ala Leu Arg Pro Phe Gly Glu Ala Pro Arg Glu
        195                 200                 205
Leu Arg Leu Arg Ala Thr Arg Ala Phe Val Ala Ala Arg Ser Phe Val
    210                 215                 220
Gln Gly Leu Gly Val Ala Ser Asp Val Val Arg Lys Val Ala Gln Val
225                 230                 235                 240
Pro Leu Gly Pro Glu Cys Ser Arg Ala Val Met Lys Leu Val Tyr Cys
                245                 250                 255
Ala His Cys Leu Gly Val Pro Gly Ala Arg Pro Cys Pro Asp Tyr Cys
            260                 265                 270
Arg Asn Val Leu Lys Gly Cys Leu Ala Asn Gln Ala Asp Leu Asp Ala
        275                 280                 285
Glu Trp Arg Asn Leu Leu Asp Ser Met Val Leu Ile Thr Asp Lys Phe
    290                 295                 300
Trp Gly Thr Ser Gly Val Glu Ser Val Ile Gly Ser Val His Thr Trp
305                 310                 315                 320
Leu Ala Glu Ala Ile Asn Ala Leu Gln Asp Asn Arg Asp Thr Leu Thr
                325                 330                 335
Ala Lys Val Ile Gln Gly Cys Gly Asn Pro Lys Val Asn Pro Gln Gly
            340                 345                 350
Pro Gly Pro Glu Glu Lys Arg Arg Arg Gly Lys Leu Ala Pro Arg Glu
        355                 360                 365
Arg Pro Pro Ser Gly Thr Leu Glu Lys Leu Val Ser Glu Ala Lys Ala
    370                 375                 380
Gln Leu Arg Asp Val Gln Asp Phe Trp Ile Ser Leu Pro Gly Thr Leu
385                 390                 395                 400
Cys Ser Glu Lys Met Ala Leu Ser Thr Ala Ser Asp Asp Arg Cys Trp
                405                 410                 415
Asn Gly Met Ala Arg Gly Arg Tyr Leu Pro Glu Val Met Gly Asp Gly
            420                 425                 430
Leu Ala Asn Gln Ile Asn Asn Pro Glu Val Glu Val Asp Ile Thr Lys
        435                 440                 445
Pro Asp Met Thr Ile Arg Gln Gln Ile Met Gln Leu Lys Ile Met Thr
    450                 455                 460
Asn Arg Leu Arg Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Asp Val Asp Phe Gln Asp
465                 470                 475                 480
Ala Ser Asp Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asp Gly Cys Leu Asp
                485                 490                 495
Asp Leu Cys Ser Arg Lys Val Ser Arg Lys Ser Ser Ser Ser Arg Thr
            500                 505                 510
Pro Leu Thr His Ala Leu Pro Gly Leu Ser Glu Gln Glu Gly Gln Lys
        515                 520                 525
Thr Ser Ala Ala Ser Cys Pro Gln Pro Pro Thr Phe Leu Leu Pro Leu
    530                 535                 540
Leu Leu Phe Leu Ala Leu Thr Val Ala Arg Pro Arg Trp Arg Gly Gly
545                 550                 555                 560
Gly Gly Ser His His His His His His His His His His
                565                 570

Claims (14)

1.一种DNA适配体，其特征在于：所述DNA适配体为与人GPC1特异性结合的单链DNA分子，所述DNA适配体的核苷酸序列如序列28所示。
2.权利要求1所述的DNA适配体在制备胰腺癌和/或乳腺癌和/或前列腺癌和/或结直肠癌和/或脑胶质瘤的诊断试剂中的应用。
3.权利要求1所述的DNA适配体在制备检测人GPC1阳性外泌体试剂中的应用。
4.一种探针，其特征在于：所述探针为权利要求1所述的DNA适配体被标记物标记得到。
5.一种传感器，其特征在于：所述传感器包含权利要求1所述的DNA适配体或权利要求4所述的探针。
6.一种胰腺癌和/或乳腺癌和/或前列腺癌和/或结直肠癌和/或脑胶质瘤的诊断试剂，其特征在于：含有权利要求1所述的DNA适配体。
7.根据权利要求6所述的胰腺癌和/或乳腺癌和/或前列腺癌和/或结直肠癌和/或脑胶质瘤的诊断试剂，其特征在于：胰腺癌和/或乳腺癌和/或前列腺癌和/或结直肠癌和/或脑胶质瘤的诊断试剂还含有与人CD81特异结合的物质。
8.根据权利要求7所述的胰腺癌和/或乳腺癌和/或前列腺癌和/或结直肠癌和/或脑胶质瘤的诊断试剂，其特征在于：所述与人CD81特异结合的物质为与人CD81特异结合的适配体或与人CD81特异结合的适配体共轭的磁珠。
9.根据权利要求8所述的胰腺癌和/或乳腺癌和/或前列腺癌和/或结直肠癌和/或脑胶质瘤的诊断试剂，其特征在于：所述与人CD81特异结合的适配体的核苷酸序列如序列41所示。
10.根据权利要求7所述的胰腺癌和/或乳腺癌和/或前列腺癌和/或结直肠癌和/或脑胶质瘤的诊断试剂，其特征在于：所述与人CD81特异结合的物质为抗人CD81的抗体或与抗人CD81的抗体共轭的磁珠。
11.一种用于检测人外泌体GPC1蛋白质的试剂，其特征在于：含有权利要求1所述的DNA适配体和与人CD81特异结合的物质。
12.根据权利要求11所述的用于检测人外泌体GPC1蛋白质的试剂，其特征在于：所述与人CD81特异结合的物质为与人CD81特异结合的适配体或与人CD81特异结合的适配体共轭的磁珠。
13.根据权利要求12所述的用于检测人外泌体GPC1蛋白质的试剂，其特征在于：所述与人CD81特异结合的适配体的核苷酸序列如序列41所示。
14.根据权利要求11所述的用于检测人外泌体GPC1蛋白质的试剂，其特征在于：所述与人CD81特异结合的物质为抗人CD81的抗体或与抗人CD81的抗体共轭的磁珠。
CN202011238509.1A 2020-11-09 2020-11-09 一种gpc1 dna适配体及其应用 Active CN112501173B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011238509.1A CN112501173B (zh) 2020-11-09 2020-11-09 一种gpc1 dna适配体及其应用
PCT/CN2020/130517 WO2022095141A1 (zh) 2020-11-09 2020-11-20 一种gpc1 dna适配体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011238509.1A CN112501173B (zh) 2020-11-09 2020-11-09 一种gpc1 dna适配体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112501173A CN112501173A (zh) 2021-03-16
CN112501173B true CN112501173B (zh) 2023-04-28

Family

ID=74955649

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011238509.1A Active CN112501173B (zh) 2020-11-09 2020-11-09 一种gpc1 dna适配体及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN112501173B (zh)
WO (1) WO2022095141A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114280016A (zh) * 2021-12-07 2022-04-05 广州兆瑞医学生物科技有限公司 一种外泌体检测方法
WO2024096642A1 (ko) * 2022-11-02 2024-05-10 건국대학교 산학협력단 대장암 진단 또는 치료용 dna 압타머
CN116515844B (zh) * 2023-06-30 2023-09-08 四川大学华西医院 一种迁移体适配体及其筛选方法和应用
CN117330481B (zh) * 2023-11-27 2024-04-09 南京联笃生物科技有限公司 一种外泌体的流式检测方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107893101A (zh) * 2017-12-22 2018-04-10 郑州大学 一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒、方法及应用
CN109490528A (zh) * 2017-10-05 2019-03-19 香港科技大学 外泌体分析及癌症诊断方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105974122B (zh) * 2016-05-04 2018-09-28 华东医药（杭州）基因科技有限公司 一种检测外泌体gpc1蛋白的方法
CN110095608B (zh) * 2019-04-12 2022-04-15 南方医科大学南方医院 基于磁性分离和dna自组装的肿瘤外泌体纳米荧光传感器

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109490528A (zh) * 2017-10-05 2019-03-19 香港科技大学 外泌体分析及癌症诊断方法
CN107893101A (zh) * 2017-12-22 2018-04-10 郑州大学 一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒、方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖1的DNA适配体筛选;翟景勤等;《生物技术通讯》;20180130(第01期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112501173A (zh) 2021-03-16
WO2022095141A1 (zh) 2022-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112501173B (zh) 一种gpc1 dna适配体及其应用
Yu et al. An aptamer-based new method for competitive fluorescence detection of exosomes
Xiong et al. Cancer protein biomarker discovery based on nucleic acid aptamers
CN101036055B (zh) 循环癌细胞上Her-2/neu蛋白的增加水平的检测以及治疗
Jin et al. Cancer biomarker discovery using DNA aptamers
Tadimety et al. Advances in liquid biopsy on-chip for cancer management: Technologies, biomarkers, and clinical analysis
ES2253533T3 (es) Procedimiento para la deteccion cualitativa y/o cuantitativa de celulas.
KR102161733B1 (ko) 자성비드 및 분자비컨을 이용한 엑소좀의 다중검출방법
CN101538570B (zh) 用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法
CN109337909B (zh) 一种检测肝癌耐药细胞株的核酸适体及其应用
Portier et al. HER4 expression status correlates with improved outcome in both neoadjuvant and adjuvant Trastuzumab treated invasive breast carcinoma
CN113640515A (zh) 一种利用多种标志物联合检测外泌体的方法及试剂盒
Sousa et al. Recent advances in the selection of cancer-specific aptamers for the development of biosensors
Yang et al. Elemental-tagged immunoassay combined with inductively coupled plasma mass spectrometry for the detection of tumor cells using a lead sulfide nanoparticle label
US11073521B2 (en) Methods for monitoring polymorphonuclear myeloid derived suppressor cells
EP3102593A1 (en) Fluorometric immunoassay for detection of anti-dsdna antibodies
CN105527433A (zh) 一种检测肿瘤标志物的荧光方法
KR101995189B1 (ko) 비침습적 체외진단을 위한 간암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 포함하는 키트
CN109266653B (zh) 一种耐药异质性循环肿瘤细胞捕获与基因分析的试剂、装置和方法
KR100925147B1 (ko) 폐암 진단용 마커
CN101914543B (zh) 一种用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法
KR101334123B1 (ko) 소세포폐암 진단용 조성물 및 소세포폐암 진단키트
KR20160050727A (ko) 리포칼린 2 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도
KR102323360B1 (ko) 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치 및 제조방법
CN114350670A (zh) 特异性识别可溶性st2蛋白的核酸适配体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant