ES2253533T3 - Procedimiento para la deteccion cualitativa y/o cuantitativa de celulas. - Google Patents
Procedimiento para la deteccion cualitativa y/o cuantitativa de celulas.Info
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Abstract
Procedimiento para la detección cualitativa y/o cuantitativa de células biológicas predeterminadas de y/o en una muestra que contiene células biológicas, en el que la muestra se mezcla con una combinación predeterminada de al menos dos anticuerpos y/o derivados de anticuerpo que se unen por sus sitios de unión a diferentes epítopos que están preferencialmente presentes en las células que se van a detectar, y/o con al menos un anticuerpo y/o derivado de anticuerpo biespecífico, que se une por sus dos sitios de unión a diferentes epítopos que están preferencialmente presentes en las células que se van a detectar, se separan las células marcadas con al menos uno de los anticuerpos y/o derivados de anticuerpo de la muestra, y las células separadas se ensayan con una combinación predeterminada de al menos dos reactivos de detección biológico-molecular en cuanto a la expresión de una combinación predeterminada de al menos dos porciones de ARNm, realizándose su expresión preferencialmente en las células que se van a detectar, y se detecta si se expresa al menos una de las porciones de ARNm.
Description
Procedimiento para la detección cualitativa y/o
cuantitativa de células.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección cualitativa y/o cuantitativa de
células en una muestra. Los procedimientos de detección de este tipo
son necesarios especialmente en el diagnóstico o control del
tratamiento de enfermedades tumorales. Por ello es de gran
importancia en el marco de la previsión o
post-tratamiento del cáncer poder detectar
prematuramente tumores malignos y/o recaídas de tumores malignos en
función de la aparición de células tumorales metastatizadas en
sangre. No obstante el presente procedimiento no sólo se usa en esta
invención sino que se puede usar fundamentalmente para la detección
y para el reconocimiento de células extrañas en muestras que
contienen células biológicas. Esto se puede realizar, por ejemplo,
también para la detección de células fetales en sangre materna o
también para la detección de células madre.
El cáncer de testículos es responsable de al
menos el 2% de todas las neoformaciones malignas de tumores en
hombres. Sin embargo, el cáncer de testículos constituye el 20 al
30% de todas las enfermedades cancerígenas en hombres menores de 40
años. La cifra anual de nuevos enfermos, por ejemplo, en la
República Federal de Alemania es de aproximadamente 3600, en los que
fallecen aproximadamente 240 hombres de cáncer de testículos. A este
respecto la mayor incidencia se encuentra entre los 25 y 40 años de
vida. Mediante la investigación en terapia oncológica se pueden
curar hoy en día a largo plazo sobre el 90% de todos los casos. A
este respecto la elevada supervivencia se basa a la remarcada
actividad de las quimioterapias basadas en
cis-platino.
El cáncer de mama es el diagnóstico más frecuente
cuando se manifiesta una enfermedad tumoral en mujeres (26,4% de
todas las nuevas enfermas). A pesar de que se dispensaron esfuerzos
masivos en cuanto a la detección precoz, tratamiento y
post-tratamiento, esta enfermedad se sitúa cada vez
más en la primera causa de muerte provocada por cáncer en mujeres.
Las cifras de enfermedad en las repúblicas federadas esencialmente
industriales aumentaron más en años pasados a pesar de los fuertes
esfuerzos en la detección precoz. Es problemático la elevada tasa de
metastatización tras el primer tratamiento que lleva al paciente en
la mayoría de los casos ya tras 1 a 3 años a la muerte. La razón
principal para esto es la dispersión de células tumorales en
estadios incipientes del desarrollo de tumores. Además de la
detección precoz de un carcinoma de mama es por tanto especialmente
de importancia decisiva la detección lo más pronto posible de
células metastatizadas para un tratamiento con éxito. Igualmente
puede ser de gran ayuda en el estadio clínico I una detección
negativa definitiva, si se ha de decidir si la paciente se debe
someter a una quimioterapia o a una operación.
En el tumor primario colonrectal se ha de
analizar la progresión del tumor tras la resección en primer lugar
sobre células tumorales residuales. Estas células se desprenden pre-
o intraoperativamente del tumor primario y adquieren la posibilidad
de dispersión en todo el organismo.
Por tanto además de la detección precoz de un
carcinoma colonrectal es especialmente de importancia decisiva la
detección lo más pronta posible de células metastatizadas para un
tratamiento con éxito.
A este respecto es válido decidir en el estadio
clínico 1 de las enfermedades si el paciente se debe someter a una
quimioterapia y/o a una operación, para conseguir un éxito de
curación duradero. En relación a esto se trata un gran número de
pacientes quimioterapéuticamente, aunque no presenten detección
segura de una metastatización. Por el contrario, en los conceptos
que se consideran en la supervisión pura se llega en el 25% de los
casos a recaídas en parte con desenlace mortal.
En los procedimientos de estudio usados hoy en
día se determinan en pacientes de cáncer los denominados marcadores
tumorales sobre plano de la proteína (inmunológicamente y/o
enzimáticamente) cuantitativamente en sangre o en otros fluidos
corporales. No obstante, estos procedimientos de detección son sólo
adecuados de forma condicionada para el diagnóstico de tumor y/o
control de tratamiento/post-tratamiento en tumores,
ya que los valores elevados de marcadores tumorales en fluidos
corporales también pueden ser provocados por enfermedades no
tumorales como, por ejemplo, inflamaciones del tracto
gastrointestinal, cirrosis hepática, infecciones por virus o fuerte
hábito de
fumar.
fumar.
Los procedimientos
genético-moleculares se muestran aquí útiles para la
detección de células tumorales en sangre periférica, ya que al
comienzo del proceso de metastatización puede tener lugar el paso de
células tumorales a la sangre venosa.
El documento EP 0520794 B1 da a conocer un
procedimiento de este tipo, en el que se detecta metastatización en
tejidos corporales o fluidos. A este respecto se detectan ácidos
nucleicos, por ejemplo, por medio de multiplicación mediante
reacción en cadena de la polimerasa. El procedimiento se basa de
forma determinante en que se expresa la secuencia de ácido nucleico
a detectar en células del tejido de procedencia de un tumor, es
decir, en células tumorales y en función del marcador también en las
células sanas del tejido de procedencia. Otra condición es que esta
secuencia normalmente no se exprese en aquellas células cuyo tejido
se estudie. Por tanto, si se encuentra una secuencia correspondiente
en la muestra estudiada esta debe provenir de células arrastradas,
es decir metastatizadas de un tumor forastero. Por tanto, este
procedimiento se basa en definitiva en la detección de células que
no deberían presentarse en la muestra de sangre de personas
sanas.
En suma se demuestra que los procedimientos de
diagnóstico usados hoy en día son muy inexactos si estos giran en
torno a la valoración de la potencia maligna de tumores residuales
tras quimioterapia llevada a cabo en los estadios de
metastatización. Además es válido por tanto encontrar pruebas de una
metastatización oculta y/o residual que permita una asignación a
tiempo de las múltiples opciones terapéuticas curativas primarias.
En esto el problema esencial es que las células que se deben
detectar, por ejemplo, células tumorales en sangre periférica, sólo
se presentan en número extremadamente bajo.
El documento WO 98/12227 A1 da a conocer un
procedimiento para la detección de la expresión del antígeno
GP-54. Para este fin se aíslan en primer lugar de
una muestra células inmunológicamente por medio de dos anticuerpos
dirigidos contra epítopos distintos del antígeno
GP-54. Para estas células aisladas se prueba a
continuación la detección de la expresión de GP-54
mediante análisis del ARNm.
El documento WO 97/37226 A1 da a conocer un
procedimiento para la consecución de células tumorales o fragmentos
de células tumorales mediante un anticuerpo y/o una mezcla de
anticuerpos. El análisis de las células o fragmentos de células así
obtenidos se realiza mediante procedimientos ópticos, que hacen
posible al observador distinguir células tumorales de células
normales.
El documento WO 96/29430 A1 da a conocer la
detección de células tumorales con un ensayo multimarcador. En esto
se estudian dos o varios marcadores de ARNm en muestras, por
ejemplo, muestras de sangre. Los resultados de estas detecciones de
multimarcador biológico-molecular se comparan con un
grupo de referencia estadísticamente significativo de pacientes
normales y pacientes de melanoma o cáncer de mama y en base a esta
comparación se lleva a cabo una correlación del número y tipo de
marcadores con distintos estados clínicos. El objetivo de este
procedimiento es detectar tumores ocultos también en pacientes en
los que no están presentes evidencias clínicas de un tumor.
Hardingham y col.:
"Immunobead-PCR: A technique for the detection of
circulating tumor cells using immunomagnetic beads and the
polymerase chain reaction", Cancer Research, tomo 53 (1993),
páginas 3455 a 3458 da a conocer un procedimiento para la detección
de células tumorales diseminadas en muestras de sangre. Para este
fin se realiza en primer lugar una etapa de enriquecimiento
inmunológico por medio de un anticuerpo seguida de la detección de
una mutación de ADN. Para la etapa de enriquecimiento inmunológico
se determina experimentalmente el anticuerpo más adecuado a partir
de una selección de anticuerpos y a continuación se usa para el
procedimiento.
Con el conocimiento de este estado de la técnica
es objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento
con el que se puedan detectar con mayor sensibilidad y especificidad
de forma sencilla, segura y reproducible células biológicas extrañas
en una muestra que contiene células biológicas.
Este objetivo se consigue mediante el
procedimiento según la reivindicación 1. Se dan otras
configuraciones ventajosas del procedimiento de acuerdo con la
invención en las respectivas reivindicaciones subordinadas.
Es decisivo en el procedimiento de acuerdo con la
invención que en primer lugar las células que se van a seleccionar
y/o a detectar se marquen por medio de una combinación de
anticuerpos o derivados de anticuerpos o un anticuerpo o derivado de
anticuerpo bi-específico. De este modo es posible
marcar, separar y con ello enriquecer especialmente las células
buscadas. Esto significa que en una primera etapa se realiza una
detección y/o selección inmunológica combinada. Con derivado de
anticuerpo se entiende en esta solicitud cada tipo de anticuerpo o
fragmento de anticuerpo modificado, que presenta un sitio de unión,
por ejemplo, anticuerpos de una cadena, fragmentos de anticuerpos
como fragmentos Fab o anticuerpos recombinantes. En lo sucesivo se
designan, cuando se habla de "anticuerpos", siempre anticuerpos
y/o derivados de anticuerpos.
En una segunda etapa se detectan en base
biológico-molecular con una combinación predefinida
de reactivos de detección al menos un marcador, que es específico
para las células sanas y/o se debe encontrar en estas
preferencialmente, de modo que se seleccionan de nuevo aquí
específicamente las células sanas. Esto se trata por tanto de una
detección biológico-molecular combinada. Por tanto,
la idea básica de la presente invención es combinar una detección
mediante una combinación de parámetros inmunológicos con una
detección mediante una combinación de parámetros
biológico-moleculares. De forma sorprendente
resultan de este modo resultados de detección muy relevantes con los
que se avanza en los alcances de detección, que no eran accesibles
hasta ahora con el conjunto de técnicas conocidas del estado de la
técnica. Así se pueden detectar concentraciones de células sanas en
muestras de sangre de hasta dos células por 5 mililitros. En el
estado de la técnica no se consigue hoy en día una especificidad y
selectividad de este tipo.
Las células eucarióticas portan una multiplicidad
de moléculas distintas en su superficie celular. La combinación de
las moléculas de superficie exprimidas se diferencia en
correspondencia al origen y la función de las células individuales,
de modo que se genera el patrón específico del tipo de célula. Para
el reconocimiento de este patrón específico del tipo de célula se
usan anticuerpos. Los anticuerpos se unen con mayor especificidad a
su antígeno, en moléculas de superficie seleccionadas. Esta
propiedad se usa para reconocer células por medio de unión del
anticuerpo específico en función de su patrón específico del tipo
celular y distinguir unas de otras.
De este modo se distingue, por ejemplo, la
expresión de proteínas de superficie especiales de células tumorales
de células no transformadas de este tipo de célula.
La detección de los marcadores precede una
selección de las células diana mediante la unión de distintos
anticuerpos a las células sanas. Así la expresión de proteínas de
superficie especiales diferencia células de un tipo de células de
otro tipo. De este modo se diferencia, por ejemplo, la expresión de
células tumorales con proteínas de superficie especiales de células
no transformadas de este tipo de células.
Debido a que se diferencia el patrón especial del
antígeno de superficie, por ejemplo, en células tumorales también de
los patrones típicos de células sanguíneas, se pueden diferenciar
células tumorales en la sangre. Para identificar células tumorales
se usan anticuerpos como herramientas, que reconocen específicamente
estas proteínas de superficie especiales. La unión del anticuerpo
específica es útil para distintos procedimientos de análisis y
separación.
En virtud de la unión intensiva de
inmunoglobulinas seleccionadas especialmente para este fin es
posible además del reconocimiento de células mediante sus epítopos
de superficie también una separación de células reconocidas de no
reconocidas.
Son posibles distintos principios de
separación:
- 1.
- Principio de separación basado en fase líquida; por ejemplo citometría de flujo:
- Para el análisis por citometría de flujo se acoplan anticuerpos con colorantes de fluorescencia. Se conducen individualmente por delante de una fuente de luz (láser) células aisladas en una corriente de líquido constante. En la irradiación de las células se estimulan las sustancias fluorescentes unidas a los anticuerpos e irradian luz de longitudes de onda determinadas. La luz irradiada se detecta y la señal medida se guarda digitalmente. La señal de luz se puede asignar a células individuales. Las células marcadas con anticuerpo se reconocen así y se pueden separar ahora de otras células. Para la separación se aíslan las células en gotas más pequeñas. Tras reconocimiento de las células marcadas con anticuerpo se llevan las gotas correspondientes a un recipiente colector. Un enriquecimiento de este tipo puede realizarse, por ejemplo, mediante citometría de flujo FACS. A este respecto se incuban, por ejemplo, células enriquecidas con anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia frente a proteínas de superficie específicas del tumor. Las células marcadas se lavan dos veces con PBS y a continuación se resuspenden 10^{7} células en 1 ml de PBS. Para el aislamiento de las células tumorales se usa un citómetro de flujo FACS Vantage SE (Becton Dickinson). Mediante el programa CellQuet se realizaron la toma de datos, el control de instrumentos y valoración de los datos. Las células extrañas se transfirieron a un recipiente de reacción de 1,5 ml (relleno con 1 ml de PBS). El ARN se puede aislar luego como se describe más adelante.
- 2.
- Principio de separación basado en fase sólida; por ejemplo separación magnética:
- Para la separación magnética se acoplan anticuerpos a partículas pseudomagnéticas. Tras introducción de las partículas pseudomagnéticas en un campo magnético las partículas cambian en el campo magnético. En el movimiento en este campo magnético se arrastran células, que están unidas a estos anticuerpos acoplados, y se separan de otras células.
Por consiguiente para el reconocimiento celular
mediante partículas magnéticas se acoplan anticuerpos a partículas
pseudomagnéticas, que poseen un número definido en sitios activos
químicamente sobre su superficie. Los procedimientos de acoplamiento
son conocidos, por ejemplo, de James P. Gosling,
Solid-phase Concepts and Design, en: R.F. Masseyeff,
W.H. Albert N.A. Staines (eds), Methods of Immunological Analysis,
volumen 1, VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, páginas 507 a
529. Mediante la especificidad de los anticuerpos se determina la
especificidad de la separación. Se mezcla una muestra de sangre que
contiene células diana con partículas magnéticas acopladas con
anticuerpos; entonces las partículas las partículas y la sangre unas
respecto a otra, por ejemplo, mediante "rotación con agitador
suspendido" de muestras que se encuentran en un recipiente
cerrado o mediante movimiento de partículas en base al campo
magnético variable. Aquellas células diana, que son reconocidas por
uno de los anticuerpos unidos a fase sólida y por tanto se unen
sólidamente, siguen el movimiento de las partículas. Mediante esto
es posible, con la disposición de un campo magnético, extraer las
partículas con las células unidas a estas de la sangre (por
ejemplo, en la pared del recipiente de separación). La sangre
agotada de este modo en células diana se puede se puede intercambiar
con otras soluciones, en donde las células separadas mediante
partículas magnéticas permanecen hasta la interrupción/retirada del
campo magnético del lugar y se encuentran disponibles para otros
usos.
De forma alternativa a los principios de
separación descritos se puede usar también cualquier otro principio
de separación del estado de la técnica, que se base en el marcado de
células con anticuerpos.
De acuerdo con la invención se usan de forma
ventajosa para el reconocimiento de células tumorales mezclas de
anticuerpos específicos. Por ejemplo, son adecuados para el
reconocimiento de células tumorales en la sangre una combinación de
los anticuerpos MOC-31 y
Ber-EP4.
| Mezcla de anticuerpos | ||
| Antígeno | Clon | Concentración |
| Antígeno relacionado con el epitelio | MOC-31 (compañía Novocastra) | 1,25 \mul/10^{8} células |
| Antígeno del epitelio | Ver-EP4 (compañía DAKO) | 0,924 \mul/10^{6} células |
Mediante la mezcla de anticuerpos en la tabla 1
anterior se detectan preferiblemente células tumorales con mayor
especificidad. Esto se basa en la expresión preferida de
determinadas proteínas de superficie, que distinguen las células
cancerígenas de otras células.
Las mezclas de anticuerpos de este tipo muestran
una sensibilidad mayor en comparación con los respectivos
anticuerpos usados por separado en el reconocimiento de células y
separación de células independientemente del procedimiento
usado.
La presente invención se basa además
esencialmente en que casi no se detectan marcadores celulares sobre
planos inmunológicos o enzimáticos en la sangre de pacientes, sino
que como marcadores biológico-moleculares se
detectan los ARNm (ácido ribonucleico mensajero) de células buscadas
en una muestra, por ejemplo, de una muestra de sangre.
Debido a que los marcadores individuales se
expresen de forma distinta dependiendo de la terapia, se estudia una
combinación de marcadores tumorales, para detectar todas las células
tumorales que circulan en la sangre. Mediante esto se pueden
reconocer también células tumorales si la expresión de un marcador
determinado en un paciente y/o en un estadio de enfermedad es
relativamente baja, lo que sino podría llevar a un resultado
hipotéticamente negativo. El uso de marcadores choca sin embargo en
la mayoría de los casos con limitaciones ya que las células
sanguíneas mononucleares presentan una expresión de fondo
("trascripción ilegítima"), que dificulta un análisis
exacto.
Como marcador, por ejemplo para tumores, se
detecta la expresión de los genes mencionados en la tabla 2. A este
respecto la detección se puede llevar a cabo para dos marcadores o
también para un número discrecional de estos marcadores tumorales en
combinación unos con otros. El kit de acuerdo con la invención puede
contener por tanto pares de oligonucleótidos para dos o una elección
discrecional o también todos los marcadores tumorales.
| Gen y/o producto génico | Gen | Designación alternativa |
| Gen GA733-2 del antígeno asociado al carcinoma humano | GA733-2 | GA733-2 |
| \begin{minipage}[t]{87mm} Gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EFGR) humano \end{minipage} | EGFR | EGFR |
| Gen del antígeno carcinoembriónico (CEA) humano | CEA | CEA |
| Mucina 1 (MUC 1) de homo sapiens | MUC1 | CA15-3 |
| Gen (ERBB2) de la proteína C-erb B2/neu de homo sapiens | HER-2/neu | HER-2 |
| ARNm de claudina 7 (CLDN7) de homo sapiens | Claudina 7 (CLDN7) | Claudina-7 |
| \begin{minipage}[t]{88mm} Fosfatasa alcalina, tipo placentaria (Nago isozyme), fosfatasa alcalina de célula germinal), (tipo P\_AP) \end{minipage} | ALPPL2 (GCAP) | FLAP |
| \begin{minipage}[t]{88mm} Gen del receptor peptídico liberador de la gastrina (GPPR) de homo sapiens \end{minipage} | GRPR | GRPR |
| \begin{minipage}[t]{88mm} ARNm, isoforma I-C de la proteína del grupo de alta movilidad (no histona cormosomal) (HMGIC) del homo sapiens \end{minipage} | HMGIC | HMGI-C |
| Gen del homo sapiens para citoqueratina 20 | CK20 | CK20 |
| Gen del antígeno MAGE-3 (MAGE-3) de homo sapiens | MAGE-3 | MAGE-3 |
| Gen de estaniocalcina 1 (STC1) de homo sapiens | Estaniocalcina 1 (STC1) | Estaniocalcina |
De este modo se desprecian todos aquellos casos
en los que por ejemplo se expresan igualmente los marcadores
tumorales a consecuencia de otras enfermedades y alcanzan la vía
sanguínea sólo como proteína. Se detectan por consiguiente por la
primera etapa de selección inmunológica únicamente células, que por
un lado se encuentran como tales en la muestra de sangre y por otro
lado expresan el o los respectivos marcadores tumorales. A este
respecto se trata por consiguiente de células tumorales que proceden
de su tejido tumoral original y se arrastraron a la sangre de los
pacientes. Debido a que normalmente no se expresa el ARNm del
marcador estudiado en la sangre de un enfermo no de tumor, se
muestra una correlación directa entre la existencia del ARNm
correspondiente y una metastatización ya en estadio temprano en el
proceso de metastatización.
A este respecto no se detecta sólo el ARNm de un
marcador tumoral individual sino que se estudia una combinación de
marcadores. Por ello es posible poder detectar formas cancerígenas
mediante sus células metastatizantes en la sangre. Esto significa
que en el caso de tumores de testículos se detectan formas de cáncer
de testículos tanto seminoso como también no seminoso y/o también
tumores mixtos con proporciones de un seminoma y con esto de 90 a
95% de todos los tumores malignos del testículo, a saber, tumores de
células germinales completas.
Por tanto para el reconocimiento de células de
tumor de testículo se propone de acuerdo con la invención una
combinación de al menos dos de los siguientes marcadores:
- -
- GA733.2
- -
- GCAP/PLAP
- -
- HMGI-C
- -
- GRPR
Para el reconocimiento de células de cáncer de
mama se propone de acuerdo con la invención una combinación de al
menos dos marcadores tumorales de los siguientes grupos de
marcadores:
- a)
- EGFR, CEA, estaniocalcina, MAGE-3, CK20, claudina 7, Her-2/neu, MUC1 y GA 733.2;
- b)
- CK20, MAGE-3 y MUC1
- c)
- Her-2/neu y claudina 7 así como
- d)
- EGFR, CEA y estaniocalcina
Para el reconocimiento de células de cáncer de
intestino se propone de acuerdo con la invención una combinación de
al menos dos marcadores tumorales de los siguientes grupos de
marcadores:
- a)
- CK20, EGFR, GA 733.2, CEA y estaniocalcina,
- b)
- CK20, EGFR, CEA y estaniocalcina así como
- c)
- EGFR, CEA y GA 733.2
A continuación se dan algunos ejemplos, de los
cuales resulta que con el procedimiento de acuerdo con la invención
se consigue una sensibilidad de detección que es muy superior a la
de todos los conocidos hasta ahora del estado de la técnica. Las
figuras 1 a 10 muestran resultados de distintos protocolos de
ensayo.
En conjunto para la totalidad de ejemplos el modo
de proceder fundamental es que comprenda una primera etapa con
enriquecimiento inmunológico de células diana y una segunda etapa de
una detección de marcadores de ARNm en las células enriquecidas
inmunológicamente. A continuación se describen estas etapas de forma
general ya que son idénticas para todos los ejemplos.
En primer lugar se extrajo una muestra de sangre
periférica y a esta se añade un número definido de células diana,
por ejemplo, 2, 10, 100 células de un tipo de tumor determinado.
Además de esto se acoplaron anticuerpos a
partículas magnéticas. A este respecto se usaron los anticuerpos
representados a continuación en la tabla 3.
| Antígeno | Clon | Compañía |
| Antígeno de membrana epitelial | GP1.4 | Novocastra |
| Antígeno epitelial | MOC-31 | Novocastra |
| Antígeno epitelial | Ber-EP4 | DAKO |
| Muc 1 | HMPV.2 | Pharmingen |
| PLAP | 8B6 | Cymbus Biotechnology LTD |
| Antígeno de membrana epitelial | E29 | DAKO |
| Antígeno de membrana epitelial | 131-11741 | HISS |
A este respecto se usaron las partículas
magnéticas con una concentración de partículas de 4 x 10^{8}
esferas/ml (kit CELLectlon^{TM} Pan Mouse IgG, compañía Dynal).
Las relaciones entre la concentración de anticuerpos y los
anticuerpos acoplados a ellas se reproducen en la tabla 4.
| Clon | Concentración de anticuerpo | \mul de anticuerpo/25 \mul de partículas |
| BerEP4 | 0,1 mg/ml | 4 \mul |
| HMPV.2 | 0,5 mg/ml | 4 \mul |
| MOC31 | k.A. dilución véase indicaciones del fabricante (liofilizado) | 4 \mul |
| GP1.4 | k.A. dilución véase indicaciones del fabricante (liofilizado) | 4 \mul |
| 8B6 | 0,1 mg/ml | 4 \mul |
| 131-11741 | 0,5 mg/ml | 4 \mul |
| E29 | 0,1 mg/ml | 4 \mul |
Las partículas magnéticas así preparadas se
añadieron según cada mezcla de ensayo y sistema de detección a la
sangre. La adición correspondiente de partículas magnéticas
acopladas a anticuerpos por ml de sangre a una concentración de
partida de 4 x 10^{8} esferas/ml se reproduce en la tabla 5.
| Anticuerpo tumoral | Diagnóstico de cáncer | Diagnóstico de cáncer | Diagnóstico de cáncer |
| de mama | de intestino | de testículos | |
| BerEP4 | 8,3 \mul | 10 \mul | 8 \mul |
| HMPV.2 | 8,3 \mul | ||
| MOC31 | 10 \mul | 8 \mul | |
| GP1.4 | 8,3 \mul | ||
| 8B6 | 4 \mul |
Después de incubación de dos horas en el agitador
suspendido se lavaron las partículas magnéticas, que dado el caso se
presentan como complejos de
célula-anticuerpo-partícula
magnética, por medio de un concentrador de partículas magnéticas
(MPC®-S, compañía Dynal) 3 veces con PBS (solución salina tamponada
con fosfato) y las células que se adhieren se tratan a continuación
en correspondencia al protocolo de aislamiento de ARN descrito más
adelante.
Como alternativa para la separación mediante
partículas magnéticas se ofrece una separación inmunológica mediante
citometría de flujo (separación de células asociadas a
fluorescencia, FACS).
Aquí se consigue un primer enriquecimiento
relativo de las células tumorales mediante eliminación de los
eritrocitos. Para este fin se mezcla sangre completa (con EDTA) con
un tampón hipotónico para la lisis de eritrocitos y se incuba
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células que contienen
núcleo que quedan se centrifugan y se resuspenden en PBS/BSA. Las
células así obtenidas se incuban a continuación con anticuerpos, que
están marcados con un fluoróforo. Las células diana que están
marcadas con fluorescencia por unión a un anticuerpo, se separaron
luego mediante FACS.
De forma alternativa se ofrece un enriquecimiento
mediante centrifugación en gradiente de densidad. Mediante una
centrifugación de este tipo con distintos gradientes de densidad se
separan células de densidad volumétrica media distinta unas de
otras. Las células sanguíneas mononucleares se separan mediante un
gradiente Ficoll-Hypaque (compañía Pharmacia,
Uppsala, Suecia) y a continuación se lava dos veces con PBS/FCS al
1%. A continuación se realiza un enriquecimiento acoplado con fase
sólida (por ejemplo, mediante partículas magnéticas) y/o una
separación basada en fases líquidas (FACS) de células diana como se
describió anteriormente.
En primer lugar se realiza un aislamiento del ARN
completo de las células separadas como se describió anteriormente.
Esto se realiza con el kit QIAamp RNA Blood Mini (compañía Qiagen,
Hilden) según las indicaciones del fabricante del mismo, en donde el
tampón para lisis se añadió directamente a las células unidas a las
partículas magnéticas. Mediante una digestión del ADN adicional en
la columna se evita una contaminación con ADN genómico. Esta
digestión de ADN se realiza con el RNase-Free DNase
Set, compañía Qiagen, Hilden.
De forma alternativa se puede realizar también un
aislamiento del ARNm, por ejemplo, por medio de partículas
magnéticas acopladas con Oligo(dT), kit Dynabeads® mRNA
Direct^{TM} Micro (compañía Dynal). También se realiza este
aislamiento correspondientemente a las indicaciones del fabricante
facilitadas en el kit.
Como otra alternativa al aislamiento de ARN se
lisan las células aisladas mediante adición de reactivo de trizol
(compañía Gibco BRL, Nueva York, EEUU) y se homogenizan mediante
pipeta. Después de extracción con cloroforma subsiguiente se
precipita la fase acuosa que contiene ARN en isopropanol a -80ºC.
Tras lavado dos veces y centrifugación en etanol al 80% se seca el
agregado en el aire y a continuación se resuspende en agua libre de
RNasa. Esta etapa de procesamiento se realiza igualmente según
protocolos habituales.
En el aislamiento del ARN se culmina una
transcripción inversa en la que se transcribe el ARNm en ADNc.
Para este fin se desnaturaliza el ARN en un
volumen correspondiente de agua según la mezcla de reacción de la
tabla 6 junto con cebadores Oligo(dT)15 (compañía
Promega, Mannheim) durante 5 minutos a 65ºC y a continuación se
incuba directamente sobre hielo.
| Componentes de la síntesis de ADNc | ||
| La síntesis de ADNc se realiza en una mezcla de reacción de 20 \mul | ||
| Componentes | Volumen | Concentración final |
| ARN/ARNm | 10 \mul | - |
| 10 x tampón para TR (transcripción inversa) | 2 \mul | 1 x |
| dNTP-Mix (cada 5 mM) | 2 \mul | Respectivamente 0,5 mM |
| Cebador Oligo(dT) (10 \muM) | 2 \mul | 1 \muM |
| Inhibidor de RNasa | 1 \mul | 0,6 unidades/\mul |
| Transcriptasa inversa | 1 \mul | 4 U |
| Agua exenta de RNasa | Hasta 20 \mul |
\newpage
La síntesis de ADNc se realizó a 37ºC durante una
hora con inactivación subsiguiente de la transcriptasa inversa
mediante calentamiento durante 5 minutos a 95ºC y a continuación
enfriamiento sobre hielo. Para este fin se usó un kit de
transcriptasa inversa Sensiskript, compañía Qiagen, Hliden según
protocolos facilitados en el mismo.
En el caso del uso de partículas magnéticas
acopladas con Oligo(dT) ya para el aislamiento de ARNm no
tiene lugar a continuación la adición de cebadores Oligo(dT),
es decir, el conector Oligo(dT) sirve simultáneamente como
cebador para la transcripción inversa, con lo que las partículas
magnéticas permanecen en la mezcla de reac-
ción.
ción.
A continuación de la transcripción del ARNm en
ADNc se realiza una reacción en cadena de la polimersa (PCR) con
\beta-actina como control interno.
A este respecto se usaron los oligonucleótidos
indicados en la tabla 7 como cebadores de PCR para la amplificación
de ADNc en correspondencia a distintos genes marcadores, como se
indican en la primera columna.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La tabla 7 contiene en la primera columna el dato
del marcador tumoral que se va a detectar, en el que se indican
respectivamente dos oligonucleótidos (homosentido y antisentido)
como par cebador. La longitud del producto de la PCR que se produce
mediante el cebador indicado en la columna dos se indica en la
columna tres. La PCR se llevó a cabo con la mezcla de reacción
indicada en la tabla 8.
| Mezcla de reacción para PCR | ||
| La síntesis por PCR se realizó en una mezcla de reacción de 50 \mul | ||
| Componentes | Volumen | Concentración final |
| ADNc | 6 \mul | |
| Tampón de PCR* 10 veces | 5 \mul | 1 vez |
| Mezcla dNTP | 1 \mul | Respectivamente 200 \muM |
| Cebador | Véase tablas 7 y 9 | |
| Polimerasa Taq-ADN** | 0,5 \mul | 2,5 U |
| Solución Q*** | 10 \mul | |
| H_{2}O | Hasta 50 \mul | |
| (* contiene MgCl_{2} 15 mM; **Polimersa HolStarTaq^{TM} DANN, Hilden) | ||
| (*** La adición de 10 \mul de solución Q (Qiagen, Hilden) es sólo necesario para la detección de GCAPIPLAP). |
La tabla 9 da un listado de la combinación de
cebadores y concentraciones de cebadores específicas como
concentración final en la mezcla de reacción de la PCR. En los
siguientes ejemplos se muestra para los distintos cánceres de mama,
cánceres de intestino y cánceres de testículos de tipo tumoral
respectivamente una combinación múltiple a modo de ejemplo de estos
cebadores, tal como se indican en la tabla 9.
| Marcador Cebador | Cáncer de mama 1 | Cáncer de intestino 1 | Cáncer de testículos 1 |
| GA733.2 homosentido | 500 nM | 500 nM | 500 nM |
| GA733.2 homosentido | 500 nM | 500 nM | 500 nM |
| EGFR homosentido | 750 nM | ||
| EGFR antisentido | 750 nM | ||
| CEA homosentido | 750 nm | ||
| CEA antisentido | 750 nM | ||
| CA-15-3 homosentido | 400 nM | ||
| CA-15-3 antisentido | 400 nM | ||
| Her-2 homosentido | 300 nM | ||
| Her-2 antisentido | 300 nM | ||
| Claudina-7 homosentido | 400 nM | ||
| Claudina-7 antisentido | 400 nM | ||
| GCAP/PLAP homosentido | 800 nM | ||
| GCAP/PLAP antisentido | 800 nM |
| Marcador Cebador | Cáncer de mama 1 | Cáncer de intestino 1 | Cáncer de testículos 1 |
| GRPR homosentido | 500 nM | ||
| GRPR antisentido | 500 nM | ||
| HMGI-C homosentido | 500 nM | ||
| HMGI-C antisentido | 500 nM | ||
| \beta-actina homosentido | 100 nM | 200 nM | 100 nM |
| \beta -actina antisentido | 100 nM | 200 nM | 100 nM |
Las condiciones de la PCR (índice de ciclos,
realización de los ciclos etc.) se dan en las tablas 10 y 11.
| Condiciones de la PCR | ||
| Predesnaturalización | 95ºC 15 minutos | |
| Ciclo | ||
| 1. | Desnaturalización | 94ºC 1 minuto |
| 2. | Hibridación | xºC 1 min (véase tabla 1) |
| 3. | Extensión | 72ºC 1 minuto |
| Extensión final | 72ºC 10 minutos | |
| 4ºC pausa |
| Temperatura de anelación múltiple-específica e índice de ciclos | |||
| Marcador | Cáncer de mama 1 | Cáncer de intestino 1 | Cáncer de testículos 1 |
| Temperatura de hibridación | 60ºC | 58ºC | 58ºC |
| Número de ciclos | 35 | 40 | 40 |
| (Termociclador: PCT 200, Biozym) |
Los amplificados así producidos del ADNc se
separaron electroforéticamente mediante un bioanalizador 2100
(compañía Agilent). Para este fin se separó 1 \mul del producto de
la PCR en el bioanalizador sobre una microformación de ADN (500) y
el resultado de la separación se documenta electrónicamente. De esta
forma se generaron las figuras 1 a 10.
De forma alternativa se separan 25 \mul del
producto de la PCR sobre un gel de agarosa al 2,5% y se colorean las
bandas de ADN con bromuro de etidio. La documentación se realiza,
por ejemplo, con ayuda del Sistema DUO Store de la compañía
Intas.
De forma alternativa se puede llevar a cabo
además un análisis de fragmentos, por ejemplo, mediante un
analizador genético ABI Prism 310 Genetic (compañía PE Applied
Biosystem, Weiterstadt). Para este fin se usa respectivamente 1
\mul del producto de la PCR en la dilución 1.50. Es este caso se
usan cebadores marcados con fluorescencia.
La figura 1 muestra el resultado de un
procedimiento de acuerdo con la invención para el reconocimiento de
células de cáncer de mama en la sangre. Para este fin se añadió a
sangre de individuos sanos una cantidad definida en células
tumorales de una línea celular de cáncer de mama. El número de
células añadidas fue a este respecto de 10 células (10 c) y/o 100
células (100 c) por mililitro de sangre. Así al figura 1A y 1B
muestran separaciones electroforéticas respectivas, en las que las
bandas individuales en estas y en las sucesivas están marcadas con
los mismos términos. El término patrón designa calibradores de 50 a
600 pb de longitud, con RT-Co se designa un control
que no contenía en modo alguno ARNm, con PCR-Co se
designa una medida de control, que no contenía en modo alguno ADNc.
Con "sangre" se designa la muestra de sangre sin células
tumorales inoculadas, con 10 c la muestra de sangre con 10 células
tumorales inoculadas por mililitro y con 100 c la muestra de sangre
con 100 células tumorales inoculadas por mililitro y/o por 5
mililitros. Con "línea celular" se designa una medida de
control con un número de células grande de línea celular tumoral en
la muestra.
En la figura 1 se representan resultados cuando
se llevó a cabo la selección en la primera etapa con sólo uno, dos o
los tres anticuerpos siguientes HMPV.2, GP1.4 y
Ber-Ep 4. Es de constatar inmediatamente que sólo
con el uso de un anticuerpo la detección del marcador tumoral CA
15.3 (Muc1) sólo es baja. Los mejores resultados se consiguen si se
usan para la detección dos de los anticuerpos, a saber, HMPV.2 y
Ber-EP 4 y/o GP1.4 y Ber-EP 4. Ya la
combinación de los tres anticuerpos es, como se puede reconocer en
la intensidad de las bandas para los marcadores tumorales CA 15.3,
más efectiva. Por tanto se demuestra que con la selección adecuada
de un número determinado de anticuerpos específicos es posible un
resultado considerablemente mejor en la detección de células
tumorales. Se muestra también especialmente que no es posible el
desenlace simple que aumentó necesariamente la sensibilidad con uso
de varios anticuerpos. Se da la situación contraria según las
circunstancias del caso ya que es posible una reacción inespecífica
más prematura con número creciente de anticuerpos. Por tanto es de
especial importancia determinar experimentalmente una combinación
adecuada de anticuerpos.
La figura 2 muestra resultados del procedimientos
de detección en donde en la figura 2A no se llevó a cabo
preselección alguna mediante marcado de anticuerpos y en la figura
2B se llevó a cabo una preselección mediante marcado de anticuerpos.
En la figura 2 se han determinado a este respecto combinaciones de
los anticuerpos HMPV.2, Ber-Ep 4 y GP1.4 como
combinación de dos y/o de tres anticuerpos en conjunto. Al mismo
tiempo se llevó a cabo una determinación múltiple de los cuatro
marcadores, a saber, GA 733.2, CA 15.3, Her 2/neu así como
claudina-7. También aquí se incubaron de nuevo 10,
100 y/o 1000 células tumorales de una línea celular de cáncer de
mama en sangre y a continuación se detectaron. Se muestra aquí que
sin la selección de anticuerpos se detecta una expresión de fondo
para algunos de los marcadores de ARNm (GA 733.2, CA 13.2 y Her
2/neu). Un fondo de este tipo se puede evitar con uso de cada una de
las combinaciones de anticuerpos representadas en la figura 2B para
la preselección de las células que se van a estudiar sobre ARNm. De
nuevo es interesante en la figura 2B que el uso de los tres
anticuerpos sea superior incondicionalmente al uso de dos
anticuerpos, por ejemplo, GP 1.4 con Ber-Ep 4. La
selección de combinaciones de anticuerpos determinadas así como la
selección de marcadores de ARNm determinados hace posible sin
embargo detectar las células tumorales buscadas correspondientes
hasta 10 células por mililitro de sangre sin fondo inespecífico. La
expresión de fondo podría eliminarse y se aumenta considerablemente
la sensibilidad (véase las bandas para
claudina-7).
En la figura 3 se representa el resultado de un
procedimiento de acuerdo con la invención con células tumorales
inoculadas en sangre de una línea celular de cáncer de testículos.
De nuevo se seleccionan células tumorales completas de la muestra de
sangre que están marcadas con uno de los anticuerpos representados.
A continuación se estudia en conjunto cuatro marcadores de ARNm
(GCAP, GA 733.2, GRPR y HGMI-C). Se muestra aquí que
con el uso de un de sólo un anticuerpo como Ber-Ep 4
mediante el marcador HGMI-C únicamente se detectan
hasta 10 células por mililitro de sangre y con uso del anticuerpo
MOC-31 principalmente ninguna célula de cáncer de
testículos. Es válido lo mismo para el anticuerpo 8B6, que presenta
sólo una sensibilidad baja.
La combinación de los anticuerpos
Ber-EP 4 y 8B6 lleva igualmente a una detección
defectuosa mediante el marcador HGMI-C así como
también la combinación de los anticuerpos Ber-Ep y
MOC-31. Un resultado de detección óptimo para los
cuatro marcadores estudiados resulta para células tumorales de
testículos con uso de los tres anticuerpos Ber-Ep 4,
MOC-31 y 8B6, donde se detectan hasta 2 células por
mililitro de sangre de forma segura por cada uno de los marcadores.
Si se detectan de acuerdo con la invención con las reacciones de
detección dos marcadores entonces se puede llevar a cabo con la
selección de dos marcadores de los marcadores usados para la figura
3 una detección más segura de un número de células mínimo al mismo
tiempo que se evita una interferencia de fondo.
La figura 4 muestra la detección de células de
cáncer de intestino que se inocularon en sangre de un individuo
sano. Aquí se muestra directamente que el uso de una combinación de
anticuerpos Ber-Ep 4 y MOC-31 lleva
a una sensibilidad mejorada respecto al marcador de ARNm
EGF-R. Con el uso de ambos anticuerpos se consigue
simultáneamente una sensibilidad de detección de 100 células por
mililitro de sangre, mientras que con el uso sólo de una anticuerpo
la sensibilidad de la detección se encuentra en aproximadamente 1000
células por mililitro de sangre.
La figura 5 muestra un ensayo en el que mediante
una combinación de anticuerpos de Ber-EP 4, HMPV.2 y
GP1.4 se seleccionaron las células marcadas con al menos uno de los
anticuerpos y a continuación se estudiaron sobre el marcador de ARNm
GA 733.2, CA 15.3, Her 2 y claudina-7. Sin embargo
no se añadió aquí a la sangre de individuos sanos células tumorales
sino cantidades definidas de células epiteliales. Como se desprende
directamente de la figura 5 sólo dos de los marcadores muestran con
un número muy elevado de células epiteliales un resultado
positivo.
En la figura 6 se añadieron células tumorales de
dos líneas celulares de cáncer de mama distintas
(MCF-7 y SKBR-3) de una muestra de
sangre. Como anticuerpos se usaron los anticuerpos
Ber-EP 4, HMPV.2 y GP1.4 en combinación. Como es de
constatar inmediatamente se garantiza mediante el uso de los cuatro
marcadores de ARNm GA 733.2, CA 15.3, Her 2 y
claudina-7 un reconocimiento de las células de
cáncer de mama de hasta 10 células de líneas celulares individuales
por mililitro. No tuvo lugar una reacción inespecífica en sangre sin
células de cáncer de mama. Sin embargo los marcadores tumorales GA
733.2 y CA 15.3 para la línea celular 2 (SKBR-3) son
más sensibles, mientras que el marcador tumoral Her 2 para la línea
celular 1 (MCR 7) es más sensible. De este modo se pueden
diferenciar entonces unos de otros también los subtipos de células
de cáncer de mama en función del patrón de marcador presente.
También en la figura 7 se han inoculado células
de cáncer de mama de distintas líneas celulares
(MCF-7) en la figura 7A y SKBR 3 en la figura 7B en
sangre. Como anticuerpos para la selección de las células de la
muestra de sangre se usaron los anticuerpos Ber-Ep
4, HMPV.2 y GPI.4 en combinación. Es de constatar inmediatamente que
con uso de una combinación de los marcadores de ARNm GA 733.2, CA
15.3, Her 2 y claudina-7 en cada caso reacciona
positivamente al menos uno de los marcadores con hasta 2 células por
5 mililitros, sin que la sangre sin células tumorales diese un fondo
de expresión. También aquí se constata de nuevo un comportamiento
diferencial de ambas líneas celulares sobre los cuatro marcadores de
ARNm distintos.
Sin embargo se encuentran, por ejemplo, en una
muestra de sangre ambas líneas celulares, de modo que se
garantizaría mediante la combinación de marcadores elegida en cada
caso un reconocimiento de ambas líneas celulares de hasta 2 células
por 5 mililitros de sangre, es decir, sería posible la detección de
células de cáncer de mama en la sangre independientemente del tipo
de célula de la línea celular de cáncer de mama con mayor
sensibilidad.
La figura 8 muestra la detección de células de
cáncer de intestino que se inocularon en sangre. A este respecto se
realizó la selección de las células con los dos anticuerpos
Ber-EP 4 y MOC-31. La etapa de
detección biológico-molecular se realizó con los
marcadores de ARNm GA 733.2, CEA y EGF-R. Serían
detectables dos células tumorales en 5 mililitros de sangre.
La figura 9 muestra de nuevo una medida con una
combinación de tres anticuerpos Ber-Ep 4,
MOC-31 y 8B6 y asimismo se inocularon los marcadores
de ARNm GCAP/PLAP, GA 733.2, GRPR y HMGI-C en
sangre, en las células de cáncer de testículos.
Con cada uno de los marcadores
biológico-moleculares se consigue con uso de esta
combinación de tres de anticuerpos para la selección de células en
la etapa de selección inmunológica la detección de hasta 2 células
por 5 mililitros.
La figura 10 muestra finalmente la separación de
células extrañas de la mezcla celular de un material de biopsia.
Para este fin se aislaron mecánicamente material de biopsia de
tejido de mama, que contenía tejido tumoral con un supuesto tumor
primario, y se separó mediante gasa de restos celulares, tejido
conjuntivo etc. La mezcla celular obtenida, que contenía tanto
células del supuesto tejido tumoral así como también células del
tejido sano limítrofe, se mezcló con una selección celular con una
mezcla de anticuerpos acoplados a una fase sólida (partículas
magnéticas con anticuerpos GA1.4, HMPV.2 y Ber-EP 4)
y tras incubación para la preparación de la unión
antígeno-anticuerpo se separó magnéticamente. A
continuación tuvo lugar una detección de ARNm respecto a los
marcadores GA 733.2 y Her 2. Como control se determinó al mismo
tiempo una línea celular de un cáncer de mama en paralelo. Como se
reconoce, tuvo lugar una detección positiva relativa a que la
biopsia contenía un tumor de cáncer de mama.
Las bandas que se distinguen en las figuras 8 y 9
con "control positivo" muestran resultados de muestras con las
líneas celulares HT 29 para tumor de intestino (figura 8) y/o Tera/l
para tumor de testículos (figura 9).
Claims (28)
1. Procedimiento para la detección cualitativa
y/o cuantitativa de células biológicas predeterminadas de y/o en una
muestra que contiene células biológicas, en el que
la muestra se mezcla con una combinación
predeterminada de al menos dos anticuerpos y/o derivados de
anticuerpo que se unen por sus sitios de unión a diferentes epítopos
que están preferencialmente presentes en las células que se van a
detectar, y/o con al menos un anticuerpo y/o derivado de anticuerpo
biespecífico, que se une por sus dos sitios de unión a diferentes
epítopos que están preferencialmente presentes en las células que se
van a detectar,
se separan las células marcadas con al menos uno
de los anticuerpos y/o derivados de anticuerpo de la muestra,
y las células separadas se ensayan con una
combinación predeterminada de al menos dos reactivos de detección
biológico-molecular en cuanto a la expresión de una
combinación predeterminada de al menos dos porciones de ARNm,
realizándose su expresión preferencialmente en las células que se
van a detectar, y
se detecta si se expresa al menos una de las
porciones de ARNm.
2. Procedimiento según la reivindicación
precedente, caracterizado porque la separación de las células
marcadas se realiza en fase líquida o fase sólida.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se usan
anticuerpos o derivados de anticuerpos acoplados a la fase sólida
para separar las células diana de la muestra.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se usan
anticuerpos o derivados de anticuerpos marcados con fluoróforos y se
realiza la separación de las células marcadas de la muestra mediante
citometría de flujo (separación de células asociada a fluorescencia,
FACS).
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se usan
anticuerpos o derivados de anticuerpos acoplados con partículas
magnéticas o pseudomagnéticas y para la separación de las células
marcadas de la muestra, las partículas acopladas con anticuerpos
magnéticas o pseudomagnéticas se separan tras la mezcla con la
muestra de forma magnética de la muestra.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los
anticuerpos o derivados de anticuerpos presentan sitios de unión que
se unen a células tumorales.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los
anticuerpos o derivados de anticuerpos presentan sitios de unión que
se unen a células de uno o varios tipos o subtipos de tumor
determinados.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque para la
separación de células tumorales o células de un tipo o subtipo de
tumor determinado los anticuerpos o derivados de anticuerpo
presentan sitios de unión que se unen a epítopos de un antígeno
epitelial, de un antígeno de membrana epitelial, del antígeno MUC1
y/o del antígeno PLAP.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se usa al
menos uno de los anticuerpos GP1.4, MOC-31,
Ber-EP4, HMPV.2, 8B6, E29 y/o
131-11741.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque para la
separación de células tumorales en general o de un tipo o subtipo
determinado se usa una combinación de anticuerpos que contiene los
anticuerpos Ber-EP4 y MOC31 o al menos dos de los
anticuerpos HMPV.2, GP1.4 y Ber-EP4.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque para la
separación de células tumorales de mama se usa una combinación de
anticuerpos que contiene al menos dos de los anticuerpos
131-11741, GP1.4, E29 y HMPV.2 o al menos dos de los
anticuerpos HIKEIV.2, GP1.4 y Ber-EP4.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque para la
separación de células tumorales del intestino se usa una combinación
de anticuerpos que contiene los anticuerpos Ber-EP4
y
\hbox{MOC-31.} 13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque para la
separación de células tumorales de los testículos se usa una
combinación de anticuerpos que contiene al menos dos de los
anticuerpos MOC31, Ber-EP4 y 8B6.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque para la
detección de células tumorales o células de un tipo o subtipo de
tumor determinado se ensaya una combinación de porciones de ARNm que
contiene las porciones de ARNm correspondientes a las porciones de
secuencia de al menos dos de los genes GA733.2, EGFR, CEA, HWE2/neu,
claudina-7 (CLDN7), GCAP(ALPPL2)/ALPP, GRPR,
HMGIC, CK20, MAGE3, MUC1 y estaniocalcina (STC1).
15. Procedimiento según la reivindicación
precedente, caracterizado porque para la detección de células
tumorales o células de un tipo o subtipo de tumor determinado se
ensaya una combinación de porciones de ARNm que contiene porciones
de ARNm correspondientes a porciones de secuencia de al menos dos de
los genes EGFR, GA733.2 y HER-2/NEU.
16. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque para la detección de células tumorales
de mama se usa una combinación de porciones de ARNm que contiene
porciones de ARNm correspondientes a porciones de secuencia de al
menos dos de los genes GA733.2, MUC1, Her-2/neu,
claudina7, CK20, PIAGE3, estaniocalcina, EGFR y CEA.
17. Procedimiento según la reivindicación 16,
caracterizado porque para la detección de células tumorales
de mama se usa una combinación de porciones de ARNm que contiene
porciones de ARNm correspondientes a porciones de secuencia de los
dos genes GA733.2 y MUC1, correspondientes a porciones de secuencia
de los dos genes Her-2/neu y claudina7,
correspondientes a porciones de secuencia de al menos dos de los
genes CK20, MAGE-3 y MUC1 y/o correspondientes a
porciones de secuencia de al menos dos de los genes estaniocalcina,
EGFR y CEA.
18. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque para la detección de células tumorales
del intestino se usa una combinación de porciones de ARNm que
contiene porciones de ARNm correspondientes a porciones de secuencia
de al menos dos de los genes CK20, EGFR, GA733.2, CEA y
estaniocalcina.
19. Procedimiento según la reivindicación 18,
caracterizado porque para la detección de células tumorales
del intestino se usa una combinación de porciones de ARNm que
contiene porciones de ARNm correspondientes a porciones de secuencia
de al menos dos de los genes CK20, EGFR, CEA y estaniocalcina y/o
correspondientes a porciones de secuencia de al menos dos de los
genes EGFR, CEA y GA733.2.
20. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque para la detección de células tumorales
de los testículos se usa una combinación de porciones de ARNm que
contiene porciones de ARNm correspondientes a porciones de secuencia
de al menos dos de los genes ALPP/ALPPL2 (GCAP),
CGA733.2(=EGP-40), HMGI-C, GRPR.
21. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se
multiplican y/o detectan las porciones de ARNm con uso de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), LCR, NASBA,
RT-PCR y/o procedimientos de hibridación.
22. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el ARNm de
las células separadas se transcribe inversamente en ADNc, el ADNc se
multiplica y a continuación se detecta la presencia o ausencia de la
porción de ARNm que se ha de detectar.
23. Procedimiento según la reivindicación
precedente, caracterizado porque el ADNc multiplicado es
digerido por enzimas de restricción adecuados y se detecta la
presencia o ausencia del ARNm que se va a detectar a partir de los
fragmentos de ADNc producidos (análisis de fragmentos).
24. Procedimiento según una o ambas
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se
determina el ADNc correspondiente al ARNm que se va a detectar por
medio de PCR en tiempo real basado en fluorescencia.
25. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque como
control interno se detecta el ARNm de la proteína
\beta-actina.
26. Uso de un procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes para la detección de células de tipo
poco común en suspensiones y mezclas celulares, en especial de
células tumorales, células epiteliales y/o células endoteliales en
líquidos corporales, sangre periférica, expectoraciones, líquido
ascítico, linfa, orina, médula ósea y/o material de biopsia y/o de
células fetales en líquido amniótico o sangre periférica
materna.
27. Uso según la reivindicación precedente para
el diagnóstico y/o control del tratamiento de enfermedades
tumorales.
28. Uso según la reivindicación precedente para
el diagnóstico y/o control del tratamiento de tumor de testículos,
tumor de mama y/o tumor de intestino.
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