ES2323067T3

ES2323067T3 - Metodo para detectar niveles bajos de una proteina de fusion.

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Publication number: ES2323067T3
Application number: ES04774869T
Authority: ES
Inventors: Frank Jakob Theodor Staal; Jacobus Johannes Maria Van Dongen
Original assignee: Erasmus University Medical Center
Current assignee: Erasmus University Medical Center
Priority date: 2003-08-12
Filing date: 2004-08-11
Publication date: 2009-07-06
Anticipated expiration: 2024-08-11
Also published as: EP1507147A1; JP2007502404A; US20060172345A1; AU2004264178A1; EP1660888A1; EP1660888B1; ATE423974T1; DK1660888T3; WO2005015235A1; CN1836165B; CA2535073A1; CN1836165A; DE602004019659D1

Abstract

Método para detectar una proteína de fusión en una muestra, comprendiendo dicha proteína de fusión un fragmento amino terminal y un fragmento carboxilo terminal correspondientes cada uno a una proteína nativa, comprendido dicho método: - poner en contacto dicha muestra con, como mínimo, una molécula de unión específicamente reactiva con una parte de la proteína nativa que no está presente en la proteína de fusión, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre dicha, como mínimo, una molécula de unión y dicha proteína nativa; - eliminar dicho complejo de dicha muestra para agotar en dicha muestra dicha proteína nativa; y - detectar dicha proteína de fusión en dicha muestra usando, como mínimo, un anticuerpo dirigido contra dicha proteína de fusión.

Description

Método para detectar niveles bajos de una proteína de fusión.

La presente invención se refiere a la detección de, entre otras, proteínas de fusión específicas de tumores. Más específicamente, la presente invención se refiere a técnicas que indican la presencia de translocaciones cromosómicas mediante la detección de la presencia de una proteína de fusión en una muestra biológica.

En el diagnóstico de diversos tipos de cáncer, tales como leucemias, linfomas y tumores sólidos, frecuentemente se usan aberraciones cromosómicas para la clasificación en sub-grupos relevantes para el pronóstico. Muchas de estas aberraciones cromosómicas dan como resultado genes de fusión, es decir genes acoplados de forma aberrante acoplados mediante la parte cadena arriba de un gen a la parte cadena abajo del otro gen o viceversa. Los genes de fusión pueden transcribirse a transcritos de genes de fusión y traducirse a proteínas de fusión. Generalmente, las proteínas de fusión juegan un papel importante en el proceso oncogénico. Por ejemplo, aproximadamente el 35% de los pacientes adultos con leucemia linfoblástica aguda (ALL) y aproximadamente el 95% de los pacientes con leucemia mieloide crónica (CML) tienen un defecto cromosómico específico en sus células leucémicas, es decir una translocación entre los cromosomas 9 y 22 que crea el cromosoma Filadelfia (Ph). Esta translocación se produce en el punto en el genoma de una proteína tirosina quinasa llamada ABL, creando la proteína de fusión anormal BCR-ABL, un producto génico de la fusión en marco del gen ABL con otro gen llamado BCR. Generalmente, las proteínas de fusión juegan un papel importante en el proceso oncogenético. Por ejemplo, la actividad quinasa de ABL en la proteína de fusión BCR-ABL está activada y no regulada, impulsando el crecimiento celular incontrolado observado en ALL y en CML.

Cuando se diagnostica ALL en un paciente, el número total de células leucémicas habitualmente está en el intervalo de 10^{11} a 10^{12}. El tratamiento citostático o citotóxico induce la completa remisión en la mayoría de los pacientes con tumores linfoides. Sin embargo, muchos de estos pacientes recaen. La completa remisión no significa que las células leucémicas se erradiquen totalmente del cuerpo, sino que su nivel está fuera del nivel de sensibilidad de los métodos citomorfológicos clásicos. Puesto que el límite de detección de las técnicas citomorfológicas no es inferior al 1-5% de células malignas, esto significa que hasta 10^{10} células malignas pueden permanecer en el paciente, también indicado como la "enfermedad mínima residual" (EMR). Aparentemente, los actuales protocolos de tratamiento no son capaces de destruir todas las células malignas en estos pacientes con recaída, aunque alcanzaron la llamada remisión completa según criterios citomorfológicos. De este modo, es obvio que las técnicas citomorfológicas solamente pueden proporcionar información superficial acerca sobre la eficacia del tratamiento.

La detección de bajas cantidades de células malignas residuales durante la respuesta al tratamiento temprano permite una precisa evaluación de la cinética de la reducción tumoral durante la quimioterapia. Actualmente se ha establecido que la información de EMR representa un potente factor de pronóstico para un resultado final. La detección de un aumento del nivel de EMR permite anticipar una inminente recaída. Las técnicas con una alta sensibilidad para detectar EMR, por lo tanto, son cruciales para una mejor comprensión de la reducción de la masa tumoral durante el tratamiento de inducción y la posterior erradicación de las células malignas durante el tratamiento de mantenimiento.

Las técnicas existentes para detectar aberraciones cromosómicas incluyen técnicas tradicionales tales como análisis citogenéticos y tecnología biomolecular, tales como transferencia de Southern o análisis de hibridación fluorescente in situ (FISH). Sin embargo, la sensibilidad de detección de análisis citogénicos, FISH y transferencia de Southern habitualmente no es inferior al 1-5%, lo que les hace inadecuados para la detección de la EMR.

La PCR, aunque en esencia es muy adecuada para un ensayo de diagnóstico rápido y masivo o incluso un cribado, permite analizar solamente de 0,1 a 4-5 kb de ácido nucleico (ADN o ARN) de forma rutinaria por análisis de PCR, lo que dificulta enormemente el rápido cribado de grandes tramos de cromosomas y regiones de fractura o de fusión dentro de los cromosomas o sus productos génicos. Una desventaja adicional de la PCR es su inherente sensibilidad a cebadores emparejados erróneamente. Las pequeñas alteraciones que siempre pueden estar presentes en la secuencia de ácido nucleico del fragmento génico complementario al cebador harán imposible realizar la PCR con el efecto deseado y pueden provocar un diagnóstico erróneo y resultados falsos negativos. Especialmente, los resultados falsos negativos hacen a un ensayo de diagnóstico basado en PCR, aunque muy específico, inadecuado para un diagnóstico fiable, y no hace falta decir que solamente un diagnóstico fiable de tumores puede contribuir a comprender el pronóstico y el diseño de una terapia adecuada.

Como se ha indicado anteriormente, la mayoría de las técnicas disponibles actualmente dirigidas a la detección de aberraciones cromosómicas específicas implican análisis a nivel cromosómico o de ácido nucleico (ADN o ARN). Sin embargo, también es posible detectar una aberración cromosómica a nivel proteico.

Se ha realizado un esfuerzo considerable en el campo del diagnóstico de leucemia para desarrollar una tecnología adecuada para la detección inmunológica de una proteína de fusión que resulte de una aberración cromosómica. Muchos de estos estudios se centraban en el descubrimiento de reactivos inmunológicos (anticuerpos) que son exclusivamente reactivos con proteínas específicas de tumores y que no proporcionan al mismo tiempo detección inmunológica de proteínas no de fusión que normalmente también son producidas por el cuerpo (véase por ejemplo Nagasaki y otros., J. Imm. Methods 162, 235-245, 1993 y Van Derenden y otros., J Exp Med. 1989 169(1): 87-89). Habitualmente, dichos anticuerpos reaccionan de forma cruzada con proteínas celulares normales. Solamente cuando se conocen puntos de fusión específicos, puede ser posible seleccionar reactivos inmunológicos específicos que reaccionan exclusivamente con la proteína específica de tumores, uniéndose de forma selectiva al epítopo del punto de fusión. Sin embargo, la variación en los puntos de fusión es tan grande entre pacientes (diferentes valores críticos a nivel del ADN) y en los propios pacientes (variantes de empalme de ARNm) que la detección inmunológica específica solamente funciona en pocas ocasiones, a menudo únicamente en una base paciente a paciente (véase Van Dongen y otros., Leukemia 1999; 13: 1901-1928). Además, los ensayos de diagnóstico que implican inmunodetección del punto de fusión de una proteína de fusión tienen la gran desventaja inherente de que requieren laboratorios especializados y bien equipados y personal formado y altamente especializado. Además, los ensayos anteriores habitualmente sólo se usan en casos sospechosos de tumores y no son adecuados para un cribado a gran escala de la presencia de aberraciones cromosómicas en pacientes de leucemia.

El desarrollo de un método inmunológico rápido y más conveniente que permita la detección exclusiva de una proteína de fusión A-B era un importante avance en el área de ensayos de diagnóstico dirigidos a la detección de una proteína de fusión (véase el documento PCT/NL98/00289). El método descrito implica la aplicación de un llamado anticuerpo de captura que reconoce una parte de una proteína de fusión (parte A) y un anticuerpo de detección marcado que reconoce otra parte de una proteína de fusión (parte B). En dicho sistema, un anticuerpo de captura está unido a una capa de soporte sólido, tal como una placa de ELISA o una tira reactiva ("dipstick") (P. Berendes, "Recognition of tumor specific proteins in human cancer". Tesis Doctoral, Universidad Erasmo de Roterdam, ISBN 90-73436-36-2). Un anticuerpo de captura también puede inmovilizarse sobre perlas que pueden analizarse mediante citometría de flujo (véase por ejemplo el documento PCT/NL01/00945). Después de la incubación de un anticuerpo de captura unido a una perla con un lisado celular del que se sospecha que contiene una proteína de fusión, la proteína de fusión unida se detecta mediante un anticuerpo de detección marcado.

Un sistema de anticuerpo de captura/detección (basado en perlas) permite la detección exclusiva de una proteína de fusión y es elegante y fácil de realizar, especialmente cuando se usa citometría de flujo. Dicho sistema de detección también permite diagnóstico de alto rendimiento de muchas muestras clínicas. En el momento del diagnóstico de un tumor que implica una proteína de fusión, una muestra de diagnóstico habitualmente contiene un número relativamente alto de células malignas con una proteína de fusión en comparación con el número de células normales que pueden contener proteínas nativas (no fusionadas). Cuando se diagnostica ALL en un paciente, el número total de células leucémicas es de aproximadamente 10^{11} a 10^{12}, de las cuales aproximadamente de manera general del 25% al 98% contienen un gen de fusión que codifica una proteína de fusión. Un sistema de anticuerpo de captura/detección es, por lo tanto, adecuado para el cribado rápido de aberraciones cromosómicas que dan origen a una proteína de fusión. Desafortunadamente sin embargo, la sensibilidad de un sistema de anticuerpo de captura/detección a menudo parece insuficiente para detectar frecuencias bajas (<1%) de células malignas en un fondo con gran cantidad de células normales. Como ejemplo, los sistemas de anticuerpo de captura/detección actuales en general no son adecuados para detectar la EMR durante el seguimiento del tratamiento. La aplicación de diagnóstico de un sistema de anticuerpo de captura/detección está, por lo tanto, esencialmente limitada a la fase de diagnóstico inicial, cuando la frecuencia relativa de células malignas en médula ósea o en sangre es alta (generalmente >10%). En conjunto, existe una necesidad específica de un método que permita detectar exclusiva y convenientemente una proteína de fusión en una muestra, incluso aunque la muestra contenga solamente cantidades mínimas de la proteína de fusión.

Actualmente se ha reconocido que, en los métodos actuales, una proteína de fusión y una proteína nativa (es decir de tipo silvestre) no fusionada, compiten habitualmente por la unión específica a una sonda que se usa para la detección de la proteína de fusión. Por ejemplo, una proteína de fusión A-B y una proteína nativa no fusionada A competirán por la unión a un anticuerpo de captura u otro tipo de sonda, reactiva específicamente con la parte A de la proteína de fusión. Del mismo modo, una proteína de fusión A-B y una proteína nativa no fusionada B compiten por la unión específica a un anticuerpo de captura que es reactivo con la parte B de la proteína de fusión. De este modo, la sensibilidad de un sistema de anticuerpo de captura/detección para detectar una proteína de fusión que comprende partes de, cómo mínimo, dos proteínas nativas se determina en gran medida por la proporción de una proteína de fusión presente en una muestra con respecto a dichas proteínas nativas no fusionadas. Cuando una proteína nativa está presente en una cantidad muy superior con respecto a una proteína de fusión de interés, es probable que la proteína nativa ocupe la mayoría de, sino todos, los puntos de unión de un anticuerpo de captura, impidiendo esencialmente de este modo la unión de una proteína de fusión. Además, incluso aunque algunas proteínas de fusión sean atrapadas eficazmente por un anticuerpo de captura, la intensidad de señal indicativa de la unión de un anticuerpo de detección marcado puede no ser suficiente para producir un resultado de ensayo fiable.

La presente invención permite comprender que la sensibilidad de un método para detectar una proteína de fusión en una muestra puede aumentar agotando en dicha muestra una o más proteínas nativas antes de detectar la presencia de una proteína de fusión, para enriquecer dicha muestra en dicha proteína de fusión con respecto a una o más proteínas nativas "competidoras". Se da a conocer un método para detectar una proteína de fusión (por ejemplo, resultante de una translocación cromosómica) en una muestra mediante la detección de una proteína de fusión que comprende un fragmento amino terminal y un fragmento carboxilo terminal que corresponden cada uno a una proteína nativa diferente, comprendiendo dicho método (i) poner en contacto dicha muestra con, como mínimo, una molécula de unión reactiva específicamente con una parte de la proteína nativa que no está presente en la proteína de fusión, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre dicha, como mínimo, una molécula de unión y dicha proteína nativa; (ii) eliminar dicho complejo de dicha muestra para esencialmente agotar en dicha muestra dicha proteína nativa pero no la proteína de fusión y (iii) detectar dicha proteína de fusión en dicha muestra usando, como mínimo, un anticuerpo dirigido contra dicha proteína de fusión. La expresión proteína nativa o proteína nativa relevante como se usa en este documento se refiere a una proteína no fusionada de tipo silvestre, que puede competir con una proteína de fusión de interés por la unión a una sonda o reactivo que se usa para la detección de una proteína de fusión, tal como por ejemplo un anticuerpo de captura. Una proteína nativa de la presente invención puede adoptar una conformación nativa (la estructura tridimensional de una proteína cuando está en un entorno fisiológico) o una conformación desnaturalizada.

Según la presente invención, una proteína de fusión se deriva de un gen de fusión de una célula maligna o de un gen de fusión producido artificialmente. En una proteína de fusión que comprende un fragmento amino terminal y un fragmento carboxilo terminal que corresponden cada uno a una proteína nativa, dichos fragmentos habitualmente se fusionan o conectan directamente entre sí mediante una fusión de fractura o región de fusión de modo que estos fragmentos juntos representan toda la proteína de fusión. La longitud o el tamaño de un fragmento, ya sea amino terminal o carboxilo terminal, puede variar. Si la región de fusión se sitúa aproximadamente en la zona intermedia de la proteína de fusión, la proteína de fusión comprende un fragmento amino (N) terminal y un fragmento carboxilo (C) terminal de aproximadamente el mismo tamaño. En otros casos, la región de fusión se sitúa más cerca hacia cualquiera de los extremos C-terminal o N-terminal de la proteína de fusión, de modo que la proteína de fusión comprende un fragmento N-terminal grande y un fragmento C-terminal pequeño o un fragmento C-terminal grande y un fragmento N-terminal pequeño, respectivamente. Una proteína de fusión de la presente invención contiene suficientes aminoácidos cadena arriba y cadena abajo desde la región de fusión para permitir el reconocimiento (epítopo) por una sonda de anticuerpo reactiva específicamente con partes de la proteína de fusión situadas en lados opuestos de la región de fusión o un fragmento de unión funcionalmente equivalente a ésta.

En un método de la presente invención, una muestra se enriquece en una proteína de fusión con respecto a una o más proteínas nativas "competidoras", dando como resultado una mayor unión de una proteína de fusión a una sonda dirigida contra dicha proteína de fusión. Un método que se da a conocer es particularmente adecuado para aumentar la sensibilidad de un sistema de anticuerpo de captura/detección o sándwich para la detección de una proteína de fusión. De este modo, la presente invención da a conocer una solución a un problema principal encontrado cuando se usan los métodos de detección actuales en los que una proteína nativa satura o "consume" una sonda que se usa para detectar una proteína de fusión, tal como un anticuerpo de captura, impidiendo, de este modo, la unión de una proteína de fusión a dicha sonda. Obviamente, la saturación de la sonda con proteína nativa reduce la sensibilidad de detección de una proteína de fusión presente en la misma muestra. Agotando en una muestra una proteína nativa competidora según la presente invención, la proporción de proteína de fusión/proteína nativa aumenta marcadamente, favoreciendo de este modo la unión de la sonda de detección y la detección de la proteína de fusión. Con un método que se da a conocer en este documento, es posible ahora detectar específicamente la presencia de una proteína de fusión de forma relativamente rápida y sencilla, incluso si dicha proteína de fusión está presente en una muestra solamente en una cantidad limitada. Por ejemplo, permite aplicar un sistema de anticuerpo de captura/detección para detectar una proteína de fusión específica de tumores en una muestra que comprende solamente una pequeña población de células malignas positivas para proteína de fusión en un fondo con gran cantidad de células normales, que contienen gran número de proteínas nativas competidoras.

Además, con un método según la presente invención también es ahora posible calcular la cantidad de proteína nativa (como una medida de la cantidad de células normales) con respecto a la cantidad de proteína de fusión (como medida de la cantidad de células malignas). La proporción obtenida de proteína normal frente a proteína de fusión puede usarse para determinar la frecuencia relativa de células malignas, es decir el nivel de EMR.

La presente invención permite comprender que la sensibilidad de detección de la presencia de una proteína de fusión en una célula, por ejemplo una oncoproteína quimérica, en una célula maligna, puede aumentar agotando en dicha célula, como mínimo, una proteína nativa relevante. Por supuesto, es posible agotar más de una proteína nativa antes de la detección de una proteína de fusión. Huelga decir que, el uso de un método que se da a conocer en este documento es más beneficioso cuando se detecta una proteína de fusión en una muestra que también contiene una cantidad significativa de proteínas nativas que pueden competir por la unión a una sonda que se usa para atrapar a una proteína de fusión. En un ejemplo, se da a conocer un método para la detección de la EMR determinando la presencia de células malignas en una muestra, comprendiendo dicho método la detección de una proteína de fusión específica de tumores que comprende partes de, como mínimo, dos proteínas nativas no específicas de tumores en una muestra, estando dicha etapa de detección precedida por una etapa de "predepuración" en la que en dicha muestra se agota, como
mínimo, una de dichas proteínas nativas, que en caso contrario competirían con la detección de la proteína de fusión.

En un método de la presente invención, como mínimo, una molécula de unión se usa para eliminar una o más proteínas nativas de una muestra. Una muestra comprende una muestra biológica tal como una muestra de sangre, muestra de suero, muestra de tejido, médula ósea, muestra de líquido cefalorraquídeo, biopsias y otras muestras que pueden contener una o más células que expresan una proteína de fusión codificada por un gen de fusión. Una muestra se trata de tal manera que una molécula de unión tiene acceso suficiente a una proteína nativa. Puesto que muchas proteínas celulares están ubicadas intracelularmente, esto se consigue habitualmente rompiendo la integridad de la membrana de una célula. Por ejemplo, una muestra se trata de tal manera que produce un lisado celular o un homogenado celular, obtenido por ejemplo mediante la rotura mecánica de las células o exponiendo las células a un tampón de lisis celular que contiene un detergente. Una molécula de unión adecuada comprende preferentemente una proteína o un polipéptido, como un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Sin embargo, otros tipos de moléculas de unión también juegan un papel decisivo a la hora de poner en práctica un método que se da a conocer. Un anticuerpo específico o fragmento del mismo puede obtenerse usando diversos procedimientos estándar conocidos en la técnica, incluyendo métodos para generar anticuerpos policlonales en un animal de laboratorio, métodos para obtener anticuerpos monoclonales usando tecnología de hibridoma convencional y fragmentos de anticuerpo Fv de cadena sencilla (scFv) usando un proceso de selección de presentación en fagos. Dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se denomina en lo sucesivo en este documento como "anticuerpo de agotamiento".

Para el diseño o desarrollo de una molécula de unión que es reactiva con una proteína nativa pero no con una proteína de fusión que comprende una parte de dicha proteína nativa (tal como un anticuerpo de agotamiento), por supuesto es crucial saber qué parte o fragmento de dicha proteína nativa forma parte de la proteína de fusión y qué parte no. En otras palabras, es preferente que el punto de fusión o región de fusión de una proteína de fusión a detectar esté establecido. Un método de la presente invención se usa ventajosamente para detectar una proteína de fusión que es el resultado de una aberración cromosómica conocida. En estos casos, los genes de fusión y proteínas de fusión resultantes a menudo han sido caracterizados con detalle. Son ejemplos bien conocidos las translocaciones que dan como resultado genes de fusión BCR-A.BL descubiertos en >95% de los casos de CML y en el 30% de los casos de ALL en adultos y los genes de fusión TEL-AML1 que se encuentran en el 25-30% de los casos de ALL en la infancia. Sin embargo, se conoce que muchos más genes de fusión y proteínas de fusión codificadas están implicados en la leucemia, tales como E2A-PBX1, ETO-AML1 y PML-RAR\alpha.

Debe entenderse que la aplicación de la presente invención no se limita a la detección de leucemia; varias otras enfermedades no leucémicas están caracterizadas por la presencia de genes de fusión y proteínas de fusión. Por ejemplo, los siguientes genes de fusión de ALK pueden observarse en linfoma anaplásico de células grandes (ALCL): el gen de fusión NPM-ALK resultante de la aberración cromosómica t(2;5)(p23;q35); el gen de fusión TPM3-ALK resultante de la aberración cromosómica t(1;2)(q25;p23); el gen de fusión TFG-ALK resultante de t(2;3)(p23;q21) y el gen de fusión ATIC-ALK de inv(2)(p23q35). El agotamiento de la proteína ALK nativa de una muestra según la presente invención usando un anticuerpo de agotamiento reactivo con ALK nativa pero no con la proteína de fusión, aumentará la sensibilidad de un posterior ensayo de captura/detección. En otra realización, la presente invención se aplica ventajosamente para detectar una aberración cromosómica observada en sarcoma de Ewing (EWS), tal como t(11;22)(q24;q12) que da como resultado la proteína de fusión EWS-FLI1, t(21;22)(q22;q12) que da como resultado la proteína de fusión EWS-ERG y t(7;22)(p22;q12) que da origen a la proteína de fusión EWS-ETV1. El sarcoma de Ewing (EWS)/Tumores Neuroectodérmicos Primitivos Periféricos (PNET) de hueso es un tipo de cáncer que se encuentra habitualmente en niños y en adultos jóvenes. La incidencia máxima está entre las edades de 10 y 20 años, es menos común en niños de menos de 5 años o en adultos por encima de los 30. El sarcoma de Ewing puede aparecer en cualquier hueso del cuerpo; las zonas más comunes son la pelvis, muslo, parte inferior de la pierna, parte superior del brazo y costillas. El agotamiento de proteína EWS celular normal (y/o opcionalmente el agotamiento del gen socio de fusión tal como FLI1, ERG o ETV1) en una etapa de predepuración según la presente invención aumentará la sensibilidad de detección de una proteína de fusión relacionada con el sarcoma de Ewing.

De este modo, la presente invención permite a un experto en la materia aplicar y realizar la presente invención sin una carga excesiva para el diagnóstico o clasificación de cualquier tipo de enfermedad que se asocia con la presencia de un gen de fusión que se traduce a una proteína de fusión que comprende una fragmento amino terminal y un fragmento carboxilo terminal que corresponden cada uno a una proteína nativa.

Partiendo de la estructura de una proteína de fusión, puede determinarse fácilmente qué parte de la proteína nativa no está presente en la proteína de fusión. Una molécula de unión específicamente reactiva con esta parte, o un tramo (polipéptido) de la misma, puede usarse para eliminar esencialmente la proteína nativa, pero no la proteína de fusión, de una muestra. Un experto en la materia reconocerá las etapas a seguir para obtener una molécula de unión específicamente reactiva con la proteína nativa (de tipo silvestre) pero no con la proteína de fusión. En una realización preferente, dicha molécula de unión específica es un anticuerpo o un fragmento de unión funcionalmente equivalente a éste.

Los expertos en la materia conocen métodos para producir un anticuerpo. Por ejemplo, para obtener un anticuerpo policlonal, se inmuniza un animal de laboratorio con un inmunógeno. En un método de la presente invención, dicho inmunógeno preferentemente es un fragmento de proteína recombinante o un péptido sintético correspondiente al tramo o dominio seleccionado de la proteína nativa. La respuesta inmune del animal se supervisa tomando muestras de sangre de ensayo y determinando el valor cuantitativo de la reactividad. Cuando se obtienen apropiadamente valores cuantitativos altos, se recoge sangre del animal y se preparan antisueros. Si se desea, puede realizarse el fraccionamiento adicional de los antisueros para enriquecer en anticuerpos reactivos con la proteína nativa. Véase por ejemplo Harlow y otros., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (1988). Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales mediante diversas técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo fusionando células esplénicas de ratones inmunizados con una línea celular de mieloma mediante la adición de polietilenglicol (PEG). Las células fusionadas se cultivan en un medio de selección, por ejemplo medio que contiene una mezcla de hipoxantina, aminopterina y timidina. Se ensayan las células fusionadas en este medio de selección para la producción del anticuerpo deseado (por ejemplo mediante un inmunoensayo en fase sólida tal como ELISA) y, si éste es positivo, los cultivos se clonan de modo que solamente haya una célula en cada pocillo de cultivo. Esto produce un clon de células de una única progenitora que es inmortal y un productor de un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos obtenidos pueden caracterizarse usando técnicas de inmunodiagnóstico convencionales, por ejemplo mediante transferencia Western usando lisados de células que expresan la proteína nativa (recombinante) o la proteína de fusión (recombinante). Solamente aquellos anticuerpos reactivos con la proteína nativa A pero no con la proteína de fusión A-B son adecuados para su uso como anticuerpo de agotamiento en un método según la presente invención.

Según la presente invención, un complejo entre un anticuerpo de agotamiento y una proteína nativa se elimina de una muestra antes de detectar una proteína de fusión. En una realización, se da a conocer un método que conlleva la rápida y selectiva eliminación o precipitación de una proteína nativa de un lisado u homogenado celular, por ejemplo mediante la formación de un complejo anticuerpo/antígeno. A este efecto, se pone en contacto una muestra con, como mínimo, una molécula de unión específicamente reactiva con una proteína nativa bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre dicha molécula de unión y dicha proteína nativa. Pueden usarse diversas técnicas de separación en un método según la presente invención para eliminar un complejo de una muestra. Los métodos comúnmente usados para precipitar un complejo anticuerpo/antígeno de una mezcla en bruto incluyen inmunoprecipitación en fase sólida. En una realización, dicho complejo se elimina de dicha muestra mediante la adición de perlas o microesferas sólidas capaces de unirse a dicho complejo, para formar una suspensión de perlas en una muestra esencialmente líquida. Según la presente invención, una perla adecuada comprende una perla de Sepharose o una perla de poliestireno o cualquier tipo de partícula sólida que permite la simple eliminación de un complejo unido a una perla de una muestra. La ventaja de las perlas sólidas es que pueden sedimentarse de forma sencilla en una muestra, habitualmente mediante centrifugado de la suspensión. Como alternativa, se obtiene una muestra predepurada mediante filtración de la suspensión. En una realización de la presente invención, una muestra se pone en contacto con un anticuerpo de agotamiento para formar un complejo con una proteína nativa y una proteína de unión a inmunoglobulina inmovilizada sobre una perla se usa para eliminar dicho complejo de dicha muestra. Existen diversos tipos de proteínas de unión a inmunoglobulina que pueden usarse adecuadamente (Antibodies, a Laboratory Manual, E. Harlow & D. Lane (1988)). Estas incluyen proteína A, proteína G y "fantasmas" de células bacterianas de Staphylococcus aureus. S. aureus tiene una proteína especial en su superficie llamada Proteína A que es un reactivo de unión a IgG versátil de amplio espectro. La Proteína A se une a la porción Fc de anticuerpos (clase IgG) sin alterar su unión al antígeno. Los anticuerpos de muchas especies de mamíferos generalmente reaccionarán con la Proteína A. En otra realización, se usa GammaBind G de Tipo 2 o Proteína G para eliminar un complejo de un anticuerpo de agotamiento y una proteína nativa de una muestra. GammaBind^{TM} G de Tipo 2 y Proteína G son formas manipuladas de forma recombinante de la proteína G estreptocócica. Ambas proteínas pueden producirse en Escherichia coli. Se unen a la región constante de muchos tipos de inmunoglobulina G y se usan ampliamente para detectar, cuantificar y purificar anticuerpos IgG y complejos de antígeno/anticuerpo. GammaBind G de Tipo 2 y Proteína G son las proteínas de unión a anticuerpo más universalmente aplicables disponibles. En comparación con la Proteína A, se unen fuerte y específicamente a anticuerpos de muchas especies diferentes. Por ejemplo, GammaBind G de Tipo 2 se une mejor a IgG de ratón y de rata, GammaBind G de Tipo 2 y Proteína G se unen selectivamente a todas las subclases de IgG humana. Los fantasmas bacterianos, proteínas de unión a inmunoglobulina y perlas recubiertas con proteínas de unión a inmunoglobulina pueden obtenerse comercialmente de diversos proveedores, tales como Pharmacia Biotech AB, Sigma Aldrich o Pierce. En un método que se da a conocer en este documento, después de la formación de un complejo entre una proteína nativa y un anticuerpo de agotamiento, fantasmas bacterianos o perlas recubiertas se mezclan con la muestra de células u homogenado celular, tiempo durante el que la proteína de unión a inmunoglobulina se une al anticuerpo de agotamiento. Una breve y sencilla etapa de centrifugado o filtración puede separar los fantasmas bacterianos o perlas con complejo anticuerpo de agotamiento/proteína nativa unido, de la muestra.

En una realización preferente, sin embargo, una molécula de unión (preferentemente un anticuerpo de agotamiento) se acopla directamente o se inmoviliza sobre una perla u otra partícula sólida. La presentación de reactivos sintéticos en microperlas sintéticas es una tendencia preponderante en el desarrollo de ensayos bioanalíticos. Las fuentes comerciales (por ejemplo, Spherotech, IL; Bangs, IN; Polysciences; PA); Molecular Probes, OR) para sistemas de presentación basados en perlas (por ejemplo, acoplamiento covalente, biotina-estreptavidina, marca His) están disponibles actualmente. El uso de un anticuerpo de agotamiento que está conjugado directamente a una perla no requiere el uso intermitente de una proteína de unión a inmunoglobulina y en general dará como resultado una mayor especificidad. Después de la incubación durante un periodo de tiempo suficiente, las perlas con anticuerpo de agotamiento unido complejadas con la proteína nativa pueden eliminarse de una muestra, tal como en forma de lisado u homogenado. La eliminación de las perlas de una muestra se consigue fácil y rápidamente por ejemplo mediante centrifugado, dando como resultado una muestra en la que se ha agotado esencialmente una proteína nativa que, en caso contrario, competiría con una proteína de fusión por la unión a una sonda dirigida contra dicha proteína de fusión. Puesto que esta etapa de agotamiento da como resultado una muestra que está enriquecida en una proteína de fusión con respecto a la proteína no fusionada nativa "competidora", la probabilidad de que una proteína de fusión se una a dicha sonda, por ejemplo un anticuerpo de captura, es significativamente mayor. Por ejemplo, un método que se da a conocer ahora permite detectar una proteína de fusión usando un sistema de captura/detección con mayor sensibilidad.

En otra realización de la presente invención, un anticuerpo de agotamiento o cualquier otro tipo de molécula de unión adecuada, se conjuga con una perla magnética. Esto permite la eliminación de un complejo unido a una perla de una muestra usando separación inmunomagnética (IMS). La IMS es una técnica que implica añadir perlas magnéticas recubiertas con una molécula de unión, que es específicamente reactiva con un antígeno de interés, a un lisado celular. Las perlas y el lisado se mezclan, periodo durante el que se forma un complejo entre un anticuerpo de agotamiento u otra molécula de unión y una proteína nativa para formar un complejo (antígeno/anticuerpo). Después de cierto periodo de incubación, se aplica un campo magnético para separar las perlas magnéticas o partículas magnéticas con complejo unido de otras sustancias, dejando atrás una muestra reducida o "predepurada". Las perlas magnéticas adecuadas son por ejemplo las comercializadas por Spherotec Inc. (www.spherotech.com) con la marca comercial partículas magnéticas SPHERO. Éstas se preparan recubriendo con una capa de magnetita y poliestireno sobre partículas centrales de poliestireno monodispersadas (es decir de tamaño uniforme) (véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.091.206). Como resultado, las partículas son de forma esférica y de naturaleza paramagnética. También tienen un tamaño muy uniforme. El contenido de magnetita de estas partículas magnéticas puede ajustarse, pero en general representa aproximadamente del 10% al 15%. Las partículas magnéticas pueden separarse fácilmente de una suspensión de forma magnética. Estas partículas se vuelven no magnéticas cuando se alejan de un imán, y no conservan ningún magnetismo detectable ni siquiera después de la exposición repetida a un campo magnético fuerte. Las partículas magnéticas pueden usarse para la separación de células, purificación por afinidad, ensayos con sondas de ADN, Inmunoensayo Enzimático (EIA) con partículas magnéticas, etc. Diversos tamaños de perlas, ya sean perlas de Sepharose, perlas de poliestireno, perlas de látex, perlas magnéticas o similares, están disponibles en el mercado. En una realización preferente, se usan perlas con un diámetro relativamente pequeño, puesto que para cierto volumen de perlas, las perlas pequeñas tienen una mayor superficie en comparación con las perlas grandes. Cuanto mayor sea la superficie de la perla, más moléculas de unión pueden inmovilizarse sobre una perla y más eficazmente puede eliminarse una proteína nativa de una muestra por volumen de perlas. Esto es especialmente ventajoso cuando se elimina una proteína nativa de una muestra con un pequeño volumen de muestra.

Como se ha dicho, la presente invención resuelve el problema de que un sistema de anticuerpo de captura/detección, aunque rápido y fácil de realizar, a menudo no es lo suficientemente sensible para detectar la presencia de bajas cantidades de una proteína de fusión en una muestra. Se da a conocer un método para detectar una proteína de fusión que comprende partes de dos proteínas nativas diferentes con mayor sensibilidad incluyendo una etapa de pretratamiento para obtener una muestra que está enriquecida en una proteína de fusión de interés con respecto a una a ambas de las proteínas nativas. Esta muestra enriquecida, o predepurada, se procesa adicionalmente para detectar la presencia de una proteína de fusión. En teoría, una proteína de fusión A-B presente en una muestra que está completamente empobrecida en proteína nativa A usando un método que se da a conocer, puede detectarse usando un único anticuerpo (o equivalente funcional del mismo) dirigido contra la parte A de la proteína de fusión A-B. Sin embargo, puesto que en la práctica es muy difícil obtener una muestra predepurada que no contenga ninguna proteína nativa A, el uso de un único anticuerpo específico de A no siempre da la especificidad de detección deseada. De este modo, cuando se pretende la detección exclusiva de una proteína de fusión A-B, se prefiere usar, como mínimo, un anticuerpo adicional que está dirigido contra la parte B de la proteína de fusión. Por ejemplo, una proteína de fusión se detecta usando una serie de, como mínimo, un primer y un segundo anticuerpos, cada anticuerpo capaz de reconocer un punto de unión situado en lados opuestos de la región de fusión de dicha proteína de fusión. En una realización preferente de la presente invención, la presente invención da a conocer un método en el que una proteína de fusión obtenida de un gen de fusión se detecta mediante detección por citometría de flujo o mediante cualquier otra manera conveniente para medir fluorescencia asociada a perlas usando, como mínimo, dos sondas de anticuerpo, por lo que, como mínimo, una está dirigida contra un fragmento de proteína que comprende el fragmento amino terminal de la proteína de fusión, y, como mínimo, la otra está dirigida contra un fragmento de proteína que comprende el fragmento carboxilo terminal de la proteína de fusión.

El uso de microesferas, perlas u otras partículas como soportes sólidos para reacciones antígeno-anticuerpo para detectar antígenos o anticuerpos en una muestra es particularmente atractivo cuando está vinculado a citometría de flujo (véase por ejemplo el documento US 6.159.748). En una realización preferente, una sonda de anticuerpo se acopla a una perla que permite la detección de una proteína de fusión mediante citometría de flujo. Los citómetros de flujo tienen la capacidad de detectar diferencias en el tamaño de partícula y son detectores de fluorescencia altamente sensibles. El tamaño de las microesferas puede seleccionarse mediante dispersión de luz en ángulo frontal (FALS) o volumen electrónico. Usando junto con dispersión de luz en ángulo recto (RALS), un citómetro de flujo puede distinguir entre partículas individuales y agregadas.

Un método según la presente invención es muy atractivo para la detección de una proteína específica de tumores que comprende un fragmento amino terminal y un fragmento carboxilo terminal que corresponden cada uno a una proteína no específica de tumores diferente. Dicha proteína de fusión específica de tumores es, por ejemplo, el resultado de una aberración del cromosoma Filadelfia, que crea la proteína BCR-ABL anormal. Antes de realizar la detección, se agota una o ambas proteínas nativas BCR y ABL de una muestra a analizar usando, como mínimo, una molécula de unión específicamente reactiva con (un fragmento de) la proteína ABL o BCR, pero no con la proteína de fusión BCR-ABL. Después de la eliminación del complejo que comprende BCR y/o ABL, se detecta la proteína de fusión BCR-ABL, preferentemente usando un conjunto de, como mínimo, un primer y un segundo anticuerpos, por lo que cada anticuerpo reconoce un punto de unión situado en extremos opuestos de la región de fusión de la proteína de fusión. La proteína de fusión puede detectarse usando un sistema de captura/detección, por ejemplo usando un método de citometría de flujo, ELISA o con tira reactiva (véase también el Ejemplo a continuación).

Un método de la presente invención es especialmente adecuado para detectar cantidades muy bajas de células que expresan una proteína de fusión (<1% tales como las que se encuentran en la EMR). Sin embargo, por supuesto, éste también se usa ventajosamente para aumentar la sensibilidad de métodos de detección que no requieren dichos bajos límites de detección, tales como los usados para el diagnóstico inicial de una enfermedad que está correlacionada con la presencia de una proteína de fusión. También en estos casos, la eliminación de una o más proteínas nativas antes de detectar una proteína de fusión dará como resultado una mayor sensibilidad. En la fase de diagnóstico, a menudo se desea investigar la aparición de diferentes proteínas de genes de fusión, preferentemente de forma simultánea en el tubo. Esto no se debe a que un tumor particular tendrá más de una proteína de gen de fusión, sino porque es conveniente tener un único tubo de ensayo para la detección de varias proteínas de genes de fusión bien establecidas en una categoría de enfermedad, por ejemplo leucemia mieloide aguda (AML) o ALL precursora de células B
(Tabla 1).

TABLA 1 Ejemplos de detección combinada de varias proteínas de fusión en un único tubo

1

En una realización preferente, un método que se da a conocer en este documento comprende la detección mediante citometría de flujo de diferentes tipos de proteínas de fusión, preferentemente en un único tubo de ensayo, pero usando diferentes anticuerpos de captura unidos a perlas contra una parte de las diferentes proteínas de fusión y los anticuerpos de detección relevantes correspondientes contra la otra parte de las proteínas de fusión. Combinando FALS y fluorescencia, es práctico usar perlas de diferentes tamaños, cada perla recubierta con un diferente anticuerpo de captura, para la detección simultánea de múltiples proteínas de fusión. Las microesferas pueden recubrirse con proteínas de forma pasiva o covalente, dependiendo de su carácter químico. En base a diferentes características de citometría de flujo de las perlas (por ejemplo, tamaño, color de fluorocromo, intensidad de tinción del fluorocromo, o características de dispersión lateral), múltiples proteínas de fusión pueden detectarse específicamente en el mismo ensayo. Esto también incluye la detección de proteínas de fusión de diversas variantes de translocaciones del mismo gen objetivo así como proteínas de fusión de translocaciones con variantes de regiones de rotura. Una parte esencial de un método según la presente invención para la detección de una o más proteínas de fusión, ya sea usando un sistema de captura/detección o cualquier otro tipo de procedimiento de detección, se basa en el hecho de que la detección de la proteína de fusión está precedida por el agotamiento de una o más proteínas nativas relevantes no fusionadas. Esto puede conseguirse usando una o más moléculas de unión, tales como anticuerpos de agotamiento, que pueden reconocer y unirse específicamente a una proteína nativa para formar un complejo. Diferentes proteínas de unión pueden unirse a diferentes superficies de soporte sólido, como una perla. Como alternativa, múltiples socios de unión específicamente reactivos con diferentes proteínas nativas se acoplan a la misma perla de modo que solamente una única perla puede usarse para agotar simultáneamente en una muestra múltiples proteínas nativas. Esto es especialmente interesante cuando se usa un método según la presente invención para investigar la presencia de diferentes proteínas de fusión simultáneamente en un tubo, por ejemplo para el diagnóstico de un tumor en una categoría de enfermedad, particularmente cuando se usan muestras de paciente con una baja carga tumoral (por ejemplo, menor del 5%) en el diagnóstico.

De este modo, un método de la presente invención permite la detección simultánea de una primera proteína de fusión A-B, que comprende el fragmento N-terminal de la proteína nativa A y el fragmento C-terminal de la proteína nativa B y una segunda proteína de fusión C-D, que comprende el fragmento N-terminal de la proteína nativa C y el fragmento C-terminal de la proteína nativa D, en un único tubo de ensayo con una alta especificidad y sensibilidad mejorada en comparación con métodos de detección existentes. En este ejemplo específico, una muestra de un paciente con una baja carga tumoral se pone en contacto por ejemplo con un anticuerpo de agotamiento específicamente reactivo con el fragmento C-terminal de la proteína A (anti-A) y con un anticuerpo de agotamiento específicamente reactivo con el fragmento N-terminal de la proteína D (anti-D), para agotar la muestra en proteínas A y D, respectivamente. Los anticuerpos de agotamiento anti-A y anti-D se inmovilizan preferentemente sobre una perla (pequeña), aún más preferentemente sobre la misma perla por razones de eficacia y facilidad de uso. Una única etapa de centrifugado es en general suficiente para separar el complejo de la muestra, que en este ejemplo específico consta de perlas/anti-A/proteína A/anti-D/proteína D. Como resultado, se obtiene una muestra que esencialmente está empobrecida en proteínas nativas A y D. Esto aumentará la probabilidad de que las proteínas de fusión A-B y C-D sean reconocidas por sus sondas específicas, por ejemplo un anticuerpo de captura específicamente reactivo con el fragmento N-terminal de la proteína de fusión A-B y el fragmento C-terminal de la proteína de fusión C-D.

Además de la sensibilidad limitada, los métodos actuales para detectar una proteína de fusión en una muestra afrontan el problema común de que la posibilidad de cuantificar la proteína de fusión detectada son limitadas. Especialmente cuando se aplican estos métodos como herramientas de diagnóstico, es altamente deseable cuantificar, o, como mínimo, semi-cuantificar, una proteína de fusión. En la medida de lo posible, una señal de detección, tal como intensidad de fluorescencia, que indica la presencia de una proteína de fusión puede expresarse con respecto a un factor interno de control que se asume que es constante independientemente de si está presente o no una proteína de fusión. Dicho factor puede ser por ejemplo el número de células analizadas o el contenido total de proteína de una muestra. Este valor relativo puede usarse para fines de comparación entre diferentes muestras, por ejemplo una muestra de control positiva y negativa. Obviamente, sería mucho más informativo relacionar directamente la presencia de una proteína de fusión que comprende partes de dos proteínas nativas con una proteína fusionada, o incluso con las dos, proteínas nativas fusionadas.

Hasta el momento, ninguno de los métodos de detección existentes permite dicha cuantificación. En gran medida, la presente invención también da a conocer ahora una solución simple y clara a este problema. Se analiza preferentemente un complejo que contiene una o más proteínas nativas agotadas que se elimina de una muestra en un método de la presente invención de manera adicional para indicar la cantidad de proteína o proteínas nativas agotadas en dicha muestra. En una realización preferente, el análisis comprende el uso de, como mínimo, un reactivo capaz de unirse específicamente a uno o más componentes del complejo agotado o aislado, seguido de la determinación de la unión de dicho reactivo a dicho complejo como indicación de la cantidad de proteína nativa que se agotó en dicha muestra. Un reactivo preferentemente comprende un socio de unión, como un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, capaz de unirse a una proteína nativa agotada. En una realización preferente, se detecta un complejo agotado usando un reactivo dirigido contra una proteína nativa agotada, en una región que es distinta del sitio de interacción entre la proteína nativa y un anticuerpo de agotamiento. Más preferente, un reactivo para detectar una proteína nativa agotada reacciona con esa parte de la proteína nativa que también está presente en la proteína de fusión. Por ejemplo, una proteína A agotada se detecta ventajosamente usando el "anticuerpo de captura" usado para la detección de la proteína de fusión A-B, como reactivo.

Se proporciona preferentemente un reactivo con una molécula informadora o marca, como un fluorocromo, que permite la detección de un complejo mediante la unión de un reactivo marcado a una proteína agotada.

La detección de un complejo para determinar la cantidad de proteína nativa agotada de una muestra se realiza ventajosamente usando citometría de flujo. En una realización, un anticuerpo de agotamiento se conjuga a una perla. Las perlas adecuadas comprenden aquellas definidas anteriormente para la detección de una proteína de fusión, incluyendo perlas magnéticas compatibles con citometría de flujo.

Cuando se conoce la cantidad de proteína nativa agotada, esta información puede usarse como indicación de la cantidad de material celular o contenido total de proteína. En otras palabras, la proteína agotada puede servir como un tipo de "control interno" en el ensayo de diagnóstico. Cuando se relaciona la presencia (expresión) de una proteína en un complejo aislado con la cantidad de material celular o con el número de células, se prefiere por supuesto que el complejo aislado contenga una cantidad suficiente de dicha proteína nativa a detectar por el reactivo. De este modo, una proteína nativa a agotar y analizar adicionalmente como medida de la cantidad de material celular comprende preferentemente una proteína que es relativamente ubicua en dichas células. Además, es importante que la expresión de dicha proteína nativa no esté sometida a grandes variaciones, por ejemplo entre células individuales o bajo diferentes condiciones celulares. En una realización preferente, dicha proteína nativa a agotar y analizar adicionalmente es una proteína abundante con una expresión estable, tal como una proteína de mantenimiento. Por ejemplo, cuando se detecta la proteína de fusión BCR-ABL en una muestra es ventajoso agotar y posteriormente detectar la proteína nativa ABL puesto que ABL es una proteína abundante.

Sin embargo, una proteína de fusión no siempre comprende un fragmento de una proteína nativa abundante. Por ejemplo, en la proteína de fusión E2A-PBX1 el dominio de transactivación N-terminal del factor de transcripción hélice-bucle-hélice básico (bHLH), E2A, se une a la mayor parte del factor 1 de transcripción de leucemia de precursores de células B (PBX1). Los factores de transcripción se expresan habitualmente a un nivel bajo y de forma específica del tipo celular. De este modo, en estos casos no se prefiere usar ninguna de las proteínas nativas agotadas como control interno. En su lugar, es ventajoso usar una sonda (anticuerpo) adicional que agota simultáneamente en una muestra una proteína abundante. Para ilustrar esto adicionalmente, en la situación representada anteriormente, una muestra, por ejemplo, un lisado celular se pone en contacto con una perla que está recubierta con dos anticuerpos: un anticuerpo reactivo con E2A nativo pero no con la proteína de fusión E2A-PBX1 para agotar en la muestra la proteína E2A competidora, y un anticuerpo reactivo con una proteína de mantenimiento (tal como ABL) para agotar en la muestra al mismo tiempo una proteína de mantenimiento que puede servir como control interno.

Según la presente invención, la (semi)-cuantificación de una proteína nativa agotada puede realizarse construyendo una curva patrón que relaciona una cantidad medida (por ejemplo, fluorescencia) con cantidades "conocidas" de proteína nativa. Preferentemente, las muestras "conocidas" contienen la proteína nativa en cantidades seleccionadas para ampliar el intervalo de concentración de proteínas nativas que se esperan en las muestras "desconocidas" (por ejemplo usando diluciones (sucesivas) de células normales). Dicha curva patrón puede usarse a continuación para determinar concentraciones de la sustancia de proteína nativa agotada en una muestra "desconocida" (o una dilución de la misma) que contiene el complejo agotado.

La presente invención da a conocer un método como se ha descrito anteriormente usando sondas que pueden marcarse o conjugarse con moléculas informadoras, tales como biotina, digitoxigenina, enzimas tales como peroxidasa, fosfatasa alcalina u otras moléculas informadoras o partículas informadoras, tales como perlas, conocidas en la técnica. La presente invención da a conocer además un kit de diagnóstico que comprende todos los medios tales como moléculas de unión, perlas (conjugadas), sondas (marcadas) o reactivos o sustratos o instrucciones, necesarias para llevar a cabo el método según la presente invención. Los métodos o kits de diagnóstico dados a conocer por la presente invención se usan preferentemente para detectar aberraciones cromosómicas descubiertas con ciertos tipos de cáncer, por ejemplo con leucemia, ya sea en la detección de cáncer (residual) en pacientes o el cribado de cáncer en grandes poblaciones como un todo.

Las fortalezas de un método según la presente invención son: 1) la capacidad de analizar de forma simultánea, pero de manera discreta, múltiples proteínas de fusión (lo más relevante en el momento del diagnóstico); 2) la sencillez de unión de las proteínas a microesferas; 3) la capacidad de la citometría de flujo para detectar pequeñas diferencias de tamaño de partícula; y 4) la exquisita sensibilidad de la citometría de flujo como detector de diferentes longitudes de onda de fluorescencia, simultáneamente. Los sistemas de auto-muestreo disponibles le hacen aún más atractivo a este respecto.

Un método de la presente invención se usa ventajosamente en ensayos de diagnóstico de muestras biológicas tales como muestras de sangre, muestras de suero, muestras de células, muestras de tejido, líquido cefalorraquídeo, médula ósea, biopsias, para aberraciones cromosómicas. La presente invención da a conocer un método a usar en un ensayo de diagnóstico en el que se requiere tanto una alta sensibilidad como una alta especificidad. Un método dado a conocer permite ahora diagnosticar un tumor y supervisar estrechamente la EMR durante el seguimiento de pacientes con diversos tipos de cáncer que implican translocaciones, inversiones o deleciones cromosómicas que dan origen a un gen de fusión. El uso de un método de la presente invención se da a conocer antes, durante y después del tratamiento de una enfermedad, para evaluar la eficacia de dicho tratamiento.

Ejemplo

Detección de la proteína de fusión BCR-ABL en lisados celulares predepurados

Este ejemplo ilustra cómo puede eliminarse ABL normal (es decir nativa) de una muestra antes de la detección en un ensayo de anticuerpo de captura/detección para mejorar la sensibilidad de detección de la proteína de fusión BCR-ABL en un ensayo de EMR. Dicha etapa de "predepuración" puede realizarse con un anticuerpo anti-ABL contra la parte N-terminal de ABL. Toda la ABL normal expresada en las célula se depurará, y solamente el fragmento de ABL que está presente en la proteína de fusión BCR-ABL se unirá a las perlas de detección que tienen el anticuerpo de captura anti-ABL contra la parte C-terminal de ABL. La BCR-ABL unida a las perlas se detecta a continuación usando un anticuerpo de detección anti-BCR conjugado a una marca fluorescente.

Materiales

1): Células leucémicas obtenidas de un paciente con EMR cultivadas en medio

2): Solución salina tamponada con fosfato (PBS)/suero fetal de ternero (FCS) al 2%: añadir 2 ml de FCS (termoinactivado) a 100 ml de PBS pH 7,8; Almacenar a 4ºC.

3): Tampón de radioinmunoprecipitación (RIPA) (sin desoxicolato sódico):

: Preparación de 50 ml de tampón RIPA:

: Tris-HCl 50 mM: usar 2,5 ml de una solución madre de Tris-HCL 1 M

: NaCl 150 mM: usar 1,5 ml de una solución madre de NaCl 5 M

: NP40 al 1%: usar 0,5 ml de Nonidet P40 sin diluir (BHD, Nº56009 2L)

: SDS al 0,1%: usar 0,5 ml de una solución madre de SDS al 10%

: Añadir 45 ml de milli-Q (agua ultrapura)

: Almacenar a 4ºC

4): Cóctel de inhibidores de proteasa, Sigma, Nº P2714:

: Disolver el polvo en 2 ml de milli-Q para preparar una solución concentrada 50x. Almacenar a 4ºC.

5): Predepurar las perlas: Perlas de poliestireno (>10 \mum) recubiertas con anticuerpo de agotamiento dirigido contra el extremo N de ABL.

6): Perlas de detección: perlas Luminex, PolyScience o Molecular Probe, recubiertas con anticuerpo de captura dirigidos contra el extremo C de ABL.

7): Anticuerpo de detección: anticuerpo conjugado ya sea a FITC o a biotina dirigido contra el extremo N de BCR.

8): Estreptavidina (SA)-PE, laboratorios Caltag, NºSA1004-1.

Métodos Preparación de lisados celulares

1): Transferir la cantidad de células necesaria y calculada exactamente a un nuevo tubo y lavar las células dos veces con PBS. Como mínimo habitualmente se necesitan 1x10^{6} células para el análisis de una proteína de fusión. Sin embargo, pueden ser necesarias más células, por ejemplo hasta 50x10^{6} células, si se espera que el nivel de EMR (y por lo tanto los niveles de proteína de fusión aberrante) sea muy bajo.

2): Entre tanto, calcular el volumen de tampón RIPA necesario para hacer lisados celulares: 50 \mul de tampón RIPA por 500.000 células. Transferir el tampón RIPA a un tubo de 15 ml y añadir cóctel de inhibidores de proteasa concentrado 50x (20 \mul de cóctel de inhibidores de proteasa por 1 ml de tampón RIPA).

3): Resuspender los sedimentos celulares en la cantidad apropiada de tampón RIPA (5 x 10^{6}/ml) que contiene inhibidores de proteasa y transferir la solución a nuevos tubos eppendorf.

4): Incubar en hielo durante 30 minutos.

5): Centrifugar 10 minutos a 10.000 x g, 4ºC.

6): Transferir el sobrenadante (lisado celular) a un nuevo tubo eppendorf.

Predepuración del lisado celular

7): Añadir 1x10^{6} perlas de predepuración a 100 \mul de muestra de lisado celular.

8): Incubar en hielo durante 30 minutos.

9): Centrifugar a 10.000 x g durante 3 minutos y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf.

10): Repetir la etapa 9.

Detección de la proteína de fusión

11): Añadir a un tubo de ensayo:

: \bullet 100 \mul de muestra de lisado celular predepurado

: \bullet 10.000 perlas de captura en 10 \mul de PBS + FCS al 2%

: \bullet 1-2 \mug de anticuerpo de detección conjugado en 25 \mul de PBS + FCS al 2%

12): Incubar en hielo durante 30 minutos.

13): Lavar las perlas con 500 \mul de PBS/FCS al 2% y centrifugar durante 1 minuto a 14.000 x g. Eliminar el sobrenadante y repetir esta etapa.

Cuando se usa un anticuerpo de detección marcado con biotina, continuar con las etapas 14 - 18. Cuando se usa un anticuerpo de detección marcado con FITC, continuar con las etapas 17 y 18.

14): Diluir SA-PE 200 veces en PBS/FCS al 2% y resuspender las perlas en 20 \mul del SA-PE diluido por tubo.

15): Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

16): Lavar las perlas con 500 \mul de PBS/FCS al 2% y centrifugar durante 1 minuto a 14.000 x g. Eliminar el sobrenadante y repetir esta etapa.

17): Después del segundo lavado, resuspender las perlas en 100-150 \mul de PBS/FCS al 2% por tubo y transferir a tubos de FACS.

18): Medir la cantidad de marca sobre las perlas con un citómetro de flujo. La proporción de la cantidad de marca y el número inicial de células es una medida del nivel de EMR.

Claims

1. Método para detectar una proteína de fusión en una muestra, comprendiendo dicha proteína de fusión un fragmento amino terminal y un fragmento carboxilo terminal correspondientes cada uno a una proteína nativa, comprendido dicho método:

-: poner en contacto dicha muestra con, como mínimo, una molécula de unión específicamente reactiva con una parte de la proteína nativa que no está presente en la proteína de fusión, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre dicha, como mínimo, una molécula de unión y dicha proteína nativa;

-: eliminar dicho complejo de dicha muestra para agotar en dicha muestra dicha proteína nativa; y

-: detectar dicha proteína de fusión en dicha muestra usando, como mínimo, un anticuerpo dirigido contra dicha proteína de fusión.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que dicha, como mínimo, una molécula de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión funcionalmente equivalente a éste.

3. Método, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha, como mínimo, una molécula de unión se conjuga a una partícula sólida, preferentemente una perla.

4. Método, según la reivindicación 3, en el que dicho complejo se elimina de dicha muestra mediante centrifugado o mediante separación magnética.

5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha proteína de fusión se detecta usando un conjunto de, como mínimo, un primer y un segundo anticuerpos, cada anticuerpo capaz de reconocer un punto de unión situado en lados opuestos de la región de fusión de dicha proteína de fusión.

6. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que, como mínimo, un anticuerpo está marcado con un fluorocromo.

7. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que, como mínimo, un anticuerpo está acoplado a una perla.

8. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha proteína de fusión se detecta mediante citometría de flujo.

9. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además después de la etapa de eliminación de dicho complejo de dicha muestra, detectar dicho complejo usando, como mínimo, un reactivo capaz de unirse específicamente a dicho complejo y determinar la unión de dicho, como mínimo, un reactivo a dicho complejo como indicación de la cantidad de proteína nativa agotada en dicha muestra.

10. Método, según la reivindicación 9, en el que dicha proteína nativa es una proteína abundante o de mantenimiento.

11. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha proteína de fusión comprende un fragmento amino terminal y un fragmento carboxilo terminal que corresponden cada uno a una proteína no específica de tumor diferente.

12. Método, según la reivindicación 11, en el que dicha proteína de fusión es el resultado de una aberración del cromosoma Filadelfia.

13. Método, según la reivindicación 12, en el que el fragmento amino terminal de dicha proteína de fusión corresponde a la proteína ABL o BCR, mientras que el fragmento carboxilo terminal de dicha proteína de fusión corresponde a la proteína BCR o ABL, respectivamente.

14. Método, según la reivindicación 13, en el que dicha, como mínimo, una molécula de unión, preferentemente un anticuerpo, es específicamente reactiva con un fragmento de la proteína ABL o BCR, pero no con dicha proteína de fusión.

15. Kit de diagnóstico para detectar simultáneamente, como mínimo, una primera y una segunda proteínas de fusión específicas de tumores en una muestra, comprendiendo dicha primera y segunda proteínas de fusión un fragmento amino terminal y un fragmento carboxilo terminal que corresponden cada uno a una proteína nativa, comprendiendo dicho kit, como mínimo, una molécula de unión específicamente reactiva con una parte de la proteína nativa que no está presente en la primera proteína de fusión y una molécula de unión específicamente reactiva con una parte de la proteína nativa que no está presente en la segunda proteína de fusión; y que comprende además, como mínimo, un primer y segundo anticuerpo para detectar dicha primera y segunda proteínas de fusión específicas de tumor.

16. Kit, según la reivindicación 15, en el que dichas moléculas de unión están inmovilizadas sobre la misma perla.

17. Uso de un kit de diagnóstico, según la reivindicación 15 ó 16, para el diagnóstico y/o clasificación in vitro de una enfermedad.