CN102952190B - 一个微泡膜蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

细胞微泡与疾病有关，本发明涉及一个新发现的磷酸化CSE1L(染色体分离-1类蛋白，chromosome segregation 1-like protein)微泡膜蛋白及其应用。所揭示包含可与CSE1L或磷酸化CSE1L结合的组合物，用于分离、检测或结合微泡，应用于疾病诊断或治疗。

Description

一个微泡膜蛋白及其应用

相关申请案之参照

本申请涉及到2011年8月18日提交的国际申请PCT/CN2011/078559，而且据此要求专利权限与优先权，该国际申请所提案及披露的，由此全部并入为本申请之参照。

技术领域

本发明涉及一个新发现的磷酸化CSE1L细胞微泡膜蛋白及其应用。

背景技术

细胞微泡(microvesicles)是由细胞膜衍生释放到细胞外环境中的小粒子，其大小约直径0.1μm至100μm。微泡参与蛋白酶、基因、小分子核糖核酸(RNA)、激素受体、细胞胞器等，在细胞与细胞之间的转移，因而与多种疾病，包括癌症的恶化有关(Simak 2006；Cocucci 2009；Muralidharan-Chari2010)。肿瘤细胞的侵袭和转移为癌症患者死亡的主要因素。肿瘤细胞藉由分泌蛋白酶，分解细胞外基质而进行癌侵袭和癌转移。由肿瘤细胞释放的微泡，富含可分解细胞外基质的蛋白酶，从而在癌细胞的侵袭和转移上，起到重要作用(Cocucci 2009)。

CSE1L蛋白(染色体分离-1类蛋白，chromosome segregation 1-like protein)或称细胞凋亡易感蛋白(CAS，cellular apoptosis susceptibility protein)(GenBank登录号U33286)，高度表现于多种癌症的组织检体(Brinkmann1995；Tung 2009；Tai 2010)。CSE1L之前被Scherf等人发现可被细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)磷酸化，因此是一个酪氨酸磷酸化蛋白(tyrosine phosphorylated protein)，且Scherf等人发现酪氨酸磷酸化的CSE1L蛋白其功能在于促使细胞蛋白由细胞质往细胞核运输(Scherf1998)。

目前所查资料表明，和CSE1L蛋白相关的专利包括：US 6,664,057是关于鉴别一种与癌症有关之人类染色体20q13.2上之新颖扩增子(amplicon)(此扩增子含CSE1L基因)。US 6,072,031是关于CSE1L之互补脱氧核糖核酸(complementary DNA，cDNA)及胺基酸序列，用于侦测正常细胞及癌细胞中CSE1L基因之表现及扩增，此外将反义CSE1L基因序列引入活细胞中可抑制细胞凋亡。US 6,207,380是关于衍生自角蛋白/细胞角蛋白、CSE1L或mat-8的多肽及多核苷酸于人体泌尿道组织之表现，用于侦测、诊断、监测、活体内造影、预防或治疗个体罹患泌尿系统疾病(如泌尿系统癌)。US 6,207,380亦揭示特异结合至泌尿道组织角蛋白/细胞角蛋白、CSE1L或mat-8编码之多肽或蛋白质之抗体，该分子有助于治疗泌尿道疾病。故US6,207,380描述利用特异结合至泌尿道组织之角蛋白/细胞角蛋白、CSE1L或mat-8之抗体以治疗泌尿道疾病。US 6,232,086揭示CSE1L之互补脱氧核糖核酸及胺基酸序列，用于侦测正常细胞及癌细胞中CSE1L基因之表现及扩增。US 6,156,564是关于侦测人类增生性细胞之方法，其包含测量人体组织检体中CSE1L蛋白质之表现量，以及侦测该人类蛋白质表现量较正常非增生性人类细胞之CSE1L蛋白质表现量高至少两倍以上。US 6,440,737是关于调控CSE1L基因表现之反义化合物、组合物及方法。US20080081339是关于测量几十个体液抗体，包括体液中CSE1L“自体抗体“(非CSE1L蛋白)作为前列腺癌的诊断标志物。US20050260639是关于检测从体液或身体组织分离出之“癌细胞”内的CSE1L，以诊断胰腺癌。WO2009/052573是关于检测从体液或身体组织分离出之“癌细胞”内的几百个转录核糖核酸包括CSE1L的核糖核酸，以诊断胃肠癌。US20100120074是关于测量体液中的CSE1L蛋白以诊断转移性癌症。由上述之说明可知这些先前技艺(专利)的内容，都在侦测细胞层级之CSE1L基因表现或体液CSE1L蛋白。

发明内容

本发明的一方面涉及于体外分离、结合或检测微泡的方法，用以诊断或治疗疾病。

在本发明的一方面涉及诊断肿瘤的方法，包含以下步骤：1)取得哺乳动物之体液；2)于体外检测受检测个体体液中微泡的CSE1L或磷酸化CSE1L量；2)于体外检测正常个体体液中微泡的CSE1L或磷酸化CSE1L量做为对照组；3)依据受检测个体与对照组个体体液中微泡的CSE1L或磷酸化CSE1L量的差别，判别受检测个体是否有肿瘤。

在本发明的一方面涉及诊断肿瘤的方法，包含以下步骤：1)取得哺乳动物之体液；2)于体外检测受检测个体体液中磷酸化CSE1L量；2)于体外检测正常个体体液中磷酸化CSE1L量做为对照组；3)依据受检测个体与对照组个体体液中磷酸化CSE1L量的差别，判别受检测个体是否有肿瘤。

在本发明的一方面涉及由体液分离微泡的方法，包含以下步骤：1)取得哺乳动物之体液；2)于体外以可和CSE1L或磷酸化CSE1L结合的抗体，分离与抗体结合之微泡。

在本发明的一方面涉及检测体液中微泡的方法，包含以下步骤：1)取得哺乳动物之体液；2)于体外以抗CSE1L抗体或抗磷酸化CSE1L抗体，检测与抗体结合之微泡。

在本发明的一方面也涉及以可和CSE1L或磷酸化CSE1L结合的抗体与细胞微泡结合，用于预防或治疗疾病的方法。优先考虑的疾病是癌症。

在本发明的一方面也涉及以含有抗CSE1L抗体或抗磷酸化CSE1L抗体的组合物与细胞微泡结合，以用于诊断或治疗疾病。优先考虑的疾病是癌症。

本发明的其它用途，特点，及优点可以从下面的详细描述和数据图标中显示。

附图说明

图1为本发明实施例1的图，以免疫墨点法(immunoblotting)，分析B16-dEV，B16-ras，B16-CSE1L，和B16-Ras/anti-CSE1L细胞的Ras和CSE1L蛋白的表达量。

图2为本发明实施例2的图，显示v-H-ras癌基因转染诱导癌细胞微泡生成。

图3为本发明实施例3的图，显示v-H-ras癌基因转染增加癌细胞分泌CSE1L。

图4为本发明实施例4的图，显示CSE1L是一个磷酸化的蛋白。

图5为本发明实施例5的图，显示v-H-ras癌基因转染增加癌细胞内CSE1L蛋白之磷酸化，以及磷酸化CSE1L蛋白存在于癌血清中。

图6为本发明实施例6的图，显示磷酸化ERK与CSE1L高表达于大肠直肠癌肿瘤，且相对表染色强度一致。

图7为本发明实施例7的图，显示CSE1L介导v-H-ras癌基因所诱导的癌细胞微泡生成。

图8为本发明实施例8的图，显示CSE1L介导v-H-ras癌基因所诱导的癌细胞侵袭。

图9为本发明实施例9的图，显示CSE1L介导v-H-ras癌基因所诱导的癌细胞转移。

图10为本发明实施例10的图，显示CSE1L位于微泡膜，而且抗CSE1L的抗体能够寻找并结合肿瘤。

图11为本发明实施例11的图，显示抗磷酸化CSE1L抗体针对磷酸化CSE1L蛋白的专一性结合。

图12为本发明实施例12的图，显示磷酸化CSE1L蛋白位于细胞微泡。

图13为本发明实施例13的图，显示相对于由健康献血者血清中分离到的微泡，由癌症患者血清中分离到的微泡有较高的CSE1L和磷酸化CSE1L盛行率。

图14为本发明实施例14的图，显示相对于健康献血者血清的磷酸化CSE1L，癌症患者血清有较高的磷酸化CSE1L盛行率。

具体实施方式

细胞微泡为由细胞产生，分布于细胞膜，或从细胞释放，可发现于体液和培养细胞的培养基(Simak 2006；Cocucci 2009；Muralidharan-Chari 2010)。本发明所述的微泡，包括及适用于与细胞膜结合的微泡，及从细胞释放的微泡。本发明所述的微泡，也包括及适用于所有大小的细胞微泡。

本发明首先发现CSE1L调控细胞生成微泡、磷酸化CSE1L位于微泡的膜上、磷酸化CSE1L普遍存在于癌症患者的血清中。微泡在多种疾病尤其癌症恶化过程中起重要的作用(Simak 2006)。因此，可与CSE1L或磷酸化CSE1L结合的组合物，如抗CSE1L抗体或抗磷酸化CSE1L抗体与其衍生物、以及药品的成分，可以用于检测或结合体液微泡，进而诊断或控制疾病。微泡参与蛋白酶、基因、小分子核糖核酸、激素受体、细胞胞器等在细胞与细胞之间的转移，因而与多种疾病，包括凝血疾病，伤口愈合，动脉粥样硬化，冠状动脉疾病，糖尿病，血液病，传染病，炎症性疾病，神经系统疾病，癌症等的恶化有关(Simak 2006；Cocucci 2009；Muralidharan-Chari 2010)。因此，微泡的蛋白分子，尤其是位于微泡膜上的蛋白分子，可以用来作为诊断疾病的标志物。另外，可以利用和微泡膜蛋白结合的抗体或组合物与微泡结合，应用于医疗成像或治疗疾病。

在本发明的另一的发现是，CSE1L与Ras和ERK细胞信号通路连结，激活的Ras和ERK信号通路可磷酸化CSE1L，磷酸化CSE1L普遍性地存在于癌症患者血清中。另外，在癌症的诊断上，检测血清磷酸化CSE1L的癌症检验灵敏度，高于检测血清非磷酸化CSE1L的癌症检验敏度。因此，磷酸化CSE1L具有癌症诊断的临床应用性。

本发明的另一发现是，癌症患者的体液中有磷酸化CSE1L存在，而且虽然正常(健康)人的体液也有CSE1L存在，但是在正常人的体液中很难检测到磷酸化CSE1L(实施例5)。之前有研究指出，一个可被细胞分泌的蛋白若同时具有蛋白磷酸化形(phosphorylated form)和去磷酸化形(dephosphorylated form)，则并非此蛋白的磷酸化形和去磷酸化形都可被细胞分泌(Konishi 1994；Fendrick 1997)。因此，本发明的另一发现是磷酸化CSE1L是一种分泌蛋白，且磷酸化CSE1L可在癌症患者的体液中被检测到。

本发明的另一个发现是磷酸化CSE1L为微泡的膜蛋白，且抗CSE1L的抗体能够寻找并结合肿瘤。经肿瘤细胞释放的微泡仍然残留在肿瘤周围环境。因此，利用CSE1L结合剂或磷酸化CSE1L结合剂与治疗药物或细胞毒性剂结合，可应用于癌症治疗。此外，利用CSE1L结合剂或磷酸化CSE1L结合剂与可发出荧光、幅射或其它可被侦测讯息的物质结合，可应用于疾病医疗成像。

本发明的另一个方面涉及利用可结合CSE1L或磷酸化CSE1L的组合物或抗体，应用于生物体液内微泡，包括细胞条件培养液(cell conditioned media)内微泡的分离和分析。所述包括可结合CSE1L或磷酸化CSE1L的化合物或抗体的方法或试剂套组盒，适用于(但不仅限于)，超速离心(ultracentrifugation)，免疫亲和纯化(immunoprecipitation)，亲和纯化(affinitypurification)，微滤(microfiltration)，流式细胞仪或荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorter)，酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbent assay)，抗体芯片(microarray)，生物芯片(biochips)，色谱法(chromatography)，免疫墨点法(immunoblotting)，微流体系统(microfluidicsystems)，微流控芯片(microfluidic chip)，及其它免疫学技术。

本发明的另一个方面涉及以包含CSE1L结合剂或磷酸化CSE1L结合剂的方法或试剂盒，分离、分析或结合微泡，以诊断或监测疾病。CSE1L或磷酸化CSE1L的分析可以是定量(quantitative)或定性(qualitative)分析，并将分析结果与同时对一个或多个确定没有疾病的生物体(做为对照组)的体液微泡内CSE1L或磷酸化CSE1L的分析结果进行比较。如果受检测个体体液微泡内CSE1L或磷酸化CSE1L量与对照组进行比较结果有差异，可以指出肿瘤的状况，例如有无肿瘤和肿瘤恶性程度的变化。

由于体液中的微泡可能被溶解，因此微泡所载磷酸化CSE1L可释放到体液。本发明的另一个方面涉及以包含可以和磷酸化CSE1L结合的结合剂(例如抗磷酸化CSE1L的抗体)的方法或试剂盒，分离或分析体液内磷酸化CSE1L，以诊断或监测疾病。磷酸化CSE1L的分析可以是定性性或定量性分析，并将分析结果与同时对一个或多个确定没有疾病生物体(做为对照组)的体液内磷酸化CSE1L的分析结果进行比较。如果受检测个体体液磷酸化CSE1L量与对照组进行比较结果有差异，可以指出肿瘤的状况，例如有无肿瘤和肿瘤恶性程度的变化。

本发明亦提供应用于上述侦测及诊断之套组。于诊断或侦测应用上，该套组可包含下述任何一者或所有：检测试剂、缓冲液、抗磷酸化CSE1L抗体或可与磷酸化CSE1L蛋白或磷酸化CSE1L多肽结合且可显示体液或体液微泡内磷酸化CSE1L蛋白或磷酸化CSE1L多肽含量之化学药品、多肽及其它分子。

本发明所述的“体液(biological fluid)”指的是可由生物任何部位分离的流体样品，包括但不限于：血液，血清，血浆，尿液，淋巴液，脑脊液，痰液，胸腔液，乳头吸出液，呼吸道液，肠道液，泌尿生殖道液，乳汁，泪液，唾液，淋巴液，精液，脑脊液，腹水，羊水，肿瘤囊液。也包括细胞条件培养液。在体液样本的微泡也包括存在于体液样本内之细胞细胞膜上的微泡。细胞条件培养液为已经培养细胞一段时间的培养液。“取得体液样本”意指获取用于本发明所描述方法之体液样本。

本发明所述的“肿瘤”是指个体具有引发癌症之细胞存在。具有引发癌症之细胞通常具有失控之增生、永生、转移潜力、及某些特有的细胞型态及细胞标记之典型特征。在某些情况下，癌细胞呈肿瘤形式，但其亦可能于动物体中单独存在或以独立细胞形式(如白血病细胞)于血流中循环。

本发明所述的“个体(subject)”是指其细胞会产生微泡的动物。动物包括哺乳动物，尤其是人类。

本发明所述的“正常个体(normal subject)”是指个体没有肿瘤或其它疾病。

本发明所述的“受检测个体(test subject)”是指要被检测有没有肿瘤或其它疾病的个体。

本发明所述的“于体外(in vitro)”是指在一个活的个体之外的环境，通常是一种人工环境，如试管中或培养的环境。

本发明所述的“免疫学技术(immunological techniques)”是指涉及任何以抗体为基础的检测技术，包括但不限于，斑点杂交，免疫墨点法，免疫沉淀，酶联免疫吸附试验(ELISA)，和放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)技术。

本发明所述的“斑点杂交(dot blot assay)”是指将样本固定在纸、玻璃纤维、或塑料板材的表面，可以用很多方法，包括以直接或间接标记抗体的杂交，检测待检测蛋白，待检测蛋白的存在会形成明显的检测信号。

本发明所述的“肿瘤靶向性(tumor targeting)”是指化合物偏好或优先和肿瘤结合的能力。一个肿瘤靶向药物成分是指药物成分可偏好或优先结合到肿瘤组织。

本发明所述的“癌症治疗(cancer therapy)”是指可控制肿瘤生长，侵袭，转移，或癌症死亡率的技术、步骤、或物质。

本发明所述的“医疗成像(medical imaging)”是指临床用途或医疗科学研究，使人体或动物组织器官产生图像的技术。

本发明所述的“治疗药剂(therapeutic agent)”是指对癌细胞具有细胞毒性，生长抑制，或免疫抑制效果的药剂或化合物。

本发明所述的“抗体(antibody)”是指：(一)与相应抗原(如CSE1L或磷酸化CSE1L)发生特异性结合反应的免疫球蛋白、免疫球蛋白多肽免疫活性部分(即免疫球蛋白的多肽，或片段及其包含抗原结合位点，可结合到一个特定的抗原(如CSE1L或磷酸化CSE1L)；或(二)任何免疫球蛋白的多肽或片段的衍生物等可结合到抗原(如CSE1L或磷酸化CSE1L)。

本发明所述的抗体可以用已知的技术及方法生产。例如，单克隆抗体(monoclonal antibodies)、杂交瘤细胞(hybridoma)、重组抗体(recombinantantibodies)、噬菌体展示(phage display)等技术生产抗体。

本发明所述的抗CSE1L抗体，或抗磷酸化CSE1L抗体与微泡间的结合反应，是以免疫原理技巧检测。在典型的免疫检测，可以将细胞、微泡或抗体固定于支持物(管柱、膜、或胶粒)上，分离掉未反应或未结合的物质后，可检测这些抗体与微泡间的结合。固定细胞、微泡或抗体的方法为已知的技术。例如，它们可以经由化学联结(chemical linking)反应或物理吸附(physicaladsorption)方法直接固定到固相(solid phase)物质上。另外，本发明的抗体经过生物素联结生物素化(biotinylated)后，也可将抗体间接地固定到吸附抗生素蛋白(avidin)或链霉抗生素蛋白(streptavidin)的固相物质上。当抗体联结到磁性粒子，不仅抗体，包括微泡也可以快速且方便地被检测和使用磁铁分离。另外，当使用一种可识别多种抗原的抗体，例如多重特异性抗体(multispecificantibody)，该抗体结合微泡上的CSE1L或磷酸化CSE1L，然后也可以再结合其它抗原蛋白。另外，抗体也可以经过蛋白A(protein A)或G(protein G)或类似物固定到固相物质上。

本发明所述的固定抗体的时间没有特别限制，抗体可在与体液样本混合接触之前，之后，或同时间被固定。可以使用任何的固相物质固定抗体，此类固相物质包括以玻璃、有机聚合物、聚苯乙烯、硅胶(silica gel)、氧化铝、活性炭等物质制成之纤维膜、粒子、纤维载体等。例如，本发明的抗体可以固定到试管、盘、碟子、或小珠子的反应容器的内壁。

使用本发明所述抗体检测或定量微泡，包括但不限于以下免疫学方法，例如，荧光抗体法，酶联免疫吸附(ELISA)，放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)，免疫组织化学染色(见Monoclonal Antibodies：Principle and Practice，3rd ed.(1996)Academic Press)，免疫墨点法，及免疫沉淀。

本发明所述的“平均量(average amount)”之计算方法，为在一个或多个样本，先确定CSE1L或磷酸化CSE1L在每个样本内的值(水平)或浓度，然后计算CSE1L或磷酸化CSE1L在这些样本的平均值或平均浓度。平均值可以由多个样本的单独值经过总加而成为总加值，再除以值的个数决定平均值。“微泡的CSE1L的平均量”是指在一个或多个对照体液样本内，CSE1L蛋白在微泡的平均量。“微泡的磷酸化CSE1L的平均量”是指在一个或多个对照体液样本内，磷酸化CSE1L蛋白在微泡的平均量。“体液样本中的磷酸化CSE1L的平均量”是指在一个或多个对照体液样本内，磷酸化CSE1L蛋白的平均量。受检测体液样本内微泡的CSE1L或磷酸化CSE1L的量，或受检测体液样本内磷酸化CSE1L的量，高于对照组体液样本中的CSE1L或磷酸化CSE1L的平均量，是指和对照组体液样本比较下，受检测体液样本CSE1L或磷酸化CSE1L量的增加。“量的增加”通常是至少10％，或至少有20％或50％，或100％，或至少2倍，或至少是5倍，或者可高达10倍甚至20倍的增加。

本发明所述的“临界值(cut-off value)”或“阳性判定值”是指一个阈值，用以区分及判断受检测个体是否患有疾病或其疾病之情况。临界值是一个由统计得出的适当数值，使用于疾病诊断上，其中测试值的平均(mean)和标准差(standard deviation，SD)从同一类患者测试及计算获得。当病人的测试值小于这个临界值时，病人被视为阴性(例如无肿瘤)，当病人的测试值大于或等于临界值，病人被视为阳性(例如有肿瘤)。

本发明所述的“药物组合(pharmaceutical composition)”是指一种或多种药物及一种或多种辅药、药物赋形剂的组合。

本发明所述的“药物的赋形剂、稀释剂或载体(pharmaceutical excipient，diluent or carrier)”包括任何经政府监管机构核准的药用辅料，稀释剂或载体，例如磷酸盐缓冲液、水、水油乳液等。也包括任何药典中使用的药剂。

本发明所述的“试剂盒(kit)”或“试剂套组”是指配有进行分析或测定所必需的全部试剂的成套用品。试剂盒内包含一个或多个试剂项目，包括但不限于，化合物、组合物成分、仪器或设备等。本发明所述的试剂盒可以附或不附使用说明或操作手册。

除非另有定义，本发明所述的所有技术和科学术语和一般惯用的技术和科学术语具有相同含义。本发明不限于本发明所述的特定检测方法、检测指导准则(protocol)、和检测试剂，因为这些检测方法和试剂可适度改变而能达到相同结果与目的。本发明所使用的科学术语是为了要做具体化的描述，并不是要限制本发明的范围或领域。

CSE1L蛋白及其编码基因为已知的技艺。CSE1L基因(GenBank编号U33286)之脱氧核糖核酸(DNA)序列如下所示：

序列1(SEQ ID NO.：1)

1   gtcgcgccat tttgccgggg tttgaatgtg aggcggagcg gcggcaggag cggatagtgc

61  cagctacggt ccgcggctgg ggttccctcc tccgtttctg tatccccacg agatcctata

121 gcaatggaac tcagcgatgc aaatctgcaa acactaacag aatatttaaa gaaaacactt

181  gatcctgatc ctgccatccg acgtccagct gagaaatttc ttgaatctgt tgaaggaaat

241  cagaattatc cactgttgct tttgacatta ctggagaagt cccaggataa tgttatcaaa

301  gtatgtgctt cagtaacatt caaaaactat attaaaagga actggagaat tgttgaagat

361  gaaccaaaca aaatttgtga agccgatcga gtggccatta aagccaacat agtgcacttg

421  atgcttagca gcccagagca aattcagaag cagttaagtg atgcaattag cattattggc

481  agagaagatt ttccacagaa atggcctgac ttgctgacag aaatggtgaa tcgctttcag

541  agtggagatt tccatgttat taatggagtc ctccgtacag cacattcatt atttaaaaga

601  taccgtcatg aatttaagtc aaacgagtta tggactgaaa ttaagcttgt tctggatgcc

661  tttgctttgc ctttgactaa tctttttaag gccactattg aactctgcag tacccatgca

721  aatgatgcct ctgccctgag gattctgttt tcttccctga tcctgatctc aaaattgttc

781  tatagtttaa actttcagga tctccctgaa ttttgggaag gtaatatgga aacttggatg

841  aataatttcc atactctctt aacattggat aataagcttt tacaaactga tgatgaagag

901  gaagccggct tattggagct cttaaaatcc cagatttgtg ataatgccgc actctatgca

961  caaaagtacg atgaagaatt ccagcgatac ctgcctcgtt ttgttacagc catctggaat

1021 ttactagtta caacgggtca agaggttaaa tatgatttgt tggtaagtaa tgcaattcaa

1081 tttctggctt cagtttgtga gagacctcat tataagaatc tatttgagga ccagaacacg

1141 ctgacaagta tctgtgaaaa ggttattgtg cctaacatgg aatttagagc tgctgatgaa

1201 gaagcatttg aagataattc tgaggagtac ataaggagag atttggaagg atctgatatt

1261 gatactagac gcagggctgc ttgtgatctg gtacgaggat tatgcaagtt ttttgaggga

1321 cctgtgacag gaatcttctc tggttatgtt aattccatgc tgcaggaata cgcaaaaaat

1381 ccatctgtca actggaaaca caaagatgca gccatctacc tagtgacatc tttggcatca

1441 aaagcccaaa cacagaagca tggaattaca caagcaaatg aacttgtaaa cctaactgag

1501 ttctttgtga atcacatcct ccctgattta aaatcagcta atgtgaatga atttcctgtc

1561 cttaaagctg acggtatcaa atatattatg atttttagaa atcaagtgcc aaaagaacat

1621 cttttagtct cgattcctct cttgattaat catcttcaag ctggaagtat tgttgttcat

1681 acttacgcag ctcatgctct tgaacggctc tttactatgc gagggcctaa caatgccact

1741 ctctttacag ctgcagaaat cgcaccgttt gttgagattc tgctaacaaa ccttttcaaa

1801 gctctcacac ttcctggctc ttcagaaaat gaatatatta tgaaagctat catgagaagt

1861 ttttctctcc tacaagaagc cataatcccc tacatcccta ctctcatcac tcagcttaca

1921 cagaagctat tagctgttag taagaaccca agcaaacctc actttaatca ctacatgttt

1981 gaagcaatat gtttatccat aagaataact tgcaaagcta accctgctgc tgttgtaaat

2041 tttgaggagg ctttgttttt ggtgtttact gaaatcttac aaaatgatgt gcaagaattt

2101 attccatacg tctttcaagt gatgtctttg cttctggaaa cacacaaaaa tgacatcccg

2161 tcttcctata tggccttatt tcctcatctc cttcagccag tgctttggga aagaacagga

2221 aatattcctg ctctagtgag gcttcttcaa gcattcttag aacgcggttc aaacacaata

2281 gcaagtgctg cagctgacaa aattcctggg ttactaggtg tctttcagaa gctgattgca

2341 tccaaagcaa atgaccacca aggtttttat cttctaaaca gtataataga gcacatgcct

2401 cctgaatcag ttgaccaata taggaaacaa atcttcattc tgctattcca gagacttcag

2461 aattccaaaa caaccaagtt tatcaagagt tttttagtct ttattaattt gtattgcata

2521 aaatatgggg cactagcact acaagaaata tttgatggta tacaaccaaa aatgtttgga

2581 atggttttgg aaaaaattat tattcctgaa attcagaagg tatctggaaa tgtagagaaa

2641 aagatctgtg cggttggcat aaccaactta ctaacagaat gtcccccaat gatggacact

2701 gagtatacca aactgtggac tccattatta cagtctttga ttggtctttt tgagttaccc

2761 gaagatgata ccattcctga tgaggaacat tttattgaca tagaagatac accaggatat

2821 cagactgcct tctcacagtt ggcatttgct gggaaaaaag agcatgatcc tgtaggtcaa

2881 atggtgaata accccaaaat tcacctggca cagtcacttc acatgttgtc taccgcctgt

2941 ccaggaaggg ttccatcaat ggtgagcacc agcctgaatg cagaagcgct ccagtatctc

3001 caagggtacc ttcaggcagc cagtgtgaca ctgctttaaa ctgcattttt ctaatgggct

3061 aaacccagat ggtttcctag gaaatcacag gcttctgagc acagctgcat taaaacaaag

3121 gaagttttcc ttttgaactt gtcacga

CSE1L蛋白(蛋白质ID编号AAC50367.1)之胺基酸序列如下所示：

序列2(SEQ ID NO.：2)

MELSDANLQTLTEYLKKTLDPDPAIRRPAEKFLESVEGNQNYPL

LLLTLLEKSQDNVIKVCASVTFKNYIKRNWRIVEDEPNKICEADRVAIKANIVHLMLS

SPEQIQKQLSDAISIIGREDFPQKWPDLLTEMVNRFQSGDFHVINGVLRTAHSLFKRY

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用于产生抗磷酸化CSE1L(蛋白质ID编号AAC50367.1)抗体之磷酸化肽的氨基酸序列如下：

序列3(SEQ ID NO.：3)

LTpEYpLKKTLDPDPAC[Tp代表磷酸化苏氨酸(phosphothreonine)，Yp代表磷酸化酪氨酸(phosphotyrosine)]

实施例

抗体

实施例所使用之抗体为：抗p21/ras抗体(EP1125Y)(Epitomics，美国)；抗CSE1L抗体(3D8)，抗MAPK1/MAPK3抗体(phospho T202/204，G15-B)(Abnova，台湾，中国)；抗CSE1L抗体(24)，抗磷酸化酪氨酸抗体(PY20)，抗磷酸化丝氨酸及磷酸化苏氨酸(phospho-serine/threonine)抗体(22A/pSer/Thr)(BD Pharmingen，美国)；抗β-微管蛋白抗体(D66)(Sigma Chemicals，美国)；抗β-肌动蛋白抗体(Ab-5)，抗GFP抗体(Ab-1)(Lab Vision，美国)；抗MMP-2抗体(H-76)，抗磷酸化苏氨酸抗体(H2)(Santa Cruz Biotechnology，美国)；山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories，美国)；联结Alexa Fluor 488(或568)的山羊抗小鼠(或抗兔)IgG二级抗体(Molecular Probes，美国)。

基因表达载体

pZIP-v-H-ras为一种可以表达v-H-Ras蛋白的表达载体，含有新霉素(neomycin)转染选择标记，由Dr.Channing J Der提供。pcDNA-CSE1L为一种可以表达CSE1L蛋白的表达载体，含有新霉素转染选择标记，为之前自行建构(Tung 2009)。可降低细胞CSE1L基因表达的CSE1L短发夹RNA(shRNA，short hairpin RNA)载体(SC-29909-SH，Santa CruzBiotechnology)，和其对照控制shRNA载体(SC-108060，Santa CruzBiotechnology)，含有嘌呤霉素(puromycin)转染选择标记，购自Santa Cruz公司(Santa Cruz Biotechnology)。

细胞和基因转染

B16F10黑色素瘤细胞系购自American Type Culture Collection(美国)。以10％之胎牛血清(FBS)、100units/mL青霉素(penicillin)、100mg/mL链霉素(streptomycin)及2mM谷氨酸(glutamate)补充之DMEM培养基(Dulbecco′sModified Eagle′s Medium)于37℃，湿润之5％CO₂大气条件下培养细胞。利用脂质转染胺试剂Lipofectamine plus reagent(Invitrogen，美国)以基因表达载体转染细胞。以高浓度新霉素和嘌呤霉素筛选经转染之细胞3周。收集多重抗药性纯系(＞100)并增殖成大量细胞。将经转染之细胞维持于含有新霉素和嘌呤霉素之培养基中。用于本文所述实验之细胞则培养于不含新霉素和嘌呤霉素之培养基中。

免疫墨点法

以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，并以刮取法收集细胞。以RIPA放射免疫沈淀缓冲液(radioimmunoprecipitation buffer)[25mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HC1，pH 7.2)，0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.1％Triton X-100，1％脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate)，150mM氯化钠(NaCl)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，5mM正钒酸钠(sodium orthovanadate)，1mM苯甲基磺酰化氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)，10μg/mL抑肽酶(aprotinin)，5μg/mL亮抑酶肽(leupeptin)，25mM β-甘油磷酸(β-glycerophosphate)，5mM氟化钠(sodiumfluoride)]溶解收集之细胞。以BCA蛋白质检测套组(Pierce，美国)测定蛋白质浓度。将50μg之蛋白质检体做十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)。将蛋白质转渍至硝酸纤维素膜(nitrocellulose membranes；Amersham Pharmacia，英国)。硝酸纤维素膜于4℃下和含1％牛血清白蛋白(BSA，bovine serumalbumin)，50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HC1，pH 7.6)，150mM氯化钠，0.1％Tween-20的免疫染色封闭液(blocking buffer)反应16小时。再将硝酸纤维素膜于室温下与一级抗体反应1小时，接着与辣根过氧化酶(horseradishperoxidase)结合之二级抗体反应1小时。利用Forte免疫墨点侦测系统(ForteWestern HRP Substrate；Millipore，美国)测定蛋白含量。

免疫沉淀反应

以磷酸盐缓冲液洗涤细胞，收集细胞，加入适量放射免疫沈淀缓冲液，在冰上或者4℃下裂解20分钟，12,000rpm离心10分钟后取上清；用BCA蛋白质检测套组(Pierce，美国)测定蛋白浓度。将定量细胞裂解液(500μg)、相应的抗体、和30μL蛋白A/G-微珠(protein A/G-beads)加入免疫沉淀缓冲液(immunoprecipitation buffer)[含50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HC1，pH 7.5)，150mM氯化钠]的试管中，于4℃缓慢摇晃孵育过夜；免疫沉淀反应后，在4℃下，以3,000rpm速度离心5分钟，将蛋白A/G-微珠离心至管底；后将上清液小心吸去，蛋白A/G-微珠用1mL放射免疫沈淀缓冲液洗3-4次；最后加入50μL的2倍十二烷基硫酸钠蛋白加样缓冲液(SDSprotein Loading buffer)，在沸水中煮10分钟；用免疫墨点法分析。以抗GFP的鼠抗体进行控制组免疫沉淀反应。

在以血清样品进行免疫沉淀方面，将血清和与琼脂糖偶联的抗磷酸化苏氨酸抗体(agarose-conjugated anti-phosphothreonine antibodies，H2)(Santa CruzBiotechnology)于磷酸盐缓冲液中，在4℃缓慢摇晃孵育过夜；免疫沉淀反应后，在4℃下，以3,000rpm速度离心5分钟。后将上清液小心吸去，以1mL磷酸盐缓冲液洗沉淀物3-4次，最后加入50μL的2倍十二烷基硫酸钠蛋白加样缓冲液(SDS protein Loading buffer)，在沸水中煮10分钟；用免疫墨点法分析。以和琼脂糖偶联的小鼠正常IgG(agarose-conjugated normalmouse IgG)进行控制组免疫沉淀反应。

免疫荧光实验及微泡计数

将生长于12×12mm盖玻片之细胞以1000rpm离心10分钟。以磷酸盐缓冲液洗涤并以4％多聚甲醛(paraformaldehyde)之磷酸盐缓冲液固定细胞，再以甲醇(methanol)处理细胞，之后将细胞以含有0.1％牛血清白蛋白之磷酸盐缓冲液反应一小时。使细胞与一级抗体反应一小时后以磷酸盐缓冲液洗涤，接着与Alexa Fluor 488(或568)山羊抗小鼠(或抗兔)IgG二级抗体反应一小时后以磷酸盐缓冲液洗涤。以倒立式荧光显微镜观察细胞。实验进行三次独立实验，每次实验含两个盖玻片，每片盖玻片随机取5个视野观察。每次实验观察三百个细胞并计算这些细胞表面的微泡，由三个独立实验所计数的微泡数目绘统计图并显示统计标准偏差。

细胞增殖分析

将相同数量之细胞(1×10⁴细胞个数/盘)接种于100-mm细胞培养盘。细胞接种后，每隔24小时以台盼蓝拒染试验(trypan blue exclusion assay)计算细胞数量。每隔三天更新培养液。每个时间点算三盘细胞，每盘只计算一次。

条件培养基(conditioned medium)

将相同数量之细胞接种于100-mm细胞培养盘，先使细胞生长至快满(sub-confluence)后以磷酸盐缓冲液洗涤，接着将细胞培养于不含血清之培养液培养48小时后，测定细胞数，收集该培养液，并以10,000rpm离心收集之培养液10分钟后收集上清液，以移除任何可能之悬浮细胞或细胞碎片。

微泡收集

细胞条件培养基和血清中之微泡，基本上以分子筛选层析(size exclusionchromatography)及超高速离心技术收集。简言之，将细胞条件培养基或血清注入Sepharose 2管柱(Amersham Biosciences，美国)。单独收集每1毫升通过管柱流出的液体，并且以光度仪器测量280nm吸光度。将含大于50万kDa的收集蛋白质液体在4℃下离心105,000g一小时。离心下来的即为含有微泡的沉淀物，加入50μL的磷酸盐缓冲液均匀混合并低温保存。

GST-CSE1L融合蛋白合成及CSE1L蛋白纯化

GST-CSE1L融合蛋白质是利用小麦胚芽无细胞蛋白质合成系统(wheatgerm cell-free protein synthesis system；CellFree Sciences，日本)合成。简言之，以限制酶切割出pcDNA-CSE1L载体的CSE1L蛋白合成序列，再将CSE1L蛋白合成序列以接合酶接合到pPEU-E01小麦胚芽表达载体(CellFreeSciences)。将2微克(μg)的CSE1L小麦胚芽表达载体加入含转录溶液(transcription premix solution；CellFree Sciences)的试管中，在37℃进行转录反应6小时。将10微升(μL)的转录讯息核糖核甘酸(mRNA)产物与10微升的小麦胚芽提取液(WEPRO 3240，CellFree Sciences)混合，并将此混合液注入到含SUB-AMIX(CellFree Sciences)试管的下层，在26℃进行蛋白转译反应16小时以合成GST-CSE1L融合蛋白。利用GST纯化组件(Bulk GSTPurification Modules，Amersham Pharmacia，美国)以谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B珠(glutathione-Sepharose 4B beads Amersham Pharmacia，美国)纯化GST-CSE1L融合蛋白。接着，以磷酸盐缓冲液洗涤含融合蛋白的管柱，再以还原之谷胱甘肽(reduced glutathione；Amersham Pharmacia)分离融合蛋白。以凝血酶(thrombin；Sigma Chemicals，美国)于3units/100μg融合蛋白质的浓度下于22℃切割GST-CSE1L融合蛋白16小时。以Ultra-4离心过滤组(Millipore，美国)移除凝血酶及GST。利用抗CSE1L抗体以免疫墨点法确认纯化之CSE1L。以BCA蛋白质检测套组(Pierce)测定CSE1L蛋白浓度。

组织微阵列切片和免疫组织化学反应

将癌组织和相邻非癌组织石蜡块切成适度大小，将组织石蜡块排列及制成组织微阵列切片。以4μm厚度的组织微阵列切片进行免疫组织化学反应。切片于二甲苯去石蜡并以乙醇复水后，于95℃下将其浸于柠檬酸盐缓冲液中10分钟。利用Histostain套组(Zymed，美国)以标记链霉抗生物素-生物素法(labeled streptavidin-biotin method)进行免疫组织化学反应。以3％溶于水之过氧化氢遮盖组织切片内源性过氧化酶活性，之后于室温下以5％牛血清白蛋白培育1小时以遮盖非专一性染色。于室温下使切片与稀释50倍之抗体反应1小时，之后与生物素化之二级抗体(biotinylated secondary antibodies)反应，最后与链霉抗生物素标定之过氧化酶(streptavidin-labeled peroxidase)反应。以二氨基联苯胺(diaminobenzidine)使切片显影并以蒸馏水洗涤，最后以Mayer′s苏木清(Mayer′s hematoxylin)进行复染。

以Matrigel做细胞侵袭性分析

将matrigel基质胶(BD Pharmingen，美国)以1∶10的比例稀释于DMEM中，并和不含聚乙烯吡咯啶酮之8μm孔径聚碳酸滤纸(polyvinylpyrrolidone-free polycarbonate filters；Costar，美国)于4℃共置16小时，之后以DMEM洗涤滤纸4次后，将其置于微趋化室(microchemotaxischambers)中。以0.1％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)处理细胞并将细胞重新悬浮于含有10％胎牛血清之DMEM培养基，之后以不含血清之DMEM培养基洗涤细胞。最后将细胞(3×10⁵)悬浮于DMEM(200μL)并置于微趋化室之上层隔间。将含有20％胎牛血清之细胞培养液(300μL)置于微趋化室之下层当作细胞侵袭引诱剂。于细胞培养箱中培养10小时后，以棉花棒完全拭去微趋化室上层隔间滤纸上面之细胞。以甲醇固定微趋化室上层隔间之滤纸下面的细胞，并以Liu′s A及Liu′s B试剂染色，之后于显微镜下计数。重复检测三次，每次检测包括四个重复。于每个样本，随机选择10个显微镜视野计数侵袭到微趋化室滤纸下面的细胞，并且将计数平均统计。

免疫电子显微镜(immunogold electron microscopy)

用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，并固定在含0.5％戊二醛(glutaraldehyde)和2％多聚甲醛(paraformaldehyde)的羟乙基呱嗪乙磺酸(HEPES，hydroxyethyl-piperazine ethanesulafonic acid)缓冲液(pH值6.8)15分钟，然后再将细胞在含2％多聚甲醛的羟乙基呱嗪乙磺酸缓冲液于4℃反应14天。样品再用80％乙醇脱水再以Lowicryl HM20树脂(Polysciences，日本)处理及进行聚合反应24小时。将含细胞的树脂块做超薄切片，然后将切片置于涂有2％氯丁橡胶(Neoprene，Ohken，日本)的镍网(nickel gids)上。样品以100％乙醇处理3分钟后，浸泡在65℃的0.01M乙二胺四乙酸(EDTA，pH值7.2)24小时。样品用磷酸盐缓冲液洗三次，再和含1％牛血清白蛋白和0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲液反应15分钟。样品再和稀释于磷酸盐缓冲液(1∶30)的抗体反应1小时，用磷酸盐缓冲液洗三次，再和偶联纳米金粒子的二级抗体(gold-labeled secondary antibodies)反应，再用磷酸盐缓冲液洗三次。之后样品以醋酸铀(uranyl acetate)染色，以Hitachi H-7000(Hitachi，日本)电子显微镜观察。

明胶酶谱检测(gelatin zymography assay)

依细胞数量调整细胞条件培养基体积，取由细胞条件培养基收集的微泡，进行明胶酶谱检测。将微泡溶于不含还原剂二硫苏糖醇(dithiothreitol)或2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol)的2倍十二烷基硫酸钠蛋白加样缓冲液(SDSprotein Loading buffer)，以含1mg/mL明胶(gelatin)的10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。之后将凝胶以含2.5％Triton X-100的水洗两次，每次30分钟去除十二烷基硫酸钠(SDS)，并随后将凝胶置于明胶酶谱缓冲液[50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HC1，pH 7.6)，200mM氯化钠，10mM氯化钙(CaCl₂)]于37℃放置24小时。将凝胶以Comassie blue染色液(0.125％Comassie blue R-250，50％甲醇，10％乙酸)染色30分钟，再以脱色液(20％甲醇，10％乙酸，70％水)脱色，直到清晰的透明条带显现。

动物癌转移实验

于标准环境下(22℃；50％湿度；12小时之光/暗周期)，将6至7周(N＝18)及14至15周(N＝26)大之C57BL/6小鼠(实验动物中心，台湾，中国)圈养于动物室。实验包括4组[即注射B16-dEV细胞(N＝11)，B16-CSE1L细胞(N＝14)，B16-ras细胞(N＝8)，和B16-Ras/anti-CSE1L细胞(N＝11)的小鼠]，且不同年龄的小鼠被均匀地分布在四组。每只鼠由尾静脉注射100μL含3×10⁴细胞的磷酸盐缓冲液。注射后三个星期将小鼠牺牲。以肉眼检验及显微检验计数小鼠肺中之肿瘤数。小鼠之饲育及实验程序均依照台湾实验动物管理委员会之规范。有3只注射B16-dEV细胞的小鼠、10只注射B16-CSE1L细胞的小鼠、4只注射B16-ras细胞的小鼠、和1只注射B16-Ras/anti-CSE1L细胞的小鼠，于注射3周后失去生命，因而被排除肺肿瘤统计。另外，有1只注射B16-dEV细胞的小鼠、1只注射B16-CSE1L细胞的小鼠、0只注射B16-ras细胞的小鼠、和3只注射B16-Ras/anti-CSE1L细胞的小鼠，没有生长肿瘤，因而也被排除肿瘤统计。

病人和肿瘤样本

肿瘤样本为从台湾彰化基督教医院之115个大肠直肠癌病患，取得未经癌治疗处理之癌组织及血清检体。肿瘤检体在遵循及通过机构伦理审查委员会(IRB)审查核准之指导方针，及告知病患同意下，于诊断及手术时取得检体。肿瘤的分级和分类，是根据第六版美国联合委员会的癌症分期手册。健康捐赠者的血清样品，获得自60个健康人(平均年龄61.0±8.7岁；年龄范围，22-71岁)。收集之血液于室温下放置至少30分钟，以形成凝块。接着使检体于4℃以1300g离心20分钟，收集血清。将血清以10,000rpm离心10分钟，收集上清液，以移除任何可能之悬浮细胞或细胞残骸，并保存于-80℃冷冻以备后续检测使用。将所有检体以特定标签标示以保护病患隐私。在进行分析前所有检体都未经解冻。患者的临床病理特征整理于表格1。

表格1、大肠直肠癌病患之临床病理特征

^a平均数±标准差。^b第1级：分化良好，第2级：中度分化，第3级：低度分化。^cN0：没有区域淋巴结转移，N1：有1-3区域癌淋巴结转移，N2：癌转移至多于4个区域淋巴结，^dM0：无远处癌转移，M1：有远处癌转移。

动物活体肿瘤显像实验

依据厂商的操作手册，利用Qdot 800抗体偶联试剂盒(Qdot 800AntibodyConjugation Kit；Invitrogen，美国)将抗CSE1L抗体或正常小鼠IgG与Qdot800量子点结合。与Qdot 800量子点结合的小鼠正常IgG抗体将应用于控制组实验。简言之，以4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC，N-Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)将Qdot激活，同时以二硫苏糖醇(dithiothreitol)进行抗体还原。还原之抗体与激活之Qdot混合以进行偶联反应，并且以2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol)终止反应。利用超细过滤(ultrafiltration)和分子筛选层析(size exclusionchromatography)将偶联Qdot的抗体纯化。用分光光度计测定偶联Qdot的抗体浓度。

将6至7周大之C57BL/6小鼠(实验动物中心，台湾，中国)圈养于标准环境下之动物室(22℃；50％湿度；12小时之光/暗周期)，每只鼠由背侧皮肤注射100μL含3×10⁴个B16-CSE1L细胞的磷酸盐缓冲液。注射后三周，背侧有肿瘤的小鼠由尾静脉注射100μL含500pmole偶联Qdot的抗CSE1L抗体。控制组实验注射等量与Qdot 800量子点偶联的小鼠正常IgG。利用非侵入式Xenogen IVIS 200活体影像系统[激发波长(excitation)：525/50nm；发射波长(emission)：832/65nm]于注射，0，1和4小时后检测肿瘤显像。

生产抗磷酸化CSE1L的抗体

采用固相法(solid phase  method)合成磷酸化肽：LTpEYpLKKTLDPDPAC(Tp代表磷酸化苏氨酸；Yp代表磷酸化酪氨酸)，和非磷酸化肽：LTEYLKKTLDPDPAC。将钥孔血蓝蛋白(keyhole limpethaemocyanin，KLH)经由磷酸化肽N末端的半胱氨酸(cysteine)的巯基(thiol)与磷酸化肽偶联，并以此当抗原，注射及免疫新西兰兔(New Zealand rabbit)五次。于末次免疫后的一个星期，收集免疫血清。利用蛋白质G管(protein Gcolumn；Amersham Pharmacia，瑞典)纯化IgG抗体。利用以磷酸化肽制成的亲和层析柱(phosphorylated peptide affinity column)纯化抗体，然后利用非磷酸化肽吸附以除去其中之非抗磷酸化CSE1L抗体。以酶联免疫吸附试验和免疫墨点法分析抗体效价(titer)及专一性。

斑点杂交(dot blotting)

将各纯化之微泡悬浮液等量(5μL)各别注到96孔斑点印迹盘(96-welldot-blot manifold apparatus；BRL，美国)的硝酸纤维素膜(nitrocellulosemembranes；Amersham Pharmacia)。硝酸纤维素膜于室温和含1％牛血清白蛋白，50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，(Tris-HC1，pH 7.6)，150mM氯化钠，0.1％Tween-20的免疫染色封闭液(blocking buffer)反应一小时。然后与初级抗体4℃下反应16小时，再与偶联辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)的二次抗体反应1小时。利用Forte免疫墨点侦测系统(Forte Western HRPSubstrate；Millipore，美国)测定蛋白质含量。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

将各血清以磷酸盐缓冲液稀释3倍，再二重复且等量(100μL)置放入96孔的NUNC Immunoplate MaxiSorb孔盘(96-well Nunc ImmunoplateMaxiSorb plates；Nunc，丹麦)，4℃下反应16小时。然后吸掉孔内悬浮血清，以含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液与吸附在孔内的血清于室温反应1小时。吸掉含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，以PBST(含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液)简单洗涤孔盘的孔。使孔与标记生物素(biotin)之抗CSE1L抗体(biotin-conjugated anti-CSE1L antibodies)或与标记生物素之抗磷酸化CSE1L抗体反应1小时。标记生物素之抗体系利用Biotin Labeling Kit-NH2试剂盒(Dojindo Laboratories，日本)，将抗CSE1L抗体或抗磷酸化CSE1L抗体生物素化(biotinylation)而制得。之后将孔以PBST洗涤并与和链霉亲和素结合之辣根过氧化酶(streptavidin-conjugated horseradish peroxidase；R&DSystems，美国)反应30分钟，以PBST洗涤孔盘的孔，再与酶联免疫吸附受质试剂(R&D Systems)反应20分钟。然后用PBST洗涤孔盘的孔。以3个含磷酸盐缓冲液之孔作为背景值，及3个含磷酸盐缓冲液之孔但有与所有其它酶联免疫吸附试剂反应之孔作为对照组，以供校正。于30分钟内以酶标仪(Thermo Multiskan EX Microplate Photometer，Thermo Fisher Scientific，美国)测量于450nm之吸光值。每一检体均进行两次分析。

统计分析

使用SPSS14.0统计软件进行数据分析。利用双尾Fisher精确检验(two-tailed Fisher’s exact test)分析统计差异。α值小于0.01则为统计上显着。

实施例

实施例1：建立B16-dEV细胞、B16-CSE1L细胞、B16-ras细胞和B16-Ras/anti-CSE1L细胞。

利用pcDNA空载体、pZIP空载体、pcDNA-CSE1L载体、pZIP-v-H-ras载体、CSE1L shRNA载体、或对照控制shRNA载体转染B16F10细胞，以建立B16-dEV细胞、B16-CSE1L细胞、B16-ras细胞和B16-Ras/anti-CSE1L细胞。图1是以免疫墨点法分析B16-dEV，B16-ras，B16-CSE1L，和B16-Ras/anti-CSE1L细胞的Ras和CSE1L蛋白表达量的结果(图1)。

图1显示以抗Ras抗体、抗CSE1L抗体、和免疫墨点法，分析Ras和CSE1L蛋白在B16-dEV细胞、B16-CSE1L细胞、B16-ras细胞、和B16-Ras/anti-CSE1L细胞的表达量。β-肌动蛋白的表达量为对照。

实施例2：v-H-ras癌基因转染癌细胞诱导微泡生成。

经v-H-ras癌基因转染的B16F10细胞(即B16-ras细胞)表面，可发现很多泡状微泡生成(图2A)。在细胞的细胞质及伪足(pseudopodia)基部，也可发现正在形成中或发展中的微泡(图2B)。因此，v-H-ras基因调控细胞微泡的生成。微泡内含有大量蛋白酶(Taraboletti 2002)。免疫荧光实验证实B16-ras细胞的微泡内含有基质金属蛋白酶-2(MMP-2)(图2C)。以免疫墨点法分析，结果表明v-H-ras癌基因转染B16F10细胞，会增加微泡MMP-2蛋白量；而PD98059(一种ERK活性抑制剂)处理会降低v-H-ras所刺激的细胞微泡MMP-2蛋白量的增加(图2D)。以4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；4′，6-diamidino-2-phenylindole)染色细胞染色质，结果表明这些细胞没有染色质浓缩或染色质碎片等细胞凋亡现象。因此，Ras-ERK讯息路径介导细胞微泡的生成。

图2显示v-H-ras癌基因转染诱导癌细胞微泡生成。(A)B16F10细胞，B16-dEV细胞，和B16-ras细胞的显微镜像及微泡计数。(B)显微镜像显示B16-ras细胞的伪足基部和细胞膜上正在生成中的微泡。(C)抗MMP-2抗体免疫荧光显示B16-ras细胞微泡内的MMP-2。(D)免疫墨点法，分析以50μMPD98059或其溶解剂二甲基亚砜(DMSO，dimethy sulphoxide)处理，且在无血清条件下培养48小时的B16-dEV和B16-ras细胞之微泡的MMP-2量。

实施例3：v-H-ras癌基因转染增加癌细胞分泌CSE1L。

以抗CSE1L抗体及免疫墨点法分析的结果表明，v-H-ras基因转染B16F10细胞，会增加细胞分泌CSE1L蛋白；而PD98059处理会降低v-H-ras所刺激的细胞CSE1L蛋白分泌(图3)。v-H-ras基因转染B16F10细胞或PD98059处理细胞，没有明显影响细胞内的CSE1L表达(图3)。因此，Ras-ERK讯息路径介导细胞分泌CSE1L。

图3显示v-H-ras癌基因转染增加癌细胞分泌CSE1L。以抗CSE1L抗体及免疫墨点法，分析以二甲基亚砜(DMSO)或50μM PD98059处理，且在无血清条件下培养24小时的B16-dEV和B16-ras细胞之CSE1L表现量及分泌量。

实施例4：CSE1L是一种磷酸化蛋白。

利用以小麦胚芽无细胞蛋白质合成系统合成的GST-CSE1L融合蛋白及纯化之CSE1L蛋白，研究CSE1L的磷酸化。免疫墨点法的结果显示，CSE1L蛋白可以和抗磷酸化丝氨酸及磷酸化苏氨酸抗体，和抗磷酸化酪氨酸抗体反应(图4)。因此，CSE1L是一种丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸磷酸化蛋白(serine/threonine and tyrosine phosphorylated protein)。

图4显示CSE1L是一个磷酸化的蛋白。以抗磷酸化丝氨酸及磷酸化苏氨酸抗体，和抗磷酸化酪氨酸抗体和免疫墨点法，分析CSE1L蛋白之磷酸化状况。CSE1L蛋白为以凝血酶(thrombin)分解以小麦胚芽无细胞蛋白质合成系统合成的GST-CSE1L融合蛋白而得。

实施例5：v-H-ras癌基因转染增加癌细胞内CSE1L蛋白之磷酸化，以及磷酸化CSE1L蛋白存在于癌血清中。

以抗CSE1L抗体和免疫沉淀技术，免疫沉淀以二甲基亚砜(DMSO)或50μM PD98059处理，且在无血清条件下培养24小时的B16-dEV和B16-ras细胞。免疫沉淀物再以偶联辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)的抗磷酸化苏氨酸抗体做免疫墨点法分析。结果表明，v-H-ras癌基因转染，会增加细胞内CSE1L蛋白之磷酸化；而PD98059处理会降低v-H-ras癌基因转染所增加之细胞内CSE1L蛋白之磷酸化(图5A)。因此，Ras-ERK传导信号介导CSE1L蛋白磷酸化。CSE1L是一种分泌蛋白，因此也测试Ras-ERK信号通路是否介导磷酸化CSE1L蛋白的分泌。以抗CSE1L抗体和免疫沉淀技术，免疫沉淀收集自以二甲基亚砜(DMSO)或50μM PD98059处理，且在无血清条件下培养24小时的B16-dEV和B16-ras细胞的条件培养基。免疫沉淀物再以经过辣根过氧化酶标记的抗磷酸化苏氨酸抗体做免疫墨点法分析。结果表明，v-H-ras癌基因转染，会增加细胞磷酸化CSE1L蛋白之分泌；而PD98059处理会降低v-H-ras癌基因转染所增加之细胞磷酸化CSE1L蛋白之分泌(图5B)。

以琼脂糖偶联的抗磷酸化苏氨酸抗体(agarose-conjugatedanti-phosphothreonine antibodies)和免疫沉淀技术，免疫沉淀大肠直肠癌患者血清(N＝36)和健康献血者(N＝36)血清。免疫沉淀物再以抗CSE1L抗体做免疫墨点法分析。结果表明，苏氨酸磷酸化CSE1L蛋白存在于癌症血清之免疫沉淀物，但不存在于健康献血者之免疫沉淀物(图5C)。另一方面，免疫墨点法分析结果表明，虽然这些癌患者血清中CSE1L的量高于健康献血者血清中之CSE1L的量，但这差异并不如癌症血清之苏氨酸磷酸化CSE1L与健康献血者血清中之苏氨酸磷酸化CSE1L量之间的差异显着(图5D)。这些结果表明，分泌的磷酸化CSE1L可为癌症诊断标志。

图5显示v-H-ras癌基因转染增加癌细胞内CSE1L蛋白之磷酸化，以及磷酸化CSE1L蛋白存在于癌血清中。(A)以抗磷酸化苏氨酸抗体、抗CSE1L抗体、和免疫沉淀反应，分析以二甲基亚砜(DMSO)或50μM PD98059处理，且在无血清条件下培养24小时的B16-dEV和B16-ras细胞内之CSE1L磷酸化状况。另外，以抗GFP的鼠抗体进行控制组免疫沉淀反应。(B)以抗磷酸化苏氨酸抗体、抗CSE1L抗体、和免疫沉淀反应，分析以二甲基亚砜(DMSO)或50μM PD98059，且在无血清条件下培养24小时的B16-dEV和B16-ras细胞所分泌之CSE1L蛋白磷酸化状况。以抗GFP的鼠抗体进行控制组免疫沉淀反应。(C)以琼脂糖偶联的抗磷酸化苏氨酸抗体、抗CSE1L抗体、和免疫沉淀反应，分析癌患者血清中CSE1L蛋白磷酸化状况。癌患者血清取自36个大肠癌患者(每个患者10μL)，健康献血者血清取自36位健康人(每人10μL)。以琼脂糖偶联的正常小鼠IgG(agarose-conjugated normal mouseIgG)进行控制免疫沉淀。(D)免疫墨点法，分析上述癌患者血清(36个大肠直肠癌患者，每个患者10μL)和健康献血者血清(36位健康人，每人10μL)中CSE1L蛋白的量。

实施例6：磷酸化ERK与CSE1L高表达于大肠直肠癌肿瘤，且相对表染色强度一致。

以癌组织微阵列切片(tissue microarray)，和免疫组织化学技术(immunohistochemistry)，分析115个大肠直肠癌癌检体，结果显示磷酸化ERK和CSE1L分别在100％(115/115)和99.1％(114/115)的癌检体有高表达(图6A)。相邻正常组织仅有相对微弱的磷酸化ERK和CSE1L表达(图6A)。以大肠癌组织相邻的连续切片，及免疫组织化学技术，分析磷酸化ERK和CSE1L在大肠肿瘤的相对染色强度，也发现磷酸化ERK和CSE1L在大部分(97.4％；112/115)大肠直肠癌肿瘤检体的相对染色强度有一致性。表明磷酸化ERK与CSE1L于大肠直肠癌恶化的密切关系(图6B)。

图6显示磷酸化ERK与CSE1L高表达于大肠癌肿瘤，且相对表染色强度一致。(A)以免疫组织化学技术，及由115癌标本构成的组织微阵列切片分析磷酸化ERK和CSE1L在大肠直肠癌的表达量。左图：非肿瘤组织；右图：大肠肿瘤。原放大倍率：400倍。(B)以免疫组织化学及大肠直肠癌组织相邻的连续切片，分析磷酸化ERK和CSE1L在大肠直肠癌肿瘤的相对染色强度。箭头指示磷酸化ERK与CSE1L相对表染色强度一致的部位。原放大倍率：40倍。

实施例7：CSE1L介导v-H-ras癌基因所诱导的癌细胞微泡生成。

利用携带CSE1L shRNA基因的表达载体，转染B16-ras细胞，以抑制B16-ras细胞内之CSE1L表达，建立B16-Ras/anti-CSE1L细胞。显微镜检查显示，降低B16-ras细胞内之CSE1L表达，会抑制v-H-ras癌基因所诱导的癌细胞微泡生成(图7A)。另外，利用携带表达CSE1L基因的载体，转染B16F10细胞使细胞高度表达CSE1L，以建立B16-CSE1L细胞。显微镜检查显示，细胞高度表达CSE1L也会诱导微泡生成(图7B)。以免疫荧光技术(immunofluorescence)研究，发现CSE1L和MMP-2皆位于在细胞质及伪足(pseudopodia)基部内正在生成中的微泡内(图7C)。以上结果表明，CSE1L介导v-H-ras癌基因所诱导的癌细胞微泡生成。

图7显示CSE1L介导v-H-ras癌基因所诱导的癌细胞微泡生成。(A)B16-Ras细胞和B16-Ras/anti-CSE1L细胞的显微镜像及微泡计数。(B)B16-dEV细胞和B16-CSE1L细胞的显微镜像及微泡计数。(C)免疫荧光技术研究，显示CSE1L和MMP-2蛋白位于B16-ras细胞的伪足基部和细胞膜上正在生成中的微泡内。

实施例8：CSE1L介导v-H-ras癌基因所诱导的癌细胞侵袭(invasion)。

收集以二甲基亚砜(DMSO)或50μM PD98059处理，且在无血清条件下培养24小时的B16-dEV，B16-ras，B16-CSE1L，和B16-Ras/anti-CSE1L细胞的条件培养基，再分离这些条件培养基中之微泡。以明胶酶谱法(zymography)分析这些条件培养基中微泡之MMP-2明胶酶活性。结果表明，v-H-ras癌基因转染，会增加细胞释放至条件培养基中之微泡的MMP-2明胶酶活性；PD98059可抑制v-H-ras癌基因转染所增加之微泡MMP-2明胶酶活性(图8A)。此外，细胞高度表达CSE1L也会增加细胞释放至条件培养基中之微泡的MMP-2明胶酶活性(图8A)。而且降低B16-ras细胞内之CSE1L表达，会抑制v-H-ras癌基因所增加之微泡MMP-2明胶酶活性(图8A)。用Matrigel基质胶做B16-dEV，B16-Ras，B16-CSE1L，和B16-Ras/anti-CSE1L细胞的细胞侵袭性分析(Matrigel-based invasion assays)，结果表明，v-H-ras癌基因转染增加癌细胞侵袭性(图8B)，细胞高度表达CSE1L也会增加癌细胞侵袭性(图8B)，利用CSE1L shRNA降低B16-ras细胞内之CSE1L表达，也会抑制v-H-ras癌基因转染所增加之癌细胞侵袭性(图8B)。因此，CSE1L介导v-H-ras癌基因所诱导的癌细胞侵袭。

图8显示CSE1L介导v-H-ras癌基因所诱导的癌细胞侵袭。(A)以明胶酶谱法，分析以二甲基亚砜(DMSO)或50μM PD98059处理，且在无血清条件下培养24小时的B16-dEV，B16-ras，B16-CSE1L，和B16-Ras/anti-CSE1L细胞，所释放之微泡的MMP-2明胶酶活性(zymographic activities)。(B)用Matrigel基质胶做B16-dEV，B16-Ras，B16-CSE1L，和B16-Ras/anti-CSE1L细胞的细胞侵袭性分析。侵袭细胞的数目(平均数±标准差；细胞数目/视野)分别为B16-dEV细胞：109.4±12.6；B16-CSE1L细胞：406.8±23.9；B16-Ras细胞：311.25±32.4；B16-Ras/anti-CSE1L细胞：46.75±8.7。

实施例9：CSE1L介导v-H-ras癌基因所诱导的癌细胞转移。

MMP-2在肿瘤侵袭浸润(tumor invasion)起着至关重要的作用(Taraboletti 2002)。免疫荧光显示，CSE1L和MMP-2共同位于在B16-ras细胞和B16-CSE1L细胞的微泡内，且CSE1L偏好性的累积在微泡中(图9A)。动物实验研究结果表明，利用携带CSE1L基因的表达载体让B16F10癌细胞的CSE1L表达增加，使癌细胞转移至肺的能力增加361.5％(P＜0.05)(图9B)。v-H-ras癌基因转染B16F10癌细胞，使癌细胞转移至肺的能力增加了246.1％(P＜0.05)(图9B)。利用CSE1L shRNA降低B16-ras细胞内之CSE1L表达，会抑制v-H-ras癌基因所增加之癌细胞转移至肺的能力(100％，P＜0.01)；虽然B16-Ras细胞和B16-Ras/anti-CSE1L细胞的生长速率相似(图9B和C)。因此，CSE1L介导v-H-ras癌基因所诱导的癌细胞转移。

图9显示CSE1L介导v-H-ras癌基因所诱导的癌细胞转移。(A)细胞免疫荧光分析证明CSE1L和MMP-2共同位于在B16-ras细胞和B16-CSE1L细胞的微泡内，而且CSE1L偏好性的累积在微泡中，而非像MMP-2平均分布于细胞。(B)CSE1L调控v-H-ras癌基因所诱导的癌细胞转移。较上之图是一个代表性照片，显示B16-dEV，B16-ras，B16-CSE1L，和B16-Ras/anti-CSE1L细胞注入C57BL/6小鼠，所引发的小鼠肺肿瘤。这些细胞注入小鼠所引发之肺肿瘤平均数(平均数±标准差；肿瘤数目/每只鼠)分别为B16-dEV细胞：13.7±4.8；B16-CSE1L细胞：47±15.8；B16-Ras细胞：32.2±8.5；B16-Ras/anti-CSE1L细胞：7±3.6。(C)B16-dEV，B16-CSE1L，B16-Ras，及B16-Ras/anti-CSE1L细胞的细胞记数生长曲线。图表示三个独立的实验结果。

实施例10：CSE1L位于微泡膜，而且抗CSE1L的抗体能够寻找并结合肿瘤。

免疫荧光研究显示CSE1L位于微泡膜(图10A)。免疫电子显微镜(immunogold electron microscopy)研究进一步表明，CSE1L和MMP-2皆位于微泡，而且CSE1L主要位于微泡膜(图10B)。经肿瘤细胞释放的微泡仍然残留在肿瘤周围环境。CSE1L位于微泡膜，表明CSE1L可为癌症治疗的目标物。以B16-CSE1L细胞注射到C57BL/6小鼠背部引发肿瘤，再经由尾巴打入以Qdot 800量子点(quantum dots)标记的抗CSE1L抗体之后，小鼠背部肿瘤发出量子点的近红外荧光信号(NIR fluorescence signals)，这结果表明，抗CSE1L的抗体能够寻找并结合肿瘤。对照组小鼠打入以量子点标记的小鼠正常IgG(normal mouse IgG)，在同等条件下，其肿瘤并没有发出量子点的近红外荧光信号(图10C)。因此，抗CSE1L的抗体能够寻找并结合肿瘤。

图10显示CSE1L位于微泡膜，而且抗CSE1L的抗体能够寻找并结合肿瘤。(A)细胞免疫荧光分析证明CSE1L位于B16-CSE1L细胞所生成微泡的膜上。(B)免疫电子显微镜分析显示CSE1L(18-nm纳米金，箭头指示处)和MMP-2(12nm纳米金)分布在B16-CSE1L细胞所生成微泡的膜上。原放大倍率：250,000倍。(C)组合图像显示，以B16-CSE1L细胞注射引发肿瘤的C57BL/6小鼠，经由尾巴打入以量子点标记的抗CSE1L抗体(右鼠，N＝3)4小时后，其肿瘤发出量子点的近红外荧光信号。对照组小鼠(左鼠，N＝3)为打入以量子点标记的小鼠正常IgG，在同等条件下其肿瘤并没有发出量子点的近红外荧光信号。

实施例11：抗磷酸化CSE1L抗体针对磷酸化CSE1L蛋白的特异性结合。

以合成的磷酸化CSE1L肽免疫新西兰兔，以生产抗磷酸化CSE1L抗体。以酶联免疫吸附试验分析经过亲和性纯化的抗体之效价(titer)，结果列于表2(表2)。免疫墨点法结果表明，抗磷酸化CSE1L抗体可以专一性地和磷酸化CSE1L结合(图11)。

图11显示抗磷酸化CSE1L抗体针对磷酸化CSE1L蛋白的特异性结合。以免疫墨点法，和经二甲基亚砜(DMSO)或50μM的PD98059处理12小时的B16-dEV和B16-ras细胞溶解物，分析抗磷酸化CSE1L抗体针对磷酸化CSE1L蛋白的特异性免疫结合表征。抗CSE1L抗体(克隆号24)和动物免疫前的血清也做测试作为对照。

表2、间接ELISA检测经过亲和性纯化的抗磷酸化CSE1L抗体之效价。

^*O.D.(光学密度)

实施例12：磷酸化CSE1L蛋白位于细胞微泡。

以抗磷酸化CSE1L抗体和免疫荧光技术研究，结果表明磷酸化CSE1L蛋白位于细胞微泡(图12)。

图12显示磷酸化CSE1L蛋白位于细胞微泡。以抗磷酸化CSE1L抗体和B16-CSE1L细胞做细胞免疫荧光分析，结果证明磷酸化CSE1L蛋白位于微泡，而且磷酸化CSE1L偏好性的累积在微泡中。

实施例13：癌症患者血清中分离出的微泡含有磷酸化CSE1L蛋白。从大肠癌患者血清和健康献血者血清中分离出微泡，将各纯化之微泡悬浮液等量(5μL)各别注到96孔斑点印迹膜盘(96-well dot-blot manifold)，并分别以抗CSE1L抗体和抗磷酸化CSE1L抗体做斑点杂交(dot blot assay)分析。结果表明，相对于由健康献血者血清中分离到的研究样本，由癌症患者血清中分离到的研究样本，有较高的CSE1L蛋白盛行率。CSE1L可在96.5％(111/115)的癌症患者血清内分离到的研究样本中被检测到，而只有6.6％(4/60)的健康献血者血清内分离到的研究样本可被检测到CSE1L(图13A)。癌症组与健康组间具显着差异(P＜0.01)。以合成的CSE1L蛋白作为标准，癌症患者血清中分离到的研究样本的CSE1L截止值(cut-off value)测定为≥21ng/mL。另一方面，分析结果也表明，相对于由健康献血者血清中分离到的研究样本，由癌症患者血清中分离到的研究样本，有较高的磷酸化CSE1L盛行率。磷酸化CSE1L可在98.2％(113/115)的癌症患者血清内分离到的研究样本中被检测到，而只有3.3％(2/60)的健康献血者血清内分离到的研究样本可被检测到磷酸化CSE1L(P＜0.01)(图13B)。以合成的磷酸化CSE1L肽作为标准，癌症患者血清中分离到的研究样本的磷酸化CSE1L截止值测定为≥15ng/mL。

图13显示，相对于由健康献血者血清中分离到的微泡，由癌症患者血清中分离到的微泡有较高的CSE1L和磷酸化CSE1L盛行率。CSE1L(A)和磷酸化CSE1L(B)在大肠直肠癌患者和健康人血清中的微泡的盛行率是分别利用抗CSE1L抗体和抗磷酸化CSE1L抗体以斑点杂交法检测。*显着统计差异。

实施例14：于癌症诊断上，检测血清磷酸化CSE1L优于检测血清CSE1L。免疫沉淀反应的结果显示，磷酸化CSE1L蛋白存在于癌血清中(图5C)。以酶联免疫吸附试验，分析大肠直肠癌患者血清的CSE1L和磷酸化CSE1L盛行率。结果表明，92.1％(106/115)的癌症患者血清为磷酸化CSE1L阳性(phosphorylated CSE1L-positive)，而只有1.6％(1/60)的健康献血者血清为磷酸化CSE1L阳性(P＜0.01)(图14)。以合成的磷酸化CSE1L肽作为标准，癌症患者血清的磷酸化CSE1L截止值测定为≥3ng/mL。酶联免疫吸附试验结果表明，65.2％(75/115)的癌症患者血清为CSE1L阳性(CSE1L-positive)，而13％(8/60)的健康献血者血清为CSE1L阳性。以合成的CSE1L蛋白作为标准，癌症患者血清CSE1L截止值(cut-off value)测定为≥8ng/mL。测量血清中磷酸化CSE1L检验癌症，其灵敏度和专一性分别为92.1％和98.3％。测量血清中CSE1L检验癌症，其灵敏度和专一性分65.2％和86.6％。因此，于癌症诊断上，检测血清磷酸化CSE1L优于检测血清CSE1L。

图14显示，相对于健康献血者血清的磷酸化CSE1L，癌症患者血清有较高的磷酸化CSE1L盛行率。磷酸化CSE1L在大肠直肠癌患者和健康献血者血清的盛行率以酶联免疫吸附试验检测。^*显着统计差异。

参考文献

1.Bianco F，Pravettoni E，Colombo A，Schenk U，T，Matteoli M，Verderio C.Astrocyte-derived ATP induces vesicle shedding and IL-1 beta releasefrom microglia.J Immunol 2005；174：7268-7277.

2.Brinkmann U，Brinkmann E，Gallo M，Pastan I.Cloning andcharacterization of a cellular apoptosis susceptibility gene，the human homologueto the yeast chromosome segregation gene CSE1.Proc Natl Acad Sci USA1995；92：10427-10431.

3.Cocucci E，Racchetti G，Meldolesi J.Shedding microvesicles：artefactsno more.Trends Cell Biol 2009；19：43-51.

4.Fendrick JL，Konishi I，Geary SM，Parmley TH，Quirk JG Jr，O′Brien TJ.CA125 phosphorylation is associated with its secretion from the WISH humanamnion cell line.Tumour Biol.1997；18(5)：278-89.

5.Hoshino R，Chatani Y，Yamori T，Tsuruo T，Oka H，Yoshida O，ShimadaY，Ari-i S，Wada H，Fujimoto J，Kohno M.Constitutive activation of the41-/43-kDa mitogen-activated protein kinase signaling pathway in human tumors.Oncogene 1999；18：813-822.

6.Konishi I，Fendrick JL，Parmley TH，Quirk JG Jr，O′Brien TJ.Epidermal growth factor enhances secretion of the ovarian tumor-associatedcancer antigen CA125 from the human amnion WISH cell line.J Soc GynecolInvestig.1994；1：89-96.

7.Muralidharan-Chari V，Clancy J，Plou C，Romao M，Chavrier P，Raposo G，D′Souza-Schorey C.ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasmamembrane microvesicles.Curr Biol 2009；19：1875-1885.

8.Muralidharan-Chari V，Clancy JW，Sedgwick A，D′Souza-Schorey C.Microvesicles：mediators of extracellular communication during cancerprogression.J Cell Sci 2010；123：1603-1611.

9.Roberts PJ，Der CJ.Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activatedprotein kinase cascade for the treatment of cancer.Oncogene 2007；26：3291-3310.

10.Scherf U，Kalab P，Dasso M，Pastan I，Brinkmann U.The hCSE1/CASprotein is phosphorylated by HeLa extracts and MEK-1：MEK-1 phosphorylationmay modulate the intracellular localization of CAS.Biochem Biophys ResCommun 1998；250：623-628.

11.Simak J，Gelderman MP.Cell membrane microparticles in blood andblood products：potentially pathogenic agents and diagnostic markers.TransfusMed Rev 2006；20：1-26.

12.Tai CJ，Hsu CH，Shen SC，Lee WR，Jiang MC.Cellular apoptosissusceptibility(CSE1L/CAS)protein in cancer metastasis and chemotherapeuticdrug-induced apoptosis.J Exp Clin Cancer Res 2010；29：110.

13.Taraboletti G，D′Ascenzo S，Borsotti P，Giavazzi R，Pavan A，Dolo V.Shedding of the matrix metalloproteinases MMP-2，MMP-9，and MT1-MMP asmembrane vesicle-associated components by endothelial cells.Am J Pathol2002；160：673-680.

14.Tung MC，Tsai CS，Tung JN，Tsao TY，Chen HC，Yeh KT，Liao CF，Jiang MC.Higher prevalence of secretory CSE1L/CAS in sera of patients withmetastatic cancer.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2009；18：1570-1577.

15.van Doormaal FF，Kleinjan A，Di Nisio M，Büller HR，Nieuwland R.Cell-derived microvesicles and cancer.Neth J Med 2009；67：266-273.

Claims (10)

1.抗CSE1L抗体或抗磷酸化CSE1L抗体在制备一种于体外检测体液样本中微泡的CSE1L或磷酸化CSE1L的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于体外检测体液样本中微泡的CSE1L或磷酸化CSE1L的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)取得受检测个体的体液样本；

(2)分离样本中的微泡；

(3)于体外，以抗CSE1L抗体或抗磷酸化CSE1L抗体与样本混合及反应；及

(4)测量受检测体液样本中微泡的CSE1L或磷酸化CSE1L的量。

2.如权利要求项1的用途，CSE1L或磷酸化CSE1L在所述样本中的量，以斑点杂交法(dot blot assay)进行检测。

3.如权利要求项1的用途，CSE1L在所述样本中的量，以抗CSE1L抗体和微泡之结合进行检测；磷酸化CSE1L在所述样本中的量，以抗磷酸化CSE1L抗体和微泡之结合进行检测。

4.如权利要求项1的用途,个体为动物。

5.抗磷酸化CSE1L抗体在制备一种于体外检测体液样本中磷酸化CSE1L的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于体外检测体液样本中磷酸化CSE1L的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)取得受检测个体的体液样本；

(2)于体外，以抗磷酸化CSE1L抗体，与受检测体液样本混合及反应；及

(3)测量受检测体液样本的磷酸化CSE1L的量。

6.如权利要求项5的用途，磷酸化CSE1L在所述样本中的量，以酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测。

7.如权利要求项5的用途，磷酸化CSE1L在所述样本中的量，以抗磷酸化CSE1L抗体和磷酸化CSE1L之结合进行检测。

8.如权利要求项5的用途,个体为动物。

9.一种偶联抗CSE1L抗体或抗磷酸化CSE1L抗体的肿瘤靶向载体。

10.一个用于于体外检测体液样本内之磷酸化CSE1L的试剂盒，该试剂盒含有权利要求项5至8所述之抗体。