JP6672383B2 - 間葉及び上皮間葉形質転換循環腫瘍細胞のための特異的検出ツール - Google Patents

Description

本出願は、２０１３年３月５日に出願された米国特許仮出願第６１／７７２，９７３号の優先権の利益を主張するものであり、この仮出願の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

３ＫＢであり（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定）、２０１４年２月１８日に作成されたファイル名「ＵＴＦＣＰ１２０８ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」中に含まれている配列表は、電子申請によって本明細書と共に提出され、参照により本明細書に組み込まれる。
発明の背景

本発明は、合衆国国立衛生研究所から与えられた助成金ＣＡ１２０２９５による合衆国政府の援助を受けてなされたものである。政府は本発明において一定の権利を有する。

本発明は、全般的には、癌生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍、転移、及び再発の早期検出において補助となる循環腫瘍細胞の計数及び単離に関する。

転移は、癌関連死の主な原因である。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、転移の根源であると考えられ、それら自体が原発腫瘍から血流中に分離し、遠隔の臓器に向かって移動し、コロニー形成して転移に至る希少な細胞として定義される（Ｐａｎｔｅｌ ａｎｄ Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ，２００４）。癌療法の分野における最近の進歩は、原発癌が拡散することを封じ込めることができるが、転移性癌の早期の検出、診断、及び治療モニタリングのための信頼できるバイオマーカーに対する要求がある。ＣＴＣは、癌患者の末梢血液中に存在し、早期検出及び抗癌剤の治療有効性をモニタリングするための有望な標的として浮かび上がってきた（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１２）。現在、ＣＴＣを検出するための許容可能なマーカーは、ＥｐＣＡＭ及びサイトケラチンが挙げられる（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１２）。しかしながら、これらのマーカーは、上皮ＣＴＣのみを検出することができるために、ＥｐＣＡＭの発現を喪失した上皮間葉形質転換（ＥＭＴ）ＣＴＣ（Ｓｉｅｕｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２００９）及び成人の癌のタイプの約１０％及び小児の癌のタイプの約２０％を構成する、間葉腫瘍に源を発するいずれの他の非上皮ＣＴＣ（Ｍａｃｋａｌｌ ｅｔａｌ．２００２）も除外する。現行の検出ツールのこの限界は、これらの要求を満足させ得る新規ツールに対する切実な必要性を示唆している。

Ｐａｎｔｅｌ ａｎｄ Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ，Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｓｃａｄｅ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，４：４４８−４５６，２００４

本発明は、いくつかの実施形態において、循環腫瘍細胞上の細胞表面ビメンチンの検出に対する新規抗体を提供する。一実施形態では、本発明は、単離されたモノクローナル抗体を提供し、この抗体は、ビメンチンポリペプチドに特異的に結合し、この抗体は、このポリペプチドの結合に対して８４−１モノクローナル抗体と競合する。特定の態様では、本発明のモノクローナル抗体は、８４−１モノクローナル抗体と同一のエピトープに結合し得る。
一態様では、本発明のモノクローナル抗体は、８４−１のＶ_ＨＣＤＲ１（配列番号３）と少なくとも８０％同一の第１のＶ_ＨＣＤＲ、８４−１のＶ_ＨＣＤＲ２（配列番号４）と少なくとも８０％同一の第２のＶ_ＨＣＤＲ、８４−１のＶ_ＨＣＤＲ３（配列番号５）と少なくとも８０％同一の第３のＶ_ＨＣＤＲ、８４−１のＶ_ＬＣＤＲ１（配列番号６）と少なくとも８０％同一の第１のＶ_ＬＣＤＲ、８４−１のＶ_ＬＣＤＲ２（配列番号７）と少なくとも８０％同一の第２のＶ_ＬＣＤＲ、及び８４−１のＶ_ＬＣＤＲ３（配列番号８）と少なくとも８０％同一の第３のＶ_ＬＣＤＲを含み得る。

別の態様では、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号３と同一である第１のＶ_ＨＣＤＲ、配列番号４と同一である第２のＶ_ＨＣＤＲ、配列番号５と同一である第３のＶ_ＨＣＤＲ、配列番号６と同一である第１のＶ_ＬＣＤＲ、配列番号７と同一である第２のＶ_ＬＣＤＲ、及び配列番号８と同一である第３のＶ_ＬＣＤＲを含み得る。

さらに別の態様では、本発明のモノクローナル抗体は、８４−１のＶ_Ｈドメイン（配列番号１）と少なくとも約８０％同一のＶ_Ｈドメイン、及び８４−１のＶ_Ｌドメイン（配列番号２）と少なくとも約８０％同一のＶ_Ｌドメインを含み得る。特定の態様では、本発明のモノクローナル抗体は、８４−１のＶ_Ｈドメイン（配列番号１）と同一のＶ_Ｈドメイン、及び８４−１のＶ_Ｌドメイン（配列番号２）と同一のＶ_Ｌドメインを含み得る。別の特定の態様では、本発明のモノクローナル抗体は、８４−１抗体であってもよい。

いくつかの態様では、本明細書に開示されるモノクローナル抗体は、組換え体であってもよい。いくつかの態様では、本実施形態のモノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはこれらの抗原結合断片であってもよい。いくつかの態様では、本発明のモノクローナル抗体は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦＶ、または単一ドメイン抗体であってもよい。いくつかの態様では、本明細書のモノクローナル抗体は、ヒト、ヒト化抗体、または脱免疫化抗体であり得る。特定の態様では、こうしたヒト化または脱免疫化抗体は、ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）骨格上に前述のＣＤＲを含み得る。

特定の態様では、本実施形態のモノクローナル抗体は、造影剤、化学療法剤、毒素、または放射性核種に抱合されることができる。特定の態様では、本明細書に開示されるモノクローナル抗体は、薬学的に許容し得る担体中に含まれてもよい。

一実施形態では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。

一実施形態では、本発明は、８４−１のＶ_ＨドメインのＣＤＲ１〜３（配列番号３、４、及び５）を含む抗体のＶ_Ｈドメインを含む組換えポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、８４−１のＶ_ＬドメインのＣＤＲ１〜３（配列番号６、７、及び８）を含む抗体のＶ_Ｌドメインを含む組換えポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、８４−１のＶ_ＨドメインのＣＤＲ１〜３（配列番号３、４、及び５）を含む抗体のＶ_Ｈドメイン及び／または８４−１のＶ_ＬドメインのＣＤＲ１〜３（配列番号６、７、及び８）を含む抗体のＶ_Ｌドメインを含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。

一実施形態では、本発明は、本実施形態のモノクローナル抗体または組換えタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞を提供する。特定の態様では、この宿主細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、繊毛虫類細胞、または昆虫細胞であり得る。

一実施形態では、本発明は、抗体を製造する方法を提供し、本方法は、細胞中で、本発明の抗体のＶＬ及びＶＨポリペプチド鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を発現させることと、抗体を細胞から精製することと、を含む。

一実施形態では、本発明は、単離された抗体を提供し、この抗体は、８４−１のＶ_ＨＣＤＲ１（配列番号３）と少なくとも８０％同一の第１のＶ_ＨＣＤＲ、８４−１のＶ_ＨＣＤＲ２（配列番号４）と少なくとも８０％同一の第２のＶ_ＨＣＤＲ、８４−１のＶ_ＨＣＤＲ３（配列番号５）と少なくとも８０％同一の第３のＶ_ＨＣＤＲ、８４−１のＶ_ＬＣＤＲ１（配列番号６）と少なくとも８０％同一の第１のＶ_ＬＣＤＲ、８４−１のＶ_ＬＣＤＲ２（配列番号７）と少なくとも８０％同一の第２のＶ_ＬＣＤＲ、及び８４−１のＶ_ＬＣＤＲ３（配列番号８）と少なくとも８０％同一の第３のＶＬＣＤＲを含む。

一実施形態では、本発明は、循環腫瘍細胞を特異的に検出する方法を提供し、本方法は、（ａ）患者から血液サンプルを得ることと、（ｂ）このサンプルを細胞表面ビメンチンに結合する抗体とインキュベートすることと、（ｃ）抗体結合細胞を検出することと、を含む。特定の態様では、細胞表面ビメンチンに結合する抗体は本明細書に開示される抗体であり得る。いくつかの態様では、この抗体は、細胞表面ビメンチンに結合する、アプタマーなどの抗体様分子であってもよい。いくつかの態様では、抗体結合細胞を検出することは、フローサイトメトリー、免疫組織化学法、蛍光顕微鏡法、ラジオイムノアッセイ、またはＥＬＩＳＡを用いることを含み得る。

特定の態様では、本方法は、サンプルを細胞表面ビメンチンに結合する抗体とインキュベートするのに先立ってＣＤ４５陽性細胞のサンプルを枯渇させることをさらに含む。特定の態様では、本方法は、サンプルをタンパク質チロシンホスファターゼ阻害物質とインキュベートすることによって、細胞表面ビメンチンの発現のレベルを増加させることをさらに含む。いくつかの態様では、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害物質は、オルトバナジウム酸ナトリウムである。他の態様では、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害物質は、デホスタチン、ｍｐＶ（ｐｉｃ）、フェニルアルシンオキシド、スチボグルコン酸ナトリウム、ＢＡＹ Ｕ６７５１、チロシンホスファターゼ阻害物質カクテル（バナジウム酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、及びイミダゾールを含む）、またはＲＫ−６８２であってもよい。

特定の態様では、本方法は、生循環腫瘍細胞を単離する方法としてさらに定義され、サンプルから（ｃ）の抗体結合循環腫瘍細胞を分離することをさらに含む。いくつかの態様では、分離することは、免疫磁気捕捉、接着に基づく細胞選別法、磁気活性化細胞選別法、または蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を含んでもよい。特定の態様では、本方法は、単離された生循環腫瘍細胞を遺伝子型特定することをさらに含んでもよい。

特定の態様では、本方法は、サンプルをＥｐＣＡＭまたはサイトケラチン抗体とインキュベートすることをさらに含んでもよい。特定の態様では、患者における循環腫瘍細胞の数を定量化することをさらに含んでもよい。特定の態様では、血液サンプルは、以前に癌と診断されていない患者からのサンプルであり、本方法は、早期癌検出の方法である。別の態様では、血液サンプルは、寛解期にある患者からのサンプルであり、本方法は、再発を検出する方法である。いくつかの態様では、１ミリリットルの血液当たり少なくとも約３個の循環腫瘍細胞を検出することが、患者が腫瘍を有する指標である。他の態様では、１ミリリットルの血液当たり少なくとも約１個または少なくとも約２個の循環腫瘍細胞を検出することが、患者が腫瘍を有する指標である。

特定の態様では、本方法は、癌患者において療法に対する応答をモニタリングする方法であってもよく、循環腫瘍細胞の数が経時的に減少する場合、この患者は療法に対して肯定的な応答を有したと言われる。特定の態様では、本方法は、予後の方法であってもよく、１ミリリットルの血液当たり少なくとも約５個の循環腫瘍細胞を検出することが、患者が予後不良を有する指標である。他の態様では、本方法は予後の方法であってもよく、１ミリリットルの血液当たり少なくとも約１個、少なくとも約２個、少なくとも約３個、または少なくとも約４個の循環腫瘍細胞を検出することが、患者が予後不良を有する指標である。

特定の態様では、患者は、上皮腫瘍を有し得る。他の態様では、患者は間葉腫瘍を有し得る。特定の態様では、この腫瘍は、乳癌、肺癌、頭頚部癌、前立腺癌、食道癌、気管癌、皮膚癌、脳癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌、及び皮膚癌を含み得る。特定の態様では、この腫瘍は、骨肉腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、ユーイング肉腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、及び白血病を含み得る。

一実施形態では、本発明は、本発明の方法により循環腫瘍細胞を有することが判定された患者を治療する方法を提供し、本方法は、本明細書に開示される抱合抗体の有効量を投与することを含む。いくつかの態様では、この抱合抗体は、薬学的に許容し得る組成物中に含まれてもよい。

一態様では、抗体は、全身的に投与されてもよい。追加の態様では、抗体は、静脈内、皮内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、または局所で投与されてもよい。本方法は、少なくとも第２の抗癌療法を対象に施すことをさらに含む。第２の抗癌療法の例としては、外科療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法、またはサイトカイン療法が含まれるが、これらに限定されない。

さらなる態様では、本方法は、本発明の組成物を、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０回またはそれ以上の回数などの複数回で対象に投与することをさらに含んでもよい。

一実施形態では、対象において癌の治療で使用するための本実施形態の抗体を含む組成物が提供される。この対象は、本実施形態の方法により循環腫瘍細胞を有することが判定されている。いくつかの態様において、この対象は、ヒトであり得る。いくつかの態様では、この対象は、非ヒト哺乳動物であってもよい。いくつかの態様では、この組成物は、薬学的に許容し得る組成物である。

特定の態様では、この対象は上皮腫瘍を有し得る。他の態様では、この対象は、間葉腫瘍を有し得る。他の態様では、この対象は、転移性腫瘍を有し得る。特定の態様では、この腫瘍は、乳癌、肺癌、頭頚部癌、前立腺癌、食道癌、気管癌、皮膚癌、脳癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌、及び皮膚癌を含み得る。特定の態様では、この腫瘍は、骨肉腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、ユーイング肉腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、及び白血病を含み得る。

いくつかの態様では、この組成物は、化学療法剤、放射線療法剤、遺伝子療法剤、または第２選択免疫療法剤などの少なくとも１つの他の抗癌剤をさらに含んでもよい。いくつかの態様では、この組成物は、全身、静脈内、皮内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、または局所投与用に製剤化され得る。

一実施形態では、対象における癌の治療のための医薬品の製造における本実施形態の抗体の使用が本明細書に提供され、この対象は、循環腫瘍細胞を含むことが判定されている。

特定の実施形態は、細胞表面ビメンチンに特異的に結合する単離された及び／もしくは組換え抗体またはポリペプチドを含む、抗体または組換えポリペプチド組成物を目的とする。特定の態様では、この抗体またはポリペプチドは、本明細書で提供される任意のモノクローナル抗体の全てまたは一部と８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％（もしくはこれらの派生し得る任意の範囲で）同一である配列を有し、少なくとも、または最大でもこれらである。さらに他の態様では、単離された及び／もしくは組換え抗体またはポリペプチドは、本明細書に提供される配列のいずれかまたはこうした配列の組み合わせからの、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個またはそれ以上の隣接するアミノ酸を有し、少なくとも、または最大でもこれらを有する。

さらに他の態様では、本実施形態の抗体またはポリペプチドは、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかの１つ以上のアミノ酸セグメントを含む。例えば、この抗体またはポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のアミノ酸セグメントを含むことができ、このアミノ酸セグメントは、本明細書に開示されたアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である、約、少なくとも、または最大で、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００個のアミノ酸の長さ（これらの間にある全ての値及び範囲を含める）を含む。特定の態様では、このアミノセグメント（複数可）は、表７に提供される細胞表面ビメンチン結合抗体のアミノ酸配列のうちの１つから選択される。

さらに他の態様では、本実施形態の抗体またはポリペプチドは、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸セグメントを含み、このセグメントは、本明細書に提供されるいずれかの配列中のアミノ酸位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００で開始し、同一の提供される配列中のアミノ酸位置４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５〜２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００で終了する。特定の態様では、このアミノセグメント（複数可）、またはそれらの一部は、表７に提供される細胞表面ビメンチン結合抗体のアミノ酸配列のうちの１つから選択される。

さらに他の態様では、本実施形態の抗体またはポリペプチドは、細胞表面ビメンチン結合抗体（表７に提供される）のＶ、ＶＪ、ＶＤＪ、Ｄ、ＤＪ、Ｊ、またはＣＤＲドメインと少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である（もしくはこれらの中で導き出せる任意の範囲の）アミノ酸セグメントを含む。例えば、ポリペプチドは、表７に提供される細胞表面ビメンチン結合抗体のＣＤＲ１、２、及び／または３と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である（もしくはこれらの中で導き出せる任意の範囲の）１、２、または３個のアミノ酸セグメントを含んでもよい。

本発明の方法及び／または組成物に関して説明される実施形態は、本明細書に記載される任意の他の方法または組成物に対して使用されてもよい。したがって、１つの方法または組成物に関連するある実施形態が、本発明の他の方法及び組成物に同様に適用されてもよい。

本明細書で使用される「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味することがある。単語「含む」と共に使用されるとき、特許請求の範囲で使用される単語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味することがある。

特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すよう明示的に示されない限りかつ選択肢が相互排他的でない限り、「及び／または」を意味するよう使用されるが、本開示は、選択肢及び「及び／または」のみを指す定義を支持する。本明細書で使用される「別の」は、少なくとも２番目またはそれ以上を意味することがある。

本明細書の全体を通して、用語「約」は、値が、この値を決定するために使用される装置、方法についての誤差の固有の変動、もしくは試験対象間で存在する変動を含むことを示すために使用される。

本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、この詳細な説明及び特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、例示としてのみ行われるものであって、この詳細な説明によって当業者に明らかになる各種の変更や修正は、本発明の趣旨及び範囲内にあることを理解するべきである。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
単離されたモノクローナル抗体であって、前記抗体がビメンチンポリペプチドに特異的に結合し、前記抗体が前記ポリペプチドの結合に対して８４−１モノクローナル抗体と競合する、前記抗体。
（項目２）
前記抗体が、
（ａ）８４−１のＶ _Ｈ ＣＤＲ１（配列番号３）と少なくとも８０％同一の第１のＶ _Ｈ ＣＤＲと、
（ｂ）８４−１のＶ _Ｈ ＣＤＲ２（配列番号４）と少なくとも８０％同一の第２のＶ _Ｈ ＣＤＲと、
（ｃ）８４−１のＶ _Ｈ ＣＤＲ３（配列番号５）と少なくとも８０％同一の第３のＶＨＣＤＲと、
（ｄ）８４−１のＶ _Ｌ ＣＤＲ１（配列番号６）と少なくとも８０％同一の第１のＶ _Ｌ ＣＤＲと、
（ｅ）８４−１のＶ _Ｌ ＣＤＲ２（配列番号７）と少なくとも８０％同一の第２のＶ _Ｌ ＣＤＲと、
（ｆ）８４−１のＶ _Ｌ ＣＤＲ３（配列番号８）と少なくとも８０％同一の第３のＶ _Ｌ ＣＤＲと、を含む、項目１に記載の前記抗体
（項目３）
前記抗体が、
（ａ）配列番号３と同一である第１のＶ _Ｈ ＣＤＲと、
（ｂ）配列番号４と同一である第２のＶ _Ｈ ＣＤＲと、
（ｃ）配列番号５と同一である第３のＶ _Ｈ ＣＤＲと、
（ｄ）配列番号６と同一である第１のＶ _Ｌ ＣＤＲと、
（ｅ）配列番号７と同一である第２のＶ _Ｌ ＣＤＲと、
（ｆ）配列番号８と同一である第３のＶ _Ｌ ＣＤＲと、を含む、項目２に記載の前記単離された抗体。
（項目４）
前記抗体が、８４−１のＶ _Ｈ ドメイン（配列番号１）と少なくとも約８０％同一のＶ _Ｈ ドメインと、８４−１のＶ _Ｌ ドメイン（配列番号２）と少なくとも約８０％同一のＶ _Ｌ ドメインと、を含む、項目２に記載の前記抗体。
（項目５）
前記抗体が、前記８４−１のＶ _Ｈ ドメイン（配列番号１）と同一のＶ _Ｈ ドメインと、前記８４−１のＶ _Ｌ ドメイン（配列番号２）と同一のＶ _Ｌ ドメインと、を含む、項目４に記載の前記抗体。
（項目６）
前記抗体が、前記８４−１抗体である、項目１〜５のいずれか一項に記載の前記抗体。
（項目７）
前記抗体が組換え体である、項目１〜５のいずれか一項に記載の前記抗体。
（項目８）
前記抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはこれらの抗原結合断片である、項目１〜５のいずれか一項に記載の前記抗体。
（項目９）
前記抗体が、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦＶ、または単一ドメイン抗体である、項目１〜５のいずれか一項に記載の前記抗体。
（項目１０）
前記抗体が、ヒト、ヒト化抗体、または脱免疫化抗体である、項目１〜５のいずれか一項に記載の前記抗体。
（項目１１）
前記抗体が、造影剤、化学療法剤、毒素、または放射性核種に抱合される、項目１〜５のいずれか一項に記載の前記抗体。
（項目１２）
薬学的に許容し得る担体中に項目１〜５のいずれか一項に記載の抗体を含む、組成物。
（項目１３）
項目１〜５のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目１４）
前記８４−１のＶ _Ｈ ドメインのＣＤＲ１〜３（配列番号３、４、及び５）を含む抗体のＶ _Ｈ ドメインを含む、組換えポリペプチド。
（項目１５）
前記８４−１のＶ _Ｌ ドメインのＣＤＲ１〜３（配列番号６、７、及び８）を含む抗体のＶ _Ｌ ドメインを含む、組換えポリペプチド。
（項目１６）
項目１４または１５に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目１７）
項目１〜５のいずれか一項に記載の抗体または項目１４もしくは１５に記載の組換えポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む、宿主細胞。
（項目１８）
前記宿主細胞が、哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、繊毛虫類細胞、または昆虫細胞である、項目１７に記載の前記宿主細胞。
（項目１９）
抗体を製造する方法であって、
（ａ）項目１〜５のいずれか一項に記載の抗体のＶ _Ｌ 及びＶ _Ｈ 鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を、細胞中で発現させることと、
（ｂ）前記抗体を前記細胞から精製することと、を含む、前記方法。
（項目２０）
単離された抗体であって、前記抗体が、
（ａ）８４−１のＶ _Ｈ ＣＤＲ１（配列番号３）と少なくとも８０％同一の第１のＶ _Ｈ ＣＤＲと、
（ｂ）８４−１のＶ _Ｈ ＣＤＲ２（配列番号４）と少なくとも８０％同一の第２のＶ _Ｈ ＣＤＲと、
（ｃ）８４−１のＶ _Ｈ ＣＤＲ３（配列番号５）と少なくとも８０％同一の第３のＶ _Ｈ ＣＤＲと、
（ｄ）８４−１のＶ _Ｌ ＣＤＲ１（配列番号６）と少なくとも８０％同一の第１のＶ _Ｌ ＣＤＲと、
（ｅ）８４−１のＶ _Ｌ ＣＤＲ２（配列番号７）と少なくとも８０％同一の第２のＶ _Ｌ ＣＤＲと、
（ｆ）８４−１のＶ _Ｌ ＣＤＲ３（配列番号８）と少なくとも８０％同一の第３のＶ _Ｌ ＣＤＲと、を含む、前記抗体。
（項目２１）
循環腫瘍細胞を選択的に検出する方法であって、
（ａ）患者から血液サンプルを得ることと、
（ｂ）前記サンプルを細胞表面ビメンチンに結合する抗体とインキュベートすることと、
（ｃ）前記抗体結合細胞を検出し、これによって循環腫瘍細胞を選択的に検出することと、を含む、前記方法。
（項目２２）
生循環腫瘍細胞を単離する方法としてさらに定義され、前記サンプルから（ｂ）の前記抗体結合循環腫瘍細胞を分離することをさらに含む、項目２１に記載の前記方法。
（項目２３）
前記サンプルの、細胞表面ビメンチンに結合する抗体との前記インキュベートに先立って、ＣＤ４５陽性細胞の前記サンプルを枯渇させることをさらに含む、項目２１に記載の前記方法。
（項目２４）
フローサイトメトリー、免疫組織化学法、蛍光顕微鏡法、ラジオイムノアッセイ、またはＥＬＩＳＡを用いて、前記抗体結合細胞を検出することをさらに含む、項目２１に記載の前記方法。
（項目２５）
前記単離された生循環腫瘍細胞を遺伝子型特定することをさらに含む、項目２２に記載の前記方法。
（項目２６）
分離することが、免疫磁気捕捉、接着に基づく細胞選別法、磁気活性化細胞選別法、または蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を含む、項目２２に記載の前記方法。
（項目２７）
前記サンプルをタンパク質チロシンホスファターゼ阻害物質とインキュベートすることによって、細胞表面ビメンチンの発現のレベルを増加させることをさらに含む、項目２１に記載の前記方法。
（項目２８）
前記タンパク質チロシンホスファターゼ阻害物質が、オルトバナジウム酸ナトリウム、デホスタチン、ｍｐＶ（ｐｉｃ）、フェニルアルシンオキシド、スチボグルコン酸ナトリウム、ＢＡＹ Ｕ６７５１、チロシンホスファターゼ阻害物質カクテル（バナジウム酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、及びイミダゾールを含む）、ならびにＲＫ−６８２である、項目２７に記載の前記方法。
（項目２９）
前記サンプルをＥｐＣＡＭまたはサイトケラチン抗体とインキュベートすることをさらに含む、項目２１に記載の前記方法。
（項目３０）
前記患者における循環腫瘍細胞の数を定量化することをさらに含む、項目２１に記載の前記方法。
（項目３１）
癌患者において療法に対する応答をモニタリングする方法としてさらに定義され、循環腫瘍細胞の前記数が経時的に減少する場合、前記患者が療法に対して肯定的な応答を有したと言われる、項目３０に記載の前記方法。
（項目３２）
前記患者が、以前に癌と診断されておらず、前記方法が、早期癌検出の方法である、項目３０に記載の前記方法。
（項目３３）
前記患者が、寛解期にあり、前記方法が、再発の検出方法である、項目３０に記載の前記方法。
（項目３４）
１ミリリットルの血液当たり少なくとも約３個の循環腫瘍細胞を検出することが、前記患者が腫瘍を有する指標である、項目３２及び３３に記載の前記方法。
（項目３５）
前記方法が、予後の方法であり、１ミリリットルの血液当たり少なくとも約５個の循環腫瘍細胞を検出することが、前記患者が予後不良を有する指標である、項目３０に記載の前記方法。
（項目３６）
前記患者が、上皮腫瘍を有する、項目２１に記載の前記方法。
（項目３７）
前記患者が、間葉腫瘍を有する、項目２１に記載の前記方法。
（項目３８）
項目２１に記載の前記方法に従って循環腫瘍細胞を有することが判定された患者の治療方法であって、項目１１に記載の抗体の有効量を投与することを含む、前記方法。
（項目３９）
前記抗体が、薬学的に許容し得る組成物中に含まれる、項目３８に記載の前記方法。
（項目４０）
対象における癌の治療で使用するための、項目１１に記載の抗体を含む組成物であって、前記対象が、循環腫瘍細胞を有すると判定されている、前記組成物。
（項目４１）
前記癌が、乳癌、肺癌、頭頚部癌、前立腺癌、食道癌、気管癌、皮膚癌、脳癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌、及び皮膚癌である、項目４０に記載の前記組成物。
（項目４２）
前記対象が、上皮腫瘍を有する、項目４０に記載の前記組成物。
（項目４３）
前記対象が、間葉腫瘍を有する、項目４０に記載の前記組成物。
（項目４４）
前記対象が、転移性腫瘍を有する、項目４０に記載の前記組成物。
（項目４５）
化学療法剤、放射線療法剤、遺伝子療法剤、または第２選択免疫療法剤をさらに含む、項目４０に記載の前記組成物。
（項目４６）
対象における癌の前記治療のための医薬品の製造での項目１１に記載の抗体の使用であって、前記対象が、循環腫瘍細胞を含むことが判定されている、前記使用。

以下の図面は本明細書の一部をなし、かつ本発明の特定の態様をさらに裏付けるために含まれる。本発明は、これらの図面を本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、より深く理解され得る。

８４−１、細胞表面ビメンチン（ＣＳＶ）特異的抗体の単離及び特性評価である。図１Ａは、ＣＳＶ特異的抗体の抗体スクリーニングの概略的表現である。異なるハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体のプールを、フローサイトメトリーを用いてＣＳＶ結合について分析し、癌特異的結合について選択した。選択された抗体を、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法を用いて、ビメンチンについて特性化した。図１Ｂは、フローサイトメトリーを用いる異なる非上皮性正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶの発現の免疫学的評価である。ＣＳＶは、癌細胞株ＳＫＮＢＥ−２（神経芽細胞腫）、患者の血液から単離されたＡＭＬ細胞、及びＬＭ７（骨肉腫）細胞でのみ検出可能であるが、一方、非上皮性正常細胞ＨＵＶＥＣ、ＨＦＯＢ、及びＰＢＭＣはＣＳＶの発現に対してネガティブであった。イソタイプ対照を陰性対照に使用した。図１Ｃは、フローサイトメトリーを用いる異なる非上皮性正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶの免疫学的評価である。ＣＳＶは、癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（乳癌）、ＤＬＤ−１（結腸癌）、及びＨＬＭ−６（肝臓癌）でのみ検出可能であるが、一方、正常な上皮細胞株ＨＥＫ−２９３、ＮＣＭ−３５６、及びＭＣＦ−１０Ａは、ＣＳＶの発現に対してネガティブであった。図１Ｄは、共焦点顕微鏡を用いる、正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶについての細胞表面染色分析である。ＨＬＭ−３（肝臓癌）及びＮＣＭ−３５６（正常な結腸）細胞を、ＣＳＶ、ＷＧＡ（細胞表面マーカー）、及び核染色剤ＤＲＡＱ５に対して染色した。８４−１への結合は、白色の矢印で示されている図の拡大部分から明らかなように、ＷＧＡと同時局在化する細胞表面ビメンチンを示す。スケールは１０μｍを示す。図１Ｅは、フローサイトメトリーを用いるヒト原発癌及び転移性癌中のＣＳＶの免疫学的評価であり、ヒト原発性結腸癌（ＨＰＣ１）及びヒト肝臓転移性癌（ＨＬＭ３）の分析は、原発性ＨＰＣ１細胞と比べて、ＨＬＭ３上のＣＳＶの大量の発現を示した。図１Ｆは、共焦点顕微鏡を用いる、Ｇｅｌｔｒｅｘの薄いコーティングが施されたウェル上のＨＰＣ１由来スフェア中のＣＳＶの検出である。ＣＳＶは、スフェアの周辺部でほとんどの細胞で検出されなかった。核染色液ＤＲＡＱ５を用いて、細胞を分離した。スケールは２０μｍを示す。 ８４−１、細胞表面ビメンチン（ＣＳＶ）特異的抗体の単離及び特性評価である。図１Ａは、ＣＳＶ特異的抗体の抗体スクリーニングの概略的表現である。異なるハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体のプールを、フローサイトメトリーを用いてＣＳＶ結合について分析し、癌特異的結合について選択した。選択された抗体を、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法を用いて、ビメンチンについて特性化した。図１Ｂは、フローサイトメトリーを用いる異なる非上皮性正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶの発現の免疫学的評価である。ＣＳＶは、癌細胞株ＳＫＮＢＥ−２（神経芽細胞腫）、患者の血液から単離されたＡＭＬ細胞、及びＬＭ７（骨肉腫）細胞でのみ検出可能であるが、一方、非上皮性正常細胞ＨＵＶＥＣ、ＨＦＯＢ、及びＰＢＭＣはＣＳＶの発現に対してネガティブであった。イソタイプ対照を陰性対照に使用した。図１Ｃは、フローサイトメトリーを用いる異なる非上皮性正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶの免疫学的評価である。ＣＳＶは、癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（乳癌）、ＤＬＤ−１（結腸癌）、及びＨＬＭ−６（肝臓癌）でのみ検出可能であるが、一方、正常な上皮細胞株ＨＥＫ−２９３、ＮＣＭ−３５６、及びＭＣＦ−１０Ａは、ＣＳＶの発現に対してネガティブであった。図１Ｄは、共焦点顕微鏡を用いる、正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶについての細胞表面染色分析である。ＨＬＭ−３（肝臓癌）及びＮＣＭ−３５６（正常な結腸）細胞を、ＣＳＶ、ＷＧＡ（細胞表面マーカー）、及び核染色剤ＤＲＡＱ５に対して染色した。８４−１への結合は、白色の矢印で示されている図の拡大部分から明らかなように、ＷＧＡと同時局在化する細胞表面ビメンチンを示す。スケールは１０μｍを示す。図１Ｅは、フローサイトメトリーを用いるヒト原発癌及び転移性癌中のＣＳＶの免疫学的評価であり、ヒト原発性結腸癌（ＨＰＣ１）及びヒト肝臓転移性癌（ＨＬＭ３）の分析は、原発性ＨＰＣ１細胞と比べて、ＨＬＭ３上のＣＳＶの大量の発現を示した。図１Ｆは、共焦点顕微鏡を用いる、Ｇｅｌｔｒｅｘの薄いコーティングが施されたウェル上のＨＰＣ１由来スフェア中のＣＳＶの検出である。ＣＳＶは、スフェアの周辺部でほとんどの細胞で検出されなかった。核染色液ＤＲＡＱ５を用いて、細胞を分離した。スケールは２０μｍを示す。 ８４−１、細胞表面ビメンチン（ＣＳＶ）特異的抗体の単離及び特性評価である。図１Ａは、ＣＳＶ特異的抗体の抗体スクリーニングの概略的表現である。異なるハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体のプールを、フローサイトメトリーを用いてＣＳＶ結合について分析し、癌特異的結合について選択した。選択された抗体を、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法を用いて、ビメンチンについて特性化した。図１Ｂは、フローサイトメトリーを用いる異なる非上皮性正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶの発現の免疫学的評価である。ＣＳＶは、癌細胞株ＳＫＮＢＥ−２（神経芽細胞腫）、患者の血液から単離されたＡＭＬ細胞、及びＬＭ７（骨肉腫）細胞でのみ検出可能であるが、一方、非上皮性正常細胞ＨＵＶＥＣ、ＨＦＯＢ、及びＰＢＭＣはＣＳＶの発現に対してネガティブであった。イソタイプ対照を陰性対照に使用した。図１Ｃは、フローサイトメトリーを用いる異なる非上皮性正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶの免疫学的評価である。ＣＳＶは、癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（乳癌）、ＤＬＤ−１（結腸癌）、及びＨＬＭ−６（肝臓癌）でのみ検出可能であるが、一方、正常な上皮細胞株ＨＥＫ−２９３、ＮＣＭ−３５６、及びＭＣＦ−１０Ａは、ＣＳＶの発現に対してネガティブであった。図１Ｄは、共焦点顕微鏡を用いる、正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶについての細胞表面染色分析である。ＨＬＭ−３（肝臓癌）及びＮＣＭ−３５６（正常な結腸）細胞を、ＣＳＶ、ＷＧＡ（細胞表面マーカー）、及び核染色剤ＤＲＡＱ５に対して染色した。８４−１への結合は、白色の矢印で示されている図の拡大部分から明らかなように、ＷＧＡと同時局在化する細胞表面ビメンチンを示す。スケールは１０μｍを示す。図１Ｅは、フローサイトメトリーを用いるヒト原発癌及び転移性癌中のＣＳＶの免疫学的評価であり、ヒト原発性結腸癌（ＨＰＣ１）及びヒト肝臓転移性癌（ＨＬＭ３）の分析は、原発性ＨＰＣ１細胞と比べて、ＨＬＭ３上のＣＳＶの大量の発現を示した。図１Ｆは、共焦点顕微鏡を用いる、Ｇｅｌｔｒｅｘの薄いコーティングが施されたウェル上のＨＰＣ１由来スフェア中のＣＳＶの検出である。ＣＳＶは、スフェアの周辺部でほとんどの細胞で検出されなかった。核染色液ＤＲＡＱ５を用いて、細胞を分離した。スケールは２０μｍを示す。 ８４−１、細胞表面ビメンチン（ＣＳＶ）特異的抗体の単離及び特性評価である。図１Ａは、ＣＳＶ特異的抗体の抗体スクリーニングの概略的表現である。異なるハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体のプールを、フローサイトメトリーを用いてＣＳＶ結合について分析し、癌特異的結合について選択した。選択された抗体を、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法を用いて、ビメンチンについて特性化した。図１Ｂは、フローサイトメトリーを用いる異なる非上皮性正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶの発現の免疫学的評価である。ＣＳＶは、癌細胞株ＳＫＮＢＥ−２（神経芽細胞腫）、患者の血液から単離されたＡＭＬ細胞、及びＬＭ７（骨肉腫）細胞でのみ検出可能であるが、一方、非上皮性正常細胞ＨＵＶＥＣ、ＨＦＯＢ、及びＰＢＭＣはＣＳＶの発現に対してネガティブであった。イソタイプ対照を陰性対照に使用した。図１Ｃは、フローサイトメトリーを用いる異なる非上皮性正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶの免疫学的評価である。ＣＳＶは、癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（乳癌）、ＤＬＤ−１（結腸癌）、及びＨＬＭ−６（肝臓癌）でのみ検出可能であるが、一方、正常な上皮細胞株ＨＥＫ−２９３、ＮＣＭ−３５６、及びＭＣＦ−１０Ａは、ＣＳＶの発現に対してネガティブであった。図１Ｄは、共焦点顕微鏡を用いる、正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶについての細胞表面染色分析である。ＨＬＭ−３（肝臓癌）及びＮＣＭ−３５６（正常な結腸）細胞を、ＣＳＶ、ＷＧＡ（細胞表面マーカー）、及び核染色剤ＤＲＡＱ５に対して染色した。８４−１への結合は、白色の矢印で示されている図の拡大部分から明らかなように、ＷＧＡと同時局在化する細胞表面ビメンチンを示す。スケールは１０μｍを示す。図１Ｅは、フローサイトメトリーを用いるヒト原発癌及び転移性癌中のＣＳＶの免疫学的評価であり、ヒト原発性結腸癌（ＨＰＣ１）及びヒト肝臓転移性癌（ＨＬＭ３）の分析は、原発性ＨＰＣ１細胞と比べて、ＨＬＭ３上のＣＳＶの大量の発現を示した。図１Ｆは、共焦点顕微鏡を用いる、Ｇｅｌｔｒｅｘの薄いコーティングが施されたウェル上のＨＰＣ１由来スフェア中のＣＳＶの検出である。ＣＳＶは、スフェアの周辺部でほとんどの細胞で検出されなかった。核染色液ＤＲＡＱ５を用いて、細胞を分離した。スケールは２０μｍを示す。 ８４−１、細胞表面ビメンチン（ＣＳＶ）特異的抗体の単離及び特性評価である。図１Ａは、ＣＳＶ特異的抗体の抗体スクリーニングの概略的表現である。異なるハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体のプールを、フローサイトメトリーを用いてＣＳＶ結合について分析し、癌特異的結合について選択した。選択された抗体を、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法を用いて、ビメンチンについて特性化した。図１Ｂは、フローサイトメトリーを用いる異なる非上皮性正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶの発現の免疫学的評価である。ＣＳＶは、癌細胞株ＳＫＮＢＥ−２（神経芽細胞腫）、患者の血液から単離されたＡＭＬ細胞、及びＬＭ７（骨肉腫）細胞でのみ検出可能であるが、一方、非上皮性正常細胞ＨＵＶＥＣ、ＨＦＯＢ、及びＰＢＭＣはＣＳＶの発現に対してネガティブであった。イソタイプ対照を陰性対照に使用した。図１Ｃは、フローサイトメトリーを用いる異なる非上皮性正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶの免疫学的評価である。ＣＳＶは、癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（乳癌）、ＤＬＤ−１（結腸癌）、及びＨＬＭ−６（肝臓癌）でのみ検出可能であるが、一方、正常な上皮細胞株ＨＥＫ−２９３、ＮＣＭ−３５６、及びＭＣＦ−１０Ａは、ＣＳＶの発現に対してネガティブであった。図１Ｄは、共焦点顕微鏡を用いる、正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶについての細胞表面染色分析である。ＨＬＭ−３（肝臓癌）及びＮＣＭ−３５６（正常な結腸）細胞を、ＣＳＶ、ＷＧＡ（細胞表面マーカー）、及び核染色剤ＤＲＡＱ５に対して染色した。８４−１への結合は、白色の矢印で示されている図の拡大部分から明らかなように、ＷＧＡと同時局在化する細胞表面ビメンチンを示す。スケールは１０μｍを示す。図１Ｅは、フローサイトメトリーを用いるヒト原発癌及び転移性癌中のＣＳＶの免疫学的評価であり、ヒト原発性結腸癌（ＨＰＣ１）及びヒト肝臓転移性癌（ＨＬＭ３）の分析は、原発性ＨＰＣ１細胞と比べて、ＨＬＭ３上のＣＳＶの大量の発現を示した。図１Ｆは、共焦点顕微鏡を用いる、Ｇｅｌｔｒｅｘの薄いコーティングが施されたウェル上のＨＰＣ１由来スフェア中のＣＳＶの検出である。ＣＳＶは、スフェアの周辺部でほとんどの細胞で検出されなかった。核染色液ＤＲＡＱ５を用いて、細胞を分離した。スケールは２０μｍを示す。 ８４−１、細胞表面ビメンチン（ＣＳＶ）特異的抗体の単離及び特性評価である。図１Ａは、ＣＳＶ特異的抗体の抗体スクリーニングの概略的表現である。異なるハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体のプールを、フローサイトメトリーを用いてＣＳＶ結合について分析し、癌特異的結合について選択した。選択された抗体を、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法を用いて、ビメンチンについて特性化した。図１Ｂは、フローサイトメトリーを用いる異なる非上皮性正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶの発現の免疫学的評価である。ＣＳＶは、癌細胞株ＳＫＮＢＥ−２（神経芽細胞腫）、患者の血液から単離されたＡＭＬ細胞、及びＬＭ７（骨肉腫）細胞でのみ検出可能であるが、一方、非上皮性正常細胞ＨＵＶＥＣ、ＨＦＯＢ、及びＰＢＭＣはＣＳＶの発現に対してネガティブであった。イソタイプ対照を陰性対照に使用した。図１Ｃは、フローサイトメトリーを用いる異なる非上皮性正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶの免疫学的評価である。ＣＳＶは、癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（乳癌）、ＤＬＤ−１（結腸癌）、及びＨＬＭ−６（肝臓癌）でのみ検出可能であるが、一方、正常な上皮細胞株ＨＥＫ−２９３、ＮＣＭ−３５６、及びＭＣＦ−１０Ａは、ＣＳＶの発現に対してネガティブであった。図１Ｄは、共焦点顕微鏡を用いる、正常細胞及び癌細胞株中のＣＳＶについての細胞表面染色分析である。ＨＬＭ−３（肝臓癌）及びＮＣＭ−３５６（正常な結腸）細胞を、ＣＳＶ、ＷＧＡ（細胞表面マーカー）、及び核染色剤ＤＲＡＱ５に対して染色した。８４−１への結合は、白色の矢印で示されている図の拡大部分から明らかなように、ＷＧＡと同時局在化する細胞表面ビメンチンを示す。スケールは１０μｍを示す。図１Ｅは、フローサイトメトリーを用いるヒト原発癌及び転移性癌中のＣＳＶの免疫学的評価であり、ヒト原発性結腸癌（ＨＰＣ１）及びヒト肝臓転移性癌（ＨＬＭ３）の分析は、原発性ＨＰＣ１細胞と比べて、ＨＬＭ３上のＣＳＶの大量の発現を示した。図１Ｆは、共焦点顕微鏡を用いる、Ｇｅｌｔｒｅｘの薄いコーティングが施されたウェル上のＨＰＣ１由来スフェア中のＣＳＶの検出である。ＣＳＶは、スフェアの周辺部でほとんどの細胞で検出されなかった。核染色液ＤＲＡＱ５を用いて、細胞を分離した。スケールは２０μｍを示す。 ８４−１ｍＡｂを用いてＣＴＣを単離し、計数するための方法論である。図２Ａは、８４−１媒介ＣＴＣ検出、単離、計数、及び分析の概略的表現である。図２Ｂは、蛍光顕微鏡を用いる血液中にスパイクされた単一細胞の検出である。単一のＬＭ８細胞を段階希釈及びスポット分析を用いて単離し、１ｍｌの血液中にスパイクした。ＲＢＣ溶解後に、単核化細胞集団を８４−１ｍＡｂ及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８二次抗体について染色し、ＣＳＶ陽性細胞を検出した。高倍率は、ＣＳＶ陽性である全血集団数の単一細胞の検出を示す。図２Ｃは、全血からの単一細胞の単離である。全血中にスパイクされた単一細胞を、ＥａｓｙＳｅｐに基づく８４−１陽性及びＣＤ４５陰性選択を用いて単離した。この単一細胞を、３７℃でインキュベーション後に、培養皿上で２時間観察した。図２Ｄは、血液から単離された細胞を、ＣＳＶ、ＣＤ４５に対する抗体及び核染色ＤＲＡＱ５を用いて共染色した顕微鏡写真である。スケールは、１０μｍを示す。図２Ｅは、健常者、原発性及び転移性癌患者の血液検体からのＣＳＶ陽性ＣＴＣの計数である。原発性癌患者からの血液を使用して、検出の閾値（点線）を選択した。転移性癌患者のサンプルは、比較的高いＣＴＣ計数を示した。 ８４−１ｍＡｂを用いてＣＴＣを単離し、計数するための方法論である。図２Ａは、８４−１媒介ＣＴＣ検出、単離、計数、及び分析の概略的表現である。図２Ｂは、蛍光顕微鏡を用いる血液中にスパイクされた単一細胞の検出である。単一のＬＭ８細胞を段階希釈及びスポット分析を用いて単離し、１ｍｌの血液中にスパイクした。ＲＢＣ溶解後に、単核化細胞集団を８４−１ｍＡｂ及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８二次抗体について染色し、ＣＳＶ陽性細胞を検出した。高倍率は、ＣＳＶ陽性である全血集団数の単一細胞の検出を示す。図２Ｃは、全血からの単一細胞の単離である。全血中にスパイクされた単一細胞を、ＥａｓｙＳｅｐに基づく８４−１陽性及びＣＤ４５陰性選択を用いて単離した。この単一細胞を、３７℃でインキュベーション後に、培養皿上で２時間観察した。図２Ｄは、血液から単離された細胞を、ＣＳＶ、ＣＤ４５に対する抗体及び核染色ＤＲＡＱ５を用いて共染色した顕微鏡写真である。スケールは、１０μｍを示す。図２Ｅは、健常者、原発性及び転移性癌患者の血液検体からのＣＳＶ陽性ＣＴＣの計数である。原発性癌患者からの血液を使用して、検出の閾値（点線）を選択した。転移性癌患者のサンプルは、比較的高いＣＴＣ計数を示した。 単離されたＣＴＣの分子の特性化である。図３Ａは、ＣＴＣ及び適合する白血球中のＫＲＡＳの突然変異分析である。ＣＴＣは、均一な（中央パネル）及び不均一なコドン１３突然変異（右側パネル）保有したが、白血球は、野生型配列を有した（左側パネル）。図３Ｂは、ユーイング肉腫（ＥＷＳ）及び平滑筋肉腫（ＬＭＳ）サンプルからのＣＴＣの分析である。ＥＷＳ ＣＴＣは、ＣＤ９９マーカーを用いて検証し、ＬＭＳ ＣＴＣは、α−ＳＭＡ染色を用いて検証した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｃは、分子特異的マーカーについてのＣＴＣの分析である。８４−１ｍＡｂを用いて単離されたＣＴＣを、ＥｑＣＡＭ（上皮マーカー）、ＳＬＵＧ（ＥＭＴ特異的調節因子）、及びＥ−カドヘリンについて染色した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｄは、ビメンチン、β−カテニン、及びｃ−ｍｙｃ発現についてのＣＴＣの分析である。ＣＴＣをヒト結腸癌サンプルから単離し、総ビメンチン、β−カテニン、ｃ−ｍｙｃ及び核染色ＤＲＡＱ５について染色し、これは患者サンプル中でβ−カテニン及びｃ−ｍｙｃの完全な核の局在化を示した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｅは、オルトバナジウム酸ナトリウム（ＳＯＶ）のＬＭ８及びＷＢＣに及ぼす効果である。ＬＭ８及びＷＢＣをＳＯＶで処理し、共焦点顕微鏡を用いてＣＳＶの発現について分析した。細胞をＣＳＶ、細胞表面マーカーのＷＧＡ、及び核染色ＤＲＡＱ５について染色した。癌細胞のＳＯＶによる１５分間の処理は、未処理細胞のものと比べるとき、ＣＳＶ発現を増強することが明らかである。ＷＢＣに及ぼすＳＯＶの効果は観察されなかった。図３Ｆは、患者由来のＣＴＣに及ぼすＳＯＶの効果の分析である。溶解後の患者の血液をＳＯＶ処理にかけて、８４−１及び核染色ＤＲＡＱ５を用いてビメンチンについて染色した。ＳＯＶ処理は、腫瘍細胞中のＣＳＶの発現を特異的に増強した。スケールは１０μｍを示す。 単離されたＣＴＣの分子の特性化である。図３Ａは、ＣＴＣ及び適合する白血球中のＫＲＡＳの突然変異分析である。ＣＴＣは、均一な（中央パネル）及び不均一なコドン１３突然変異（右側パネル）保有したが、白血球は、野生型配列を有した（左側パネル）。図３Ｂは、ユーイング肉腫（ＥＷＳ）及び平滑筋肉腫（ＬＭＳ）サンプルからのＣＴＣの分析である。ＥＷＳ ＣＴＣは、ＣＤ９９マーカーを用いて検証し、ＬＭＳ ＣＴＣは、α−ＳＭＡ染色を用いて検証した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｃは、分子特異的マーカーについてのＣＴＣの分析である。８４−１ｍＡｂを用いて単離されたＣＴＣを、ＥｑＣＡＭ（上皮マーカー）、ＳＬＵＧ（ＥＭＴ特異的調節因子）、及びＥ−カドヘリンについて染色した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｄは、ビメンチン、β−カテニン、及びｃ−ｍｙｃ発現についてのＣＴＣの分析である。ＣＴＣをヒト結腸癌サンプルから単離し、総ビメンチン、β−カテニン、ｃ−ｍｙｃ及び核染色ＤＲＡＱ５について染色し、これは患者サンプル中でβ−カテニン及びｃ−ｍｙｃの完全な核の局在化を示した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｅは、オルトバナジウム酸ナトリウム（ＳＯＶ）のＬＭ８及びＷＢＣに及ぼす効果である。ＬＭ８及びＷＢＣをＳＯＶで処理し、共焦点顕微鏡を用いてＣＳＶの発現について分析した。細胞をＣＳＶ、細胞表面マーカーのＷＧＡ、及び核染色ＤＲＡＱ５について染色した。癌細胞のＳＯＶによる１５分間の処理は、未処理細胞のものと比べるとき、ＣＳＶ発現を増強することが明らかである。ＷＢＣに及ぼすＳＯＶの効果は観察されなかった。図３Ｆは、患者由来のＣＴＣに及ぼすＳＯＶの効果の分析である。溶解後の患者の血液をＳＯＶ処理にかけて、８４−１及び核染色ＤＲＡＱ５を用いてビメンチンについて染色した。ＳＯＶ処理は、腫瘍細胞中のＣＳＶの発現を特異的に増強した。スケールは１０μｍを示す。 単離されたＣＴＣの分子の特性化である。図３Ａは、ＣＴＣ及び適合する白血球中のＫＲＡＳの突然変異分析である。ＣＴＣは、均一な（中央パネル）及び不均一なコドン１３突然変異（右側パネル）保有したが、白血球は、野生型配列を有した（左側パネル）。図３Ｂは、ユーイング肉腫（ＥＷＳ）及び平滑筋肉腫（ＬＭＳ）サンプルからのＣＴＣの分析である。ＥＷＳ ＣＴＣは、ＣＤ９９マーカーを用いて検証し、ＬＭＳ ＣＴＣは、α−ＳＭＡ染色を用いて検証した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｃは、分子特異的マーカーについてのＣＴＣの分析である。８４−１ｍＡｂを用いて単離されたＣＴＣを、ＥｑＣＡＭ（上皮マーカー）、ＳＬＵＧ（ＥＭＴ特異的調節因子）、及びＥ−カドヘリンについて染色した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｄは、ビメンチン、β−カテニン、及びｃ−ｍｙｃ発現についてのＣＴＣの分析である。ＣＴＣをヒト結腸癌サンプルから単離し、総ビメンチン、β−カテニン、ｃ−ｍｙｃ及び核染色ＤＲＡＱ５について染色し、これは患者サンプル中でβ−カテニン及びｃ−ｍｙｃの完全な核の局在化を示した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｅは、オルトバナジウム酸ナトリウム（ＳＯＶ）のＬＭ８及びＷＢＣに及ぼす効果である。ＬＭ８及びＷＢＣをＳＯＶで処理し、共焦点顕微鏡を用いてＣＳＶの発現について分析した。細胞をＣＳＶ、細胞表面マーカーのＷＧＡ、及び核染色ＤＲＡＱ５について染色した。癌細胞のＳＯＶによる１５分間の処理は、未処理細胞のものと比べるとき、ＣＳＶ発現を増強することが明らかである。ＷＢＣに及ぼすＳＯＶの効果は観察されなかった。図３Ｆは、患者由来のＣＴＣに及ぼすＳＯＶの効果の分析である。溶解後の患者の血液をＳＯＶ処理にかけて、８４−１及び核染色ＤＲＡＱ５を用いてビメンチンについて染色した。ＳＯＶ処理は、腫瘍細胞中のＣＳＶの発現を特異的に増強した。スケールは１０μｍを示す。 単離されたＣＴＣの分子の特性化である。図３Ａは、ＣＴＣ及び適合する白血球中のＫＲＡＳの突然変異分析である。ＣＴＣは、均一な（中央パネル）及び不均一なコドン１３突然変異（右側パネル）保有したが、白血球は、野生型配列を有した（左側パネル）。図３Ｂは、ユーイング肉腫（ＥＷＳ）及び平滑筋肉腫（ＬＭＳ）サンプルからのＣＴＣの分析である。ＥＷＳ ＣＴＣは、ＣＤ９９マーカーを用いて検証し、ＬＭＳ ＣＴＣは、α−ＳＭＡ染色を用いて検証した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｃは、分子特異的マーカーについてのＣＴＣの分析である。８４−１ｍＡｂを用いて単離されたＣＴＣを、ＥｑＣＡＭ（上皮マーカー）、ＳＬＵＧ（ＥＭＴ特異的調節因子）、及びＥ−カドヘリンについて染色した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｄは、ビメンチン、β−カテニン、及びｃ−ｍｙｃ発現についてのＣＴＣの分析である。ＣＴＣをヒト結腸癌サンプルから単離し、総ビメンチン、β−カテニン、ｃ−ｍｙｃ及び核染色ＤＲＡＱ５について染色し、これは患者サンプル中でβ−カテニン及びｃ−ｍｙｃの完全な核の局在化を示した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｅは、オルトバナジウム酸ナトリウム（ＳＯＶ）のＬＭ８及びＷＢＣに及ぼす効果である。ＬＭ８及びＷＢＣをＳＯＶで処理し、共焦点顕微鏡を用いてＣＳＶの発現について分析した。細胞をＣＳＶ、細胞表面マーカーのＷＧＡ、及び核染色ＤＲＡＱ５について染色した。癌細胞のＳＯＶによる１５分間の処理は、未処理細胞のものと比べるとき、ＣＳＶ発現を増強することが明らかである。ＷＢＣに及ぼすＳＯＶの効果は観察されなかった。図３Ｆは、患者由来のＣＴＣに及ぼすＳＯＶの効果の分析である。溶解後の患者の血液をＳＯＶ処理にかけて、８４−１及び核染色ＤＲＡＱ５を用いてビメンチンについて染色した。ＳＯＶ処理は、腫瘍細胞中のＣＳＶの発現を特異的に増強した。スケールは１０μｍを示す。 単離されたＣＴＣの分子の特性化である。図３Ａは、ＣＴＣ及び適合する白血球中のＫＲＡＳの突然変異分析である。ＣＴＣは、均一な（中央パネル）及び不均一なコドン１３突然変異（右側パネル）保有したが、白血球は、野生型配列を有した（左側パネル）。図３Ｂは、ユーイング肉腫（ＥＷＳ）及び平滑筋肉腫（ＬＭＳ）サンプルからのＣＴＣの分析である。ＥＷＳ ＣＴＣは、ＣＤ９９マーカーを用いて検証し、ＬＭＳ ＣＴＣは、α−ＳＭＡ染色を用いて検証した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｃは、分子特異的マーカーについてのＣＴＣの分析である。８４−１ｍＡｂを用いて単離されたＣＴＣを、ＥｑＣＡＭ（上皮マーカー）、ＳＬＵＧ（ＥＭＴ特異的調節因子）、及びＥ−カドヘリンについて染色した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｄは、ビメンチン、β−カテニン、及びｃ−ｍｙｃ発現についてのＣＴＣの分析である。ＣＴＣをヒト結腸癌サンプルから単離し、総ビメンチン、β−カテニン、ｃ−ｍｙｃ及び核染色ＤＲＡＱ５について染色し、これは患者サンプル中でβ−カテニン及びｃ−ｍｙｃの完全な核の局在化を示した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｅは、オルトバナジウム酸ナトリウム（ＳＯＶ）のＬＭ８及びＷＢＣに及ぼす効果である。ＬＭ８及びＷＢＣをＳＯＶで処理し、共焦点顕微鏡を用いてＣＳＶの発現について分析した。細胞をＣＳＶ、細胞表面マーカーのＷＧＡ、及び核染色ＤＲＡＱ５について染色した。癌細胞のＳＯＶによる１５分間の処理は、未処理細胞のものと比べるとき、ＣＳＶ発現を増強することが明らかである。ＷＢＣに及ぼすＳＯＶの効果は観察されなかった。図３Ｆは、患者由来のＣＴＣに及ぼすＳＯＶの効果の分析である。溶解後の患者の血液をＳＯＶ処理にかけて、８４−１及び核染色ＤＲＡＱ５を用いてビメンチンについて染色した。ＳＯＶ処理は、腫瘍細胞中のＣＳＶの発現を特異的に増強した。スケールは１０μｍを示す。 単離されたＣＴＣの分子の特性化である。図３Ａは、ＣＴＣ及び適合する白血球中のＫＲＡＳの突然変異分析である。ＣＴＣは、均一な（中央パネル）及び不均一なコドン１３突然変異（右側パネル）保有したが、白血球は、野生型配列を有した（左側パネル）。図３Ｂは、ユーイング肉腫（ＥＷＳ）及び平滑筋肉腫（ＬＭＳ）サンプルからのＣＴＣの分析である。ＥＷＳ ＣＴＣは、ＣＤ９９マーカーを用いて検証し、ＬＭＳ ＣＴＣは、α−ＳＭＡ染色を用いて検証した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｃは、分子特異的マーカーについてのＣＴＣの分析である。８４−１ｍＡｂを用いて単離されたＣＴＣを、ＥｑＣＡＭ（上皮マーカー）、ＳＬＵＧ（ＥＭＴ特異的調節因子）、及びＥ−カドヘリンについて染色した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｄは、ビメンチン、β−カテニン、及びｃ−ｍｙｃ発現についてのＣＴＣの分析である。ＣＴＣをヒト結腸癌サンプルから単離し、総ビメンチン、β−カテニン、ｃ−ｍｙｃ及び核染色ＤＲＡＱ５について染色し、これは患者サンプル中でβ−カテニン及びｃ−ｍｙｃの完全な核の局在化を示した。スケールは１０μｍを示す。図３Ｅは、オルトバナジウム酸ナトリウム（ＳＯＶ）のＬＭ８及びＷＢＣに及ぼす効果である。ＬＭ８及びＷＢＣをＳＯＶで処理し、共焦点顕微鏡を用いてＣＳＶの発現について分析した。細胞をＣＳＶ、細胞表面マーカーのＷＧＡ、及び核染色ＤＲＡＱ５について染色した。癌細胞のＳＯＶによる１５分間の処理は、未処理細胞のものと比べるとき、ＣＳＶ発現を増強することが明らかである。ＷＢＣに及ぼすＳＯＶの効果は観察されなかった。図３Ｆは、患者由来のＣＴＣに及ぼすＳＯＶの効果の分析である。溶解後の患者の血液をＳＯＶ処理にかけて、８４−１及び核染色ＤＲＡＱ５を用いてビメンチンについて染色した。ＳＯＶ処理は、腫瘍細胞中のＣＳＶの発現を特異的に増強した。スケールは１０μｍを示す。 図４Ａは、市販の抗体を用いる、骨肉腫細胞株ＬＭ７中のＣＳＶの免疫学的評価である。フローサイトメトリーを用いるＬＭ７細胞上のＣＳＶの検出のために、ＡＭＦ−１７Ｂ、ＥＣ−４０、ＣＳ、及びＶ−９抗体を利用したが、これらの抗体を用いて観察された結合はなかった。図４Ｂは、フローサイトメトリーを用いるＬＭ７骨肉腫細胞株に対するＣＨＰ−ＴＡＭＲＡペプチドの免疫学的評価である。ＣＨＰ−ＴＡＭＲＡペプチドはＬＭ７細胞に結合し、これはこれらの細胞上のＣＳＶの存在を示している。図４Ｃは、ウェスタンブロット法を用いる８４−１及び１２−１のｒｈＶｉｍタンパク質への結合の評価である。１０、１００及び１０００ｎｇのｒｈＶｉｍを、４〜２０％の勾配ゲル上に充填し、ウェスタンブロット法を行った。ブロットを８４−１及び１２−１抗体でブローブ探査した。この抗体が総ビメンチンに非常に高い親和性を有することが観察された。図４Ｄでは、ＬＭ７細胞からの細胞溶解物を調製し、８４−１及び１２−１抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法を行った。ブロットを、細胞シグナル伝達抗体（ＩｇＧバンドを除外するために、ウサギ起源）でプローブ探査した。図４Ｅは、共焦点顕微鏡を用いる癌細胞株における細胞内及び細胞外ビメンチン染色分析である。ＨＬＭ−３（肝臓癌）細胞を、ＣＳＶ、ＷＧＡ、及び核染色ＤＲＡＱ５について染色した。非透過処理細胞中の８４−１結合は、専ら膜に特異的であったが、透過処理細胞は、総ビメンチンレベルを示した。スケールは、２０μｍを示す。 図４Ａは、市販の抗体を用いる、骨肉腫細胞株ＬＭ７中のＣＳＶの免疫学的評価である。フローサイトメトリーを用いるＬＭ７細胞上のＣＳＶの検出のために、ＡＭＦ−１７Ｂ、ＥＣ−４０、ＣＳ、及びＶ−９抗体を利用したが、これらの抗体を用いて観察された結合はなかった。図４Ｂは、フローサイトメトリーを用いるＬＭ７骨肉腫細胞株に対するＣＨＰ−ＴＡＭＲＡペプチドの免疫学的評価である。ＣＨＰ−ＴＡＭＲＡペプチドはＬＭ７細胞に結合し、これはこれらの細胞上のＣＳＶの存在を示している。図４Ｃは、ウェスタンブロット法を用いる８４−１及び１２−１のｒｈＶｉｍタンパク質への結合の評価である。１０、１００及び１０００ｎｇのｒｈＶｉｍを、４〜２０％の勾配ゲル上に充填し、ウェスタンブロット法を行った。ブロットを８４−１及び１２−１抗体でブローブ探査した。この抗体が総ビメンチンに非常に高い親和性を有することが観察された。図４Ｄでは、ＬＭ７細胞からの細胞溶解物を調製し、８４−１及び１２−１抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法を行った。ブロットを、細胞シグナル伝達抗体（ＩｇＧバンドを除外するために、ウサギ起源）でプローブ探査した。図４Ｅは、共焦点顕微鏡を用いる癌細胞株における細胞内及び細胞外ビメンチン染色分析である。ＨＬＭ−３（肝臓癌）細胞を、ＣＳＶ、ＷＧＡ、及び核染色ＤＲＡＱ５について染色した。非透過処理細胞中の８４−１結合は、専ら膜に特異的であったが、透過処理細胞は、総ビメンチンレベルを示した。スケールは、２０μｍを示す。 図４Ａは、市販の抗体を用いる、骨肉腫細胞株ＬＭ７中のＣＳＶの免疫学的評価である。フローサイトメトリーを用いるＬＭ７細胞上のＣＳＶの検出のために、ＡＭＦ−１７Ｂ、ＥＣ−４０、ＣＳ、及びＶ−９抗体を利用したが、これらの抗体を用いて観察された結合はなかった。図４Ｂは、フローサイトメトリーを用いるＬＭ７骨肉腫細胞株に対するＣＨＰ−ＴＡＭＲＡペプチドの免疫学的評価である。ＣＨＰ−ＴＡＭＲＡペプチドはＬＭ７細胞に結合し、これはこれらの細胞上のＣＳＶの存在を示している。図４Ｃは、ウェスタンブロット法を用いる８４−１及び１２−１のｒｈＶｉｍタンパク質への結合の評価である。１０、１００及び１０００ｎｇのｒｈＶｉｍを、４〜２０％の勾配ゲル上に充填し、ウェスタンブロット法を行った。ブロットを８４−１及び１２−１抗体でブローブ探査した。この抗体が総ビメンチンに非常に高い親和性を有することが観察された。図４Ｄでは、ＬＭ７細胞からの細胞溶解物を調製し、８４−１及び１２−１抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法を行った。ブロットを、細胞シグナル伝達抗体（ＩｇＧバンドを除外するために、ウサギ起源）でプローブ探査した。図４Ｅは、共焦点顕微鏡を用いる癌細胞株における細胞内及び細胞外ビメンチン染色分析である。ＨＬＭ−３（肝臓癌）細胞を、ＣＳＶ、ＷＧＡ、及び核染色ＤＲＡＱ５について染色した。非透過処理細胞中の８４−１結合は、専ら膜に特異的であったが、透過処理細胞は、総ビメンチンレベルを示した。スケールは、２０μｍを示す。 図５Ａは、ヒト血液からのＰＢＭＣ集団の免疫蛍光画像を用いるＣＳＶ染色についての評価である。ＰＢＭＣ集団をヒト血液から単離し、ＣＤ３ｅ、ＣＤ１１ｂ、及びＣＤ４５染色を含む異なるマーカーについて、８４−１と共に評価した。これらの細胞は、８４−１抗体によっていかなる強い免疫染色も示さなかった。スケールは１０μｍを示す。図５Ｂは、共焦点顕微鏡を用いる正常細胞及び癌細胞株の細胞内ビメンチン染色分析である。ＨＬＭ−３（肝臓癌）及びＮＣＭ−３５６（正常な結腸）細胞を、ＣＳＶ、ＷＧＡ（細胞表面マーカー）及び核染色ＤＲＡＱ５について染色した。８４−１の結合は、ＮＣＭ−３５６細胞と比べて、ＨＬＭ３細胞中のみのビメンチンの存在を示す。スケールは１０μｍを示す。図５Ｃは、フローサイトメトリーを用いる、骨肉腫患者のサンプルから単離したＣＳＶ細胞の免疫学的評価であって、ＯＳＴ−ＤＬ−３９１（転移なし）及びＯＳＴ−ＤＬ−３９６Ａ（脳への転移）の分析は、ＯＳＴ−ＤＬ−３９６Ａ上のＣＳＶで、ＯＳＴ−ＤＬ−３９１細胞のものに比べて細胞の分画の増加を示した。図５Ｄはフローサイトメトリーを用いるヒトの原発性癌細胞及び転移性癌細胞におけるＣＳＶの免疫学的評価であり、ヒト原発性結腸癌（ＨＰＣ）及びヒト肝臓転移性癌（ＨＬＭ）の分析は、原発性ＨＰＣ１細胞と比べて、ＨＬＭ３上のＣＳＶの大量の発現を示した。ＣＰＭ−１は、結腸から転移した肺癌から単離された細胞を表し、原発性癌細胞のものと比べて増加するＣＳＶを示した。図５Ｅは、共焦点顕微鏡を用いる、Ｇｅｌｔｒｅｘ被覆ウェル上のＨＰＣ１由来のスフェア中のビメンチン及びβ−カテニンの発現である。総ビメンチンは、スフェアの周辺部においてほとんどの細胞で検出可能ではなく、これはβ−カテニンの核蓄積と相関した。核染色ＤＲＡＱ５を用いて細胞を分離した。スケールは２０μｍを示す。 図５Ａは、ヒト血液からのＰＢＭＣ集団の免疫蛍光画像を用いるＣＳＶ染色についての評価である。ＰＢＭＣ集団をヒト血液から単離し、ＣＤ３ｅ、ＣＤ１１ｂ、及びＣＤ４５染色を含む異なるマーカーについて、８４−１と共に評価した。これらの細胞は、８４−１抗体によっていかなる強い免疫染色も示さなかった。スケールは１０μｍを示す。図５Ｂは、共焦点顕微鏡を用いる正常細胞及び癌細胞株の細胞内ビメンチン染色分析である。ＨＬＭ−３（肝臓癌）及びＮＣＭ−３５６（正常な結腸）細胞を、ＣＳＶ、ＷＧＡ（細胞表面マーカー）及び核染色ＤＲＡＱ５について染色した。８４−１の結合は、ＮＣＭ−３５６細胞と比べて、ＨＬＭ３細胞中のみのビメンチンの存在を示す。スケールは１０μｍを示す。図５Ｃは、フローサイトメトリーを用いる、骨肉腫患者のサンプルから単離したＣＳＶ細胞の免疫学的評価であって、ＯＳＴ−ＤＬ−３９１（転移なし）及びＯＳＴ−ＤＬ−３９６Ａ（脳への転移）の分析は、ＯＳＴ−ＤＬ−３９６Ａ上のＣＳＶで、ＯＳＴ−ＤＬ−３９１細胞のものに比べて細胞の分画の増加を示した。図５Ｄはフローサイトメトリーを用いるヒトの原発性癌細胞及び転移性癌細胞におけるＣＳＶの免疫学的評価であり、ヒト原発性結腸癌（ＨＰＣ）及びヒト肝臓転移性癌（ＨＬＭ）の分析は、原発性ＨＰＣ１細胞と比べて、ＨＬＭ３上のＣＳＶの大量の発現を示した。ＣＰＭ−１は、結腸から転移した肺癌から単離された細胞を表し、原発性癌細胞のものと比べて増加するＣＳＶを示した。図５Ｅは、共焦点顕微鏡を用いる、Ｇｅｌｔｒｅｘ被覆ウェル上のＨＰＣ１由来のスフェア中のビメンチン及びβ−カテニンの発現である。総ビメンチンは、スフェアの周辺部においてほとんどの細胞で検出可能ではなく、これはβ−カテニンの核蓄積と相関した。核染色ＤＲＡＱ５を用いて細胞を分離した。スケールは２０μｍを示す。 図５Ａは、ヒト血液からのＰＢＭＣ集団の免疫蛍光画像を用いるＣＳＶ染色についての評価である。ＰＢＭＣ集団をヒト血液から単離し、ＣＤ３ｅ、ＣＤ１１ｂ、及びＣＤ４５染色を含む異なるマーカーについて、８４−１と共に評価した。これらの細胞は、８４−１抗体によっていかなる強い免疫染色も示さなかった。スケールは１０μｍを示す。図５Ｂは、共焦点顕微鏡を用いる正常細胞及び癌細胞株の細胞内ビメンチン染色分析である。ＨＬＭ−３（肝臓癌）及びＮＣＭ−３５６（正常な結腸）細胞を、ＣＳＶ、ＷＧＡ（細胞表面マーカー）及び核染色ＤＲＡＱ５について染色した。８４−１の結合は、ＮＣＭ−３５６細胞と比べて、ＨＬＭ３細胞中のみのビメンチンの存在を示す。スケールは１０μｍを示す。図５Ｃは、フローサイトメトリーを用いる、骨肉腫患者のサンプルから単離したＣＳＶ細胞の免疫学的評価であって、ＯＳＴ−ＤＬ−３９１（転移なし）及びＯＳＴ−ＤＬ−３９６Ａ（脳への転移）の分析は、ＯＳＴ−ＤＬ−３９６Ａ上のＣＳＶで、ＯＳＴ−ＤＬ−３９１細胞のものに比べて細胞の分画の増加を示した。図５Ｄはフローサイトメトリーを用いるヒトの原発性癌細胞及び転移性癌細胞におけるＣＳＶの免疫学的評価であり、ヒト原発性結腸癌（ＨＰＣ）及びヒト肝臓転移性癌（ＨＬＭ）の分析は、原発性ＨＰＣ１細胞と比べて、ＨＬＭ３上のＣＳＶの大量の発現を示した。ＣＰＭ−１は、結腸から転移した肺癌から単離された細胞を表し、原発性癌細胞のものと比べて増加するＣＳＶを示した。図５Ｅは、共焦点顕微鏡を用いる、Ｇｅｌｔｒｅｘ被覆ウェル上のＨＰＣ１由来のスフェア中のビメンチン及びβ−カテニンの発現である。総ビメンチンは、スフェアの周辺部においてほとんどの細胞で検出可能ではなく、これはβ−カテニンの核蓄積と相関した。核染色ＤＲＡＱ５を用いて細胞を分離した。スケールは２０μｍを示す。 図５Ａは、ヒト血液からのＰＢＭＣ集団の免疫蛍光画像を用いるＣＳＶ染色についての評価である。ＰＢＭＣ集団をヒト血液から単離し、ＣＤ３ｅ、ＣＤ１１ｂ、及びＣＤ４５染色を含む異なるマーカーについて、８４−１と共に評価した。これらの細胞は、８４−１抗体によっていかなる強い免疫染色も示さなかった。スケールは１０μｍを示す。図５Ｂは、共焦点顕微鏡を用いる正常細胞及び癌細胞株の細胞内ビメンチン染色分析である。ＨＬＭ−３（肝臓癌）及びＮＣＭ−３５６（正常な結腸）細胞を、ＣＳＶ、ＷＧＡ（細胞表面マーカー）及び核染色ＤＲＡＱ５について染色した。８４−１の結合は、ＮＣＭ−３５６細胞と比べて、ＨＬＭ３細胞中のみのビメンチンの存在を示す。スケールは１０μｍを示す。図５Ｃは、フローサイトメトリーを用いる、骨肉腫患者のサンプルから単離したＣＳＶ細胞の免疫学的評価であって、ＯＳＴ−ＤＬ−３９１（転移なし）及びＯＳＴ−ＤＬ−３９６Ａ（脳への転移）の分析は、ＯＳＴ−ＤＬ−３９６Ａ上のＣＳＶで、ＯＳＴ−ＤＬ−３９１細胞のものに比べて細胞の分画の増加を示した。図５Ｄはフローサイトメトリーを用いるヒトの原発性癌細胞及び転移性癌細胞におけるＣＳＶの免疫学的評価であり、ヒト原発性結腸癌（ＨＰＣ）及びヒト肝臓転移性癌（ＨＬＭ）の分析は、原発性ＨＰＣ１細胞と比べて、ＨＬＭ３上のＣＳＶの大量の発現を示した。ＣＰＭ−１は、結腸から転移した肺癌から単離された細胞を表し、原発性癌細胞のものと比べて増加するＣＳＶを示した。図５Ｅは、共焦点顕微鏡を用いる、Ｇｅｌｔｒｅｘ被覆ウェル上のＨＰＣ１由来のスフェア中のビメンチン及びβ−カテニンの発現である。総ビメンチンは、スフェアの周辺部においてほとんどの細胞で検出可能ではなく、これはβ−カテニンの核蓄積と相関した。核染色ＤＲＡＱ５を用いて細胞を分離した。スケールは２０μｍを示す。 図６Ａは、腫瘍細胞と免疫細胞との間の相互作用である。血液から単離された単核化集団を、８４−１、ＣＤ４５、及びＤＲＡＱ５染色について評価した。ＣＤ４５陽性である免疫細胞は、核のサイズによって決定されたように、８４−１陽性腫瘍細胞と相互作用していた。図６Ｂ及びＣは、マウスにおけるＣＴＣの連続分析である。マウスにＬＭ８（図６Ｂ）またはＣＴ−２６（図６Ｃ）細胞を移植した。約２００μｌの血液を、顎下頬出血法によって得た。マウスが腫瘍負荷のために安楽死されるまで、サンプルを約一週間間隔で得た。左側パネルは、対照として正常なマウスで毎週計数されたＣＴＣを示す。図６Ｂ及びＣの右側パネルの代表的なデータは、各々がそれぞれＬＭ８またはＣＴ−２６腫瘍を有する１匹のマウスからのデータを示す。ここで表されたデータは、１週間の間隔で得られたＣＴＣ対腫瘍体積のプロットである。図６Ｄは、血液から単離された細胞をＣＳＶ、ＣＤ４５に対する抗体及び核染色ＤＲＡＱ５を用いて共染色した顕微鏡写真である。スケールは１０μｍを示す。図６Ｅは、細胞コロニーの形成について８日間にわたって監視された、ＬＭ８（上部パネル）及びＣＴ−２６（下部パネル）から単離したＣＴＣの単離及び培養である。スケールは１０μｍを示す。図６Ｆは、イヌモデルにおける８４−１陽性ＣＴＣの検出である。血液サンプルからＣＴＣを単離し、明視野及び蛍光顕微鏡によって分析した。ＣＴＣを単離し、９６ウェルプレート上で培養し、明視野画像を獲得した。蛍光画像については、ＣＴＣをＣＳＶ、ＣＤ４５、及び核染色ＤＲＡＱ５について染色し、共焦点顕微鏡によって分析した。細胞生存能をカルセイン−ＡＭ染色を用いてテストした。スケールは１０μｍを示す。 図６Ａは、腫瘍細胞と免疫細胞との間の相互作用である。血液から単離された単核化集団を、８４−１、ＣＤ４５、及びＤＲＡＱ５染色について評価した。ＣＤ４５陽性である免疫細胞は、核のサイズによって決定されたように、８４−１陽性腫瘍細胞と相互作用していた。図６Ｂ及びＣは、マウスにおけるＣＴＣの連続分析である。マウスにＬＭ８（図６Ｂ）またはＣＴ−２６（図６Ｃ）細胞を移植した。約２００μｌの血液を、顎下頬出血法によって得た。マウスが腫瘍負荷のために安楽死されるまで、サンプルを約一週間間隔で得た。左側パネルは、対照として正常なマウスで毎週計数されたＣＴＣを示す。図６Ｂ及びＣの右側パネルの代表的なデータは、各々がそれぞれＬＭ８またはＣＴ−２６腫瘍を有する１匹のマウスからのデータを示す。ここで表されたデータは、１週間の間隔で得られたＣＴＣ対腫瘍体積のプロットである。図６Ｄは、血液から単離された細胞をＣＳＶ、ＣＤ４５に対する抗体及び核染色ＤＲＡＱ５を用いて共染色した顕微鏡写真である。スケールは１０μｍを示す。図６Ｅは、細胞コロニーの形成について８日間にわたって監視された、ＬＭ８（上部パネル）及びＣＴ−２６（下部パネル）から単離したＣＴＣの単離及び培養である。スケールは１０μｍを示す。図６Ｆは、イヌモデルにおける８４−１陽性ＣＴＣの検出である。血液サンプルからＣＴＣを単離し、明視野及び蛍光顕微鏡によって分析した。ＣＴＣを単離し、９６ウェルプレート上で培養し、明視野画像を獲得した。蛍光画像については、ＣＴＣをＣＳＶ、ＣＤ４５、及び核染色ＤＲＡＱ５について染色し、共焦点顕微鏡によって分析した。細胞生存能をカルセイン−ＡＭ染色を用いてテストした。スケールは１０μｍを示す。 図６Ａは、腫瘍細胞と免疫細胞との間の相互作用である。血液から単離された単核化集団を、８４−１、ＣＤ４５、及びＤＲＡＱ５染色について評価した。ＣＤ４５陽性である免疫細胞は、核のサイズによって決定されたように、８４−１陽性腫瘍細胞と相互作用していた。図６Ｂ及びＣは、マウスにおけるＣＴＣの連続分析である。マウスにＬＭ８（図６Ｂ）またはＣＴ−２６（図６Ｃ）細胞を移植した。約２００μｌの血液を、顎下頬出血法によって得た。マウスが腫瘍負荷のために安楽死されるまで、サンプルを約一週間間隔で得た。左側パネルは、対照として正常なマウスで毎週計数されたＣＴＣを示す。図６Ｂ及びＣの右側パネルの代表的なデータは、各々がそれぞれＬＭ８またはＣＴ−２６腫瘍を有する１匹のマウスからのデータを示す。ここで表されたデータは、１週間の間隔で得られたＣＴＣ対腫瘍体積のプロットである。図６Ｄは、血液から単離された細胞をＣＳＶ、ＣＤ４５に対する抗体及び核染色ＤＲＡＱ５を用いて共染色した顕微鏡写真である。スケールは１０μｍを示す。図６Ｅは、細胞コロニーの形成について８日間にわたって監視された、ＬＭ８（上部パネル）及びＣＴ−２６（下部パネル）から単離したＣＴＣの単離及び培養である。スケールは１０μｍを示す。図６Ｆは、イヌモデルにおける８４−１陽性ＣＴＣの検出である。血液サンプルからＣＴＣを単離し、明視野及び蛍光顕微鏡によって分析した。ＣＴＣを単離し、９６ウェルプレート上で培養し、明視野画像を獲得した。蛍光画像については、ＣＴＣをＣＳＶ、ＣＤ４５、及び核染色ＤＲＡＱ５について染色し、共焦点顕微鏡によって分析した。細胞生存能をカルセイン−ＡＭ染色を用いてテストした。スケールは１０μｍを示す。 図７Ａでは、患者の血液から単離された単核化細胞を、８４−１について染色した。これらの細胞が、血液中のＰＢＭＣ集団とは明確に区別されることを観察することができた。図７Ｂは、ＣＲＣ患者から単離されたＣＴＣの細胞培養である。結腸癌患者の血液から単離された８４−１＋ＣＴＣを、インビトロで９６ウェルプレートにて培養し、単一細胞分析用に利用した。図７Ｃは、フローサイトメトリー分析による、８４−１の結合についてのＭＤＡ−ＭＢ−４６８分析である。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、８４−１について染色し、ＣＳＶに結合する細胞の陽性分画について分析した。図７Ｄでは、オルトバナジウム酸ナトリウム（ＳＯＶ）処理は、フローサイトメトリーによって見ることができるように、ＬＭ７細胞上のＣＳＶの発現を誘発する。 図７Ａでは、患者の血液から単離された単核化細胞を、８４−１について染色した。これらの細胞が、血液中のＰＢＭＣ集団とは明確に区別されることを観察することができた。図７Ｂは、ＣＲＣ患者から単離されたＣＴＣの細胞培養である。結腸癌患者の血液から単離された８４−１＋ＣＴＣを、インビトロで９６ウェルプレートにて培養し、単一細胞分析用に利用した。図７Ｃは、フローサイトメトリー分析による、８４−１の結合についてのＭＤＡ−ＭＢ−４６８分析である。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、８４−１について染色し、ＣＳＶに結合する細胞の陽性分画について分析した。図７Ｄでは、オルトバナジウム酸ナトリウム（ＳＯＶ）処理は、フローサイトメトリーによって見ることができるように、ＬＭ７細胞上のＣＳＶの発現を誘発する。 １２−１モノクローナル抗体を用いて抽出されたＬＭ７細胞を、１２−１モノクローナル抗体を用いて細胞表面ビメンチンについて、及びＤＲＡＱ５（核染色）について染色した。スケールバーは１０μｍを示す。 ８４−１、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ、及び８４−１＋ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈを用いる乳癌ＣＴＣ検出法の比較である。各転移性乳癌患者からの１本の採血管を用いて、８４−１法（図９Ａ）及びＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ法（図９Ｂ）によってＣＴＣを計数した。ＣＴＣの平均数を、８４−１法及びＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ法の両方から計算した（図９Ｃ）。これらの患者を安定性集団（療法に応答する）及び進行性集団（療法に応答せず、腫瘍進行を示す）に分類した。 ８４−１及びＣｅｌｌＳｅａｒｃｈを用いる前立腺癌ＣＴＣの検出法の比較である。各前立腺癌患者からの１本の採血管を用いて、８４−１法及びＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ法によってＣＴＣを計数した。これらの患者を安定性集団（療法に応答する）及び進行性集団（療法に応答せず、腫瘍進行を示す）に分類した。 抗体１２−１強度のプロットである。データの定量化に続いて、ペプチドの生成及び強度マップならびに左側の１０ａａのペプチド、中央の１２ａａのペプチド、及び右側の１５ａａのペプチドを用いて、前染色（下のプロット）及び主アッセイ（１：５０００−中央のプロット、１：１０００−上のプロット）に関する強度プロットを行った。 抗体８４−１の強度プロットである。データの定量化に続いて、ペプチドの生成及び強度マップならびに左側の１０ａａのペプチド、中央の１２ａａのペプチド、及び右側の１５ａａのペプチドを用いて、前染色（下のプロット）及び主アッセイ（１：５０００−中央のプロット、１：１０００−上のプロット）に関する強度プロットを行った。 組み合わせた抗体１２−１及び８４−１の強度プロットである。マウスモノクローナル抗体１２−１（中央のプロット）及び８４−１（上のプロット）の強度プロットの比較は、左側の１０ａａのペプチド、中央の１２ａａのペプチド、及び右側の１５ａａのペプチドで、両サンプルの明白な類似性を明らかにした。 抗体１２−１についてのＭＥＭＥモチーフである。 抗体８４−１についてのＭＥＭＥモチーフである。

癌患者の末梢血液中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出は、いくつかの型の転移性癌の早期診断及び予後における新規のツールとして浮かび上がっている。現段階では、ＣＴＣマーカーは上皮癌に限定され、非上皮癌（すなわち、間葉性）及び上皮間葉形質転換（ＥＭＴ）癌細胞型を検出することができない。本明細書において、本発明者は、非上皮及びＥＭＴ ＣＴＣに向かう高度の特異性及び感度を示す（１００万個の血液細胞から１つのＣＴＣが検出できる）、新規の癌細胞表面ビメンチン（ＣＳＶ）に特異的なモノクローナル抗体、すなわち８４−１を報告する。このことが、８４−１を、ＣＴＣ検出及び単離のための理想的なツールにする。さらに、本発明者は、ホスファターゼ阻害物質を用いてＣＴＣ上のビメンチンの細胞表面発現を刺激し、これによって検出及び単離の効率を増加させる方法論も発見した。ＣＴＣの検出及び分子の特性化は、癌のトランスレーショナルリサーチの急激な成長を遂げる領域のうちの１つである。本発明者の細胞表面マーカーを利用することで、本発明者は、腫瘍、転移、及び再発の早期検出において役立つために、ＣＴＣを計数し、単離し、かつ分析することができる。同様に、８４−１は、癌患者における個別化された療法の効率性をモニタリングしかつ評価するための可能性のあるツールである。さらに、８４−１抗体を用いて単離されるＣＴＣは、ゲノム配列決定によって任意の突然変異を検出するための分子の特性化を含めて、詳細に研究されることができ、これが特異的に標的化される療法の開発、個別化された医薬品の最終的な目標に寄与するであろう。

本発明は、Ａ）癌患者の血液から間葉及び上皮間葉形質転換循環腫瘍細胞を検出かつ単離するための新規バイオマーカーとしての細胞表面ビメンチンの発見、Ｂ）循環腫瘍細胞上の細胞表面ビメンチンの検出に特異的な抗体、及びＣ）ＣＴＣ上の細胞表面ビメンチンの発現を増強し／刺激し、それによってパートＢ）の抗体の検出能を増強させるための特異的ホスファターゼ阻害物質の使用を含む。
Ｉ．本発明の抗体

特定の実施形態では、細胞表面ビメンチンの少なくとも一部に結合し、循環腫瘍細胞の表面上のビメンチンを特異的に検出する抗体またはそれらの断片、ならびに疾患の診断及び治療におけるその関連する使用が企図される。本明細書で使用される、用語「抗体」は、広くは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥならびに抗原結合活性を保持する抗体ＣＤＲドメインを含むポリペプチドなどの任意の免疫学的結合作用物質を指すよう意図される。抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、もしくは抗原結合抗体断片または天然あるいは合成リガンドからなる群から選択され得る。好ましくは、抗ビメンチン抗体は、モノクローナル抗体またはヒト化抗体である。既知の手段によってまたは本明細書に記載されるように、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、抗体断片、ならびに結合ドメイン及びＣＤＲ（前述のいずれかの操作された形態を含む）は、これらが細胞表面ビメンチンに、その対応のエピトープのうちの１つ以上に、または前述のいずれかの抱合体に対して、こうした抗原またはエピトープが天然源から単離されようが、もしくはこれらが合成誘導体またはこの天然化合物の変異体であろうが、特異的であるように作成され得る。

本発明に好適な抗体断片の例としては、限定されないが、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる「Ｆｄ」断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなる「Ｆｖ」断片、（ｉｖ）「ｄＡｂ」断片（これはＶＨドメインからなる）、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（２つの結合したＦａｂ断片を含む二価の断片）、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（「ｓｃＦｖ」）（ここでは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、２つのドメインを結合させて結合ドメインを形成するペプチドリンカーによって結合される）（ｖｉｉｉ）二重特異的単鎖Ｆｖ二量体（米国特許第５，０９１，５１３号を参照）、及び（ｉｘ）二重特異性抗体（遺伝子融合によって構築される多価または多重特異的断片）（米国特許出願公開第２００５０２１４８６０号）が含まれる。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または二重特異性抗体分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインとを結合するジスルフィド架橋の組み込みによって安定化され得る。ＣＨ３ドメインに結合されるｓｃＦｖを含むミニボディも生成され得る（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。

抗体様結合ペプチド疑似体もまた実施形態において企図される。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）は、「抗体様結合ペプチド疑似体」（ＡＢｉＰ）を記載しており、これは、少しずつ減少する抗体として作用し、より長い血清半減期ならびに面倒な合成法が少ないという特定の利点を有するペプチドである。アプタマー（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子から生成される）、小ペプチド、及びナノ粒子が含まれるＣＴＣ上の細胞表面ビメンチンを検出するために使用され得る追加のツールも企図される。

ビメンチンタンパク質に特異的な抗体を生成するために、動物に、６−Ｈｉｓタグ可溶性ビメンチン（ＮＣＢＩ受入番号Ｐ０８６７０、参照により本明細書に組み込まれる）などの抗原を接種することができる。頻繁に、免疫応答を増強するために、抗原は別の分子と結合されまたは抱合される。本明細書で使用される抱合体は、抗原に結合された任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または非タンパク質性物質であり、これは動物において免疫応答を誘起するために使用される。抗原接種に応答して動物において生成される抗体は、Ｂリンパ球を生成する多様な個々の抗体から生成された多様な非同一分子（ポリクローナル抗体）を含む。ポリクローナル抗体は、抗体種の混合集団であり、このそれぞれが、同一の抗原上の異なるエピトープを認識することができる。動物におけるポリクローナル抗体の生成のための適正な条件があれば、動物の血清中の大部分の抗体は、動物が免疫化された抗原化合物上の集団的エピトープを認識するであろう。この特異性は、関心の抗原またはエピトープを認識するこれらの抗体だけを選択するための親和性精製によってさらに増強される。ビメンチンに対する抗体の場合、細胞表面ビメンチンを検出するための選択性は、ビメンチンをそれらの表面上で発現するかまたは発現しない細胞に対する差別的結合をアッセイすることによって決定することができる。

モノクローナル抗体は、抗体の単一種であり、ここでは、全ての抗体生成細胞が単一のＢリンパ球細胞株に由来するために、全ての抗体分子が、同一のエピトープを認識する。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生成するための方法は、一般的に、ポリクローナル抗体を調製するためのものと同一の株で開始する。いくつかの実施形態では、マウス及びラットなどの齧歯類が、モノクローナル抗体を生成するために使用される。いくつかの実施形態では、ウサギ、ヒツジ、またはカエルの細胞が、モノクローナル抗体を生成するために使用される。ラットの使用が周知であり、特定の利点を提供する場合がある。マウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）は日常的に使用され、一般的に高比率の安定した融合を提供する。

ハイブリドーマ技術は、前もってビメンチン抗原で免疫化されたマウスからの単一のＢリンパ球の不死化骨髄細胞（通常はマウス骨髄）との融合を伴う。この技術は、単一抗体生成細胞を無限の世代数まで増殖させる方法を提供することで、同一の抗原またはエピトープへの特異性を有する構造的に同一の無制限の量の抗体（モノクローナル抗体）が生成され得る。

一実施形態では、この抗体はキメラ抗体、例えば、異種非ヒト、ヒト、またはヒト化配列（例えば、枠組配列及び／または定常ドメイン配列）に移植された非ヒトドナーからの抗原結合配列を含む抗体である。モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖定常ドメインをヒト起源の類似のドメインで置き換えて、外来抗体の可変ドメインを無傷で残存させるための方法が開発されている。あるいは、「完全なヒト」モノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックのマウスにおいて生成される。齧歯類、例えばマウスとヒトのアミノ酸配列の両方を有する抗体可変ドメインを組換えにより構築することによって、モノクローナル抗体の可変領域をよりヒト型に変換するための方法も開発されている。「ヒト化」モノクローナル抗体においては、超可変的ＣＤＲのみがマウスモノクローナル抗体に由来し、枠組及び定常領域がヒトアミノ酸配列に由来する（米国特許第５，０９１，５１３号及び同第６，８８１，５５７号を参照）。齧歯類に特徴的である抗体中のアミノ酸配列をヒト抗体の対応する位置で見出されるアミノ酸配列で置き換えることは、治療的使用の際の有害な免疫反応の傾向性を低減することになるであろう。ハイブリドーマまたは他の抗体生成細胞は、遺伝子突然変異または他の変化を受ける場合もあり、これは、ハイブリドーマによって生成された抗体の結合特異性を変更することもまたは変更しないこともある。

様々な動物種においてポリクローナル抗体を生成するための方法、ならびにヒト化、キメラ、及び完全ヒト抗体を含む種々のタイプのモノクローナル抗体を生成するための方法は当該技術分野において周知であり、容易に予想可能である。例えば、以下の米国特許及び特許出願は、こうした方法を可能にする説明を提供する：米国特許出願公開第２００４／０１２６８２８号及び同第２００２／０１７２６７７号、ならびに米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，１９６，２６５号、同第４，２７５，１４９号、同第４，２７７，４３７号、同第４，３６６，２４１号、同第４，４６９，７９７号、同第４，４７２，５０９号、同第４，６０６，８５５号、同第４，７０３，００３号、同第４，７４２，１５９号、同第４，７６７，７２０号、同第４，８１６，５６７号、同第４，８６７，９７３号、同第４，９３８，９４８号、同第４，９４６，７７８号、同第５，０２１，２３６号、同第５，１６４，２９６号、同第５，１９６，０６６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，４２０，２５３号、同第５，５６５，３３２号、同第５，５７１，６９８号、同第５，６２７，０５２号、同第５，６５６，４３４号、同第５，７７０，３７６号、同第５，７８９，２０８号、同第５，８２１，３３７号、同第５，８４４，０９１号、同第５，８５８，６５７号、同第５，８６１，１５５号、同第５，８７１，９０７号、同第５，９６９，１０８号、同第６，０５４，２９７号、同第６，１６５，４６４号、同第６，３６５，１５７号、同第６，４０６，８６７号、同第６，７０９，６５９号、同第６，７０９，８７３号、同第６，７５３，４０７号、同第６，８１４，９６５号、同第６，８４９，２５９号、同第６，８６１，５７２、同第６，８７５，４３４号、及び同第６，８９１，０２４号。本明細書及びそれらで引用される全ての特許、特許出願公開、及び他の刊行物は、本出願において参照により本明細書に組み込まれる。

抗体は、鳥類及び哺乳動物を含む任意の動物源から生成されてもよい。好ましくは、この抗体は、ヒツジ、ネズミ（例えば、マウス及びラット）、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリの抗体である。加えて、最新の技術が、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリーからのヒト抗体についての開発及びスクリーニングを可能にする。例えば、バクテリオファージ抗体発現技術は、米国特許第６，９４６，５４６号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、特異的抗体を動物免疫化の不在下で生成することを可能にする。これらの技術は、Ｍａｒｋｓ（１９９２）、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）、Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）及びＳｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）においてさらに記述されている。

細胞表面ビメンチンに対する抗体が、動物種、モノクローナル細胞株、または抗体の他の供給源に無関係に、ＣＴＣに結合する能力を有するという見込みが確実である。特定の動物種は、抗体の「Ｆｃ」部分を通しての補体系の活性に起因して、これらがアレルギー反応を引き起こす可能性が高いために、治療的抗体を生成するために好ましさの程度は比較的低い場合がある。しかしながら、全抗体が「Ｆｃ」（補体結合）断片に、かつ結合ドメインまたはＣＤＲを有する抗体断片に酵素により消化されることが可能である。Ｆｃ部分の除去は、抗原抗体断片が望ましくない免疫学的応答を誘発する傾向性を低減し、これによって、Ｆｃを含まない抗体は、予防または治療的処置のために優位的であり得る。上述のように、抗体はまた、他の種で生成された、または他の種からの配列を有する抗体を動物に投与することから生じる有害な免疫学的結果を低減しまたは排除するために、キメラもしくは部分的にまたは完全にヒトとなるように構築され得る。

置換型変異体は、典型的には、タンパク質内の１つ以上の部位における１つのアミノ酸の別のアミノ酸への交換を含有し、ポリペプチドの１つ以上の特性を、他の機能または特性の損失の有無で、修飾するよう設計されてもよい。置換は、保存的であってもよく、すなわち、１つのアミノ酸が同様な形状または電荷の１つで置き換えられる。保存的置換は、当該技術分野において周知であり、例えば、アラニンのセリンへの変更、アルギニンのリジンへの変更、アスパラギンのグルタミンまたはヒスチジンへの変更、アスパラギン酸のグルタミンへの変更、システインのセリンへの変更、グルタミンのアスパラギンへの変更、グルタミン酸のアスパラギン酸への変更、グリシンのプロリンへの変更、ヒスチジンのアスパラギンまたはグルタミンへの変更、イソロイシンのロイシンまたはバリンへの変更、ロイシンのバリンまたはイソロイシンへの変更、リジンのアルギニンへの変更、メチオニンのロイシンまたはイソロイシンへの変更、フェニルアラニンのチロシンへの変更、ロイシンのメチオニンへの変更、セリンのスレオニンへの変更、スレオニンのセリンへの変更、トリプトファンのチロシンへの変更、チロシンのトリプトファンまたはフェニルアラニンへの変更、及びバリンのイソロイシンまたはロイシンへの変更が含まれる。あるいは、置換は、ポリペプチドの機能または活性が影響を受けるように、非保存的であってもよい。非保存的変化は、典型的には、残基を化学的に異なるもので置換すること、例えば、極性または荷電アミノ酸を非極性または非荷電アミノ酸で置換することを伴い、逆もまた同様である。

タンパク質は組換え体であっても、またはインビトロで合成されてもよい。あるいは、非組換えまたは組換えタンパク質が、細菌から単離されてもよい。こうした変異体を含有する細菌が、組成物及び方法において実現され得ることも企図される。その結果、タンパク質は単離される必要がない。

組成物中に、ｍｌ当たり約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇの総ポリペプチド、ペプチド、及び／またはタンパク質が存在することが企図される。したがって、組成物中のタンパク質の濃度は、約、少なくとも約または最大で約０．００１、０．０１０、０．０５０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上（もしくはこれらの中で誘導可能な任意の範囲）であり得る。このうちの、約、少なくとも約、または最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％が、細胞表面ビメンチンに結合する抗体であってもよい。

抗体または好ましくは抗体の免疫学的部分は、他のタンパク質と化学的に抱合されるか、または融合タンパク質として発現され得る。本明細書及び添付の特許請求の範囲の目的のために、全てのこうした融合タンパク質は、抗体または抗体の免疫学的部分の定義に含まれる。

実施形態は、抗体抱合体またはペイロードを形成するために、少なくとも１つの作用物質に結合する、細胞表面ビメンチン、ポリペプチド、及びペプチドに対する抗体及び抗体様分子を提供する。診断薬または治療薬としての抗体分子の有効性を増加させるために、少なくとも１つの所望の分子または部分と結合するか、共有結合するか、または複合体を形成することが慣習的である。こうした分子または部分としては、限定されないが、少なくとも１つのエフェクターまたはレポーター分子が含まれる。エフェクター分子は、所望の活性、例えば、細胞毒性活性を有する分子を含む。抗体に取り付けられたエフェクター分子の非限定的な例としては、毒素、治療的酵素、抗生物質、放射標識ヌクレオチド等が含まれる。対照的に、レポーター分子は、アッセイを用いて検出され得る任意の部分として定義される。抗体に抱合されたレポーター分子の非限定的な例としては、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、燐光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子、またはビオチンなどのリガンドが含まれる。

抗体のその抱合体部分への取付けまたは抱合のためのいくつかの方法が当該技術分野において既知である。一部の取付け方法は、抗体に取り付けられる有機キレート剤、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物（ＤＴＰＡ）、ジエチレントリアミンテトラ酢酸、Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド、及び／またはテトラクロロ−３−６α−ジフェニルグリコウリル−３を使用する金属キレート錯体の使用を伴う。モノクローナル抗体はまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩などのカップリング剤の存在下で酵素と反応させてもよい。フルオレセインマーカーとの抱合体は、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製される。
ＩＩ．循環腫瘍細胞

ＣＴＣは、任意の好適なサンプル型において検出され得る。本明細書で使用される用語「サンプル」とは、本発明によって提供される方法に好適な任意のサンプルを指す。このサンプルは、検出に好適なＣＴＣを含む任意のサンプルであってもよい。サンプルの供給源としては、全血、骨髄、胸水、腹水、中枢脊髄液、尿、唾液、及び気管支洗浄液が含まれる。一態様では、このサンプルは、例えば、全血またはそれらの任意のフラクションもしくは成分を含む血液サンプルである。本発明での使用に好適な血液サンプルは、例えば静脈血、動脈血、末梢血液、組織、脊髄等の血液細胞またはそれらの成分を含むことが知られている任意の供給源から抽出され得る。例えば、サンプルは、周知であり慣用的な臨床的方法（例えば、全血を取り出し、処理するための手法）を用いて得られ、処理されてもよい。一態様では、例示のサンプルは、癌を有する対象から取り出された末梢血液であってもよい。

本明細書で使用される用語「癌」は、異形成、過形成、固形腫瘍、及び造血癌を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において周知である多様な癌の型を含む。癌の多くの型が、転移して循環腫瘍細胞を排出し、または転移性、例えば転移した原発性癌から生じる二次性癌になることが知られている。追加の癌としては、限定されないが、以下の臓器または系の癌が含まれる：脳、心臓、肺、胃腸管系、泌尿生殖器、肝臓、骨、神経系、婦人科系、血液、皮膚、乳房、及び副腎。癌細胞の追加の型は、グリオーマ（シュワン細胞腫、膠芽腫、神経膠星状細胞腫）、神経芽細胞腫、クロム親和細胞腫、傍神経節腫、髄膜腫、副腎皮質癌、髄芽腫、横紋筋肉腫、腎臓癌、種々の型の血管癌、骨芽球性骨肉腫、前立腺癌、卵巣癌、子宮筋腫、唾液腺癌、脈絡膜叢癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、及び巨核芽球性白血病、ならびに悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平細胞癌、カポジ肉腫、ほくろ異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、肉腫（線維肉腫または血管肉腫など）、及び黒色腫を含む皮膚癌が含まれる。

ＣＴＣ集団中に含まれる検出されたＣＴＣの総数は、部分的には、初期サンプルの容量に依存する。様々な態様では、広範囲の初期サンプル容量におけるＣＴＣの検出は、臨床的に有意な結果を提供することが可能なＣＴＣの検出数を生成するのに十分なものである。したがって、初期サンプル容量は、約２５μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、１２５μｌ、１５０μｌ、１７５μｌ、２００μｌ、２２５μｌ、２５０μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、７５０μｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ未満、または約１０ｍｌを超えるものであり得る。例示の態様では、初期サンプル容量は、約１００〜２００μｌである。別の例示の態様では、本明細書に記載されるように処理されるサンプルは、約１、２、５、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、またはさらには１０００個を超える明らかにされたＣＴＣを含む。

本明細書で使用される分析は、ＣＴＣの直接的または間接的な可視化を可能にし、インビボまたはエクスビボであってもよい任意の方法を含む。例えば、分析としては、エクスビボ顕微鏡法または細胞数測定検出及び固体基材に結合した細胞の可視化、フローサイトメトリー、蛍光画像診断法等が含まれるが、これらに限定されない。例示の態様では、ＣＴＣは細胞表面ビメンチンに向けられる抗体を用いて検出され、続いて固体基材に結合され、顕微鏡法または細胞数測定検出法を用いて可視化される。

別の実施形態では、ＣＴＣは、ＣＴＣに対してサンプルを濃縮するために通常使用される技術、例えば、免疫磁性捕捉などの免疫特異的相互作用を伴うものによって捕捉される。免疫磁性捕捉は、免疫磁性細胞分離としても知られ、典型的には、特定の細胞型上で見出されるタンパク質に向けられる抗体を、小さい常磁性ビーズに付着させることを伴う。抗体被覆ビーズが、血液などのサンプルと混合されると、これらは特定の細胞に付着し、これらを包囲する。次いでサンプルを強磁場に置き、ビーズをペレット化させ、一方に寄せる。血液を除去後に、捕捉された細胞が、ビーズ内に保持される。この一般法の多くの変形が当該技術分野において周知であり、ＣＴＣを単離するために好適である。

本発明の方法を使用するＣＴＣの検出、単離、及び特性化は、癌の予後を評価することにおいて、及び疾患の再発に繋がり得る治療の失敗の早期検出のための治療有効性をモニタリングすることにおいて有用である。加えて、本発明によるＣＴＣの分析は、治療の過程を完了した前駆症状性の患者における早期の再発の検出を可能にする。これは、ＣＴＣの存在が、腫瘍の進行ならびに蔓延、治療に対する応答不良、疾患の再発、及び／またはある期間にわたる生存率の低下に関連付けられる及び／または相関するために可能である。したがって、ＣＴＣの計数及び特性化は、治療に対する応答に基づいて、初期リスク及び後続のリスクを予測するベースライン特性化に対して患者を層別化するための方法を提供する。

本明細書で使用される用語「対象」は、主題の方法が実施される任意の個体または患者を指す。一般的に、この対象はヒトであるが、当業者に理解されるように、この対象は動物であってもよい。したがって、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、及びモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜動物（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等を含む）、ならびに霊長類（サル、チンパンジー、オラウータン、及びゴリラ）などの哺乳動物を含む他の動物が、対象の定義に含まれる。

したがって、別の実施形態において、本発明は、対象において癌を診断し予後の判断を行うための方法を提供する。本明細書に開示された方法により単離されたＣＴＣは、対象において癌を診断し予後の判断を行うために分析され得る。然して、本発明の方法は、例えば、癌患者を評価し、癌患者及び癌発生のリスクがある人々を評価するために使用され得る。本明細書に記載される診断または予後判断の方法のいずれかにおいて、癌細胞などの癌の、または任意の他の障害の１つ以上の指標の存在または不在のいずれかが、診断または予後判断を行うために使用されてもよい。

一態様では、血液サンプルが患者から取り出され、ＣＴＣが本明細書に記載されるように検出される。本発明の方法を使用して、血液サンプル中のＣＴＣの数が決定され、その後ＣＴＣが分析されてもよい。例えば、細胞が、細胞表面ビメンチン、サイトケラチン、またはＥｐＣＡＭに結合する１つ以上の抗体で標識されてもよく、この抗体は、共有結合した蛍光標識を有してもよい。次いで、サンプル中のＣＴＣの数及び特性化を決定するために分析を行うことができ、この測定値から、初期血液サンプル中に存在するＣＴＣの数を決定することができる。ＣＴＣの数は、細胞数測定検出または顕微鏡技法によって決定され、ＣＴＣを可視的に定量化かつ特性化することができる。

様々な態様では、対象のＣＴＣの数の分析及び特性化は、対象の進行及び病理を評価するために、様々な間隔で特定の時間的経過にわたって行われてもよい。例えば、ＣＴＣのレベル及び特性化を時間の関数として追跡するために、分析は１日間、２日間、３日間、１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、または１年間などの規則的な間隔で行われてもよい。既存の癌患者の場合、これは疾患の進行の有用な指標を提供し、医療実施者がＣＴＣにおける増加、減少、または無変化に基づいて、適切な治療的選択を行うことを補助する。ＣＴＣにおける、経時的な２倍、５倍、１０倍またはそれ以上のいかなる増加も、患者の予後を低下させ、患者が治療を変更するべきであるとの早期指標である。同様に、２倍、５倍、１０倍またはそれ以上のいかなる増加も、患者が、予後及び治療に対する応答をさらに評価するために、画像診断法などのさらなる検査を受けるべきであることを示している。ＣＴＣにおける、経時的な２倍、５倍、１０倍またはそれ以上のいかなる減少も、疾患の安定化及び患者の治療への応答を示し、治療を変更する必要がないことの指標である。癌発生のリスクがある人については、検出されたＣＴＣの数における急激な増加は、患者が腫瘍を発現しており、したがって早期診断を提供することの早期警告を提供することができる。一実施形態では、ＣＴＣの検出は、癌の病期分類を向上させる。

本明細書に提供される方法のいずれかにおいて、ＣＴＣを特性化し、さらなる臨床的評価を提供するために、追加の分析が行われてもよい。例えば、画像分析及びバルク数測定に加えて、ＣＴＣが起源を発する腫瘍の型、転移状態、及び悪性の程度などの情報を得るために特定の癌マーカーに特異的なプライマーとの多重化などのＰＣＲ技術が使用されてもよい。さらに、細胞サイズ、ＤＮＡまたはＲＮＡ分析、プロテオーム解析、もしくはメタボローム解析が、患者の癌の特性化に関する追加の情報を評価する上での尺度として実施されてもよい。

例えば、追加の分析は、特定の治療計画に対する対象の応答性の決定を行うために、または癌の治療における候補薬剤の有効性を決定するために、十分なデータを提供し得る。したがって、本発明は、本明細書に記載される対象のＣＴＣを検出／単離し、該ＣＴＣを分析することによって、特定の治療計画に対する対象の応答性の決定をするための、または癌の治療における候補作用物質の有効性を決定するための方法を提供する。例えば、一旦薬剤治療が患者に施されると、本発明の方法を使用して、薬剤治療の有効性を決定することが可能である。例えば、薬剤治療前に患者から採取されたサンプル、ならびに薬剤治療と同時にまたは薬剤治療に引き続いて患者から採取された１つ以上の細胞サンプルが、本発明の方法を用いて処理され得る。それぞれの処理されたサンプルの分析の結果を比較することによって、薬剤治療の有効性または患者の薬剤に対する応答性を決定することができる。このようにして、無効な化合物の早期発見を行うことが可能であり、または有望な化合物の早期検証を行うことが可能である。
ＩＩＩ．疾患の治療

本発明の特定の態様は、循環腫瘍細胞に関連付けられる疾患または障害を予防しまたは治療するために使用され得る。ＣＲＣの転移力は、ＣＴＣの増殖及び組織のコロニー形成を防止するための任意の好適な薬剤によって低減され得る。好ましくは、こうした物質は、抗細胞表面ビメンチン抗体を含むであろう。

「治療」及び「治療する」は、対象への治療薬の投与または適用、もしくは疾患または健康に関連する状態の治療上の利益を得る目的のための対象への処置または治療形態の実行を指す。例えば、治療は、ＣＴＣの増殖及び組織のコロニー形成を阻害する抗体の薬学的有効量の投与を含み得る。

本出願全体を通して使用される用語「治療上の利益」または「治療的に有効」とは、対象の健康状態をこの状態の医療に関して促進しまたは増強するいかなるものも指す。これらは、疾患の徴候または症状の頻度または重症性における減少が含まれるが、これらに限定されない。例えば、癌の治療は、例えば、腫瘍の浸潤性における減少、癌の増殖速度における減少、または転移の予防を伴い得る。癌の治療はまた、癌を有する対象の生存期間の延長を指してもよい。
Ａ．薬学的調製物

抗細胞表面ビメンチン抗体を含有する治療用組成物の臨床用途が実施される場合、一般的に、意図される用途に適切な薬学的または治療用組成物を調製することが有益となる。特定の実施形態では、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態では、活性化合物は、約２重量％〜約７５重量％の、例えば約２５％〜約６０％、またはこの中で誘導可能な任意の範囲の単位を含んでもよい。

本発明の治療用組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能な組成物の形態で好都合に投与され、注射前に液体溶液、または液体懸濁液にするのに好適な固形形態も調製されてもよい。これらの調製物は、乳化されてもよい。

フレーズ「薬学的にまたは薬理的に許容し得る」とは、適切な方法でヒトなどの動物に投与される際に、有害反応、アレルギー反応、または他の不必要な反応を生成することがない分子実体及び組成物を指す。抗体または追加の活性成分を含む薬学的組成物の調製は、本開示を考慮すれば、当業者に知るところとなろう。さらに、動物（例えば、ヒト）の投与については、ＦＤＡ事務所の生物学的標準によって要求される無菌、発熱原性、一般的安全性、及び純度標準に適合するべきであることが理解されよう。

本明細書で使用される「薬学的に許容し得る担体」は、当業者に既知であるように、任意の及び全ての水性溶媒（例えば、水、アルコール性／水性溶液、生理食塩溶液、塩化ナトリウムなどの非経口ビヒクル、リンガー溶液等）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル等）、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗細菌剤または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬剤、薬剤安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、風味剤、染料、流体及び栄養補充物、これらの類似の材料及びこれらの組み合わせを含む。薬学的組成物中の種々の成分のｐＨ及び正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。薬学的に許容し得る担体は、特にヒトへの投与のために製剤化されるが、特定の実施形態では、非ヒト動物への投与のために製剤化されるが、しかしヒトへの投与には許容し得ない（例えば、政府の規制のために）薬学的に許容し得る担体を使用することが望ましい場合がある。いかなる慣用の担体も活性成分と不適合でない限り、治療用組成物または薬学的組成物に使用することが企図される。

用語「単位用量」または「投与量」は、対象において使用するために好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち、適切な経路及び治療計画に関連付けて上述の所望の応答を起こすよう計算された治療用組成物の所定の量を含有する。治療の回数及び単位用量の両方に従う投与される量は、所望の効果に依存する。患者または対象に投与される本発明の組成物の実際の投与量は、対象の体重、年齢、健康状態、及び性別、治療される疾患の種類、疾患の侵入の程度、以前または同時的な治療的介入、患者の突発性疾患、投与の経路、ならびに特定の治療用物質の効力、安定性、及び毒性などの物理的ならびに生理学的因子によって決定され得る。例えば、用量はまた、１回の投与当たり約１μｇ／ｋｇ／体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重（このような範囲は、介在する用量を含む）またはそれ以上、及びその中で誘導可能な任意の範囲を含むことができる。本明細書に列挙した数字からの誘導可能な範囲の非限定的な例では、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重の範囲、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ／体重の範囲等が投与され得る。投与を担当する施術医は、いずれにしても、組成物中の活性成分（複数可）の濃度及び個々の対象に適切な用量（複数可）を決定するであろう。

活性化合物は、非経口投与用に製剤化され得、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、またはさらには腹腔内経路を介する注射用に製剤化され得る。典型的には、こうした組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製することができ、また、注射に先立って液体の添加時に溶液または懸濁液を調製するよう使用するために好適な固形形態を調製することができ、この調製物はまた乳化され得る。

注射可能な用途に好適な製剤の形態としては、無菌の水溶液または分散液、ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含む製剤、ならびに無菌注射可能溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末が含まれる。全ての場合で、この形態は無菌であらねばならず、これが容易に注射可能な程度に流体でなければならない。これはまた、製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌または真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されねばならない。

タンパク質性組成物は、中性または塩形態に製剤化されてもよい。薬学的に許容し得る塩としては、酸添加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が含まれ、これは、例えば塩酸またはリン酸などの無機酸で、もしくは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデリン酸等の有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩もまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導され得る。

薬学的組成物は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体プロピレングリコール等）、これらの好適な混合物、ならびに植物油を含有する溶媒、または分散媒体を含むことができる。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合、必要とされる粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって、適切な流動性が維持され得る。微生物の作用の抑制は、種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中の使用によってもたらされ得る。
Ｂ．併用治療

特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、二次療法または追加の療法と組み合わせて、ＣＴＣに選択的に結合するために、細胞表面ビメンチンに対する抗体または抗体断片を伴う。こうした療法は、ＣＴＣに関連付けられる任意の疾患の治療において適用することができる。

併用療法を含む方法及び組成物は、治療的または保護的効果を増強し、及び／または別の抗癌療法または抗過剰増殖性疾患療法の治療的効果を増加させる。治療法ならびに予防法及び組成物は、ＣＴＣの殺傷及び／または転移の予防などの所望の効果を達成するために有効な組み合わされた量で提供され得る。このプロセスは、細胞を抗体もしくは抗体断片及び二次療法の両方と接触させることを伴い得る。組織、腫瘍、または細胞は、作用物質（すなわち、抗体もしくは抗体断片または抗癌剤）のうちの１つ以上を含む、１つ以上の組成物または薬理学的製剤と接触させることができ、組織、腫瘍、及び／または細胞を２つまたはそれ以上の別個の組成物または製剤と接触させることも可能で、この一方の組成物は、１）抗体または抗体断片、２）抗癌剤、もしくは３）抗体または抗体断片と抗癌剤の両方を提供する。また、こうした併用療法が化学療法、放射線療法、外科的療法、または免疫療法と併せて使用され得ることも企図される。

用語「接触させる」及び「曝露させる」は、細胞に適用されるときに、治療的構築物及び化学療法剤または放射線療法剤が標的細胞に送達されるか、もしくは標的細胞と直接並置して配置される処理を説明するために本明細書で使用される。細胞殺傷を達成するために、例えば、両方の作用物質が、細胞を殺傷し、または細胞が分裂することを防止するために有効な組み合わせた量で、細胞に送達される。

抗細胞表面ビメンチン抗体は、抗癌治療の前に、抗癌治療中に、抗癌治療後に、または抗癌治療に対して種々の組み合わせで、投与されてもよい。投与は、同時的から数分、数日、数週間に至る範囲の間隔で行われてもよい。抗体または抗体断片が、抗癌剤とは別個に患者に提供される実施形態では、通常、かなりの長時間の送達によって各々の送達の間に有効期限が切れてしまわないことを保証することで、２つの化合物は、有利に組み合わされた効果をなおいっそう患者に及ぼすことができる。こうした例では、抗体療法と抗癌療法を互いに対して約１２〜２４時間または７２時間以内に、より具体的には互いに対して約６〜１２時間以内に患者に提供し得ることが企図される。いくつかの状況では、それぞれの投与の間に、数日間（２、３、４、５、６、または７日間）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）が経過する状態で、治療のための期間をかなり延長させることが望ましい場合がある。

特定の実施形態では、治療のコースは、１〜９０日間またはそれ以上（このような範囲は介在する数日間を含む）続くであろう。１つの作用物質が１日目から９０日目（このような範囲は介在する数日間を含む）のいかなる日にも、またはこれらの日の任意の組み合わせで投与されてもよく、もしくは別の作用物質が１日目から９０日目（このような範囲は介在する数日間を含む）のいかなる日にも、またはこれらの日の任意の組み合わせで投与されることが企図される。一日以内（２４時間の期間）に、患者は作用物質（複数可）の１回または複数回投与を受けてもよい。さらには、治療のコース後に、抗癌治療が施されない期間があることが考えられる。この期間は、例えば、患者の予後、耐久力、健康状態等の患者の状態に応じて、１〜７日間、及び／または１〜５週間、及び／または１〜１２ヶ月間またはそれ以上（このような範囲は介在する数日間を含む）続いてもよい。治療周期は、必要に応じて繰り返されるであろう。

種々の組み合わせが使用され得る。例えば、以下で、抗体療法は「Ａ」であり、抗癌療法は「Ｂ」である。

本発明の任意の化合物または療法の患者への投与は、もしあるなら、作用物質の毒性を考慮して、こうした化合物の投与のための一般的プロトコルに従うであろう。したがって、いくつかの実施形態では、併用療法に寄与し得る毒性をモニタリングするステップがある。

ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を裏付けるために含まれる。以下に続く実施例において開示された技術は、本発明の実行において良好に機能するように本発明者によって発見された技術を表し、したがって、その好適な実行のモードを構成すると考えられ得ることを、当業者に理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、多くの変更が開示される特定の実施形態においてなされるが、それでも同様なまたは類似する結果を得ることができることを理解するべきである。
実施例１−材料及び方法

細胞株。ＤＬＤ−１、ＧＥＯ、及びＨＵＶＥＣ細胞をＬｅｅ Ｅｌｌｉｓ博士（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｍｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）から賜った。ＬＭ７、ＳＡＯＳ−２、Ｋ７、Ｋ７Ｍ３、ＬＭ−８、及びＤＵＮＮ細胞は、Ｅｕｇｅｎｉｅ Ｓ Ｋｌｅｉｎｅｒｍａｎ博士（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｍｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）により提供していただいた。ＨＯＳ、ＭＧ−２６３、ＯＳ−Ｄ、ＯＳ−Ｏ、及びＯＳ−２５細胞は、Ｄｅｎｎｉｓ Ｈｕｇｈｅｓ博士（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）により提供していただいた。ＳＮＵ３９８、ＨＥＰ３Ｂ、及びＳＮＵ ４４９細胞は、Ｌｏｐａ Ｍｉｓｈｒａ博士（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）により提供していただいた。ＳＫＮＡＳ、ＳＫＮＢＥ２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＮＧＰ、ＣＨＰ１３４、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＬＡＮ５、及びＫＣＮ細胞は、Ｐａｔｒｉｃｋ Ｚｗｅｉｄｌｅｒ−ＭｃＫａｙ博士（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）により提供していただいた。本研究で使用した全ての他の細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から得た。骨肉腫患者からの一次細胞培養物は、Ｄｉｎａ Ｌｅｖ博士（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）により提供していただいた。全ての細胞株は、ＡＴＣＣ推奨基準に従って増殖した。特定の推奨基準を有さない細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％のＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び０．１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で増殖させた。全ての細胞は、指定がない限り、５％のＣＯ_２のインキュベータ内で３７℃にて維持した。ヒトの結腸癌、肝臓癌、肺癌、及び骨癌から得た一次培養物は、１０％の熱不活性化ＦＢＳ、１％のＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍＬのプリモシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び０．１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中で培養した。

８４−１抗体を用いて単離されたＣＴＣを、１０％の熱不活性化血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含み、増殖因子が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中、フィブロネクチン被覆プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上で培養した。骨肉腫患者から得たＣＴＣは、１０ｎｇ／ｍＬのヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及びインスリン増殖因子（ｈＩＧＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充して培養した。結腸癌及び肝臓癌患者から単離されたＣＴＣは、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦ、ＩＧＦ、及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈＦＧＦ２）を補充して培養した。イヌ及びマウス血液から単離されたＣＴＣは、上皮、インスリン、及び線維芽細胞増殖因子（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を含む上述の培地中で培養した。培地は、４日毎に１回交換した。全ての細胞は、５％のＣＯ_２のインキュベータ内で３７℃にて維持した。

Ｇｅｌｔｒｅｘ薄層法。ＨＰＣ−１細胞を、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍から精製された基底膜の可溶性型であり、３７℃でゲル化し、細胞の培養物に対してマトリックスを提供する再構成された基底膜を形成する、Ｇｅｌｔｒｅｘ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で増殖させた。Ｇｅｌｔｒｅｘの主成分は、種々の増殖因子及びラミニン、コラーゲンＩＶ、エンタクチンを含む。製造業者の推奨に従って、Ｇｅｌｔｒｅｘを氷上で融解し、細胞を平板培養する１時間前に、１００μＬのＧｅｌｔｒｅｘを用いて、Ｌａｂ Ｔｅｋチャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ）をコーティングした。その後、２％のＧｅｌｔｒｅｘを含む冷無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地１００μＬ中の１０００個のＨＰＣ−１細胞を、薄いゲルコーティングを備えたチャンバースライド上で平板培養した。細胞を、大気中、５％のＣＯ_２の加湿した雰囲気において、３７℃で増殖させて、顕微鏡を通して、スフェアの形成を観察した。

血液採集及び処理。マウスサンプルについては、顎下頬出血法を用いて、所定の時間で、血液をマウスから採集し、毎週の追跡治験中に、２００μＬの血液をＥＤＴＡチューブ（Ｆｉｓｈｅｒ）内に採集した。試験終了時に、左心室穿刺法を用いて、少なくとも８００μＬの血液を採集した。次いで採集された血液を、製造業者の推奨に従って、ＲＢＣ溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＲＢＣ溶解にかけた。その後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、さらなる分析のために使用した。

ＣＴＣ分析のためのヒト血液サンプルを、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒにおいてＩＲＢプロトコルに従って、インフォームドコンセントを得た後に取得した。最大で８ｍＬの血液を、ＣＰＴバキュテーナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、任意の所定の採血で得た。健常者の血液サンプルは、Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒから得た。単一の有核細胞を製造業者の推奨に従って単離した。その後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、さらなる分析のために用いた。

イヌの血液サンプルは、Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙクリニックから得た。Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙクリニックで指示された個人所有のイヌを、本試験用に選択した。組織学的に確認された新生物疾患を有することを除いて、選択基準は、顕在性の心臓、腎臓、または他の生命を脅かす疾患が認められないことを含んだ。イヌを、全体的な既往歴、理学検査所見、完全な血液細胞計数、血清の生化学プロファイル、尿検査、心電図、胸部Ｘ線検査（三次元ビューの転移チェック）、及び必要な場合、腹部超音波検査を得ることによって、病期分類した。腫瘍型の確認については、原発腫瘍からの切除生検を、麻酔下で外科的に得て、１０％の中性緩衝ホルマリン中に配置した。固定した後に、組織を切断し、パラフィンに埋包し、断面を作り、スライドガラスに接着させて、ヘマトキシリン及びエオシンにより染色し、カバーガラスで覆い、公認獣医病理学者により評価した。

抗体生成。６−Ｈｉｓを含む組換えヒトビメンチン（ｒｈＶｉｍ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、抗体生成のための抗原として用いた。抗ビメンチン力価を、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した。簡単に言うと、ｒｈＶｉｍを、ＥＬＩＳＡにおいて固相抗原として用いた。２倍段階希釈した血清を、ｒｈＶｉｍで被覆したＥＬＩＳＡウェル中で２時間インキュベートした。洗浄、及びペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体とのインキュベーション後に、着色反応を行い、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）で分析した。より低い希釈でより高いＯ．Ｄ．を示した抗体は、さらなるスクリーニングにかけるとみなされた。スクリーニング用に選択された抗体を、細胞表面上のビメンチンの有無で骨肉腫細胞と共にインキュベートした。ＣＳＶに対して非常に高い親和性を有する抗体を選択し、さらなる分析を行った。８４−１は、細胞表面ビメンチンを高親和性及び高感度で検出するために利用可能な最適なクローンである。次いで、この抗体を、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、免疫細胞化学法、及び免疫組織化学法によって、ビメンチン結合についてさらに特性化した。抗体１２−１もまた、ＣＴＣの検出及び単離について特性化した。

８４−１陽性細胞の選択。先ず初めに、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ４５
Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造業者の推奨に従って用いて、ＣＤ４５陽性細胞を除去した。次に、ＣＤ４５−ｖｅ細胞フラクションを、８４−１陽性選択にかけた。簡単に言うと、細胞を８４−１抗体で標識し、その後マウスＩｇＧ結合マイクロビーズを、この混合物に添加した。次いで、８４−１＋ｖｅ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃからの磁性カラムを用いて抽出した。このように得られた細胞は、８４−１陽性及びＣＤ４５陰性であり、さらなる分析に使える状態である。

フローサイトメトリー。５０万個の細胞をトリプシン化によって取り出し、洗浄し、暗所において氷上で２０分間染色した。ＣＳＶ分析については、細胞を８４−１ｍＡｂ（１：１００）で染色し、イソタイプ対照（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）として、マウス一次抗体を用いた。その後、細胞をＰＢＳ中で２回濯ぎ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４０５、−４８８、及び−５５５二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて二次抗体について標識した。次いで細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いての即時のデータ取得のために用いた。分析用に１０〜５０，０００個の細胞を計数した。その後、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を用いて、データを分析した。平均蛍光強度を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって提供されるアルゴリズムを用いて測定し、その後、表面上のＣＳＶの存在について評価した。あるいは、ＲＢＣ溶解後に得られた細胞を、ＣＳＶに対する８４−１抗体及びＣＤ４５抗体を用いて二重染色にかけた。サンプルを、抗体捕捉Ａｂｃビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて補正した。所定サンプル中のＣＴＣを計数するために、点のプロットを、ＣＳＶ陽性ゲーティング及びＣＤ４５陰性ゲーティングでプロットした。イソタイプ対照を利用して、未染色かつ非特異的染色細胞をゲートした。細胞集団全体を、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーターを用いてＣＴＣについて分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。

顕微鏡画像の取得及び分析。チャンバー当たり合計で５，０００個の細胞を、上述のように、Ｌａｂ−Ｔｅｋ ８−ウェル ｐｅｒｍａｎｏｘチャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）上で増殖させた。細胞表面染色については、細胞を４％のパラホルムアルデヒドを用いて１５分間固定し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１時間ブロックし、対応の一次抗体（１：１００）で４℃にて一晩標識した。その後、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、対応の一次抗体に対して、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−４８８、及び−５５５二次抗体（１：２５０）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色した。

核染色については、ＤＲＡＱ５（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）（１：５００）を、二次抗体と共に６０分間組み込んだ。ＷＧＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１：１０００で５分間、細胞表面を染色するために用いた。次いで、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で（３×１５分）洗浄し、Ｓｌｏｗｆａｄｅ ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に装着した。細胞内染色については、細胞を上述の通りに固定し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）／０．２％ＮＰ４０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で２０分間透過性にした。ブロッキング、一次、及び二次抗体のインキュベーションならびに装着化は、上述の通りである。３Ｄ培養スフェアの染色については、上記の細胞外及び細胞内染色法を、一次抗体では３６時間の、二次抗体では４時間の修正されたインキュベーション時間で利用した。

細胞のインビボ標識付については、ＲＢＣ溶解後に得られた総細胞混合物を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で２回洗浄し、８４−１抗体を用いて氷上で２０分間標識し、次いで染色された細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で２回洗浄し、８４−１に対する二次抗体Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−４８８について２０分間染色し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で２回洗浄した後に、細胞を培養皿上で平板培養し、Ｅｐｉ蛍光倒立顕微鏡下でＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ−４８８陽性細胞を視覚化し、供給されたソフトウェアを用いて顕微鏡写真を取得した。高強度の緑色蛍光細胞のみがこの分析用に検討された。このアッセイの感度を、細胞スパイキングアッセイによって確認した。生細胞画像診断については、光漂白及び光毒性を最小限に抑えるために、レーザー強度を、画像を取得するのに必要とされる最小値に保持した。あるいは、ＣＤ４５除去後に、細胞を、８４−１及びＣＤ４５（ＡｂＣＡＭ）について、対応する抗体を用いて染色し、Ｃｙｔｏｆｕｇｅ（Ｉｒｉｓ）を用いてスライドガラス上で平板培養し、共焦点顕微鏡を用いて８４−１＋及びＣＤ４５−細胞について分析した。

共焦点分析については、ＬＳＭ ５ ３．２画像捕捉器及び分析ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いて、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０共焦点顕微鏡で８ビットにおいて取得した。画像所得のために、６３倍の水浸型対物レンズ（ＮＡ、１．０）をデジタルズームと共に利用した。異なるサンプル間の免疫反応性の相対的レベルの量的な比較を可能にするために、同一のユーザーが同一の強度及び光検出器ゲインを使用することによって全ての画像を取得した。

スパイキングアッセイ。８４−１抗体による捕捉精度及び再現性を立証するために、培養された細胞を純粋なマウスから採集した血液中にスパイクした。精度の立証のために、約５、約２５、及び約５０個のＫ７Ｍ３、Ｋ７、ＬＭ８、及びＤＵＮＮを１ｍＬの全血に三通りでスパイクした。細胞計数については、細胞を培養基中で採取し、次いで、必要な計数まで段階希釈し、次いでこれを顕微鏡下で一連の５μＬのスポットで確認した。より少数／より多数の細胞が観察される状況では、計算を行い、混合して、スパイクするのに要求される細胞の必要な計数を得た。スパイキング実験を三通り行い、この方法の感度及び特異性を明確にした。陰性対照については、ＣＳＶ陰性細胞を血液中にスパイクし、陽性選択に関して分析した。

突然変異分析。少数のＣＴＣ細胞または単一細胞からの全ゲノム増幅を、ＲＥＰＬＩ−ｇ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて行った。簡単に言うと、４μｌのＰＢＳ中の細胞材料を、微小遠心管内で３μｌのＢｕｆｆｅｒ Ｄ２を添加することによって溶解させ、６５℃で１０分間インキュベートした。全ゲノム増幅を、製造業者の推奨に従って同じ管内で行った。得られたＤＮＡを、異なる染色体上のプライマーを用いるＰＣＲによって品質についてテストした。増幅されたＤＮＡの分取物を、１：１０に希釈し、その後ＰＣＲ分析用に用いた。遺伝子突然変異の検出については、Ｑ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて特異的突然変異部位に対する特異的遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ生成物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、ＭＤＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）によりサンガー配列決定した。

マーカー分析。特異的マーカーに対する抗体を、各タイプの癌、ＣＤ９９（Ａｂｃａｍ）、α−ＳＭＡ（Ａｂｃａｍ）、ＣＤ−３１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＥｐＣＡＭ、Ｓｌｕｇ、Ｅ−カドヘリン、β−カテニン、ｃ−ｍｙｃ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対して用いた。

ウェスタンブロット法及び免疫沈降法。組換えヒトビメンチン（ｒｈＶｉｍ）（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、３つの異なるレーンに充填し（１、１０、及び１０００ｎｇ）、ＳＤＳゲルを用いて分離し、二フッ化ポリピロリデン膜上に移した。ｒｈＶｉｍの検出を、８４−１抗体（１：１０００）を用いる膜のインキュベーションによって行った。二次ヤギ抗マウスＩｇＧ：ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて８４−１抗体を検出した。免疫沈降法については、ＬＭ７細胞を、免疫沈降緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて溶解させ、８４−１及び１２−１抗体を用いてビメンチンを免疫沈降させた。マウスＩｇＧを、対照抗体として用いた。免疫沈降物を、ウサギモノクローナル抗ビメンチン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いてブロットした。

オルトバナジウム酸ナトリウム処理。８−ウェルチャンバースライド上で平板培養したＬＭ８細胞及び懸濁液中のＷＢＣを、オルトバナジウム酸ナトリウム（ＳＯＶ）（１００μＭ）または対照としてのＰＢＳに曝露した。１８時間のインキュベーション後に、細胞外染色のための上述した方法を用いて、次に細胞を免疫蛍光染色用に処理した。フローサイトメトリー検出法については、６ウェルプレート中の細胞を、ＳＯＶ（１００μＭ）または対照としてのＰＢＳで処理した。一晩のインキュベーションの後に、細胞を、上述の通りにフローサイトメトリー分析用に処理した。ヒト血液検体については、ＣＰＴチューブから得られた単核化細胞を、ＳＯＶ（１００μＭ）または対照としてのＰＢＳで１５分間処理した。次いで細胞を、細胞外染色法を用いて、免疫蛍光染色に直接曝露した。

動物試験。５匹の６〜８週齢のＣ３Ｈ及びＢａｌｂ／ｃ（ＮＣＩ）マウスを、ＮＩＨガイドラインに従って維持した。全ての動物のプロトコルは、テキサス大学のＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒの動物管理使用委員会によって確認された後承認されている。マウスを施設必要条件に従って収容した。ＬＭ８及びＣＴ−２６癌細胞株をインビボ接種用に用いて、１０％のＦＢＳ及び０．１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２中で維持した。集密状態のＣＴ−２６及びＬＭ８細胞を培養プレートから分離し、１×１０^５個の細胞を、骨内（ｉ．ｏ．）接種のために１５μＬのＰＢＳ中に懸濁させた。２７ゲージ、^１／_２インチの注射針のインスリン用シリンジ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を右脛骨に直接挿入し、次いでプランジャーをシリンジに押し付けることによって、骨内接種を行った。腫瘍体積を、上述のように採血によって毎週測定した。最小侵襲的方法である、顎下出血法を用いて、マウスから繰り返し血液を採集した。この方法を利用して、２００μＬの血液サンプルをＣＴＣの分析用に採集した。上皮または間葉細胞は、腫瘍の存在に関わりなく、これらの血液サンプル中では検出不能であった。アッセイ及び採血の経路の最適化の後に、ＬＭ８及びＣＴ−２６細胞で移植されたマウス中のＣＴＣを計数した。
実施例２−細胞表面ビメンチン、新規ユニバーサル循環腫瘍細胞マーカー

ビメンチンの過発現は、細胞が上皮から間葉表現型への移行を介して増加性の浸潤性及び転移力を獲得するプロセスである、ＥＭＴとの関連頻度が高い（Ｓａｔｅｌｌｉ及びＬｉ、２０１１によって検討）。癌患者から単離されたＣＴＣの単一細胞プロファイリングは、樹立細胞株と比較するときに、ビメンチン転写物の過発現を示し（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、これらのＣＴＣ中のＥＭＴ表現型の可能性を示唆しているが、白血球細胞（ＷＢＣ）の大部分を含む正常な間葉細胞中のビメンチンの細胞内発現は、このＣＴＣマーカーとしての利用能を制限している。本発明者のグループを含めるいくつかのグループは、癌細胞の表面上のビメンチンの検出を以前に報告している（Ｓａｔｅｌｌｉ ａｎｄ Ｌｉ，２０１１、Ｃｕｔｒｅｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｈｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００６）。細胞内ビメンチンとは異なり、細胞表面ビメンチン（ＣＳＶ）の発現は、主として癌細胞に関連し、上皮及び間葉癌の両方で見出された。したがって、本発明者は、ＣＳＶがＣＴＣに対する潜在的マーカーとしての機能を果たすという仮説を提唱した。しかしながら、ＣＳＶ結合ペプチドの制限及びＣＳＶに特異的に結合する市販の抗体の非可用性のために（図４Ａ）、本発明者は、ＣＳＶ特異的モノクローナル抗体を生成することを目指した。この観点において、本発明者は、正常細胞を除外しながら、癌細胞のみに結合するＣＳＶ特異的抗体を単離するための戦略を設計した（図１Ａ）。簡単に言うと、多数のハイブリドーマクローンを、完全長ヒトビメンチン（ＮＣＢＩ：ＮＰ＿００３３７１．２）に対して生成し、骨肉腫（ＬＭ７）細胞株上のＣＳＶを標的化することによって、フローサイトメトリーを利用して、抗体をＣＳＶ結合についてスクリーニングし、これは、ＣＳＶ特異的ペプチドに対して肯定的な結合を示した（図４Ｂ）。ネガティブな結合については、正常細胞株ＨＦＯＢ及びＮＣＭ−３５６を利用した。この戦略を利用して、本発明者は、ビメンチンに特異的に結合したハイブリドーマ８４−１から、モノクローナル抗体（表７）、またはそれらの細胞表面ビメンチン結合断片を同定した。８４−１のビメンチンに対する特異性は、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、及び免疫蛍光法を用いてさらに確認された（図４Ｃ、Ｄ、及びＥ）。

異なる上皮、非上皮癌、及び正常細胞株の細胞表面スクリーニングは、癌細胞の表面上のみにビメンチンが存在することを示した（図１Ａ及びＢ）。重要なことに、マクロファージ、内皮細胞、好中球、血小板、及びアポトーシスＴリンパ球は、ＣＳＶを発現することがこれまでに報告されているが（Ｍｏｉｓａｎ及びＧｉｒａｒｄ，２００６、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｍｏｒ−Ｖａｋｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）、この発現は、８４−１によってほとんど検出不可能であり（図５Ａ）、８４−１の癌ＣＳＶに対する特異性を示している。

本発明者は、乳房、膀胱、脳、結腸、肝臓、肺、膵臓、皮膚組織、及び血液に源を発する様々な癌細胞株をテストし、これはＣＳＶ発現を有する細胞の明確な集団を示している（表１）。ヒトの肝臓の転移性細胞（ＨＬＭ−３）の免疫細胞化学分析は、細胞表面マーカー小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）と同時局在化する細胞の表面上のビメンチンの存在を示していて（図１Ｄ）、これは正常な結腸上皮細胞（ＮＣＭ−３５６）においては検出不可能である。これらの細胞の透過性化は、ＨＬＭ−３細胞中でのみ細胞質ビメンチンの存在を示したが、ＮＣＭ−３５６細胞は、ネガティブであった（図５Ｂ）。ヒト骨肉腫患者サンプルから生成した原発性癌細胞株の分析（図５Ｃ）は、転移性細胞株中でＣＳＶの発現を示すが、一方原発性細胞株はネガティブであった（表２）。ヒト結腸及び転移性肝臓（結腸からの転移）組織から単離され癌細胞のＣＳＶについてのさらなる分析は、原発性結腸癌細胞サンプルと比べて肝臓転移性サンプル中の非常に高い発現を示し（図１Ｅ及び５Ｄ）、これは、ＣＳＶが転移性癌細胞に対する潜在的バイオマーカーとして機能を果たし得ることを示唆している。しかしながら、原発性結腸癌細胞は、ＣＳＶのより低い発現を有する細胞のサブタイプを示し、これらの細胞が、遠隔臓器に拡散するために、血液循環に流れ込んでいる浸潤性／転移性表現型の細胞である可能性がある。この仮説は、３Ｄスフェアモデルにおけるスフェアの周囲におけるＣＳＶ陽性細胞の存在によって支持され（図１Ｆ）、これらの細胞がより攻撃的かつ浸潤性表現型の細胞である可能性を示唆し、このことは、これらの細胞の浸潤性表現型を表すβ−カテニンの核蓄積の増加によって支持される（Ｂｒａｂｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００５）（図５Ｅ）。

上皮及び非上皮起源の様々な癌細胞株中のＣＳＶの検出に基づいて、本発明者は、ＣＳＶがＣＴＣを検出するためのバイオマーカーとしての機能を果たし得るという仮説を提唱した。この仮説をテストするために、本発明者は、十分に特性化されたマウス転移性ＬＭ８細胞の検出をテストし、このＬＭ８細胞を、７．５ｍＬの血液中にスパイクし、８４−１抗体を用いて免疫蛍光染色にかけた（図２Ａの概略的表現）。顕微鏡写真から、蛍光顕微鏡法を利用して、単一細胞が全血中で検出可能であることが明らかである（図２Ｂ）。８４−１抱合ビーズを用いる磁性分離を利用して、本発明者は、全血から単一細胞を単離し（図２Ｃ）、これを培養皿で可視化することができ、これは生細胞の単離を示唆している。さらに、単離された細胞を、共焦点画像診断法を用いてさらに特性化し、核のサイズ（＞８μｍ）及びＣＳＶについての陽性染色ならびにＣＤ４５、白血球マーカーについての陰性染色に基づいて癌細胞であることを確認した（図２Ｄ）。稀な例において、本発明者は、腫瘍細胞と免疫細胞との間の相互作用の観察を行った（図６Ａ）。本発明者は、８４−１染色に対して陽性であるＨＬＭ３及びＬＭ７細胞を用いて、８４−１抗体の感度及び特異性をさらに評価した（表５）。この結果は、この抗体のＣＴＣ検出における非常に高い感度及び約１００％の特異性を示した。追加のスパイキングアッセイを、別の単離された細胞表面ビメンチン結合抗体、１２−１を用いて行った（表６）。この結果は、この抗体のＣＴＣ検出における非常に高い特異性及び約４０％の感度を示した。さらには、１２−１抗体を用いるＬＭ７細胞抽出物を、１２−１抗体及びＤＲＡＱ５（核染色）を使用して、細胞表面ビメンチンについて染色した（図８）。

８４−１を用いて行ったスパイキングアッセイは、本発明者がＬＭ８骨肉腫細胞を非上皮モデルに、ＣＴ２６結腸腺癌細胞を上皮モデルに利用したインビボ試験によってさらに確証された。これらのマウスは、所定の期間にわたってＣＴＣにおける変化について監視され（図６Ｂ及びＣ）、試験の終了時に、細胞を単離し、培養皿内で培養し（図６Ｄ）、ＣＳＶ＋、ＣＤ４５−、及び大きな核を確認した（図６Ｅ）。本発明者はまた、ｐ５３突然変異型マウスの自発性腫瘍モデルを利用し、所定の期間にわたって自発的に発現する、腫瘍中の異なる型のＣＴＣの存在を示した（表４）。さらに、本発明者は自発性腫瘍を有するイヌの血液中のＣＴＣについてテストし、興味深いことに、８４−１は、このモデルにおいてＣＴＣを検出することができ、このことは、ＣＤ４５陰性ならびにＣＳＶ陽性によって、及び核のサイズに基づいて確認された（図６Ｆ）。

８４−１抗体がスパイクされた細胞及び血中のＣＴＣを高い特異性で検出したために、本発明者は、健康なボランティア、骨肉腫を含む非上皮癌、平滑筋肉腫、多形肉腫、未確認多形肉腫（ＵＰＳ）及び結腸癌ならびに肝臓癌を含む上皮癌からのヒト血液サンプルを、蛍光画像診断法を用いてＣＴＣについてテストし（表３）、ＣＴＣの同定を成功裏に行った。健常者の血液サンプルでは、ＣＴＣは検出不可能であった。全体として、ＣＴＣ計数における増加は、原発性癌サンプルと比べて転移性癌患者サンプルで観察され、これは、高度に転移性のＣＴＣの可能な検出を示している（図２Ｅ）。結腸癌患者からのＣＴＣも、８４−１＋ＣＤ４５−細胞の磁性分離の前に、蛍光顕微鏡下で可視化された（図７Ａ）。磁性ビーズを用いて単離された８４−１＋ＣＤ４５−細胞は、数週間ほど生存しために、これらをＦＩＳＨ及び突然変異アッセイを用いてさらに分析することを可能にし、これによって、それら細胞のアイデンティティを癌細胞として確認した（図７Ｂ）。単一細胞を、突然変異分析によって、腫瘍表現型について特性化した。この分析については、結腸癌患者から単離されたＣＴＣを用いた。ＣＴＣ中のＫＲＡＳ（ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）についての突然変異分析は、ＣＴＣが、コドン１３上にＫＲＡＳ突然変異を特異的に有するが、一方単離されたＣＤ４５＋細胞が、野生型のＫＲＡＳ遺伝子を有する対照として用いられることを示した（図３Ａ）。原発性腫瘍はコドン１２上にＫＲＡＳ突然変異を有したが、ＣＴＣはコドン１３上の突然変異に対して陽性であるとテストされたことは興味深い。以前の研究は、同一の患者から単離されたＣＴＣ中のＫＲＡＳ突然変異の検出における不均一性を報告している（Ｇａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。さらに、ＫＲＡＳの状態に依存する転移性結腸直腸癌を有する患者の臨床的特性化は、コドン１３突然変異型転移性結腸直腸癌が、臨床疾患が先ず初めに明らかになった時点で局所的及び遠隔の転移に対して関連頻度が高いより攻撃的かつ浸潤性の疾患を表すことを示した（Ｍｏｄｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。また、骨髄転移におけるＫＲＡＳ突然変異及び結腸直腸癌中の原発性腫瘍の分析は、コドン１２突然変異が原発性腫瘍内にあるのに比べてコドン１３突然変異が播種性細胞内にあることを示し、これによって、ＣＴＣの不均質な性質を強調している（Ｔｏｒｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。したがって、これらの結果は、攻撃的表現型及び結腸直腸癌における転移能を有するＣＴＣのための潜在的な突然変異ホットスポットマーカーを示している。間葉腫瘍ＣＴＣについては、その後血液から単離された８４−１＋ＣＴＣを、所定の腫瘍に対する特異的マーカーを利用することによって検証した（ＣＤ９９は、ユーイング肉腫ＣＴＣについてのマーカーとして使用され、α−ＳＭＡは平滑筋肉腫について使用された（図３Ｂ））。集団の大きな集合を用いる今後の試験は、ＣＳＶ陽性ＣＴＣと臨床転帰との間の任意の相関を引き出すことが保証される。

Ｓｉｅｕｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００９）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞が正常な乳房に似た癌細胞であり、浸潤性表現型で特徴付けられるが、ＥｐＣＡＭ媒介検出を逃れることを示すことを以前に報告した。興味深いことに、これらの細胞は、フローサイトメトリーを利用する本発明者の抗体を用いて検出可能であり（図７Ｃ）、このことは、ＥＭＴを引き起こす可能性があったＥｐＣＡＭ陰性ＣＴＣの検出を示唆している。我々の抗体は、結腸癌患者サンプルからＣＴＣを検出することができたために、本発明者は、これらの細胞がＥＭＴを引き起こしたかどうか、したがってＣＳＶ発現の増加に起因して容易に検出可能であるかどうかをテストすることを希望した。単離された８４−１＋ＣＤ４５−ＣＴＣを、共焦点顕微鏡を用いて、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、ビメンチン、及びＳｌｕｇの免疫蛍光標識についてテストを行った（図３Ｃ）。この結果は、これらのＣＴＣは、上癌細胞の皮表現型についてのマーカーであるＥｐＣＡＭの発現を喪失したことを示した。しかしながら、内部ビメンチンについてのさらなる特性化は、それらの上皮表現型から間葉表現型への移行を確認した。この移行は、ＥＭＴの転写調節因子であるＳｌｕｇの発現及び上皮表現型についてのマーカーである膜Ｅ−カドヘリンのダウンレギュレーションによって確認される。ビメンチン及びＳｌｕｇの発現における増加を伴うＥｐＣＡＭ及びＥ−カドヘリンのダウンレギュレーションは、ＣＴＣのＥＭＴの性質を示している。Ｓｌｕｇの過発現は、結腸直腸腺癌患者における低生存率に関する独立した予後パラメータであることが示されている（Ｓｈｉｏｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）。さらに、本発明者は、活性ＥＭＴ細胞の指標である（Ｂｒａｂｌｅｔｚ
ｅｔ ａｌ．，２００１）、単離されたＣＴＣの核中のβ−カテニンの存在を検出した（図３Ｄ）。核中のＣ−Ｍｙｃ蓄積は、β−カテニンの核進入についての証拠を提供する（図３Ｄ）。全体として、これらの結果は、８４−１抗体を使用しての、現行のＣＴＣ検出技術において主要な欠陥を引き起こす上皮癌細胞からのＥＭＴ ＣＴＣの単離を確証している。

上皮癌の細胞表面上のビメンチンの発現は、癌細胞のステージ、すなわちＥＭＴステージに依存するために、本発明者は、これらが特定の作用物質を用いて癌細胞の表面上のビメンチンの発現を誘発できるかどうかをテストすることを望んだ。既報は、ビメンチンの細胞表面への移行が、リン酸化依存性であることを示唆している（Ｓａｔｅｌｌｉ ａｎｄ Ｌｉ、２０１１において検討）。本発明者は、特異的なホスファターゼを阻害することが、ビメンチンのリン酸化を増加させ、これによってＣＳＶ発現を増加するという仮説を提唱した。この仮説をテストするために、本発明者は、特異的なホスファターゼを阻害し、癌細胞中のＣＳＶの発現を増加させる阻害物質である、オルトバナジウム酸ナトリウム（ＳＯＶ）を用いたが（図３Ｅ、中央パネル）、正常な白血球のＣＳＶにおいて変化はなかった。（図３Ｅ、下部パネル）。さらに、ＳＯＶで処理されたＬＭ７は、ＣＳＶにおける増加を示し、これによってＣＳＶの検出を非常に高い効率性で増強させる（図７Ｄ）。さらに、本発明者は、ヒト結腸癌血液検体をＳＯＶの効果についてテストし、これは、蛍光顕微鏡によって検出可能であるＣＳＶにおける増加を明確に示した（図３Ｆ）。したがってＳＯＶは、ＣＴＣの検出における主要な要件である、ＣＴＣの収量を増加させるＣＳＶブースティング剤として使用することができる。したがってこれらの結果は、ＣＴＣ中のＣＳＶ発現を増強されるためのＳＯＶのブースティング剤としての使用を示唆している。

ＣＴＣ検出は、病院でその使用が非常に増加する傾向にあり、治療現場で適用されているが、現行の技術を使用するＣＴＣ検出の効率全体にわたる不確実性は、検出の効率を増大させ、患者の治療の評価における有用なツールとして補助する、ＣＴＣに対する新しいマーカーの発見を必要としている。本明細書において、本発明者は、非上皮細胞型及びＥＭＴ細胞型の両方のＣＴＣの細胞表面上のビメンチンの存在を報告している。ＣＴＣ中のＣＳＶ検出は、現行のマーカーに基づく検出技術を超えるいくつかの利点を提供する。第１には、間葉腫瘍由来ＣＴＣの検出のための特異的マーカーの存在に関する文献における報告がないために、ＣＳＶを１つだけの特異的なマーカーとして使用することが、マーカーの組み合わせの使用を超えるその優れた優位性を際立たせることである。第２には、上皮腫瘍からＥＭＴ ＣＴＣを検出する能力が、市場において現行のＣＴＣ検出技術の検出能力を増強することである。第３には、ヒトからのみならず、さらにイヌ及びマウスモデルからのさらなる分子特性化のための生ＣＴＣの単離が、臨床研究ツールとしてのその使用を際立たせることである。

結論として、本発明者は、ＣＳＶ特異的モノクローナル抗体８４−１を発見し、この８４−１は、検出に役立つばかりでなく、さらなる分析用に利用され得る、上皮及び非上皮癌の両方からの生ＣＴＣの単離に役立つ。Ｃｅｌｌ Ｓｅａｒｃｈ、Ｍａｇｓｗｅｅｐｅｒ、ＣＴＣ Ｃｈｉｐ、及び他の技術によるＣＴＣの計数は、ＣＴＣの分野に革命をもたらした。しかしながら、これらのツールを利用する検出は、広範囲の癌におけるＣＴＣの検出でさらに支援することができる強力なバイオマーカーを必要とする。ＥＭＴ形質転換細胞は、一次マーカーとしてＥｐＣＡＭ及びサイトケラチンを利用するツールによる検出を逃れることが知られているために、８４−１との併用は、これらの方法論の感度及び信頼度を高めることができる。この抗体を単独で利用すること（間葉癌に対して）、または現行のマーカーと共に利用すること（ＥＭＴ癌に対して）が、これらの転移性前駆体サブ集団についての理解を向上させることができ、治療モニタリングに基づいて新規の診断、治療、及び予後選択を提供することで役立ち得る技術が、ＣＴＣ検出において非常に有効であり得る。
実施例３：ビメンチンに対するマウスモノクローナル抗体１２−１及び８４−１のエピトープマッピング

ビメンチン配列を、９、１１、及び１４個のアミノ酸のペプチド間重複を有する１０、１２、及び１５個のアミノ酸（ａａ）ペプチドに翻訳した。このペプチドをペプチドアレイ上にスポットした。得られたペプチドマイクロアレイは、１，４０６個の異なるペプチドを二重に含有し（２８１２個のペプチドスポット）、Ｆｌａｇ及びＨＡ制御ペプチド（それぞれ１１６のスポット）によってフレームされた。

標準緩衝液中での１０分間の前膨潤後に、ペプチドアレイの前染色を、１：５０００希釈の二次ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０抗体で、室温で６０分間行い、アッセイを妨害する可能性がある抗原由来のペプチドとのバックグラウンド相互作用を調べた。７のスキャン強度値においては、ビメンチン由来ペプチドとの顕著なバックグラウンド相互作用は観察されなかった。

引き続いて、インキュベーション緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び１０％のＲｏｃｋｌａｎｄブロッキング緩衝液を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４））中で、ペプチドアレイのマウスモノクローナル抗体１２−１及び８４−１（１μｇ／ｍｌの濃度）とのインキュベーションを行い、その後、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＤｙＬｉｇｈｔ６９０抗体（１：５０００）による染色を行い、ＬＩ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｍａｇｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍを用いて、７のスキャン強度値で読み取った。特に抗体８４−１による、高強度で複雑な染色パターンのために、アッセイを抗体の０．２μｇ／ｍｌの低濃度において繰り返して行った。染色パターンの全般的な強度は低下したが、バックグラウンドもスポットパターンの複雑性も減少しなかった。種々のペプチド長への明確な依存性を有する隣接するペプチドの連続した列によって形成されるエピトープ様スポットは、同定されなかった。その後、Ｆｌａｇ及びＨＡ制御ペプチドを、対応する対照抗体で染色した。

スポット強度及びペプチドアノテーションの定量化を、ＰｅｐＳｌｉｄｅ（登録商標）アナライザーで行った。ソフトウェアアルゴリズムは、各スポットの蛍光強度を、生信号、フォアグラウンド信号、及びバックグラウンド信号に分解し、フォアグラウンド中央値強度の標準偏差を計算する。平均化フォアグラウンド中央値強度に基づいて、強度マップを作成し、ペプチドマップ内のバインダーを強度カラーコードによって強調させた。

二次抗体による前染色及びＮ末端からＣ末端までのビメンチン配列に対する各マウス抗体による主アッセイの平均化スポット強度をプロットし、全体のスポット強度及び信号対ノイズ比を可視化した。強度プロットを、ペプチド及び強度マップとならびにマイクロアレイスキャンの目視検査と相関させて、抗体サンプルと相互作用したコンセンサスモチーフ及び特有のペプチドを同定した。

マイクロアレイスキャン及び強度マップによると、明確なエピトープ様パターンがなく、抗体１２−１（図１１）及び抗体８４−１（図１２）の交差反応性に起因する複雑かつノイジーな応答が観察された。マウスモノクローナル抗体１２−１（１ｕｇ／ｍＬ）及び８４−１（０．２ｕｇ／ｍＬ）の強度プロットの比較は、両サンプルの明白な類似性を明らかにした（図１３）。両抗体は、ほぼ２倍のスポット強度で抗体８４−１との類似の交差反応性を示し、重複するコンセンサスモチーフを有する隣接するペプチドによってエピトープ様スポットパターンは形成されなかった。

両抗体の可能な生モチーフ及びアミノ酸指向性の同定は、ＭＥＭＥ部位（モチーフに基づく配列分析ツール）によって支持された（図１４及び１５）。ＭＥＭＥ分析については、各アッセイの上位１００個のペプチドを選択し、２つのみのアミノ酸の最小モチーフ長さを規定した。得られたＥ値は、所与の対数尤度比（またはそれ以上）、ならびに類似の大きさのランダム配列で見出されるであろう同じ幅及び部位係数を持ち、コンセンサスモチーフの統計的有意性と対応する。１のＥ値は、ランダムペプチドの集合中である特定のモチーフの偶然の同定と予想され、Ｅ値の減少は、統計的有意性の増加と相関する。

ＭＥＭＥ分析は、上位モチーフｘＬＱＥ［ＬＥ］Ｅ［ＤＭ］Ｒでならびに非常に高い統計的有意性で、両抗体１２−１及び８４−１の明白な類似性を強調した。このサンプルは、アミノ酸Ｄ及びＥに対するならびに疎水性アミノ酸Ｍ、Ｆ、Ａ、及び特にＬに対する明確な指向性を示した。ＭＥＭＥ分析は、疎水性アミノ酸Ｌと産生アミノ酸ＤまたはＥとの間の１つのアミノ酸の好ましいスペーサーをさらに示した。これに基づいて、ＬＱＥ、ＱＥＬ、ＱＥＥ、ＱＥ［ｘｘ］Ｅ［ｘｘ］Ｒ、Ｅ［ｘ］Ｅ［Ｍ］Ｒ、Ｌ［ｘ］Ｅ、及びｘＬｘＥｘｘＤを含むいくつかの可能なサブモチーフが存在する。
実施例４−癌患者からの血液中のＣＴＣの検出

乳癌患者の血液中のＣＴＣを検出するための能力をテストするために、転移性乳癌を有する６２人の患者からそれぞれ２本の採血管（それぞれ７．５ｍＬ）を得た。それぞれ１本の管を、８４−１法によりＣＴＣを計数し（図９Ａ）、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ法によりＣＴＣを計数する（図９Ｂ）ために用いた。ＣＴＣの平均数を、８４−１法及びＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ法の両方から計算し、組み合わせた方法の平均値を発生させた（図９Ｃ）。患者を、安定性（療法に応答している）及び進行性（療法に応答せず、腫瘍進行を示している）集団に分類した。検出の感度及び特異性を、各方法について計算し、８４−１法（それぞれ８３．３％及び９５％）、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ法（それぞれ５０％及び８５％）、及び組み合わせた方法の平均値（それぞれ８３．３％及び９５％）であった。

前立腺癌患者の血液中のＣＴＣを検出するための能力をテストするために、転移性前立腺癌を有する２１人の患者からそれぞれ２本の採血管（それぞれ７．５ｍＬ）を得た。それぞれ１本の管を、８４−１法及びＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ法によりＣＴＣを計数する（図１０）ために用いた。患者を、安定性（療法に応答している）及び進行性（療法に応答せず、腫瘍進行を示している）集団に分類した。検出の感度を、各方法について計算し、８４−１法（９５％）及びＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ法（５０％）であった。検出の特異性は、入手可能なサンプルの数が制限されたために、計算しなかった。
＊＊＊

本明細書に開示され主張される方法の全ては、本開示に照らして、過度の実験なしに実行かつ達成される。本発明の組成物及び方法が、好ましい実施形態に関して記述されてきたが、様々な変形が、本発明の概念、趣旨、または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される方法に及びステップにおいてまたは方法のステップの順序において適用されてもよいことが、当業者には明らかであろう。より具体的には、同一または類似の結果が達成される限り、化学的及び生理学的の両方に関連する特定の作用物質が、本明細書に記載される作用物質に置き換えられてもよいことが明らかであろう。当業者に明確な全てのこうした類似の置換及び修正は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨、範囲、及び概念の範囲内にあるとみなされる。

Claims (8)

1. 固形腫瘍の生循環転移性腫瘍細胞を単離する方法であって、
   （ｉ）患者から以前に得られた生血液細胞またはその成分を、前記細胞の細胞表面ビメンチンに特異的に結合する抗体とインキュベートすることと、
   （ｉｉ）前記抗体結合循環腫瘍細胞を分離し、これによって固形腫瘍の循環転移性腫瘍細胞を単離することと
   を含み、前記抗体は、
   （ａ）配列番号３の第１のＶＨＣＤＲと、
   （ｂ）配列番号４の第２のＶＨＣＤＲと、
   （ｃ）配列番号５の第３のＶＨＣＤＲと、
   （ｄ）配列番号６の第１のＶＬＣＤＲと、
   （ｅ）配列番号７の第２のＶＬＣＤＲと、
   （ｆ）配列番号８の第３のＶＬＣＤＲと、を含む、方法。
2. （ｉ）サンプルの、細胞表面ビメンチンに結合する抗体との前記インキュベートに先立って、前記サンプルからＣＤ４５陽性細胞を枯渇させること；
   （ｉｉ）前記サンプルをＥｐＣＡＭまたはサイトケラチン抗体とインキュベートすること；
   （ｉｉｉ）フローサイトメトリー、免疫組織化学法、蛍光顕微鏡法、ラジオイムノアッセイ、またはＥＬＩＳＡを用いて、前記抗体結合細胞を検出すること；
   （ｉｖ）前記サンプルをタンパク質チロシンホスファターゼ阻害物質とインキュベートすることによって、細胞表面ビメンチンの発現のレベルを増加させること；または
   （ｖ）前記単離された生循環腫瘍細胞を遺伝子型特定すること
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 単離することが、免疫磁気捕捉、接着に基づく細胞選別法、磁気活性化細胞選別法、または蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記タンパク質チロシンホスファターゼ阻害物質が、オルトバナジウム酸ナトリウム、デホスタチン、ｍｐＶ（ｐｉｃ）、フェニルアルシンオキシド、スチボグルコン酸ナトリウム、ＢＡＹ Ｕ６７５１、チロシンホスファターゼ阻害物質カクテル（バナジウム酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、及びイミダゾールを含む）、ならびにＲＫ−６８２から選択される、請求項２に記載の方法。
5. 前記患者における循環転移性腫瘍細胞の数を定量化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記患者が、上皮腫瘍または間葉腫瘍を有する、請求項１に記載の方法。
7. （ａ）配列番号３の第１のＶ_ＨＣＤＲと、
   （ｂ）配列番号４の第２のＶ_ＨＣＤＲと、
   （ｃ）配列番号５の第３のＶ_ＨＣＤＲと、
   （ｄ）配列番号６の第１のＶ_ＬＣＤＲと、
   （ｅ）配列番号７の第２のＶ_ＬＣＤＲと、
   （ｆ）配列番号８の第３のＶ_ＬＣＤＲと、を含む、細胞表面ビメンチンに特異的に結合する単離された抗体。
8. 前記抗体が薬学的に許容し得る担体中で組成物に含まれている、請求項７に記載の抗体。