CN105693841A - 一种提取纯化波形蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明首次公开一种提取纯化波形蛋白的方法，解决了既有文献报道的波形蛋白提取工艺复杂、成本高、周期长的问题。本发明以猪眼晶状体为原料，经粗提、精提、分离、纯化和透析后制成冻干粉。在分离步骤中使用DEAE Sepharose FF柱进行一次性线性洗脱。本发明方法具有高效、低成本的特点，提取波形蛋白纯度高、相对回收率高。

Description

一种提取纯化波形蛋白的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域的一种提取纯化波形蛋白的方法。
背景技术
波形蛋白(vimentin，Vim)为极度保守的细胞骨架Ⅲ型中间丝蛋白，主要表达于中胚层起源的间充质细胞中，以多聚体纤维稳定存在。Vim单体仅溶于高离子序列溶液如尿素、阴离子表面活性剂、盐酸胍溶液等，分子量为53kDa，等电点5.05，在pH值7.2-7.4最稳定。Vim具有调节细胞分化、迁移、信号传导、凋亡以及自身抗原和细胞因子特性，在感染、肿瘤、自身免疫、固有免疫等方面显现复杂的功能，具有生物药品开发的广阔前景。
国外曾有文献报道天然Vim的纯化方法。Geisler等依次用SephadexG-25(葡聚糖凝胶G-25)、CM-32(弱阳离子交换柱)及DE52(弱阴离子交换柱)纯化猪晶状体中的Vim，最后得到Vim纤维丝。Nelson等使用组织上清液中的艾氏腹水癌细胞，以DNA-纤维素层析法得到Vim。Bioemendal等依次用SephadexG-25和PBE94(聚焦色谱的pH梯度柱)聚焦层析法纯化牛晶状体中的Vim。DLSpector用SephadexG-25，之后用羟基磷灰石柱在8-35mM磷酸钠浓度范围线性洗脱分离纯化牛晶状体中的Vim。以上技术方法成本高、产量低，方法复杂，周期长，不适于制备型应用。国内戴丽娟等曾报道从人宫颈癌细胞中克隆Vim基因并构建带有GST标签的PGEX-4T-1-VIM重组表达质粒，以DH5α菌、BL21菌进行质粒扩增和诱导表达Vim。但未提及纯化方法，且仍存在成本高、产量低、方法复杂、周期长的问题。现售Vim由国外基因工程制备，价格昂贵且与天然Vim蛋白相比存在结构缺陷。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种方法简捷、高效、低成本的提取高纯度天然波形蛋白的方法。
技术方案包括以下步骤：
(1)粗提：解剖猪眼取晶状体，浸入粗提液后匀浆制得混悬液；将混悬液离心后弃上清液，取沉淀物重悬数次并离心；取沉淀物冻干制得粗提粉；
(2)精提：以精提液溶解步骤(1)中的粗提粉，离心后去沉淀，取上清液浓缩后得到精提物溶液；
(3)分离：取精提物溶液加载到预平衡的DEAESepharoseFF柱(二乙胺基乙基键合快流速琼脂糖凝胶弱阴离子交换柱)，先使用第一缓冲液洗脱大部分的42kDa杂蛋白，再使用第二缓冲液进行线性洗脱，收集馏分；
(4)纯化：对各馏分用10％SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶)电泳，做Western-Blot(免疫印迹法)实验进行蛋白成分检测；合并53kDa目标波形蛋白含量达80％以上的馏分，经透析、冻干即得纯化Vim粉。
所述步骤(3)中，所述第一缓冲液中含有36mMNaH2PO4(磷酸二氢钠)、8M尿素、0.5mMPMSF(胆碱酯酶抑制剂)、1mg/LLeupeptin(亮抑肽酶)、1mg/LAprotinin(抑肽酶)、1mMDTT(二硫苏糖醇)，其pH值为7.0。
所述步骤(3)中，所述第二缓冲液中含有36-86mMNaH2PO4、8M尿素、0.5mMPMSF、1mg/LLeupeptin、1mg/LAprotinin、1mMDTT，其pH值为7.0；进行线性洗脱时，第二缓冲液以36mMNaH2PO4为起始洗脱浓度，以86mMNaH2PO4为终止洗脱浓度。
所述步骤(3)中，所述第二缓冲液线性洗脱参数为：流速1ml/min，压力0.5MPa，NaH2PO4线性上升梯度0.5mM/1ml。
所述步骤(3)中，第一缓冲液的洗脱体积至少为40ml；控制第二缓冲液的洗脱体积为100ml，2ml一管收集馏分。
所述步骤(2)中，精提液含有10mMNaH2PO4、8M尿素、0.5mMPMSF、1mg/LLeupeptin、1mg/LAprotinin、1mMDTT，其pH值为7.0，4℃预冷。
有益效果：
1)本发明首次采用DEAESepharoseFF柱层析纯化猪源天然波形蛋白，此技术方法原料易得，仅采用一次过柱分离，制备过程简捷，周期短、成本低。
2)使用第一缓冲液将大部分42KDa分子量的杂蛋白洗脱，再使用第二缓冲液通过限定的线性洗脱方法将53kDa的Vim与42KDa和128KDa的杂蛋白分离，可得Vim电泳纯的馏分；合并馏分Vim纯度可达80wt％以上，相对回收率为36％以上。
3)本发明方法简单可靠、生产周期短、分离效率和回收率高，可获得高纯度的天然Vim；能解决目前Vim蛋白依靠国外进口的困境，并大幅降低成本及售价。
附图说明
图1是实施例1中波形蛋白UV检测线图。
其中实心三角符号表示系统设置的经搅拌泵进入色谱柱中缓冲液的浓度；实心圆符号表示经过色谱柱后检测到的总缓冲液的离子强度s/m2；十字符号表示经过色谱柱后UV检测器在280nm处检测到的吸光度。
图2A-图2H是实施例1中以10％SDS-PAGE电泳分析各馏分蛋白成份，馏分管号标注于图上。1-8管显示含36mMNaH2PO4缓冲液洗脱馏分，9-58管显示含36-86mMNaH2PO4缓冲液洗脱馏分，59-64管显示含210mMNaH2PO4缓冲液洗脱馏分。
图3是实施例1中对第2、18、29、30、38、47、52管馏分进行波形蛋白Western-blot验证。
图4是实施例1中以10％SDS-PAGE电泳分析精提物溶液(A)和纯化品(B)蛋白成分，图中M为分子量Marker，S为纯化前后对应的蛋白成分。
图5A-图5D为对比实施例1中以10％SDS-PAGE电泳分析各馏分蛋白成分，其中1-8管显示含36mMNaH2PO4缓冲液洗脱馏分，9-28管显示含58mMNaH2PO4缓冲液洗脱馏分，29-35显示含210mMNaH2PO4缓冲液洗脱馏分。
图6A-图6E为对比实施例2中以10％SDS-PAGE电泳分析各馏分蛋白成分，其中1-10管显示含36mMNaH2PO4缓冲液洗脱馏分，11-35管显示含36-86mMNaH2PO4缓冲液洗脱馏分，36-45管显示含210mMNaH2PO4缓冲液洗脱馏分。
具体实施方式
实施例1
第一步：粗提
在冰盒上解剖猪眼取晶状体，将晶状体置入粗提液：含100mMNaCl(氯化钠)、1mMEDTA(乙二胺四乙酸)、10mMNaH2PO4(磷酸二氢钠)，PH6.8，4℃预冷中，匀浆机4℃匀浆后得到混悬液，然后4℃、10000×g离心30min，弃上清；取沉淀物以粗提液复悬，重复数次并离心，弃上清；取沉淀物冻干制得粗提粉，-80℃保存。
第二步：精提
所述粗提粉充分溶于精提液(含10mMNaH2PO4、8M尿素、0.5mMPMSF、1mg/LLeupeptin、1mg/LAprotinin、1mMDTT，PH7.0，经0.22um滤膜过滤，超声脱气10min制得)，于4℃，10000×g离心30min，弃沉淀。上清液用0.45um滤膜过滤；滤液置浓缩管以2000rpm离心浓缩后得到精提物溶液，以BCA蛋白浓度测定试剂盒检测其蛋白浓度，4℃储存。
第三步：分离
①使用AKTAprimeplus低压蛋白纯化系统(中国通用电气医疗集团)，DEAESepharoseFF柱(二乙胺基乙基键合快流速琼脂糖凝胶弱阴离子交换柱，上海博格隆生物技术有限公司生产，1ml柱，载样量50mg)。先使用精提液浸润平衡DEAESepharoseFF柱，待基线(UV检测线)平稳，将精提物溶液注入纯化系统的上样环内，设置程序平衡、自动上样、再平衡、洗脱DEAESepharoseFF柱。
②待基线平稳，使用第一缓冲液(含36mMNaH2PO4、8M尿素、0.5mMPMSF、1mg/LLeupeptin、1mg/LAprotinin、1mMDTT，PH7.0，经0.22um滤膜过滤，超声脱气10min)对所上样品进行洗脱分离。洗脱条件为1ml/min，0.5MPa，洗脱体积为40ml。本实施例中，每5ml洗脱液收集为一馏分，馏分收集管编号为1-8。
③待基线平稳，使用第二缓冲液(含36-86mMNaH2PO4、8M尿素、0.5mMPMSF、1mg/LLeupeptin、1mg/LAprotinin、1mMDTT，PH7.0，经0.22um滤膜过滤，超声脱气10min)进行线性洗脱。洗脱条件为：以36mMNaH2PO4为起始洗脱浓度，以86mMNaH2PO4为终止洗脱浓度，1ml/min，0.5MPa，洗脱体积为100ml，每2ml洗脱液收集至一馏分管共计50管，编号为9-58。
④待基线平稳，使用含210mMNaH2PO4(磷酸二氢钠)、8M尿素、0.5mMPMSF(胆碱酯酶抑制剂)、1mg/LLeupeptin(亮抑肽酶)、1mg/LAprotinin(抑肽酶)、1mMDTT(二硫苏糖醇)，PH7.0，经0.22um滤膜过滤，超声脱气10min制得缓冲液进行洗脱，洗脱条件为1ml/min，0.5MPa，洗脱体积为30ml，每5ml洗脱液收集至一馏分管，编号为59-64。
UV检测图见图1。
第四步：纯化
①以10％SDS-PAGE电泳分析收集馏分中所含蛋白组分情况，做Western-Blot进行Vim蛋白鉴定验证(见图2)。参见图2A，第1-8管的馏分中仅含42kDa的蛋白，即第一缓冲液可以洗脱42kDa的杂蛋白，而未洗脱Vim蛋白。从图2B、图2C、图2D、图2E、图2F和图2G中9-58管馏分可以看到53kDa的Vim蛋白被线性洗脱，其中第26-37管馏分在图中显示Vim蛋白均达到电泳纯，合并26-37管收集的馏分。
②将合并的馏分用0.45um滤膜过滤，滤液装入透析袋(8-14MWCO)中，置于1L透析液(含10mMNaH2PO、0.5mMDTT，0.22um滤膜过滤除菌)中4℃透析，每4h换液一次，透析12h。透析后馏分液冻干即得纯化波形蛋白干粉。
纯度测试：将实施例1制得的纯化波形蛋白溶液与精提物溶液进行纯度对比测试，以10％SDS-PAGE电泳，图4中的“A”为精提波形蛋白的电泳图，“B”为本实施例纯化波形蛋白的电泳图。经ImageLab4.0软件进行灰度值分析，本方法制备纯化波形蛋白的纯度为80wt％以上，相对回收率为36％以上。
对比实施例1
将实施例1第三步③中的线性洗脱更改为单一洗脱，即第二缓冲液含58mMNaH2PO4、8M尿素、0.5mMPMSF、1mg/LLeupeptin、1mg/LAprotinin、1mMDTT，PH7.0，经0.22um滤膜过滤，超声脱气10min，洗脱体积100ml，5ml一管收集；其余同实施例1，结果见图5A-图5D。可见第17-28管馏分除含有53kDaVim蛋白，均同时含有大量的杂蛋白；合并第17-28管馏分处理后得到的冻干粉的Vim纯度仅约为43wt％，分离纯化效果较差。
对比实施例2
将实施例1第三步③中的第二缓冲液洗脱体积由100ml更改为50ml,第一缓冲液洗脱体积更改为50ml，第三步④中洗脱体积更改为50ml；其余同实施例1，结果见图6A-图6E,可见第11-35管中能达到Vim蛋白电泳纯馏分管较少。虽然收集第26-30管馏分处理得到的冻干粉的Vim纯度约为75wt％,但继续用实施例1第三步④中的缓冲液50ml洗脱时，由第36-45馏分可见仍有较多量的Vim蛋白与杂蛋白同时被洗脱，即纯化回收率较低,不具有实用性。

Claims (6)

1.一种波形蛋白的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)粗提：解剖猪眼取晶状体，浸入粗提液后匀浆制得混悬液；将混悬液离心后弃上清液，取沉淀物重悬数次并离心；取沉淀物冻干制得粗提粉；
(2)精提：用精提液溶解步骤(1)中的粗提粉，离心后弃沉淀，取上清液浓缩后得到精提物溶液；
(3)分离：取精提物溶液上样到预平衡的DEAESepharoseFF柱，先使用第一缓冲液洗脱大部分的42kDa杂蛋白，再使用第二缓冲液进行线性洗脱，收集线性洗脱的馏分；
(4)纯化：对收集的馏分用10％SDS-PAGE电泳，做Western-Blot实验进行蛋白成分鉴定；合并53kDa目标波形蛋白含量达80wt％以上的馏分，经透析、冻干即得纯化Vim粉。
2.如权利要求1所述的波形蛋白的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述第一缓冲液中含有36mMNaH2PO4、8M尿素、0.5mMPMSF、1mg/LLeupeptin、1mg/LAprotinin、1mMDTT，其pH值为7.0。
3.如权利要求1所述的波形蛋白的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述第二缓冲液中含有36-86mMNaH2PO4、8M尿素、0.5mMPMSF、1mg/LLeupeptin、1mg/LAprotinin、1mMDTT，其pH值为7.0；进行线性洗脱时，第二缓冲液以36mMNaH2PO4为起始洗脱浓度，以86mMNaH2PO4为终止洗脱浓度。
4.如权利要求1或3所述的波形蛋白的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述第二缓冲液线性洗脱参数为：流速1ml/min，压力0.5MPa，NaH2PO4线性上升梯度0.5mM/1ml。
5.如权利要求1所述的波形蛋白的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)中，第一缓冲液的洗脱体积至少为40ml；控制第二缓冲液的洗脱体积为100ml，2ml一管收集馏分。
6.如权利要求1所述的波形蛋白的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，精提液含有10mMNaH2PO4、8M尿素、0.5mMPMSF、1mg/LLeupeptin、1mg/LAprotinin、1mMDTT，其pH值为7.0，4℃预冷。
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