CN102093465A - 分离ⅲ型前胶原氨基末端肽的方法 - Google Patents

分离ⅲ型前胶原氨基末端肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种分离III型前胶原氨基末端肽的方法，解决了III型前胶原氨基末端肽的提取方法、效率、纯度、活性的问题，采用硫酸氨分级分离发法，第一步将杂质减少了5.5％，而得率增加了11.7％，采用Qsepharose FF，上样量大，流速快，进一步分离未采用pH4.5和pH8.5的缓冲液变换洗脱，而采用对蛋白有保护作用的疏水层析，纯度和活性大大提高，用高分辨率的Superdex200代替Sephacryl200，进一步提高纯度，经SDS-PAGE分析纯度达98％，活性是现有技术的10倍。

Description

分离Ⅲ型前胶原氨基末端肽的方法
技术领域
本发明涉及一种分离III型前胶原氨基末端肽的方法。
背景技术
现有的提纯方法是都采用了DEAE-Sephacel离子交换柱及Sephacryl分子筛，经验证此法纯化效率不高，杂蛋白与活性峰分不开，而且纯化的pIIIINP活性不高，活性下降极快，纯度无法满足高精度实验要求。最主要是，得率太低，经测算(RIA-Gnost Prokollagen-III-Peptid)，用此法提纯95％的PIIINP1mg需要PIIINP的有效含量达100mg以上。
第一步加(NH4)2SO4没有分级将大部杂质带入后续阶段，而且这一步也仅能去掉10％的杂蛋白。
Figure B2009102504789D0000011
上述方法所用的DEAE-Sephacel离子交换柱及Sephacryl分子筛分辨率不高是造成纯度低、效率低的主要原因，长时间采用pH4.5和pH8.5的缓冲液洗脱及未完全去除的杂质导致pIIIINP活性不高。
采用(NH4)2SO4沉淀，二次不同pH的及Sephacel S-200分子筛柱层析从人癌性腹水中分离并纯化了PIIINP，并制备了抗血清，经取癌性腹水3L，加固体(NH4)2SO4到40％饱和度，搅拌过夜，静置4h，16000g离心20min，弃上清液，将沉淀溶于50mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，2mmol/LNEM，2mmol/LPMB，1mmol/LPMSF，2mmol/L ICH2COONa，2mmol/L(NH2)2CO的缓冲液中，pH8.6。并与该缓冲液做充分透析，以除去样品中的(NH4)2SO4。经DEAE-Sephacel离子交换柱层析，用上述缓冲液做NaCl阶段洗脱。洗脱后的活性峰部分与10mmol/L柠檬酸盐缓冲液pH4.5充分透析后，25000g离心60min。取上清液，再经DEAE-Sephacel离子交换柱，用0——0.6mmol/LNaCl，10mmol/L柠檬酸盐缓冲液pH4.5作线性梯度洗脱，在232nm处检测蛋白峰，用西德PIIIP药盒检测PIIIP活性峰，合并活性峰部分，与10mmol/LNH4HCO3充分透析后，冷冻干燥，经Sephacryl S-200分子筛柱层析，收集PIIIP活性峰，合并，与10mmol/LNH4HCO3充分透，分装，冷冻干燥，置-20C保存。全部提纯过程均在4-8C下进行。上述方法的缺点：1)纯化效率、纯度不高，杂蛋白与活性峰分不开；2)纯化的pIIIINP活性不高，活性下降极快。
发明内容
本发明是要解决III型前胶原氨基末端肽的提取方法、效率、纯度、活性的问题。采用硫酸氨分级分离发法，第一步将杂质减少了5.5％，而得率增加了11.7％。采用Qsepharose FF，上样量大，流速快，分辩高，大大提高了效率。进一步分离未采用pH4.5和pH8.5的缓冲液变换洗脱，而采用对蛋白有保护作用的疏水层析，纯度和活性显著提高，用高分辨率的Superdex200代替Sephacryl200，进一步提高纯度。经SDS-PAGE分析纯度达98％，活性是现有技术的10倍。
具体实施方式
为了获得免疫活性好的抗体，从人癌性腹水中提取PIIINP，免疫家兔。取癌性病人腹水2升，10000RPM离心，目的是去掉组织块和癌性细胞；这一步必须穿戴防护手套和眼镜，因为决大多数肝癌病人都携带肝炎病毒；
分级收集硫酸氨浓度达到40～60％(根据不同病人而变化)的沉淀，加入硫 酸氨后要搅拌过夜，10000RPM离心，收集沉淀，弃上清；
由于腹水杂蛋白含量达80mg/ml，而有效含量60～600ng/ml，仅为百万分之一，所以直接用柱层析方法是不可能将痕量的pIIINP分离出来。根据序列分析，PIIINP的等电点为～5.71。因此，用BufferA透析上述沉淀并使浓度为1mg/ml，调溶液的pH为5.6，搅拌4个小时，10000RPM离心，收集沉淀，弃上清；
用BufferA透析上述沉淀并使浓度为1mg/ml，上阴离子交换柱去掉硷性蛋白的同时，收集40～60％(BufferB)部分；
上述收集物用BufferC(0.1m HAC-NaAC，pH4.4)透析，上阳离子交换柱CM-SepharoseFF，去掉酸性蛋白的同时，用BufferC和BufferA进行梯度洗脱，收集20～50馏分；
浓缩成5mg/ml，取200ul上superdex200分子筛层析，收集45KD位置的峰，浓缩成1mg/ml，加入叠氮钠，PMSF，最后进行纯度鉴定和免疫学鉴定，将合格品保存；
用法国CIS公司的三型前胶原肽免放药盒OCFKO7-PIIIP(国家食品药品监督管理局特殊药品进口准许证P-04-05-27-03)检验各峰中PIIINP的含量，获得纯度高的PIIINP进行免疫。
用PIIINP-R和PIIINP-Ag分别标记125I然后替代药盒中的相同组份，检验试剂盒的各种组分。结果PIIINP-R组总有部分(且只有部分)组分完全符合免疫学检验对药盒的各项指标，但B0偏低。而PIIINP-Ag各项指标B0达到70以上，但非特异稍高。
本发明解决了III型前胶原氨基末端肽的提取方法的问题。首先在初提阶段增加20％硫酸氨分级沉淀为以后的进一步分离奠定了基础。选用高分辩率的Qsepharose FF(阴离子交换柱)Superdex200(分子筛层析)。选用Phenylsepharose Highperformence(疏水层析柱)，避免用pH4.5和pH8.5的缓冲液变换洗脱。选用Qsepharose FF(阴离子交换柱)Phenylsepharose Highperformence(疏水层析柱)，使分离效率大大提高。离子交换和分子筛层析选用高分辩率的Qsepharose FF(阴离子交换柱)Superdex200(分子筛层析)，使得纯度的提高。避免用pH4.5和pH8.5的缓冲液变换洗脱，通过提高纯度提高活性。

Claims (1)

1.一种分离III型前胶原氨基末端肽的方法：
离体腹水2升，提取PIIINP，10000RPM离心，收集硫酸氨浓度达到40～60％的 馏分，方法为加入硫酸氨后搅拌过夜，10000RPM离心，收集沉淀，弃上清；用BufferA透析上述沉淀并使浓度为1mg/ml，调溶液的pH为5.6，搅拌4个小时，10000RPM离心，收集沉淀，弃上清；用BufferA透析上述沉淀并使浓度为1mg/ml，上阴离子交换柱去掉硷性蛋白的同时，收集40～60％即BufferB部分；上述收集物用BufferC 0.1m HAC-NaAC，pH4.4透析，上阳离子交换柱CM-SepharoseFF，去掉酸性蛋白的同时，用BufferC和BufferA进行梯度洗脱，收集20～50馏分；浓缩成5mg/ml，取200ul上superdex200分子筛层析，收集45KD位置的峰，浓缩成1mg/ml，加入叠氮钠，PMSF。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102690347A (zh) * 2012-05-18 2012-09-26 北京北方生物技术研究所 分离i型前胶原氨基末端肽的方法
CN108431606A (zh) * 2016-02-03 2018-08-21 北欧生物科技公司 纤维化的联合生物标志物测量

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