CN108431606A - 纤维化的联合生物标志物测量 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于检测交联的PIIINP的夹心免疫测定法,交联的PIIINP具有通过链间交联连接在一起的至少两条PIIINP链,每条链具有由完整的III型前胶原的N蛋白酶切割产生的PIIINP的C末端新表位。具有交联的PIIINP的生物样品与第一表面结合单克隆抗体接触,然后与第二单克隆抗体接触,两种抗体都是与PIIINP的C末端序列中的新表位特异性反应的,并且然后测定第二单克隆抗体的结合。还提供了一种通过免疫测定和试剂盒评估靶向赖氨酰氧化酶的拮抗剂药物的功效的方法,试剂盒包含结合第一单克隆抗体的固体载体并且包含第二单克隆抗体。

Description

纤维化的联合生物标志物测量
技术领域
本发明涉及用于检测在生物样品中交联的PIIINP的夹心免疫测定及其在评估靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的药物功效中的用途。本发明还涉及用于进行夹心免疫测定的试剂盒。
背景技术
纤维化疾病(包括表1中列出的疾病)是发病和死亡的主要原因,例如,全球每年有800,000人死于肝硬化(1)。
表1.不同的纤维化疾病(2)
“纤维化疾病”是任何引起无论是作为主要还是次要症状的纤维化的疾病。纤维化是由多种刺激引起的慢性炎症反应的最终结果,刺激包括持续感染、自身免疫反应、过敏反应、化学损伤、辐射和组织损伤。纤维化的特征在于细胞外基质(ECM)的积聚和重组。尽管有明显的病因和临床特性,但大多数慢性纤维化病症都有一个共同点,都具有持续性刺激物质,该刺激物质维持生长因子、蛋白水解酶、血管生成因子和纤维化细胞因子的产生,这些刺激物质一起刺激结缔组织成分的沉积,特别是胶原和蛋白多糖,这逐步重构和破坏正常的组织结构(3、4)。尽管它对人类健康有巨大的影响,但目前还没有经批准的直接针对纤维化机制的治疗(5)。
细胞外基质(ECM)
ECM是一种超分子结构,具有形成蛋白质聚集体的能力,因此形成在三维网络中将细胞连接在一起的动态支架。该支架通过上调和下调蛋白酶来控制细胞-基质相互作用和细胞命运(6)。ECM由胶原、层粘连蛋白、蛋白多糖和其他糖蛋白以各种数量和组合组成,从而提供多种生物成分,该成分可被蛋白酶修饰以产生具有特定功能的支架来满足个体组织的需求(7)。
Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原是人体内主要的结构蛋白质。III型胶原对于心血管系统和其他器官中的I型胶原的原纤维的生成是必需的(8、9)。在纤维组装期间,在将成熟胶原并入ECM中之前,III型前胶原的N末端前肽(由三条相同的α链组成,总共分子量为42kDa)被特异性N蛋白酶切割。切割的前肽可以保留在ECM中或释放到循环中。然而,前肽的切割有时是不完全的,使前肽附连至分子。这导致形成具有异常交联的细纤维,这反过来导致异常分子容易发生快速代谢更新(10、11)。因此,合适样品中III型胶原的N末端前肽(PIIINP)的水平可以作为III型胶原形成和/或降解的标志物。
ECM的重构在各种疾病的发病机理中起重要作用,因为ECM改变的成分和非编码修饰引起组织僵硬以及完整ECM及其片段的信号电位的变化。ECM重构是组织功能和修复的重要前提,并由负责ECM合成和降解的酶的严格控制。
在病理事件期间,诸如纤维化疾病,ECM的形成和降解之间的平衡受到干扰,引起ECM的组成改变。这种改变导致组织功能改变(12、13)。已经提出PIIINP可以用作几种纤维化疾病的生物标志物,诸如肺损伤(14)、病毒性和非病毒性肝炎(15)、系统性硬化症(16)、血管重构(17)和肾病(18)。
骨骼肌组织中的ECM重构被给予了有限的关注。在大鼠模型中,在运动后的股四头肌和胫骨前肌中证实了增加的胶原基因表达和生物合成(19、20)。此外,在运动后的临床研究中证实了升高的血清PIIINP水平(21)。因此,骨骼肌蛋白质的重构增加PIIINP在循环中的量,并且可以用作检测早期肌肉合成代谢的生物标志物。先前已经提出血清PIIINP水平作为肌肉组织应答睾酮(22)、重组人生长激素(23)或其组合(24、25)的生物标志物。
在肝纤维化中,I型和III型原纤维胶原高度上调(26、27)。III型胶原在纤维化的早期阶段占主导地位,而I型胶原的上调与纤维化的后期阶段相关。肝脏中发生纤维化导致胶原沉积和前肽释放,主要是PIIINP。因此,PIIINP是用于纤维发生的最好研究标志物之一(28、29、30)。多年来,已开发了几种用于定量检测PIIINP的放射免疫测定,灵敏度高达94%,检测肝硬化的特异性高达81%(31,32);然而以前的测定均无新表位特异性。另外,目前市售的用于定量PIIINP的测定利用靶向前胶原或前肽的内部序列的多克隆抗体或单克隆抗体,并且不特异性地区分III型胶原(31、32)的形成和/或降解。
因此,为了区分III型胶原的形成和降解,我们认为有必要测定和检测仅仅在形成过程中产生的新表位片段(即在III型胶原的形成中产生,但是在III型胶原的降解中不产生的片段)。
WO2014/170312公开了一种对包括在C末端氨基酸序列CPTGXQNYSP-COOH(SEQ IDNO:4)的末端氨基酸中的C末端PIIINP新表位具有特异性的单克隆抗体,其中X可以是Gly或Pro。
Brocks(31)公开了一种针对修饰的牛C末端PIIINP序列IC*QSCPTGGENYSP-COOH(SEQ ID NO:1)(C*=乙酰氨基保护的Cys;Gln被Glu(E)代替)的多克隆抗体,然而所述抗体对牛C末端PIIINP序列ICQSCPTGGQNYSP-COOH(SEQ ID NO:2)的末端氨基酸是非特异性的,并且另外所述抗体不识别人PIIINP。
Bayer(33)公开了一种夹心ELISA,其使用针对序列H2N-GSPGPPGICQSCPTGPQNYSP-COOH(SEQ ID NO:3)的检测器单克隆抗体,但结合表位未确定。
本申请人现在已经发现,利用WO 2014/170312中公开的针对PIIINP的C末端新表位的新表位特异性抗体的特异性夹心免疫测定可用于评估靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的药物的功效,特别是LOX拮抗剂药物。通过LOX酶促胶原交联和胶原的加工是组织成熟和稳定性的关键。在器官纤维化患者中,胶原变得高度交联,因此不易纤维化消退。LOXL2是一种特异性LOX,是纤维化组织中病理生理性胶原交联的主要驱动,目前正在进行新型LOXL2拮抗剂的临床试验。因此,可用于评估靶向LOX的药物(例如LOX拮抗剂)功效的测定显然将是制药工业的有用工具。
发明内容
本发明涉及用于检测在生物样品中交联的PIIINP的夹心免疫测定法,其中交联的PIIINP包括通过链间交联连接在一起的至少两条PIIINP。该方法包括使包括交联的PIIINP的生物样品与结合至表面的第一单克隆抗体接触,其中包括在交联的PIIINP中的PIIINP每条链具有由N蛋白酶切割完整的Ⅲ型前胶原产生的PIIINP的C末端新表位;以及加入第二单克隆抗体。两种单克隆抗体都是与PIIINP的C末端新表位特异性反应的,并且所述新表位包括在C末端氨基酸序列CPTGXQNYSP-COOH中,其中X是Gly或Pro。该方法还包括测定第二单克隆抗体的结合量。
本发明还涉及用于评估靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的拮抗剂药物的功效的方法。该方法包括使用本文所述的夹心免疫测定法定量至少两种生物样品中交联的PIIINP的量,生物样品是在向受试者给药拮抗剂药物期间的第一时间点和至少一个随后的时间点从该受试者获得的。在给药拮抗剂药物期间从所述第一时间点至该至少一个随后的时间点,交联的PIIINP的量的减少指示靶向LOX的拮抗剂药物有效。
本发明还涉及用于如本文所述的夹心免疫测定法的试剂盒。该试剂盒包括固体载体,如上所述的第一单克隆抗体结合于该固体载体,和如本文所述的标记的第二单克隆抗体。
附图说明
图1:人(SEQ ID NO:14)和大鼠(SEQ ID NO:15)物种中的靶向PIIINPα1链序列的比对(使用方框突出显示)。在III型胶原N末端前肽的α1链内相应的人类(-)和大鼠序列的位置。使用NLP CLUSTALW软件进行比对。
图2:蛋白质印记(Western Blot)示出了由单克隆抗体NB61N62(泳道1和3)和NB61N62+选择肽(泳道2+4)识别的来自a)大鼠和b)人的羊水中的III型胶原N末端前肽的特异性条带。在52-60kDA附近观察到大鼠的两个条带,观察到人的一个条带。选择肽的加入导致大鼠和人的带强度变弱。
图3A-图3D:PRO-C3ELISA运行示出了典型的校准曲线和对人、啮齿动物和小鼠材料的天然反应性。图3A:校准曲线和使用健康人血清、血浆和羊水(AF)的竞争性PRO-C3ELISA的抑制。校准曲线从76.31ng/mL以2倍稀释,而天然材料如(--)所示1:2稀释至1:16。图3B:校准曲线和使用健康大鼠血清、血浆和AF的竞争性PRO-C3ELISA的抑制。校准曲线从200ng/mL以2倍稀释,而天然材料不经稀释至1:8,如(--)所示。图3C:校准曲线和使用健康小鼠血清和血浆的竞争性PRO-C3ELISA的抑制。校准曲线从200ng/mL以2倍稀释,而天然材料未稀释至1:4,如(--)所示。图3D:使用延长肽(即在C末端具有一个附加氨基酸的校准肽的肽序列)的PIIINP新表位特异性抗体的新表位特异性。校准曲线、延长肽和无义肽从76.31ng/mL以2倍稀释。该信号被视为450nm处的光密度,减去650nm处的背景,作为肽浓度的函数。
图4:肺成纤维细胞的体外模型的结果(“罐中瘢痕(scar-in-a-jar)”)。
图5:来自瘢痕疙瘩提取物和正常皮肤提取物中Pro-C3X水平的比较。
图6A至图6B:肝纤维化患者的研究结果。
图7:Pro-C3X测定的图形表示。
图8:对酒精性脂肪性肝炎患者的研究结果。
图9:在第10天从罐中瘢痕模型(Scar-in-a-Jar model)收集的上清液中的Pro-C3X水平。通过单因素ANOVA采用邓尼特多重比较试验(Dunnett’s multiple comparisonstest)评价各项条件与单独TGF-β的显著性。数据表示为带SD的平均值。****P<0.0001。BAPN,β-氨基丙腈;TGF-β,转化生长因子β。
具体实施方式
如本文所用,术语“新表位”是指位于多肽末端的N或C末端肽序列,即在多肽的N或C末端,并且不被解释为在其总体方向的含义。
如本文所用的术语,术语“竞争性ELISA”是指竞争性酶联免疫吸附测定,并且是本领域技术人员已知的技术。
如本文所用,术语“夹心免疫测定”是指使用至少两种抗体来检测样品中的抗原,并且是本领域技术人员已知的技术。
如本文所用,术语单克隆抗体NB61N-62是指针对PIIINP的C末端新表位的新表位特异性抗体,所述新表位包括C末端序列CPTGXQNYSP-COOH(SEQ ID NO:4),其中X是Gly或Pro。
如本文所用,术语“PRO-C3”用于将本文所述的PIIINP测定与本领域已知的的PIIINP测定区分开来,本领域已知的PIIINP测定不基于源自PIIINP的新表位的特异性结合。
如本文所用,术语“PRO-C3X”测定是指本文描述的用于检测和定量交联PIIINP的夹心免疫测定。
WO 2014/170312中公开了一种适用于本发明方法的单克隆抗体,并且该抗体是与PIIINP的C末端新表位特异性反应的,所述新表位包括在C末端氨基酸序列CPTGXQNYSP-COOH(SEQ ID NO:4)中,其中X是Gly或Pro,并且其中所述单克隆抗体基本上不识别或结合所述C末端氨基酸序列延长形式,即CPTGXQNYSPQZ-COOH(SEQ ID NO:5),其中Z不存在或者是III型胶原序列的一个或多个氨基酸。
优选地,单克隆抗体与是人PIIINP中的新表位C末端序列CPTGPQNYSP-COOH(SEQID NO:6)特异性反应的,该序列通过来自人PIIINP中完整的III型前胶原的PIIINP在氨基酸P153-Q154之间的Pro-Gln键处的N蛋白酶切割形成。
或者,单克隆抗体可以是与啮齿动物PIIINP中的新表位C末端序列CPTGGQNYSP-COOH(SEQ ID NO:7)特异性反应的,所述新表位通过来自啮齿动物PIIINP中完整的III型前胶原的PIIINP在氨基酸P154-Q155之间的Pro-Gln键处的N蛋白酶切割形成。
优选地,单克隆抗体对氨基酸序列CPTGXQNYSP-COOH(SEQ ID NO:4)的亲和力与所述单克隆抗体对延长的氨基酸序列CPTGXQNYSPQZ-COOH(SEQ ID NO:5)的亲和力的比例为至少10比1,优选至少100比1,更优选至少1,000比1,更优选至少10,000比1,更优选至少100,000比1,最优选至少1,000,000比1。
优选地,单克隆抗体不识别或结合PIIINP的C末端新表位的缩短形式,所述缩短的新表位具有氨基酸序列CPTGXQNYS(SEQ ID NO:8)。
优选地,单克隆抗体对氨基酸序列CPTGXQNYSP-COOH(SEQ ID NO:4)的亲和力与所述单克隆抗体对缩短的氨基酸序列CPTGXQNYS-COOH(SEQ ID NO:8)的亲和力的比例为至少10比1,优选至少100比1,更优选至少1,000比1,更优选至少10,000比1,更优选至少100,000比1,最优选至少1,000,000比1。
本发明涉及用于检测在生物样品中交联的PIIINP的夹心免疫测定法,所述交联的PIIINP包括至少两条通过链间交联连接在一起的PIIINP,所述方法包括:
使包括所述交联的PIIINP的所述生物样品与结合至表面的第一单克隆抗体接触,其中包括在交联的PIIINP中的PIIINP每条链包括由N蛋白酶切割完整的Ⅲ型前胶原产生的PIIINP的C末端新表位;
加入第二单克隆抗体;以及
测定所述第二单克隆抗体的结合量;
其中所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体都是与所述PIIINP的C末端新表位特异性反应的,所述新表位包括在C末端氨基酸序列CPTGXQNYSP-COOH中,其中X是Gly或Pro。
优选地,单克隆抗体基本上不识别或结合所述C末端氨基酸序列的延长形式,即CPTGXQNYSPQZ-COOH,其中Z不存在或者是III型胶原序列的一个或多个氨基酸。
本文描述的夹心免疫测定法使用与捕捉器和检测器抗体二者相同的抗体,因此双链肽(即交联的)可以被该测定法识别。
优选地,夹心免疫测定法用于定量生物流体中交联的PIIINP的量,其中所述生物流体可以是但不限于血清、血浆、尿液、羊水、组织上清液或细胞上清液。
夹心免疫测定可以是但不限于放射免疫测定、荧光免疫测定或酶联免疫吸附测定。
在优选的实施方式中,第二单克隆抗体可以是标记的以测定所述第二单克隆抗体的结合量。
优选地,第二单克隆抗体可以是酶联抗体。酶可以是但不限于辣根过氧化物酶(HRP)。
优选地,第二单克隆抗体可以被放射性标记或与荧光团连接。
尽管这些是与本发明一起使用的优选标记,但设想可以使用任何合适的标记系统,诸如但不限于DNA报告子或电化学发光标签。
或者,可以使用识别第二单克隆抗体的另外的标记抗体来测定所述第二单克隆抗体的结合量。可以使用如上所述的标记来标记该另外的标记抗体。
在本发明的优选实施方式中,夹心免疫测定还可以包括将通过所述方法测定的交联PIIINP的量与已知疾病严重程度的标准纤维化疾病样品相关联,以评估纤维化疾病的严重程度。这种纤维化疾病可以是但不限于肝脏疾病。
另一方面,本文所述的夹心免疫测定可以在用于评估靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的药物(诸如靶向LOX的拮抗剂药物)的功效的方法中使用。
因此,本发明还涉及用于评估靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的拮抗剂药物的功效的方法,其中所述方法包括使用本文所述的夹心免疫测定法定量至少两种生物样品中交联的PIIINP的量,所述生物样品是在向所述受试者给药拮抗剂药物期间的第一时间点和至少一个随后的时间点从该受试者获得的,并且其中在给药拮抗剂药物期间从所述第一时间点至所述至少一个随后的时间点,交联的PIIINP的量的减少指示靶向LOX的拮抗剂药物有效。
优选地,该方法量化拮抗剂药物的有效性。
优选地,该方法评估靶向LOXL2的拮抗剂药物的功效。
另一方面,本发明涉及用于如本文所述的夹心免疫测定法的试剂盒,该试剂盒包括与上述第一单克隆抗体结合的固体载体;以及如上所述的标记的第二单克隆抗体。
实施例
材料和一般考虑
实验中使用的所有试剂均为来自Merck(Whitehouse Station,NJ,USA)和SigmaAldrich(St.Louis,MO,USA)等公司的高标准化学品。用于单克隆抗体生产和验证的合成肽是1)免疫原性肽:卵清蛋白(OVA)-CGG-CPTGPQNYSP(SEQ ID NO:10)、2)筛选肽:生物素-CGG-CPTGPQNYSP(SEQ ID NO:11)和3)选择肽:CPTGPQNYSP(SEQ ID NO 6)。所有合成肽均购自中国北京中肽生化有限公司(Chinese Peptide Company)。
实施例1-单克隆抗体NB61-N62
单克隆抗体的产生
在人类、大鼠和小鼠物种之间比对III型胶原的N末端前肽序列,并且通过蛋白质爆破选择物种之间的同源性和其他ECM蛋白质之间的独特性。PIIINPα1链中的氨基酸序列145'-CPTGPQNYSP-'153(SEQ ID NO:6)在人和大鼠之间是100%同源物(图1)。通过使用弗氏不完全佐剂用200μL乳化抗原和50μg PIIINP新表位C末端序列(OVA-CGG-CPTGPQNYSP(SEQ ID NO:10))皮下免疫4-5周龄Balb/C小鼠开始单克隆抗体的产生。每2周重复免疫,直至达到稳定的血清效价水平。选择血清效价最高的小鼠用于融合。小鼠休息一个月,然后在分离脾脏之前三天用100μL 0.9%NaCl溶液中的50μg PIIINP新表位C末端序列静脉内加强。如(34)所述,将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞,并使用半培养基方法在培养皿中克隆。使用有限稀释方法将克隆铺在96孔微量滴定板中进一步生长以确保单克隆生长。使用链霉亲和素包被的平板在间接ELISA中筛选上清液对校准物肽和天然材料的反应性。生物素-CGG-CPTGPQNYSP(SEQ ID NO:11)用作筛选肽,而游离肽CPTGPQNYSP(SEQID NO:6)用作校准物以测试克隆的进一步特异性。
克隆的表征
在初步ELISA中使用链霉亲和素包被的微量滴定板上的2ng/ml生物素化肽和来自增长的单克隆杂交瘤细胞的上清液,使用来自人和大鼠二者的不同生物材料(诸如尿液、血清和羊水(AF))对肽的天然反应性和亲和力进行评价。人AF获得自在北京妇产科医院(Beijing Obstetrics Gynecology Hospital)2个月期间进行选择性下段剖腹产手术的30名妇女。切开后直接采集100-200mL的AF,并将该流体储存在-20℃直至使用。
当地的道德委员会已经批准了这项研究,所有女性在收集之前都提供了书面同意。预期分娩前两天从怀孕的Wistar大鼠的子宫抽取鼠AF。使用去选择和延长肽(即分别具有10个氨基酸取代的校准物肽和在切割位点具有一个附加氨基酸的校准物肽)在初步测定中测试抗体特异性。使用Clonotyping System-HRP试剂盒cat.5300-05(SouthernBiotech,Birmingham,AL,USA)测定单克隆抗体的同种型。
抗体的表征
在蛋白质印迹(Western Blotting)之前,根据生产商的说明书使用二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定测量人和大鼠AF的总蛋白质浓度。简言之,用PBS将BCA从2mg/ml 2倍稀释以产生用于样品计算的标准行。用1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)将样品1:4稀释,并将25μL样品与200μL工作试剂(试剂A和B以50:1的比例混合)一起加入到微量滴定板中。将内容物在平板摇床上混合30秒,然后在37℃下温育30分钟。温育结束后,将板冷却至室温,并在ELISA读数仪中562nm处测量吸光度(Molecular Devices,SpectraMax M,CA,USA)。此后,将大鼠或人AF与样品缓冲液(×2)和还原剂(×10)混合,在70℃下加热10分钟,加载到4-20%tris-甘油十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-page)上,并在180V下跑胶(run)1小时。根据制造商的说明使用Invitrogen i-Blot凝胶转移系统将蛋白条带印迹到硝酸纤维素膜上。将膜在封闭缓冲液(在Tris-缓冲盐水中的含5%脱脂牛奶的吐温(TBST))中于4℃下封闭过夜,并与1μg/mL辣根过氧化物酶(HRP)偶联的PIIINP新表位特异性单克隆抗体NB61N-62温育2小时。通过以10:1比例加入过量的PIIINP新表位校准物肽和抗体研究PIIINP新表位特异性单克隆抗体的特异性,并预孵育1小时,加入至膜以过夜温育。温育后,将膜在TBST中洗涤4×10分钟,与4mL化学发光检测试剂盒(ECL)一起温育,并使用Amersham Hyperfilm显色。
克隆的选择和表征
亚型被确定为IgG1亚型。从蛋白质印迹分析中可见,PIIINP新表位特异性单克隆抗体NB61N-62识别出大鼠羊水中的分子大小约为52-60kDa的两个条带,但在人羊水中仅检测到一个约52kDa的条带。另外,信号在大鼠中可以被选择肽部分抑制,并且在人中被抑制(图2)。在ELISA中使用NB61N-62抗体观察到天然反应性。观察到对人血清、血浆和AF以及针对啮齿动物血清、血浆和AF天然反应性(图3A-3C)。对小鼠血清和血浆信号的抑制稍小。分别使用人类、啮齿动物和小鼠天然材料中的1:2至1:16、未稀释至1:8或未稀释至1:4,竞争性ELISA的信号被抑制。对于所有三种物种,天然材料的稀释大致遵循与校准曲线相同的稀释模式。人类AF抑制信号最高达100%;大鼠AF为80%;人血清和血浆和大鼠血清为70%;大鼠血浆为44%,小鼠血清和血浆为35%。使用延长肽(CPTGPQNYSPQ(SEQ ID NO:6))和无义肽(GSPGKDGVRG(SEQ ID NO:12))观察到零抑制(图3D)。
实施例2-使用NB61N-62的PRO-C3ELISA
收集来自产生抗体的杂交瘤的上清液并使用HiTrap亲和柱(GE Healthcare LifeScience,Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)纯化单克隆抗体,并根据制造商的说明使用Lightning-LinkTM HRP缀合试剂盒(Innova Biosciences,Babraham,Cambridge,英国)用HRP标记。
PRO-C3竞争性ELISA过程如下:用溶于包被缓冲液(50mM PBS-BTE+10%山梨醇,pH7.4)中的生物素化肽生物素-CGG-CPTGPQNYSP (SEQ ID NO:11)包被来自Roche,cat.11940279的96孔链霉亲和素包被ELISA板,在20℃在黑暗中温育30分钟,并随后在洗涤缓冲液(20mM Tris,50mM NaCl,pH 7.2)中洗涤。此后,将20μL肽校准物或样品加入适当的孔中,然后加入100μL溶解于温育缓冲液(50mM PBS-BTB+10%LiquidII(Roche),pH 7.4)中的HRP-缀合的单克隆抗体NB61N-62,并将板在4℃温育20小时并洗涤。最后,加入100μL四甲基联苯胺(TMB)(Kem-En-Tec cat.:438OH),将板在20℃在黑暗中温育15分钟,并且为了停止反应,加入100μL终止溶液(1%H2SO4),并在ELISA读数仪中在450nm处以650nm作为参照(Molecular Devices,SpectraMax M,CA,USA)分析了该板。使用4参数数学拟合模型绘制了校准曲线。
技术评估
使用2倍稀释的来自人和大鼠的健康血清和血浆样品来测定线性并且计算为100%样品的回收率百分比。将抗体特异性以100%校准物肽(CPTGPQNYSP(SEQ ID NO:6))、延长肽(CPTGPQNYSPQ(SEQ ID NO:13))和无义肽(GSPGKDGVRG(SEQ ID NO:12))计算。检测下限(LLOD)以来自标准K(即缓冲液)的21次测定的空白的平均值+3×标准偏差(SD)计算。检测上限(ULOD)被确定为标准A的10次测量的平均值–3×SD。定量下限(LLOQ)被确定为以低于30%的精度重复测量的最低浓度。批内和批间变异率由8个QC样品的10次独立运行测定,每次运行由样品的双重测定组成。在加标标准曲线或显著浓度的人羊水的健康人血清样品中测量样品的精确度,并以血清理论量的回收率百分比计算。在加标显著浓度的血红蛋白、脂血和生物素的健康人血清中测量干扰,并以血清理论量的回收率百分比计算。
结果
通过计算0.867-60.1ng/mL范围的ULOD和LLOQ,其中LLOD为0.606ng/mL,确定了人类PRO-C3ELISA的测量范围。PRO-C3ELISA的技术性能表现出平均值为11.03%和4.11%(表1)的可接受的批内和批间检测变异率,接受范围分别低于15%和10%。
表1:使用人血清质量对照样品#1-8(HS1-HS8)的PRO-C3测定的批内和批间变异率。该变异率以每个样品10次单独测定之间的平均变异率计算。
使用来自人、大鼠和小鼠的健康血清和血浆样品进行稀释回收。稀释回收率在可接受的100±20%回收率内(表2)。进一步的稀释导致测量值低于LLOQ。
表2:使用人、大鼠和小鼠样品进行PRO-C3测定的百分比稀释回收率。人血清(HS)、人血浆(HP)、大鼠血清(RS)、小鼠血清(MS)、小鼠血浆(MP)。
在血清或血浆中的加标校准物肽导致平均回收率分别为56%和55%(表3)。
表3:人血清或血浆中校准物肽的加标回收率,以及人血清或血浆中人AF的加标回收率。该回收率以血清/血浆中计算的肽/AF与纯血清/血浆相比的百分比回收率计算。校准肽的浓度为38.16ng/mL(StdB)、19.08ng/mL(StdC)、9.54ng/mL(StdD)、4.77ng/mL(StdE)、2.39ng/mL(StdF)和1.19ng/mL(StdG)。AF从1:2开始以2倍稀释加入。
然而,向健康人血清或血浆中从1:2开始以2倍稀释加标人AF导致平均回收率分别为100%和111%。在加标不同浓度血红蛋白、生物素和脂血的血清中未观察到干扰(表4)。
表4:在人血清中以各种浓度添加的血红蛋白、脂血和生物素的干扰。所有数据都显示为与纯血清相比的百分比回收率。
最高达4次冷冻/解冻循环的分析物的稳定性是可接受的,回收率为100±20%(表5)。
表5:4次冷冻/解冻循环中三种人血清和血浆样品中的分析物的稳定性。所有数据显示为与1次冷冻/解冻循环相比的平均回收率百分比。
实施例3-测定结合亲和力的比例
为了测定单克隆抗体对靶序列的结合亲和力与单克隆抗体对延长或缩短序列的结合亲和力的比例,合成每个序列并且用作如实施例2所述的PRO-C3ELISA中的校准物肽。所得校准曲线用于确定每个序列/抗体组合的IC50值。IC50[目标]/IC50[延长或缩短]的比例定义了结合亲和力的比例。
实施例4-PRO-C3X测定
如上所述,通过赖氨酰氧化酶(LOX)的酶促胶原交联和前胶原的加工是组织成熟和稳定性的关键。因此,监测III型前胶原在酶促加工之前的链间交联对于监测LOX的体内活性可能是有用的。这可以通过检测和定量交联的PIIINP(即在酶促加工前胶原之前通过III型前胶原中由LOX形成的链间连接结合在一起的两个或更多PIIINP链)来实现。在循环中检测到较高水平的交联PIIINP可以表示较高的LOX活性。因此,在针对LOX的药物(诸如LOX拮抗剂)药物试验期间监测交联的PIIINP的水平能够为所述药物提供有用的功效数据。
ELISA
用100μL/孔的1μg/mL生物素化捕捉器抗体(生物素连接的NB61-N62)包被链霉亲和素包被的板,并在20℃、300rpm振荡下温育30分钟。在洗涤缓冲液(20nM TRIS,50mMNaCl,pH 7.2)中洗涤板5次。加入样品、标准或对照(20μL),然后立即加入100μL测定缓冲液并在4℃、300rpm振荡下温育20小时。温育后,在洗涤缓冲液中洗涤板5次。加入100μL/孔的1μg/mL HRP标记的检测器抗体(HRP连接的NB61-N62),并在20℃、300rpm振荡下温育1小时。温育后,在洗涤缓冲液中洗涤板5次。加入体积为100μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)并在20℃在黑暗中温育15分钟。为了停止TMB的酶反应,加入100μL的0.1%硫酸。然后使用二次曲线拟合在ELISA读数仪上读取酶反应。每个ELISA板包括试剂盒对照样品和内部质量控制样品以监测批间变异率。在特异性测定范围内测定所有样品。低于定量下限(LLOQ)水平的所有样品都赋值为LLOQ。
该测定的技术特征是:
结果
瘢痕组织
使用肺成纤维细胞的体外模型(“罐中瘢痕”)的初步结果强烈表明LOX家族的酶负责PIIINP中的交联(在本领域中已知TGF-β增加赖氨酰氧化酶(LOX)的酶活性)。简言之,通过在拥挤的条件下和在TGF-β刺激下培养肺成纤维细胞5天产生Pro-C3X(即交联的PIIINP)。在用TGF-β培养12天后Pro-C3X显著升高,在不存在TGF-β的情况下观察到可忽略的量的Pro-C3X(图4)。类似地,与来自正常皮肤的提取物相比,在来自瘢痕疙瘩的提取物中Pro-C3X升高了(图5)。
肝纤维化
使用“Pro-C3X”测定对肝纤维化患者进行研究,并与本文所述的“Pro-C3”竞争性ELISA进行比较。发现了Pro-C3X在疾病的晚期阶段显著升高,当纤维化更严重时,在疾病的早期阶段具有与健康对照相似的水平(图6A)。相比之下,Pro-C3水平在疾病的各个阶段都不同(图6B)。
Pro-C3X测定和Pro-C3测定之间的选择性差异归因于Pro-C3X测定仅识别交联的PIIINP,而Pro-C3测定识别交联和非交联的PIIINP。图7显示了Pro-C3X测定,并为该结论背后的推理提供了图解说明:
Pro-C3X测定:如果存在交联的PIIINP,则第一抗体将与PIIINP的第一链上的游离表位结合,并且随后第二抗体将与PIIINP的第二链上的游离表位结合。然而,如果存在非交联的PIIINP,则表面结合抗体将与非交联的III型胶原的游离表位结合,但是由于结合表位已被占用,所以第二抗体将不能结合,因此第二抗体的加入将不能产生信号。因此,来自Pro-C3X测定的信号完全是由于检测到交联的PIIINP。
相反,在Pro-C3测定中基本上所有的抗体都将与包括游离结合表位的PIIINP链结合,而不管PIIINP是否交联。因此,从Pro-C3测定获得的信号是交联和非交联的PIIINP的聚集信号。
因此,正是这种选择性促使Pro-C3X测定用于评价靶向LOX的药物的功效;如上所述,监测PIIINP交联的水平表明了在向受试者给药期间LOX活性的结果,可以用于监测药物活性并由此监测所述药物的功效。
酒精性脂肪性肝炎
使用“Pro-C3X”测定对酒精性脂肪性肝炎患者进行研究,并与本文所述的“Pro-C3”测定进行比较。在酒精性脂肪性肝炎中,Pro-C3和Pro-C3X在疾病晚期(Metavir2-4)升高。然而,对于肝硬化患者,Pro-C3与MELD(终末期肝病模型)评分(P=0.527)不相关,而Pro-C3X与之强相关(相关系数3.34,P<0.001)。此外,ProC3仅与白蛋白负相关,而ProC3X与白蛋白、胆红素和γ-谷氨酰转肽酶(GGT)相关(图8)。Pro-C3X的后期增加表明PIIINP的交联增加,这与肝脏瘢痕增加(即LOX活性增加)相一致。
实施例5评估罐中瘢痕模型中的Pro-C3X
背景:纤维化是细胞外基质(ECM)在受影响的组织内的积聚,可导致器官衰竭并最终导致死亡。在受到例如转化生长因子(TGF)-β的刺激时成纤维细胞是负责ECM蛋白特别是胶原的过度积聚的主要细胞类型。在这里,我们描述了体外模型“罐中瘢痕”(已知其产生ECM和交联)与Pro-C3X ELISA组合使用以研究纤维形成期间的胶原形成和交联。通过评估这些纤维化过程的调节,该工具能够用于新型抗纤维化化合物的研究中。
方法:健康的人肺成纤维细胞(L248)生长至汇合,然后以30,000个细胞/孔的密度接种。使细胞在包含0.4%FCS、225mg/mL聚蔗糖(ficoll)70、150mg/mL聚蔗糖400和1%抗坏血酸的DMEM培养基中生长18天。使用具有或不具有赖氨酰氧化酶(LOX)抑制剂β-氨基丙腈(BAPN;0.02或0.2mM)的1ng/mL TGF-β刺激细胞以抑制交联的形成。未刺激的细胞或生长在不含聚蔗糖的培养基中的细胞用作对照。在第3天、第6天、第10天和第14天更换培养基。使用AlamarBlue测定评价成纤维细胞存活率。使用上述Pro-C3X夹心ELISA评价收集的上清液中的Pro-C3X水平。
结果:TGF-β刺激诱导从第3天Pro-C3X的释放,在第10天Pro-C3X水平达到峰值,与未刺激细胞相比显示出14倍的增加(p<0.0001;图9)。用0.02mM BAPN处理没有显著效果,但与仅用TGF-β刺激相比,0.2mMBAPN诱导Pro-C3X水平显著降低(0.59倍变化,p<0.0001;图9)。
结论:泛LOX抑制剂BAPN在0.2mM浓度下显著降低Pro-C3X水平,说明Pro-C3XELISA评价交联表位。因此,Pro-C3X ELISA可用于评估成纤维细胞活性并因此用于筛选潜在的抗纤维化化合物。TGF-β刺激诱导的Pro-C3X(交联的III型胶原前肽的标志物)释放。
总之,Pro-C3X测定是第二代测定,其将III型胶原前肽的切割新表位与分子中交联的存在相结合。因此该测定为Pro-C3的测量提供了附加信息,因为其描述纤维化时间表中的不同过程;即瘢痕中胶原分子的交联。因此,Pro-C3X测定可用于测试靶向LOX的药物,特别是LOX拮抗剂/抑制剂的功效,因为LOX抑制剂的使用显示出减少了交联PIIINP的生物标志物的存在。
在本说明书中,除非明确另有指示,否则使用术语“或”是指当符合所述条件中的一个或两个时返回真值的运算符,而不是要求仅满足一个条件的运算符“互斥或”。“包括”一词在“包含”的意义上使用,而不是用于表示“由...组成”。上面承认的所有在先教导都通过引用并入本文。在此之前不承认任何在先公布的文件应该被认为是承认或表示其教导在此日期在澳大利亚或其他地方是公知常识。
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<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 现有技术肽
<220>
<221> 位点
<222> 2
<223> 乙酰氨基保护的Cys
<400> 1
Ile Cys Gln Ser Cys Pro Thr Gly Gly Glu Asn Tyr Ser Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 牛
<220>
<223> 牛PIIINP的C末端序列
<400> 2
Ile Cys Gln Ser Cys Pro Thr Gly Gly Gln Asn Tyr Ser Pro
1 5 10
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> C末端PIIINP序列
<400> 3
Gly Ser Pro Gly Pro Pro Gly Ile Cys Gln Ser Cys Pro Thr Gly Pro
1 5 10 15
Gln Asn Tyr Ser Pro
20
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体表位
<220>
<221> 位点
<222> 5
<223> Xaa可以是Pro或Gly
<400> 4
Cys Pro Thr Gly Xaa Gln Asn Tyr Ser Pro
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 延长的表位肽
<220>
<221>
<222> 5
<223> Xaa可以是Pro或Gly
<220>
<221> 位点
<222> 12
<223> Xaa可以不存在或者可以是III型胶原序列的一个或多个氨基酸
<400> 5
Cys Pro Thr Gly Xaa Gln Asn Tyr Ser Pro Gln Xaa
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人PIIINP新表位C末端序列
<400> 6
Cys Pro Thr Gly Pro Gln Asn Tyr Ser Pro
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 啮齿目
<220>
<223> 啮齿动物PIIINP新表位C末端序列
<400> 7
Cys Pro Thr Gly Gly Gln Asn Tyr Ser Pro
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缩短表位肽
<220>
<221> 位点
<222> 5
<223> Xaa可以是Pro或Gly
<400> 8
Cys Pro Thr Gly Xaa Gln Asn Tyr Ser
1 5
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 位点
<222> 1
<223> Xaa不存在或是生物素化的Cys Gly Gly
<220>
<223> 生物素化肽
<220>
<221> 位点
<222> 2
<223> 如果Xaa不存在,则Cys被生物素化
<400> 9
Xaa Cys Pro Thr Gly Pro Gln Asn Tyr Ser Pro
1 5 10
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 位点
<222> 1
<223> Cys具有N末端结合的卵清蛋白
<220>
<223> 卵清蛋白结合
<400> 10
Cys Gly Gly Cys Pro Thr Gly Pro Gln Asn Tyr Ser Pro
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 位点
<222> 1
<223> Cys是N末端生物素化的
<220>
<223> 生物素化肽
<400> 11
Cys Gly Gly Cys Pro Thr Gly Pro Gln Asn Tyr Ser Pro
1 5 10
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 无义肽
<400> 12
Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 延长肽
<400> 13
Cys Pro Thr Gly Pro Gln Asn Tyr Ser Pro Gln
1 5 10
<210> 14
<211> 179
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Met Met Ser Phe Val Gln Lys Gly Ser Trp Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
His Pro Thr Ile Ile Leu Ala Gln Gln Glu Ala Val Glu Gly Gly Cys
20 25 30
Ser His Leu Gly Gln Ser Tyr Ala Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu
35 40 45
Pro Cys Gln Ile Cys Val Cys Asp Ser Gly Ser Val Leu Cys Asp Asp
50 55 60
Ile Ile Cys Asp Asp Gln Glu Leu Asp Cys Pro Asn Pro Glu Ile Pro
65 70 75 80
Phe Gly Glu Cys Cys Ala Val Cys Pro Gln Pro Pro Thr Ala Pro Thr
85 90 95
Arg Pro Pro Asn Gly Gln Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Pro Gly
100 105 110
Pro Pro Gly Ile Pro Gly Arg Asn Gly Asp Pro Gly Ile Pro Gly Gln
115 120 125
Pro Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Pro Gly Ile Cys Glu Ser Cys
130 135 140
Pro Thr Gly Pro Gln Asn Tyr Ser Pro Gln Tyr Asp Ser Tyr Asp Val
145 150 155 160
Lys Ser Gly Val Ala Val Gly Gly Leu Ala Gly Tyr Pro Gly Pro Ala
165 170 175
Gly Pro Pro
<210> 15
<211> 178
<212> PRT
<213> 大鼠属
<400> 15
Met Met Ser Phe Val Gln Cys Gly Thr Trp Phe Leu Leu Thr Leu Leu
1 5 10 15
His Pro Ser Leu Ile Leu Ala Gln Gln Ser Asn Val Asp Glu Leu Gly
20 25 30
Cys Asn Tyr Leu Gly Gln Ser Tyr Glu Ser Arg Asp Val Trp Lys Pro
35 40 45
Glu Pro Cys Gln Ile Cys Val Cys Asp Ser Gly Ser Val Leu Cys Asp
50 55 60
Asp Ile Met Cys Asp Asp Glu Pro Leu Asp Cys Pro Asn Pro Glu Ile
65 70 75 80
Pro Phe Gly Glu Cys Cys Ala Ile Cys Pro Gln Pro Ser Thr Pro Ala
85 90 95
Pro Val Ile Pro Asp Gly Asn Arg Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Pro
100 105 110
Gly Pro Pro Gly Ile Pro Gly Arg Asn Gly Asp Pro Gly Leu Pro Gly
115 120 125
Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Ile Cys Glu Ser
130 135 140
Cys Pro Thr Gly Gly Gln Asn Tyr Ser Pro Gln Phe Asp Ser Tyr Asp
145 150 155 160
Val Lys Ser Gly Val Gly Gly Met Gly Gly Tyr Pro Gly Pro Ala Gly
165 170 175
Pro Pro

Claims (16)

1.一种用于检测在生物样品中交联的PIIINP的夹心免疫测定法,所述交联的PIIINP包括通过链间交联连接在一起的至少两条PIIINP链,所述方法包括:
使包括所述交联的PIIINP的所述生物样品与结合至表面的第一单克隆抗体接触,其中包括在所述交联的PIIINP中的PIIINP每条链包括由N蛋白酶切割完整的Ⅲ型前胶原产生的PIIINP的C末端新表位;
加入第二单克隆抗体;以及
测定所述第二单克隆抗体的结合量;
其中所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体都是与所述PIIINP的C末端新表位特异性反应的,所述新表位被包括在C末端氨基酸序列CPTGXQNYSP-COOH中,其中X是Gly或Pro。
2.根据权利要求1所述的夹心免疫测定法,其中所述单克隆抗体基本上不识别或结合所述C末端氨基酸序列的延长形式CPTGXQNYSPQZ-COOH,其中Z不存在或者是所述III型胶原序列的一个或多个氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的夹心免疫测定法,其中所述夹心免疫测定法用于定量生物样品中交联的PIIINP的量。
4.根据权利要求3所述的夹心免疫测定法,还包括将由所述方法测定的交联PIIINP的量与已知疾病严重程度的标准纤维化疾病样品相关联以评估纤维化疾病的严重程度。
5.根据权利要求4所述的夹心免疫测定法,其中所述纤维化疾病是肝病。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的夹心免疫测定法,其中所述生物样品是生物流体。
7.根据权利要求6所述的夹心免疫测定法,其中所述生物流体是血清、血浆、尿液、羊水、组织上清液或细胞上清液。
8.根据前述权利要求中任一项所述的夹心免疫测定法,其中所述夹心免疫测定法是放射免疫测定、荧光免疫测定或酶联免疫吸附测定。
9.根据前述权利要求中任一项所述的夹心免疫测定法,其中所述第二单克隆抗体是标记的。
10.根据权利要求9所述的夹心免疫测定法,其中所述第二单克隆抗体是酶联抗体。
11.根据权利要求10所述的夹心免疫测定法,其中所述酶是辣根过氧化物酶(HRP)。
12.根据权利要求9所述的夹心免疫测定法,其中所述第二单克隆抗体被放射性标记或与荧光团连接。
13.根据权利要求1至8中任一项所述的夹心免疫测定法,其中使用识别所述第二单克隆抗体的另外的标记抗体来测定所述第二单克隆抗体的结合量。
14.一种用于评估靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的拮抗剂药物的功效的方法,其中所述方法包括使用根据权利要求1所述的夹心免疫测定法定量至少两种生物样品中交联的PIIINP的量,所述生物样品是在向受试者给药拮抗剂药物期间的第一时间点和至少一个随后的时间点从所述受试者获得的,并且其中在给药拮抗剂药物期间从所述第一时间点至所述至少一个随后的时间点,交联的PIIINP的量的减少指示靶向LOX的拮抗剂药物有效。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述方法评估靶向LOXL2的拮抗剂药物的功效。
16.一种用于夹心测定的试剂盒,所述试剂盒包括:
与如权利要求1中限定的所述第一单克隆抗体结合的固体载体;
以及
如权利要求1中限定的所述第二单克隆抗体,所述第二单克隆抗体包括标记物。
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