JP7094219B2 - 線維症の組み合わせたバイオマーカー測定 - Google Patents
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Description
細胞外マトリックス(ECM)
前記架橋PIIINPを含む前記生体サンプルと、ある表面に結合した第1のモノクローナル抗体とを接触させることであって、架橋PIIINPに含まれるそれぞれのPIIINP鎖が、インタクトなIII型プロコラーゲンのN-プロテアーゼ開裂によって生成するPIIINPのC末端ネオエピトープを有する、接触させることと、
第2のモノクローナル抗体を加えることと、
前記第2のモノクローナル抗体の結合量を決定することとを含み、
前記第1のモノクローナル抗体および前記第2のモノクローナル抗体は、両方とも、PIIINPの前記C末端ネオエピトープに特異的に反応し、前記ネオエピトープは、C末端アミノ酸配列CPTGXQNYSP-COOHを含み、XはGlyまたはProである、サンドイッチイムノアッセイに関する。
実験で使用した全ての試薬は、Merck(ホワイトハウスステーション、NJ、USA)製およびSigma Aldrich(セントルイス、MO、USA)製の高級化学品であった。モノクローナル抗体製造およびバリデーションに使用される合成ペプチドは、(1)免疫原性ペプチド:オボアルブミン(OVA)-CGG-CPTGPQNYSP(配列番号10)、(2)スクリーニングペプチド:ビオチン-CGG-CPTGPQNYSP(配列番号11)および(3)選択ペプチド:CPTGPQNYSP(配列番号6)であった。全ての合成ペプチドは、中国北京のChinese Peptide Companyから購入した。
実施例1-モノクローナル抗体NB61-N62
モノクローナル抗体の生成
クローンのキャラクタライゼーション
抗体のキャラクタライゼーション
クローンの選択とキャラクタライゼーション
実施例2-NB61N-62を用いたPRO-C3 ELISA
技術的評価
結果
実施例4-PRO-C3Xアッセイ
ELISA
肝線維症
アルコール性脂肪性肝炎
実施例5 Scar-in-a-JarモデルにおけるPro-C3Xの評価
<223>従来技術のペプチド
<223>アセトアミド保護されたCys
配列表2 <223>ウシPIIINPのC末端配列
配列表3 <223>C末端PIIINP配列
配列表4
<223>抗体エピトープ
<223>XaaはProまたはGlyであってもよい
配列表5
<223>伸長されたエピトープペプチド
<223>XaaはProまたはGlyであってもよい
<223>Xaaは存在しなくてもよく、またはIII型コラーゲンの配列の1つ以上のアミノ酸であってもよい
配列表6 <223>ヒトPIIINPネオエピトープC末端配列
配列表7 <223>げっ歯類PIIINPネオエピトープC末端配列
配列表8
<223>短くなったエピトープペプチド
<223>XaaはProまたはGlyであってもよい
配列表9
<223>Xaaは存在しないか、またはビオチン化-Cys Gly Glyである
<223>ビオチン化ペプチド
<223>Xaaが存在しない場合、Cysはビオチン化されている
配列表10
<223>CysはN末端に結合したオボアルブミンを含む
<223>結合したオボアルブミン
配列表11
<223>CysはN末端がビオチン化されている
<223>ビオチン化ペプチド
配列表12 <223>ナンセンスペプチド
配列表13 <223>伸長されたペプチド
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Claims (16)
- 生体サンプルにおいて非架橋PIIINPを検出することなく架橋PIIINPを検出するためのサンドイッチイムノアッセイであって、前記架橋PIIINPが、鎖間架橋によって一緒に接続したPIIINPの少なくとも2つの鎖を含み、この方法が、
前記架橋PIIINPを含む前記生体サンプルと、ある表面に結合した第1のモノクローナル抗体とを接触させることであって、架橋PIIINPに含まれるそれぞれのPIIINP鎖が、インタクトなIII型プロコラーゲンのN-プロテアーゼ開裂によって生成するPIIINPのC末端ネオエピトープを有する、接触させることと、
第2のモノクローナル抗体を加えることと、
前記第2のモノクローナル抗体の結合量を決定することと
を含み、
前記第1のモノクローナル抗体および前記第2のモノクローナル抗体は、両方とも、PIIINPの前記C末端ネオエピトープに特異的に反応し、前記C末端ネオエピトープは、C末端アミノ酸配列CPTGXQNYSP-COOHを含み、XはGlyまたはProである、サンドイッチイムノアッセイ。 - 前記第1のモノクローナル抗体および前記第2のモノクローナル抗体が、CPTGXQNYSPQZ-COOHである前記C末端アミノ酸配列の伸長形態を認識しないか、または結合せず、ここで、Zは、存在しないか、またはIII型コラーゲンの配列の1つ以上のアミノ酸である、請求項1に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
- 前記サンドイッチイムノアッセイを使用し、前記生体サンプル中の架橋PIIINPの量を定量する、請求項1または2に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
- 前記方法によって決定された架橋PIIINPの量と、既知の疾患重篤度の標準的な線維性疾患サンプルとを関連づけることをさらに含む、線維性疾患の重篤度を評価するための、請求項3に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
- 前記線維性疾患が肝疾患である、請求項4に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
- 前記生体サンプルが、生体液である、請求項3~5のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
- 前記生体液が、血清、血漿、尿、羊水、組織上清または細胞上清である、請求項6に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
- 前記サンドイッチイムノアッセイが、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着法である、請求項1~7のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
- 前記第2のモノクローナル抗体が、標識されている、請求項1~8のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
- 前記第2のモノクローナル抗体が、酵素結合抗体である、請求項9に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
- 前記酵素結合抗体の酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)である、請求項10に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
- 前記第2のモノクローナル抗体が、放射性標識されているか、またはフルオロフォアに結合している、請求項9に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
- 前記第2のモノクローナル抗体を認識するさらに標識された抗体を使用し、前記第2のモノクローナル抗体の結合量を決定する、請求項1~8のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
- リシルオキシダーゼ(LOX)を標的とするアンタゴニスト薬の効能を評価するための方法であって、請求項1に記載のサンドイッチイムノアッセイを用い、少なくとも2つの生体サンプル中の架橋PIIINPの量を定量することを含み、前記生体サンプルが、対象に対してアンタゴニスト薬を投与する期間中、第1の時間点と少なくとも1つのその後の時間点で対象から得られたものであり、アンタゴニスト薬を投与する期間中、第1の時間点から少なくとも1つのその後の時間点までに架橋PIIINPの量が減少することは、LOXを標的とする有効なアンタゴニスト薬の指標である、方法。
- 前記方法が、LOXL2を標的とするアンタゴニスト薬の効能を評価する、請求項14に記載の方法。
- サンドイッチアッセイで生体サンプルにおいて非架橋PIIINPを検出することなく架橋PIIINPを検出するためのキットであって、
第1のモノクローナル抗体と、
前記第1のモノクローナル抗体に結合する固体支持体と、
場合によっては標識を含む第2のモノクローナル抗体とを含み、
前記第1のモノクローナル抗体および前記第2のモノクローナル抗体は、両方とも、PIIINPのC末端ネオエピトープに特異的に反応し、前記C末端ネオエピトープは、C末端アミノ酸配列CPTGXQNYSP-COOHを含み、XはGlyまたはProである、キット。
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