JP6706297B2 - 病理学バイオマーカーアッセイ - Google Patents

Description

本発明は、疾患を発生するリスク、例えば、慢性損傷後に線維症を発生するリスクを示
すバイオマーカーを含めた、線維症疾患を含む様々な疾患の診断およびそれの発生の予後
に有用なバイオマーカーについてのアッセイに関する。強直性脊椎炎などの炎症性疾患に
ついてのバイオマーカーもまた記載され、心血管疾患（ＣＶＤ）についてのバイオマーカ
ーも同様である。

特に、本発明によれば、コラーゲンＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、およびＶＩ型、エ
ラスチン、Ｃ反応性タンパク質、アポＥ、ルミカン、ＬＡＭＣ１、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＡ
５、ならびにビグリカン、デコリン、バーシカン、およびパールカンを含むプロテオグリ
カンの分解断片に関するバイオマーカーは、有用であることが見出されている。

（表１に列挙されたものを含む）線維性疾患は、罹患率および死亡率の主な原因であり
、例えば、肝硬変は世界中で１年あたり８００，０００人の死亡がある^１。

「線維性疾患」は、主な症状としてであるか二次的症状としてであるかに関わらず、線
維症を生じる任意の疾患である。

線維症は、持続性感染、自己免疫反応、アレルギー応答、化学的傷害、放射線照射、お
よび組織損傷を含む様々な刺激によって誘発される慢性炎症反応の最終結果である。線維
症は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の蓄積および再編成によって特徴づけられる。明ら
かな病原学的および臨床的差異があるにも関わらず、たいていの慢性線維性障害は、結合
組織要素、特にコラーゲンおよびプロテオグリカンの沈着（これらは正常な組織構造を進
行性にリモデリングして、破壊する^３、４）を協力し合って刺激する、成長因子、タンパ
ク質分解酵素、血管新生因子、および線維形成性サイトカインの産生を維持する持続性刺
激物質を共通して有する。そのヒト健康への多大な影響にも関わらず、線維症の機構を直
接、標的にする、認可された処置が現在、存在しない^５。

線維症の鍵となる細胞メディエータは、筋線維芽細胞であり、これは、活性化された場
合、主要なコラーゲン産生細胞として働く。

＜炎症状態＞
強直性脊椎炎（ＡＳ）は、脊椎および仙腸関節の慢性炎症の一形態である。長期にわた
ると、脊椎の慢性炎症は、椎骨の完全なセメンテーション（分子病理学がまだ調査されて
おらず、完全には理解されていない過程）をもたらし得る（１１０）。全身性疾患でもあ
り、他の関節、ならびに眼、心臓、肺、および腎臓などの器官の炎症または損傷を含む、
体中の他の組織を冒す（１１１）。複数の組織を巻き込む、ＡＳにおける炎症関連過程は
、大部分の型の結合組織ターンオーバーに見られる、ＭＭＰ活性の増加およびコラーゲン
沈着を含む分子過程を伴うようである。

細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リモデリングは、組織恒常性の重要な過程である（１１
２、１１３）。特異的なタンパク質分解活性は、ＥＣＭ内の一連の細胞機能および相互作
用にとっての必要条件である（１１４）。これらの特異的な活性は、正常な生理的状況下
で正確に協調されており、特定化された一連の事象は、調節された組織ターンオーバーを
生じる。病的状況において、結合組織疾患に特に重点を置くと、正常な修復−応答関係は
妨害され（１１５）、過剰なリモデリングおよび組織ターンオーバーをもたらす。このＥ
ＣＭリモデリングの結果は、病的に冒された領域に局所的に発現するプロテアーゼによっ
て生成される、タンパク質の一連の分解産物である、ネオエピトープの放出である。これ
らのタンパク質分解断片は、それらの未切断の起源と比較して由来の組織に対してより特
異的であるため、分子バイオマーカー標的としての役割を果たす可能性がある（１１６）
。

マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）などのエンドペプチダーゼは、コラーゲ
ンおよびプロテオグリカンなどのＥＣＭタンパク質の分解において主要な役割を果たす（
１１７、１１８）。特に、線維症などの結合組織疾患において、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ
−９は、高度に上方制御されることが示されている（１１９〜１２１）。最近、尿および
血清中に見出されるネオエピトープに基づいた生化学的マーカーが、それらの診断的およ
び予後的な潜在能力について、注目度が増加している（１１６）。特に、骨粗鬆症および
変形性関節症などの進行が遅い疾患について、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲン分解産物にそ
れぞれ、基づいた、骨吸収マーカーおよび軟骨分解マーカーが広範に研究されている（１
２２）。

＜細胞外マトリックス（ＥＣＭ）＞
線維形成は、組織損傷から通常生じる複雑な細胞性および分子性機構を含む動的過程で
ある^６。線維形成は、高分子の濃度を変化させ、組織サイズおよび密度の増加をもたらす
、正常なＥＣＭ制御における不均衡の結果であり、次第に機能が損なわれる。これらの高
分子は、主に、コラーゲンおよびプロテオグリカンなどの構造機能および接着機能を有す
る線維性タンパク質である。

＜コラーゲン＞
コラーゲンは、ヒト身体において広く分布しており、すなわち、ヒト身体におけるタン
パク質質量の約３０％がコラーゲンで構成されている。コラーゲンは、ほとんどの結合組
織のＥＣＭの構造的完全性を担う。ＥＣＭ内容物は、遺伝子発現およびタンパク質分泌の
制御を介してだけでなく、メタロプロテイナーゼおよびシステインプロテアーゼによる内
因性プロテアーゼ抑制およびタンパク質分解を介して、厳重に調節される合成と分解の間
の微妙な均衡に起因する^７〜９。表２は、主要なコラーゲンの型をそれらの主要な組織分
布と共に列挙している。

Ｉ型コラーゲンは、最も豊富なコラーゲンであり、たいていの結合組織に見出される。
コラーゲンは骨および皮膚の構造のために特に重要であり、そこでの主要なコラーゲン成
分はＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンである^１０。

コラーゲンＩ型およびＩＩＩ型は、健康な組織において１：１の比で存在する、肝臓お
よび肺の主要な構成要素である。加えて、コラーゲンＩＶ型およびＶＩ型は、たいていの
組織において基底膜内に見出される。Ｖ型コラーゲンの最も一般的な局在は、コラーゲン
Ｉ型およびＩＩＩ型と会合して、特徴的なコラーゲン原線維内にある^１０。

いくつかのコラーゲンは、限定的な組織分布を有する：例えば、ＩＩ型は、ほとんど軟
骨内のみに見出される^１１。

線維形成中、コラーゲンの正味の量は増加する^{１２〜１４}。表３は、例として、肝線維
症中のコラーゲンの増加を示している。

Ｖ型コラーゲンは、ｃｏｌ５ａ１−／−マウスにおけるコラーゲン原線維形成のほとん
ど事実上の欠如によって例示される、コラーゲン原線維の形成に極めて重要であることが
実証されている（１２３）。アラインメントにおいて、ヘテロ接合性マウスは、原線維数
および皮膚コラーゲン含有量の５０％低下に関連していた。これは、原線維形成の寿命依
存性制御におけるＶ型コラーゲンの中心的役割を示しており、このコラーゲンの型が、多
くの結合性疾患における極めて重要な関心対象であることを示唆している。しかしながら
、結合性疾患におけるＶ型コラーゲンターンオーバーの役割の理解における概念的欠如が
依然としてあり、これは、コラーゲンＶ型分解およびターンオーバーの調査を行う技術的
能力がないことに一部より得る。興味深いことに、ごく最近、限定された種々のタンパク
質のセットが、Ｖ型コラーゲンに結合することが見出され、この分子の分子機能をより詳
細に解明し始めており、ＭＭＰ−２はそれらのうちの１つであった（１２４）。分子の特
徴づけに加えて、Ｖ型コラーゲンが、動的運動性および他の細胞活性を誘導することによ
り異なる細胞表現型に直接、影響するという、より多くの証拠が現れつつあり、このタン
パク質が、ＥＣＭの受動的構成要素だけにとどまらない可能性があることを示唆している
（１２５、１２６）。これを直接的に支持するものとして、本発明者らは、最近、肝線維
症の２つの別々の動物モデルにおいて、肝線維症とＶ型コラーゲン形成との非常に強い相
関を記載し（１２７）、過剰な組織ターンオーバーにおけるＶ型コラーゲン形成の中心的
役割を示唆した。

Ｖ型コラーゲンは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、およびＸＩ型と共に、原線維形成コラー
ゲンであり（１１）、３つの異なるα鎖（α１、α２、α３）のヘテロ三量体として形成
される。それは、典型的には、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンと共にヘテロ原線維を形成
し、有機骨マトリックス、角膜実質、ならびに筋肉、肝臓、肺、および胎盤の間質マトリ
ックスに寄与する（１２８）。Ｖ型コラーゲン突然変異は、一連の結合組織疾患を生じ、
その疾患のうち、エーラス−ダンロス症候群（ＥＤＳ）が最もよく表している。ＥＤＳは
、関節過度可動性、皮膚変化（例えば、過伸展性、痩せ、および脆弱性）によって特徴づ
けられる、遺伝性障害の混成群である。その疾患は、異なる亜型、ＥＤＳ−ＩおよびＩＩ
に分けることができる。Ｉ型ＥＤＳおよびＩＩ型ＥＤＳは、萎縮性瘢痕、皮膚過伸展性、
および関節弛緩症によって特徴づけられる。両方の亜型は、Ｖ型コラーゲンのポリペプチ
ド鎖の２つをコードするＣＯＬ５Ａ１およびＣＯＬ５Ａ２遺伝子における突然変異に起因
することは明らかである（１２９〜１３１）。これは、結合組織疾患におけるＶ型コラー
ゲンの重要性を浮き彫りにしている。

＜エラスチン＞
エラスチンは、多くの結合組織、主に弾性である結合組織内に存在するタンパク質であ
る。エラスチンは、アミノ酸のグリシン、バリン、アラニンおよびプロリンの含有量が非
常に高く、６４〜６６ｋＤａの分子量を有する。エラスチンは、８３０個のアミノ酸で構
成される不規則な、またはランダムコイルの高次構造に組織化されている。エラスチンは
、リジルオキシダーゼによって触媒される反応において、多くの可溶性トロポエラスチン
タンパク質分子を連結して、塊状の不溶性で耐久性のある架橋したアレイを生成すること
により生じる。

エラスチンは、血流を助けるための圧力波伝播の媒体として動脈中、重要な機能を果た
し、大動脈などの大きな弾性血管で特に豊富である。エラスチンはまた、肺、弾性靱帯、
および皮膚において非常に重要である。

エラスチンの合成およびターンオーバーの理解に多くの努力が注がれたにも関わらず、
このマトリックス分子のタンパク質分解性切断から生じるネオエピトープは、これまで、
線維症における疾患発生と関連づけられたことはない。

＜ビメンチン＞
ビメンチンは、中間径フィラメントファミリーのタンパク質のメンバーである。中間径
フィラメントは、真核細胞の重要な構造的特徴である。それらは、微小管およびアクチン
マイクロフィラメントと共に、細胞骨格を形成する。たいていの中間径フィラメントは安
定な構造であるが、線維芽細胞において、ビメンチンは、動的構造として存在する。この
フィラメントは、中胚葉由来組織についてのマーカーとして用いられ、その結果、肉腫に
ついての免疫組織化学的マーカーとして用いられている。

Ｈｅｒｔｉｇら（Ｈｅｒｔｉｇら、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．２００８ Ａ
ｕｇ；１９（８）：１５８４〜９１）は、慢性移植腎症を有する対象の腎尿細管上皮細胞
における上皮間葉転換が、同種移植片における線維症の進行を予測することができるかど
うかを調べ、これらの対象から得た８３個の生検においてビメンチン発現を測定した。彼
らは、手術後１年目におけるビメンチン発現の上昇と腸線維症スコアとの間の関連を見出
した。

肝線維症の別の研究において、Ｍｅｒｉｄｅｎら（Ｍｅｒｉｄｅｎら、Ｃｌｉｎ Ｇａ
ｓｔｒｏ ＆ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０１０；８：２８９〜２９６）は、（Ｆ０段階に得ら
れた生検における）ビメンチン発現と線維症進行との間の有意な関連を見出し、上昇した
レベルが、肝線維症の急速な進行を予測した。

したがって、本発明者らは、ビメンチンの循環断片が、線維症の高感度かつ特異的なバ
イオマーカーとしての役割を果たすことができるかどうかを調べたいと考えた。

＜プロテオグリカン＞
プロテオグリカンは、コアタンパク質に様々な数のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）側
鎖を共有結合している高分子の多様な群である^１６。これらのＧＡＧは、二糖繰り返し（
例えば、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）のポリマーであ
り、二糖単位上のヒドロキシル側鎖、カルボキシル化側鎖、および硫酸化側鎖により酸性
（負荷電）である。これは、それらを高親水性にし、それに従って、水および陽イオン（
例えば、細胞外液からのナトリウム）の拡散を助ける^１７。さらに、ＧＡＧは、例えば、
ヒアルロン酸鎖との非共有結合性連結を形成し、さらにより大きい分子複合体を形成する
能力を有する^１６。表４は、結合組織に関連した最も研究されているプロテオグリカンを
列挙する。

＜Ｃ反応性タンパク質＞
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、炎症、感染、または外傷などの種々の臨床状態に応
答して肝臓により産生される急性期血清タンパク質である^２９。ＣＲＰの産生は、患部組
織または損傷組織から放出されるＩＬ−６などのサイトカインにより誘導される。ＣＲＰ
の生理学的役割はまだわかっておらず、それの炎症促進性または抗炎症性作用の議論が進
行中である。

＜アポリポタンパク質Ｅ＞
アポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）は、肝細胞および末梢細胞上の特定の受容体に結合す
る、キロミクロン（大きいリポタンパク質粒子）および中間密度リポタンパク質粒子に見
出されるアポリポタンパク質の分類である。アポＥは、トリグリセリドリッチなリポタン
パク質成分の正常な代謝に必須である。アポＥは、２９９アミノ酸長であり、リポタンパ
ク質、脂溶性ビタミン、およびコレステロールをリンパ系へ、その後、血液へ輸送する。
それは、主に肝臓内で合成されるが、脳、腎臓、および脾臓などの他の組織内でも見出さ
れている。アポＥは、トリグリセリドリッチなリポタンパク質成分の正常な代謝に必須で
ある。アポＥは、最初、リポタンパク質代謝および心血管疾患におけるそれの重要性で知
られていた。

＜エラスチン＞
エラスチンは、組織の弾性に関与する細胞外マトリックス分子であり、最初、その役割
に限定されると考えられていた。エラスチン分解が、正常細胞および腫瘍細胞の幅広いパ
ネルにおいて細胞走化性、細胞増殖、およびプロテアーゼ合成に影響する生理活性ペプチ
ドの産生をもたらし得ることが今や、確立されている。

＜ＬＡＭＣ１、ＬＡＭＡ２、ＬＡＭＢ１、およびＬＡＭＡ５＞
細胞外マトリックス糖タンパク質のファミリーである、ラミニンは、基底膜の主要な非
コラーゲン性成分である。それらは、細胞接着、分化、遊走、シグナル伝達、神経突起伸
長、および転移を含む幅広い種類の生物学的過程に結びつけられている。ラミニンは、３
つの非同一鎖：ラミニンα、β、およびγ（以前は、それぞれ、Ａ、Ｂ１、およびＢ２）
で構成され、３つの短腕（それぞれが異なる鎖によって形成されている）、および全ての
３つの鎖で構成される長腕からなる十字型構造を形成する。各ラミニン鎖は、別々の遺伝
子によってコードされる、マルチドメインタンパク質である。各鎖のいくつかのアイソフ
ォームが記載されている。異なるα鎖、β鎖、およびγ鎖のアイソマーが組み合わさって
、異なるヘテロ三量体ラミニンアイソフォームを生じ、それらは、それらの発見の順番に
アラビア数字で表されている。種々の鎖および三量体分子の生物機能は大部分、知られて
いないが、その鎖のいくつかは、それらの組織分布に関して異なることが示されており、
おそらくインビボでの多様な機能を反映している。

ＬＡＭＣ１（以前はＬＡＭＢ２）は、ラミニンサブユニットγ−１である。

ＬＡＭＡ２は、ラミニンサブユニットα−２である。

ＬＡＭＢ１は、ラミニンサブユニットβ−１である。

ＬＡＭＡ５は、ラミニンサブユニットα−５である。

＜プロテアーゼ＞
線維形成中のＥＣＭの合成と分解の間の不均衡は、低密度内皮下マトリックスの、間質
コラーゲンに富んだマトリックスへの変換に起因する。コラーゲンおよびプロテオグリカ
ンの増加は、（１）タンパク質産生の減少、ならびに（２）タンパク質分解障害と、その
結果としてのマトリックス分解の減少の、一方または両方による可能性がある。タンパク
質分解の減少は、最近、注目されることが増えている。この過程の制御において、マトリ
ックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびそれらの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）、
加えて、システインプロテアーゼおよびシスタチンなどの他のプロテアーゼおよびそれら
のインヒビターは、重要な役割を果たす。

ＭＭＰ
ＭＭＰは、ＥＣＭの全部の構成要素ではないにしても、大部分の構成要素を分解する能
力がある、エンドペプチダーゼの大きな群である。現在、２５個より多いＭＭＰが見出さ
れている。ＭＭＰは、金属原子、典型的には亜鉛を含有する活性部位によって特徴づけら
れ、酵素前駆体として分泌される。異なるＭＭＰは異なる組織に発現している。表５にお
いて、肝臓におけるＭＭＰが示されている。

ＴＩＭＰは、ＭＭＰおよび膜１型メタロプロテイナーゼに、３分子複合体として、基質
特異的および組織特異的に結合することによって、ＭＭＰのタンパク質分解活性をブロッ
クする（表６）。線維症中、ＴＩＭＰレベルは劇的に増加し、ＭＭＰレベルは、中程度に
増加するか、または相対的に変化しないままであり（ＭＭＰ−２を除く）、全体で、コラ
ーゲンの分解の減少を生じる。

＜線維芽細胞活性化タンパク質＞
線維芽細胞活性化タンパク質αサブユニット（ＦＡＰａ、またはＦＡＰ，α）は、セリ
ンプロテアーゼファミリーに属する内在性膜ゼラチナーゼである。ＦＡＰａは、１７０ｋ
Ｄａメラノーマ膜ゼラチナーゼ、内在性膜セリンプロテイナーゼ、およびセプラーゼとし
ても知られたヘテロ二量体膜結合型プロテイナーゼ複合体のαサブユニットであり、ＤＰ
Ｐ４（ＣＤ２６）はβサブユニットである。ある細胞は、ＦＡＰａホモ二量体のみを生成
し、ある細胞はＤＰＰ４ホモ二量体のみを生成する。単量体は不活性である。ＦＡＰαは
、上皮癌の反応性間質線維芽細胞、回復期創傷の肉芽組織、ならびに骨肉腫および軟部肉
腫の悪性細胞において選択的に発現している^３３。このタンパク質は、発生中、組織修復
中、および上皮発癌中、線維芽細胞増殖または上皮間葉相互作用の調節に関与すると考え
られている。ＦＡＰの発現は、線維症の病期と共に増加することが示されている^{３４、３
５}。

＜ＡＤＡＭＴＳ＞
ＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロ
プロテイナーゼ）は、ペプチダーゼのファミリーであり、これまで、このファミリーの１
９個のメンバーがヒトにおいて同定されている。ＡＤＡＭＴＳプロテアーゼの既知の機能
には、プロコラーゲンおよびフォンビルブランド因子のプロセシング、加えて、アグリカ
ン、バーシカン、ブレビカン、およびニューロカンの切断が挙げられる。それらは、結合
組織の組織化、凝固、炎症、関節炎、血管新生、および細胞遊走において重要な役割をも
つことが実証されている。

＜カテプシン＞
プロテアーゼのカテプシンファミリーには十数個のメンバーがあり、それらは、それら
の構造、触媒機構、およびそれらがどのタンパク質を分解するかによって区別される。そ
のメンバーの大部分は、リソソームにおいて見出される低ｐＨにおいて、活性化する。し
たがって、このファミリーの活性は、ほとんど完全に、それらの細胞小器官内にある（た
だし、多くの例外がある）。例えば、（いくつかある活性の中で）骨吸収において破骨細
胞による分泌後に細胞外で働くカテプシンＫなど。

カテプシンＫ（ＣＡＴ−Ｋ）およびカテプシンＳ（ＣＡＴ−Ｓ）はどちらもシステイン
プロテアーゼである。

＜線維症バイオマーカー＞
線維性疾患の特異的な産物ではないが、この疾患のいくつかの生化学的マーカーが示唆
されている。表７において、臨床試験に用いられる肝線維症の生化学的マーカーの例があ
る。加えて、他の線維性疾患のバイオマーカーの多数の例がある^{１２、３６〜４２}。

米国特許第５３８７５０４号は、アグリカン部位Ｎ_３４１−Ｆ_３４２におけるストロメ
ライシンの作用によって放出されるネオエピトープＶＤＩＰＥＮ、およびこのネオエピト
ープに特異的なモノクローナル抗体を用いるＲＩＡアッセイを記載する。より一般的には
、特異的なストロメライシン切断によって生成されるアグリカンの断片に特異的な単一特
異性抗体の使用が記載されている。ストロメライシンの上昇は、変形性関節症、関節リウ
マチ、アテローム性動脈硬化病変、痛風、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、特発性肺線維症（Ｉ
ＰＦ）、特定の癌、関節損傷、および多数の炎症性疾患で起こる。ストロメライシンは、
特発性肺線維症において上昇することが報告されており、そのアッセイを、血液または他
の生体液で行って、アグリカンのストロメライシン切断産物を検出することができること
、およびそのような断片の定量化がＩＰＦ、加えて他の状態に関して診断的に用いること
ができることが主張されている。しかしながら、これの証拠は提供されず、本発明者らが
知る限りでは、この予測を確証するその後の刊行物は存在していない。そのようなＲＩＡ
アッセイは、長年、市販されており、いかなる線維性疾患を診断またはモニターすること
においても、それらを用いて成功したという報告は現れていない。

米国特許第７，２２５，０８０号は、患者において炎症性、線維性、または癌性疾患の
診断のための方法であって、前記患者における肝線維症および／または肝臓壊死性炎症性
病変の存在を決定するために、前記患者の血清または血漿においてα２−マクログロブリ
ン、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトラ
ンスフェラーゼ）、ＧＧＴ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）、γ−グロブリン、
総ビリルビン、アルブミン、α１−グロブリン、α２−グロブリン、ハプトグロビン、β
−グロブリン、アポＡ１、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β１、アポＡ２、およびアポＢからなる
群から選択される少なくとも４つの生化学的マーカーの値を測定し、その後、前記値を組
み合わせることによる、方法を開示する。その特許は、線維性疾患中に生成された、ネオ
エピトープを有するペプチド断片の定量的測定を教示していない。

米国特許第６，０６０，２５５号は、肝線維症の程度を診断するための方法であって、
ＩＶ型コラーゲンに特異的に結合する抗体を用いて試料において、ＩＶ型コラーゲンの高
分子量型の濃度を測定するステップ、およびその測定値を肝線維症の程度に関係づけるス
テップを含む方法を記載する。この場合もやはり、身体中で作用するタンパク質分解酵素
によって生じるネオエピトープは利用されていない。実際、試料はペプシンで消化され、
そのことは、試料におけるコラーゲン切断の天然のパターンを不明瞭にする可能性がある
。

米国特許第４，６２８，０２７号（Ｇａｙ）は、結合組織タンパク質に特異的な抗体の
産生、より具体的には、ヒトコラーゲン、およびコラーゲン分解に関与する酵素に対する
融合細胞ハイブリッドによるモノクローナル抗体の産生を開示する。組織学的、細胞学的
、および生物学的液体試料のコラーゲンプロファイルを確立するための、結合組織タンパ
ク質に対するモノクローナル抗体の使用が記載されている。しかしながら、その特許は、
前記結合組織タンパク質上のネオエピトープへの抗体の結合に基づいた結合組織タンパク
質の測定を記載していない。

Ｇｕａｎａｂｅｎｓ Ｎら、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ、１９９８^９８は、肝
線維症の増加を伴う疾患である原発性胆汁性肝硬変を有する患者において、骨ターンオー
バーのマーカー、Ｉ型コラーゲンのＮ−テロペプチド（ＮＴＸ）、Ｉ型コラーゲンのＣ−
テロペプチド（ＣＴＸ）、およびコラーゲンＩ型のＮ末端プロペプチド（ＰＩＮＰ）を評
価した。ＮＴＸ、ＣＴＸ、およびＰＩＮＰのレベルは、対照と比較して患者において上昇
し、その疾患の組織学的段階と相関した。ＮＴＸに用いられた抗体は、コラーゲンＩ型の
Ｎ末端におけるカテプシンＫ切断部位に対して産生され、ネオエピトープＹＤＧＫＧＶＧ
↓（配列番号３０２）により決定される。ＣＴＸに用いられた抗体は、コラーゲンＩ型の
Ｃ末端におけるカテプシンＫ切断部位に対して産生され、ネオエピトープＥＫＡＨＤＧＧ
Ｒ↓（配列番号３０３）により決定される。これらのマーカーは、コラーゲンＩ型のテロ
ペプチド内に位置し、コラーゲンＩ型の内部部分（三重らせん部分）に位置しない。ＰＩ
ＮＰアッセイに用いられるモノクローナル抗体は、ネオエピトープではないＰＩＮＰ配列
における内部エピトープに対して産生された。

Ｍｏｌｌｅｒ Ｓら、Ｇｕｔ．、１９９９^９９は、Ｉ型コラーゲンのＣ末端架橋テロペ
プチド（ＩＣＴＰ）が、対照と比較して、アルコール性肝硬変患者において上昇すること
を実証した。記載された研究は、生化学的マーカーが、肝線維症を反映し得ることを示し
た。ＩＣＴＰポリクローナル抗体は、トリプシンおよびコラゲナーゼに切断されたコラー
ゲンＩ型に対して産生されている。しかしながら、その抗体は、ネオエピトープに結合し
ない。

Ｒｏｓｅｎ ＨＮら、Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ、２００４^１００は、ホル
モン補充処置（ＨＲＴ）を受ける女性において、骨ターンオーバーのマーカー、Ｉ型コラ
ーゲンのＮ−テロペプチド（ＮＴＸ）およびＩ型コラーゲンのＣ−テロペプチド（ＣＴＸ
）を評価した。その研究において、骨ターンオーバーのマーカーは処置と共に減少するこ
とが観察された。ＮＴＸに用いられた抗体は、コラーゲンＩ型のＮ末端におけるカテプシ
ンＫ切断部位に対して産生され、ネオエピトープＹＤＧＫＧＶＧ↓（配列番号３０２）に
より決定される。ＣＴＸに用いられた抗体は、コラーゲンＩ型のＣ末端におけるカテプシ
ンＫ切断部位に対して産生され、ネオエピトープＥＫＡＨＤＧＧＲ↓（配列番号３０３）
により決定される。本発明とは違って、これらの抗体は、骨代謝の評価について用いられ
、線維症の評価については用いられなかった。

Ｌｅｉｎ Ｍら、Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ、２００７^１０１は、ゾレドロン酸を受ける前立腺
癌患者においてネオエピトープ特異的骨ターンオーバーのマーカー、Ｉ型コラーゲンのＮ
−テロペプチド（ＮＴＸ）およびＩ型コラーゲンのＣ−テロペプチド（ＣＴＸ）の使用を
評価した。その研究において、骨ターンオーバーのマーカーは処置と共に減少することが
観察された。ＮＴＸに用いられた抗体は、コラーゲンＩ型のＮ末端におけるカテプシンＫ
切断部位に対して産生され、ネオエピトープＹＤＧＫＧＶＧ↓（配列番号３０２）により
決定される。ＣＴＸに用いられた抗体は、コラーゲンＩ型のＣ末端におけるカテプシンＫ
切断部位に対して産生され、ネオエピトープＥＫＡＨＤＧＧＲ↓（配列番号３０３）によ
り決定される。本発明とは違って、これらの抗体は、骨転移の浸潤中の骨代謝の評価につ
いて用いられ、線維症の評価については用いられなかった。

ＰＩＩＩＮＰは、いくつかの研究、すなわち、線維性疾患の重症度を評価するための研
究^１０２、重度の熱傷後の皮膚線維症を有する患者においての研究^１０３、非硬変性原発
性胆汁性肝硬変における疾患進行についての研究^１０４、原発性胆汁性肝硬変および慢性
ウイルス性Ｃ型肝炎においての研究^１０５に用いられている。

ＰＩＩＩＮＰおよびＩＣＴＰは、心筋の線維症を有する患者において測定された。

多くの報告は、生化学的指数の予測値を向上させるために１セットの生化学的マーカー
を組み合わせている。１１個の異なる血清マーカーが、Ｆ０からＦ４までの線維性病期分
類を有する２０５人の患者において測定され、最も情報価値のあるマーカーは、α２マク
ログロブリン、α２グロブリン（またはハプトグロビン）、γグロブリン、アポリポタン
パク質Ａ１、γグルタミルトランスペプチダーゼ、および総ビリルビンであった^１０７。
これらのマーカーの指数は、ゼロから０．１０までの範囲のスコア（全患者の１２％［４
１］）について陰性適中率（Ｆ２、Ｆ３、またはＦ４の非存在の１００％確実性）、およ
び０．６０から１．００までの範囲のスコア（全患者の３４％［１１５］）について高い
陽性適中率（Ｆ２、Ｆ３、またはＦ４の存在の＞９０％確実性）を有した。

ＷＯ２０１０／１１５７４９は、線維症バイオマーカーとして上記タンパク質の一部の
多数のネオエピトープを開示し、ＷＯ２００９／０５９９７２は、心血管疾患のバイオマ
ーカーとして上記タンパク質の一部の多数のネオエピトープを開示する。

しかしながら、上で挙げた報告のいずれにおいても、ここで主張されているようなネオ
エピトープへの抗体の結合に基づいたペプチド断片の測定が線維性疾患または炎症性疾患
を有する患者の評価に有用であり得ることは示唆されていない。

本発明は、ここで、イムノアッセイを行って、患者生体液試料に天然で存在するネオエ
ピトープ含有タンパク質断片を測定することを含むバイオアッセイの方法であって、前記
イムノアッセイが、前記試料に天然で存在するタンパク質断片を、プロテイナーゼによる
タンパク質の切断によって形成されるネオエピトープと反応する免疫学的結合パートナー
と接触させるステップと、ペプチド断片の前記免疫学的結合パートナーへの結合の程度を
測定して、その中において、前記ネオエピトープを含むタンパク質断片を測定するステッ
プであって、前記ネオエピトープが、以下の表に示された切断部位のいずれか１つにおけ
る前記タンパク質の切断によって形成される、ステップとを含む方法によって行われる、
バイオアッセイの方法を提供する。

本明細書を通してのアミノ酸配列において、Ｐはヒドロキシプロリンを示し、Ｍは酸化
メチオニンを示し、Ｋはヒドロキシリジンを示す。

本発明は、患者生体液試料に天然で存在するネオエピトープ含有タンパク質断片を測定
するためのイムノアッセイを行うステップを含むバイオアッセイの方法であって、前記イ
ムノアッセイが、前記試料に天然で存在するタンパク質断片を、プロテイナーゼによるタ
ンパク質の切断によって形成されるネオエピトープと反応性の免疫学的結合パートナーと
接触させるステップと、前記試料における前記ネオエピトープを含むタンパク質断片を測
定するためにペプチド断片の前記免疫学的結合パートナーへの結合の程度を測定するステ
ップとを含む方法により行われ、前記タンパク質がアポＥまたはラミニンである、方法を
含む。これらのタンパク質は、好ましくはヒトであり、試料は、好ましくはヒトであるが
、試料および／またはタンパク質は、特に齧歯類、例えば、マウスもしくはラットを含む
哺乳類であってもよく、またはイヌ、もしくはサルを含む霊長類であってもよい。

上記方法は、正常レベルより上への前記患者における前記測定値の上昇を、線維症また
は炎症性疾患の存在と関連づけることを含んでもよい。

任意選択的に、本発明によるイムノアッセイにおける上昇した結果は、皮膚線維症、肺
線維症、もしくは肝線維症、または心血管疾患と関連づけられる。任意選択的に、本発明
によるイムノアッセイにおける上昇した結果は、強直性脊椎炎などの炎症状態と関連づけ
られてもよい。方法は、患者生体液試料を得る予備ステップを含んでもよい。

前記免疫学的結合パートナーは、Ｃ末端ネオエピトープまたはＮ末端ネオエピトープを
含むペプチド断片に対する特異的結合親和性を有してもよい。

ネオエピトープに対する特異的な反応性または免疫学的親和性は、関連した免疫学的結
合パートナーが、ネオエピトープが由来する未切断のタンパク質とは反応しないことを意
味する。好ましくは、前記免疫学的結合パートナーは、下記に列挙される配列などのネオ
エピトープ配列に対して、その配列がそれぞれの切断部位をまたいで伸びている場合には
、反応しない。これは、測定されるペプチドが、指定された配列で終結していることを意
味する。

本明細書で用いられる場合、用語「免疫学的結合パートナー」は、ポリクローナルおよ
びモノクローナル抗体、ならびにまた、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２などの抗体の特異的
結合性断片を含む。したがって、前記免疫学的結合パートナーは、特異的結合親和性を有
する、モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の断片であってもよい。

好ましくは、免疫学的結合パートナーが結合するネオエピトープ配列は、いかなる他の
タンパク質に見出されず、または本発明の方法が関係する他のタンパク質のいずれにおい
ても見出されない。

いくつかの候補プロテアーゼが線維性組織内でのタンパク質の消化に関与し得る。おそ
らく、これは、疾患のレベルに依存した異なるネオエピトーププロファイルを生じる、広
い範囲の複雑な過程の結果である。

＜コラーゲンアッセイ＞
＜コラーゲンＩ型＞
本発明者らは、以下の表に列挙される酵素が、Ｉ型コラーゲンを少なくとも以下の切断
部位（「．」でマーク）で切断することを決定している。

したがって、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端における以下の配列
のいずれかと特異的に反応し得る。

あるいは、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＣ末端における以下の配列の
いずれかと特異的に反応し得る。

＜コラーゲンＩＩＩ型＞
本発明者らは、以下の表に列挙される酵素が、ＩＩＩ型コラーゲンを少なくとも以下の
切断部位（^＊でマーク）で切断することを決定している。

免疫学的結合パートナーは、ＩＩＩ型コラーゲンの切断により形成されたＣ末端または
Ｎ末端ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。

したがって、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端における以下の配列
：
のいずれか、またはペプチドのＣ末端における以下の配列：
のいずれかと特異的に反応し得る。

＜コラーゲンＩＶ＞
本発明者らは、以下の表に列挙される酵素が、ＩＶ型コラーゲンを少なくとも以下の切
断部位（「．」でマーク）で切断することを決定している。

免疫学的結合パートナーは、ＩＶ型コラーゲンの切断により形成されたＣ末端またはＮ
末端ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。

したがって、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端における以下の配列
：
またはペプチドのＣ末端における以下の配列：
と特異的に反応し得る。

＜コラーゲンＶ＞
本発明者らは、以下の表に列挙される酵素が、Ｖ型コラーゲンを少なくとも以下の切断
部位（「．」でマーク、または「．」がない場合は配列の末端で）で切断することを決定
している。

免疫学的結合パートナーは、Ｖ型コラーゲンの切断により形成されたＣ末端またはＮ末
端ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。

したがって、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端における以下の配列
：
のいずれか、またはペプチドのＣ末端における以下の配列：
と特異的に反応し得る。

＜コラーゲンＶＩ＞
本発明者らは、以下の表に列挙される酵素が、ＶＩ型コラーゲンを少なくとも以下の切
断部位（「．」でマーク、または「．」がない場合は配列の末端で）で切断することを決
定している。

免疫学的結合パートナーは、ＶＩ型コラーゲンの切断により形成されたＮ末端ネオエピ
トープと特異的に反応するものであり得る。

したがって、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端における以下の配列
のいずれかと特異的に反応し得る。

＜プロテオグリカン＞
本発明の別の態様において、前記ペプチド断片は、プロテオグリカンのバーシカン、ル
ミカン、ビグリカン、およびデコリンの断片であり、それらは全て、線維性組織内に同定
されている。

いくつかの候補プロテアーゼが線維性病変におけるプロテオグリカンの消化に関与し得
る。本発明者らは、表２３に列挙される酵素が、ビグリカン断片を生成し、少なくとも以
下の切断産物を生じることを決定している。

＜ビグリカン＞

免疫学的結合パートナーは、ビグリカンの切断により形成されたＣ末端またはＮ末端の
ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。

したがって、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端における以下のいず
れか：
またはペプチドのＣ末端における表２５における以下の配列：
と特異的に反応し得る。

＜デコリン＞

免疫学的結合パートナーは、デコリンの切断により形成されたＮ末端ネオエピトープと
特異的に反応するものであり得る。

したがって、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端における以下と特異
的に反応し得る。

バーシカン

免疫学的結合パートナーは、バーシカンの切断により形成されたＣ末端またはＮ末端の
ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。

したがって、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端における以下：
のいずれか、またはペプチドのＣ末端における表３０における以下の配列：
のいずれかと特異的に反応し得る。

＜ルミカン＞

免疫学的結合パートナーは、ルミカンの切断により形成されたＮ末端ネオエピトープと
特異的に反応するものであり得る。

したがって、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＣ末端における以下の配列
と特異的に反応し得る。

＜ＣＲＰ＞
いくつかの候補プロテアーゼが線維性組織内のＣＲＰの消化に関与し得る。文献は、線
維性組織内の多くの異なるプロテアーゼを報告している。おそらく、これは、最終的に、
線維症をもたらす広い範囲の複雑な過程の結果である。しかしながら、本発明者らの評価
において、初期相は、一連のＭＭＰからなり得るが、後期は、マトリックスのカテプシン
Ｋ分解により多く頼る可能性があり、その結果として、疾患のレベルに依存する異なるネ
オエピトーププロファイルを生じる。本発明者らは、純粋な天然のタンパク質の一連のイ
ンビトロ切断を通して、以下の表に列挙された酵素が、表３３において「．」でマークさ
れた少なくとも以下の切断部位でＣＲＰを切断したことを決定している。

したがって、本発明の方法において、前記ペプチド断片は、好ましくは、表３３のＣＲ
Ｐの上記の部分的配列のいずれか１つにおける、印「．」によってマークされた部位での
プロテアーゼによるＣＲＰの切断により形成されるネオエピトープを含む。

免疫学的結合パートナーは、ＣＲＰの切断により形成されたＮ末端ネオエピトープと特
異的に反応するものであり得る。

したがって、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＣ末端における以下の配列
のいずれかと特異的に反応し得る。

＜エラスチン＞
いくつかの候補プロテアーゼが線維性組織内のエラスチンの消化に関与し得る。本発明
者らは、純粋な天然のタンパク質の一連のインビトロ切断を通して、以下の表に列挙され
た酵素が、少なくとも、以下の配列の各末端における切断部位で、または「．」でマーク
された切断部位でエラスチンを切断したことを決定している。
^＊アミノ酸残基番号は、ヒトエラスチン配列からである。

したがって、本発明の方法において、前記ペプチド断片は、好ましくは、表３５のエラ
スチンの部分的配列のいずれか１つにおいて、Ｃ末端部位でのプロテアーゼによるエラス
チンの切断により形成されるネオエピトープを含む。

免疫学的結合パートナーは、エラスチンの切断により形成されたＣ末端ネオエピトープ
と特異的に反応するものであり得る。

したがって、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＣ末端における以下の配列
のいずれかと特異的に反応し得る。

＜アポＥ＞
いくつかの候補プロテアーゼが線維性組織内のアポＥの消化に関与し得る。本発明者ら
は、純粋な天然のタンパク質の一連のインビトロ切断を通して、以下の表に列挙された酵
素が、少なくとも、以下の配列の各末端における切断部位で、または「．」でマークされ
た切断部位でアポＥを切断したことを決定している。

したがって、本発明の方法において、前記ペプチド断片は、好ましくは、表３７のアポ
Ｅの部分的配列のいずれか１つにおける、Ｎ末端もしくはＣ末端部位での、または表示さ
れている場合、印「．」によってマークされた部位でのプロテアーゼによるアポＥの切断
により形成されるネオエピトープを含む。

免疫学的結合パートナーは、アポＥの切断により形成されたＣ末端またはＮ末端のネオ
エピトープと特異的に反応するものであり得る。

したがって、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端における以下の配列
：
のいずれか、またはペプチドのＣ末端における以下の配列：
のいずれかと特異的に反応し得る。

＜ＬＡＭＣ１＞
いくつかの候補プロテアーゼが線維性組織内のＬＡＭＣ１の消化に関与し得る。本発明
者らは、純粋な天然のタンパク質の一連のインビトロ切断を通して、酵素が、少なくとも
、以下の配列の各末端における切断部位で、または「．」でマークされた切断部位でＬＡ
ＭＣ１を切断することを決定している。

したがって、本発明の方法において、前記ペプチド断片は、好ましくは、表４０のＬＡ
ＭＣ１の部分的配列のいずれか１つにおける、Ｃ末端部位でのプロテアーゼによるＬＡＭ
Ｃ１の切断により形成されるネオエピトープを含む。

免疫学的結合パートナーは、ＬＡＭＣ１の切断により形成されたＣ末端またはＮ末端の
ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。

したがって、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＣ末端における以下の配列
のいずれかと特異的に反応し得る。

＜ＬＡＭＡ２＞
いくつかの候補プロテアーゼが線維性組織内のＬＡＭＡ２の消化に関与し得る。本発明
者らは、純粋な天然のタンパク質の一連のインビトロ切断を通して、酵素が、少なくとも
、以下の配列の各末端における切断部位で、または「．」でマークされた切断部位でＬＡ
ＭＡ２を切断することを決定している。

したがって、本発明の方法において、前記ペプチド断片は、好ましくは、表４２のＬＡ
ＭＡ２の部分的配列のいずれか１つにおける、Ｎ末端部位でのプロテアーゼによるＬＡＭ
Ａ２の切断により形成されるネオエピトープを含む。

免疫学的結合パートナーは、ＬＡＭＡ２の切断により形成されたＣ末端またはＮ末端の
ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。

したがって、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端における以下の配列
のいずれかと特異的に反応し得る。

＜ＬＡＭＢ１＞
いくつかの候補プロテアーゼが線維性組織内のＬＡＭＢ１の消化に関与し得る。本発明
者らは、純粋な天然のタンパク質の一連のインビトロ切断を通して、酵素が、少なくとも
、以下の配列の各末端における切断部位で、または「．」でマークされた切断部位でＬＡ
ＭＢ１を切断することを決定している。

したがって、本発明の方法において、前記ペプチド断片は、好ましくは、表４４のＬＡ
ＭＢ１の部分的配列のいずれか１つにおける、Ｎ末端またはＣ末端部位でのプロテアーゼ
によるＬＡＭＢ１の切断により形成されるネオエピトープを含む。

免疫学的結合パートナーは、ＬＡＭＢ１の切断により形成されたＣ末端またはＮ末端の
ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。

したがって、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端における以下の配列
：
またはペプチドのＣ末端における以下の配列：
のいずれかと特異的に反応し得る。

ＬＡＭＡ５
いくつかの候補プロテアーゼが線維性組織内のＬＡＭＡ５の消化に関与し得る。本発明
者らは、純粋な天然のタンパク質の一連のインビトロ切断を通して、酵素が、少なくとも
、以下の配列の各末端における切断部位で、または「．」でマークされた切断部位でＬＡ
ＭＡ５を切断することを決定している。

したがって、本発明の方法において、前記ペプチド断片は、好ましくは、表２４のＬＡ
ＭＡ５の部分的配列のいずれか１つにおける、Ｎ末端もしくはＣ末端部位で、または表示
されている場合、印「．」によってマークされた部位でのプロテアーゼによるＬＡＭＡ５
の切断により形成されるネオエピトープを含む。

免疫学的結合パートナーは、ＬＡＭＡ５の切断により形成されたＣ末端またはＮ末端の
ネオエピトープと特異的に反応するものであり得る。

したがって、適切な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端における以下の配列
：
またはペプチドのＣ末端における以下の配列：
のいずれかと特異的に反応し得る。

同様の様式によってアッセイされ得るネオエピトープを定義するさらなる切断部位は、
コラーゲン、エラスチン、ＣＲＰ、およびプロテオグリカン、または上記で言及された他
の組織タンパク質を、本明細書に記載された酵素のいずれかに曝露し、それにより産生さ
れたペプチドを単離およびシーケンシングすることにより、同定することができる。さら
に、アッセイは、例証された切断部位に隣接して生成される、すなわち、上記で示された
Ｎ末端エピトープへと繋がるＣ末端配列、および記載されたＣ末端エピトープに接続して
いるＮ末端配列における、ネオエピトープに基づいてもよい。

上記のペプチドのうちの１つより多くについてのアッセイを、別々に行い、それらの結
果を組み合わせてもよく、または上記のペプチドのうちの１つより多くを一緒に測定して
もよい。

本発明によるアッセイの結果を、１つまたは複数の他の測定されたバイオマーカーと組
み合わせて、診断値または予後値の複合指数を形成してもよい。

一般的に、全ての以前に知られたイムノアッセイの方式は、本発明に従って用いること
ができ、それらには、不均一および均一型式、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、酵
素結合アッセイ、放射免疫アッセイなどが挙げられる。したがって、任意選択的に、前記
方法は、前記免疫学的結合パートナーおよび競合作用物質が、前記試料の存在下でインキ
ュベートされ、競合作用物質が、試料中のペプチド断片と、免疫学的結合パートナーに結
合することにおいて競合する、競合イムノアッセイとして行われる。

前記競合作用物質は、（１）コラーゲンＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、もしくはＶＩ
型の配列由来、またはＣＲＰ由来、またはプロテオグリカンのバーシカン、ルミカン、デ
コリン、およびビグリカンペプチドのいずれか、アポＥ、ルミカン、ＬＡＭＣ１、ＬＡＭ
Ｂ１、もしくはＬＡＭＡ５由来の合成ペプチド、あるいは（２）前記ネオエピトープを顕
わにするプロテアーゼによって切断される上記で名前を挙げられた精製された天然タンパ
ク質由来の競合作用物質であってもよい。

１つの適切な方法は、上記で名前を挙げられたタンパク質のネオエピトープに結合する
モノクローナル抗体または抗体結合断片を用いる競合イムノアッセイであり得る。マイク
ロタイタープレートの固体表面上にコーティングされた適切に選択された合成ペプチドは
、試料と、モノクローナル抗体または結合断片への結合において競合することができる。
あるいは、モノクローナル抗体または結合断片によって認識されるネオエピトープを有す
る精製された天然タンパク質断片は、固体表面上に用いることができる。さらに別の代替
法は、固体表面上にモノクローナル抗体または結合断片を固定化し、その後、試料を、シ
グナル分子、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼまたはビオチンに、適切に連結された合
成ペプチドと共に、共インキュベートすることである。

試料は、血清、血液、もしくは血漿、または他の種類、例えば、線維性組織生検の試料
であってもよい。

アッセイは、前記ネオエピトープと特異的に反応する第１の免疫学的結合パートナーと
、ネオエピトープが属する関連タンパク質と反応する第２の免疫学的結合パートナーとを
用いるサンドイッチアッセイとして行われてもよい。任意で、前記第２の免疫学的結合パ
ートナーは、同じタンパク質の第２のネオエピトープに向けられる。

特定の好ましい方法において、上記方法は、前記ペプチド断片の前記結合の決定された
レベルを、（ａ）比較し得る健康な個体および／または（ｂ）病的状態に特有な値と比較
するステップと、任意選択的に、測定されたペプチドのより高いレベル（通常には、結合
のより高いレベルによって示される）を前記状態のより重篤な度合いと関連づけるステッ
プとをさらに含む。前記状態は、線維性状態であってもよいし、または炎症性状態であっ
てもよい。

本発明の態様は、上記のようなネオエピトープを認識するモノクローナル抗体の開発に
関する。これは、名前を挙げられたタンパク質の分子のアミノ酸配列から生じる合成ペプ
チド（上記で列挙された配列、またはその配列で終結する配列を含む）によりマウスを免
疫し、選択されたマウス由来の脾臓細胞を骨髄腫細胞に融合し、関連合成ペプチド上のネ
オエピトープへの結合についてモノクローナル抗体を試験することにより達成することが
できる。ネオエピトープに対する特異性は、合成ペプチドとの反応性、および（Ｃ末端ネ
オエピトープについては）その免疫したペプチドのＣ末端側に延長した形、または（Ｎ末
端ネオエピトープについては）その免疫したペプチドのＮ末端側に延長した形のいずれに
対する反応性も欠如していることを必要とすることにより保証することができる。ネオエ
ピトープに対する抗体はまた、天然タンパク質に対する結合能力の欠如を確立するように
評価され得る。あるいは、ネオエピトープに対する特異性は、末端アミノ酸の１つに共有
結合したビオチンまたは他の機能性群の存在に非依存性である抗体の反応性を必要とする
ことにより保証することができる。

本発明は、上記で提示された部分的配列のいずれか１つにおける末端部位でのプロテア
ーゼによる関連タンパク質の切断により形成されるネオエピトープと特異的に免疫反応し
、例えば、モノクローナル抗体またはその結合断片であってもよい、免疫学的結合パート
ナーを含む。

本発明は、上記で提示された部分的配列のいずれか１つにおける末端部位での関連タン
パク質の切断により形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープに対するモノクローナ
ル抗体を産生する細胞株を含む。

本発明はさらに、上記で提示されたこれらのタンパク質の部分的配列のいずれか１つに
おける、関連タンパク質の切断により形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープを含
むペプチドを提供する。そのようなペプチドを、前記ペプチドに対して免疫応答を生じる
ためにハプテンとして担体にコンジュゲートしてもよく、またはイムノアッセイに用いる
ために、固体表面に固定化し、もしくは検出可能なマーカーにコンジュゲートしてもよい
。

本発明はさらに、上記で提示された部分的配列のいずれか１つにおける、関連タンパク
質の切断により形成されるＣ末端またはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドをコードす
る単離された核酸分子を含む。

本発明はさらに、発現シグナル、および上記で提示された部分的配列のいずれか１つに
おける、関連タンパク質の切断により形成されるＣ末端またはＮ末端のネオエピトープを
含むペプチドの発現をコードするコード配列を含む核酸配列を含むベクターを含み、さら
に、そのようなベクターで形質転換され、前記ペプチドを発現する宿主細胞を含む。

本発明のさらに別の態様は、上記の方法を実行するために便利に用いることができるキ
ットに関する。そのようなキットは、（１）合成ペプチドでコーティングされたマイクロ
タイタープレート、（２）前記合成ペプチドと反応する、本発明のモノクローナル抗体ま
たは抗体結合断片、および（３）標識された抗マウスＩｇＧ免疫グロブリンを含んでもよ
い。あるいは、そのようなキットは、（１）精製された天然のタンパク質断片でコーティ
ングされたマイクロタイタープレート、（２）その関連断片上のネオエピトープを認識し
、かつ前記精製タンパク質断片と反応するモノクローナル抗体、および（３）標識された
抗マウスＩｇＧ免疫グロブリンを含んでもよい。あるいは、そのようなキットは、（１）
ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート、（２）ビオチンに
連結した合成ペプチド、（３）タンパク質断片上のネオエピトープを認識し、かつ前記合
成ペプチドと反応するモノクローナル抗体、および（４）標識された抗マウスＩｇＧ免疫
グロブリンを含んでもよい。さらに別の代替物は、（１）ストレプトアビジンでコーティ
ングされたマイクロタイタープレート、（２）ビオチンに連結した合成ペプチド、（３）
関連タンパク質断片上のネオエピトープを認識し（かつ前記合成ペプチドと反応し）、か
つ西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたモノクローナル抗体を含むキットで
あり得る。

したがって、本発明は、本明細書に記載された免疫学的結合パートナー、ならびに前記
免疫学的結合パートナーに結合する競合作用物質、ならびに、任意選択的に、洗浄試薬、
緩衝剤、停止試薬、酵素標識、酵素標識基質、キャリブレーション標準、抗マウス抗体、
および使用説明書のうちの１つまたは複数を含むイムノアッセイキットを含む。

本明細書に記載されたアッセイは、患者における線維症または炎症状態の診断に有用で
ある。加えて、その検査は、疾患進行の評価、および治療に対する応答のモニタリングに
有用である。本発明の免疫学的結合パートナーはまた、開示されたタンパク質切断産物の
存在または位置を示すための免疫染色に用いられてもよい。

本発明は、以下の実施例および添付の図面を参照して、さらに記載および例証される。

パネルＡおよびＢにおいて、本発明によるモノクローナル抗体の特異性を調べた結果を示す図である。 強直性脊椎炎患者由来のヒト血清においてコラーゲンＶネオエピトープ所有断片の量を調べた結果を示す図である。 実施例５において得られた標準曲線を示す図である。 実施例５においてエクスビボ培養物から測定されたペプチド放出を示す図である。 実施例５において得られたさらなるペプチド測定を示す図である。 パネル（ａ）〜（ｄ）において、実施例５において得られたさらなる測定を示す図である。 実施例５において得られた血清中のさらなるペプチド測定を示す図である。 実施例６において測定された血清中のペプチドを示す図である。 実施例７において記載された抗体特異性の試験を示す図である。 実施例７において測定されたペプチドの血漿中レベルを示す図である。 実施例７において得られたＲＯＣ曲線を示す図である。 実施例８において得られたＥＬＩＳＡ結果を示す図である。 実施例８において得られた強直性脊椎炎に関してのペプチド測定を示す図である。 実施例９において得られた結果を示す図である。

＜酵素切断によるＶ型コラーゲン断片の同定＞
［試薬］
本実験に用いられる全ての試薬は、Ｍｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏ
ｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）およびＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳ
Ａ）などの会社からの標準高品質化学物質であった。モノクローナル抗体産生に用いられ
た合成ペプチドを、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｅｉｊｉｎｇ
、Ｃｈｉｎａから購入した。

インビトロ切断
ヒト胎盤由来の精製されたＶ型コラーゲン（カタログ番号ａｂ７５３７、Ａｂｃａｍ、
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を、プロＭＭＰ−２またはプロＭＭＰ−９（カタログ番号４
４４２１３；４４４２３１；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ
Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）で切断した。５０μｇのＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９
を、ジメチルスルホキシド中で２０μｌの１ｍＭ酢酸４−アミノフェニル水銀で活性化し
、３７℃で３時間、インキュベートした。０．５Ｍ酢酸中に溶解したＶ型コラーゲンを加
えた。ＭＭＰ切断を促進するために、そのタンパク質を、酢酸を除去するように２日間、
透析した。１０ｋＤａ未満のタンパク質を除去するためにその液体を濾過した（Ｍｉｃｒ
ｏｃｏｎ Ｕｌｔｒａｃｅｌ ＹＭ−１０、カタログ番号４２４０７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）。ＭＭＰ緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、２ｍＭの酢酸Ｚｎ、ｐＨ８．０）中
、１００μｇのＶ型コラーゲンと１μｇのＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９のいずれかを混合
することにより、各ＭＭＰ切断を別々に実施した。対照として、１００μｇのコラーゲン
を、ＭＭＰ緩衝液単独と混合した。その溶液を、３７℃で２時間、インキュベートした。
切断反応を、１μＭの最終濃度になる５０μＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を
用いて停止した。製造会社の使用説明書に従ってＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（登録商標）
Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（カタログ番号ＬＣ６１００、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａ、ＵＳＡ）を用いる可視化により、切断を検証した。

［ペプチド同定］
インビトロで切断された試料中のペプチド断片を、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）結合
型エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用い
て同定した。ＬＣ−ＭＳ試料を、１０ｋＤａより上のタンパク質を除去するために限外濾
過を行い、ｐＨを、ギ酸を用いて２．０に調整し、４μＬの試料をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによ
って分析した。ＬＣを、ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ_１８カラム（Ｗ
ａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）でギ酸／アセトニトリル勾配を用いて実施
した。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳを、Ｓｙｎａｐｔ高分解能質量分析四重極飛行時間型ＭＳ（
ＱＵＡＤ−ＴＯＦ；Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）において、ＭＳにつ
いては３５０〜１６００ｍ／ｚ、ＭＳ／ＭＳについては５０〜２０００ｍ／ｚの獲得範囲
で実施した。ソフトウェア「ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ ＳＥＲＶＥＲ（Ｐ
ＬＧＳ）」（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、スペクトルを分
析し、ピークリストを作成した。ペプチドを同定するために、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳデー
タを、Ｍａｓｃｏｔ ２．２（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、Ｕ
ＳＡ）ソフトウェアを用いてＶ型コラーゲン（ＦＡＳＴＡ）タンパク質データベースに対
して、ＥＳＩ−ＱＵＡＤ−ＴＯＦ設定、および可変性修飾として、カルバミドメチル（Ｃ
）、メチオニン（Ｍ）の酸化、リジン（Ｋ）の酸化、およびプロリン（Ｐ）の酸化を用い
て、検索した。

ＭＳによって同定されたペプチドのＮ末端またはＣ末端における６個のアミノ酸を、問
題のプロテアーゼによって生成されたネオエピトープとみなした。全てのプロテアーゼに
よって生成された配列を、相同性および他の切断部位までの距離を分析し、ＮＰＳ＠：ネ
ットワークタンパク質配列分析（Ｃｏｍｂｅｔ Ｃ、Ｂｌａｎｃｈｅｔ Ｃ、Ｇｅｏｕｒ
ｊｏｎ Ｃ、Ｄｅｌｅａｇｅ Ｇ． ＮＰＳ＠：ｎｅｔｗｏｒｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２０００；
２５：１４７〜５０）を用いて相同性について試験した。

＜同定された断片についてのＥＬＩＳＡアッセイの開発＞
［ペプチドコンジュゲーション］
ペプチドコンジュゲーションを、マレイミド活性化免疫原コンジュゲーションキット（
Ｍａｌｅｉｄｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて実施した。簡単に
述べれば、１個の遊離スルフヒドリル（−ＳＨ）基を有するシステイン含有免疫原性ネオ
エピトープ（ＨＭＧＲＥＧＲＥＧＥ−ＧＧＣ、５ｍｇ／ｍｌにおける４００μｌペプチド
）を、スルフヒドリル含有ペプチドと反応することができる利用可能なマレイミド基を有
する、担体タンパク質としてのマレイミド活性化オボアルブミン（ＯＶＡ）（１０ｍｇ／
ｍｌにおける１８０μｌ ＯＶＡ）と、コンジュゲーション緩衝液において、混合し、室
温で２時間、インキュベートした。コンジュゲートされた生成物から、２日間の脱塩また
は透析によりＥＤＴＡおよびアジ化ナトリウムを除去した。ビオチンコンジュゲート化ペ
プチドについて、固相ペプチド合成手順において、ビオチンコンジュゲート化リジンを加
えた。

［モノクローナル抗体開発］
４〜６週齢Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、約２００μｌの乳化抗原および５０μｇのネオエピ
トープＣＯ５−ＭＭＰ（ＨＭＧＲＥＧＲＥＧＥ−ＧＧＣ−ＯＶＡ）を皮下に免疫した。フ
ロイント不完全アジュバントにおいて安定した血清力価レベルに達するまで２週間間隔で
連続免疫化を実施した。２回目の免疫化から血液試料を収集した。各血液試料採取時点に
おいて、血清力価を決定し、最高抗血清力価を有するマウスを融合のために選択した。４
回目の免疫化後、このマウスを１ヶ月間、休息させ、その後、細胞融合のための脾臓の単
離の３日前に、５０μｇのＣＯ５−ＭＭＰ／１００μｌの０．９％塩化ナトリウム溶液中
を静脈内にブーストした。

［融合および抗体スクリーニング］
Ｇｅｆｔｅｒら^１３２によって記載されているように、融合手順を実施した。簡単に述
べれば、マウス脾臓細胞を、ＳＰ２／０骨髄腫融合パートナー細胞と融合した。ハイブリ
ドーマ細胞を、半流動性培地方法を用いてクローン化し、さらなる増殖のために９６ウェ
ルマイクロタイタープレート内へ移し、ＣＯ_２インキュベータ内でインキュベートした。
標準限界希釈法を用いて、モノクローナル増殖を促進した。ストレプトアビジンコーティ
ングされたマイクロタイタープレートおよび捕獲ペプチドとしてのＨＭＧＲＥＧＲＥＧＥ
−Ｋ−ビオチンでの間接的ＥＬＩＳＡを用いて、上清をスクリーニングした。

［クローンの特徴づけ］
モノクローナル抗体の天然の反応性およびペプチド結合を、ストレプトアビジンコーテ
ィングされたマイクロタイタープレート上の１０ｎｇ／ｍＬのビオチン化ペプチドコータ
ーおよび増殖中のモノクローナルハイブリドーマ由来の上清を用いた予備的ＥＬＩＳＡに
対し、天然試料（ヒト／ラット／マウス血清、血漿、および尿）を置換することによって
評価した。クローンの遊離ペプチド（ＨＭＧＲＥＧＲＥＧＥ）、ナンセンスなペプチド、
および伸長させたペプチド（ＧＨＭＧＲＥＧＲＥＧ）に対する特異性を試験した。Ｃｌｏ
ｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰキット、カタログ番号５３００−０５（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）を用いて、モノク
ローナル抗体のアイソタイプ分類を実施した。選択されたクローンを、製造会社（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、
Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）の使用説明書に従ってプロテインＧカラムを用
いて、精製した。選択されたモノクローナル抗体を、製造会社（Ｉｎｎｏｖａｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅ、Ｂａｂｒａｈａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）の使用説明書に従ってＬｉ
ｇｈｔｎｉｎｇ ｌｉｎｋ ＨＲＰ標識キットを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（
ＨＲＰ）で標識した。

［ＣＯ５−ＭＭＰのＥＬＩＳＡの手順］
予備実験において、本発明者らは、いくつかのチェッカーボード分析を実施することに
より、試薬、それらの濃度、およびインキュベーション期間を最適化した。ＣＯ５−ＭＭ
ＰのＥＬＩＳＡを以下のように開発した。９６ウェルのストレプトアビジンプレートを、
アッセイ緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７
．４）中に溶解した５ｎｇ／ｍＬのビオチン化合成ペプチドＨＭＧＲＥＧＲＥＧＥ−Ｋ−
ビオチンでコーティングし、３００ｒｐｍで絶えず振盪することにより２０℃で３０分間
、インキュベートした。アッセイ緩衝液中に溶解した２０μｌのペプチドキャリブレータ
または試料を、適切なウェルに加え、続いて、１００μＬのコンジュゲート化モノクロー
ナル抗体（１２５ｎｇ／ｍＬ）を加え、３００ｒｐｍで絶えず振盪することにより４℃で
１時間、インキュベートした。最後に、１００μＬのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）
（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃカタログ番号４３８ＯＨ）を加え、プレートを、暗闇および３０
０ｒｐｍでの振盪において２０℃で１５分間、インキュベートした。各インキュベーショ
ンステップ後、プレートを洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ
７．２）中で５回、洗浄した。ＴＭＢ反応を、１００μｌの停止溶液（１％ＨＣＬ）を加
えることにより停止し、４５０ｎｍで分光光度的に測定し、参照として６５０ｎｍを用い
た。標準曲線を、ＣＯ５−ＭＭＰペプチド（ＨＭＧＲＥＧＲＥＧＥ）の段階希釈により実
施し、４−パラメトリック数学的フィットモデルを用いてプロットした。標準濃度は、０
ｎｇ／ｍＬ、１５．６２５ｎｇ／ｍＬ、３１．２５ｎｇ／ｍＬ、６２．５ｎｇ／ｍＬ、１
２５ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬだった。

技術的評価
プールされた血清試料の２倍希釈から、１００％試料の回収のパーセンテージとして直
線性を計算した。検出下限（ＬＤＬ）を、最低標準（ゼロ標準）の２１個の決定値から計
算し、平均＋３×標準偏差として計算した。アッセイ間およびアッセイ内変動を、５個の
ＱＣ試料の１０回の独立した実行により決定し、各実行は、試料の２回の決定についての
２個のレプリカからなった。最後に、各アッセイについて、アミノ酸分析により正確に定
量化された合成ペプチドから調製されたマスターキャリブレータを、キャリブレーション
のために用いた。

分析物安定性を、１０回の凍結および解凍のサイクルの期間に、３つのヒト血清試料に
ついて決定した。

＜ＥＬＩＳＡ特徴づけ＞
開発したＣＯ５−ＭＭＰ ＥＬＩＳＡを、２０μｌの試料（未切断Ｖ型コラーゲン、Ｍ
ＭＰ−２で切断されたＶ型コラーゲン、ＭＭＰ−９で切断されたＶ型コラーゲン、ＭＭＰ
−１３で切断されたＶ型コラーゲン、および伸長させたＣＯ５−ＭＭＰアミノ酸配列（Ｇ
ＨＭＧＲＥＧＲＥＧ））を用いて評価した。交差反応性を、インビトロで切断されたコラ
ーゲンＩ型を用いて試験した。

結果は、図１、パネルＡおよびＢに示されており、Ａ）遊離ペプチド（ＨＭＧＲＥＧＲ
ＥＧＥ）、未切断Ｖ型コラーゲン、ＭＭＰ−９切断型Ｖ型コラーゲン、ＭＭＰ−２切断型
Ｖ型コラーゲン；Ｂ）遊離ペプチド（ＨＭＧＲＥＧＲＥＧＥ）、ＭＭＰ−１３切断型Ｖ型
コラーゲン、ＭＭＰ−９切断型Ｉ型コラーゲン、伸長させたペプチド（ＧＨＭＧＲＥＧＲ
ＥＧ）のシグナルのパーセント阻害を示している。パネルＡにおいて、抗体が未切断コラ
ーゲンＶ型と実質的に反応しないが、切断型コラーゲンＶ型と反応すること、およびパネ
ルＢにおいて、抗体が、Ｎ末端伸長型ペプチドと反応しないことがわかる。したがって、
抗体は、酵素切断によって生じたＮ末端ネオエピトープと特異的に反応することが示され
ている。

＜臨床的有用性＞
［健康な対象およびＡＳ患者］
その生化学的マーカーを、強直性脊椎炎（ＡＳ、改訂ニューヨーク基準による）と診断
された患者由来の血清中において評価し、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ ３ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｒｌａｎｇｅｎ−Ｎｕｒｅｍｂ
ｅｒｇから入手した性別および年齢をマッチさせた非疾患性血清試料と比較した。非疾患
群は、平均年齢が４３．０歳、１８〜６６歳の範囲である、２１人の健康な女性および１
９人の健康な男性からなった。ＡＳ群は、平均年齢が４２．５歳、２９〜６３歳の範囲で
ある、１９人の女性および２１人の男性からなった。

［統計］
その２つの群間のＣＯ５−ＭＭＰの血清レベルを、ＥＬＩＳＡを用いて測定し（結果は
図２に示されている）、両側ノンパラメトリックマンホイットニー検定を用いて比較した
。図２において、バーは、平均レベル±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。ＲＯＣに関
して、曲線下面積を測定した。オッズ比を、分割表から外挿し、全ての対象を、低レベル
（正常集団の平均の２ＳＤ内）または高レベル（＞ＳＤ）のバイオマーカーを有するとし
て分類した。Ｐ＜０．０５である場合、結果を有意とみなした。

これらの結果は、コラーゲンＶ型の測定されたネオエピトープがＡＳについての価値あ
るマーカーであることを強く示唆している。

＜ＮＢ２０２ビグリカンアッセイ：ＢＧＭ ．ＹＷＥＶＱＰＡＴＦＲ（配列番号１１３）
＞
本発明者らは、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、およびＭＭＰ−１３によって生成されたＢ
ＧＮネオエピトープの測定のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の開発を本
明細書で実証し、肝線維症の２匹のラットモデルにおいてそのアッセイの生物学的妥当性
を試験する。

方法：ＢＧＮを、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、およびＭＭＰ−１３によってインビトロで
切断し、^↓３４４「ＹＷＥＶＱＰＡＴＦＲ」^３５３ペプチド（ＢＧＮ−３４４）を、可能
性のあるネオエピトープとして選択した。その選択されたペプチドに対して産生されたモ
ノクローナルマウス抗体を、ＭＭＰ分解型ＢＧＮネオエピトープを測定する競合ＥＬＩＳ
Ａの開発に用いた。そのアッセイを、肝線維症の２匹のラットモデル、四塩化炭素（ＣＣ
Ｌ_４）誘発性線維症モデル、および胆管結紮（ＢＤＬ）モデルにおいて確認した。

結果：対照群と比較して１６週間（２００ｎｇ／ｍｌ対１２０ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．００
１３）および２０週間（１９０ｎｇ／ｍｌ対１００ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０１９）のＣＣ
Ｌ_４で処理されたラットにおいて、加えて、偽手術された群と比較してＢＤＬを受けた全
ての群のラットにおいて、血清ＢＧＮ−３４４の有意な上昇が見出された。さらに、ＣＣ
Ｌ_４モデルにおいて、肝臓切片のシリウスレッド染色によって決定された肝線維症の程度
と血清ＢＧＮ−３４４レベルとの有意な相関があった。

結論：本発明者らは、ＭＭＰ分解型ＢＧＮの特定の病理学的組織リモデリング産物、すな
わち、ネオエピトープＢＧＮ−３４４が、ＣＣＬ_４モデルおよびＢＤＬモデルにおいて、
インビボおよびエクスビボの両方のレベルで、肝線維症中、増加することを実証した。

アッセイ開発：
融合から得られた、選択されたモノクローナル抗体のアッセイ開発は、ＳＯＰによる以
下の全部の試験を含んだ（データは示されていない）。１）チェッカーボード（すなわち
、抗体−抗原結合親和性）−異なるインキュベーション時間、インキュベーション温度、
およびインキュベーション緩衝液での抗体対コーター濃度、２）標準ペプチド、ナンセン
スなペプチド、ヒト血清、天然ＢＧＮ、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、およびＭＭＰ−１３
でインビトロ処理された天然ＢＧＮに対する抗体特異性および感度を評価するための置換
（すなわち、競合強度）、３）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（商標）西洋ワサビペルオ
キシダーゼ標識キット（Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ、Ｂａｂｒａｈａ
ｍ、ＵＫ）を用いて評価されるペルオキダーゼに対する標識親和性。これらの試験の結果
に基づいて、最終アッセイ開発として、モノクローナル抗体ＮＢ２０２−７−５Ａ１を選
択した。

ＢＧＮ−３４４競合ＥＬＩＳＡ手順を以下のように開発した。９６ウェルのストレプト
アビジンコーティングされたプレートを、１．２５ｎｇ／ｍｌのＹＷＥＶＱＰＡＴＦＲ−
Ｋ−ビオチン（配列番号３０５）で、３００ｒｐｍ、２０℃で３０分間、コーティングし
た。その後、ウェルを、標準洗浄緩衝液で５回洗浄した。標準列を、２５０ｎｇ／ｍｌか
ら開始する、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＢＴＢ中に２倍に前希釈した標準ペプチド（ＹＷＥＶ
ＱＰＡＴＦＲ）により調製した。試料（すなわち、ヒト血清、マウス血清、ラット血清）
を同様に希釈した。標準および試料（２０μｌ／ウェル）、続いて、５０ｍＭのＴｒｉｓ
−ＢＴＢ緩衝液中の２０ｎｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識ＮＢ２０２−７−５Ａ１抗体
の１００μｌ／ウェルを加えた。プレートを３００ｒｐｍ、４℃で１時間、インキュベー
トした。インキュベーション時間後、ウェルを５回、洗浄し、１００μｌのＴＭＢと、４
℃、３００ｒｐｍで１５分間、インキュベートし、続いて、各ウェル中に、１００μｌの
停止溶液を加えた。比色反応を、標準実験室用プレートリーダーにおいて、６５０ｎｍで
の測定を参照として、４５０ｎｍで測定した。データを、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｖ５
．０プログラムを用いて取得した。

ＣＣＬ _４ 誘発性肝線維症のラットモデル：
肝線維症のＣＣＬ_４吸入ラットモデルにおいてＢＧＮ−３４４レベルを測定した。その
研究の完全な詳細は別の所で記載されている（１３３）。その研究は、ＣＣＬ_４で処理さ
れた５２匹の雄ウィスターラット、および２８匹の雄ウィスター対照ラットを含んだ（Ｃ
ｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ、Ｓａｉｎｔ Ａｕｂｉｎ ｌｅｓ Ｅｌｓｅｕｆ、Ｆｒａｎ
ｃｅ）。肝線維症の誘発を、以前に記載されているように（１３４）、実施した。簡単に
述べれば、ＣＣＬ_４を、吸入により週に２回、投与し、フェノバルビタール（０．３ｇ／
ｌ）を飲料水に加えた。対照ラットは、フェノバルビタールのみを受けた。動物を、８週
間、１２週間、１６週間、または２０週間のＣＣＬ_４処理または対照処理を受ける群へ層
別化した（各群について、ＣＣＬ_４がｎ＝１３；対照がｎ＝７）。Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃ
ｌｉｎｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉの調査倫理委員会（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａ
ｉｎ）、承認＃Ｂ−ＮＮＰ−２３３／０９によって明確に承認された書面におけるインフ
ォームドコンセントの後、研究を実施した。ＣＣＬ_４群由来の４匹の動物が研究中、死亡
した。終了時点に血液を収集し、２５０ｒｐｍでの１０分間の遠心分離の前に、室温で２
０分間、置いておき、凝固させた。試料を、バイオマーカー評価の前に−８０℃で保存し
た。肝臓切片（厚さ４μｍ）を、飽和ピクリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中の０
．１％シリウスレッドＦ３Ｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）
において染色した。分析された各動物から、線維症の量を、３６個のフィールドについて
全肝臓面積に占めるパーセンテージとして表し、平均値を示した（１３５）。

胆管結紮（ＢＤＬ）誘発性肝線維症のラットモデル：
胆管結紮により誘発された肝線維症のラットモデルにおいてＢＧＮ−３４４レベルを測
定した。その研究の完全な詳細は別の所で記載されている（１３３、１３６）。その研究
は、合計８１匹の月齢６ヶ月の雌スプラーグドーリーラットを含んだ。胆管を２箇所で結
紮し、腹部の縫合前に結紮間を切開する標準ＢＤＬにより、麻酔されたラットにおいて肝
線維症を誘発した。偽手術されたラットにおいて、腹部をＢＤＬなしに縫合した。

ラットを以下の４つの群に分けた。群１（１０匹のＢＤＬ、８匹の偽）は１週間後に殺
害し、群２（１２匹のＢＤＬ、８匹の偽）は２週間後に殺害し、群３（１３匹のＢＤＬ、
８匹の偽）は３週間後に殺害し、群４（１４匹のＢＤＬ、８匹の偽）は４週間後に殺害し
た。

図３は、ａ）競合ＥＬＩＳＡ設定における標準曲線の例、ｂ）インビトロＭＭＰ−９、
ＭＭＰ−１２、およびＭＭＰ−１３分解型ビグリカン（ＢＧＮ／ＭＭＰ９、ＢＧＮ／ＭＭ
Ｐ１２、およびＢＧＮ／ＭＭＰ１３）について、ならびに未切断ビグリカン（ＢＧＮ）に
ついてのＢＧＮ−３４４ペプチド測定を示す。

図４は、５つの複製物において培養の３日目および１７日目に測定された、ウシ移植片
のエクスビボ培養物からのＢＧＮ−３４４ペプチド放出を示す。ｗ／ｏ＝いかなる刺激も
受けていない培養物；ＭＩ＝液体窒素での処理による代謝的に不活性の培養物；Ｔ＋Ｏ＝
ＴＮＦα［２０ｎｇ／ｍｌ］およびオンコスタチン［１０ｎｇ／ｍｌ］での異化サイトカ
イン刺激；Ｔ＋Ｏ＋ＧＭ６００１＝選択性ＭＭＰ阻害剤ＧＭ６００１を追加した異化サイ
トカインＴＮＦα［２０ｎｇ／ｍｌ］およびオンコスタチン［１０ｎｇ／ｍｌ］；Ｔ＋Ｏ
＋Ｅ６４＝選択性システインプロテアーゼ阻害剤Ｅ６４を追加した異化サイトカインＴＮ
Ｆα［２０ｎｇ／ｍｌ］およびオンコスタチン［１０ｎｇ／ｍｌ］（^＊＊＊＝ｐ＜０．０
０１）。

図５は、処理８週間、１２週間、１６週間、および２０週間で決定されたＣＣＬ４処理
ラットにおけるシリウスレッド定量化の絶対値を示す。（各群について、ＣＣＬ_４処理動
物：ｎ＝１３；対照：ｎ＝７）。

図６は、ａ）８週間目、１２週間目、１６週間目、および２０週間目に測定された肝線
維症の四塩化炭素（ＣＣＬ_４）誘発性ラットモデルにおける平均循環血清ＢＧＮ−３４４
レベルを示す（各群について、ＣＣＬ_４処理動物：ｎ＝１３；対照：ｎ＝７）。ｂ）シリ
ウスレッドにより決定された肝臓における総コラーゲン含有量に従って、四分位数に層別
化された全対照ラットおよび全ＣＣＬ_４ラットにおける血清ＢＧＮ−３４４レベル；（ｎ
ｓ＝有意でない、^＊＝ｐ＜０．０５、^＊＊＝ｐ＜０．０１、^＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
ｃ）ＣＣＬ_４処理ラットおよびｄ）対照における、循環血清ＢＧＮ−３４４と、肝線維症
の程度を決定する組織学的シリウスレッド定量化との相関。

図７は、ベースライン、および１週間目、２週間目、３週間目、４週間目での終了時点
での、ＢＤＬラットおよび偽手術されたラットにおける平均循環血清ＢＧＮ−３４４レベ
ルを示す。データは、平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として示されている（^＊＝ｐ＜
０．０５、^＊＊＝ｐ＜０．０１、^＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。

＜ＮＢ９１ Ｉ型コラーゲンアッセイ（生成されたＦＡＰ）：．ＡＧＫＥＧＰＶＧＬＰ（
配列番号４９）ＣＯ１−４６２アッセイプロトコール＞
本発明者らは、製造会社（Ｉｎｎｏｖａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂａｂｒａｈａｍ、Ｃ
ａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）の使用説明書に従い、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ ｌｉｎｋ ＨＲＰ
標識キットを用いて、選択されたモノクローナル抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）で標識した。９６ウェルストレプトアビジンプレートを、アッセイ緩衝液（５０ｍ
ＭのＴｒｉｓ、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、２０℃でｐＨ７．４に調整）中
に溶解したビオチン化合成ペプチドＡＧＫＥＧＰＶＧＬＰ−ビオチンでコーティングし、
２０℃で３０分間、インキュベートした。２０μｌのペプチドキャリブレータまたは試料
を、適切なウェルに加え、続いて、１００μＬのコンジュゲート化モノクローナル抗体３
Ｈ２−ＨＲＰを加え、２０℃で１時間、インキュベートした。最後に、１００μＬのテト
ラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃカタログ番号４３８ＯＨ）を加え
、プレートを、暗闇中、２０℃で１５分間、インキュベートした。全ての上記のインキュ
ベーションステップは３００ｒｐｍでの振盪を含んだ。各インキュベーションステップ後
、プレートを洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中で
５回、洗浄した。ＴＭＢ反応を、１００μＬの停止溶液（１％ＨＣｌ）を加えることによ
り停止し、４５０ｎｍで測定し、参照として６５０ｎｍを用いた。検量線を、４−パラメ
トリック数学的フィットモデルを用いてプロットした。

ラット胆管結紮肝線維症モデル：
ＣＯ１−４６２を、肝線維症のＢＤＬラットモデルにおいて評価した。コペンハーゲン
、ＤＫにおけるデンマーク動物保護局「Ｄｙｒｅｆｏｒｓｏｇｓｔｉｌｓｙｎｅｔ」が承
認し、その研究の書面におけるインフォームドコンセントを与えている；承認＃２００８
／５６１−１４５０。その研究は、別の所で詳細に記載されている（Ｖｅｉｄａｌら、２
０１０ｂ）。簡単に述べれば、１７匹の月齢６ヶ月の雌スプラーグドーリーラットを以下
の４群に層別化した。２週間後または４週間後に屠殺される、ＢＤＬラットまたは偽手術
されたラット。胆管を２箇所で結紮し、腹部の縫合前に２つの結紮間を切開する標準ＢＤ
Ｌにより、麻酔されたラットにおいて肝線維症を誘発した。偽手術されたラットにおいて
、腹部をＢＤＬ手術なしに縫合した。血液試料を、ベースラインおよび終了時点において
、少なくともその前の１４時間、断食させたラットの後眼窩洞からＣＯ_２／Ｏ_２麻酔下で
採取した。収集した血液を、室温で３０分間、放置して、凝固させ、続いて、１５００ｇ
で１０分間の遠心分離を２回、行った。その後、血清を、きれいなチューブに移し、使用
まで−８０℃で保存した。ＢＤＬモデルの妥当性は、（１３７）によって実証された。

結果は図８に示されている。測定されたシグナルの有意な上昇は、２週間後に見られた
。

＜ＮＢ１５８バーシカンアッセイ：ＶＣＡＮ ３３０６（．ＫＴＦＧＫＭＫＰＲＹ）＞
細胞外マトリックスリモデリングは、アテローム性動脈硬化病変発生において鍵となる
特徴であり、かつプラーク破綻の前提条件である。プロテオグリカンのバーシカンは、ア
テローム性動脈硬化プラーク内に位置し、それは、マクロファージリッチな領域に存在す
るＭＭＰについての潜在的基質である。本発明者らは、特定のＭＭＰ１２由来バーシカン
分解断片（ＶＣＡＮ−３３０６）を検出し、アテローム性動脈硬化を診断するためのバイ
オマーカーとしてのそれの可能性を評価するためのイムノアッセイを開発している。

方法および結果：ＶＣＡＮ−３３０６に対して産生されたマウスモノクローナル抗体を、
競合ＥＬＩＳＡの開発のために用いた。異なる程度のアテローム性動脈硬化を有する患者
由来の臨床血漿試料を、アッセイ確証のために用いた。５人の死亡した成人の冠動脈にお
けるＶＣＡＮ−３３０６を、ＶＣＡＮ−３３０６−ｍＡｂを用いて検出した。最低のプラ
ーク量を有する動脈は、ＶＣＡＮ−３３０６−ｍＡｂに対して高い反応性を示した中間お
よび大きいアテローム性動脈硬化プラークによって冒された動脈と比較して、ほとんど、
または全く反応性を示さなかった。Ｉ）急性冠動脈症候群を経験する患者（ｎ＝３０）、
ＩＩ）安定型虚血性心疾患を経験する患者（ｎ＝３０）、およびＩＩＩ）高レベルの冠動
脈カルシウム沈着を示す患者（ｎ＝３０）は、検出可能な動脈カルシウム沈着をもたない
個体の対照群（ｎ＝３０）と比較して、ＶＣＡＮ−３３０６の有意に高い血漿レベルを有
した。さらに、高い動脈カルシウム沈着レベルを有する患者において、ＶＣＡＮ−３３０
６の存在と、ＬＤＬおよび総コレステロールとの間に強い関連が示された。

結論：ＭＭＰ１２によって生成されたバーシカンのネオエピトープは、ヒトアテローム性
動脈硬化プラーク内に存在する。ＭＭＰ１２仲介性バーシカン分解は、アテローム性動脈
硬化疾患を有する患者において有意に上昇し、アテローム性動脈硬化についての可能性の
あるバイオマーカーとしてのＶＣＡＮ−３３０６を示唆した。

ＶＣＡＮ−３３０６アッセイプロトコール：
選択されたモノクローナル抗体を、製造会社（Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、
Ｂａｂｒａｈａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）の使用説明書に従い、Ｌｉｇｈｔｎｉｎ
ｇ−Ｌｉｎｋ Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）抗体標識キッ
トを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した。Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌ
ａｎｄ）から購入した９６ウェルの、ストレプトアビジンで事前にコーティングされたプ
レートを、アッセイ緩衝液５０ｍＭのＰＢＳ−ＢＴＢ中に溶解した２．５ｎｇのビオチン
化合成ペプチドＫＴＦＧＫＭＫＰＲＹ−Ｋ−ビオチン（配列番号３０６）によってコーテ
ィングし、２０℃で３０分間、インキュベートした。２０μＬのペプチドキャリブレータ
または試料を、適切なウェルに加え、続いて、１００μＬの２０ｎｇ／ｍｌコンジュゲー
ト化モノクローナル抗体を加え、２０℃で１時間、インキュベートした。最後に、１００
μＬのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃカタログ番号４３８Ｏ
Ｈ、Ｔａａｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）展開液を加え、プレートを、暗闇中、２０℃で
１５分間、インキュベートした。全ての上記のインキュベーションステップは３００ｒｐ
ｍでの振盪を含んだ。各インキュベーションステップ後、プレートを洗浄緩衝液（２０ｍ
ＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中で５回、洗浄した。ＴＭＢ反応を、
１００μＬの停止溶液（１％ＨＣｌ）を加えることにより停止し、４５０ｎｍで測定し、
参照として６５０ｎｍを用いた。標準検量線を、標準ペプチドについての開始濃度が１０
ｎｇで、続いて、２倍希釈する、４−パラメトリック数学的フィットモデルを用いてプロ
ットし、最後の標準はゼロ標準であった。

免疫組織化学法についての試料および手順：
検体：以前に記載されているように（１３８）、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｂａ
ｐｔｉｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｗｉｎｓｔｏｎ−Ｓａｌｅｍ、ＵＳＡで１８ヶ月間の間
に死亡した２５歳より上の患者から冠動脈を入手した。

組織病理学的手順：解剖により得られた５つの心臓を、生理食塩水で洗い流し、４％中
性緩衝ホルムアルデヒド溶液で、１００ｍｍＨｇの圧力で１時間、灌流固定した。組織学
的切片作製（各３ｍｍ長）のための隣接組織ブロックを、左前下行枝（ＬＡＤ）、左回旋
枝、および右冠動脈の長軸（近位３ｃｍ）に対して垂直に切断した。２個の５μｍの組織
学的切片を各ブロックから作製した。１個をヘマトキシリン−エオシンで、１個をＶｅｒ
ｈｏｅｆｆ−ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ染色で染色した。

それぞれが異なる程度のアテローム性動脈硬化を有する５人の個体由来のヒト左前下行
枝のＶＣＡＮ−３３０６染色のために、標準Ｎｏｒｄｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅプロト
コールを用いた。簡単に述べれば、パラフィン包埋動脈を、５μｍ切片へ切断し、脱パラ
フィンし、ペルオキシダーゼをブロックし、再水和した。切片を、８００Ｗでのマイクロ
波における２×５分間の前処理に供した。この後、切片をＴＢＣ＋１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００中で洗浄し、ＴＢＳ中０．５％カゼインにおいてブロッキングし、ＴＢＳ緩衝液
中に希釈したＶＣＡＮ−３３０６に対する２．２５μｇ／ｍｌ ｍＡｂと、４℃で一晩、
インキュベートした。その後、切片をＴＢＳ＋１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で洗浄し
、Ｓｕｐｅｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ中で３０分間、インキュベートし、再び洗浄し、ＤＡ
Ｂ基質で処理した（６〜１０分間）。切片を、マイヤーのヘマトキシリン中に１２秒間、
浸漬し、マウントし、放置して乾燥させた。

患者および試料収集：
異なる程度のアテローム動脈硬化性心疾患を有する、それぞれ３０人の個体の４つの群
を３つの大きな研究（ＤＡＮＲＩＳＫ、ＤＥＦＡＭＩ、およびＯｄｅｎｓｅ Ａｒｔｅｒ
ｙ Ｂｉｏｂａｎｋ）から選択した。これらの研究における参加者は、同時にＯｄｅｎｓ
ｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｏｄｅｎｓｅ、Ｄｅｎｍａｒｋによって
登録された。４つの群は以下からなった。１）検出可能な冠動脈カルシウムをもたない３
０人の無症状の個体（ＣＴ−ｎｏＣａ）、２）冠動脈カルシウムの存在によって定義され
る無症候性ＣＶＤを有する３０人の無症状の対象（ＣＴ−ｐｌｕｓＣａ）、３）冠動脈バ
イパス手術をされるべき、安定虚血性心疾患（ＩＨＤ）を有する３０人の患者、ならびに
４）急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）および過去２４時間以内の発症を有する３０人の患者（
表１）。全ての試料は、Ｏｄｅｎｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｏｄ
ｅｎｓｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）におけるＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙによって取り扱われ、か
つ試験された。

５０歳〜６０歳の１８２５人の男性および女性のランダムな試料である、ＤＡＮＲＩＳ
Ｋコホートから、群１および群２の患者を採用し、２００９年に冠動脈疾患についてのス
クリーニングに招いた。スクリーニングは、心臓ＣＴスキャン、続いてＡｇａｔｓｔｏｎ
スコアを用いる冠動脈カルシウム量の見積もりを含んだ。招かれた個体から、１２５７人
をスクリーニングに検討したが、すでに虚血性心疾患または糖尿病を有する者（ｎ＝１０
０）を除外した後、１１５７人の患者を分析に登録した。６０歳のこれらの個体（ｎ＝６
４７）の中で、検出可能な冠動脈カルシウムをもたない３０人の患者（ＣＴ−ｎｏＣａ）
の群１、およびＡｇａｔｓｔｏｎスコア≧４００を有する（ＣＴ−ｐｌｕｓＣａ）３０人
の群２を選択した。これらの２つの群の選択にはまた、総コレステロールおよび血圧につ
いてのマッチングも関係させた。心臓スコアは、臨床医が、個体の心血管系リスクの低下
を最適化するのを援助することを目的とする。このリスク推定は、リスク因子（性別、年
齢、喫煙、収縮期血圧、および総コレステロール）に基づき、最終的に１０年後に起こる
だろう致死的なＣＶＤイベントの数を予測する。致死的心血管イベントに基づいた高リス
クについての閾値は、「５％より高い」と定義される（１３９）。

安定ＩＨＤを有する患者の群である、群３は、冠動脈バイパス手術を受けた患者から予
備の動脈組織および血液試料を集めるＯｄｅｎｓｅ Ａｒｔｅｒｙ Ｂｉｏｂａｎｋに由
来した。血液試料は、バイパス術の前日に採取された。本発明者らは、約６０歳の平均年
齢および上記の集団に類似した性別分布をもつ３０人の患者を選択した。ＡＣＳを有する
患者の群である、群４は、ＤＥＦＡＭＩコホートから採用し、そのコホートにおける全て
の患者は、２００９年１０月１日から２０１０年４月３０日の間にＯｄｅｎｓｅ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌに入院し、ＡＣＳの疑いでトロポニン分析を受けてお
り、登録された。これらの患者において、連続的血液試料採取は、発症の最初の２４時間
以内に実施された。ＤＥＦＡＭＩコホートにおける８２２人の患者のうち、非ＳＴ上昇型
心筋梗塞（ＮＳＴＥＭＩ、ｎ＝２４）または不安定狭心症（ｎ＝６）を有する３０人の患
者が選択され、本研究に参加した。彼らの年齢は約６０歳であり、彼らの性別分布は、２
つのＤＡＮＲＩＳＫ部分群（群１および群２）にマッチした。ＮＳＴＥＭＩは、典型的な
臨床症状の存在に関連して、０．０３μｇ／ｌより上のＴｎＩレベルの典型的な上昇およ
び／または降下が示されたかどうかについて規定された。不安定狭心症は、ＳＴ部分抑制
またはＴ波ゆらぎと共に、安静時または最小身体活動中に典型的な胸痛の存在があるが、
正常なＴｎＩレベル（０．０３μｇ／ｌ未満）を有するとして定義された。不安定狭心症
を有する全ての患者はまた、少なくとも１つの有意な冠動脈狭窄（＞５０％直径狭窄）を
示す必要があった。したがって、この研究において、ＡＣＳ患者は、ＮＳＴＥＭＩおよび
不安定狭心症を有する患者を含んだ。ＳＴ部分上昇型心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ）を有する患
者は含まれず、これらの患者において、ヘパリンでの薬物療法および緊急ＰＣＩが行われ
る前に十分な連続的血液試料を得ることは可能ではないだろうからである。両方の介入は
、生化学的アッセイにおいて干渉する可能性がある。３０人のＡＣＳ患者（群４）におけ
る平均ＴｎＩレベルは０．６２μｇ／ｌ（０．０１〜５．２３μｇ／ｌの範囲）であった
。

群１〜４の全患者（ｎ＝１２０）において、高血圧は、その患者が降圧性医学的処置を
用いたかどうかが考慮され、糖尿病は、抗糖尿病薬物療法が処方されたかどうかについて
規定された。収縮期および拡張期血圧を、血液試料採取と同じ日に測定した。Ａｇａｔｓ
ｔｏｎスコアを、群１および群２の患者において計算した。ＡＣＳ群におけるＴｎＩを、
本血液試料採取の前の、入院時すぐに、測定した。総コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、
およびトリグリセリドもまた、本研究のための血液試料採取の前に測定した。血液試料を
、ＥＤＴＡを含むチューブ中に回収し、２００ｇで１０分間、遠心分離した。血漿を、生
化学的分析まで、−８０℃で保存した。

ＤＡＮＲＩＳＫ、ＤＥＦＡＭＩ、およびＯｄｅｎｓｅ Ａｒｔｅｒｙ Ｂｉｏｂａｎｋ
研究のための研究プロトコールは、研究の開始前に倫理委員会によって承認された。イン
フォームドコンセントは、全ての参加した患者から得られた。
表５０．［］内に平均値および標準偏差を示す、研究に含まれる各群の個体群統計学。Ｃ
Ｔ−ｎｏＣａ：検出可能な冠動脈カルシウムなしの無症状の個体；ＣＴ−ｐｌｕｓＣａ：
高い冠動脈カルシウムを有する無症状のＣＶＤ；ＡＣＳ（急性冠動脈症候群）；ＩＨＤ：
安定虚血性心疾患を有する患者。平均値［＋／−ＳＴＤ］；＃幾何平均値［＋／−ＳＴＤ
］、および一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）からのｐ値。対照群「ＣＴ−ｎｏＣａ」に対
する各群の比較からのｐ値の有意性のレベルは、ダネットの方法による多重比較として調
整された（^＊：ｐ＜０．０５；^＊＊：ｐ＜０．０１；^＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
表５１．検出可能な冠動脈カルシウムなしの対照群（ＣＴ−ｎｏＣａ）と比較した、高い
冠動脈カルシウム群（ＣＴ−ｐｌｕｓＣａ）、急性冠動脈症候群の群（ＡＣＳ）、および
虚血性心疾患群（ＩＨＤ）におけるＲＯＣ曲線の結果。ＡＵＣは、標準誤差およびｐ値と
共に示されている。
表５２．ＶＣＡＮ−３３０６のスピアマン相関係数および標準測定パラメータが、ｒ値お
よびｐ値で提示されている。

図９は、抗体のエピトープに対する特異性の試験の結果を示す。競合ＥＬＩＳＡ設定に
おいて加えられて、試験された試料は以下であった。伸長させたペプチド（２０ｎｇ／ｍ
ｌ）、非切断型バーシカン（ＶＣＡＮ）、ＭＭＰ−８切断型バーシカン（ＶＣＡＮ＋ＭＭ
Ｐ８）、ＭＭＰ−１２切断型バーシカン（ＶＣＡＮ＋ＭＭＰ１２）、およびカテプシンＫ
切断型バーシカン（ＶＣＡＮ＋ＣａｔＫ）。

図１０は、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）、冠動脈カルシウムの高沈着（ＣＴ−ｐｌｕｓ
Ｃａ）、安定虚血性心疾患（ＩＨＤ）と診断された患者において測定され、かつ検出可能
な冠動脈カルシウム沈着がない個体を含む年齢をマッチさせた対照（ＣＴ−ｎｏＣａ）と
比較した、ＶＣＡＮ−３３０６の血漿レベルを示す。^＊＝ｐ＜０．０５；^＊＊＊＝ｐ＜０
．０００５；個々の値、および線と誤差バーとしての群平均とＳＥＭが示されている。

図１１は、高い冠動脈カルシウム沈着（ＣＴ−ｐｌｕｓＣａ）を有する無症状の患者の
群におけるａ）ＬＤＬと組み合わされたＶＣＡＮ−３３０６、およびｂ）コレステロール
と組み合わされたＶＣＡＮ−３３０６についてのＲＯＣ曲線を示す。

＜ＮＢ１８５ Ｖ型アッセイ：Ｃ５Ｍ．ＨＭＧＲＥＧＲＥＧＥ（配列番号９３）＞
脊椎の慢性炎症強直性脊椎炎（ＡＳ）は、椎骨の完全なセメンテーション（関節に見出
されるいくつかのコラーゲンのターンオーバーを含む過程）がもたらされ得る。診断的評
価および患者特徴づけは、結合組織ターンオーバーのマーカーの測定によって向上する可
能性がある。コラーゲンのタンパク質分解は、細胞外マトリックスリモデリングにおいて
、およびそれにより、ＡＳの発病において重要な役割を果たす。この分解は、ネオエピト
ープと呼ばれる小さいペプチド断片を生じ、それは、線維性事象の新しいクラスのバイオ
マーカーであることが証明される可能性がある。この研究の目的は、ＭＭＰ−２およびＭ
ＭＰ−９によって生成されたＶ型コラーゲンの断片を検出する能力がある競合ＥＬＩＳＡ
を開発すること、ならびにＡＳについてのバイオマーカーとしてのこのアッセイの使用を
評価することであった。

材料および方法：ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９によって分解されたＶ型コラーゲンの質
量分光分析により、多数のプロテアーゼ生成ネオエピトープが明らかにされた。これらの
データから、Ｖ型コラーゲンに特有で、かつＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９によって生成さ
れた断片を、ＥＬＩＳＡ開発のための標的として選択した。このネオエピトープに対して
モノクローナル抗体が産生され、それは、Ｖ型コラーゲン断片をアミノ酸位置１３１７に
おいて検出した（ＣＯ５−ＭＭＰ）。そのアッセイを用いて、４０人のＡＳ患者および４
０人の年齢をマッチさせた対照の血清においてＣＯ５−ＭＭＰネオエピトープの含有量を
評価した。

結果：ＥＬＩＳＡは、もっぱらＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９分解のＣＯ５−ＭＭＰネオ
エピトープ断片だけを検出することが実証され、アッセイ間およびアッセイ内変動は、そ
れぞれ、９．１３％および４．３８％であった。ＣＯ５−ＭＭＰのレベルは、ＡＳ患者に
おいて有意により高く、２２９％の増加（Ｐ＜０．０００１）があった。ＡＵＣは８３％
であった。

結論：この新規なＥＬＩＳＡは、Ｖ型コラーゲンネオエピトープを評価するために開発
された最初のアッセイである。Ｖ型コラーゲンの高いターンオーバーは、病態生理学的役
割を示唆する。ＣＯ５−ＭＭＰは、進行中の線維形成の候補マーカーである。

［方法］
健康な対象およびＡＳ患者
生化学的マーカーを、強直性脊椎炎（ＡＳ、改訂ニューヨーク基準による）と診断され
た患者由来の血清中において評価し、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
３ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｒｌａｎｇｅｎ−Ｎｕｒｅｍｂｅｒ
ｇからの性別および年齢をマッチさせた非疾患性血清試料と比較した。非疾患群は、平均
年齢が４３．０歳、１８〜６６歳の範囲である、２１人の健康な女性および１９人の健康
な男性からなった。ＡＳ群は、平均年齢が４２．５歳、２９〜６３歳の範囲である、１９
人の女性および２１人の男性からなった（表５３）。

ＣＯ５−ＭＭＰのＥＬＩＳＡの手順
予備実験において、本発明者らは、いくつかのチェッカーボード分析を実施することに
より、試薬、それらの濃度、およびインキュベーション期間を最適化した。ＣＯ５−ＭＭ
Ｐ ＥＬＩＳＡを以下のように開発した。９６ウェルのストレプトアビジンプレートを、
アッセイ緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７
．４）中に溶解した５ｎｇ／ｍＬのビオチン化合成ペプチドＨＭＧＲＥＧＲＥＧＥ−Ｋ−
ビオチン（配列番号３０７）でコーティングし、３００ｒｍｐで絶えず振盪することによ
り２０℃で３０分間、インキュベートした。アッセイ緩衝液中に溶解した２０μｌのペプ
チドキャリブレータまたは試料を、適切なウェルに加え、続いて、１００μＬのコンジュ
ゲート化モノクローナル抗体（１２５ｎｇ／ｍＬ）を加え、３００ｒｐｍで絶えず振盪す
ることにより４℃で１時間、インキュベートした。最後に、１００μＬのテトラメチルベ
ンジジン（ＴＭＢ）（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃカタログ番号４３８ＯＨ）を加え、プレート
を、暗闇および３００ｒｐｍでの振盪において２０℃で１５分間、インキュベートした。
各インキュベーションステップ後、プレートを洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中で５回、洗浄した。ＴＭＢ反応を、１００μｌの停止溶液
（１％ＨＣＬ）を加えることにより停止し、４５０ｎｍで分光光度的に測定し、参照とし
て６５０ｎｍを用いた。標準曲線を、ＣＯ５−ＭＭＰペプチド（ＨＭＧＲＥＧＲＥＧＥ）
の段階希釈により実施し、４−パラメトリック数学的フィットモデルを用いてプロットし
た。標準濃度は、０ｎｇ／ｍＬ、１５．６２５ｎｇ／ｍＬ、３１．２５ｎｇ／ｍＬ、６２
．５ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎ
ｇ／ｍＬだった。

図１２は、以下のシグナルのパーセント阻害を示すＣＯ５−ＭＭＰのＥＬＩＳＡの特徴
づけにおいて得られた結果を示す。Ａ）遊離ペプチド（ＨＭＧＲＥＧＲＥＧＥ）、未切断
Ｖ型コラーゲン、ＭＭＰ−９切断型Ｖ型コラーゲン、ＭＭＰ−２切断型Ｖ型コラーゲン；
Ｂ）遊離ペプチド（ＨＭＧＲＥＧＲＥＧＥ）、ＭＭＰ−１３切断型Ｖ型コラーゲン、ＭＭ
Ｐ−９切断型Ｉ型コラーゲン、伸長させたペプチド（ＧＨＭＧＲＥＧＲＥＧ）。

図１３は、非疾患対象（ＮＤ、ｎ＝４０）および強直性脊椎炎患者（ＡＳ、ｎ＝４０）
におけるＣＯ５−ＭＭＰの測定の結果を示す。バーは、平均レベル±平均値の標準誤差（
ＳＥＭ）を示す。群を、マンホイットニーによって比較した。

＜エラスチンＥＬＮ−５５２（ＥＬＭ−２）ＧＶＡＰＧＩＧＰＧＧ．（配列番号３０８）
＞
［材料および方法］
表５４．エラスチンネオエピトーププログラムの記載。下向きの矢印は切断部位を示し、
伸長させたペプチドにおいて伸長しているアミノ酸には下線が引かれている。

［ＥＬＩＳＡ手順ＥＬＮ−５５２（ＥＬＭ２）］
アッセイ緩衝液およびプレートを室温に平衡させた。アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＰＢ
Ｓ、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４０）中に２．５ｎｇ／ｍＬに希
釈した１００μＬのビオチン化ペプチド（ビオチン−ＣＧＧ−ＧＶＡＰＧＩＧＰＧＧ 配
列番号２８７）を用いて、９６ウェルのストレプトアビジンコーティングされたプレート
をコーティングした。プレートを、３００ｒｐｍで振盪させながら、２０℃で３０分間、
インキュベートし、洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２
）中で５回、洗浄した。各血清試料を、アッセイ緩衝液中に２倍に希釈し、２０μＬの血
清希釈溶液またはペプチドキャリブレータ（２５０ｎｇ／ｍＬから開始）を各ウェルに加
えた。６５ｎｇ／ｍＬの濃度の１００μＬのＨＲＰ標識ＮＢ２４４−２Ｂ４抗体を各ウェ
ルに加え、プレートを、３００ｒｐｍで振盪させながら、２０℃で１時間、インキュベー
トさせておいた。プレートを洗浄緩衝液中で５回、洗浄し、１００μＬのＴＭＢを加え、
プレートを暗闇中、２０℃で１５分間、インキュベートした。１００μＬの停止溶液（１
％Ｈ_２ＳＯ_４）を加え、プレートを、ＥＬＩＳＡリーダーにおいて４５０ｎｍで読み取り
、参照として６５０ｎｍを用いた。検量線を、４パラメータ数学的フィットモデルを用い
てフィットさせた。

［ＥＬＮ−５５２アッセイの臨床的確証］
ＥＬＮ−５５２アッセイを、アテローム性動脈硬化コホートである、ＢｉｏＣｏｒｅコ
ホートにおいて試験した。コホートを、アッセイにおいて希釈せずに実行した。ＢｉｏＣ
ｏｒｅコホートにおける患者は、臨床症状に基づいて以下の４つの群に分けられる。確認
された急性心筋梗塞を有する患者であるＡＭＩ群、ＡＭＩが疑われるが、トロポニン−Ｔ
レベルに基づいた診断がない患者である非ＡＭＩ群、ａｇａｔｓｔｏｎスコアに基づいた
高い冠動脈カルシウムを示すが、臨床症状がない患者である、高冠動脈カルシウム群、お
よび陰性対照群である冠動脈カルシウムなしの群。冠動脈カルシウムなしの群における患
者は、彼らのＣＰＲ数に基づいてランダムに選択され、アテローム性動脈硬化の臨床症状
またはバイオマーカー徴候をもたない。全ては、コホートの残りの部分と性別および年齢
がマッチされている。各群において３０人の患者があり、１２０人の患者の研究となって
いる。ＢｉｏＣｏｒｅデータの一部の個体群統計学的表は表５５に見られる。
表５５．ＢｉｏＣｏｒｅコホートに関する個体群統計学的データ
値は、平均±標準偏差である。高Ｃｏｒ Ｃａ：高い冠動脈カルシウム群、Ｃｏｒ Ｃ
ａなし：冠動脈カルシウムなしの群。ＢＰ：血圧、^＊心臓スコアは、年齢、収縮期血圧、
ｍｍｏｌ／Ｌでの総コレステロール、および喫煙状態に基づいた心血管疾患のリスクの評
価である。^＊＊１人の患者のみからのＡｇａｔｓｔｏｎスコア。

統計学
ＥＬＮ−５５２アッセイにおいて２つのコホートを検定する際、データを、ダゴスティ
ーノ−ピアソンのオムニバス検定を用いてガウス分布についてチェックし、ヒストグラム
を作成することにより分布を視覚的にチェックした。その後、異なる群を、ノンパラメト
リックｔ検定を用いて差について検定した。

結果
ＥＬＮ−５５２は、急性心筋梗塞を有する患者において上昇している
ＥＬＮ−５５２を、ＢｉｏＣｏｒｅアテローム性動脈硬化コホートにおいて試験した。
ＥＬＮ−５５２のレベルは、非ＡＭＩと比較して、ＡＭＩを有する患者由来の血清におい
て有意に高かった（ｐ＜０．０１）（エラー！参照源が見つからない。１４）。患者は、
臨床症状および画像化マーカーに基づいて群に分けられている。ＡＭＩ群および非ＡＭＩ
群を網羅するバーは、ノンパラメトリックｔ検定によって計算されたこれらの群の間での
有意差を示す。^＊＊は０．０１未満のｐ値を示す。比較について、ｙ軸は、（エラー！参
照源が見つからない）におけるものと同じ値を有する。ノンパラメトリックｔ検定を用い
て、群間の最も高い差はＡＭＩ群と非ＡＭＩ群の間で見出されることが明らかである。Ａ
ＭＩ群と冠動脈カルシウムなしの群の間において、ｐ＝０．０７のほぼ有意な差があり、
非ＡＭＩ群と高冠動脈カルシウム群の間では、０．０８のｐ値があり、より大きい患者の
群、およびそれにより高い検出力が、これらの差を確認し得、かつ、さらにアッセイを特
徴づけ得ることを示唆した。

本明細書において、明確に他に指示がない限り、単語「または（ｏｒ）」は、提示され
た条件のうちの１つのみが満たされることを必要とする機能語「排他的ｏｒ」とは対照的
に、その条件のうちの一方または両方が満たされる場合、真の値を戻す機能語の意味で用
いられる。単語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「からなること（ｃｏｎｓｉ
ｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を意味するよりむしろ、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の意
味で用いられる。上記で認知された全ての先行の教示は、参照により本明細書に組み込ま
れる。本明細書におけるいかなる先行の公表された文書の認知も、その教示が、オースト
ラリアまたは他の場所においてその公表日時点で、共通の一般知識であったことの承認ま
たは表示であると解釈されるべきではない。

［文献リスト］

Claims (7)

1. 患者生体液試料に天然で存在するＮ末端またはＣ末端ネオエピトープを含有するバーシカンタンパク質断片を測定するためのイムノアッセイを行うステップを含む線維症疾患を評価するためのバイオアッセイの方法であって、前記イムノアッセイが、前記試料に天然で存在するタンパク質断片を、ＭＭＰ８またはカテプシンＫによるバーシカンの切断によって形成されるＮ末端またはＣ末端ネオエピトープと反応性の免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、前記試料における前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを含むタンパク質断片を測定するためにペプチド断片の前記免疫学的結合パートナーへの結合の程度を測定するステップとを含む方法により行われ、前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープが、以下の表に示される切断部位におけるバーシカンの切断によって形成される、
   バイオアッセイの方法。
2. 前記免疫学的結合パートナーが、Ｃ末端ネオエピトープまたはＮ末端ネオエピトープを含むペプチド断片に対する特異的結合親和性を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記免疫学的結合パートナーが、ペプチドのＮ末端における以下の配列のいずれかと特異的に反応する、請求項１に記載の方法。
   
4. 前記免疫学的結合パートナーが、ペプチドのＣ末端における以下の配列のいずれかと特異的に反応する、請求項１に記載の方法。
   
5. 前記結合の検出が定量的である、請求項１に記載の方法。
6. 前記結合の量が、健康な個体の集団、および、線維性疾患または炎症状態により特徴づけられた個体の集団について、確立された対照値と比較される、請求項１に記載の方法。
7. 前記試料中のペプチドが、前記免疫学的結合パートナーへの結合について、前記免疫学的結合パートナーに結合する既知の濃度の結合物質と競合する競合アッセイとして行われる、請求項１に記載の方法。