ES2708424T3 - Ensayo de biomarcadores patológicos - Google Patents

Abstract

Un método de bioensayo que comprende realizar un inmunoensayo para medir los fragmentos de proteínas que contienen neo-epítopos presentes de forma natural en una muestra de biofluido, en el que dicho inmunoensayo se realiza mediante un método que comprende: poner en contacto los fragmentos de proteínas presentes de forma natural en dicha muestra con una pareja de unión inmunológica específicamente reactiva con un neo-epítopo formado por escisión de una proteína por una proteinasa y medir la extensión de la unión de fragmentos peptídicos a dicha pareja de unión inmunológica para medir en la misma fragmentos de proteína que comprenden dicho neo-epítopo, en el que dicha pareja de unión inmunológica es específicamente reactiva con la siguiente secuencia en el terminal N de un péptido: KTFGKM.

Description

DESCRIPCION

Ensayo de biomarcadores patologicos

La presente invencion se refiere a ensayos para biomarcadores utiles en el diagnostico de diversas enfermedades incluyendo enfermedades de fibrosis y el pronostico de su desarrollo, incluidos biomarcadores indicativos del riesgo de desarrollar una enfermedad, por ejemplo, el riesgo de desarrollar una fibrosis despues de una lesion cronica. Los biomarcadores para enfermedades inflamatorias tal como la espondilitis anquilosante, tambien se describen como biomarcadores para enfermedades cardiovasculares (ECV).

En particular, de acuerdo con la presente invencion, se encuentran utiles biomarcadores relacionados con fragmentos de degradacion de Colageno de tipo I, III, IV, V y VI, elastina, protefna C reactiva, ApoE, lumicano, LAMC1, LAMB1, LAMA5 y proteoglicanos, incluyendo Biglicano, Decorina, Versicano y Perlecano.

Las enfermedades fibroticas (incluidas las enumeradas en la Tabla 1) son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad, por ejemplo, cirrosis con 800.000 muertes al ano en todo el mundo1.

Tabla 1. Diferentes enfermedades fibroticas2

Una "enfermedad fibrotica" es cualquier enfermedad que da lugar a fibrosis, ya sea como sfntoma principal o secundario.

La fibrosis es el resultado final de reacciones inflamatorias cronicas inducidas por una diversidad de estfmulos incluyendo infecciones persistentes, reacciones autoinmunes, respuestas alergicas, insultos qufmicos, radiacion y lesion tisular. La fibrosis se caracteriza por la acumulacion y reorganizacion de la matriz extracelular (MEC). A pesar de tener obvias distinciones etiologicas y clfnicas, la mayorfa de los trastornos fibroticos cronicos tienen en comun un irritante persistente que sostiene la produccion de factores de crecimiento, enzimas proteolfticas, factores angiogenicos y citocinas fibrogenicas, que en conjunto estimulan la deposicion de elementos del tejido conectivo, especialmente colagenos y proteoglicanos, que remodelan y destruyen progresivamente la arquitectura tisular normal3, 4 A pesar de su enorme impacto en la salud humana, actualmente no hay tratamientos aprobados que aborden directamente los mecanismos de la fibrosis5.

El mediador celular clave de la fibrosis es el miofibroblasto, que cuando se activa sirve como la celula primaria productora de colageno.

Afecciones inflamatorias

La espondilitis anquilosante (AS) es una forma de inflamacion cronica de la columna vertebral y las articulaciones sacroilfacas. Con el tiempo, la inflamacion cronica de la columna vertebral puede llevar a una cementacion completa de las vertebras (110), un proceso con una patologfa molecular que aun debe investigarse y entenderse completamente. La AS es tambien una enfermedad sistemica que afecta a otros tejidos del cuerpo, incluida la inflamacion o lesion de otras articulaciones, asf como a los organos tal como los ojos, el corazon, los pulmones y los rinones (111). Los procesos relacionados con la inflamacion en la AS, que implican multiples tejidos, parecen implicar procesos moleculares que incluyen un aumento de la actividad de MMP y la deposicion de colageno, lo que se observa en la mayorfa de los tipos de renovacion del tejido conectivo.

La remodelacion de la matriz extracelular (MEC) es un proceso clave de la homeostasis del tejido (112, 113). Las actividades proteolfticas especfficas son un requisito previo para una serie de funciones e interacciones celulares dentro de la MEC (114). Estas actividades especfficas se coordinan con precision en situaciones fisiologicas normales, con una secuencia especffica de eventos que dan como resultado una renovacion tisular controlada. En situaciones patologicas, con especial enfasis en las enfermedades del tejido conectivo, la relacion normal de reparacion-respuesta se ve alterada (115), lo que conduce a una remodelacion excesiva y a la renovacion tisular. La consecuencia de esta remodelacion de la MEC es la liberacion de una gama de productos de degradacion de protefnas, neo-epftopos, generados por las proteasas expresadas localmente en el area patologicamente afectada. Estos fragmentos de degradacion de protefnas pueden servir como dianas de biomarcadores moleculares, ya que son mas especfficos para el tejido de origen en comparacion con sus orfgenes intactos (116).

Las endopeptidasas, tales como las metaloproteinasas de matriz (MMP), desempenan un papel importante en la degradacion de protefnas de la MEC como colagenos y proteoglicanos (117, 118). En particular, en enfermedades del tejido conectivo, tal como la fibrosis, se ha demostrado que MMP-2 y -9 estan muy reguladas positivamente (119­ 121). Recientemente, los marcadores bioqufmicos basados en neo-epftopos encontrados en la orina y el suero han recibido mayor atencion por su potencial diagnostico y pronostico (116). En particular para enfermedades de progreso lento, tal como osteoporosis y osteoartritis, los marcadores de reabsorcion osea y de degradacion del cartflago, basados en productos de degradacion del colageno de tipo I y II, respectivamente, se han estudiado ampliamente (122).

Matriz Extracelular (MEC)

La fibrogenesis es un proceso dinamico que implica mecanismos celulares y moleculares complejos que normalmente se originan en la lesion tisular6. La fibrogenesis es el resultado de un desequilibrio en la regulacion de la MEC normal que altera la concentracion de macromoleculas lo que conduce a un aumento del tamano y la densidad del tejido, con una funcion progresivamente alterada. Estas macromoleculas son principalmente protefnas fibrosas con funciones estructurales y adhesivas, tales como colagenos y proteoglicanos.

Colageno

Los colagenos se distribuyen de manera amplia en el cuerpo humano, es decir, ~30 % de la masa de protefnas en el cuerpo humano esta compuesta por colagenos. Los colagenos son responsables de la integridad estructural de la MEC de la mayorfa de los tejidos conectivos. El contenido de la MEC es resultado de un fino equilibrio entre la sfntesis y la degradacion que se controla estrechamente mediante la regulacion de la expresion genica y la secrecion de protefnas, pero tambien a traves de la inhibicion endogena de las proteasas y la degradacion de las protefnas por las metaloproteinasas y las proteasas de cistefna7'9. La Tabla 2 enumera los principales tipos de colageno con su principal distribucion tisular.

_______________________Tabla 2. Principales tipos de colageno y su distribucion tisular.____________

Tipo de colageno Distribucion tisular____________________________________________________

I Mayorfa de los tejidos conectivos

II Cartflago, humor vftreo

III Tejidos conectivos extensibles, por ejemplo, hfgado, piel, pulmon, sistema vascular

IV Membranas basales

V Tejidos que contienen colageno I

VI Mayorfa de los tejidos conectivos

VII Piel, vejiga, mucosa oral, cordon umbilical, amnios

VIII Muchos tejidos, especialmente el endotelio

XIII Celulas endoteliales, piel, ojos, corazon, musculo esqueletico

Tipo de colageno Distribucion tisular____________________________________________________

XIV Vasos, hueso, piel, cartflago, ojos, nervios, tendones, utero

XXI_____________ Vasos, corazon, estomago, rinones, musculo esqueletico, placenta______________

El colageno de tipo I es el colageno mas abundante y se encuentra en la mayorfa de los tejidos conectivos. Es especialmente importante para la estructura de los huesos y de la piel donde los principales componentes de colageno son los colagenos de tipo I y III10.

Los colagenos tipo I y III son los principales componentes del hfgado y del pulmon en una relacion 1:1 en los tejidos sanos. Adicionalmente, los colagenos tipo IV y VI se encuentran en las membranas basales en la mayorfa de los tejidos. La localizacion mas frecuente del colageno de tipo V es dentro de las fibrillas de colageno caracterfsticas, en asociacion con los colagenos de tipo I y III10.

Algunos colagenos tienen una distribucion tisular restringida: por ejemplo, el de tipo II, que se encuentra casi exclusivamente en el cartflago11.

Durante la fibrogenesis la cantidad neta de colageno aumenta12-14. La Tabla 3 muestra, en forma de ejemplo, el aumento de colageno durante la fibrosis hepatica.

Tabla 3. Cambios de la composicion de colageno entre el hfgado humano normal y el cirrotico15.

Tipo de Colageno del Colageno del Distribucion en el Distribucion en el colageno ^Cadenas hfgado normal hfgado cirrotico Veces que

aumento hfgado normal hfgado cirrotico (mg/g) (mg/g) (%) (%) I a1(I) 16 8 37 42

a2(I) 2

III a¹(III) 2 8 4 37 21 IV a¹(IV) 0,5 7 14 9 18 a²(IV)

V a¹(V) 0,9 7 8 17 18

a²(V)

a3(V)

VI a¹(VI) 0,01 0,1 10 0,2 0,3

a²(VI)

Se ha documentado que el colageno de tipo V es crfticamente importante para la formacion de fibrillas de colageno (123), ilustrado por una falta casi virtual de formacion de fibrillas de colageno en los ratones col5a1-/-. Durante la alineacion, los ratones heterocigotos se asociaron con una reduccion del 50% en el numero de fibrillas y el contenido de colageno dermico. Esto indica un papel central para el colageno de tipo V en la regulacion dependiente de la vida de la fibrilogenesis, lo que sugiere que este tipo de colageno es de interes fundamental en muchas enfermedades conectivas. Sin embargo, todavfa hay una falta conceptual de comprension del papel de la renovacion de colageno de tipo V en las enfermedades conectivas que puede deberse en parte a las incapacidades tecnicas para la investigacion de la degradacion y la renovacion del colageno de tipo V. De forma interesante, muy recientemente, se encontro que un conjunto diverso limitado de protefnas se unfa al colageno de tipo V, comenzando a dilucidar la funcion molecular de esta molecula con mas detalles, de las cuales la MMP-2 era una de ellas (124). Ademas de la caracterizacion molecular, esta surgiendo mas evidencia de que el colageno de tipo V afecta directamente a diferentes fenotipos celulares al inducir la motilidad dinamica y otras actividades celulares, lo que sugiere que estas protefnas pueden ser mas que un componente pasivo de la MEC (125, 126). En apoyo directo de esto, recientemente se describio una correlacion muy fuerte con la fibrosis hepatica con la formacion de colageno de tipo V en dos modelos animales separados de fibrosis hepatica (127), lo que sugiere un papel central de la formacion de colageno de tipo V en la renovacion excesiva de tejido.

El colageno de tipo V es un colageno formador de fibrillas, junto con los tipos I, II, III y XI (11), y se forma como heterotrfmeros de tres cadenas a diferentes (a1, a2, a3). Tfpicamente forma heterofibrillas con colagenos de tipo I y III y contribuye a la matriz osea organica, el estroma corneal y la matriz intersticial de musculos, hfgado, pulmones y placenta (128). La mutacion del colageno de tipo V produce una variedad de enfermedades del tejido conectivo, de las cuales el sfndrome de Ehlers-Danlos (EDS) es el mejor descrito. El EDS es un grupo heterogeneo de trastornos hereditarios caracterizados por hipermovilidad articular, cambios en la piel (por ejemplo, hiperextensibilidad, delgadez y fragilidad). La enfermedad se puede dividir en diferentes subtipos, EDS 1 y II. Los tipos de EDS I y II se caracterizan por cicatrices atroficas, hiperextensibilidad de la piel y laxitud de las articulaciones. Es evidente que ambos subtipos son resultado de mutaciones en los genes COL5A1 y COL5A2 que codifican dos de las cadenas polipeptfdicas del colageno de tipo V (129-131). Esto destaca la importancia del colageno de tipo V en las enfermedades de los tejidos conectivos.

Elastina

La elastina es una protefna presente en muchos tejidos conectivos, fundamentalmente en los que son elasticos. Tiene un muy alto contenido de los aminoacidos glicina, valina, alanina y prolina, y tiene un peso molecular de 64 a 66 kDa. Se organiza en una conformacion helicoidal irregular o al azar compuesta por 830 aminoacidos. La elastina se elabora mediante el enlace de muchas moleculas solubles de la protefna tropoelastina, en una reaccion que se cataliza por la lisiloxidasa, para elaborar una matriz reticulada duradera, insoluble masiva.

La elastina cumple una importante funcion en las arterias como un medio para la propagacion de la onda de presion para ayudar al flujo sangufneo y es particularmente abundante en los grandes vasos sangufneos elasticos tales como la aorta. La elastina es tambien muy importante en los pulmones, los ligamentos elasticos y la piel.

A pesar de muchos esfuerzos que se dedican a la comprension de la sfntesis y la renovacion de la elastina, los neoepftopos procedentes de la escision proteolftica de estas moleculas de la matriz no han asociado hasta ahora con el desarrollo de la enfermedad en la fibrosis.

Vimentina

La vimentina es un miembro de la familia de protefnas de filamentos intermedios. Los filamentos intermedios son una importante caracterfstica estructural de las celulas eucariotas. Junto con los microtubulos y microfilamentos de actina, constituyen el citoesqueleto. Aunque la mayorfa de los filamentos intermedios son estructuras estables, en los fibroblastos, la vimentina existe como una estructura dinamica. Este filamento se utiliza como un marcador de los tejidos que se derivan del mesodermo, y como tal se utiliza como un marcador inmunohistoqufmico para los sarcomas.

Hertig y colaboradores (Hertig et al., J Am Soc Nephrol. 2008 Aug;19(8):1584-91) investigaron si la transicion epitelial a mesenquimal en las celulas epiteliales tubulares renales de pacientes con nefropatfa cronica de aloinjerto podia predecir la progresion de la fibrosis en el aloinjerto y midieron la expresion de vimentina en 83 biopsias de estos. Encontraron una asociacion entre la expresion elevada de la vimentina y la puntuacion de la fibrosis intestinal 1 ano despues de la cirugfa.

En otro estudio de la fibrosis hepatica, Meriden y colaboradores (Meriden et al., Clin Gastro & Hepatol 2010; 8:289­ 296) encontraron una asociacion significativa entre la expresion de la vimentina (en biopsias que se obtuvieron en el estadio F0) y la progresion de la fibrosis, donde los niveles elevados predijeron la rapida progresion de la fibrosis hepatica.

Por consiguiente, se quiso investigar si los fragmentos de vimentina circulantes podrfan servir como biomarcadores sensibles y especfficos de la fibrosis.

Proteoalicanos

Los proteoglicanos son un grupo diverso de macromoleculas, que unen covalentemente un numero variable de cadenas laterales de glucosaminoglicanos (GAG) a una protefna nuclear16. Estos GAG son polfmeros de repeticiones de disacarido (por ejemplo, N-acetil glucosamina o N-acetil galactosamina), que son acidos (cargados negativamente) debido a los grupos laterales hidroxilo, carboxilados y sulfatadas en las unidades de disacarido. Esto los hace altamente hidrofilos, facilitando de este modo la difusion del agua y los iones positivos (por ejemplo, el sodio de los fluidos extracelulares)17. Ademas, los GAG tienen la capacidad de formar enlaces no covalentes con, por ejemplo, las cadenas de acido hialuronico para formar complejos moleculares aun mayores16. La Tabla 4 enumera los proteoglicanos mas estudiados que se asocian con el tejido conectivo.

Tabla 4. Proteoglicanos de la matriz extracelular del tejido conectivo

Grupo Proteoglicanos Origen Funcion Proteoglicanos

extracelulares grandes Condrocitos del cartflago

intervertebral, Estabilidad de la matriz extracelular (mediante la agregacion y Agrecano ' articular, disco union de hialuronano) la union de hialuronano) cartflago nasal (

Tejido conectivo: fibroblastos, Interacciones celula-celula y celula-Versicano ' queratinocitos, celulas de

musculo liso, celulas matriz Union de azucares de forma mesangiales dependiente de Ca Neurocano 21 Tejido nervioso Se une a las moleculas de adhesion de las celulas neuronales Brevicano 22 Tejido nervioso Estabilidad de la matriz extracelular Proteoglicanos pequenos Se une a y conecta las moleculas ricos en leucina (union a Decorina 23 Tejido conectivo, cartflago, de colageno (estabilizacion de la colageno) hueso matriz y espesor) Union en la organogenesis de TGFp Endotelio capilar, piel

Biglicanos 24 (queratinocitos), epitelio del La diferenciacion celular Une y rinon conecta las fibrillas de colageno Fibromodulina Tejido conectivo, hueso, Orientacion regulada de las fibras 17 cartflago de colageno Lumicano 23 Cornea, musculo, cartflago, Controla el espaciado y el espesor rinon, pulmon, intestino de las fibras de colageno Proteoglicanos asociados a Ampliamente distribuidas a Diferenciacion de las celulas _celulas Serglicinas 25 los compartimientos hematopoyeticas Adhesion y intercelulares del endotelio activacion de las celulas linfoides Ampliamente distribuidos - a

Sindecanos 26 menudo unidos a la Une colagenos, fibronectina, membrana celular trombospondina, tenascina y bFGF Betaglicano 27 Ampliamente distribuido Receptor de TGFp y senalizacion Posible reservorio de TGFp Proteoglicanos de la Barrera selectiva para membrana basal Perlecano 28 ^{Todas las membranas}

_basales macromoleculas

PROTEINA C REACTIVA

La protefna C reactiva (CRP) es una protefna serica de la fase aguda que se produce por el hfgado en respuesta a diferentes afecciones clfnicas tales como, inflamacion, infeccion o trauma29. La produccion de CRP se induce por citocinas, tal como IL-6, que se libera de los tejidos afectados o danados. El papel fisiologico de la CRP se desconoce aun y estan en curso analisis sobre su accion pro o antiinflamatoria.

APOLIPOPROTEINA e

La apolipoprotefna E (APOE) es una clase de apolipoprotefna que se encuentra en el quilomicron (partfculas grandes de lipoprotefnas) y partfculas de lipoprotefnas de densidad intermedia que se unen a receptores especfficos en celulas hepaticas y celulas perifericas. Es esencial para el catabolismo normal de los constituyentes de lipoprotefnas ricas en trigliceridos. La APOE tiene una longitud de 299 aminoacidos y transporta lipoprotefnas, vitaminas liposolubles y colesterol al sistema linfatico y luego a la sangre. Se sintetiza principalmente en el hfgado, pero tambien se ha encontrado en otros tejidos tal como el cerebro, los rinones y el bazo. La APOE es esencial para el catabolismo normal de los constituyentes de lipoprotefnas ricas en trigliceridos. La APOE fue reconocida inicialmente por su importancia en el metabolismo de las lipoprotefnas y las enfermedades cardiovasculares.

ELASTINA

La elastina es la molecula de la matriz extracelular responsable de la resiliencia de los tejidos y se penso primero que estaba restringida a ese papel. Ahora se ha establecido que la degradacion de la elastina puede conducir a la produccion de peptidos bioactivos que influyen en la quimiotaxis celular, la proliferacion celular y la sfntesis de proteasas en un amplio panel de celulas normales y tumorales.

LAMC1, LAMA2, LAMB1, y LAMA5

Las lamininas, una familia de glucoprotefnas de matriz extracelular, son el principal constituyente no colageno de las membranas basales. Se han visto implicadas en una amplia diversidad de procesos biologicos que incluyen adhesion celular, diferenciacion, migracion, senalizacion, crecimiento de neuritas y metastasis. Las lamininas estan compuestas por 3 cadenas no identicas: laminina alfa, beta y gamma (antes A, B1 y B2, respectivamente), y forman una estructura cruciforme que consiste en 3 brazos cortos, cada uno formado por una cadena diferente, y un brazo largo compuesto por las 3 cadenas. Cada cadena de laminina es una protefna multidominio codificada por un gen distinto. Se han descrito varias isoformas de cada cadena. Diferentes isomeros de cadena alfa, beta y gamma se combinan para dar lugar a diferentes isoformas heterotrimericas de laminina, que se designan mediante numeros arabigos en el orden de su descubrimiento. Las funciones biologicas de las diferentes cadenas y moleculas trimericas son en gran parte desconocidas, pero se ha demostrado que algunas de las cadenas difieren con respecto a su distribucion tisular, probablemente reflejando diversas funciones in vivo.

LAMC1 (antes LAMB2) es la subunidad de laminina gamma-1.

LAMA2 es la subunidad de laminina alfa-2

LAMB1 es la subunidad de laminina beta-1

LAMA5 es la subunidad de laminina alfa-5

Proteasas

El desequilibrio entre la sfntesis y la degradacion de la MEC durante la fibrogenesis, es resultado de la conversion de la matriz subendotelial de baja densidad en la matriz rica en colagenos intersticiales. El aumento de colageno y proteoglicanos puede deberse a uno o ambos de (1) una disminucion en la produccion de la protefna y (2) la alteracion de la degradacion de protefnas, y por lo tanto, menos degradacion de la matriz. La disminucion de la degradacion de protefnas recibe recientemente mayor atencion. En la regulacion de este proceso las metaloproteinasas de matriz (MMP) y sus inhibidores tisulares (TIMP) desempenan funcionan importantes, asf como otras proteasas y sus inhibidores, tales como las cistefna proteasas y las cistatinas.

MMP

Las MMP son un grupo grande de endopeptidasas, capaces de degradar la mayorfa, sino todos, los componentes de la MEC. Actualmente, se encontraron mas de 25 ^m M^p . Las MMP se caracterizan por un sitio activo que contiene un atomo de metal, tfpicamente cinc, y se secretan como zimogenos. Se expresan diferentes MMP en diferentes tejidos. En la Tabla 5 se muestran las MMP en el hfgado.

Tabla 5. MMP en el hfgado30-32

, p o 3

Las TIMP bloquean la actividad proteolftica de las MMP mediante la union a la MMP de manera espedfica del sustrato y el tejido y la metaloproteinasa de membrana tipo 1 en un complejo trimolecular (Tabla 6). Durante la fibrosis, los niveles de TIMP aumentan drasticamente, y los niveles de MMP aumentan modestamente o se mantienen relativamente estaticos (excepto los de la MMP-2), lo que en conjunto da una disminucion de la degradacion de los colagenos.

Tabla 6. TIMP en el higado31

Protefna de activacion de fibroblastos

La subunidad alfa de la proteina de activacion de fibroblastos (FAPa o FAP, alfa) es una gelatinasa integral de membrana que pertenece a la familia de las serina proteasas. La FAPa es la subunidad alfa y la DPP4 (CD26) la subunidad beta de un complejo de proteinasa heterodimerico unido a la membrana que se conoce tambien como Gelatinasa de Membrana de Melanoma 170 kDa, Serina Proteinasa Integral de Membrana y Seprasa. Algunas celulas solo producen homodfmeros de FAPa, algunas solo homodfmeros de DPP4. El monomero esta inactivo. La FAP, alfa se expresa de manera selectiva en los fibroblastos del estroma reactivo de los canceres epiteliales, el tejido de granulacion de la cicatrizacion de heridas, y las celulas neoplasicas de los sarcomas oseos y de los tejidos blandos33. Se cree que esta proteina participa en el control del crecimiento de los fibroblastos o en las interacciones mesenquimales-epiteliales durante el desarrollo, la reparacion tisular, y la carcinogenesis epitelial. Se demostro que la expresion de ^fA^p aumenta con el estadio de la fibrosis34, 35.

ADAMTS

La ADAMTS (una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina (A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs)) es una familia de peptidasas, y hasta ahora se han identificado 19 miembros de esta familia en seres humanos. Las funciones conocidas de las proteasas ADAMTS incluyen el procesamiento de procolagenos y el factor de von Willebrand, asf como la escision de agrecano, versicano, brevicano y neurocano. Se ha demostrado que tienen importantes funciones en la organizacion del tejido conectivo, la coagulacion, la inflamacion, la artritis, la angiogenesis y la migracion celular.

Catepsinas

Existen aproximadamente una docena de miembros de la familia de catepsinas de proteasas, que se distinguen por su estructura, mecanismo catalttico, y que protemas escinden. La mayona de los miembros se activan con el bajo pH que se encuentra en los lisosomas. Por lo tanto, la actividad de esta familia se encuentra casi en su totalidad dentro de esos organulos (aunque hay muchas excepciones). Tal como la catepsina K, que (entre otras actividades) funciona extracelularmente despues de la secrecion por osteoclastos en la resorcion osea.

La catepsina K (CAT K) y la catepsina S (CAT S) son ambas proteasas de cistema.

Biomarcadores de fibrosis

Se han sugerido varios marcadores bioqmmicos para las enfermedades fibroticas, aunque no es un producto espedfico de la enfermedad. En la Tabla 7 se muestra un ejemplo de los marcadores bioqmmicos de la fibrosis hepatica utilizados en un ensayo clmico. Adicionalmente hay numerosos ejemplos de biomarcadores de otras enfermedades fibroticas12, 36'42.

L T l 7 r m l n l m r r n i l fi r i h i .

El documento US5387504 describe el neo-epftopo VDIPEN liberado por la accion de la estromelisina en el sitio N341 -F342 del agrecano y un ensayo RIA que emplea un anticuerpo monoclonal especffico para este neo-epftopo. Mas generalmente, se describe el uso de anticuerpos monoespecfficos especfficos para los fragmentos de agrecano, que se generan por la escision de una estromelisina especffica. Las elevaciones de la estromelisina se producen en la osteoartritis, la artritis reumatoide, las lesiones ateroscleroticas, la gota, la enfermedad inflamatoria del intestino (EII), la fibrosis pulmonar idiopatica (FPI), ciertos tipos de cancer, las lesiones en las articulaciones, y numerosas enfermedades inflamatorias. Se indica que la estromelisina es elevada en la fibrosis pulmonar idiopatica, y se alega que el ensayo puede realizarse en sangre u otros fluidos biologicos para detectar los productos de escision de estromelisina del agrecano y que la cuantificacion de dichos fragmentos se puede utilizar para el diagnostico en relacion con la FPI, asf como en otras afecciones. Sin embargo, no se proporciona evidencia de esto y, segun nuestro conocimiento, no ha habido publicaciones posteriores que validen esta prediccion. Dichos ensayos de RIA han estado disponibles comercialmente durante muchos anos y no han aparecido informes de su uso exitoso en el diagnostico o seguimiento de ninguna enfermedad fibrotica.

La Patente de Estados Unidos 7.225.080 divulga un metodo para el diagnostico de una enfermedad inflamatoria, fibrotica o cancerosa en un paciente midiendo los valores de al menos cuatro marcadores bioqmmicos seleccionados del grupo que consiste en a2-macroglobulina, AST (aspartato aminotransferasa), ALT (alanina aminotransferasa), GGT (gammaglutamilo transpeptidasa), Y-globulina, bilirrubina total, albumina, a1-globulina, a2-globulina, haptoglobina, p-globulina, apoA1, IL-10, TGF-p1, apoA2 y apo en el suero o plasma de dicho paciente, y posteriormente combinando dichos valores para determinar la presencia de fibrosis hepatica y/o lesiones necroinflamatorias hepaticas en dicho paciente. La patente no ensena la medicion cuantitativa de fragmentos peptfdicos portadores de neo-epftopos generados durante la enfermedad fibrotica.

La Patente de Estados Unidos 6.060.255 describe un metodo para diagnosticar el grado de fibrosis hepatica, que comprende las etapas de medir la forma de alto peso molecular de colageno de tipo IV en una muestra que utiliza un anticuerpo que se une espedficamente al colageno de tipo IV, y relacionar la medicion con el grado de fibrosis hepatica. De nuevo, no se hace uso de neo-epftopos producidos por enzimas proteolfticas que actuan en el cuerpo. La muestra en realidad se digiere con pepsina, lo que puede ocultar el patron natural de escision del colageno en la muestra.

La Patente de Estados Unidos 4.628.027 (Gay) divulga la produccion de anticuerpos espedficos para protemas de tejido conectivo y, mas particularmente, la produccion de anticuerpos monoclonales por Idbridos de celulas fusionadas contra colagenos humanos y enzimas implicadas en la degradacion del colageno. Se describe el uso de anticuerpos monoclonales contra protemas del tejido conectivo para establecer el perfil de colageno de muestras de fluidos histologicos, citologicos y biologicos. Sin embargo, la patente no describe la medicion de protemas de tejido conectivo basandose en la union de anticuerpos a neo-epftopos en dichas protemas del tejido conectivo.

Guanabens N et al, J Bone Miner Res, 1998 98 evaluaron los marcadores de renovacion osea N-telopeptido de colageno de tipo I (NTX), C-telopeptido de colageno de tipo I (CTX) y pro-peptido N-terminal de colageno de tipo I (PINP) en pacientes con cirrosis biliar primaria, una enfermedad con un aumento de la fibrosis hepatica. El nivel de NTX, CTX y PINP se elevo en los pacientes en comparacion con los controles y se correlaciono con el estadio histologico de la enfermedad. Los anticuerpos empleados en el NTX se generaron contra un sitio de escision de la catepsina K en el extremo N del colageno de tipo I y dependen del neo-epftopo YDGKGVG^ SEQ ID NO 302. Los anticuerpos empleados en el CTX se generaron contra un sitio de escision de la catepsina K en el extremo C del colageno de tipo I y dependen del neo-epftopo EKAHDGGR^ SEQ ID NO 303. Estos marcadores estan localizados en telopeptidos del colageno de tipo I y no en la parte interna (la triple helice) del colageno de tipo I. Los anticuerpos monoclonales empleados para el ensayo PINP se generaron contra un epftopo interno en la secuencia PINP que no es un neo-epftopo.

Moller S et al, Gut., 199999 demostraron que el telopeptido reticulado C-terminal de colageno de tipo I (ICTP) estaba elevado en pacientes con cirrosis alcoholica en comparacion con los controles. El estudio descrito mostro que un marcador bioqmmico puede reflejar fibrosis hepatica. El anticuerpo policlonal ICTP se ha generado contra la tripsina y el colageno escindido con colagenasa tipo I. Sin embargo, los anticuerpos no se unen a un neo-epftopo.

Rosen HN et al, Calcif Tissue Int, 2004100 evaluaron los marcadores de renovacion osea N-telopeptido de colageno de tipo I (NTX) y C-telopeptido de colageno de tipo I (CTX) en mujeres que recibieron tratamiento de reemplazo hormonal (TRH). En el estudio se observo que los marcadores de renovacion osea disminuyeron con el tratamiento. Los anticuerpos empleados en el NTX se generaron contra un sitio de escision de la catepsina K en el extremo N del colageno de tipo I y dependen del neo-epftopo YDGKGVG^ SEQ ID NO 302. Los anticuerpos empleados en el CTX se generaron contra un sitio de escision de la catepsina K en el extremo C del colageno de tipo I y dependen del neo-epftopo EKAHDGGR^ SEQ ID NO 303. A diferencia de la presente invencion, estos anticuerpos se usaron para evaluar el metabolismo oseo y no la fibrosis.

Lein M et al, Eur Urol, 2007101 evaluaron el uso de los marcadores de renovacion osea espedficos de neo-epftopo N-telopeptido de colageno de tipo I (NTX) y C-telopeptido de colageno de tipo I (CTX) en pacientes con cancer de prostata que recibieron acido zoledronico. En el estudio se observo que los marcadores de renovacion osea disminuyeron con el tratamiento. Los anticuerpos empleados en el NTX se generaron contra un sitio de escision de la catepsina K en el extremo N del colageno de tipo I y dependen del neo-epftopo YDGKGVG^ SEQ ID NO 302. Los anticuerpos empleados en el CTX se generaron contra un sitio de escision de la catepsina K en el extremo C del colageno de tipo I y dependen del neo-epftopo EKAHDGGR^ SEQ ID NO 303. A diferencia de la presente invencion, estos anticuerpos se utilizaron para evaluar el metabolismo oseo durante la invasion de metastasis oseas y no de fibrosis.

El PIIINP se ha utilizado en varios estudios para evaluar la gravedad de la enfermedad fibrotica102, en pacientes con fibrosis de la piel despues de un traumatismo severo por quemaduras103, para la progresion de la enfermedad en la cirrosis biliar primaria no cirrotica104, en la cirrosis biliar primaria y la hepatitis viral cronica C105.

Se midieron PIIINP e ICTP en pacientes con fibrosis del miocardio106.

Muchos informes combinan un conjunto de marcadores bioqufmicos para mejorar el valor predictivo del fndice bioqufmico. Se midieron once marcadores sericos diferentes en 205 pacientes con estadificacion fibrotica de F0 a F4, y los marcadores mas informativos fueron la macroglobulina alfa2, la globulina alfa2 (o haptoglobina), la globulina gamma, la apolipoprotefna A1, la gamma glutamiltranspeptidasa y la bilirubina total107. Un fndice de estos marcadores tuvieron un valor predictivo negativo (se obtuvo una certeza del 100% de la ausencia de F2, F3 o F4) para las puntuaciones que variaban de cero a 0,10 (12% [41] de todos los pacientes), y un alto valor predictivo positivo (>90% de certeza de presencia de F2, F3 o F4) para puntuaciones que variaban de 0,60 a 1,00 (34% [115] de todos los pacientes).

El documento WO2010/115749 describe numerosos neo-epftopos de algunas de las protefnas descritas anteriormente como biomarcadores de fibrosis y el documento WO2009/059972 describe numerosos neo-epftopos de algunas de las protefnas descritas anteriormente como biomarcadores de enfermedades cardiovasculares.

El documento US 2010/209940 describe metodos de diagnostico o de cuantificacion de fibrosis que comprenden la forma de realizacion de un inmunoensayo para medir los fragmentos de protefnas que contienen neo-epftopo presentes de forma natural en una muestra de biofluido, y la asociacion de una elevacion de dicha medida en dicho paciente por encima de un nivel normal con la presencia o extension de la fibrosis.

Marian et al. ("Biomarkers of Cardiac Disease", Expert Rev. Mol. Diagn. 4(6), 805-520 (2004)) analiza biomarcadores seleccionados para la aterosclerosis coronaria, los sfndromes coronarios agudos y la insuficiencia cardfaca.

Sin embargo, en ninguno de los informes mencionados anteriormente se sugiere que las mediciones de los fragmentos peptfdicos basadas en los anticuerpos que se unen a neo-epftopos como se reivindica ahora podrfan ser utiles para la evaluacion de pacientes con enfermedad fibrotica o enfermedad inflamatoria.

La presente invencion proporciona ahora un metodo de bioensayo que comprende realizar un inmunoensayo para medir los fragmentos de protefnas que contienen neo-epftopos presentes de forma natural en una muestra de biofluido de un paciente, en el que dicho inmunoensayo se realiza mediante un metodo que comprende: poner en contacto los fragmentos de protefnas presentes de forma natural en dicha muestra con una pareja de union inmunologica reactiva con un neo-epftopo formado por escision de una protefna por una proteinasa y medir la extension de la union de fragmentos peptfdicos a dicha pareja de union inmunologica para medir en la misma fragmentos de protefna que comprenden dicho neo-epftopo, en el que dicha pareja de union inmunologica es especfficamente reactiva con la siguiente secuencia en el terminal N de un peptido: KTFGKM

Preferiblemente, la deteccion de la union es cuantitativa.

El metodo puede incluir asociar una elevacion de dicha medida en dicho paciente por encima de un nivel normal con la presencia de fibrosis o enfermedad inflamatoria. Preferiblemente, la cantidad de union se compara con los valores de control establecidos para poblaciones de individuos sanos y de individuos caracterizados por una enfermedad fibrotica o por una afeccion inflamatoria.

Opcionalmente, un resultado elevado en un inmunoensayo de acuerdo con esta invencion esta asociado con fibrosis de la piel, fibrosis pulmonar o fibrosis hepatica o enfermedad cardiovascular. Opcionalmente, un resultado elevado en un inmunoensayo de acuerdo con la invencion puede estar asociado con una afeccion inflamatoria, tal como espondilitis anquilosante. El metodo puede comprender la etapa preliminar de obtener una muestra de biofluido del paciente.

Dicha pareja de union inmunologica tiene afinidad de union especffica por fragmentos peptfdicos que comprenden el neo-epftopo N-terminal.

La reactividad especffica con o afinidad inmunologica para un neo-epftopo implicara que la pareja de union inmunologica relevante no es reactiva con la protefna intacta de la que deriva el neo-epftopo. Preferiblemente, dicha pareja de union inmunologica no es reactiva con una secuencia de neo-epftopo si la secuencia se prolonga mas alla del sitio de escision respectivo. Esto implicara que los peptidos medidos terminan con la secuencia designada. El termino "pareja de union inmunologica" como se usa en el presente documento incluye anticuerpos policlonales y monoclonales y tambien fragmentos de union especfficos de anticuerpos tales como Fab o F(ab')². Por lo tanto, dicha pareja de union inmunologica puede ser un anticuerpo monoclonal o un fragmento de un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de union especffica.

Preferiblemente, la secuencia de neo-epftopo a la que se une la pareja de union inmunologica no se encuentra en ninguna otra protefna o no se encuentra en ninguna de las otras protefnas a las que se refiere el metodo de la invencion.

El resultado de un ensayo de acuerdo con la invencion se puede combinar con uno o mas biomarcadores medidos para formar un fndice compuesto de valor diagnostico o pronostico.

En general, todos los formatos de inmunoensayo conocidos previamente se pueden usar de acuerdo con esta invencion, incluyendo formatos heterogeneos y homogeneos, ensayos en sandwich, ensayos de competicion, ensayos ligados a enzimas, ensayos radioinmunes y similares. Por lo tanto, opcionalmente, dicho metodo se realiza como un inmunoensayo de competicion en el que dicha pareja de union inmunologica y un agente de competicion se incuban en presencia de dicha muestra y el agente de competicion compite con los fragmentos peptfdicos en la muestra para unirse a la pareja de union inmunologica.

Dicho agente de competicion puede ser (1) un peptido sintetico derivado de la secuencia de versicano o un agente de competicion derivado de (2) una protefna nativa purificada nombrada anteriormente escindida por proteasas para revelar dicho neo-epftopo.

Un metodo adecuado podrfa ser un inmunoensayo de competicion usando anticuerpos monoclonales o fragmentos de union a anticuerpos que se unen a neo-epftopos de una protefna nombrada anteriormente. Los peptidos sinteticos seleccionados apropiadamente recubiertos sobre la superficie solida de una placa de microtitulacion podrfan competir con la muestra para unirse a los anticuerpos monoclonales o fragmentos de union. Como alternativa, podrfan usarse fragmentos de protefna nativa purificada que llevan el neo-epftopo reconocido por el anticuerpo monoclonal o fragmento de union en la superficie solida. Otra alternativa mas es inmovilizar el anticuerpo monoclonal o el fragmento de union en la superficie solida y luego co-incubar la muestra con un peptido sintetico ligando adecuadamente a una molecula senal, por ejemplo, peroxidasa de rabano picante o biotina.

La muestra puede ser una muestra de suero, sangre o plasma u otro tipo, por ejemplo, biopsia de tejido fibrotico. Los ensayos pueden realizarse como ensayos en sandwich usando una primera pareja de union inmunologica especfficamente reactiva con dicho neo-epftopo y una segunda pareja de union inmunologica reactiva con la protefna relevante a la que pertenece el neo-epftopo. Opcionalmente, dicha segunda pareja de union inmunologica se dirige a un segundo neo-epftopo de la misma protefna.

El desarrollo de anticuerpos monoclonales que reconocen neo-epftopos especfficos es como se indica a continuacion. Esto se puede lograr inmunizando ratones con peptidos sinteticos que se originan a partir de la secuencia de aminoacidos de las moleculas de una protefna nombrada (incluidas las secuencias enumeradas anteriormente o las secuencias que terminan en la misma), fusionando las celulas esplenicas de ratones seleccionados a celulas de mieloma, y ensayando los anticuerpos monoclonales para determinar la union a neoepftopos en peptidos sinteticos relevantes. La especificidad para los neo-epftopos se puede asegurar al requerir reactividad con un peptido sintetico y una falta de reactividad con una forma C prolongada del peptido de inmunizacion (para un neo-epftopo C-terminal) o una forma N-terminal prolongada del peptido de inmunizacion (para un neo-epftopo N-terminal). Los anticuerpos para los neo-epftopos tambien se pueden evaluar para establecer una falta de capacidad de union a la protefna nativa. Como alternativa, la especificidad para un neo-epftopo puede garantizarse exigiendo que la reactividad del anticuerpo sea dependiente de forma negativa de la presencia de biotina u otros grupos funcionales unidos covalentemente a uno de los aminoacidos terminales.

A continuacion, se describen kits que pueden usarse convenientemente para realizar los metodos descritos anteriormente. Dichos kits pueden incluir (1) una placa de microtitulacion recubierta con peptido sintetico; (2) un anticuerpo monoclonal o fragmento de union a anticuerpo reactivo con dicho peptido sintetico; y (3) una inmunoglobulina IgG anti-raton marcada. Como alternativa, dichos kits pueden incluir (1) una placa de microtitulacion recubierta con fragmentos de protefnas nativas purificadas; (2) un anticuerpo monoclonal que reconoce un neoepftopo en los fragmentos relevantes y reactivo con dichos fragmentos de protefnas purificadas; y (3) una inmunoglobulina IgG anti-raton marcada. Como alternativa, dichos kits pueden incluir (1) una placa de microtitulacion recubierta con estreptavidina; (2) un peptido sintetico unido a biotina; (3) un anticuerpo monoclonal que reconoce un neo-epftopo en fragmentos de protefnas y reactivo con dicho peptido sintetico; y (4) una inmunoglobulina IgG antiraton marcada. Aun otra alternativa podrfan ser los kits que incluyen (1) una placa de microtitulacion recubierta con estreptavidina; (2) un peptido sintetico unido a biotina; (3) un anticuerpo monoclonal que reconoce un neo-epftopo en fragmentos de protefnas relevantes (y reactivo con dicho peptido sintetico) y conjugado con peroxidasa de rabano picante.

Los ensayos descritos en el presente documento son utiles en el diagnostico de fibrosis o afecciones inflamatorias en pacientes. Ademas, las pruebas son utiles para la evaluacion de la progresion de la enfermedad y el seguimiento de la respuesta a la terapia. Los socios de union inmunologica descritos en el presente documento tambien se pueden usar en la inmunotincion para mostrar la presencia o ubicacion de los productos de escision de protefnas descritos.

La Figura 1 en los paneles A y B muestra los resultados de la investigacion de la especificidad de un anticuerpo monoclonal;

la Figura 2 muestra los resultados de la investigacion de la cantidad de fragmentos que tienen neo-epftopo de colageno V en suero humano de pacientes con espondilitis anquilosante.

La Figura 3 muestra una curva estandar obtenida en el Ejemplo 5;

la Figura 4 muestra la liberacion de peptidos medida a partir de cultivos ex vivo en el Ejemplo 5;

la Figura 5 muestra mediciones de peptidos adicionales obtenidas en el Ejemplo 5;

la Figura 6 muestra en los paneles (a) a (d) medidas adicionales obtenidas en el Ejemplo 5;

la Figura 7 muestra mediciones de peptidos adicionales en suero obtenidas en el Ejemplo 5;

la Figura 8 muestra el peptido en suero medido en el Ejemplo 6;

la Figura 9 muestra un ensayo de especificidad de anticuerpos descrito en el Ejemplo 7;

la Figura 10 muestra los niveles plasmaticos de peptido medidos en el Ejemplo 7;

la Figura 11 muestra las curvas ROC obtenidas en el Ejemplo 7;

la Figura 12 muestra los resultados de ELISA obtenidos en el Ejemplo 8;

la Figura 13 muestra mediciones de peptidos relacionadas con la espondilitis anquilosante obtenidas en el Ejemplo 8; y

la Figura 14 muestra los resultados obtenidos en el Ejemplo 9.

Ejemplo 1: Identificacion de fragmentos de colageno de tipo V por escision enzimatica

Reactivos

Todos los reactivos utilizados para los experimentos fueron productos qufmicos estandar de alta calidad de empresas tales como Merck (Whitehouse Station, NJ, EE. UU.) y Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Los peptidos sinteticos utilizados para la produccion de anticuerpos monoclonales se adquirieron en la Chinese Peptide Company, Beijing, China.

Escision in vitro

El colageno de tipo V purificado de placenta humana (cat. n.° ab7537, Abcam, Cambridge, Reino Unido) se escindio con pro-MMP-2 o pro-MMP-9 (cat. n.° 444213; 444231; Calbiochem, Merck, Whitehouse Station, NJ, EE.UU.). Se activaron cincuenta pg de MMP-2 o MMP-9 con 20 pl de acetato de 4-aminofenilmercurico 1 mM (APMA) en dimetilsulfoxido y se incubaron a 37°C durante 3 horas. El colageno de tipo V se administro disuelto en acido acetico 0,5 M. Para facilitar la escision de MMP, la protefna se dializo durante dos dfas para eliminar el acido acetico. El lfquido se filtro para eliminar protefnas por debajo de 10 kDa (Microcon Ultracel YM-10, cat. n.° 42407, Millipore, Billerica, MA, ^e E. UU.). Cada escision de MMP se realizo por separado mezclando 100 pg de colageno de tipo V y 1 pg de MMP-2 o MMP-9 en tampon de MMP (Tris-HCl 100 mM, NaCl 100 mM, CaCh 10 mM, acetato de Zn 2 mM, pH 8,0). Como control, se mezclaron 100 |jg de colageno con tampon de MMP solo. Las soluciones se incubaron durante 2 horas a 37°C. La reaccion de escision se detuvo utilizando acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) 50 jM hasta una concentracion final de 1 jM. La escision se verifico mediante visualizacion utilizando el kit de tincion de plata SilverXpress® (cat. n.° LC6100, Invitrogen, Carlsbad, Ca, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Identificacion de peptidos

Los fragmentos de peptidos en las muestras escindidas in vitro se identificaron usando cromatograffa lfquida (LC) acoplada a espectrometrfa de masas en tandem de ionizacion por electronebulizacion (ESI) (LC-MS/MS). Las muestras de ^lC-MS se ultrafiltraron para eliminar las protefnas por encima de 10 kDa, el pH se ajusto a 2,0 usando acido formico, y se analizo una muestra de 4 j l por LC-MS/MS. El analisis por LC se realizo en una columna nanoACQUITY UPLC BEH C¹⁸ (Waters, Milford, ^mA, EE.UU.) utilizando un gradiente de acido formico/acetonitrilo. Los analisis por MS y MS/MS se realizaron en una MS de tiempo de vuelo de tiempo cuadruple de espectrometrfa de masas de alta definicion Synapt (QUAD-TOF; Waters, Milford, MA, EE.UU.), con un rango de adquisicion de 350­ 1600 m/z en MS y 50-2000 m/z, en MS/MS. El software "ProteinLynx Global SERVER (PLGS)" (Waters, Milford, MA, EE. UU.) se utilizo para analizar espectros y generar listas de picos. Para identificar los peptidos, se realizaron busquedas de datos de MS y MS/MS en una base de datos de protefnas de colageno de tipo V (FASTA) utilizando el software Mascot 2.2 (Matrix Science, Boston, MA, EE. UU.) con las configuraciones ESI-QUAD-TOF y carbamidometilo (C), oxidacion de metionina (M), oxidacion de lisina (K) y oxidacion de prolina (P) como modificaciones variables.

Los seis aminoacidos en el extremo N o C de los peptidos identificados por MS se consideraron como un neoepftopo generado por la proteasa en cuestion. Todas las secuencias generadas por la proteasa se analizaron para determinar la homologfa y la distancia a otros sitios de escision y se analizaron para determinar la homologfa utilizando NPS@: analisis de secuencia de protefnas de red (Combet C, Blanchet C, Geourjon C, Deleage G. NPS@:network protein sequence analysis. Trends Biochem Sci 2000; 25: 147-50).

Ejemplo 2: Desarrollo de un ensayo ELISA para fragmentos identificados

Conjugacion de peptidos

La conjugacion de peptidos se realizo utilizando el kit de conjugacion de inmunogeno activado con maleidida (Sigma-Aldrich, MO, EE.UU.). Brevemente, el neo-epftopo inmunogenico que contenfa cistefna (HMGREGREGE-GGC, 400 j l de peptido a 5 mg/ml) con un grupo sulfhidrilo libre (-SH) se mezclo en un tampon de conjugacion con la ovalbumina activada con maleimida (OVA) (180 j l de OVA a 10 mg/ml) como una protefna transportadora con un grupo maleimida disponible que podrfa reaccionar con peptidos que contenfan sulfhidrilo y se incubo durante 2 horas a temperatura ambiente. Los productos conjugados se eliminaron de EDTA y azida de sodio mediante desalinizacion o dialisis durante dos dfas. Para los peptidos conjugados con biotina, la lisina conjugada con biotina se anadio en el procedimiento de sfntesis de peptidos en fase solida.

Desarrollo de anticuerpos monoclonales

Se inmunizaron por via subcutanea ratones Balb/C de 4 a 6 semanas de edad con aproximadamente 200 j l de antfgeno emulsionado y 50 jg del neo-epftopo CO5-MMP (HMGREGREGE-GGC-OVA). Se realizaron inmunizaciones consecutivas a intervalos de 2 semanas hasta que se alcanzaron niveles estables de tftulos sericos en el adyuvante incompleto de Freund. Se recogieron muestras de sangre de la 2a inmunizacion. En cada muestra de sangre, se determino el tftulo serico y se selecciono el raton con el tftulo anti-suero mas alto para la fusion. Despues de la ⁴ a inmunizacion, este raton descanso durante 1 mes y luego se reforzo por via intravenosa con 50 jg de CO5-MMP en 100 j l de una solucion de cloruro de sodio al 0,9% tres dfas antes del aislamiento del bazo para la fusion celular.

Fusion y cribado de anticuerpos

El procedimiento de fusion se realizo de acuerdo con lo descrito por Gefter et al132. Brevemente, las celulas de bazo de raton se fusionaron con celulas asociadas a la fusion de mieloma SP2/0. Las celulas de hibridoma se clonaron utilizando un metodo de medio semisolido y se transfirieron a placas de microtitulacion de 96 pocillos para un crecimiento adicional y se incubaron en una incubadora de CO². Se utilizo una dilucion limitada estandar para promover el crecimiento monoclonal. Los sobrenadantes se cribaron utilizando un ELISA indirecto con placas de microtitulacion recubiertas con estreptavidina y HMGREGREGE-K-Biotina como un peptido de captura.

Caracterizacion de clones

La reactividad nativa y la union peptfdica de los anticuerpos monoclonales se evaluaron mediante el desplazamiento de muestras nativas (suero, plasma y orina procedentes de ser humano/rata/raton) en un ELISA preliminar utilizando 10 ng/ml de recubrimiento de peptidos biotinilados en una placa de microtitulacion recubierta con estreptavidina y el sobrenadante del hibridoma monoclonal en crecimiento. Las especificidades de los clones con respecto a un peptido libre (HMGREGREGE), un peptido sin sentido, y un peptido alargado (GHMGREGREG) se ensayaron. La isotipificacion de los anticuerpos monoclonales se realizo con el kit Clonotyping System-HRP kit, cat. n.° 5300-05 (Southern Biotech, Birmingham, AL, EE.UU.). Los clones seleccionados se purificaron utilizando columnas de protefna G de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare Life Science, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido). Los anticuerpos monoclonales seleccionados se marcaron con peroxidasa de rabano picante (HRP) utilizando el kit de etiquetado de HRP Lightning link de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Innovabioscience, Babraham, Cambridge, Reino Unido).

Metodologfa ELISA CO5-MMP

En experimentos preliminares, se optimizaron los reactivos, sus concentraciones y los periodos de incubacion realizando varios analisis de tablero de ajedrez. La ELISA CO5-MMP se desarrollo de la siguiente manera: Una placa de estreptavidina de 96 pocillos se recubrio con 5 ng/ml de peptido sintetico biotinilado HMGREGREGE-K-Biotina disuelta en tampon de ensayo (Tris 25 mM, BSA al 1%, Tween-20 al 1%, pH 7,4) y se incubaron 30 minutos a 20°C agitando constantemente a 300 rpm. Se anadieron veinte pl de calibrador de peptidos o muestra disuelta en el tampon de ensayo a los pocillos apropiados, seguido de 100 pl de anticuerpo monoclonal conjugado (125 ng/ml) y se incubaron durante 1 hora a 4°C con agitacion constante a 300 rpm. Finalmente, se anadieron 100 pl de tetrametilbencinidina (TMB) (Kem-En-Tec cat. n.° 438OH) y la placa se incubo durante 15 minutos a 20°C en la oscuridad y se agito a 300 rpm. Despues de cada etapa de incubacion, la placa se lavo cinco veces en tampon de lavado (Tris 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,2). La reaccion de TMB se detuvo anadieron 100 pl de solucion de parada (HCl al 1%) y se midio espectrofotometricamente a 450 nm con 650 nm como referencia. Se realizo una curva estandar mediante dilucion en serie del peptido CO5-MMP (HMGREGREGE) y se represento mediante un modelo de ajuste matematico de 4 parametros. Las concentraciones estandar fueron 0, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250, 500, 1000 ng/ml.

Evaluacion tecnica

A partir de diluciones de 2 veces de muestras de suero agrupadas, se calculo la linealidad como un porcentaje de recuperacion de la muestra al 100%. El lfmite de deteccion inferior (LDL) se calculo a partir de 21 determinaciones del estandar mas bajo (el estandar cero) y se calculo como la media 3x desviacion estandar. La variacion inter e intraensayo se determino mediante 10 ejecuciones independientes de 5 muestras de QC, y cada ejecucion consistio en dos replicas de determinaciones dobles de las muestras. Finalmente, para cada ensayo, se utilizo un calibrador maestro preparado a partir de peptidos sinteticos cuantificados con precision mediante analisis de aminoacidos para fines de calibracion.

La estabilidad del analito se determino para tres muestras de suero humano para 10 ciclos de congelacion y descongelacion.

Ejemplo 3: Caracterizacion ELISA

El ELISA de CO5-MMP desarrollado se evaluo utilizando 20 pl de las muestras: colageno de tipo V intacto, colageno de tipo V escindido con MMP-2, colageno de tipo V escindido con MMP-9, colageno de tipo V escindido con MMP-13, y una secuencia de aminoacidos de CO5-MMP alargada (GHMGREGREG). La reactividad cruzada se ensayo utilizando colageno de tipo I escindido in vitro.

Los resultados se muestran en la Figura 1, paneles A y B, que muestran el porcentaje de inhibicion de la senal de: A) Peptido libre (HMGREGREGE), colageno de tipo V intacto, colageno de tipo V escindido por MMP-9, colageno de tipo V escindido por MMP-2; B) Peptido libre (HMGREGREGE), colageno de tipo V escindido por MMP-13, colageno de tipo I escindido por MMP-9, peptido alargado (GHMGREGREG). Se puede ver en el panel A que el anticuerpo no es sustancialmente reactivo con el colageno intacto tipo V, sino que es reactivo con el colageno de tipo V escindido, y en el panel B que el anticuerpo no es reactivo con el peptido extendido N-terminal. Por lo tanto, se demuestra que el anticuerpo es especfficamente reactivo con el neo-epftopo N-terminal producido por la escision enzimatica.

Ejemplo 4: Utilidad clfnica

Sujetos sanos y pacientes con AS

Los marcadores bioqufmicos se evaluaron en suero de pacientes diagnosticados con espondilitis anquilosante (AS, de acuerdo con los criterios de Nueva York modificados) y se compararon con muestras de suero sin enfermedad del mismo sexo y edad del Department of Medicine 3 de la University of Erlangen-Nuremberg. El grupo sin enfermedad consistio en 21 mujeres sanas y 19 hombres sanos con una edad media de 43,0 anos, rango de 18 a 66. El grupo de AS consistio en 19 mujeres y 21 hombres con una edad media de 42,5 anos, rango 29 a 63 anos. Estadfstica

Los niveles sericos de CO5-MMP entre los dos grupos se midieron utilizando el ELISA (los resultados se muestran en la Figura 2) y se compararon utilizando la prueba no parametrica de Mann-Whitney de dos caras. En la Figura 2, las barras indican niveles medios ± error estandar de la media (SEM). El area bajo la curva se midio en ROC. Las relaciones de probabilidades se extrapolaron de la tabla de contingencia en la que todos los sujetos se clasificaron como con niveles bajos (dentro de 2 DE de la media de la poblacion normal) o altos (>DE) del biomarcador. Los resultados se consideraron significativos cuando P <0,05.

Estos resultados sugieren fuertemente que el neo-epftopo medido de colageno de tipo V es un marcador valioso para AS.

Ejemplo 5 Ensayo de biglicano NB202: BGM .YWEVQPATFR SEQ ID NO 113

Aquf se demuestra el desarrollo de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para la medicion de un neo-epftopo de BGN generado por MMP-9, MMP-12 y MMP-13 y se prueba la validez biologica del ensayo en dos modelos de rata de fibrosis hepatica. Metodos: El BGN se escindio in vitro por MMP-9, -12 y -13 y el peptido □344,YWEVQPATFR'353 (BGN-344) se eligio como un neo-epftopo potencial. Se uso un anticuerpo monoclonal de raton generado contra el peptido seleccionado en el desarrollo de un ELISA competitivo, que media el neo-epftopo de BGN degradado por MMP. El ensayo se valido en dos modelos de rata de fibrosis hepatica, el modelo de fibrosis inducida por tetracloruro de carbono (CCL⁴), y el modelo de ligadura del conducto biliar (BDL).

Resultados: Se encontro un aumento significativo en BGN-344 en suero en ratas tratadas con CCL⁴ durante 16 semanas (200 ng/ml frente a 120 ng/ml, p = 0,0013) y 20 semanas (190 ng/ml frente a 100 ng/ml, p = 0,019) en comparacion con los grupos de control, asf como en todos los grupos de ratas sometidas a BDL en comparacion con los grupos operados de forma simulada. Ademas, hubo una correlacion significativa de los niveles sericos de BGN-344 con la extension de la fibrosis hepatica determinada por la tincion con rojo Sirius de las secciones hepaticas en el modelo CCL4.

Conclusion: Se demostro que el producto de remodelacion tisular patologico especffico de BGN degradados por MMP, concretamente, el neo-epftopo BGN-344, aumenta durante la fibrosis hepatica en un modelo CCL⁴ y en un modelo BDL tanto a nivel in vivo como ex vivo.

Desarrollo de ensayos:

El desarrollo del ensayo de los anticuerpos monoclonales seleccionados obtenidos de la fusion incluyo las siguientes pruebas generales, de acuerdo con las SOP (datos no mostrados): 1) Tablero de ajedrez (es decir, afinidad de union a antfgeno-antfgeno) - concentraciones de anticuerpo frente a revestimiento en diferente tiempo de incubacion, temperatura de incubacion y tampon de incubacion; 2) Desplazamiento (es decir, resistencia competitiva), para evaluar la especificidad del anticuerpo y la sensibilidad a un peptido estandar, peptido sin sentido, suero humano, BGN nativo, BGN nativo procesado in vitro con MMP-9, Mm P-12 y MMP-13; 3) Afinidad de etiquetado a la peroxidasa, evaluada utilizando el kit de etiquetado de peroxidasa de rabano picante Lightning-Link™ (Innova Bioscience Ltd, Babraham, Reino Unido). Basandose en los resultados de estas pruebas, se selecciono el anticuerpo monoclonal NB202-7-5A1 para el desarrollo final del ensayo.

El procedimiento ELISA competitivo de BGN-344 se desarrollo de la siguiente manera: se recubrio una placa recubierta con estreptavidina de 96 pocillos con 1,25 ng/ml de YWEVQPATFR-K-Biotina (SEQ ID NO 305) durante 30 min, a 20°C, a 300 rpm. Los pocillos se lavaron entonces 5 veces con tampon de lavado estandar. Se preparo una fila estandar mediante una dilucion previa doble del peptido estandar (YWEVQPATFR) en Tris-BTB 50 mM a partir de 250 ng/ml. Las muestras (es decir, suero humano, suero de raton, suero de rata) tambien se diluyeron. Se anadieron estandares y muestras [20 pl/pocillo], seguido de la adicion de 100 pl/pocillo de 20 ng/ml de anticuerpo NB202-7-5A1 marcado con peroxidasa en tampon Tris BTB 50 mM. Las placas se incubaron durante 1 hora a 4°C a 300 rpm. Despues del periodo de incubacion, los pocillos se lavaron 5 veces y se incubaron con 100 pl de TMB a 4°C, 300 rpm, durante 15 minutos, seguido de la adicion de 100 pl de solucion de parada en cada pocillo. La reaccion colorimetrica se midio a 450 nm con referencia a 650 nm en un lector de placas de laboratorio estandar. Los datos se adquirieron con el programa SoftMax Pro v5.0.

Modelo de rata de fibrosis hepatica inducida por CCL4 :

Los niveles de BGN-344 se midieron en un modelo de rata de inhalacion de CCL⁴ de fibrosis hepatica. Los detalles completos del estudio se describen en otra parte (133). El estudio incluyo 52 ratas Wistar macho tratadas con CCL⁴ y 28 ratas Wistar de control (Charles-River, Saint Aubin les Elseuf, Francia). La induccion de fibrosis hepatica se realizo como se ha descrito previamente (134). En resumen, se administro CCL<4< por inhalacion dos veces por semana y se anadio fenobarbital (0,3 g/l) al agua de beber. Las ratas de control recibieron fenobarbital solamente. Los animales se estratificaron en grupos que recibieron 8, 12, 16 o 20 semanas de CCL<4< o tratamiento de control (n = 13 para CCL<4<; n = 7 de control para cada grupo). El estudio se realizo despues del consentimiento informado por escrito especfficamente aprobado por el Investigation and Ethics Committee of the Hospital Clinic Universitari (Barcelona, Espana), aprobacion N.° B-NNP-233/09. Cuatro animales de los grupos de CCL<4< murieron durante el estudio. La sangre se recogio al finalizar y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir la coagulacion, antes de la centrifugacion a 2500 rpm durante 10 minutos. Las muestras se almacenaron a -80°C antes de la evaluacion del biomarcador. Las secciones de hfgado (4 pm de espesor) se tineron en rojo Sirius F3B al 0,1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en acido pfcrico saturado (Sigma-Aldrich). De cada animal analizado, la cantidad de fibrosis se expreso como un porcentaje del area total del hfgado de 36 campos y el valor promedio presentado (135).

Modelo de rata de fibrosis hepatica inducida por la ligadura de las vfas biliares (BDL):

Los niveles de BGN-344 se midieron en un modelo de rata de fibrosis hepatica inducida por la ligadura del conducto biliar. Los detalles completos del estudio se describen en otra parte (133, 136). El estudio incluyo un total de 81 ratas Sprague-Dawley hembra de 6 meses. La fibrosis hepatica se indujo en ratas anestesiadas por BDL estandar en la que el conducto biliar se ligo en dos lugares y se disecciono entre las ligaduras antes de cerrar el abdomen. En ratas operadas de forma simulada, el abdomen se cerro sin BDL.

Las ratas se dividieron en cuatro grupos: el grupo 1 (10 BDL, 8 simulaciones) se sacrifico despues de una semana, el grupo 2 (12 BDL, 8 simulaciones) se sacrifico despues de dos semanas, el grupo 3 (13 BDL, 8 simulaciones) se sacrifico despues de tres semanas, y el grupo 4 (14 BDL, 8 simulaciones) se sacrifico despues de cuatro semanas. La Figura 3 muestra a) Ejemplo de la curva estandar en una configuracion ELISA competitiva b) Medicion del peptido BGN-344 para biglicano degradado por MMP-9, MMP-12 y MMP-13 in vitro (BGN/MMP9, BGN/MMP12 y bGn/MMP13) y para biglicano intacto (BGN).

La Figura 4 muestra la liberacion del peptido BGN-344 a partir de cultivos ex vivo de explantes bovinos (BEX), medidos los dfas 3 y 17 del cultivo en cinco repeticiones. w/o = cultivos sin ninguna estimulacion; MI = cultivos metabolicamente inactivos por el tratamiento con nitrogeno lfquido; T O = estimulacion de citocinas catabolicas con TNFa [20 ng/ml] y oncostatina [10 ng/ml]; T+O+GM6001 = citocinas catabolicas con TNF a [20 ng/ml] y oncostatina [10 ng/ml] complementadas con inhibidor de MMP selectivo GM6001; T+O+E64 = citocinas catabolicas con TNF a [20 ng/ml] y oncostatina [10 ng/ml] complementadas con inhibidor selectivo de la cistefna proteasa E64 (*** = p <0,001).

La Figura 5 muestra los valores absolutos de la cuantificacion de rojo Sirius en ratas tratadas con CCL<4< determinados a las 8, 12, 16 y 20 semanas de tratamiento. (Animales tratados con CCL⁴: n = 13; controles: n = 7 para cada grupo).

La Figura 6 muestra a) los niveles sericos en la circulacion medios de BGN-344 en el modelo de rata inducido con tetracloruro de carbono (CCL<4<) de fibrosis hepatica medidos a las 8, 12, 16 y 20 semanas (animales tratados con CCL<4<: n = 13; controles: n = 7 para cada grupo). b) Niveles sericos de BGN-344 en todas las ratas control y todas las ratas CCL<4< estratificadas en cuartiles de acuerdo con el contenido total de colageno en el hfgado determinado por rojo Sirius; (ns = no significativo, * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001). Correlacion del BGN-344 serico en la circulacion y la cuantificacion histologica de rojo Sirius que determina la extension de la fibrosis hepatica en c) ratas tratadas con CCL<4< y d) controles.

La Figura 7 muestra los niveles sericos medios de BGN-344 en la circulacion en ratas operadas de BDL y de forma simulada al inicio y al final de las semanas 1, 2, 3, 4. Los datos se muestran como media ± error estandar de la media (SEM) (* = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001).

Ejemplo 6: Ensayo de colaaeno de tipo I NB91 (aenerado por FAP): Protocolo de ensayo de CO1-462 AGKEGPVGLP (SEQ ID NO 49)

Se marco un anticuerpo monoclonal seleccionado con peroxidasa de rabano picante (HRP) utilizando el kit de etiquetado de HRP Lightning link de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Innovabioscience, Babraham, Cambridge, Reino Unido). Se recubrio una placa de estreptavidina de 96 pocillos con peptido sintetico biotinilado AGKEGPVGLP-Biotina disuelto en tampon de ensayo (Tris 50 mM, BSA al 1%, Tween-20 al 0,1%, pH 7,4 ajustado a 20°C) y se incubo durante 30 minutos a 20°C. Se anadieron 20 pl de calibrador de peptido o muestra a los pocillos apropiados, seguido de 100 pl de anticuerpo monoclonal conjugado 3H2-HRP y se incubaron durante 1 hora a 20°C. Finalmente, se anadieron 100 pl de tetrametilbencinidina (TMB) (Kem-En-Tec cat. 438OH) y la placa se incubo durante 15 minutos a 20°C en la oscuridad. Todas las etapas de incubacion anteriores inclufan agitacion a 300 rpm. Despues de cada etapa de incubacion, la placa se lavo cinco veces en tampon de lavado (Tris 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,2). La reaccion de TMB se detuvo anadieron 100 pl de solucion de parada (HCl al 1%) y se midio a 450 nm con 650 nm como referencia. Se trazo una curva de calibracion utilizando un modelo de ajuste matematico de 4 parametros.

Modelo de fibrosis hepatica de ligadura del conducto biliar de rata:

CO1-462 se evaluo en un modelo de rata de BDL de fibrosis hepatica. La junta danesa de bienestar animal "Dyreforsogstilsynet" en Copenhague, Dinamarca, aprobo y dio un consentimiento informado por escrito del estudio; aprobacion n.° 2008/561-1450. El estudio se ha descrito en detalle en otra parte (Veidal et al. 2010b). Brevemente, 17 ratas Sprague-Dawley hembra de 6 meses de edad se estratificaron en 4 grupos: Se sacrificaron ratas operadas por BDL o de forma simulada despues de 2 o 4 semanas. La fibrosis hepatica se indujo en ratas anestesiadas por BDL estandar en la que el conducto biliar se ligo en dos lugares y se disecciono entre las dos ligaduras antes de cerrar el abdomen. En ratas operadas de forma simulada, el abdomen se cerro sin cirugfa BDL. Las muestras de sangre se tomaron bajo anestesia con CO<2</O<2< al inicio del estudio y al final del seno retro-orbital de ratas que habfan ayunado durante al menos las 14 horas anteriores. La sangre recogida se dejo durante 30 minutos a temperatura ambiente hasta coagularse seguido de centrifugacion 2x a 1500g durante 10 minutos. El suero se transfirio entonces a tubos limpios y se almaceno a -80°C hasta su uso. La validez del modelo BDL se demostro por (137).

Los resultados se muestran en la Figura 8. Se observo una elevacion significativa de la senal medida despues de dos semanas.

Ejemplo 7 Ensayo de versicano NB158: VCAN 3306 (.KTFGKMKPRY)

La remodelacion de la matriz extracelular es una caracterfstica clave en el desarrollo de la lesion aterosclerotica y un requisito previo para la ruptura de las placas. El proteoglicano versicano se encuentra en placas ateroscleroticas y es un sustrato potencial para las MMP presentes en areas ricas en macrofagos. Se ha desarrollado un inmunoensayo para detectar un fragmento de degradacion de versicano derivado de MMP12 especffico (VCAN-3306) y evaluar su potencial como biomarcador para el diagnostico de aterosclerosis.

Metodos y resultados: Se utilizo un anticuerpo monoclonal de raton generado contra VCAN-3306 para el desarrollo de un ELISA competitivo. Se utilizaron muestras de plasma clfnicas de pacientes con diferentes grados de aterosclerosis para la validacion del ensayo. El VCAN-3306 en las arterias coronarias de cinco adultos fallecidos se detecto utilizando el VCAN-3306 mAb. Las arterias con la carga de placa mas baja mostraron muy poca o ninguna reactividad, en comparacion con las arterias afectadas por placas ateroscleroticas intermedias y grandes, que mostraron una alta reactividad hacia VCAN-3306 mAb. Los pacientes que experimentaron I) sfndrome coronario agudo (n = 30), II) cardiopatfa isquemica estable (n = 30) y III) que demostraron niveles altos de depositos coronarios de calcio (n = 30) tenfan niveles plasmaticos significativamente mas altos de VCAN-3306 en comparacion con un grupo de control de individuos (n = 30) sin depositos coronarios de calcio detectables. Ademas, se demostro una fuerte asociacion entre la presencia de VCAN-3306 y LDL y el colesterol total en pacientes con altos niveles de depositos coronarios de calcio.

Conclusiones: Los neo-epftopos de versicano generados por MMP12 estan presentes en las placas ateroscleroticas humanas. La degradacion de versicano mediada por MMP12 fue significativamente elevada en pacientes con enfermedades ateroscleroticas, lo que sugiere que el VCAN-3306 es un biomarcador potencial para la aterosclerosis.

Protocolo de ensayo de VCAN-3306:

Los anticuerpos monoclonales seleccionados se marcaron con peroxidasa de rabano picante (HRP) usando el kit de etiquetado de anticuerpo de peroxidasa de rabano picante (HRP) Lightning-Link de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Innova Bioscience, Babraham, Cambridge, Reino Unido). Una placa pre-recubierta de estreptavidina de 96 pocillos adquirida en Roche Diagnostics (Roche Diagnostics, Basel, Suiza) se recubrio con 2,5 ng del peptido sintetico biotinilado, KTFGKMKPRY-K-Biotina (SEQ ID NO 306), se disolvio en tampon de ensayo 50 mM p Bs BTB y se incubo durante 30 minutos a 20°C. Se anadieron 20 pl del calibrador de peptidos o muestra a los pocillos apropiados, seguido de 100 pl de 20 ng/ml de anticuerpo monoclonal conjugado, y se incubaron durante 1 hora a 20°C. Finalmente, se anadieron 100 pl de tetrametil bencinidina (TMB) (Kem-En-Tec cat. 438OH, Taastrup, Dinamarca), y la placa se incubo durante 15 minutos a 20°C en la oscuridad. Todas las etapas de incubacion anteriores inclufan agitacion a 300 rpm. Despues de cada etapa de incubacion, la placa se lavo cinco veces en tampon de lavado (Tris 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,2). La reaccion de TMB se detuvo anadieron 100 pl de solucion de parada (HCl al 1%) y se midio a 450 nm con 650 nm como referencia. Se trazo una curva de calibracion estandar utilizando un modelo de ajuste matematico de 4 parametros con una concentracion inicial de 10 ng para el peptido estandar despues de una dilucion doble y el ultimo estandar fue un estandar cero.

Muestras y procedimientos para inmunohistoqufmica:

Especfmenes: Se obtuvieron arterias coronarias de pacientes mayores de 25 anos que murieron durante un periodo de 18 meses en el North Carolina Baptist Hospital, Winston-Salem, EE.UU., como se ha descrito previamente (138). Procedimientos histopatologicos: Cinco corazones obtenidos en autopsia se lavaron con una solucion salina normal y se fijaron por perfusion con una solucion de formaldehfdo tamponada neutra al 4% a una presion de 100 mm Hg durante 1 hora. Se cortaron bloques de tejido adyacentes para el corte histologico (cada uno de 3 mm de largo) perpendiculares al eje largo (proximal 3 cm) de la descendente anterior izquierda (LAD), la circunfleja izquierda, y las arterias coronarias derechas. Se hicieron dos secciones histologicas de 5 pm de cada bloque. Una se tino con hematoxilina-eosina y la otra con tincion de Verhoeff-van Gieson.

El protocolo estandar de Nordic Bioscience se uso para la tincion de VCAN-3306 de arterias coronarias descendentes anteriores izquierdas humanas de los cinco individuos, cada uno con un grado diferente de aterosclerosis. Brevemente, las arterias incluidas en parafina se cortaron en secciones de 5 pm, se desparafinizaron, y la peroxidasa se bloqueo y se rehidrato. Las secciones se sometieron a pretratamiento 2 x 5 min en un microondas a 800 W. En lo sucesivo, las secciones se lavaron en TBC Triton X-100 al 1%, se bloquearon en casefna al 0,5% en TBS y se incubaron con 2,25 pg/ml de mAb contra VCAN-3306 diluido en tampon de TBS durante una noche a 4°C. Las secciones se lavaron posteriormente en TBS Triton X-100 al 1%, se incubaron en Super Sensitive durante 30 minutos, se lavaron de nuevo y se trataron con sustrato DAB (6-10 minutos). Las secciones se sumergieron en hematoxilina Mayers durante 12 segundos, se montaron y se dejaron secar.

Pacientes y recogida de muestras:

Se seleccionaron cuatro grupos de 30 individuos cada uno, con diferentes grados de enfermedad cardfaca aterosclerotica, de tres estudios grandes (DANRISK, DEFAMI y Odense Artery Biobank). Los participates en estos estudios se incluyeron simultaneamente por el Odense University Hospital, Odense, Dinamarca. Los cuatro grupos consistfan en: 1) 30 individuos asintomaticos sin calcio coronario detectable (CT-noCa), 2) 30 sujetos asintomaticos con CVD subclfnica definida por la presencia de calcio coronario (CT-plusCa), 3) 30 pacientes con enfermedad cardfaca isquemica estable (IHD), destinada a cirugfa de derivacion coronaria, y 4) 30 pacientes con sfndrome coronario agudo (ACS) y aparicion de sfntomas en las 24 horas anteriores (Tabla 1). Todas las muestras se manipularon y se analizaron por el Department of Clinical Biochemistry and Pharmacology at Odense University Hospital (Odense, Dinamarca).

Los pacientes del grupo 1 y 2 se reunieron de la cohorte DANRISK, una muestra aleatoria de 1825 hombres y mujeres de 50 a 60 anos de edad, quienes en 2009 fueron invitados a someterse a pruebas de deteccion de enfermedad coronaria. El cribado inclufa una tomograffa computarizada cardfaca, seguida de una estimacion de la cantidad de calcio coronario utilizando la puntuacion de Agatston. De los individuos invitados, 1257 se consideraron para la deteccion, pero despues de la exclusion de aquellos con cardiopatfa isquemica previa o diabetes mellitus (n = 100), 1157 pacientes se incluyeron para el analisis. Entre estos individuos de 60 anos (n = 647), se eligieron 30 pacientes sin calcio coronario detectable (CT-noCa), grupo 1 y 30 con una puntuacion de Agatston >400 (CT-plusCa) del grupo 2. La seleccion de estos dos grupos tambien implico la correspondencia del colesterol total y la presion arterial. HeartScore esta dirigido a ayudar a los medicos a optimizar la reduccion del riesgo cardiovascular individual. Esta estimacion del riesgo se basa en los siguientes factores de riesgo: sexo, edad, tabaquismo, presion arterial sistolica y colesterol total, y predecira la cantidad de eventos de CVD fatales que eventualmente tendran lugar despues de 10 anos. El umbral de alto riesgo basado en eventos cardiovasculares fatales se define como "superior al 5%" (139).

El grupo de pacientes con IHD estable, grupo 3, provenfa del The Odense Artery Biobank, que recopila muestras de sangre y tejido arterial sobrantes de pacientes sometidos a cirugfa de derivacion coronaria. Las muestras de sangre se tomaron el dfa antes de la operacion de derivacion. Se seleccionaron 30 pacientes con una edad media de aproximadamente 60 anos y una distribucion de genero similar a las poblaciones mencionadas anteriormente. El grupo de pacientes con ACS, grupo 4, se agrupo de la cohorte de DEFAMI, en la que todos los pacientes ingresaron en el Odense University Hospital entre el 1 de octubre de 2009 y el 30 de abril de 2010 y se incluyeron los que tenfan un analisis de troponina realizado bajo sospecha de ACS. En estos pacientes, se realizo un muestreo de sangre en serie dentro de las primeras 24 horas del inicio de los sfntomas. De los 822 pacientes en la cohorte de DEFAMI, 30 pacientes con infarto de miocardio sin elevacion de ST (NSTEMI, n = 24) o angina de pecho inestable (n = 6) se seleccionaron para participar en el estudio actual. Su edad era de aproximadamente 60 anos y su distribucion de genero coincidio con los dos subgrupos DANRISK (grupo 1 y grupo 2). Se definio NSTEMI si se demostro un aumento y/o descenso tfpico de los niveles de TnI por encima de 0,03 pg/l en asociacion con la presencia de sfntomas clfnicos tfpicos. La angina de pecho inestable se definio como la presencia de dolor toracico tfpico durante el reposo o el esfuerzo ffsico mfnimo junto con la depresion del segmento S^t o las fluctuaciones de la onda T, pero con niveles normales de TnI (por debajo de 0,03 pg/l). Todos los pacientes con angina de pecho inestable tambien tuvieron que demostrar al menos una estenosis arterial coronaria significativa (>50% de diametro estenosis). Por lo tanto, en este estudio, los pacientes con ACS inclufan pacientes con NSTEMI y angina de pecho inestable. Los pacientes con infarto de miocardio con elevacion del segmento ST (STEMI) no se incluyeron, ya que en estos pacientes no serfa posible obtener muestras de sangre en serie suficientes antes de que se administrara la medicacion con heparina y PCI aguda. Ambas intervenciones podrfan interferir en los ensayos bioqufmicos. El nivel medio de TnI en los 30 pacientes con ACS (grupo 4) era de 0,62 pg/l (intervalo de 0,01-5,23 pg/l).

En todos los pacientes, grupo 1-4 (n = 120), se considero la hipertension si el paciente usaba tratamiento medico antihipertensivo y se definio la diabetes si se prescribio un medicamento antidiabetico. La presion arterial sistolica y diastolica se midio el mismo dfa que la muestra de sangre. La puntuacion de Agatston se calculo en el grupo 1 y 2 pacientes. TnI en el grupo ACS se midio inmediatamente en el ingreso hospitalario, antes de toma de la muestra de sangre actual. El colesterol total, LDL, HDL y los trigliceridos tambien se midieron antes de la toma de muestra de sangre para el presente estudio. Las muestras de sangre se extrajeron en tubos con EDTA y se centrifugaron a 200g durante 10 min. El plasma se almaceno a -80°C hasta el analisis bioqufmico.

Los protocolos de estudio para los estudios DANRISK, DEFAMI y Odense Artery Biobank se aprobaron por el Regional Ethics Committee antes del inicio de los estudios. El consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes participates.

1 Tabla 50. Demograffa de cada grupo incluido en el estudio con valores medios y desviacion estandar en [1.

Tabla 51. Los resultados de las curvas ROC en el grupo de calcio coronario alto (CT-plus Ca), de sindrome coronario agudo (ACS) y de cardiopatfa isquemica (IHD) en comparacion con el grupo control sin calcio coronario l T-n . A n rr r n r v lr .

Tabla 52. Los coeficientes de correlacion de Spearman de VCAN-3306 y los parametros medidos estandar se r n n n v lr r v lr .

La Figura 9 muestra los resultados de una prueba de especificidad de anticuerpos hacia su epftopo. Las muestras anadidas y ensayadas en un entorno ELISA competitivo fueron: peptido alargado (20 ng/ml), versicano no escindido (VCAN), versicano escindido por MMP-8 (VCAN MMP8), versicano escindido por MMP-12 (VCAN MMP12) y versicano escindido por catepsina K (VCAN CatK).

La Figura 10 muestra los niveles plasmaticos de VCAN-3306 medidos en pacientes diagnosticados con sfndrome coronario agudo (ACS), depositos elevados de calcio coronario (CT-plus Ca), cardiopatfa isquemica estable (IHD) y comparados con controles emparejados por edad que comprendfan individuos sin depositos de calcio coronario detectables (CT-no Ca). * = p <0,05; *** = p <0,0005; se muestran valores individuales y la media del grupo y SEM como barras de lfnea y error.

La Figura 11 muestra curvas ROC para a) VCAN-3306 combinado con LDL y b) VCAN-3306 combinado con colesterol en el grupo de pacientes asintomaticos con altos depositos de calcio coronario (CT-plus Ca).

Ejemplo 8 Ensayo de tipo V de NB185: C5M .HMGREGREGE (SEQ ID NO 93)

La inflamacion cronica de la espondilitis anquilosante (AS) de la columna vertebral puede conducir a una cementacion completa de las vertebras, un proceso que incluye la renovacion de varios colagenos encontrados en la articulacion. La evaluacion diagnostica y la caracterizacion del paciente pueden mejorarse mediante la medicion de los marcadores de renovacion del tejido conectivo. La degradacion proteolftica de los colagenos desempena un papel importante en la remodelacion de la matriz extracelular y, por lo tanto, en la patogenesis de la As . Esta degradacion crea pequenos fragmentos peptfdicos llamados neo-epftopos, que pueden resultar ser una nueva clase de biomarcadores de eventos fibroticos. Los objetivos de este estudio fueron desarrollar un ELISA competitivo capaz de detectar un fragmento de colageno de tipo V generado por MMP-2 y MMP-9 y evaluar el uso de este ensayo como biomarcador para AS.

Materiales y metodos : El analisis espectrometrico de masas del colageno de tipo V degradado por MMP-2 y MMP-9 revelo un gran numero de neo-epftopos generados por proteasas. A partir de estos datos, se selecciono un fragmento unico para el colageno de tipo V y generado por MMP-2 y ^m MP-9 como objetivo para el desarrollo de ELISA. Se genero un anticuerpo monoclonal contra este neo-epftopo, que detecto el fragmento de colageno de tipo V en la posicion de aminoacido 1317 (CO5-MMP). El ensayo se utilizo para evaluar el contenido del neo-epftopo CO5-MMP en suero de 40 pacientes con AS y 40 controles emparejados por edad.

Resultados: Se demostro que el ELISA detecta el fragmento de neo-epftopo CO5-MMP de la degradacion de MMP-2 y MMP-9 exclusivamente con variaciones inter e intraensayos del 9,13% y del 4,38% respectivamente. El nivel de CO5-MMP fue significativamente mayor en los pacientes con AS, con un aumento del 229% (P <0,0001). El AUC era del 83%.

Conclusiones: Este nuevo ELISA es el primer ensayo desarrollado para evaluar los neo-epftopos de colageno de tipo V. La alta renovacion del colageno de tipo V sugiere un papel fisiopatologico. CO5-MMP es un marcador candidato de la fibrogenesis en curso.

Metodos

Sujetos sanos y pacientes con AS

Los marcadores bioqufmicos se evaluaron en suero de pacientes diagnosticados con espondilitis anquilosante (AS, de acuerdo con los criterios de Nueva York modificados) y se compararon con muestras de suero sin enfermedad del mismo sexo y edad del Department of Medicine 3 de la University of Erlangen-Nuremberg. El grupo sin enfermedad consistio en 21 mujeres sanas y 19 hombres sanos con una edad media de 43,0 anos, rango de 18 a 66. El grupo de AS consistio en 19 mujeres y 21 hombres con una edad media de 42,5 anos, rango 29 a 63 anos. (Tabla 53)

Metodologfa ELISA CO5-MMP

En experimentos preliminares, se optimizaron los reactivos, sus concentraciones y los periodos de incubacion realizando varios analisis de tablero de ajedrez. La ELISA CO5-MMP se desarrollo de la siguiente manera: Una placa de estreptavidina de 96 pocillos se recubrio con 5 ng/ml de peptido sintetico biotinilado HMGREGREGE-K-Biotina (SEQ ID NO 307) disuelta en tampon de ensayo (Tris 25 mM, BSA al 1%, Tween-20 al 1%, pH 7,4) y se incubaron 30 minutos a 20°C agitando constantemente a 300 rpm. Se anadieron veinte pl de calibrador de peptidos o muestra disuelta en el tampon de ensayo a los pocillos apropiados, seguido de 100 pl de anticuerpo monoclonal conjugado (125 ng/ml) y se incubaron durante 1 hora a 4°C con agitacion constante a 300 rpm. Finalmente, se anadieron 100 pl de tetrametilbencinidina (TMB) (Kem-En-Tec cat. n.° 438OH) y la placa se incubo durante 15 minutos a 20°C en la oscuridad y se agito a 300 rpm. Despues de cada etapa de incubacion, la placa se lavo cinco veces en tampon de lavado (Tris 20 mM, NaCI 50 mM, pH 7,2). La reaccion de TMB se detuvo anadieron 100 pi de solucion de parada (HCI al 1%) y se midio espectrofotometricamente a 450 nm con 650 nm como referencia. Se realizo una curva estandar mediante dilucion en serie del peptido CO5-MMP (HMGREGREGE) y se represento mediante un modelo de ajuste matematico de 4 parametros. Las concentraciones estandar fueron 0, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250, 500, 1000 ng/ml.

Tabla 53. Descri cion del estudio

La Figura 12 muestra los resultados obtenidos en una caracterizacion del ELISA de CO5-MMP que muestra el porcentaje de inhibicion de la senal de: A) Peptido libre (HMGREGREGE), colageno de tipo V intacto, colageno de tipo V escindido por MMP-9, colageno de tipo V escindido por MMP-2; B) Peptido libre (HMGREGREGE), colageno de tipo V escindido por MMP-13, colageno de tipo I escindido por MMP-9, peptido alargado (GHMGREGREG). La Figura 13 muestra los resultados de la medicion de CO5-MMP en sujetos no enfermos (ND, n = 40) y en pacientes con espondilitis anquilosante (AS, n = 40). Las barras indican niveles medios ± error estandar de la media (SEM). Los grupos se compararon por Mann-Whitney.

Ejemplo 9 - Elastina ELN-552 (ELM-2) GVAPGIGPGG. (SEQ ID NO 308)

Materiales y Metodos

Tabla 54. Descripcion del programa de neo-epftopo de elastina. Una flecha apuntando hacia abajo indica el sitio i i n ^ l min i l r r l i l r r .

Procedimiento ELISA ELN-552 (ELM2)

El tampon de ensayo y las placas se equilibraron a temperatura ambiente. Se usaron 100 pl de peptido biotinilado (biotina-CGG-GVAPGIGPGG SEQ ID NO 287) diluido a 2,5 ng/ml en tampon de ensayo (PBS 50 mM, BSA al 1%, Tween-20 al 0,1%, pH 7,40) para recubrir placas recubiertas con estreptavidina de 96 pocillos. Las placas se incubaron durante 30 minutos a 20°C, con agitacion a 300 rpm, y se lavaron cinco veces en tampon de lavado (tris 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,2). Cada muestra de suero se diluyo 2 veces en tampon de ensayo y se anadieron a cada pocillo 20 pl de dilucion de suero o calibrador peptfdico (comenzando en 250 ng/ml). Se anadieron 100 pl de anticuerpo NB244-2B4 marcado con HRP a una concentracion de 65 ng/ml a cada pocillo y la placa se dejo incubar durante 1 hora a 20°C, agitando a 300 rpm. Las placas se lavaron cinco veces en tampon de lavado, se anadieron 100 pl de TMB, y la placa se incubo durante 15 minutos a 20°C en la oscuridad. Se anadieron 100 pl de solucion de parada (H²SO⁴ al 1%) y la placa se leyo en un lector ELISA a 450 nm con 650 nm como referencia. Se ajusto una curva de calibracion utilizando un modelo de ajuste matematico de 4 parametros.

Validacion clfnica del ensayo ELN-552

El ensayo ELN-552 se ensayo en la cohorte BioCore, que es una cohorte de aterosclerosis. La cohorte se realizo sin diluir en el ensayo. Los pacientes de la cohorte de BioCore se dividen en cuatro grupos de acuerdo con los sfntomas clfnicos: el grupo con AMI, que son pacientes con infarto agudo de miocardio confirmado, el grupo sin AMI, que son pacientes con sospecha de AMI, pero sin diagnostico basado en los niveles de troponina-T, el grupo de calcio coronario alto, que son pacientes que presentan calcio coronario alto basado en una puntuacion agatston pero sin sfntomas clfnicos, y el grupo sin calcio coronario, que es el grupo de control negativo. Los pacientes en el grupo sin calcio coronario fueron elegidos al azar en funcion de su numero de CRP y no tienen sfntomas clfnicos o indicacion de biomarcadores de aterosclerosis. Todos estan emparejados por sexo y edad con el resto de la cohorte. En cada grupo hay 30 pacientes, por lo que es un estudio de 120 pacientes. Una tabla demografica de algunos de los datos de BioCore se observa en la Tabla 55.

Tabla 55. Los datos demograficos sobre la cohorte BioCore.

Grupo ^{Edad PA sist. PA diast. Colesterol HDL LDL Puntuacion Heart} _{(anos) (mmHg) (mmHg) total (mmol/l) (mmol/l) (mmol / l) de Agatston score*} AMI (n = 30) ^{64,5 ±}

₉ 159 ± 28 88 ± 16 4,7 ± 1,3 1,2 ± 0,3 2,9 ± 1,2 --- 9,7 ±

5,4 No AMI (n = 60,2 ±

30) ₈ 143 ± 26 81 ± 14 4,9 ± 0,9 1,5 ± 0,7 2,7 ± 0,7 498** 8,7 ±

5,7 Ca coronario 60,3 ±

alto (n=30) 147 ± 20 86 ± 11 5,5 ± 1,2 1,4 ± 0,5 3,3 ± 1 1509± 1070 8,3 ±

_0,3 6,2 Sin Ca. _{60,3 ±}

^{ario (n} ,4 145 ± 14 86 ± 10 5,2 ± 1,2 1,3 ± 0,4 3,1 ± 1 0,00 6,3 ± ^coron

_{= 30)} 0 4,5

Los valores son la media ± desviacion estandar.

Ca coronario alto: el grupo de calcio coronario alto,

Sin Ca coronario: el grupo sin calcio coronario.

PA: Presion arterial

*Heart score es una evaluacion del riesgo de enfermedad cardiovascular de acuerdo con la edad, la presion arterial sistolica, el colesterol total en mmol/L, y el estado de fumador.

**Puntuacion de Agatston de un solo paciente.________________________________________________________ Estadfstica

Despues de ensayar las dos cohortes en el ensayo ELN-552, los datos se verificaron para determinar la distribucion gaussiana utilizando una prueba de omnibus D'Agostino-Pearson y comprobando visualmente la distribucion mediante la creacion de un histograma. Los diferentes grupos se ensayaron entonces para determinar la diferencia utilizando una prueba t no parametrica.

Resultados

ELN-552 esta elevado en pacientes con infarto de miocardio agudo

El ELN-552 se ensayo en la cohorte de aterosclerosis BioCore. Los niveles de ELN-552 fueron significativamente mas altos en el suero de pacientes con AMI en comparacion con los no AMI (p <0,01). Los pacientes se dividen en grupos de acuerdo con los sfntomas clfnicos y los marcadores de imagen. La barra que cubre los grupos AMI y no AMI indica una diferencia significativa entre estos grupos calculada por una prueba t no parametrica. ** indica un valor de p inferior a 0,01. Para comparacion, el eje y tiene el mismo valor que en. Al usar una prueba t no parametrica, es evidente que la mayor diferencia entre los grupos se encuentra entre los grupos AMI y no AMI. Entre el grupo AMI y el grupo sin calcio coronario hubo una diferencia casi significativa de p = 0,07 y entre los grupos no AMI y de calcio coronario alto hubo un valor de p de 0,08, lo que sugiere que los grupos de pacientes mas grandes y, por lo tanto, de mas potencia, podrfan confirmar estas diferencias y caracterizar adicionalmente el ensayo.

En esta memoria descriptiva, a menos que se indique expresamente otra cosa, la palabra "o" se usa en el sentido de un operador que devuelve un valor verdadero cuando se cumple una o las dos condiciones establecidas, a diferencia del operador "exclusivo o" lo que requiere que solo se cumpla una de las condiciones. La palabra "que comprende" se usa en el sentido de "incluir" en lugar de significar "que consiste en". No debe considerarse ningun conocimiento de ningun documento publicado anteriormente en el presente documento como una admision o representacion de que la ensenanza del mismo era de conocimiento general en Australia o en otro lugar en la fecha de la presente.

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Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo de bioensayo que comprende realizar un inmunoensayo para medir los fragmentos de protefnas que contienen neo-epftopos presentes de forma natural en una muestra de biofluido, en el que dicho inmunoensayo se realiza mediante un metodo que comprende:

poner en contacto los fragmentos de protefnas presentes de forma natural en dicha muestra con una pareja de union inmunologica especfficamente reactiva con un neo-epftopo formado por escision de una protefna por una proteinasa y medir la extension de la union de fragmentos peptfdicos a dicha pareja de union inmunologica para medir en la misma fragmentos de protefna que comprenden dicho neo-epftopo, en el que dicha pareja de union inmunologica es especfficamente reactiva con la siguiente secuencia en el terminal N de un peptido: KTFGKM

2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicha deteccion de union es cuantitativa.

3. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la cantidad de union se compara con los valores de control establecidos para poblaciones de individuos sanos y de individuos caracterizados por una enfermedad fibrotica o por una afeccion inflamatoria.

4. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, realizado como un ensayo de competicion de tal manera que los peptidos en dicha muestra compiten por la union al anticuerpo o fragmento de anticuerpo con una concentracion conocida de un agente de union que se une a dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo.