CN115427442A - 纤维化的生物标记物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测生物样品交联CTX‑III的夹心免疫分析和试剂盒，和它在评估靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的药物的功效中的用途。交联CTX‑III能够用作包括肝纤维化、慢性肠病、嗜酸细胞性食管炎和癌症在内的与纤维化相关的疾病的生物标记物。

Description

纤维化的生物标记物
技术领域
本发明涉及一种用于检测生物样品中的交联CTX-III的夹心免疫分析、和它在评估靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的药物的功效中的用途。本发明还涉及一种用于执行所述夹心免疫分析的试剂盒。
背景技术
纤维化疾病(包括表A中列出的那些)是发病率和死亡率的主要原因，例如肝硬化，全球每年有800,000例死亡。
表A.不同纤维化疾病。
Figure BDA0003891118700000011
Figure BDA0003891118700000021
‘纤维化疾病’是任何引起纤维化的疾病，无论是作为主要症状或是次要症状。纤维化是由多种刺激诱导的慢性炎症反应的最终结果，所述刺激包括持续感染、自身免疫反应、过敏反应、化学损伤、辐射和组织损伤。纤维化的特征是细胞外基质(ECM)的积聚和重组。尽管具有明显的病因和临床区别，大多数慢性纤维化病症共同具有一种持续刺激物，所述刺激物维持生长因子、蛋白水解酶、血管生成因子和纤维生成细胞因子的产生，这些因子一起刺激结缔组织成分、特别是胶原蛋白和蛋白聚糖的沉积，从而逐渐重塑并且破坏正常的组织结构。尽管它对人类健康具有巨大影响，目前还没有批准直接靶向纤维化机制的治疗。
III型胶原蛋白的作用和它在肝脏1、肠2、肾脏3以及肺4纤维化中的参与已经显示改变的周转。III型胶原蛋白是由成纤维细胞产生的主要原纤维胶原蛋白之一，也被认为参与促纤维化交联事件。此处，交联的过度形成导致蛋白酶不可接近的基质5，具有增加的基质硬度6。因此，这导致通过激活促纤维化信号传导级联的细胞：ECM相互作用，通过(肌)成纤维细胞激活7、分化8以及迁移9实现ECM积聚。
原纤维胶原蛋白的交联：
胶原蛋白原纤维成熟的最后一步是形成分子内和分子间交联，所述交联由诸如赖氨酰氧化酶(LOX)、赖氨酰氧化酶样酶(LOXL)和谷氨酰胺转胺酶(TG)的酶催化10。这些交联的形成为它们各自的组织提供机械和功能特性，包括抗张强度11、弹性以及影响数种细胞功能12-14。虽然在原纤维胶原蛋白(I、II、III、V、IX和XI型胶原蛋白)内存在各种类型的酶和非酶交联10，但由LOX(L)和TG催化的酶交联形成受到关注。这是由于它们参与生理和病理交联事件15,16。LOX(L)催化原纤维胶原蛋白端肽内的特定赖氨酸或羟基赖氨酸的氧化脱氨基，从而形成自发交联，而TG催化谷氨酰胺与赖氨酸之间的异肽键的形成。虽然LOX(L)衍生的交联的最终生物化学性质因其组织表达而不同，但主要原纤维胶原蛋白内的交联位点似乎是保守的，这表明组织特异性而非胶原蛋白特异性交联10。
当在显示出降低的组织强度和弹性的动物模型和某些遗传疾病中观察到缺乏生理交联时，生理交联的重要性是显而易见的。除了减少或减弱的交联的有害影响以外，过度形成和生物化学改变也可以对组织功能产生不利影响，正如在组织纤维化和癌症中观察到的那样。在持续组织损伤的情况下，伤口愈合级联的反复激活会导致原纤维胶原蛋白(诸如I型和III型胶原蛋白17)和促纤维化因子(包括LOX(L)和TG)的上调和积聚。胶原蛋白和其交联酶的这种过度积聚会介导硬纤维化细胞外基质(ECM)的形成。
纤维化消退的评估：
为了确定抗纤维化疗法的效果，需要一种敏感、可靠并且最佳的微创评估方法。作为当前的治疗选择，尼达尼布和吡非尼酮只能减缓如特发性肺纤维化18,19的患者中所观察到的进展，或不能与全身性硬化20研究中的情况一样对皮肤纤维化提供任何显著影响，完全抑制并且逆转纤维化的目标尚未实现。同样，使用消炎药可能不会影响纤维化，而炎症性肠病(IBD)患者21,22的肠纤维化通常是这种情况。然而，随着对原纤维胶原蛋白和其交联在器官纤维化中的参与的了解和认识的增加，已披露新的潜在靶。这些包括LOXL2/323和TG224的小分子抑制剂，以及靶向Rho激酶25的抑制剂，由此抑制促纤维化细胞内信号传导级联。使用目前是肝脏-26和肾脏-27纤维化的金标准的组织活检，以及其他用于肠28和肺纤维化29的笨重或侵入性方法时，可能应用新的血清学生物标记物。作为纤维化的关键部分，靶向交联原纤维胶原蛋白的片段可能潜在地有助于准确评估纤维化消退。应用CTX-I30和CTX-II31生物标记物分别测量I型胶原蛋白和II型胶原蛋白交联的降解片段，在骨吸收和软骨破坏的临床设置中部分地显示了这一点。因此，需要开发交联III型胶原蛋白的新颖生物标记物(CTX-III)，作为纤维化消退的生物标记物。
嗜酸细胞性食管炎
嗜酸细胞性食管炎(EoE)描述一种食物过敏原诱导的食管慢性炎症，其特征是嗜酸性粒细胞大量涌入和Th2细胞驱动的炎症。Th2炎症途径的激活导致嗜酸性粒细胞的募集，进而增加促炎症和促纤维化介质的分泌，诸如转化生长因子β。随着时间的推移，持续的炎症和促纤维化介质的分泌会启动成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，从而导致纤维生成[46-48]。肌成纤维细胞是组织纤维化的主要细胞，其中大量分泌胶原蛋白和交联酶，诸如赖氨酰氧化酶(LOX)和LOX样酶(LOXL)。通过食管活检的Masson三色染色进行组织学评估，显示胶原蛋白在固有层的上皮下室中的显著沉积[46,49]。
常见的临床症状包括吞咽困难和食物嵌塞，其中纤维化起着重要作用，因为进行性纤维狭窄可以导致食管狭窄和狭窄形成。EoE的诊断主要是基于经历吞咽困难的患者的内窥镜评估和食管活检[50]。由于EoE的斑块性质，单一活检不充分，其中敏感性为55％[51]。因此，总共采集六次活检，从而使敏感性增加至99％[52]。内窥镜检查提供临床症状的视觉确认，但由于多达10％的EoE患者没有内窥镜发现，所有患者均需要进行活检。由于食管活检需要上消化道内窥镜检查和镇静，正在开发替代方法，诸如基于血液的生物标记物。尽管已评估数种血清生物标记物，目前EoE的常规临床应用中并未使用基于血液的生物标记物[53,54]。因此，需要对微创工具，诸如基于血液的生物标记物的医学需求。同样，根据炎症性肠病[55,56]中获得的数据，靶向反映纤维生成或纤维溶解的胶原蛋白代谢物的基于血液的生物标记物可能应用于EoE。这些生物标记物可能有助于具有内窥镜检查无法观察到的亚临床纤维化的患者的早期鉴定，从而允许早期干预。此外，降解代谢物可能反映上皮下炎症或纤维化消退，从而反映治疗效果。因此，引入胶原蛋白重塑的经验证的基于血液的生物标记物可以为评估食管深部组织重塑提供基本工具，从而潜在地限制对组织活检的需求。
另外的工具包括提供食管的物理特性信息的高分辨率测压术，其中与纤维狭窄[57]相关的压力增加。此外，使用细胞海绵的刷片细胞学检查的结果显示与内窥镜发现相关，并对食管近端和远端嗜酸性粒细胞增多症具有良好的敏感性和特异性[58]。
炎症性肠病
炎症性肠病(IBD)的病理异质性，尤其是克罗恩氏病(CD)的亚病理学，已经使得创建数种疾病分类系统成为必要。临床医生作出患者和病理学评估所涉及的临床参数决定了临床上的非活动性或活动性疾病[63,64]。此外，基于内窥镜检查的蒙特利尔分类法的使用提供了一种直观并且更客观的疾病分类，使得能够基于内窥镜检查的表现，诸如非狭窄和非穿透(B1)、狭窄(B2)或穿透性(B3)[65]对患者分层。狭窄和瘘管是CD的两种严重并发症，其特征是纤维狭窄，即组织、特别是胶原蛋白的过度堆积，或是严重的组织和胶原蛋白降解，从而导致跨壁伤口。细胞外基质中的胶原蛋白在健康和发炎的肠组织中都具有重要的结构和信号传导提示，在肠组织中占很大比例[66]。由于IBD中的慢性炎症，间质基质中激活的肌成纤维细胞沉积了大量原纤维胶原蛋白，诸如I型、III型和V型胶原蛋白，以及交联酶，诸如LOX(L)和TG2。这一过程最终将导致基质硬度增加，因为胶原蛋白广泛交联会独立于炎症传播纤维化过程[67]。此外，肌成纤维细胞和募集的炎症细胞产生大量的ECM降解蛋白酶，诸如基质金属蛋白酶(MMP)，从而驱动胶原蛋白重塑。由纤维狭窄引起的狭窄性疾病是胶原蛋白广泛沉积和交联的结果，而穿透性疾病的特征是胶原蛋白的蛋白水解降解占主导地位。
临床参数和内窥镜检查代表IBD领域的标准化方法。用于确定临床参数的调查表缺乏客观性和组织表现的正确鉴定。此外，目前作为金标准的内窥镜检查使患者感到不适，小肠触及范围受限，并且缺乏经验证的组织病理学系统[68]，所述系统局限于CD患者的小肠内经常受影响的触及区域。诸如MRE的最新技术正在成为用于评估疾病表现的非侵入性和高精度工具，但确实增加了处理成本[69]。
因此，迫切需要开发能够评估驱动各种疾病表现的潜在分子过程的非侵入性生物标记物，尤其是反映肠纤维生成和肠纤维化消退的标记物。
癌症
尽管经过多年的专门研究，癌症仍然是全球第二大死亡原因。癌症患者生存的关键因素是早期诊断和预测治疗反应的能力。
与器官纤维化相似，癌症的特征是ECM重塑的病理程度[72][73]。此处，癌细胞和基质细胞分泌大量MMP，所述MMP降解周围的ECM组分，包括胶原蛋白。除了ECM降解以外，癌症相关成纤维细胞(CAF)也在肿瘤基质内提供大量胶原蛋白沉积，所述胶原蛋白通过LOX(L)和TG2进行重酶交联，从而增强肿瘤进展[74][75]。这个过程调节细胞信号传导、增殖、分化、基因表达、迁移、侵袭和转移[76][77]。随着CAF的引领，原纤维胶原蛋白的排列和酶交联为侵袭肿瘤细胞铺平了道路。此外，高度交联的ECM被认为阻止T细胞的迁移，从而屏蔽肿瘤细胞免受宿主免疫系统的影响[78]。这种屏蔽效应可以解释为什么某些癌症患者对免疫疗法反应不佳[78][79]。
随着新的证据强调原纤维胶原蛋白沉积和随后的酶交联在肿瘤进展和治疗反应中的重要作用，在多种癌症类型中对CTX-III生物标记物进行了研究。CTX-III定量和随后的患者分层可能有助于评估肿瘤基质内的分子过程，并鉴定潜在地受益于免疫疗法的患者。
WO20178/34172描述在合适样品中测量作为纤维化标记物的III型胶原蛋白的交联N端前肽(PIIINP)。这种方法使用WO 2014/170312中公开的单克隆抗体。这种标记物只在形成过程中产生。
申请人开发了一种高灵敏度的免疫分析，所述免疫分析靶向由C-蛋白酶产生的交联III型胶原蛋白的C端端肽的新表位，随后由另外的未知蛋白酶释放片段，从而能够准确评估纤维化ECM的降解。
直接夹心酶联免疫吸附分析(ELISA)是使用靶向交联III型胶原蛋白的C端端肽新表位的高度特异性单克隆抗体开发的。所述分析可以用于临床设置中，作为纤维溶解的定量评估。
发明内容
本发明针对一种用于检测生物样品中的交联C端端肽III胶原蛋白(CT-III)的夹心免疫分析，其中所述交联CT-III包含通过链间交联接合在一起的至少两条CT-III链。所述方法包括使包含交联CT-III的生物样品与结合至表面的第一单克隆抗体接触，其中所述交联CT-III中包含的每一条CT-III链均具有通过完整III型前胶原蛋白的N-蛋白酶裂解生成的CT-III的C端新表位，和添加第二单克隆抗体。两种单克隆抗体均与CT-III的C端新表位特异性反应，并且所述新表位包含在C端氨基酸序列KAGGFAPYYG–COOH(SEQ ID NO:1)中。所述方法还包括确定第二单克隆抗体的结合量。
如本文所用，术语“CT-III”是指III型胶原蛋白的C端端肽。
本发明还针对一种用于评估靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的拮抗药物的功效的方法。所述方法包括使用如本文所述的夹心免疫分析来量化在向受试者施用拮抗药物的时期中的第一时间点和至少一个后续时间点从所述受试者获得的至少两个生物样品中的交联CT-III的量。在施用拮抗药物的时期中的第一时间点至至少一个后续时间点交联CT-III的量的减少指示它是靶向LOX的有效拮抗药物。
本发明还针对一种用于如本文所述的夹心免疫分析的试剂盒。所述试剂盒包括固体载体，其上结合如上文所述的第一单克隆抗体和如本文所述的标记的第二单克隆抗体。
本发明还针对一种鉴定纤维化患者的纤维化反应表型的方法，所述方法包括使用本文所述的夹心免疫分析来量化从所述患者获得的生物流体样品中的交联CT-III的量，和使所述交联CT-III与i)与已知纤维化反应表型相关的值和/或ii)预定截断值相关联。所述方法还可以包括还包括量化生物流体样品中存在的N端III型胶原蛋白前肽(PRO-C3)的量，确定交联III型胶原蛋白(CTX-III)与PRO-C3的比率，和使所述交联III型胶原蛋白(CTX-III)与PRO-C3的比率与预定截断值相关联。
具体实施方式
因此，在第一方面，本发明涉及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性识别并结合至交联III型胶原蛋白的C端端肽新表位(本文中也称为靶肽)，所述C端具有氨基酸序列KAGGFAPYYG(SEQ ID NO:1)(本文中也称为靶序列)。
优选地，所述单克隆抗体是针对具有C端氨基酸序列KAGGFAPYYG(SEQID NO:1)的合成肽产生的单克隆抗体。用于产生所述抗体的合成肽可以是在其N端连接至载体蛋白的合成肽。示例性载体蛋白包括蛋白质，诸如但不限于钥孔戚血蓝蛋白(KLH)。合成肽可以通过任何合适的键联连接至载体蛋白，所述键联可以包括在所述肽的N端的一个或多个另外的氨基酸残基。所述单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的合适技术来产生，诸如但不限于使小鼠或其他哺乳动物免疫，从免疫的哺乳动物分离脾细胞并与杂交瘤细胞融合，接着培养所得杂交瘤细胞以确保单克隆生长。
在一个优选实施方案中，所述单克隆抗体不特异性识别或结合至具有C端氨基酸序列KAGGFAPYYGX(SEQ ID NO:2)的肽，其中X表示任何氨基酸。因此，所述单克隆抗体优选不特异性识别或结合至靶肽的延长变体，其中靶氨基酸序列在C端由一个或多个氨基酸延长。优选地，所述单克隆抗体大体上不识别或结合所述C端氨基酸序列的延长形式，即KAGGFAPYYGDZ-COOH(SEQID NO:3)，其中Z缺失或是III型胶原蛋白序列的一个或多个氨基酸。优选地，所述单克隆抗体优选不特异性识别或结合至具有C端氨基酸序列KAGGFAPYYGD(SEQ ID NO:4)的肽。
在一个优选实施方案中，所述单克隆抗体不特异性识别或结合至具有C端氨基酸序列KAGGFAPYY(SEQ ID NO:5)的肽。因此，所述单克隆抗体优选不特异性识别或结合至靶肽的缩短变体，其中靶氨基酸序列在C端由一个或多个氨基酸截短。
优选地，所述单克隆抗体或其片段可以优选地包含一个或多个选自以下的互补决定区(CDR)：
CDR-L1：RSSKSLLHSNGNTYLY(SEQ ID NO:6)
CDR-L2：RMSNLAS(SEQ ID NO:7)
CDR-L3：MQHLEFPLT(SEQ ID NO:8)
CDR-H1：DHGMH(SEQ ID NO:9)
CDR-H2：VISTYYGDATYNQKFKG(SEQ ID NO:10)
CDR-H3：SMGGNYVGTGFAY(SEQ ID NO:11)
优选地，所述抗体或其片段包含上文列出的CDR序列中的至少2、3、4、5或6个。
优选地，所述单克隆抗体或其片段具有包含以下CDR序列的轻链可变区
CDR-L1：RSSKSLLHSNGNTYLY(SEQ ID NO:6)
CDR-L2：RMSNLAS(SEQ ID NO:7)和
CDR-L3：MQHLEFPLT(SEQ ID NO:8)
优选地，所述单克隆抗体或其片段具有包含CDR之间的框架序列的轻链，其中所述框架序列与以下轻链序列中的CDR之间的框架序列大体上同一或大体上相似(其中CDR以粗体显示并加下划线，并且框架序列以斜体显示)
Figure BDA0003891118700000091
优选地，所述单克隆抗体或其片段具有包含以下CDR序列的重链可变区
CDR-H1：DHGMH(SEQ ID NO:9)
CDR-H2：VISTYYGDATYNQKFKG(SEQ ID NO:10)和
CDR-H3：SMGGNYVGTGFAY(SEQ ID NO:11)
优选地，所述单克隆抗体或其片段具有包含CDR之间的框架序列的重链，其中所述框架序列与以下轻链序列中的CDR之间的框架序列大体上同一或大体上相似(其中CDR以粗体显示并加下划线，并且框架序列以斜体显示)
Figure BDA0003891118700000092
如本文所用，如果抗体的CDR之间的框架氨基酸序列与另一抗体的CDR之间的框架氨基酸序列具有至少70％、80％、90％或至少95％的相似性或同一性，那么所述框架氨基酸序列大体上同一或大体上相似。所述相似或同一的氨基酸可以是相邻的或非相邻的。
所述框架序列可以含有一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。氨基酸取代可能是保守的，这意味着取代的氨基酸具有与原始氨基酸相似的化学特性。熟练人员应了解哪些氨基酸共享相似的化学特性。例如，以下几组氨基酸共享相似的化学特性，诸如大小、电荷和极性：第1组，Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；第2组，Asp、Asn、Glu、Gln；第3组，His、Arg、Lys；第4组，Met、Leu、Ile、Val、Cys；第5组，Phe Thy Trp。
诸如CLUSTAL程序的程序可以用于比较氨基酸序列。这一程序比较氨基酸序列，并通过在任一序列中适当插入空格来找到最佳比对。有可能计算氨基酸的同一性或相似性(同一性加上氨基酸类型的保守性)以实现最佳比对。如BLASTx的程序将比对相似序列的最长延伸，并为拟合指定值。因此，有可能获得一种比较，其中发现数个相似的区域，每个区域具有不同的分数。本发明预期这两种类型的分析。同一性或相似性优选在框架序列的整个长度上计算。
在某些优选实施方案中，所述单克隆抗体或其片段可以包含以下轻链可变区序列：
Figure BDA0003891118700000101
Figure BDA0003891118700000102
(CDR呈粗体并加下划线；框架序列呈斜体)
和/或以下重链可变区序列：
Figure BDA0003891118700000103
Figure BDA0003891118700000104
(CDR呈粗体并加下划线；框架序列呈斜体)
本发明涉及一种用于检测生物样品中的III型胶原蛋白交联C端端肽(CT-III)的夹心免疫分析，所述交联CT-III包含通过链间交联接合在一起的至少两条CT-III链，所述方法包括：
使包含所述交联CT-III的所述生物样品与结合至表面的第一单克隆抗体接触，其中所述交联CT-IIII中包含的每一条CT-III链均包含通过完整III型胶原蛋白的C-蛋白酶裂解生成的CT-III C端新表位；
添加第二单克隆抗体；以及
确定所述第二单克隆抗体的结合量；
其中所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体均与所述CT-III C端新表位特异性反应，所述新表位包含在C端氨基酸序列KAGGFAPYYG-COOH(SEQ ID NO:1)中。
优选地，所述单克隆抗体大体上不识别或结合所述C端氨基酸序列的延长形式，即KAGGFAPYYGDZ-COOH(SEQ ID NO:3)，其中Z缺失或是III型胶原蛋白序列的一个或多个氨基酸。
优选地，所述单克隆抗体大体上不识别或结合所述C端氨基酸序列的截短形式，即KAGGFAPYY-COOH(SEQ ID NO:5)。
本文所述的夹心免疫分析使用与捕捉抗体和检测抗体相同的抗体，因此所述分析可以识别双链肽(即，交联的)。
优选地，所述夹心免疫分析用于量化生物流体中的交联CT-III的量，其中所述生物流体可以是但不限于血清、血浆、尿液、羊水、组织上清液或细胞上清液。
所述夹心免疫分析可以是但不限于放射免疫分析、荧光免疫分析或酶联免疫吸附分析。
在一个优选实施方案中，可以对所述第二单克隆抗体进行标记以便确定所述第二单克隆抗体的结合量。
优选地，所述第二单克隆抗体可以是酶联抗体。所述酶可以是但不限于辣根过氧化物酶(HRP)。
优选地，所述第二单克隆抗体可以经放射性标记或连接至荧光团。
尽管这些是与用于本发明的优选标记，但应设想可以使用任何合适的标记系统，诸如但不限于DNA报告基因或电化学发光标签。
或者，可以使用识别第二单克隆抗体的进一步标记抗体来确定所述第二单克隆抗体的结合量。所述进一步标记抗体可以使用如上文所述的标记来标记。
在本发明的一个优选实施方案中，所述夹心免疫分析还可以包括使通过所述方法确定的交联CT-III的量与已知疾病严重程度的标准疾病样品相关联，以评估疾病的严重程度。所述疾病可以是纤维化疾病。此类纤维化疾病可以是但不限于肝病，尤其是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，或病毒性肝纤维化，诸如HCV相关肝纤维化。或者，所述疾病可以是慢性肠病。此类慢性肠病可以是但不限于克罗恩氏病或溃疡性结肠炎，优选是克罗恩氏病。或者，所述疾病可以是癌症。此类癌症可以是但不限于乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、胃(stomach/gastric)癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌或黑素瘤。优选地，所述癌症是乳腺癌。
所述夹心免疫分析也可以用于通过比较通过所述方法确定的交联CT-III的量与在不同时间点从同一患者获得的第二样品中确定的交联CT-III的量来监测疾病的进展。所述第二样品可以在测试所述样品之前或之后的数小时、数天、数周或数年内获得。可以在不同的时间点采集多个样品，确定交联CT-III的量并比较结果。所述夹心免疫分析可以用于监测治疗后疾病的进展，以鉴定治疗是否成功。优选地，所述疾病是纤维化疾病。此类纤维化疾病可以是但不限于肝病，尤其是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，或病毒性肝纤维化，诸如HCV相关肝纤维化。或者，所述疾病可以是嗜酸细胞性食管炎。或者，所述疾病可以是慢性肠病。此类慢性肠病可以是但不限于克罗恩氏病或溃疡性结肠炎，优选是克罗恩氏病。或者，所述疾病可以是癌症。此类癌症可以是但不限于乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌或黑素瘤。优选地，所述癌症是乳腺癌。
本文所述的夹心分析还可以包括确定III型胶原蛋白形成的量，优选地通过确定样品中存在的PRO-C3的量。
PRO-C3和交联CT-III(CTX-III)的比率可以用于确定III型胶原蛋白的净沉积，所述净沉积在一些疾病状态下显著升高。Pro-C3在胶原蛋白形成期间产生并且是胶原蛋白形成的度量，而CTX-III在降解期间产生并是降解的度量。因此，交联CT-III(CTX-III)与PRO-C3的比率可以用于确定净纤维溶解，所述净纤维溶解在一些疾病状态下显著升高。例如，在HCV相关肝纤维化患者中，与具有较高Ishak分数的患者相比，具有较低Ishak分数(纤维化严重程度的指标)的那些患者的净纤维溶解程度较高。此外，在患有克罗恩氏病和溃疡性结肠炎的患者中，与蒙特利尔分类为B2的患者相比，那些患有由蒙特利尔分类B1指示的不太严重的疾病(即，非狭窄性和非穿透性疾病)的患者的净纤维溶解程度较高。此外，在乳腺癌患者中，与II期患者相比，那些III期(癌症严重程度的指标)患者的净纤维溶解程度更高。
另一方面，本文所述的夹心免疫分析可以用于评估靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的药物(诸如靶向LOX的拮抗药物)的功效的方法。
因此，本发明还涉及一种用于评估靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的拮抗药物的功效的方法，其中所述方法包括使用本文所述的夹心免疫分析来量化至少两个生物样品中的交联CT-III的量，所述生物样品已在向受试者施用拮抗药物的时期中的第一时间点和至少一个后续时间点从所述受试者获得，并且其中在施用拮抗药物的时期中的所述第一时间点至所述至少一个后续时间点交联CT-III的量的减少指示它是靶向LOX的有效拮抗药物。
优选地，所述方法量化拮抗药物的有效性。
优选地，所述方法评估靶向LOXL2的拮抗药物的功效。
另一方面，本发明涉及一种用于如本文所述的夹心免疫分析的试剂盒，所述试剂盒包括固体载体，其上结合如上文所述的第一单克隆抗体；和如上文所述的标记的第二单克隆抗体。
另一方面，本发明还涉及一种鉴定纤维化患者的纤维化反应表型的方法，所述方法包括使用本文所述的夹心免疫分析来量化从所述患者获得的生物流体样品中的交联CT-III的量，和使所述交联CT-III与i)与已知纤维化反应表型相关的值和/或ii)预定截断值相关联。所述方法还可以包括还包括量化生物流体样品中存在的PRO-C3的量，确定交联III型胶原蛋白(CTX-III)与PRO-C3的比率，和使所述交联III型胶原蛋白(CTX-III)与PRO-C3的比率与预定截断值相关联。
所确定的交联CT-III的量可以与预定的截断值进行比较。预定截断值优选为至少3.5ng/mL，更优选为至少3.8ng/mL，甚至更优选为至少4.0ng/mL，甚至更优选为至少4.2ng/mL，并且最优选为至少4.5ng/mL。在这方面，通过综合使用各种统计学分析，发现所测量的单克隆抗体(如上所述)与C端CTX-III生物标记物之间的结合量为至少3.5ng/mL或更大，可以确定患者具有“自发回归”表型。通过具有至少3.5ng/mL、更优选至少3.8ng/mL、甚至更优选至少4.0ng/mL、甚至更优选至少4.2ng/mL并且最优选至少4.5ng/mL的统计截断值，有可能使用本发明方法以高置信水平来鉴定具有自发回归表型的患者。
样品中测量出的交联III型胶原蛋白(CTX-III)和III型胶原蛋白(PRO-C3)的比率可以与预定截断值进行比较。预定截断值优选为至少0.5，更优选为至少0.6，甚至更优选为至少0.75，甚至更优选为至少0.8，并且最优选为至少0.9。在这方面，通过综合使用各种统计学分析，发现交联III型胶原蛋白(CTX-III)和III型胶原蛋白(PRO-C3)的比率至少为0.5或更大，可以确定患者具有自发回归表型。通过具有优选至少0.5、更优选至少0.6、甚至更优选至少0.75、甚至更优选至少0.8并且最优选至少0.9的统计截断比率值，有可能使用本发明方法以高置信水平来鉴定具有自发回归表型的患者。
另一方面，本发明还涉及一种鉴定患有纤维化疾病的患者的方法，所述方法包括使用本文所述的夹心免疫分析来量化从所述患者获得的生物流体样品中的交联CT-III的量，和使所述量的交联CT-III与i)与已知纤维化疾病患者和/或正常健康对照相关的值和/或ii)预定截断值相关联。所述方法还可以包括还包括量化生物流体样品中存在的PRO-C3的量，确定交联III型胶原蛋白(CTX-III)与PRO-C3的比率，和使所述交联III型胶原蛋白(CTX-III)与PRO-C3的比率与i)与已知纤维化疾病患者和/或正常健康对照相关的值和/或ii)预定截断值相关联。与正常健康对照相比交联CT-III水平升高或比率显著不同，指示纤维化疾病。
所述纤维化疾病可以选自但不限于肝病，尤其是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，或病毒性肝纤维化，诸如HCV相关肝纤维化。
另一方面，本发明还涉及一种鉴定患有嗜酸细胞性食管炎的患者的方法，所述方法包括使用本文所述的夹心免疫分析来量化从所述患者获得的生物流体样品中的交联CT-III的量，和使所述量的交联CT-III与i)与已知嗜酸细胞性食管炎患者和/或正常健康对照相关的值和/或ii)预定截断值相关联。所述方法还可以包括还包括量化生物流体样品中存在的PRO-C3的量，确定交联III型胶原蛋白(CTX-III)与PRO-C3的比率，和使所述交联III型胶原蛋白(CTX-III)与PRO-C3的比率与i)与已知嗜酸细胞性食管炎患者和/或正常健康对照相关的值和/或ii)预定截断值相关联。与正常健康对照相比交联CT-III水平升高或比率显著不同，指示嗜酸细胞性食管炎。
另一方面，本发明还涉及一种鉴定患有慢性肠病的患者的方法，所述方法包括使用本文所述的夹心免疫分析来量化从所述患者获得的生物流体样品中的交联CT-III的量，和使所述量的交联CT-III与i)与已知患有慢性肠病的患者和/或正常健康对照相关的值和/或ii)预定截断值相关联。所述方法还可以包括还包括量化生物流体样品中存在的PRO-C3的量，确定交联III型胶原蛋白(CTX-III)与PRO-C3的比率，和使所述交联III型胶原蛋白(CTX-III)与PRO-C3的比率与i)与已知患有慢性肠病的患者和/或正常健康对照相关的值和/或ii)预定截断值相关联。与正常健康对照相比交联CT-III水平升高或比率显著不同，指示存在慢性肠病。
所述慢性肠病可以选自但不限于肠易激疾病，诸如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。优选地，所述慢性肠病是克罗恩氏病或溃疡性结肠炎，更优选是克罗恩氏病。
另一方面，本发明还涉及一种鉴定癌症患者的方法，所述方法包括使用本文所述的夹心免疫分析来量化从所述患者获得的生物流体样品中的交联CT-III的量，和使所述量的交联CT-III与i)与已知癌症患者和/或正常健康对照相关的值和/或ii)预定截断值相关联。所述方法还可以包括还包括量化生物流体样品中存在的PRO-C3的量，确定交联III型胶原蛋白(CTX-III)与PRO-C3的比率，和使所述交联III型胶原蛋白(CTX-III)与PRO-C3的比率与i)与已知癌症患者和/或正常健康对照相关的值和/或ii)预定截断值相关联。与正常健康对照相比交联CT-III水平升高或比率显著不同，指示存在癌症。
所述癌症可以选自但不限于乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌或黑素瘤。优选地，所述癌症是乳腺癌。
另一方面，本发明提供一种鉴定将受益于治疗的患者的方法，所述方法包括使用本文所述的夹心免疫分析来量化从所述患者获得的生物流体样品中的交联CT-III的量，和使所述量的交联CT-III与i)与已知疾病患者和/或正常健康对照相关的值和/或ii)预定截断值相关联。所述方法还可以包括还包括量化生物流体样品中存在的PRO-C3的量，确定交联III型胶原蛋白(CTX-III)与PRO-C3的比率，和使所述交联III型胶原蛋白(CTX-III)与PRO-C3的比率与i)与已知疾病患者和/或正常健康对照相关的值和/或ii)预定截断值相关联。与正常健康对照相比交联CT-III水平升高或比率显著不同，指示需要治疗。
所述方法还可以包括向患者施用治疗。
所述治疗优选是施用靶向胶原蛋白交联的药物，诸如靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的拮抗药物。
所述疾病可以是纤维化疾病。此类纤维化疾病可以是但不限于肝病，尤其是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，或病毒性肝纤维化，诸如HCV相关肝纤维化。或者，所述疾病可以是嗜酸细胞性食管炎。或者，所述疾病可以是慢性肠病。此类慢性肠病可以是但不限于肠易激综合征，诸如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。或者，所述疾病可以是癌症。此类癌症可以是但不限于乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌或黑素瘤。优选地，所述癌症是乳腺癌。
将统计学截断值应用于本发明方法特别有利，因为它导致独立的诊断分析；即，它不需要与健康个体和/或具有已知疾病严重程度的患者进行任何直接比较来得出诊断结论。当使用所述分析来评估已经具有一般指示纤维化的医学征象或症状(例如，如通过体格检查和/或与医务人员协商确定)的患者时，这也可能是特别有利的，因为它可以充当一种快速并且明确的工具来证实最初的预后，从而可能不再需要更具侵入性的程序，诸如内窥镜检查或活检，并加快合适治疗方案的开始。优选地，预定截断值对应于在人体血液、血清或血浆中测量的截断值。
定义
如本文所用，术语“新表位”是指在多肽末端(即，在多肽的N或C端)的N或C端肽序列，并且不应被解释为一般意义上的含义。
如本文所用，术语单克隆抗体NBH-242是指针对位于III型胶原蛋白的C端端肽(CT-III)中的C端新表位的新表位特异性抗体，所述新表位包含C端序列KAGGFAPYYG-COOH(SEQ ID NO:1)。
如本文所用，术语“PRO-C3”是指III型胶原蛋白的N端前肽。
如本文所用，术语“PCX3”是指III型胶原蛋白的交联N端前肽。
如本文所用，术语“PRO-C3分析”是指用于检测和量化先前描述的N端前肽中的新表位的竞争性ELISA32。
如本文所用，术语“PCX3分析”是指用于检测和量化WO2017/134172中先前描述的交联N端前肽的竞争性ELISA。
如本文所用，术语“CT-III”是指III型胶原蛋白的C端端肽。
如本文所用，术语“CTX-III”是指包含通过链间交联接合在一起的至少两条CT-III链的III型胶原蛋白的交联C端端肽。
如本文所用，术语“CTX-III”分析是指本文所述的夹心分析，用于检测和量化交联III型胶原蛋白的交联C端端肽新表位，即交联CT-III。
如本文所用，术语“肽”和“多肽”同义使用。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指完整抗体和保留完整抗体的结合特异性的其片段，例如Fab片段、Fv片段或本领域技术人员已知的其他此类片段。保留相同结合特异性的抗体可以含有相同的互补决定区(CDR)。抗体的CDR可以使用本领域已知的方法，诸如Kabat等人所述的方法来确定。45
如实施例中所述，可以由B细胞克隆生成抗体。抗体的同型可以通过对人IgM、IgG或IgA同型或人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类具特异性的ELISA来确定。任何合适的方法均可用于鉴定同型。
生成的抗体的氨基酸序列可以使用标准技术来确定。例如，可以从细胞中分离出RNA，并使用RNA通过逆转录来生成cDNA。接着使用扩增抗体重链和轻链的引物对cDNA进行PCR。例如，对所有VH(可变重链)序列的前导序列具特异性的引物可以与结合至位于先前确定的同型的恒定区中的序列的引物一起使用。可以使用与κ或λ链的3’末端结合的引物以及退火至Vκ或Vλ前导序列的引物来扩增轻链。可以生成全长重链和轻链并对其进行测序。
如本文所用，术语“C端”是指多肽末端(即，在多肽的C端)，并且不应被解释为一般意义上的含义。同样，术语“N端”是指多肽末端(即，在多肽的N端)，并且不应被解释为一般意义上的含义。
如本文所用，术语“竞争性免疫分析”是指一种免疫分析，其中样品中存在的靶肽(如果有的话)与已知量的肽靶(例如，它与固定底物结合或经标记)竞争与抗体结合，所述免疫分析是本领域技术人员已知的技术。
如本文所用，术语“ELISA”(酶联免疫吸附分析)是指一种免疫分析，其中使用与酶(诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)相关的抗体来检测样品中存在的靶肽(如果有的话)。接着，通过用底物孵育，产生可测量产物来评估酶的活性。由此，可以检测和/或量化样品中的靶肽的存在和/或量。ELISA是本领域技术人员已知的技术。
如本文所用，术语“夹心免疫分析”是指使用至少两种抗体来检测样品中的抗原，并且是本领域技术人员已知的技术。
如本文所用，术语“结合量”是指单克隆抗体和靶肽之间的结合的量化，所述量化通过将生物流体样品中的靶肽的测量值与校准曲线进行比较来确定，其中所述校准曲线是使用已知浓度的靶肽的标准样品产生的。在本文所公开的测量生物流体中具有C端氨基酸序列KAGGFAPYYG(SEQ ID NO:1)的靶肽的特定分析中，所述校准曲线是使用已知浓度的具有C端氨基酸序列KAGGFAPYYG(SEQ ID NO:1)的校准肽(并且它尤其可能由氨基酸序列KAGGFAPYYG(SEQ ID NO:1)组成)的标准样品产生的。将生物流体样品中测量出的值与校准曲线进行比较，以确定样品中的靶肽的实际量。
如本文所用，“截断值”意指在统计学上经确定指示患者发生纤维化疾病(诸如肝纤维化)的高可能性的结合量或纤维溶解水平，因为患者样品中的生物标记物的测量值等于或高于统计学截断值，对应于纤维化疾病(诸如肝纤维化)的存在或可能性的至少70％概率，优选至少80％概率，优选至少85％概率，更优选至少90％概率，并且最优选至少95％概率。“截断值”也可以意指在统计学上经确定指示患者具有自发回归表型的高可能性的结合量或纤维溶解水平。
如本文所用，“纤维化反应表型”是指患者的表型，所述表型指示纤维化的严重程度将如何在不治疗的情况下发生变化。具有“自发回归”表型的患者是那些用安慰剂治疗52周后具有降低的Ishak分数的患者。用安慰剂治疗52周后Ishak分数未变化的患者具有“稳定”表型，而那些用安慰剂治疗52周后具有增加的Ishak分数的患者具有“进行性”表型。具有“自发回归”表型的患者可能需要不同的治疗方案，即与那些具有稳定或进行性表型的患者相比，剂量更低或治疗周期更短。
如本文所用，术语“与正常健康受试者相关的值和/或与已知疾病严重程度相关的值”意指通过上文针对被视为健康，即未患疾病(例如未患纤维化疾病，诸如肝病，特别是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，或病毒性肝纤维化，诸如HCV相关肝纤维化；慢性肠病，诸如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎；癌症，诸如乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌或黑素瘤)的受试者所述的方法确定的交联III型胶原蛋白(CTX-III)的标准化量或交联III型胶原蛋白(CTX-II)与III型胶原蛋白N端前肽(PRO-C3)的标准化比率，和/或通过上文针对已知患有已知严重程度的疾病(例如纤维化疾病，诸如肝病，特别是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，或病毒性肝纤维化，诸如HCV相关肝纤维化；慢性肠病，诸如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎；癌症，诸如乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌或黑素瘤)的受试者所述的方法确定的交联III型胶原蛋白(CTX-III)的标准化量或交联III型胶原蛋白(CTX-II)与III型胶原蛋白N端前肽(PRO-C3)的标准化比率。
如本文所用，“纤维化疾病”是指诸如肝病，尤其是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，或病毒性肝纤维化，诸如HCV相关肝纤维化。
如本文所用，“慢性肠病”可以选自但不限于肠易激疾病，诸如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎；优选地，所述慢性肠病是克罗恩氏病或溃疡性结肠炎，更优选是克罗恩氏病。
如本文所用，“癌症”可以选自但不限于乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌或黑素瘤。优选地，所述癌症是乳腺癌
附图说明
本发明将在以下实施例中进行说明，所述实施例参考以下各图：
图1：在大鼠(顶部)、小鼠(中间)与人(底部)序列之间的III型胶原蛋白α1-链的序列比对。红色框框出了CT-III中的新表位的靶序列。使用来自uniprot.org的相应物种序列和CLUSTALW 2.1多重比对工具进行比对。
图2：间接竞争性ELISA中单克隆NBH-242抗体的最终抑制。针对选择肽、延长肽、截短肽、免疫原肽和缓冲液测试抗体特异性。
图3：描绘了针对人选择肽、延长肽、截短肽和大鼠选择肽的抗体特异性的4参数逻辑模型。
图4：描绘了在基线处和6个月随访时健康人血浆EDTA供体和减肥手术患者的CTX-III水平。低于LLMR的水平被定义为LLMR水平(1.8ng/mL)。星号指示以下：*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；****：p<0.0001。
图5：将III型胶原蛋白的净沉积表示为在基线处和6个月随访时PRO-C3(III型胶原顶部形成)和CTX-III(交联III型胶原顶部降解)的生物标记物水平之间的比率。星号指示以下：****：p<0.0001。
图6。描绘根据HCV相关肝纤维化患者在筛选时的Ishak分数(1-2、3和4-5)和他们的CTX-III水平(针对健康供体的CTX-III水平绘图)对所述患者进行分层。数据绘制为中位数+IQR并且显著性描绘为：p<0.0001****
图7：描绘根据患者的Ishak分数划分的患者的净纤维溶解水平；1-2、3和4-5。数据绘制为中位数+IQR并且显著性描绘为：p<0.05*
图8：示出安慰剂组内的患者在筛选时的CTX-III(A)或净纤维溶解(B)水平，根据患者的自发纤维化表型进行分层；回归的、稳定的或进行性的。数据绘制为中位数+IQR并且显著性描绘为：p<0.05*，p<0.01**，并且p<0.001***
图9：通过从最低水平至最高水平将患者划分为三分位数(第1个、第2个和第3个三分位数)，描绘了基于患者在筛选时的CTX-III(A)或净纤维溶解(B)水平的患者Ishak分数的百分比变化。数据绘制为平均值+SEM并且显著性描绘为：p<0.01**,and p<0.001***
图10：使用通过Youden指数计算的截断水平，示出基于筛选时的CTX-III(A)或净纤维溶解(B)水平的患者Ishak分数的平均百分比变化。数据绘制为平均值+SEM并且显著性描绘为：p<0.01**
图11：基于Youden指数确定的筛选时的CTX-III或净纤维溶解水平，描绘出现回归纤维化表型的优势比。优势比以95％ CI绘图并且显著性描绘为：p<0.01**
图12：在基线处和在干预后的针对健康供体和EoE患者绘图的血清CTX-III。通过单因素ANOVA计算的显著差异并且描绘如下：p<0.0001****
图13：绘制的健康供体、CD患者和UC患者的CTX-III水平。通过Kruskal-Wallis单因素ANOVA计算统计差异，其中显著性描绘为：p<0.0001****
图14：如通过内窥镜检查确定的具有非狭窄和非穿透(B1)或狭窄性疾病表现(B2)的患者的血浆CTX-III(A)、净交联纤维溶解(log(CTX-III/PC3X))(B)和净纤维溶解(log(CTX-III/PRO-C3))水平。通过Mann-Whitney(A)和非配对t检验(B+C)计算的统计差异，其中显著性描绘为：p<0.05*，并且p<0.01**。
图15：用10-90百分位数绘制的方框图，说明了健康供体的CTX-III水平与12种癌症类型之间的统计差异。通过普通单因素ANOVA计算显著性并且描绘如下：p>0.05NS；p<0.05*；p<0.01**；p<0.001***。
图16：CTX-III(A)和净纤维溶解(B)水平针对II期或III期乳腺癌患者绘图。数据以10-90百分位数的方框图表示。通过参数t检验计算显著差异并且描绘为：p<0.05*；p<0.001***
实施例1
方法和材料：
试剂
实验中使用的所有试剂均为来自诸如Merck(Whitehouse Station,NJ,USA)和Sigma Aldrich(St.Louis,MO,USA)的公司的优质化学品。用于单克隆抗体产生以及分析开发和验证的合成肽为1)免疫原肽：钥孔戚血蓝蛋白(KLH)-CGG-KAGGFAPYYG，2)涂布肽：生物素-KAGGFAPYYG，3)选择肽：KAGGFAPYYG(SEQ ID NO:1)或CKAGGFAPYYG x CKAGGFAPYYG(SEQID NO:16)(通过N端二硫桥连接的二聚体)，4)延长肽：KAGGFAPYYGD(SEQ ID NO:4)或CKAGGFAPYYGD x CKAGGFAPYYGD(SEQ ID NO:17)(通过N端二硫桥连接的二聚体)，5)截短肽：KAGGFAPYY(SEQ ID NO:5)或CKAGGFAPYY x CKAGGFAPYY(SEQ ID NO:18)(通过N端二硫桥连接的二聚体)，以及6)大鼠二聚体肽：CKSGGFSPYYG x CKSGGFSPYYG。二聚体肽仅用于分析开发和验证。所有合成肽均购自Genscript,Piscataway,NJ,USA。
单克隆抗体产生和克隆表征。
使用蛋白质blast(图1)来分析位于III型胶原蛋白的C端端肽中的靶新表位(1212’-KAGGFAPYYG-‘1221)的唯一性以及与大鼠和小鼠的序列同源性。
在4至6周龄Balb/C小鼠中进行单克隆抗体产生。使用弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich)，用200μL乳化抗原和50μg免疫原肽(KLH-CGG-KAGGFAPYYG)经皮下使小鼠免疫。以两周时间间隔使小鼠免疫，直到达到稳定的血清效价水平。选择具有最高血清效价的小鼠进行融合。小鼠休息一个月，用100μL 0.9％ NaCl溶液中的50μg免疫原肽静脉内使小鼠免疫。3天后，分离脾细胞进行细胞融合。简单说来，使脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，接着使用半培养基方法在培养皿中进行克隆。将克隆放置于96孔微量滴定板中，并使用有限稀释法来确保单克隆生长。使用链霉亲和素预涂板(Roche,Hvidovre,Denmark,目录号11940279)，通过间接竞争性ELISA来筛选上清液对选择肽(KAGGFAPYYG(SEQ ID NO:1))和延长肽(KAGGFAPYYGD(SEQ IDNO:4))的反应性，所述预涂板涂布有4ng/mL的涂布肽(生物素-KAGGFAPYYG)。所有试剂均在50mM PBS、1％ BSA、1％ Tween-20、150mM NaCl(pH7.4)中稀释。选择两种最好的单克隆进行最终抑制，测试它们对选择肽(KAGGFAPYYG(SEQID NO:1))而非延长(KAGGFAPYYGD(SEQ ID NO:4))、截短肽(KAGGFAPYY(SEQ ID NO:5))或免疫原肽(KLH-CGG-KAGGFAPYYG的反应性。在纯化最佳的单克隆之前，使用夹心ELISA试剂盒，即SBA ClonotypingTMSystem-HRP(Southern Biotech,Birmingham,AL,USA)对抗体进行同型测试。使用蛋白G柱，根据制造商的说明书(GE healthcare Life Sciences,LittleChalfont,Buckinghamshire,UK)来纯化具有最好的反应性的单克隆。
对产生的抗体进行测序并确定CDR。
链的序列如下(CDR加下划线并且呈粗体；恒定区呈斜体)：
重链序列(小鼠IgG同型)
Figure BDA0003891118700000221
Figure BDA0003891118700000231
CDR-H1：DHGMH(SEQ ID NO:9)
CDR-H2：VISTYYGDATYNQKFKG(SEQ ID NO:10)
CDR-H3：SMGGNYVGTGFAY(SEQ ID NO:11)
轻链序列(小鼠κ同型)
Figure BDA0003891118700000232
CDR-L1：RSSKSLLHSNGNTYLY(SEQ ID NO:6)
CDR-L2：RMSNLAS(SEQ ID NO:7)
CDR-L3：MQHLEFPLT(SEQ ID NO:8)
分析开发
单克隆抗体标记
用生物素标记用作捕获抗体的单克隆NBH-242抗体，其中向1mL(1mg/mL)抗体中添加110μL Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH 9.6)，随后添加13.3μL生物素酰胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma Aldrich,St.Louis,MO,USA,目录号B2643)。在20℃下孵育所述溶液持续1小时，同时进行端对端旋转。随后，向溶液中添加110μL 0.2M乙醇胺(pH 8.0)并如先前进行孵育。使溶液在4℃下在浸没于1x PBS中的Zeba 7k MWCO脱盐柱(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA,目录号89889)中透析过夜。此外，一部分单克隆抗体用辣根过氧化物酶(HRP)标记并用作检测抗体。HRP标记使用来自Roche的过氧化物酶标记试剂盒执行，所述试剂盒购自Sigma Aldrich,St.Louis,MO,USA,目录11829696001，并根据制造商方案进行。
直接夹心ELISA方案
向预涂有链霉亲和素(Roche Diagnostic's,Hvidovre,Denmark,目录号11940279)的96孔板涂布100μL靶向CTX-III片段的生物素化抗体，所述生物素化抗体在室温下在300转/分钟(rpm)旋转下在分析缓冲液(50mM PBS、1％BSA、1％ Tween-20、150mMNaCl(pH 7.4))中以1+100稀释持续30分钟。丢弃未结合的生物素化捕获抗体，并使用标准化ELISA板洗涤机(
Figure BDA0003891118700000241
Instruments,微板洗涤机,ELx405 Select CW,Winooski,USA)用洗涤缓冲液(25mM TRIZMA、50mM NaCl、0.036％ Bronidox L5、0.1％ Tween 20)洗涤各孔。所有样品和检测抗体均在孵育缓冲液(50mM PBS、1％ BSA、1％ Tween-20、150mMNaCl、5％ Liquid II(pH 7.4))中稀释，其中检测抗体以1+100稀释。用100μL HRP标记的靶向CTX-III片段的检测抗体孵育20μL样品材料和对照，在4℃下持续20小时并以300rpm搅拌。丢弃未结合的一级抗体和样品，并用洗涤缓冲液洗涤各孔。随后，将100μL化学发光底物添加至各孔中，在20℃下在暗处在300rpm旋转下孵育各板持续3分钟。最后，用ELISA读取器(VersaMAX；Molecular Devices,Wokingham Berkshire,UK)对发出的发光进行量化，所述ELISA读取器经设置以测量在450nm和650nm下的发光。根据由二聚体选择肽(CKAGGFAPYYGx CKAGGFAPYYG(SEQ ID NO:16))的2倍连续稀释获得的结果，使用4参数数学拟合模型来绘制标准曲线。用标准曲线内推未知的样品测量值，以获得CTX-III片段的浓度(ng/mL)。
技术验证
检测下限(LLOD)由21个零样品(即，孵育缓冲液)确定并计算为平均值+3×标准差，而检测上限(ULOD)则由二聚体选择肽的10个测量值确定，计算为平均数+3×标准差。分析间和分析内变化由5个质量控制(QC)样品的10次独立运行确定，其中至少3个是健康人血浆EDTA样品(Valley Biomedical,Winchester,VA,USA)，每次运行由所述样品的双重确定组成。分析间和分析内变化的接受准则分别为15％和10％。使用未稀释样品作为参考，通过计算具有显著浓度的健康人血浆EDTA样品的1:6倍稀释液的回收百分比(100％±20％)来确定分析线性。通过计算二聚体延长肽、二聚体截短肽以及二聚体大鼠肽测量值针对100％二聚体选择肽样品的回收百分比来确定所述分析的特异性。通过掺加两个具有显著浓度的健康人血浆EDTA样品，随后计算理论测量值与实际测量值之间的回收百分比来确定样品测量值的准确性。通过向健康人血浆EDTA样品中掺加已知浓度的干扰物来测试生物素、脂质和血红蛋白造成的干扰。随后，计算对照样品与低干扰或高干扰样品之间的回收百分比。
分析物和试剂稳定性
通过计算非应激样品中三个健康人血浆EDTA样品的回收百分比来确定CTX-III片段的稳定性。所述样品经历多达四个冷冻和解冻循环，或者在4℃或20℃下经历2、4、24或48小时的孵育。
体外裂解分析
临床群组测量
生物标记物分析
使用靶向N端前肽中的新表位的PRO-C332竞争性ELISA来执行III型胶原蛋白形成的评估。简单说来，在20℃、300rpm下，用100μL生物素化涂层肽孵育链霉亲和素涂布的96孔板持续30min，所述生物素化涂层肽在含有蛋白质稳定剂和防腐剂的PBS缓冲涂布溶液中以1+100稀释。在孵育后，丢弃涂布溶液，并使用标准化ELISA板洗涤机(
Figure BDA0003891118700000251
Instruments,微板洗涤机,ELx405Select CW,Winooski,USA)用洗涤缓冲液(25mM TRIZMA、50mM NaCl、0.036％Bronidox L5、0.1％ Tween 20)洗涤各孔五次。将20μL样品材料添加至适当孔中，随后添加100μL在孵育缓冲液中以1+100稀释的HRP标记抗体。使板在4℃、300rpm下孵育20小时，然后如先前所述洗涤所述板。四甲基联苯胺(TMB,Kem-En-Tec目录号438OH,Taastrup,Denmark)用作比色试剂，100μL/孔，在暗处在300rpm搅拌下孵育15min。通过添加100μL 1％ H2SO4来停止反应，并使用ELISA读取器(VersaMAX；Molecular Devices,Wokingham,UK)在450nm处读取光密度，其中650nm作为参考。通过用选择肽的2倍连续稀释生成的4参数对数标准曲线进行内推来确定所分析样品内的PRO-C3浓度。
结果：
单克隆抗体产生和表征
大鼠、小鼠和人III型胶原蛋白序列的比对显示了两种氨基酸差异(在图1中由“：”表示)。同型表征确定了用于分析开发的抗体NBH-242为IgG2aκ-轻链。在最终抑制中，所述单克隆抗体未对延长肽、截短肽或免疫原肽显示任何反应性，这通过信号抑制的缺乏观察到。测试对选择肽的反应性，表明随着肽浓度增加，信号抑制作用增加，从而说明它在间接竞争性ELISA中与抗体的结合(图2)。
技术验证
在夹心ELISA的开发中，单克隆NBH-242抗体用作捕获抗体和检测抗体。通过计算LLOD和ULOD来确定人CTX-III ELISA的测量范围，其提供0.92-15.94ng/mL的范围。通过计算分析间和分析内变化确定的分析的技术性能是可接受的，其变化分别为14.8％和5.4％(表4)。在健康人血浆EDTA样品中测试分析线性，其产生108.9％的平均回收，因此在100％±20％的可接受范围内。(表5)。进一步稀释样品会导致浓度低于测量范围。通过绘制计算的回收百分比，测试直接夹心ELISA中抗体对二聚体肽的特异性。此处，抗体未对二聚体延长肽、二聚体截短肽或二聚体大鼠肽显示反应性，而对增加浓度的二聚体选择肽显示反应性，如增加的发光(y轴)所示(图3)。向健康人血浆EDTA样品中掺加另一健康人血浆EDTA样品，产生102.2％的平均回收(表6)。所测试的干扰物均未显示对健康人血浆EDTA样品的样品测量值产生影响，平均回收在可接受范围(100％±20％)内(表7)。
表4：通过使用五个QC样品(其中三个是健康人血浆EDTA样品，最后两个是二聚体选择肽)获得的CTX-III分析的分析间和分析内变化。所述变化(％)是计算为每个样品的10次单独双重确定的平均值。
Figure BDA0003891118700000261
Figure BDA0003891118700000271
表5：四个健康人血浆EDTA样品(HP)的样品稀释回收。
Figure BDA0003891118700000272
表6：使具有显著浓度的健康人血浆EDTA样品相互掺加，并计算测量样品测量值与理论样品测量值之间的掺加回收(％)。
Figure BDA0003891118700000273
表7：三个健康人血浆EDTA样品中血红蛋白、生物素和脂质造成的干扰。由低浓度和高浓度的干扰物相比纯血浆EDTA样品计算回收(％)。
Figure BDA0003891118700000274
Figure BDA0003891118700000281
分析物和试剂稳定性
健康人血浆EDTA样品中的分析物的稳定性在多达四个冷冻/解冻循环内是稳定的(表8)。健康人血浆EDTA样品在4℃下孵育时的平均回收为92.5％，其中所有样品的稳定性长达48小时。在20℃下，平均回收为114.7％，其中四分之三的样品显示了长达24小时的分析物稳定性。(表9)。
表8：
Figure BDA0003891118700000282
表9：
Figure BDA0003891118700000283
Figure BDA0003891118700000291
讨论
基于C蛋白酶裂解后产生的靶向III型胶原蛋白的C端端肽中的新表位的单克隆抗体，通过利用NBH-242单克隆抗体来检测III型胶原蛋白的交联片段，开发了一种新型CTX-III夹心ELISA。简单说来，所述分析显示了对人新表位的高度特异性能够检测人血浆EDTA样品中的分析物。另外，所述分析显示出在技术上稳定，具有可接受的分析间和分析内变化、线性和准确测量值。
表征和技术验证
在抗体表征期间，在竞争性ELISA中测试单克隆抗体对新表位序列变化的反应性，虽然这表明抗体的高度特异性，但所用的肽是单体的并且因此不能验证抗体在夹心ELISA中的使用。因此，设计一组二聚体肽，其含有早先提及的不同肽变化的两个同一序列，通过位于N端的二硫键交联至抗体结合位点。在测试对二聚体肽的反应性时，抗体对二聚体人选择肽产生高度特异性，从而重新验证了它对人新表位序列的高度特异度，同时也证明了它在检测交联片段方面的潜在有用性。
由于抗体的高度特异性和不能检测大鼠序列同源物，分析开发和验证集中于人样品材料。人血浆EDTA样品显示出天然反应性，但大多数测量的样品值在测量范围的下端，如由图3中的HD水平可观察到。选择测量范围内的样品进行分析的技术验证，这表明其技术稳定性。分析间和分析内变化是可以接受的，健康人血浆EDTA样品的稀释回收也是可以接受的，并且掺加回收显示所述分析的准确性。
分析物和试剂稳定性
分析的开发和临床使用中的一个重要因素是分析物的稳定性，从而允许在各种冷冻和解冻循环以及在较高或较低温度下的孵育后准确测量样品材料。当测量可能无法完全了解精确的样品处理的临床样品材料时，这是尤其重要的。测试CTX-III分析物的稳定性并不表明存在任何主要的不稳定性，不过应始终优先小心处理样品。
在以下实施例中，使用上述分析来测量CTX-III水平。使用WO 2014/170312中所述的方法来测量PROC3水平并且使用WO2017/34172中所述的分析来测量PC3X水平。
实施例2-减肥手术
在基线处和6个月随访时，对58名经历减肥手术的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者进行血液取样。表10提供了患者人口统计数据的示意图概述，其中包括患者BMI、非酒精性脂肪性肝病活动分数(NAS)、脂肪变性等级、炎症等级、气胀和其纤维化阶段。仅在基线处获得患者人口统计数据，其中仅为45-48名患者提供人口统计数据。在手术程序之前，患者被安排饮食以鼓励术前减重。所测量的样品为血浆EDTA，它在CTX-III测量之前已经存储于-80℃下。
表10：代表基线处的减肥手术患者人口统计数据。
Figure BDA0003891118700000301
Figure BDA0003891118700000311
统计分析
通过应用单因素ANOVA(Kruskal-Wallis)、针对错误发现率进行校正，在健康血浆EDTA样品与来自减肥手术患者群组的血浆EDTA样品之间进行CTX-III水平的比较。结果显示为CTX-III水平中位数+四分位数间距(IQR)。所有统计分析均在GraphPad Prismv.8.2.0(Graph Pad Software,La Jolla,CA,USA)中进行。星号指示以下：*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；****：p<0.0001；ns＝无显著差异。
结果
CTX-III水平与NAFLD相关
当与健康人血浆EDTA供体(HD)的水平相比时，经受减肥手术的NAFLD患者在基线处(p<0.0001)和6个月随访时(p<0.001)的CTX-III水平显著较高(图4)。此外，基线(p<0.01)水平显著高于6个月随访时的水平(图)。
III型胶原蛋白的沉积
与患者在基线处相比，肥胖手术患者在6个月随访时，描绘III型胶原蛋白的净沉积的PRO-C3和CTX-III的比率显著升高(p<0.0001)(图5)
讨论
CTX-III分析的开发显示了区分HD和NAFLD患者的能力，包括基线水平与6个月随访水平之间的差异。
CTX-III水平与NAFLD相关
NAFLD是影响约四分之一人口的主要慢性肝病之一33，其主要原因之一是肥胖，导致脂肪在肝脏中积聚34。接着，这种积聚可以导致炎症级联的开始，并可能形成瘢痕组织，最终导致肝纤维化状态34。此处，包括III型胶原蛋白35和ECM相关交联酶LOXL236在内的ECM组分的过度积聚有助于疾病的进一步发展。因而，在一项对经受减肥手术的NAFLD患者进行的研究中，评估新型CTX-III标记物的潜力和生物相关性。通过测量在基线处和6个月随访时从NAFLD患者获得的血浆EDTA样品中的CTX-III水平，证明了在每个时间点各患者之间存在显著差异。此外，当比较NAFLD患者与HD的CTX-III水平时，经诊断患有NAFLD的患者在所有时间点均显示显著较高的生物标记物水平。这种增加的CTX-III标记物水平表明，减肥手术患者发生的纤维溶解的水平显著增加。与CTX-III组合，还测量了III型胶原蛋白形成的肝纤维化相关的PRO-C3生物标记物。组合这两个生物标记物测量值，可以测量III型胶原蛋白的净沉积。此处，从基线至6个月随访，沉积增加，表明从成熟交联III型胶原蛋白降解转变为组织内的新胶原蛋白形成。这些数据指示CTX-III标记物在区分患有已知活动性疾病的个体以及监测其随时间变化的CTX-III水平方面的潜力。CTX-III标记物无法基于患者的个体疾病分数，包括脂肪变性等级、炎症等级、气胀、BMI、纤维化阶段或NAS分数(数据未示)来区分患者。
实施例3 HCV相关肝纤维化
研究描述
共有158名经诊断患有丙型肝炎病毒(HCV)相关肝纤维化的患者在筛选时和52周后进行血液取样，其中所测量的样品材料为血浆EDTA。表11提供总患者群体的概述，而表12代表安慰剂组的47名患者。
表11：在筛选时经诊断患有HCV相关肝纤维化的患者的人口统计数据概述
HCV相关纤维化
Figure BDA0003891118700000331
表12：安慰剂组内的患者的人口统计数据概述，显示筛选时的数据
Figure BDA0003891118700000332
统计分析
根据所分析的组数来应用非参数t检验或单因素ANOVA(Mann-Whitney或Kruskal-Wallis)，由此在健康血浆EDTA样品与来自HCV相关肝纤维化患者群组的血浆EDTA样品之间进行CTX-III水平的比较。针对错误发现率校正数据。除非另外规定，否则结果显示为CTX-III或净纤维溶解中位数+四分位数间距(IQR)。从最低生物标记物水平开始至最高，生物标记物三分位数水平定义如下：第1个、第2个和第3个三分位数。所有统计分析均在GraphPadPrism v.8.4.3(Graph Pad Software,La Jolla,CA,USA)和MedCalc v.19.3(MedCalcSoftware Ltd,8400Ostend,Belgium)中进行。星号指示以下：*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；****：p<0.0001；ns＝无显著差异。
结果
根据呈现HCV相关肝纤维化的患者在筛选时的Ishak分数和他们的CTX-III水平，与健康供体的水平相比，对所述患者进行分层。与纤维化程度无关，与健康供体相比，呈现肝纤维化的患者在筛选时具有显著(p<0.0001)升高的CTX-III水平(图6)。
通过计算筛选时的净纤维溶解(CTX-III/PRO-C3)程度，利用Ishak分类发现呈现不同程度的纤维化的患者之间存在显著差异(图7.)。与分数为4-5的患者相比，Ishak分数为1-2的患者引起较高程度的净纤维溶解(p<0.05)。分数为3的患者的情况也是如此，其中与分数为4-5的患者相比，水平显著升高(p<0.05)
共有47名患者用安慰剂治疗持续52周，之后确定他们的Ishak分数。接着根据患者的Ishak分数从筛选至52周的变化对患者进行分层，并将其定义为具有回归、稳定或进行性纤维化表型。在筛选每个表型时对CTX-III水平绘图，发现与进行性表型相比，具有自发回归表型的患者的生物标记物水平显著升高(p<0.01)。此外，与进行性表型相比，那些呈现稳定纤维化表型的患者在筛选时显示显著较高的CTX-III水平(p<0.05)(图8A)。通过计算筛选时的净纤维溶解，考虑到患者表型之间存在更显著的差异，因为与进行性表型相比，具有回归表型的患者显示出显著较高的纤维溶解水平(p<0.001)，而在比较稳定表型与进行性表型时也是如此(p<0.01)(图8B)。
基于患者在筛选时的CTX-III水平或纤维溶解水平，以三分位数划分安慰剂组的患者，显示出与具有低初始CTX-III水平的患者(第1个三分位数)相比，在筛选时具有高CTX-III水平的患者(第3个三分位数)的Ishak分数显著降低(图9A)。观察基于净纤维溶解的Ishak分数变化，与第1个三分位数的患者相比，具有第3个三分位数的水平的患者呈现显著降低(p<0.001)。此外，与第1个三分位数相比，在筛选时具有第2个三分位数的纤维溶解水平的患者也呈现他们的Ishak分数的显著降低(p<0.01)(图9B)。
基于受试者工作特征(ROC)和其概括统计数据、Youden指数，针对筛选时的CTX-III和纤维溶解水平来确定回归纤维化表型的最佳截断值(表13)。与具有低于截断值的水平的患者相比，在筛选时>3.8ng/mL的CTX-III水平导致Ishak分数的显著降低(p<0.01)(图10A)。净纤维溶解也是如此，其中与呈现低纤维溶解水平的患者相比，交联III型胶原蛋白降解(CTX-III)与III型胶原蛋白形成(PRO-C3)的比率高于0.5的患者经历Ishak分数的显著降低(p<0.01)(图10B)。
表13：使用CTX-III水平或净纤维溶解程度的具体截断值作为筛选，并使用根据ROC曲线确定的相关值，来鉴定自发回归因子。
Figure BDA0003891118700000351
基于通过计算Youden指数所确定的截断水平对患者进行分层，随后的逻辑回归计算作为纤维化回归因子的优势比。这导致在筛选时具有≥3.8ng/mL的CTX-III水平的患者与呈现低于这一值的水平的患者相比，作为纤维化的自发回归因子的优势比高19.4倍(p＝0.0088)。观察患者纤维溶解水平，纤维溶解比率≥0.5，优势比增加至23.3(p＝0.0057)(图11)。
讨论
HCV纤维化中的III型胶原蛋白：
在纤维化进展期间，致病性细胞激活导致ECM内的胶原蛋白过度形成，尤其是I型、III型和V型的主要原纤维胶原蛋白。与胶原蛋白交联酶(诸如LOXL和TG)的增加相结合，原纤维胶原蛋白沉积增加和随后的交联导致组织硬化增加，从而引起组织破坏，这可能导致器官衰竭37。在HCV相关肝纤维化中，未经检查的病毒感染导致组织内稳态的丧失，从而导致慢性炎症，引起包括肿瘤生长因子-β1(TGF-β1)在内的数种炎症和纤维生成细胞因子的表达。纤维生成细胞因子的这种级联最终激活静止的肝星状细胞，使其转分化为肌成纤维细胞38。肌成纤维细胞构成纤维化的主要效应细胞，负责ECM产生并调节通过广泛的胶原蛋白交联和ECM收缩介导的基质硬度39。HCV相关肝纤维化中III型胶原蛋白的积聚先前已由生物标记物PRO-C3显示，所述生物标记物通过靶向III型胶原蛋白NH2前肽的高度敏感性单克隆抗体来量化III型胶原蛋白形成40,41。利用已知的PRO-C3与纤维生成表型的关系，研究纤维溶解与新生物标记物CTX-III之间的关联。与NAFLD中CTX-III水平的研究结果类似，与HD相比，罹患HCV相关纤维化的患者呈现升高水平的交联III型胶原蛋白降解。此外，在具有最低纤维化程度(Ishak分数1-2)的患者中观察到增加的纤维溶解水平，表明成熟交联III型胶原蛋白的纤维溶解增加以及III型胶原蛋白形成减少。这些数据指示交联纤维化ECM的蛋白水解上调，其中净纤维溶解能够基于纤维化程度区分患者。
纤维化消退：
虽然纤维化长期以来被视为不可逆的，但近年来对纤维化的理解已经发生了变化，现在认识到纤维化是纤维生成和纤维溶解的动态过程。随着新的抗纤维化治疗剂的开发，包括诸如LOXL2/342的靶，纤维化消退的最终目标即将实现。然而，为了优化临床管理，需要能够相应评估患者的高度敏感和特定的工具。ECM周转的血清学生物标记物可以为此提供一种非侵入性工具，正如先前通过PRO-C3生物标记物鉴定具有自发进行性纤维化表型的患者所证明的那样43,44。根据患者的纤维化表型在52周后是否回归、保持稳定或存在进展来划分患者，在筛选时，在回归与进行性表型之间观察到CTX-III和净纤维溶解水平的显著差异。这些数据表明，生物标记物具有预后潜力，其中与具有较低纤维溶解程度的患者相比，具有初始高水平的交联III型胶原蛋白降解(即，纤维溶解)的患者经历他们的纤维化ECM的自发消退。
回归因子的鉴定。疗法的后果
通过计算生物标记物的截断值，显示如何使这一探索性研究中在筛选时具有≥3.8ng/mL的CTX-III水平或≥0.5的纤维溶解水平的患者呈现回归表型的机会高19.4倍和23.3倍。生物标记物截断水平可在筛选时用于鉴定自发回归因子。与如通过生物标记物所确定具有低初始纤维溶解的患者相比，呈现纤维化ECM的自发消退的患者可能需要较低的治疗剂量。因此，这将导致试验期间更好的患者分层，降低费用，增加患者福利，并可能有助于治疗开发。
实施例4嗜酸细胞性食管炎
方法：
患者人口统计数据和临床评估
29名用消除饮食治疗的成年EoE患者被纳入分析。在基线处和干预后，通过内窥镜检查来评估吞咽困难和EREF总分。
表14显示在基线处和干预后EoE患者的基本患者人口统计数据，包括健康供体。人口统计数据包括年龄、性别、吞咽困难的存在和嗜酸细胞性食管炎参考分数(EREFS)总和。
Figure BDA0003891118700000371
统计分析
通过两组的Fischer精确检验或多组的卡方检验，确定在基线处和干预后患者的患者人口统计数据与临床参数之间的统计方差。
通过应用Kruskal-Wallis对非参数数据进行单因素ANOVA，计算EoE患者在两个时间点的血清CTX-III与健康供体之间的统计差异。低于0.05的p值被确定为具有统计显著性。
结果：
群组描述：
EoE患者与健康供体的平均年龄存在显著差异(p＝0.0039)，其中健康供体平均年长9岁。比较EoE患者在基线处和排除饮食后的EREF总分，观察到显著降低(p<0.0001)(表14)。
CTX-III生物标记物的诊断潜力，从而区分EoE患者与健康供体
与健康供体相比，血清CTX-III水平在基线处和消除饮食后(干预后)均显著升高(p<0.0001)。基线与干预后水平之间未显示显著差异(图12)。
讨论：
通过将CTX-III生物标记物应用于对29名在基线处和6周的消除饮食后进行血液取样的EoE患者以及健康供体进行的研究，证明EoE患者的血清CTX-III升高。位于间质基质中，在EoE的纤维化期间，III型胶原蛋白的沉积主要通过激活的肌成纤维细胞发生在上皮下层中[46,49]。在胶原蛋白成熟的最后步骤中，大量分泌的交联酶介导分子内和分子间交联的广泛形成。EoE患者的高度交联和病理性胶原蛋白基质能够启动健康供体成纤维细胞的肌成纤维细胞分化，突显了ECM在传播EoE相关纤维化方面的重要性[59]。由食管纤维化引起的临床症状的出现晚于上皮下纤维化的实际发作，其中对于每10年疾病持续时间，风险加倍[60]。因此，纤维化细胞外基质重塑的早期评估对于早期开始治疗至关重要[61]。此处，交联III型胶原蛋白的蛋白酶降解代谢物的量化显示了CTX-III生物标记物的诊断潜力。由于经诊断患有EoE的患者的血清CTX-III水平显著升高，所述生物标记物可以为EoE提供支持性诊断工具，并且也可能用作EoE的药效学标记物。尽管目前无法获得针对EoE的抗纤维化治疗或监测纤维狭窄发展或纤维化消退的标记物，但针对靶向EoE发病机制中的尤其关键促炎症细胞因子的治疗剂的研究仍在进行中。目前的治疗选择包括施用外用类固醇和消除饮食[62]。这两种疗法已证明食管嗜酸性粒细胞增多症的减少，但尚未证明纤维化的减少。
结论：
在目前的研究中，EoE患者被安排6周的消除饮食，这对血清CTX-III水平未造成任何显著影响。虽然利用短期饮食干预未观察到CTX-III生物标记物水平的变化，但EoE患者的蛋白酶降解和交联III型胶原蛋白水平显著升高，指示所述生物标记物在EoE相关纤维化的III型胶原蛋白重塑中的潜力。
实施例5-炎症性肠病
方法：
患者人口统计数据和病理学评估：
在血液取样时，根据CD的简单内窥镜分数(SES-CD)对患者进行内窥镜评估和评分。SES-CD分数为0-1的患者被确定为内窥镜下非活动性的，而分数>1的患者被确定为内窥镜下活动性的。另外，当无法获得SES-CD分数时，基于患者Harvey-Bradshaw指数(HBI)分数来确定非活动性或活动性疾病，所述分数是根据临床参数确定的。HBI分数为0-4表示患者患有非临床活动性疾病，而分数>4确定患者患有临床活动性疾病。
通过利用疾病行为的蒙特利尔分类将患者分为非狭窄性和非穿透性(B1)或狭窄性疾病行为(B2)，进一步对患者进行分层。蒙特利尔A1组的患者(发病年龄为16岁或以下的患者)和/或具有肛周疾病行为的蒙特利尔B4分类的患者被排除在分析之外。
表15：根据内窥镜或临床疾病活动以及内窥镜疾病行为对患者人口统计数据和分层进行的概述。
Figure BDA0003891118700000391
Figure BDA0003891118700000401
未确定(ND)；非显著性，p>0.05(NS)
统计学分析：
通过Fischer精确检验来确定B1和B2蒙特利尔分类患者的患者人口统计数据与病理学参数之间的统计方差。
根据比较组的数目来应用t检验或单因素ANOVA，由此在健康供体与经诊断患有CD或溃疡性结肠炎(UC)的患者之间对血浆CTX-III或净纤维溶解(log(CTX-III/PRO-C3))进行评估。通过Kruskal-Wallis来进行非参数单因素ANOVA并对非参数和参数数据进行Mann-Whitney或非配对t检验，由此计算统计方差。低于0.05的p值被确定为具有统计显著性。
结果：
患者人口统计数据和病理学评估
与B2患者的数目相比，B1组的患者的统计数目较高(p＝0.008)。B1患者的年龄显著小于具有B2分类的患者(p＝0.0118)。此外，与B2患者相比，具有B1分类的患者中呈现肛周表现(B4)的患者的数目显著较高(p＝0.0026)。剩余人口统计数据与病理学参数之间未显示显著差异。
患有慢性肠道炎症的患者的血浆CTX-III增加
与健康供体相比，CD和UC患者显示显著较高的血浆CTX-III水平(p<0.0001)。CD患者与UC患者之间未发现统计学差异(图13)。
通过血浆CTX-III的量化来区分管腔和狭窄性疾病表现
在呈现非活动性疾病以及非狭窄性和非穿透性疾病(B1)行为的CD患者中，血浆CTX-III显著升高。与具有狭窄性疾病(B2)表现的患者相比，所述水平升高(p<0.01)(图14A)。另外，当与患有狭窄性疾病(B2)的患者相比时，通过计算净交联纤维溶解(log(CTX-III/PC3X))或净纤维溶解(log(CTX-III/PRO-C3))，非狭窄性和非穿透性疾病(B1)患者显示较高的纤维溶解水平(p<0.05，和p<0.01)(图14B+C)。
讨论：
在本研究中，通过量化交联III型胶原蛋白(CTX-III)的蛋白酶降解代谢物的水平以及由CTX-III/PC3X比率量化净交联纤维溶解或由CTX-III/PRO-C3比率量化净纤维溶解来研究IBD患者的纤维溶解程度。本研究中的主要发现如下：1)当与健康供体相比时，IBD患者的CTX-III生物标记物水平显著升高(图13)，以及2)量化CTX-III或交联或非交联净纤维溶解水平(log(CTX-III/PC3X或PRO-C3))可以区分呈现管腔或结构性疾病行为的临床缓解患者(图14)。
IBD的特征性慢性炎症维持病理伤口愈合的激活，被视为广泛ECM重塑的关键驱动因素。与健康个体相比，发现CD患者的原纤维胶原蛋白表达显著升高[70]，其中组织学评估显示，从粘膜下层至粘膜肌层的肠道不同组织层中存在过度沉积[68]。此外，炎症细胞和激活的成纤维细胞产生增加的量的MMP，导致胶原蛋白降解增加，在严重情况下可导致瘘管形成。
Haaften等人[71]的早期研究表明，III型胶原蛋白生物标记物的使用反映了MMP介导的降解和形成，基于对疾病行为的内窥镜评估来区分CD患者。患有狭窄性疾病的患者引起胶原蛋白形成标记物的水平增加，反映组织内的胶原蛋白过度沉积，而患有穿透性疾病的患者的胶原蛋白降解增加[71]。
此处，通过量化交联III型胶原蛋白的蛋白水解代谢物，并评估呈现非狭窄和非穿透性疾病行为(B1)的患有非活动性疾病的CD患者的整体净纤维溶解，显示了纤维溶解的水平增加。与患有狭窄性疾病(B2)的患者相比，这些患者可能被视为呈现不太严重的疾病表现，并且与非活动性疾病相结合，也表明活动性炎症的程度较低。CD患者的间质基质中沉积的原纤维胶原蛋白的分子内和分子间交联的酶促形成代表胶原蛋白成熟的最后一步。因此，交联III型胶原蛋白的蛋白水解降解将引起成熟胶原蛋白原纤维的纤维溶解。患有狭窄性疾病的患者呈现大量的胶原蛋白形成，从而导致狭窄形成，与广泛的胶原蛋白交联相结合可能抑制蛋白水解降解。在目前的研究中，随着纤维溶解水平的降低，将观察到这一点。因此，在患有非狭窄性和非穿透性疾病的患者中，III型胶原蛋白沉积有所增加，但可能交联程度较小，病理性III型胶原蛋白的降解和清除有所增加。因此，可以通过使用CTX-III生物标记物以及与PC3X或PRO-C3的净纤维溶解比率来量化非狭窄性和非穿透性与狭窄性疾病之间III型胶原蛋白重塑的分子过程的这些差异。
由于肠纤维化的内窥镜检查和组织学评估的局限性，包括反映真正纤维化的生物标记物(诸如CTX-III)在临床设置中可能是有益的。通过利用最小侵入性生物标记物在分子层面上评估III型胶原蛋白重塑，可以提供支持内窥镜检查和组织学的数据。生物标记物可以鉴定亚临床疾病行为，以及提供治疗反应的亚临床信息。随着CD纤维狭窄的治疗剂的进展，诸如CTX-III的生物标记物可以用于评估纤维化消退。
结论：
所提供的数据显示，蛋白水解活性程度增加，从而将III型胶原蛋白的交联代谢物释放至IBD患者的循环中。与健康个体相比，CD和UC患者均显示出这一点。另外，基于处于内窥镜和/或临床缓解中(非活动性)对CD患者进行分层，随后根据蒙特利尔分类的非狭窄性和非穿透性(B1)或狭窄性疾病(B2)行为进行分层。此处，与具有B2分类的患者相比，B1蒙特利尔分类患者显示最高的纤维溶解程度。
实施例6-癌症
方法：
如上文所述进行分析程序。这些分析包括CTX-III和PRO-C3。
群组包括20名患者，各患者患有胰腺癌、结直肠癌、肾癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、黑素瘤、头颈癌和前列腺癌。它还包括3名肝癌患者和33名健康对照。所有癌症样品均获自Proteogenex(Los Angeles,CA,USA)并且健康对照获自BioIVT(Westbury,NY,USA)。
表16群组人口统计数据
Figure BDA0003891118700000431
Figure BDA0003891118700000441
Figure BDA0003891118700000451
CRC：结直肠癌
头颈：头颈癌
结果：
癌症中交联Ⅲ型胶原蛋白的蛋白酶降解片段的血液水平
当与健康个体相比时，健康个体和经诊断患有癌症的患者的血清CTX-III在十二种癌症类型中的七种中显示出显著升高的水平。发现膀胱癌(p<0.01)、乳腺癌(p<0.05)、CRC(p<0.001)、肾癌(p<0.05)、肺癌(p<0.05)、胰腺癌(p<0.05)和胃癌(p<0.05)中的生物标记物水平升高。
与健康个体相比，患有头颈癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌和黑素瘤的患者未显示显著升高的CTX-III水平(p>0.05)。然而，与健康个体相比，所有12种癌症类型的中位数CTX-III水平均升高，其中肝癌显示最高中位数水平11.96(表1)。
III期乳腺癌与增加的纤维溶解相关
当根据癌症阶段对乳腺癌患者进行分层时，观察到与II期患者相比，III期乳腺癌患者的CTX-III水平显著升高(p<0.001)。另外，通过利用CTX-III和PRO-C3的比率计算净纤维溶解程度，观察到与II期相比，III期患者的净纤维溶解水平显著较高(p<0.05)(图16)。
讨论
对CTX-III生物标记物在评估交联III型胶原蛋白的蛋白水解降解程度以及各种癌症类型中的净纤维溶解方面的潜力的研究产生以下结果：1)与健康个体相比，CTX-III水平在十二种癌症类型中的七种中显著升高，以及2)与II期患者相比，III期乳腺癌患者呈现较高的血清CTX-III和净纤维溶解。
而健康个体将经历平衡ECM重塑，其中旧的胶原蛋白被降解和替换，从而维持组织内稳态，这一过程在肿瘤间质中严重扭曲。在肿瘤间质中，诸如CAF的细胞主要通过I型胶原蛋白以及II、III、V和XI型的沉积和交联来驱动日益坚硬的ECM的形成。基质硬度增加的一个主要原因是由LOXL(L)和TG2[80]的酶作用介导的原纤维胶原蛋白内的分子内和分子间交联的量。
CTX-III新表位中嵌入的Lys被认为参与LOX(L)介导的交联[81]，由此允许对III型胶原蛋白的蛋白水解降解后释放的交联片段进行具体量化。因而，增加的CTX-III生物标记物水平将指示增加的MMP释放、III型胶原蛋白沉积和表征肿瘤基质的LOX(L)介导的交联。
与这一理论一致，在当前研究中观察到增加的CTX-III生物标记物水平，在所述研究中，生物标记物可以区分健康个体与癌症患者，从而鉴定具有潜在病理降解和III型胶原蛋白交联的个体。然而，在所研究的12种癌症类型中，头颈癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌和黑素瘤未显示显著高于健康个体的纤维溶解水平的纤维溶解水平。尽管当前研究中的水平与健康个体的CTX-III水平并无统计学不同，观察到癌症患者的中位数CTX-III有所增加。这指示这些患者的交联III型胶原蛋白的蛋白水解降解程度总体升高。缺乏统计差异可能是由于样品量有限，对只有三名患者的肝癌患者进行观察时尤其如此。
此外，在乳腺癌晚期，CTX-III生物标记物水平和净纤维溶解(CTX-III/PRO-C3)的总体程度均升高。这些数据指示CTX-III生物标记物在癌症患者诊断中的应用，以及生物标记物根据患者的疾病严重程度对患者进行分层的潜在能力。在III期与IV期乳腺癌患者之间观察到在纤维溶解方面存在显著差异。
Christina Jensen等人最近的一项研究指示，靶向交联胶原蛋白片段来评估癌症患者的病理性胶原蛋白重塑。此处，研究人员在肝细胞癌的研究中研究了基于血液的生物标记物PC3X以及PRO-C3生物标记物[82]。虽然PRO-C3量化了III型胶原蛋白的交联和非交联N端前肽，反映了III型胶原蛋白的形成，但PC3X生物标记物特别靶向交联N端前肽。与PRO-C3相比，肝细胞癌患者的PC3X水平指示增加的交联III型胶原蛋白水平，支持肿瘤基质中的胶原蛋白交联量的增加。
近年来，胶原蛋白的酶交联在癌症治疗领域内已引起关注[83]。如所述，诸如LOX(L)和TG2的酶驱动交联量的增加，但交联的生物化学性质也至关重要。特别是细胞内和细胞外表达的赖氨酰羟化酶2的酶作用已显示出促进转移并且降低存活。LH2介导胶原蛋白α链内的具体Lys的羟基化，从而产生更高程度的Lys羟基化衍生的交联。由于在控制基质硬度并由此促进肿瘤进展方面的重要机制作用，LOXL2和LH2已被鉴定为未来的治疗选择的靶[84]。
因此，利用具体靶向交联胶原蛋白代谢物的基于血液的生物标记物可以提供反映CAF活性和交联酶的酶活性的定量量度。在临床设置中，所述生物标记物可以潜在地用于诊断和预后目的，从而基于纤维溶解的程度来分离患者，并鉴定将受益于靶向胶原蛋白交联的治疗选择的患者。
结论：
在12种癌症类型中，反映纤维溶解的交联III型胶原蛋白的蛋白水解片段被证明经释放并可量化，确诊与健康个体相比，所有癌症类型的中位数水平均升高。尽管在癌症患者中升高，仅在七种癌症类型中发现CTX-III水平显著升高。此外，交联III型胶原蛋白纤维溶解的量化允许区分II期或III期乳腺癌患者，其中水平升高与晚期乳腺癌相关。
可以得出结论，CTX-III生物标记物可用于量化蛋白水解降解后释放至循环中的交联III型胶原蛋白片段，由此使它应用于癌症患者的临床设置中。
概述
已经证明了能够测量III型胶原蛋白的交联片段的高度新表位特异性ELISA的开发和验证。所述分析能够区分HD与罹患NAFLD的肥胖患者、HD与肝纤维化患者、HD与EoE患者、HD与慢性肠病患者以及HD与癌症患者，说明CTX-III标记物在已知III型胶原蛋白积聚和交联酶水平增加的病理学中作为疾病标记物的相关性。
此外，CTX-III生物标记物和使用PRO-C3生物标记物计算的净纤维溶解比率(CTX-III/PRO-C3)表明HCV相关肝纤维化水平升高，能够根据患者的自发纤维化表型区分患者。净纤维溶解的计算也能够根据患者的慢性肠病(尤其是克罗恩氏病)和癌症(诸如乳腺癌)的疾病严重程度来区分患者。因此，CTX-III生物标记物和相关的净纤维溶解比率不仅能够鉴定患有HCV相关肝纤维化、慢性肠病或癌症的患者，还可以用作预后生物标记物，从而潜在地预测筛选时的反应。
在本说明书中，除非另有明确指示，否则‘或’一词在运算符的意义上使用，即当满足所述条件中的任一个或两个时，返回真值，与运算符‘独占或’要求仅满足一个条件相反。‘包含’一词在‘包括’的意义上使用，而不是指‘由......组成’。上文所承认的所有先前的教导均由此以引用的方式并入。本文中对任何先前公布的文件的承认均不应视为承认或声明在本文件发布之日，其教导是澳大利亚或其他地方的公知常识。
本文引用以下参考文献：
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Figure BDA0003891118700000531
C.L.Hvas,A.-C.Bay-Jensen,M.A.Karsdal,P.Olinga,T.Manon-Jensen,G.Dijkstra,SerologicalBiomarkers of Tissue Turnover Identify Responders to Anti-TNF Therapy inCrohn’s Disease:A Pilot Study.,Clin.Transl.Gastroenterol.11(2020)e00217.https://doi.org/10.14309/ctg.0000000000000217.
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Figure BDA0003891118700000561
S.Santoro,D.Sheinson,J.Hung,J.M.Giltnane,A.A.Pierce,K.Mesh,S.Lianoglou,J.Riegler,R.A.D.Carano,P.Eriksson,M.
Figure BDA0003891118700000562
L.Somarriba,D.L.Halligan,M.S.Van Der Heijden,Y.Loriot,J.E.Rosenberg,L.Fong,I.Mellman,D.S.Chen,M.Green,C.Derleth,G.D.Fine,P.S.Hegde,R.Bourgon,T.Powles,TGFβattenuates tumour response to PD-L1 blockade bycontributing to exclusion of T cells,Nature.554(2018)544-548.https://doi.org/10.1038/nature25501.
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序列表
<110> 北欧生物科技公司
M·卡斯达尔
J·H·莫滕森
M·佩尔松
D·J·利明
M·J·菲斯克
T·马农-詹森
<120> 纤维化的生物标记物
<130> P21111WO
<150> GB2017987.5
<151> 2020-11-16
<150> GB2005564.6
<151> 2020-04-16
<160> 23
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
Lys Ala Gly Gly Phe Ala Pro Tyr Tyr Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> 其中X表示任何氨基酸
<400> 2
Lys Ala Gly Gly Phe Ala Pro Tyr Tyr Gly Xaa
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> 其中X表示III型胶原蛋白序列的一个或多个氨基酸
或其中X不存在
<400> 3
Lys Ala Gly Gly Phe Ala Pro Tyr Tyr Gly Asp Xaa
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
Lys Ala Gly Gly Phe Ala Pro Tyr Tyr Gly Asp
1 5 10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Lys Ala Gly Gly Phe Ala Pro Tyr Tyr
1 5
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 6
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 7
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 8
Met Gln His Leu Glu Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 9
Asp His Gly Met His
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 10
Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ala Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 11
Ser Met Gly Gly Asn Tyr Val Gly Thr Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 12
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg
20 25 30
Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
35 40 45
Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
50 55 60
Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Phe Pro Leu Thr
65 70 75
<210> 13
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 13
Asp His Gly Met His Trp Val Lys Gln Ser Gln Ala Lys Ser Leu Glu
1 5 10 15
Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ala Thr Tyr Asn Gln
20 25 30
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr
35 40 45
Ala Tyr Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr
50 55 60
Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Gly Asn Tyr Val Gly Thr Gly Phe Ala
65 70 75 80
Tyr
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly His Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Gly Met His Trp Val Lys Gln Ser Gln Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ala Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Met Gly Gly Asn Tyr Val Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 交联
<222> 1
<223> 肽通过N端二硫桥均二聚化
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
Cys Lys Ala Gly Gly Phe Ala Pro Tyr Tyr Gly
1 5 10
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 交联
<222> 1
<223> 肽通过N端二硫桥均二聚化
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
Cys Lys Ala Gly Gly Phe Ala Pro Tyr Tyr Gly Asp
1 5 10
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 交联
<222> 1
<223> 肽通过N端二硫桥均二聚化
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Cys Lys Ala Gly Gly Phe Ala Pro Tyr Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly His Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Gly Met His Trp Val Lys Gln Ser Gln Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ala Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Met Gly Gly Asn Tyr Val Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro
115 120 125
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser
130 135 140
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val
180 185 190
Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His
195 200 205
Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro
210 215 220
Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu
245 250 255
Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu
275 280 285
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser
305 310 315 320
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val
355 360 365
Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val
370 375 380
Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg
405 410 415
Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val
420 425 430
Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg
435 440 445
Thr Pro Gly Lys
450
<210> 20
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu
210 215
<210> 21
<211> 48
<212> PRT
<213> 家鼠(Rattus)
<400> 21
Gly Ala Ala Ile Ala Gly Val Gly Gly Glu Lys Ser Gly Gly Phe Ser
1 5 10 15
Pro Tyr Tyr Gly Asp Asp Pro Met Asp Phe Lys Ile Asn Thr Glu Glu
20 25 30
Ile Met Ser Ser Leu Lys Ser Val Asn Gly Gln Ile Glu Ser Leu Ile
35 40 45
<210> 22
<211> 49
<212> PRT
<213> 鼠科(Muridae)
<400> 22
Gly Ala Ala Ala Ile Ala Gly Val Gly Gly Glu Lys Ser Gly Gly Phe
1 5 10 15
Ser Pro Tyr Tyr Gly Asp Asp Pro Met Asp Phe Lys Ile Asn Thr Glu
20 25 30
Glu Ile Met Ser Ser Leu Lys Ser Val Asn Gly Gln Ile Glu Ser Leu
35 40 45
Ile
<210> 23
<211> 50
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
Val Gly Ala Ala Ala Ile Ala Gly Ile Gly Gly Glu Lys Ala Gly Gly
1 5 10 15
Phe Ala Pro Tyr Tyr Gly Asp Glu Pro Met Asp Phe Lys Ile Asn Thr
20 25 30
Asp Glu Ile Met Thr Ser Leu Lys Ser Val Asn Gly Gln Ile Glu Ser
35 40 45
Leu Ile
50

Claims (37)

1.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性识别并结合至具有C端氨基酸序列KAGGFAPYYG(SEQ ID NO:1)的肽。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是针对具有C端氨基酸序列KAGGFAPYYG(SEQ ID NO:1)的合成肽产生的单克隆抗体。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的单克隆抗体，其中所述抗体不特异性识别或结合至具有C端氨基酸序列KAGGFAPYYGX(SEQ ID NO:2)的肽，其中X表示任何氨基酸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体不特异性识别或结合至具有C端氨基酸序列KAGGFAPYYGD(SEQ ID NO:4)的肽。
5.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体不特异性识别或结合至具有C端氨基酸序列KAGGFAPYY(SEQ ID NO:5)的肽。
6.一种用于检测生物样品交联CT-III的夹心免疫分析，所述交联CT-III包含通过链间交联接合在一起的至少两条CT-III链，所述方法包括：
使包含所述交联CT-III的所述生物样品与结合至表面的第一单克隆抗体接触，其中所述交联CT-IIII中包含的每一条CT-III链均包含通过完整III型胶原蛋白的C-蛋白酶裂解生成的CT-III的C端新表位；
添加第二单克隆抗体；以及
确定所述第二单克隆抗体的结合量；
其中所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体均与所述CT-III的C端新表位特异性反应，所述新表位包含在C端氨基酸序列KAGGFAPYYG-COOH(SEQ ID NO:1)中。
7.根据权利要求6所述的夹心免疫分析，其中所述单克隆抗体是根据权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗体。
8.根据权利要求6或7所述的夹心免疫分析，其中所述夹心免疫分析用于量化生物样品中的交联CT-III的量。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的夹心免疫分析，其中所述生物样品是生物流体。
10.根据权利要求9所述的夹心免疫分析，其中所述生物流体是血清、血浆、尿液、羊水、组织上清液或细胞上清液。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的夹心免疫分析，其中所述夹心免疫分析是放射免疫分析、荧光免疫分析或酶联免疫吸附分析。
12.根据权利要求6至11中任一项所述的夹心免疫分析，其中所述第二单克隆抗体是标记的。
13.根据权利要求12所述的夹心免疫分析，其中所述第二单克隆抗体是酶联抗体。
14.根据权利要求13所述的夹心免疫分析，其中所述酶是辣根过氧化物酶(HRP)。
15.根据权利要求14所述的夹心免疫分析，其中所述第二单克隆抗体经放射性标记或连接至荧光团。
16.根据权利要求6至10中任一项所述的夹心免疫分析，其中使用识别所述第二单克隆抗体的进一步标记抗体来确定所述第二单克隆抗体的结合量。
17.根据权利要求8至16中任一项所述的夹心免疫分析，所述夹心免疫分析还包括使通过所述方法确定的交联CTIII的量与已知疾病严重程度的标准疾病样品相关联，以评估疾病的严重程度。
18.根据权利要求8至16中任一项所述的夹心免疫分析，所述夹心免疫分析还包括量化所述生物流体样品中存在的PRO-C3的量，
确定交联III型胶原蛋白(CTX-III)与III型胶原蛋白的N端前肽(PRO-C3)的比率。
19.根据权利要求18所述的夹心免疫分析，所述夹心免疫分析还包括使通过所述方法确定的交联III型胶原蛋白(CTX-III)与III型胶原蛋白的N端前肽(PRO-C3)的比率与已知疾病严重程度的标准疾病样品相关联，以评估疾病的严重程度。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的夹心免疫分析，其中所述疾病是纤维化疾病。
21.根据权利要求20所述的夹心免疫分析，其中所述纤维化疾病是肝病。
22.根据权利要求21所述的夹心免疫分析，其中所述肝病是非酒精性脂肪性肝病或HCV相关肝病。
23.根据权利要求17至19中任一项所述的夹心免疫分析，其中所述疾病是慢性肠病或癌症。
24.根据权利要求23所述的夹心免疫分析，其中所述慢性肠病是克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。
25.根据权利要求23所述的夹心免疫分析，其中所述癌症是乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌或黑素瘤。
26.一种用于评估靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的拮抗药物的功效的方法，其中所述方法包括使用根据权利要求6至16中任一项所述的夹心免疫分析来量化至少两个生物样品中的交联CT-III的量，所述生物样品已在向受试者施用所述拮抗药物的时期中的第一时间点和至少一个后续时间点从所述受试者获得，并且其中在施用所述拮抗药物的时期中的所述第一时间点至所述至少一个后续时间点交联CT-III的量的减少指示它是靶向LOX的有效拮抗药物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述方法评估靶向LOXL2的拮抗药物的功效。
28.一种用于夹心分析的试剂盒，所述试剂盒包括：
固体载体，其结合根据权利要求1所述的第一单克隆抗体；和
根据权利要求1所述的第二单克隆抗体，所述第二单克隆抗体包含标记。
29.一种鉴定纤维化患者的纤维化反应表型的方法，所述方法包括使用根据权利要求86至19中任一项所述的夹心免疫分析来量化从所述患者获得的生物流体样品中的交联CT-III的量，和使所述交联CT-III与i)与已知纤维化反应表型相关的值和/或ii)预定截断值相关联。
30.根据权利要求29所述的方法，所述方法还包括量化所述生物流体样品中存在的III型胶原蛋白的N端前肽(PRO-C3)的量，
确定交联III型胶原蛋白(CTX-III)与III型胶原蛋白的N端前肽(PRO-C3)的比率，以及使所述交联III型胶原蛋白(CTX-III)与III型胶原蛋白的N端前肽(PRO-C3)的比率与预定截断值相关联。
31.根据权利要求29或权利要求30所述的方法，其中所述截断值为至少3.8ng/mL的交联CT-III和/或交联III型胶原蛋白(CTX-III)与III型胶原蛋白的N端前肽(PRO-C3)的比率为至少0.5。
32.一种鉴定患有嗜酸细胞性食管炎的患者的方法，所述方法包括使用根据权利要求8至19中任一项所述的夹心免疫分析来量化从所述患者获得的生物流体样品中的交联CT-III的量，和使所述量的交联CT-III与i)与已知嗜酸细胞性食管炎患者和/或正常健康对照相关的值和/或ii)预定截断值相关联。
33.一种鉴定患有慢性肠病的患者的方法，所述方法包括使用根据权利要求8至19中任一项所述的夹心免疫分析来量化从所述患者获得的生物流体样品中的交联CT-III的量，和使所述量的交联CT-III与i)与已知患有慢性肠病的患者和/或正常健康对照相关的值和/或ii)预定截断值相关联。
34.一种鉴定癌症患者的方法，所述方法包括使用根据权利要求8至19中任一项所述的夹心免疫分析来量化从所述患者获得的生物流体样品中的交联CT-III的量，和使所述量的交联CT-III与i)与已知癌症患者和/或正常健康对照相关的值和/或ii)预定截断值相关联。
35.一种鉴定患有纤维化疾病的患者的方法，所述方法包括使用根据权利要求8至19中任一项所述的夹心免疫分析来量化从所述患者获得的生物流体样品中的交联CT-III的量，和使所述量的交联CT-III与i)与已知纤维化疾病患者和/或正常健康对照相关的值和/或ii)预定截断值相关联。
36.一种鉴定将受益于治疗的患者的方法，所述方法包括使用根据权利要求8至19中任一项所述的夹心免疫分析来量化从所述患者获得的生物流体样品中的交联CT-III的量，和使所述量的交联CT-III与i)与已知疾病患者和/或正常健康对照相关的值和/或ii)预定截断值相关联。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述治疗包括施用靶向胶原蛋白交联的药物。
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