ES2229805T3 - Ensayos de resorcion de cartilago. - Google Patents
Ensayos de resorcion de cartilago.Info
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Abstract
Procedimiento para el análisis de una muestra de un fluido corporal respecto a la presencia de un analito que indique una situación fisiológica, que comprende las etapas de poner en contacto de la muestra del fluido corporal con un anticuerpo que se une al analito, detectar la unión del anticuerpo en la muestra del fluido corporal, y correlacionar cualquier unión que se haya detectado con la situación fisiológica, caracterizado porque dicho procedimiento comprende poner en contacto una muestra sérica con un anticuerpo que se une a pero no a donde K-K-K es hidroxilisil piridinolina o lisil piridinolina, y correlacionar cualquier unión que se haya detectado con la resorción in vivo del colágeno de tipo II no mineralizado.
Description
Ensayos de resorción de cartílago.
La invención se refiere a ensayos para la
detección de analitos telopeptídicos reticulados que indican la
resorción in vivo del colágeno de tipo II (cartílago), y en
particular proporciona inmunoensayos para la medición y la
posibilidad de distinguir entre la resorción del cartílago no
mineralizado y la del mineralizado, y para la medición de la
resorción total in vivo del cartílago.
Se hace referencia a las patentes anteriores U.S.
nº 4.973.666, nº 5.140.103, nº 5.300.434, nº 5.320.970, nº
5.817.755 y nº 5.702.909 de los solicitantes.
Se conocen inmunoensayos para la detección de
analitos telopeptídicos que indican la resorción in vivo del
colágeno. Ejemplos de dichos ensayos del colágeno de tipo I para la
medición de la resorción ósea incluyen los documentos: WO 89/04491
(Eyre); WO 89/12824 (Robins); WO 91/08478 (Eyre); EP 0505210 A2
(Risteli & Risteli); WO 92/21698 (Eyre); WO 94/03813 (Naser
et al); WO 94/14844 (Baylink); WO 95/04282 (Naser et
al); WO 95/08115 (Qvist & Bonde); WO 96/12193 (Bonde &
Qvist); EP 0718309 A1 (Naser et al); y WO 96/36645 (Eyre
et al).
Ejemplos de los ensayos telopeptídicos del
colágeno de tipo II para la medición de la resorción del cartílago
incluyen los documentos WO 91/08478 (Eyre); WO 95/08115 (Qvist
& Bonde); y WO 96/12193 (Bonde & Qvist).
Ejemplos de los ensayos telopeptídicos del
colágeno de tipo III incluyen los documentos WO 88/08980 (Risteli
& Risteli) y WO 91/08478 (Eyre).
El contenido de las siguientes patentes son
también de interés: patente U.S. nº 4.628.027 (Gay) da a conocer
procedimientos de diagnóstico in vitro utilizando
anticuerpos monoclonales contra proteínas del tejido conjuntivo. La
patente nº US 5.316.914 (Oshima et al) da a conocer un
inmunoensayo enzimático sándwich de los colágenos humanos de tipo
II, IV y VI aplicable al diagnóstico de las enfermedades hepáticas.
La patente WO 94/14070 (Poole & Hollander) da a conocer un
inmunoensayo para la medición de la fragmentación del colágeno en
el cartílago. La patente WO 94/18563 (Barrach et al) da a
conocer procedimientos de inmunoensayo sándwich para la detección de
los péptidos derivados del colágeno de tipo II asociados con la
artritis.
Resulta de particular interés la publicación
internacional anterior de los solicitantes, WO 91/0478, que da a
conocer los siguientes productos de resorción urinaria del colágeno
de tipo II:
en los que los paréntesis indican
residuos aminoácidos opcionales, y el residuo de reticulación que se
muestra como Hyl-Hyl-Hyl es
hidroxilisil piridinolina (HP), un residuo natural de
3-hidroxipiridinio que se encuentra en las fibrillas
del colágeno maduro de varios tejidos. Estos analitos derivan del
dominio C-terminal del telopéptido de reticulación
del colágeno de tipo II y, así, se hace referencia a ellos
colectivamente en la presente memoria como
"col2CT".
La presente memoria también adopta la forma
simbólica de "una letra" del aminoácido taquigráfico; así, a
los componentes telopeptídicos
Glu-Hyl-Gly-Pro-Asp-(Pro)-(Leu)
de los analitos que se han mostrado anteriormente se hará
referencia en lo sucesivo como EKGPD (SEC. ID. nº:1), EKGPDP (SEC.
ID. nº:2) y EKGPDPL (SEC. ID. nº: 3). Además, tal como se utiliza
en la presente memoria, el símbolo "K" representa lisina, en el
caso de los péptidos lineales, o un residuo
3-hidroxipiridinio de reticulación, seleccionado
entre la hidroxilisil piridinolina (HP) y la lisil piridinolina
(LP).
El solicitante y sus colaboradores han descrito
también col2CTx en un reciente resumen:
Eyre et al., Bone Miner. Res.
11(S1):S413, 1996, describe telopéptidos reticulados de los
tipos I, II y III del colágeno en la orina humana.
Atley et al., Arth. Rheum. 40 (9S):584,
1997, informa que RS-130830, un inhibidor selectivo
de la colagenasa-3, bloquea la liberación de
hidroxiprolina y un neoepítopo específico (col2CTx) de una
metaloproteinasa (MMP), del cartílago bovino expuesto a
IL-1\alpha.
Artley et al., Trans. Orthop. Res. Soc.,
New Orleans, 1998, informa de la liberación mediada por la
metaloproteinasa matricial de telopéptidos inmunorreactivos a
partir del colágeno tipo II del cartílago. El objetivo de este
estudio fue evaluar si un inmunoensayo basado en un anticuerpo
monoclonal (mAb) 2B4, que reconoce un dominio del componente
telopeptídico \alpha1(II)C-EKGPDP,
mide los productos de fragmentación de MMP en el cartílago.
Haciendo referencia a la Figura 1, mAb 2B4 reconoce el producto
in vitro de la digestión de la matrilisina AFAGLGPREKGPDP
(SEC.ID. NO:4) del péptido sintético AFAGLGPREKGPDPLQYMRA (SEC.ID.
NO:5), pero no AFAGLGPREKGPDPLQ (SEC.ID.NO:6), AFAGLGPREKGPDPLQY
(SEC.ID.NO:7), LQYMRA (SEC.ID.NO:8), ó YMRA (SEC.ID.NO:9). Los
autores también se dieron cuenta de la detección de
inmunorreactividad mAb 2B4 en el líquido sinovial, suero y orina.
Concluyeron que este epítopo 2B4 posee el potencial de constituir un
marcador útil de la resorción del colágeno de tipo II in
vivo.
Moskowitz et al., Amer.Coll. Rheum., San
Diego, CA, 8-12 nov, 1998, informa de que el
epítopo 2B4 del C-telopéptido del colágeno de tipo
II constituye un marcador para la resorción del cartílago en la
osteoartrosis familiar.
Eyre et al., 6^{th} International
Meeting on Chemistry and Biology of Mineralized Tissues, Vittel,
Francia, septiembre 1998, toma en consideración los marcadores
bioquímicos del hueso y la degradación del colágeno, incluyendo un
producto telopeptídico reticulado de la degradación del colágeno II
en la orina (col2CTx).
Atley et al., Third Combined Orthopaedic
Research Societies Meeting, Hamamatsu, Japón, septiembre 1998, toma
en consideración los telopéptidos reticulados del colágeno de tipo
II, unos marcadores prometedores para la degradación del cartílago
en la artritis.
Además, se informa de que los anticuerpos
monoclonales para el C-telopéptido del colágeno de
tipo II como marcadores diagnósticos para la artritis reumatoide,
están desarrollándose en Osteometer Biotech A/S. BioWorld
International, página 3, 3 diciembre, 1997.
La invención proporciona ensayos para la medición
de la resorción in vivo del colágeno II (cartílago). Los
inmunoensayos objeto (de la invención) son útiles para distinguir
entre la resorción del cartílago no mineralizado y del
mineralizado, y para la medición de la resorción total in
vivo del cartílago.
Los inmunoensayos que se dan a conocer utilizan
uno o una combinación de dos anticuerpos. Un primer anticuerpo se
une a DEKAGGA (SEC. ID. nº:21) pero no a GGFDEKAGGAQLG (SEC.ID.
NO:27), donde los símbolos K se refieren a residuos de lisina y/o
preferentemente a residuos 3-hidroxipiridinio de
reticulación. La medición de la unión del analito al primer
anticuerpo en el suero, proporciona una indicación de una resorción
in vivo del cartílago no mineralizado.
Un segundo anticuerpo se une a GGFDEKAGGAQLG pero
no a DEKAGGA, donde los símbolos K se refieren también
preferentemente a residuos de 3-hidroxipiridinio de
reticulación. La medición de la unión del analito al segundo
anticuerpo en el suero, proporciona una indicación de la resorción
in vivo del cartílago mineralizado.
Una indicación de la resorción total in
vivo del cartílago (no mineralizado y mineralizado) es
proporcionada por la medición de la unión de los analitos al primer
anticuerpo en la orina, o por la de la unión total de los analitos
al primer y segundo anticuerpos en el suero.
Los marcadores objeto del cartílago se miden
preferentemente de modo conjunto con los marcadores de la resorción
del colágeno óseo, seleccionados a partir de los telopéptidos
amino-terminales del colágeno de tipo I, de los
telopéptidos carboxi-terminales del colágeno de
tipo I, y de las reticulaciones libres de la lisil piridinolina
(desoxipiridinolina).
Mediante la introducción, el anticuerpo
monoclonal 2B4 reconoce un epítopo C-terminal
en la secuencia EKGPDP. El anticuerpo requiere que la prolina
C-terminal esté libre para cualquier unión (es
decir, Pro-COOH) y prefiere que K sea derivatizado
(es decir, se reticule) mediante el grupo amino (épsilon) de su
cadena lateral. La presencia de aminoácidos extra
C-terminales a la prolina, evita la unión de mAb
2B4 a este dominio peptídico.
Varias metaloproteinasas matriciales (MMPs),
incluyendo a colagenasas (MMP1 y MMP13), gelatinasas (MMP2 y 9),
estromelisina (MMP3) y matrilisina (MMP7) pueden generar el epítopo
mAb 2B4 a partir del colágeno tipo II cartilaginoso o a partir de
un dominio del C-telopéptido sintético
(AFAGLGPREKGPDPLQYMRA). La matrilisina (MMP7) es el más potente,
basándose en estudios in vitro con enzimas
recombinantes.
La catepsina K, sin embargo, es incapaz de
fragmentar el enlace P-L requerido para la
liberación del epítopo 2B4, pero genera un fragmento más largo,
EKGPDPLQ (SEC.ID. NO:10). Esto es significativo porque la catepsina
K es una proteasa que se expresa esencialmente sólo por los
osteoclastos y constituye el enzima clave responsable para la
resorción del colágeno calcificado cuando los osteoclastos resorben
el hueso. Los osteoclastos (o una célula muy similar) son también
responsables de la degradación del cartílago calcificado. Éste se
forma de forma transitoria en las placas de crecimiento de los
animales que se están desarrollando y también se encuentra en el
esqueleto adulto en las superficies de contacto entre el hueso y el
cartílago en todos los tipos de articulaciones. En la artritis, la
resorción acelerada y la remodelación ósea darán lugar a una
resorción extensa del cartílago calcificado por los osteoclastos.
Este proceso puede liberar en la corriente sanguínea
C-telopéptidos del colágeno de tipo II (EKGPDPLQ)
que no son reconocidos por 2B4.
Debido a que la forma urinaria del analito
telopeptídico del colágeno de tipo II es EKGPDP o más pequeño, las
proteasas en el riñón y/o hígado eliminan sustancialmente todos los
LQ-C-terminales antes de su
liberación en la orina. Por tanto, pueden definirse dos orígenes de
los col2CTx inmunorreactivos: (1) generación directa mediante los
condrocitos activados para degradar su colágeno matricial mediante
los MMPs, y (2) generación secundaria en el riñón y/o hígado a
partir de los productos circulantes de resorción osteoclástica del
cartílago calcificado.
En la artritis (artritis reumatoidea (RA) y
osteoartritis (OA)), se sabe que los MMPs son agentes clave en la
destrucción de las matrices colágenas de los cartílagos
articulares. En ambas formas de artritis, la estructura ósea también
es afectada en gran medida. En la RA, la osteoporosis es una
consecuencia habitual tanto directamente a partir del proceso
patológico en sí mismo, a través de los efectos de las citoquinas
inflamatorias, como a partir del efecto secundario de la terapia
corticosteroide. La resorción ósea acelerada será más pronunciada
en las articulaciones implicadas e incluirá la eliminación del
cartílago calcificado que subyace a las superficies articulares. En
la OA, los osteofitos (crecimiento óseo hacia afuera) destacan a
menudo de forma predominante en la patología articular. Aquí
también, se formará el cartílago calcificado y se degradará
entonces (lo último por los osteoclastos) como parte del
crecimiento osteofítico. Por tanto, para controlar y manejar las
dos formas principales de artritis, sería deseable medir
diferencialmente la destrucción del colágeno de tipo II mediada por
los osteoclastos (catepsina K) y por MMP. En la sangre o en el
líquido sinovial, la medición de col2CTx (EKGPDP) puede clasificar
la primera actividad, mientras que la medición del producto
osteoclástico (EKGPDPLQ) en sangre, puede clasificar la última
actividad. Además, el col2CTx urinario puede proporcionar una
clasificación de la resorción total (tanto el cartílago no
mineralizado como el mineralizado). Dichos ensayos urinarios
incluyen preferentemente las etapas de determinación del contenido
de creatinina de la muestra urinaria y correlacionando la
proporción de la unión que se ha detectado del anticuerpo al
contenido de creatinina, con objeto de proporcionar un índice
urinario de la resorción total del colágeno de tipo II,
independientemente del volumen urinario.
Las mediciones diferenciales de las
inmunorreactividades EKGPDP y EKGPDPLQ tienen valor diagnóstico en
la evaluación de la actividad patológica en el paciente individual.
En combinación con la medición de un marcador del colágeno tipo I
para evaluar la actividad de resorción ósea total, y/o la medición
de un marcador de colágeno del tipo III para evaluar otras fuentes
de fragmentación del tejido conjuntivo no mineralizado, puede
prescribirse una terapia apropiada y controlar su efecto deseado.
De modo similar, dichos ensayos diferenciales pueden utilizarse
para identificar nuevos candidatos a medicamentos (in vitro
y en los animales) y para proporcionar marcadores sustitutivos en
ensayos clínicos para demostrar los efectos beneficiosos deseados
sobre los tejidos diana y los procesos celulares.
Ensayos representativos para los marcadores de
resorción del colágeno de tipo I con este propósito, incluyen
telopéptidos amino-terminales del colágeno de tipo
I (Osteomark®, Ostex International, Seattle,WA)), telopéptidos
carboxiterminales del colágeno de tipo I (CrossLaps®, Osteometer
Biotech, Herlev, Dinamarca), y reticulaciones libres de la lisil
piridinolina (Pyrilinks®, Metra Biosystems, Mountain View, CA).
Ensayos representativos para los marcadores de
resorción del colágeno de tipo III incluyen telopéptidos
amino-terminales del colágeno de tipo III y
telopéptidos carboxiterminales del colágeno de tipo III. Dichos
ensayos se dan a conocer en la patente nº US 5.532.169, patente nº
US 5.641.687. (Los marcadores de resorción del colágeno de tipo III
pueden utilizarse para evaluar la degradación del colágeno vascular
(arteriosclerosis), la degradación tisular pulmonar (por ejemplo,
enfisema y otras enfermedades pulmonares destructivas), pérdidas
musculares, síndromes de fragilidad de las personas mayores,
enfermedades hepáticas, hipertiroidismo, efectos secundarios de la
diabetes sobre el tejido conjuntivo, y otras situaciones
inflamaciones e infecciosas que aceleran la actividad de resorción
ósea total.
A continuación, se describen los péptidos
lineales (SEC.ID. n^{os}: 11-20) sintetizados
para emparejarlos con los componentes telopeptídicos de los
productos de degradación del colágeno de tipo II.
^{1} Origen del cartílago:
- N = cartílago no mineralizado;
- M = cartílago mineralizado
- N + M = degradación total del cartílago; y
- - = ausencia o sólo trazas.
El principal producto de degradación de col2CTx
es el EKGPDP reticulado. El producto de degradación posterior, EKGPD
reticulado, se encuentra habitualmente en la orina en cantidades
más pequeñas. El producto de degradación EKGPDPL reticulado es un
componente menos importante que el EKGPDP reticulado.
Unos niveles más altos en sangre que los normales
del EKGPDPLQ reticulado, pueden indicar la degradación del cartílago
mineralizado asociada con la formación osteofítica activa en la
osteoartritis.
Las secuencias telopeptídicas representadas por
las SEC.ID. NOS 11-13, resultan de la fragmentación
metaloproteinásica (MMP) del enlace G-L en el
extremo aminoácido del telopéptido \alpha1(II)C
(SEC.ID. NO:5), en combinación con los cortes MMP de los enlaces
P-L, Q-Y ó Y-M en el
extremo carboxi del telopéptido. SEC.ID.NOS 14-16
representan telopéptidos relacionados a partir de la fragmentación
MMP entre el enlace A-F. SEC.ID.NOS
17-19 representan telopéptidos más largos a partir
de la fragmentación MMP entre el enlace G-I. Los
extremos amino de estos telopéptidos más largos son generalmente
metabolizados posteriormente en los nódulos linfáticos, hígado, y/o
riñón.
La secuencia telopeptídica representada por SEC.
ID. NO:20 resulta de la fragmentación serín proteásica del enlace
R-E terminal amino al residuo K de reticulación, en
combinación con la fragmentación serín proteásica del enlace
R-A en el extremo carboxi del telopéptido.
Dichos productos de degradación de reticulación
de SEC.ID.NOS 11-19, (en los que los dos componentes
telopeptídicos se seleccionan independientemente de entre las SEC.
ID. NOS 11-19), y SEC.ID. NO:20, generalmente
resultan de la degradación del cartílago no mineralizado y se
encuentran primariamente en el líquido sinovial y en la sangre, y
en un grado menor, en la orina. Niveles más altos que los normales
de estos productos de degradación en los líquidos corporales,
indican degradación activa del cartílago que puede correlacionarse
con la artritis reumatoide, osteoartritis y otras artritis.
Los procedimientos de la invención utilizan
anticuerpos dirigidos contra productos de degradación
amino-telopeptídicos reticulados del colágeno de
tipo II, así como péptidos lineales (SEC.ID. NOS
21-31) sintetizados para emparejarlos con los
componentes telopeptídicos de los productos de degradación. Los
procedimientos de la invención proporcionan ensayos para la
degradación del cartílago utilizando los anticuerpos y los péptidos
lineales.
^{1}J = ácido piroglutámico, es decir, ácido
pirrolidona carboxílico ciclizado completamente (ácido
5-oxo-2-pirrolidinocarboxílico).
^{2} Origen del cartílago:
- N = cartílago no mineralizado;
- M = cartílago mineralizado
- N + M = degradación total del cartílago; y
- - = ausencia o sólo trazas.
Las secuencias telopeptídicas representadas por
las SEC.ID. NOS 21-23, resultan de la fragmentación
metaloproteinásica (MMP) del enlace F-D en el
extremo amino del telopéptido \alpha1(II)N, en
combinación con los cortes MMP de los enlaces A-Q,
Q-L ó L-G en el extremo carboxi del
telopéptido. SEC.ID.NOS 24-26 representan
telopéptidos relacionados a partir de la fragmentación MMP entre el
enlace G-F en el extremo amino. Los extremos amino y
carboxilo de estos telopéptidos más largos (SEC.ID. NOS:
22-26 son generalmente metabolizados posteriormente
en los nódulos linfáticos, hígado, y/o riñón. Como resultado, los
productos de degradación col2NTx principales en la orina son DEKAGGA
y FDEKAGGA reticulados.
Las secuencias telopeptídicas representadas por
las SEC. ID. n^{os} 27-28, resultan de la
fragmentación por la catepsina K del enlace G-V en
el extremo carboxilo del telopéptido, en combinación con la
fragmentación por la catepsina K del enlace A-G en
el extremo amino del telopéptido en el caso de SEC.ID.NO 27. En el
caso de SEC. ID. nº: 28, el residuo J amino terminal está bloqueado.
Niveles más altos de los normales de los GGFDEKAGGAQLG y
QMAGGFDEKAGGAQLG reticulados en sangre, pueden indicar degradación
del cartílago mineralizado asociada con la formación osteofítica
activa en la osteoartritis. Las proteasas en el riñón y/ o hígado
eliminan el residuo G carboxi terminal antes de la liberación en la
orina.
Los telopéptidos representados por las SEC.ID.
n^{os} 29-31, resultan de la fragmentación
metaloproteinásica del enlace V-M en el extremo
carboxilo del telopéptido, en combinación con los cortes MMP de los
enlaces G-F, ó F-D en el extremo
amino del telopéptido en el caso de SEC.ID nº:
30-31. Productos de degradación más voluminosos que
comprenden SEC. ID. nº: 29-31 más alguna o algunas
secuencia adicional(es) helicoidal(es) puede (o
pueden) encontrarse también en el líquido sinovial y en la sangre.
Estos telopéptidos reticulados son generalmente metabolizados
posteriormente en los nódulos linfáticos, hígado, y/o riñón y
consecuentemente, se presentan sólo en cantidades traza en la
orina.
Como se ha indicado anteriormente, los
telopéptidos \alpha1(II)N reticulados representados
por SEC. ID. n^{os} 27-31, son producidos en el
sitio o sitios de la degradación del cartílago, pero se degradan
posteriormente durante el paso a través de los nódulos linfáticos,
hígado y/ó riñón. Los productos de degradación más pequeños
resultantes tienen dos componentes pelopeptídicos que pueden
seleccionarse independientemente a partir de SEC.ID.NOS:
21-26. Niveles más altos que los normales de estos
productos de degradación en la orina, indican una degradación total
del cartílago que puede correlacionarse con la artritis reumatoide,
osteoartritis y otras artritis.
Así, la invención proporciona, en una primera
forma de realización, un procedimiento mejorado para el análisis de
una muestra de un fluido corporal respecto a la presencia de un
analito que indique una situación fisiológica, que comprende las
etapas de poner en contacto la muestra del fluido corporal con un
anticuerpo que se une al analito, detectar la unión del anticuerpo
en la muestra del fluido corporal, y correlacionar cualquier unión
que se haya detectado con la situación fisiológica, comprendiendo
la mejora poner en contacto una muestra sérica con un anticuerpo
que se une a
D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-0,7cm
D-E-K-A-G-G-A}}-A-G-G-A
pero no
a
G-G-F-D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-1,7cm
G-G-F-D-E-K-A-G-G-A-Q-L-G}}-A-G-G-A-Q-L-G
donde
K-K-K es hidroxilisil piridinolina o
lisil piridinolina, y correlacionar cualquier unión que se haya
detectado con la resorción in vivo del colágeno de tipo II
no
mineralizado.
En una segunda forma de realización, la invención
proporciona un procedimiento mejorado para el análisis de una
muestra de un fluido corporal respecto a la presencia de un analito
que indique una situación fisiológica, que comprende las etapas de
poner en contacto la muestra del fluido corporal con un anticuerpo
que se une al analito, detectar la unión del anticuerpo en la
muestra del fluido corporal, y correlacionar cualquier unión que se
haya detectado con la situación fisiológica, comprendiendo la
mejora poner en contacto una muestra sérica con un anticuerpo que
se une a
G-G-F-D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-1,7cm
G-G-F-D-E-K-A-G-G-A-Q-L-G}}-A-G-G-A-Q-L-G
pero no
a
D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-0,7cm
D-E-K-A-G-G-A}}-A-G-G-A
donde
K-K-K es hidroxilisil piridinolina o
lisil piridinolina, y correlacionar cualquier unión detectada con
la resorción in vivo del colágeno de tipo II
mineralizado.
En una tercera forma de realización, la invención
proporciona un procedimiento mejorado para el análisis de una
muestra de un fluido corporal respecto a la presencia de un analito
que indique una situación fisiológica, que comprende las etapas de
poner en contacto la muestra del fluido corporal con un anticuerpo
que se une al analito, detectar la unión del anticuerpo en la
muestra del fluido corporal, y correlacionar cualquier unión que se
haya detectado con la situación fisiológica, comprendiendo la
mejora poner en contacto una muestra sérica con un anticuerpo que
se une a
D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-0,7cm
D-E-K-A-G-G-A}}-A-G-G-A
pero no
a
G-G-F-D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-1,7cm
G-G-F-D-E-K-A-G-G-A-Q-L-G}}-A-G-G-A-Q-L-G
donde
K-K-K es hidroxilisil piridinolina o
lisil piridinolina, y correlacionar cualquier unión que se haya
detectado con la resorción in vivo tanto del colágeno de
tipo II no mineralizado como de la del colágeno de tipo II
mineralizado.
En una cuarta forma de realización, la invención
proporciona un procedimiento mejorado para el análisis de una
muestra de un fluido corporal respecto a la presencia de un analito
que indique una situación fisiológica, que comprende las etapas de
poner en contacto de la muestra del fluido corporal con un
anticuerpo que se une al analito, detectar la unión del anticuerpo
en la muestra del fluido corporal, y correlacionar cualquier unión
que se haya detectado con la situación fisiológica, comprendiendo
la mejora poner en contacto de una muestra sérica con un anticuerpo
que se une a
G-G-F-D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-1,7cm
G-G-F-D-E-K-A-G-G-A-Q-L-G}}-A-G-G-A-Q-L-G
pero no
a
D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-0,7cm
D-E-K-A-G-G-A}}-A-G-G-A
y poner en contacto la muestra
sérica con un segundo anticuerpo que se une
a
D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-0,7cm
D-E-K-A-G-G-A}}-A-G-G-A
pero no
a
G-G-F-D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-1,7cm
G-G-F-D-E-K-A-G-G-A-Q-L-G}}-A-G-G-A-Q-L-G
donde
K-K-K es hidroxilisil piridinolina o
lisil piridinolina, y correlacionar la unión total que se haya
detectado del primero y segundo anticuerpo con la resorción in
vivo, tanto del colágeno de tipo II mineralizado como de la del
colágeno de tipo II no
mineralizado.
En una quinta forma de realización, la invención
proporciona un procedimiento mejorado para el análisis de una
muestra de un fluido corporal respecto a la presencia de un analito
que indique una situación fisiológica, que comprende las etapas de
poner en contacto la muestra del fluido corporal con un anticuerpo
que se une al analito, detectar la unión del anticuerpo en la
muestra del fluido corporal, y correlacionar cualquier unión que se
haya detectado con la situación fisiológica, comprendiendo la
mejora poner en contacto una muestra sérica con un anticuerpo que
se une a
G-G-F-D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-1,7cm
G-G-F-D-E-K-A-G-G-A-Q-L-G}}-A-G-G-A-Q-L-G
pero no
a
D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-0,7cm
D-E-K-A-G-G-A}}-A-G-G-A
y poner en contacto una muestra de
orina con un segundo anticuerpo que se une
a
D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-0,7cm
D-E-K-A-G-G-A}}-A-G-G-A
pero no
a
G-G-F-D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-1,7cm
G-G-F-D-E-K-A-G-G-A-Q-L-G}}-A-G-G-A-Q-L-G
donde
K-K-K es hidroxilisil piridinolina o
lisil piridinolina, y correlacionar cualquier unión que se haya
detectado del primer anticuerpo con la resorción in vivo del
colágeno de tipo II mineralizado, y de cualquier unión que se haya
detectado del segundo anticuerpo con la resorción in vivo
tanto del colágeno del tipo II mineralizado como de la del colágeno
de tipo II no
mineralizado.
El término "anticuerpo" utilizado en la
presente memoria pretende abarcar los anticuerpos policlonales, los
anticuerpos monoclonales y sus fragmentos de unión antigénica.
Dichos anticuerpos de unión EKGPDP y (EKGPDP)LQ, o los
anticuerpos de unión GGFDEKAGGAQLG y DEKAGGA, pueden producirse
mediante procedimientos estándar que se conocen bien en la técnica.
A continuación, se muestra un protocolo representativo.
Desarrollo de hibridomas EKGPDPLQ: A ratones
hembra RFB/DnJ se les inyectó intraperitonealmente (ip) una emulsión
de adyuvante completo de Freund y péptidos sintéticos EXGPDPLQ que
se habían reticulado con la proteína transportadora hemocianina de
lapa (KLH) vía glutaldehído (KLH-EKGPDPLQ). Un mes
después se administró intraperitonealmente
KLH-EKGPDPLQ en una emulsión con adyuvante
incompleto de Freund. Aproximadamente 8 semanas después, se
sacrificaron los animales y se fusionaron los esplenocitos, mediante
polietilenglicol, a la progenie celular FOX-NY de
mieloma murino (ATCC CRL-1732). Las células
fusionadas se desarrollaron en placas de 96 pocillos en medios de
selección que contenían adenina, aminopterina y timidina (AAT).
Aproximadamente una semana después de los
cultivos de las colonias del hibridoma de fusión, se ensayaron los
sobrenadantes en ELISA respecto a la reactividad respecto al péptido
sintético EKGPDPLQ reticulado vía glutaraldehído a la albúmina
sérica bovina (BSA-EKGPDPLQ). Las colonias de
hibridoma que producían anticuerpos reactivos con
BSA-EKGPDPLQ se ensayaron secundariamente respecto a
la especificidad de la reacción en ELISA contra otras secuencias
peptídicas sintéticas. Entre las probadas están el péptido
sintético EKGPDP reticulado con BSA via glutaraldehído
(BSA-EKGPDP). Las colonias de hibridomas que
reaccionan positivamente a BSA-EKGPDPLQ y
negativamente a BSA-EKGPDP crioconservaron. Los
hibridomas representativos se clonaron hasta la monoclonalidad
mediante el procedimiento de dilución limitada.
En el ELISA de competición, se encontró que las
muestras séricas humanas, así como los BSA-EKGPDPLQ
solubles, competían con la fase sólida BSA-EKGPDPLQ
para los anticuerpos candidatos.
También puede prepararse con propósitos de
inmunización y rastreo un digesto de la catepsina K del colágeno de
tipo II. Los proteoglicanos se extraen de una muestra de tejido del
cartílago articular humano con un desnaturalizante proteico, tal
como la 4M guanidina HCl. El residuo se lava con agua y se digiere
con catepsina K recombinante (37ºC, pH 5,8). El digesto se fracciona
mediante cromatografía líquida de alta resolución, por ejemplo,
mediante fase inversa, y las fracciones que contienen
reticulaciones de piridinolina se controlan mediante emisión de
fluorescencia a 390 nm (excitación 297 nm). La fracción
fluorescente que contiene los C-telopéptidos
reticulados de secuencia EKGPDPLQ se identifica mediante análisis
de la secuencia N-terminal. Esta fracción puede
utilizarse con propósitos de rastreo y para la validación de la
especificidad de los anticuerpos.
Los anticuerpos objeto pueden utilizarse en
diversos formatos de inmunoensayo que son bien conocidos en la
técnica. Por ejemplo, véase: Harlow & Lane, Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, página
553-612, 1988; Principles and Practice of
Immunoassay, Price & Newman (Eds), Stockton Press, 1991; y
Immunoassay, Diamandis & Christopoulos (Eds), Academic Press,
1996.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Washington Research Foundation
\hskip1cmEyre, David R.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ENSAYOS DE RESORCIÓN DEL
CARTÍLAGO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
wros-1-14775
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Lys Gly Pro Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Lys Gly Pro Asp Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Lys Gly Pro Asp Pro Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Phe Ala Gly Leu Gly Pro Arg Glu Lys Gly
Pro Asp Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Phe Ala Gly Leu Gly Pro Arg Glu Lys Gly
Pro Asp Pro Leu Gln Tyr Met Arg Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
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\sa{Ala Phe Ala Gly Leu Gly Pro Arg Glu Lys Gly
Pro Asp Pro Leu Gln}
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Phe Ala Gly Leu Gly Pro Arg Glu Lys Gly
Pro Asp Pro Leu Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gln Tyr Met Arg Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Met Arg Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Lys Gly Pro Asp Pro Leu Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gly Pro Arg Glu Lys Gly Pro Asp
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gly Pro Arg Glu Lys Gly Pro Asp Pro Leu
Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gly Pro Arg Glu Lys Gly Pro Asp Pro Leu
Gln Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Gly Leu Gly Pro Arg Glu Lys Gly Pro
Asp Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Gly Leu Gly Pro Arg Glu Lys Gly Pro
Asp Pro Leu Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Gly Leu Gly Pro Arg Glu Lys Gly Pro
Asp Pro Leu Gln Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asp Met Ser Ala Phe Ala Gly Leu Gly Pro
Arg Glu Lys Gly Pro Asp Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asp Met Ser Ala Phe Ala Gly Leu Gly Pro
Arg Glu Lys Gly Pro Asp Pro Leu Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asp Met Ser Ala Phe Ala Gly Leu Gly Pro
Arg Glu Lys Gly Pro Asp Pro Leu Gln Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Lys Gly Pro Asp Pro Leu Gln Tyr Met
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Glu Lys Ala Gly Gly Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Glu Lys Ala Gly Gly Ala Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Glu Lys Ala Gly Gly Ala Gln Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Asp Glu Lys Ala Gly Gly Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Asp Glu Lys Ala Gly Gly Ala Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Asp Glu Lys Ala Gly Gly Ala Gln
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Phe Asp Glu Lys Ala Gly Gly Ala Gln
Leu Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es ácido piroglutámico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Met Ala Gly Gly Phe Asp Glu Lys Ala Gly
Gly Ala Gln Leu Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es ácido piroglutámico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Met Ala Gly Gly Phe Asp Glu Lys Ala Gly
Gly Ala Gln Leu Gly Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Asp Glu Lys Ala Gly Gly Ala Gln Leu Gly
Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético que corresponde a
la secuencia telopeptídica carboxi-terminal del
colágeno de tipo II humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Glu Lys Ala Gly Gly Ala Gln Leu Gly
Val}
Claims (7)
1. Procedimiento para el análisis de una muestra
de un fluido corporal respecto a la presencia de un analito que
indique una situación fisiológica, que comprende las etapas de poner
en contacto de la muestra del fluido corporal con un anticuerpo que
se une al analito, detectar la unión del anticuerpo en la muestra
del fluido corporal, y correlacionar cualquier unión que se haya
detectado con la situación fisiológica, caracterizado porque
dicho procedimiento comprende poner en contacto una muestra sérica
con un anticuerpo que se une a
D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-0,7cm
D-E-K-A-G-G-A}}-A-G-G-Apero no
a
G-G-F-D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-1,7cm
G-G-F-D-E-K-A-G-G-A-Q-L-G}}-A-G-G-A-Q-L-Gdonde
K-K-K es hidroxilisil piridinolina o
lisil piridinolina, y correlacionar cualquier unión que se haya
detectado con la resorción in vivo del colágeno de tipo II
no
mineralizado.
2. Procedimiento para el análisis de una muestra
de un fluido corporal respecto a la presencia de un analito que
indique una situación fisiológica, que comprende las etapas de poner
en contacto la muestra del fluido corporal con un anticuerpo que se
une al analito, detectar la unión del anticuerpo en la muestra del
fluido corporal, y correlacionar cualquier unión que se haya
detectado con la situación fisiológica, caracterizado porque
dicho procedimiento comprende poner en contacto una muestra sérica
con un primer anticuerpo que se une a
G-G-F-D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-1,7cm
G-G-F-D-E-K-A-G-G-A-Q-L-G}}-A-G-G-A-Q-L-Gpero no
a
D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-0,7cm
D-E-K-A-G-G-A}}-A-G-G-Adonde
K-K-K es hidroxilisil piridinolina o
lisil piridinolina, y correlacionar cualquier unión detectada con
la resorción in vivo del colágeno de tipo II
mineralizado.
3. Procedimiento para el análisis de una muestra
de un fluido corporal respecto a la presencia de un analito que
indique una situación fisiológica, que comprende las etapas de poner
en contacto de la muestra del fluido corporal con un anticuerpo que
se une al analito, detectar la unión del anticuerpo en la muestra
del fluido corporal, y correlacionar cualquier unión que se haya
detectado con la situación fisiológica, que comprende poner en
contacto de una muestra urinaria con un anticuerpo que se une a
D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-0,7cm
D-E-K-A-G-G-A}}-A-G-G-Apero no
a
G-G-F-D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-1,7cm
G-G-F-D-E-K-A-G-G-A-Q-L-G}}-A-G-G-A-Q-L-Gdonde
K-K-K es hidroxilisil piridinolina o
lisil piridinolina, y correlacionar cualquier unión que se haya
detectado con la resorción in vivo, tanto del colágeno de
tipo II no mineralizado como de la del colágeno de tipo II
mineralizado.
4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que dicho procedimiento también comprende poner en contacto la
muestra sérica con un segundo anticuerpo que se une a
D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-0,7cm
D-E-K-A-G-G-A}}-A-G-G-Apero no
a
G-G-F-D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-1,7cm
G-G-F-D-E-K-A-G-G-A-Q-L-G}}-A-G-G-A-Q-L-Gdonde
K-K-K es hidroxilisil piridinolina o
lisil piridinolina, y que correlaciona la unión total que se haya
detectado del primero y segundo anticuerpo con la resorción in
vivo, tanto del colágeno de tipo II mineralizado como de la del
colágeno de tipo II no
mineralizado.
5. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que dicho procedimiento también comprende poner en contacto una
muestra urinaria con un segundo anticuerpo que se une a
E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-0,3cm
E-K-G-P-F-(P)-(L)}}-G-P-F-(P)-(L)pero no
a
G-G-F-D-E-
\melm{\delm{\para}{K}}{K}{\uelm{\para}{\hskip-1,7cm
G-G-F-D-E-K-A-G-G-A-Q-L-G}}-A-G-G-A-Q-L-Gdonde
K-K-K es hidroxilisil piridinolina o
lisil piridinolina, y correlacionar cualquier unión que se haya
detectado del primer anticuerpo con la resorción in vivo del
colágeno de tipo II mineralizado, y de cualquier unión que se haya
detectado del segundo anticuerpo con la resorción in vivo del
colágeno del tipo II mineralizado como de la del colágeno de tipo
II no
mineralizado.
6. Péptido sintético DEKAGGA (SEC.ID. nº:
21).
7. Péptido sintético GGFDEKAGGAQLG (SEC.ID. nº:
27).
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|---|---|---|---|
| US335098 | 1999-06-17 | ||
| US09/335,098 US6255056B1 (en) | 1998-06-19 | 1999-06-17 | Cartilage resorption assays |
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| US141574P | 1999-06-29 | ||
| US14227499P | 1999-07-02 | 1999-07-02 | |
| US142274P | 1999-07-02 | ||
| US14267599P | 1999-07-07 | 1999-07-07 | |
| US142675P | 1999-07-07 | ||
| US385740 | 1999-08-30 | ||
| US09/385,740 US6348320B1 (en) | 1998-06-19 | 1999-08-30 | Cartilage resorption assays measuring type II collagen fragments |
| PCT/US1999/029357 WO2000079284A1 (en) | 1999-06-17 | 1999-12-10 | Cartilage resorption assays |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Families Citing this family (4)
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