KR20230154299A - 콜라겐 xi 바이오마커 검출용 검정 - Google Patents

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니일 잉어만 니슨
모튼 애서 카스달
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Abstract

본 명세서에는 A'511↓에서 유형 XI 콜라겐의 α1-사슬의 N-말단 프로-펩티드의 절단 상에 형성된 C-말단 네오-에피토프를 포함하는 펩티드의 C-말단을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 단일클론 항체, 및 상기 항체를 사용하고 이를 포함하는 면역검정 방법 및 키트가 개시된다. 면역검정 방법은 암과 같지만 이에 제한되지 않는 질환의 중증도 또는 예후를 검출 및/또는 모니터링 및/또는 평가하기 위해 사용될 수 있다.

Description

콜라겐 XI 바이오마커 검출용 검정
본 발명은 유형 XI 콜라겐의 α1-사슬의 N-말단 프로-펩티드의 절단 상에 형성된 네오-에피토프를 검출하기 위한 및/또는 샘플에서 상기 네오-에피토프의 양을 정량하기 위한 면역검정에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 네오-에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 및 상기 면역검정을 수행하기 위한 상기 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다. 면역검정, 항체 및 키트는, 예를 들어 환자에서 췌장암, 만성 췌장염, 흑색종, 방광암, 유방암, 결장직장암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 전립선암 또는 위암과 같은 질환의 중증도 또는 예후를 검출, 모니터링 및/또는 평가하는데 사용될 수 있다.
췌장암(PC)은 단지 14번째로 가장 흔한 암이지만 여전히 전 세계적으로 모든 암 사망의 4.5%를 차지한다(세계 보건 기구: 최신 글로벌 암 데이터, 2018; Bray 등, 2018). 이에 대한 주요한 이유는 대부분의 환자가 진단 당시에 전이를 나타내어 환자의 10% 만이 치유력 있는 수술을 받기 때문이다. 다른 표준의 치유 치료-옵션은 다양한 화학요법 레지멘을 포함하지만 이들 약물은 주로 완화 환경에서 사용된다(McGuigan 등, 2018).
췌관 선암종(PDAC)은 무혈성 및 저산소성 종양 미세환경(TME)을 초래하는 심각한 종양 섬유증/데스모플라시아를 특징으로 한다. PC에서 섬유성 TME는 종종 주변 기질로부터 지속적인 유해성 자극으로 인해 활성화되는 섬유아세포인 암-연관된 섬유아세포(CAF)의 광범위한 수를 특징으로 한다(Hosein, Brekken and Maitra, 2020). CAF는 종양 미세환경에서 가장 풍부한 세포 유형이고 종양 결과를 좌우하는 것으로 알려져 있다(Franco 등, 2010). CAF는 종양 성장, 혈관신생, 종양 침입 및 전이를 촉진하는 성장 인자, 효소 및 세포외 기질(ECM) 분자를 분비하고 이들은 따라서 종양-촉진 인자의 풍부한 저장소로 생각된다(Kalluri and Zeisberg, 2006). 종양 발달 및 진행에서 CAF 및 결합조직형성 기질의 이 중요한 역할을 인식하고, 종양의 기질 성분을 식별하고 표적화하는 것은 암에서의 광범위한 연구 분야이다. 특히, PC가 있는 환자의 종양에서 발견되는 것과 같이 기질- 및 CAF-풍부 TME를 가진 환자에서 종양 생물학에 대한 추가적인 통찰력을 제공할 수 있는 신규한 비-침습적 바이오마커는 극히 유익할 것이다.
면역 체크포인트 억제제(ICI) 효능을 예측하고 이에 의해 현재의 ICI 요법 및 새로운 병용 요법에 대한 환자 선택을 허용하는 바이오마커도 마찬가지로 매우 유익할 것이다. T-세포 배제된 종양을 가진 환자는 ICI 요법에 대한 빈약한 효과를 갖는다. T-세포 배제는 상향조절된 TGF-β-시그널링 및 활성화된 섬유아세포에 의해 구동되며, 이는 증가된 수준의 원섬유 콜라겐(데스모플라시아)을 생성한다.
CAF에 의해 분비되는 주요 ECM-단백질은 콜라겐이다. 섬유아세포 유래된 콜라겐은 콜라겐 I, II, III, V, IV 및 XI를 포함한다. 이들 콜라겐은 종양 기질 구획의 주요 구성요소이고 간질 매트릭스에 위치한다. 기저막 콜라겐, 예를 들어. 콜라겐 IV, 및 암에서의 그 역할은 잘 기술되어 있지만 섬유아세포 유래된 콜라겐에 대해서는 알려진 바가 훨씬 적다. 그러나, 이들 콜라겐이 종양 개시 및 진행에 중요한 역할을 할 수 있다는 증거가 나타나 있다(Nissen, Karsdal and Willumsen, 2019). 특정 섬유아세포-유래된 콜라겐 단편을 정량화하는 바이오마커는 다양한 암 질환에서 환자 결과를 예측하는 것으로 나타났다(Willumsen 등, 2013, 2014; Kang 등, 2014; Bager 등, 2015; Kehlet 등, 2016; Jensen 등, 2018). 최근에 콜라겐 III의 프로-펩티드를 표적화하는 바이오마커인 PRO-C3이 PC에서 전반적인 생존(OS)에 대한 예후인 것으로 나타났다(Chen 등, 2020). 부가하여, 또 다른 연구에서는 PRO-C3이 신규한 항-섬유화 약물 PEGPH20에 반응하는 환자를 예측할 수 있었다는 것으로 나타났다(Wang 등, 2018).
여러 연구는 신규한 바이오마커로 역할을 할 수 있는 CAF-특이적 유전자/단백질을 식별하는데 중점을 두었다. 흥미롭게도, 지금까지 식별된 가장 특이적인 CAF 유전자 중 하나는 유형 XI 콜라겐의 α1-사슬을 인코딩하는 COL11A1이다(Villa 등, 2015). 유형 XI 콜라겐은 연골세포, 파골세포, CAF에 의해 발현되는 작은 섬유성 콜라겐이지만 활발하지 않은 섬유아세포에서는 발현되지 않는다( 등, 2013; Raglow and Thomas, 2015; -Villa 등, 2015). 유형 XI 콜라겐의 기능은 적절한 피브릴 형성 및 직경의 유지를 포함하는 것으로 제안되었다. 성숙한 유형 XI 콜라겐은 α1-, α2- 및 α3-사슬로 구성된 헤테로삼량체이며, 이것은 프로-콜라겐으로 합성되고 여기서 프로-펩티드는 이후에 단백질분해로 절단되어 성숙한 유형 XI 콜라겐을 생성한다. 유형 XI 콜라겐의 α1-사슬의 N-말단 프로-펩티드는 A'253↓에서 BMP-1 절단에 의해 실험실내에서 부분적으로만 방출되는 것으로 나타났다(Rousseau 등, 1996). 그러나 유형 XI 콜라겐의 α1-사슬의 N-말단 프로-펩티드는 또한 A'511↓에서 N-말단 절단에 의해 프로-펩티드의 맨 끝에서 절단되는 것으로 나타났다(Yoshioka and Ramirez, 1990).
US 9,702,879 B2(Serra 등)는 개체에서 침습성 암종의 존재를 검출하기 위한 시험관내 방법을 기술하며, 이는 상기 개체로부터 취해진 샘플에서 proCOL11A1(유형 XI 콜라겐의 α1-사슬의 프로-콜라겐)의 양을 검출하는 것을 기반으로 한다. 본 방법은 prCOL11A1의 아미노산 268 내지 400으로 구성된 proCOL11A1의 N-말단 영역에 위치한 친수성 도메인에 존재하는 하나 이상의 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 사용한다. 이 문서의 저자는 이 영역이 그 소수성(이 영역이 단백질의 본래의 형태로 노출됨을 나타냄)에 기인하고 그것이 proCOL11A1과 가장 유사성의 다른 콜라겐 이소형과의 가장 낮은 상동성의 서열을 함유하는 것에 기인하여 proCOL11A1에 특이적인 단일클론 항체를 생성하는데 가장 유망한 영역일 것이라고 결론지었다.
WO2020/065078A1(Willumsen 등)은 A'253↓에서 유형 XI 콜라겐의 α1-사슬의 N-말단 프로-펩티드의 절단 상에 형성된 C-말단 네오-에피토프를 표적화하는 단일클론 항체의 생성 및 환자에서 비소세포 폐암을 진단 및/또는 모니터링하기 위한 경쟁 ECLIA(Electro-ChemiLuminescence ImmunoAssay)에서 상기 항체의 용도를 기술한다.
그럼에도 불구하고, 기질- 및 CAF-풍부 TME(췌장암이 있는 환자의 종양에서 발견되는 것과 같은 것)를 갖는 암 및 ICI 요법으로의 치료에 대한 반응 및 생존 결과를 예측할 수 있는 T-세포 배제된 종양을 갖는 암, 및 중증 섬유증을 특징으로 하거나 이를 나타내는 기타 질환과 같지만 이에 제한되지 않는, 암을 앓고 있는 환자를 식별하기 위해 임상적으로 사용될 수 있는 신규한 비-침습적 바이오마커에 대한 필요성이 남아 있다.
요약
출원인은 이제 A'511↓에서 유형 XI 콜라겐의 α1-사슬의 N-말단 프로-펩티드의 효소적 절단에 의해 생성된 C-말단 네오-에피토프를 표적화하는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 개발하였고, PC가 있는 환자, 만성 췌장염(CP)이 있는 환자, 전이성 흑색종이 있는 환자 및 다양한 다른 유형의 암이 있는 환자에서 이 바이오마커의 예후적 가치를 입증했다.
따라서, 제1 양태에서 출원은 (A'511↓에서 유형 XI 콜라겐의 α1-사슬의 N-말단 프로-펩티드의 절단에 형성된 C-말단 네오-에피토프를 포함하는) C-말단 아미노산 서열 DGSKGPTISA(서열번호: 1)를 갖는 펩티드의 C-말단을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 단일클론 항체를 제공한다. 아미노산 서열 DGSKGPTISA(서열번호: 1)는 또한 본 명세서에서 "PRO-C11-511 표적 서열"로 지칭되고, 상기 서열로 구성되거나 그의 C-말단으로서 상기 서열을 갖는 펩티드는 또한 본 명세서에서 "PRO-C11-511 표적 펩티드"로 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "C-말단"은 폴리펩티드의 맨끝, 즉 폴리펩티드의 C-말단 끝에 있는 C-말단 펩티드 서열을 지칭하고, 이의 일반적인 방향에서 의미하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 동의어로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "네오-에피토프"는 펩티드의 절단시 형성되지만, 비-절단된 펩티드에는 존재하지 않거나 항체에 의해 인식될 수 없는 (예를 들어, 절단 부위에서의 유리 -NH2 또는 -COOH 기는 항체에 의해 인식되고 이에 특이적으로 결합되는 에피토프의 일부를 형성하기 때문임) 에피토프를 지칭한다.
바람직한 실시형태에서, 단일클론 항체는 C-말단 아미노산 서열 DGSKGPTISAQ(서열번호: 2)(즉, 글루타민 잔기의 첨가에 의해 그 C-말단에서 연장된 PRO-C11-511 표적 서열)를 갖는 펩티드를 특이적으로 인식하지 않거나 이에 결합하지 않는다.
바람직한 실시형태에서, 단일클론 항체는 C-말단 아미노산 서열 DGSKGPTIS(서열번호: 3)(즉, 최종 알라닌 잔기의 제거에 의해 절삭된 PRO-C11-511 표적 서열)를 갖는 펩티드를 특이적으로 인식하지 않거나 이에 결합하지 않는다.
바람직하게는, 단일클론 항체는 C-말단 아미노산 서열 DGSKGPTISA(서열번호: 1)를 갖는 합성 펩티드에 맞서 생성된 단일클론 항체이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "단일클론 항체"는 전체 항체 및 전체 항체의 결합 특이성을 보유하는 이의 단편 둘 모두, 예컨대 예를 들어 Fab 단편, F(ab')2 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 또는 당업자에게 공지된 다른 이러한 단편을 지칭한다. 잘 알려진 바와 같이, 전체 항체는 전형적으로 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍의 "Y-형상" 구조를 가지며, 각 쌍은 하나의 "경쇄" 및 하나의 "중쇄"로 구성된다. 각각의 경쇄 및 중쇄의 N-말단 영역은 가변 영역을 함유하는 반면, 중쇄 및 경쇄 각각의 C-말단 부분은 불변 영역을 구성한다. 가변 영역은 주로 항원 인식을 담당하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 불변 영역은 항체가 면역 체계의 세포와 분자를 모집할 수 있도록 한다. 결합 특이성을 보유하는 항체 단편은 적어도 CDR 및 상기 결합 특이성을 보유하기 위한 가변 영역의 나머지의 충분한 부분을 포함한다.
본 발명의 방법에서, 당업계에 공지된 임의의 불변 영역을 포함하는 단일클론 항체가 사용될 수 있다. 인간 불변 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 불변 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되고 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. IgG 이소형은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 서브클래스를 갖는다. 단일클론 항체는 바람직하게는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 임의의 하나를 포함하는 IgG 이소형일 수 있다.
항체의 CDR은 Kabat 등에 의해 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체는 실시예에 기재된 바와 같이 B 세포 클론으로부터 생성될 수 있다. 항체의 이소형은 인간 IgM, IgG 또는 IgA 이소형, 또는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스에 특이적인 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 생성된 항체의 아미노산 서열은 표준 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, RNA는 세포에서 단리되고 역전사에 의해 cDNA를 생성하는데 사용될 수 있다. 그런 다음 cDNA는 항체의 중쇄 및 경쇄를 증폭하는 프라이머를 사용하여 PCR에 적용된다. 예를 들어 모든 VH(가변 중쇄) 서열에 대한 리더 서열에 특이적인 프라이머는 이전에 결정된 이소형의 불변 영역에 위치된 서열에 결합하는 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 경쇄는 V 카파 또는 V 람다 리더 서열에 어닐링하는 프라이머와 함께 카파 또는 람다 사슬의 3' 말단에 결합하는 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 전체 길이 중쇄 및 경쇄가 생성되고 시퀀싱될 수 있다.
제2 양태에서, 본 출원은 면역검정의 방법을 제공하고, 상기 방법은:
(i) 환자로부터의 생체액 샘플을 제1 양태에 따른 단일클론 항체와 접촉시키는 것; 및
(ii) 상기 샘플에서 상기 단일클론 항체와 펩티드 사이의 결합의 양을 검출하고 측정하는 것을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 방법은 환자에서 질환을 검출 및/또는 모니터링하고/하거나 환자에서 질환의 중증도 또는 예후를 평가하기 위한 면역검정의 방법이며, 상기 방법은 추가로:
(iii) 단계 (ii)에서 측정된 상기 단일클론 항체의 상기 결합의 양에 대해, 정상적인 건강한 대상체와 연관된 값, 및/또는 공지된 질환 중증도 또는 예후와 연관된 값 및/또는 이전 시점에서 상기 환자로부터 얻은 값, 및/또는 미리결정된 컷-오프 값과의 상관성을 보는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 질환은 췌장암, 흑색종, 방광암, 유방암, 결장직장암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 전립선암 또는 위암과 같으나 이에 제한되지 않는 암이다. 암은 기질- 및 암 연관된 섬유아세포-풍부 종양 미세환경을 갖는 암일 수 있다. 암은 특히 췌관 선암종 또는 전이성 흑색종일 수 있다.
일부 실시형태에서, 질환은 췌장암(특히 췌관 선암종) 또는 만성 췌장염과 같으나 이에 제한되지 않는 췌장 질환이다.
방법이 질환의 중증도 또는 예후를 평가하기 위한 방법인 경우, 방법은 예를 들어 암의 단계를 평가하기 위한 것일 수 있고; 또는 환자 생존의 기간 또는 무-진행 생존의 기간을 평가하기 위한 것일 수 있고; 또는 하나 이상의 약물(예컨대 하나 이상의 화학요법제(즉, 세포독성제) 및/또는 면역 체크포인트 억제제)로의 치료로 환자 생존 또는 무-진행 생존의 예상되는 기간과 같은 의학적 개입에 대한 예상되는 반응을 평가하기 위한 것일 수 있다.
샘플은 바람직하게는 생체액이다. 생체액은 혈액, 혈청, 혈장, 소변 또는 세포 또는 조직 배양액으로부터의 상등액일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 생체액은 혈액, 혈청 또는 혈장이다.
면역검정은 경쟁 검정 또는 샌드위치 검정일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 면역검정은 예를 들어 방사면역검정 또는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)일 수 있다. 이러한 검정은 당업자에게 공지된 기술이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "결합의 양"은 환자 샘플에서 단일클론 항체와 펩티드 사이의 결합의 정량화를 지칭한다. 상기 정량화는 예를 들어 항체가 특이적으로 결합하는 펩티드의 알려진 농도를 함유하는 표준 샘플에서 결합의 측정된 값을 사용하여 생성된 보정 곡선에 대해 환자 샘플에서 결합의 측정된 값을 비교함에 의해 결정될 수 있고, 이에 의해 항체가 환자 샘플에서 특이적으로 결합하는 펩티드의 양을 측정할 수 있다. 하기 제시된 실시예에서, 분광광도계 분석이 환자 샘플에서 그리고 보정 곡선을 생성할 때 둘 모두에서 결합의 양을 측정하기 위해 사용되는 ELISA 방법이 사용된다. 그러나, 임의의 적절한 분석 방법이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "미리결정된 컷-오프 값"은 환자에서 질환 또는 이의 특정 중증도(또는 그에 대한 예후)의 높은 가능성을 나타내는 것으로 통계적으로 결정되는 결합의 양을 의미하며, 통계적 컷-오프 값 이상인 환자 샘플에서 표적 펩티드의 측정된 값이 상기 질환의 존재 또는 이의 상기 특정 중증도(또는 이에 대한 예후)의 적어도 70% 확률, 바람직하게는 적어도 75% 확률, 더 바람직하게는 적어도 80% 확률, 더 바람직하게는 적어도 85% 확률, 보다 바람직하게는 적어도 90% 확률, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95% 확률에 해당한다는 점에서 그렇다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "정상적인 건강한 대상체와 연관된 값"은 건강한 것으로 간주되는, 즉 질환이 없는 것으로 간주되는 대상체로부터의 샘플에 대해 상기 기재된 방법에 의해 측정된 결합의 표준화된 양을 의미하고; 용어 "알려진 질환 중증도 또는 예후와 연관된 값"은 알려진 중증도 또는 예후의 질환을 갖는 것으로 알려진 환자로부터의 샘플에 대해 상기 기재된 방법에 의해 결정된 결합의 표준화된 양을 의미한다.
제3 양태에서, 본 출원은 제1 양태에 따른 단일클론 항체, 및 다음 중 적어도 하나를 포함하는 면역검정 키트에 관한 것이다;
- 스트렙타비딘 코팅된 웰 플레이트;
- 비오티닐화된 펩티드 비오틴-L-DGSKGPTISA(서열번호: 4), 여기서 L은 선택적 링커임;
- 샌드위치 면역검정에 사용하기 위한 2차 항체;
- 서열 DGSKGPTISA(서열번호: 1)를 포함하는 캘리브레이터 단백질;
- 항체 비오티닐화 키트;
- 항체 HRP 표지 키트;
- 항체 방사성표지 키트; 및
- 검정 시각화 키트.
도 1: PRO-C11-253(a) 및 PRO-C11-511(b) 바이오마커 표적의 설명이 있는 콜라겐 유형 XI의 개략도.
도 2: PRO-C11-253 및 PRO-C511 검정의 특이성 테스트. a) PRO-C11-253 항체의 반응성을 표준(STD), 신장형, 절삭형 및 넌센스(넌센스 STD) 펩티드 및 넌센스 코터에 대해 테스트했다. 그것을 또한 3가지 다른 선택-해제 펩티드에 대해 테스트했다. b) PRO-C11-511 항체의 반응성을 표준(STD), 신장형, 절삭형 및 넌센스(non-sense STD) 펩티드, 넌센스 코터 및 선택-해제 펩티드에 대해 테스트했다. %B/B0: B는 x ng/ml 펩티드에서의 OD와 같고 B0는 0 ng/ml 펩티드에서의 OD와 같다.
도 3: 건강한 대조군(n = 20), 만성 췌장염(n = 12) 및 췌장암(n = 39) 환자에서의 개별 바이오마커 측정. 검은색 선이 중앙값을 보여주고 있다. a) PRO-C11-253, b) PRO-C11-511. Ns: 유의하지 않음. * p < 0.05. **** p < 0.0001.
도 4: PRO-C11-253, PRO-C11-511의 높은(>75%) 및 낮은(<75%) 바이오마커 수준과 전반적인 생존 사이의 연관성을 보여주는 카플란 마이어 생존 플롯. a) PRO-C11-253, b) PRO-C11-511
도 5: 췌장암(n = 686)에서 개별 PRO-C11-511 바이오마커 측정. 검은색 선이 중앙값을 보여주고 있다. * p < 0.05. *** p < 0.001.
도 6: a) PRO-C11-511의 높은(>75%) 및 낮은(>75%) 수준과 췌장암(n = 686)에서 전반적인 생존 사이의 연관성을 보여주는 카플란 마이어 플롯. b) 높은(>75%) 및 낮은(>75%) 바이오마커 측정에 대해 기준선 이후 2년 동안 생존한 환자의 백분율을 나타내는 플롯.
도 7: 펨브롤리주맙 치료된 전이성 흑색종 환자에서 75번째 백분위수(Q1+Q2+Q3 대 Q4)에서 그룹화(이분화)에 의한 기준선에서 PRO-C11-511과 연관된 무-진행 생존 및 전반적인 생존을 평가하기 위한 카플란 마이어 플롯.
도 8: PRO-C11-511은 여러 암 환자 그룹과 건강한 대조군의 혈청에서 측정되었다. PRO-C11-511 수준은 데이터-포인트 지터가 있는 튜키-스타일 박스 플롯으로 표시된다: 가로 막대는 중앙값을 나타내고; 박스의 상부- 및 하부 힌지는 제1 및 제3 사분위수(25번째 및 75번째 백분위수)를 나타내고; 수염은 힌지에서 가장 크거나 가장 작은 값까지 확장되지만 양 또는 음의 방향으로 1.5*IQR(여기서 IQR은 제1 사분위수와 제3 사분위수 사이의 사분위수-간 범위임)를 넘지 않는다. PRO-C11-511의 검증에서 측정된 바와 같이, 측정 범위의 하한(LLMR) 미만을 측정하는 샘플에는 LLMR의 값이 주어졌다. ****는 0.0001 미만의 p-값을 나타낸다. *** 0.001 미만. ** 0.01 미만. * 0.05 미만.
실시예
현재 개시된 실시형태는 개시내용의 이해를 돕기 위해 제시된 다음 실시예에 기재되어 있고, 이후에 이어지는 청구범위에서 정의된 바와 같이 개시내용의 범주를 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 다음의 실시예는 기재된 실시형태를 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되고, 본 개시내용의 범주를 제한하려는 의도가 아니고, 아래 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내는 것도 아니다. 사용된 숫자(예를 들어 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 실험 오류 및 편차를 고려해야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압에 가깝다.
재료 및 방법
콜라겐 XI 검정 개발 - 표적 서열의 식별 및 단일클론 항체 생산
유형 XI 콜라겐의 α1-사슬의 N-말단 프로-펩티드는 아미노산 A'253↓ 또는 아미노산에서 절단되는 것으로 나타났다(Rousseau 등, 1996). A'511↓(Yoshioka and Ramirez, 1990). 펩티드 244DSSAPKAAQA253(서열번호: 5)(표적 서열 및 펩티드는 본 명세서에서 PRO-C11-253으로 지칭됨) 또는 502DGSKGPTISA511(서열번호: 1) (표적 서열 및 펩티드는 본 명세서에서 PRO-C11-511로 지칭됨)(도 1) 중 어느 하나에 맞서 생성된 이들 두 부위 단일클론 항체를 표적화하는 관련성을 평가하기 위함. 아미노산 서열은 NPS@: UniprotKB/Swiss-prot 데이터베이스를 사용한 네트워크 단백질 서열 분석을 사용하여 다른 인간 분비된 세포외 매트릭스 단백질에 대한 상동성을 위해 블라스팅되었고 고유한 것으로 밝혀졌다(Combet 등, 2000).
면역원성 펩티드(PRO-C11-253의 경우: KLH-CGG-DSSAPKAAQA(서열번호: 6) 및 PRO-C11-511의 경우: KLH-CGG-DGSKGPTISA(서열번호: 7))는 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, SMCC(Thermo Scientific, 미국 메사추세츠주 월섬 소재, 카탈로그 번호 22322)를 사용하여 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 캐리어 단백질에 표적 펩티드를 공유적으로 가교함에 의해 생성되었다. 글리신 및 시스테인 잔기는 캐리어 단백질의 올바른 연결을 보장하기 위해 N-말단 종단에 추가되었다. 단일클론 항체는 PRO-C11-253 면역원성 펩티드에 대한 Specol(Invitrogen 카탈로그 번호 7925000) 및 PRO-C11-511 면역원성 펩티드에 대한 시그마 어쥬번트 시스템(Sigma 카탈로그 번호 S6322)과 혼합된 100μg 면역원성 펩티드를 함유하는 200μL 유화된 항원으로 6주령 Balb/C 마우스의 피하 면역화에 의해 생성되었다. 연속적인 면역화는 안정적인 혈청 역가 수준에 도달할 때까지 2주 간격으로 수행되었다. 역가가 가장 높은 마우스는 4주 동안 휴식된 다음 100μL 0.9% NaCl 용액 내 100μg 면역원성 펩티드로 정맥내로 부스팅되었다. 하이브리도마 세포는 이전에 기재된 바와 같이(Gefter, Margulies and Scharff, 1977) SP2/0 골수종 세포와 비장 세포를 융합함에 의해 생산되었다. 생성된 하이브리도마 세포는 그 다음 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 배양되고 단일클론 성장을 확보하기 위해 표준 제한 희석이 사용되었다.
단일클론 항체는 제조업체의 지침(GE Healthcare Life Sciences, 영국 리틀 챌폰트 소재, cat. #17-0404-01)에 따라 단백질-G-컬럼을 사용하여 정제되었다. 각 바이오마커에 대한 최상의 항체 클론은 선택 펩티드(표적 펩티드, 표준 펩티드라고도 지칭됨)에 대한 반응성에 대한 예비 경쟁 ELISA를 기반으로 선택되었고, 표적 펩티드 서열의 C-말단에 추가된 추가 아미노산을 갖는 신장된 선택 펩티드, 제1 C-말단 아미노산이 제거된 절삭된 선택 펩티드, 넌센스 선택 펩티드 및 넌센스 비오티닐화된 코팅 펩티드가 아니다(표 1 참조). 비오티닐화된 선택 펩티드는 코팅 펩티드로 사용되었다(표 1). 다른 단백질에 대한 잠재적인 교차-반응성을 스크리닝하고 항체 특이성을 추가로 테스트하기 위해, 표적 서열에서 처음 6개의 아미노산과 비교하여 1개의 아미노산 불일치가 있는 3개의 펩티드(시스타틴-M, 라이실 옥시다제 상동체 1 및 케라틴-유사 단백질 KRT222에서 유래됨)가 PRO-C11-253에 대해 포함되었고 PRO-C11-511에 대해 하나의 펩티드(뮤신 4에서 유래됨)가 포함되었다(표 1).
표 1: PRO-C11-253 및 PRO-C11-511 ELISA 검정의 개발 및 검증을 위해 사용되는 합성 펩티드
PRO-C11-253 및 PRO-C11-253 ELISA 프로토콜
경쟁 PRO-C11-253 및 PRO-C11-511 ELISA 검정은 항체/코터 펩티드의 최적 비율, 인큐베이션 완충액, -시간 및 -온도의 결정, 뿐만 아니라 (PRO-C11-253 검정의 민감도를 증가시키기 위해) PRO-C11-253 항체에 양고추냉이 과산화효소의 접합 후 다음과 같이 수행되었다:
PRO-C11-253 ELISA
96-웰 스트렙타비딘-코팅된 마이크로플레이트 플레이트를 검정 완충액(50mM PBS-BTB 8g NaCl/L, pH 7.4)에 용해된 100μL 비오티닐화된 코팅 펩티드(0.5ng/mL)로 어둠에서 진탕(300rpm)하면서 20℃에서 30분 동안 코팅했다. 5회의 세정(20mmol/L TRIS, 50mmol/L NaCl, pH 7.2) 후 20μL의 표준 펩티드 또는 혈청 샘플(1:2로 사전-희석됨)을 적절한 웰에 첨가하고 이어서 검정 완충액에 용해된 PRO-C11-253에 대한 양고추냉이 과산화효소(HRP) - 접합된 항체(25ng/mL) 100μL를 첨가하고 진탕(300rpm)하면서 어둠에서 4℃에서 20시간 동안 인큐베이션했다. 5회 세정 후, 100uL 테트라메틸베지딘(TMB)(Kem-En-Tec Diagnostics, 덴마크 타스트럽 소재)을 플레이트에 첨가하고 어둠에서 15분 동안 20℃에서 진탕(300rpm)하면서 인큐베이션했다. 100μL의 1% 황산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트는 VersaMax ELISA 마이크로플레이트 판독기에서 450nM에서 650nm를 기준으로 분석했다. 표준 곡선은 4-매개변수 수학적 피팅 모델을 사용하여 플롯팅하고 데이터는 GraphPad Prism 버전 8(GraphPad Software, Inc.)을 사용하여 분석했다.
PRO-C11-511 ELISA
96-웰 스트렙타비딘-코팅된 마이크로플레이트 플레이트를 검정 완충액(25mM PBS-BTB 2 NaCl/L, pH 7.4)에 용해된 100μL 비오티닐화된 펩티드(1.9ng/mL)로 어둠에서 진탕(300rpm)하면서 20℃에서 30분 동안 코팅했다. 5회의 세정(20mmol/L TRIS, 50mmol/L NaCl, pH 7.2) 후 20μL의 표준 펩티드 또는 혈청 샘플(1:2로 사전-희석됨)을 적절한 웰에 첨가하고 이어서 검정 완충액에 용해된 PRO-C11-511(18.8ng/mL)에 대한 항체를 첨가하고 진탕(300rpm)하면서 어둠에서 4℃에서 20시간 동안 인큐베이션했다. 5회 세정 후, 검정 완충액에 희석된 130ng/mL 2차 염소 항-마우스 HRP-접합된 IgG 항체(Thermo Scientific, 미국 메사추세츠주 월섬 소재)를 각 웰에 첨가하고 어둠에서 진탕(300rpm)하면서 20℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 5회 세정 후, 100uL 테트라메틸베지딘(TMB)(Kem-En-Tec Diagnostics, 덴마크 타스트럽 소재)을 플레이트에 첨가하고 어둠에서 15분 동안 20℃에서 진탕(300rpm)하면서 인큐베이션했다. 100μL의 1% 황산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트는 VersaMax ELISA 마이크로플레이트 판독기에서 450nM에서 650nm를 기준으로 분석했다. 표준 곡선은 4-매개변수 수학적 피팅 모델을 사용하여 플롯팅하고 데이터는 GraphPad Prism 버전 8(GraphPad Software, Inc.)을 사용하여 분석했다.
PRO-C11-253 및 PRO-C11-511 ELISA의 기술적 평가
PRO-C11-253 및 PRO-C11-511 ELISA 검정의 기술적 성능은 다음 검증 테스트로 평가되었다: 측정 범위의 하한(LLMR), 측정 범위의 상한(ULMR), 검정-간 및 검정-내 변동, 선형성, 정확도(스파이킹), 분석물질 안정성(동결/해동 및 저장) 및 간섭.
분석적 측정 범위는 10개의 독립적인 실행에서 추정된 LLMR에서 ULMR까지의 농도(표준 곡선의 선형 부분)로 정의되었다. 검정-간 및 검정-내 변동은 검출 범위를 포함하는 5개의 품질 관리 샘플을 사용하여 상이한 날에 10번의 독립적인 실행으로 측정되었으며, 각 실행은 샘플의 이중 측정으로 구성된다. 5개의 대조군 샘플은 3개의 인간 혈청 샘플 및 완충액에 표준 펩티드를 갖는 2개의 샘플을 포함하였다. 검정-내 변동은 플레이트 내의 분산 평균 계수(CV%)로 계산되었고 검정-간 변동은 상이한 날에 분석된 10개의 개별 실행 사이의 평균 CV%로 계산되었다. 선형성(희석 회수율)은 3개의 인간 혈청 샘플의 2배 희석으로 결정되었고 비-희석된 샘플의 회수 백분율로 계산되었다. 정확도(스파이킹 회수)는 알려진 농도의 8개의 인간 혈청 샘플을 조합함에 의해 평가되었고 스파이킹 회수는 이론적 양의 회수 백분율이 측정된 PRO-C11-253 및 PRO-C11-511 양으로 계산되었다. 분석물질 안정성은 반복된 동결/해동의 효과에 의해 그리고 저장 온도와 관련하여 결정되었다. 3개의 혈청 샘플을 4번 해동 및 동결하고 이어서 PRO-C11-253 및 PRO-C11-511 측정을 수행했다. 냉동/해동 회수율은 제1 주기를 기준으로 계산되었다. 3개의 인간 혈청 샘플을 사용하여 4℃ 및 20℃에서 분석물질 안정성을 결정하기 위해 48시간 연구를 수행했다. PRO-C11-253 및 PRO-C11-511의 수준은 저장 4시간, 24시간 및 48시간 후에 측정되었으며, 회수율은 -20℃에서 저장된 비-스트레스의 샘플을 기준으로 계산되었다. 간섭은 저/고 함량의 헤모글로빈(2.5/5mg/mL), 지질혈증/지질(1.5/5mg/mL) 및 비오틴(30/90ng/mL)을 알려진 농도의 혈청 샘플에 첨가함에 의해 결정되었다. 회수 백분율은 혈청 샘플을 기준으로 계산되었다.
만성 췌장염 및 췌장암이 있는 환자
2개의 바이오마커 PRO-C11-253 및 PRO-C11-511은 PC(단계 I-IV)(n = 39), 만성 췌장염(CP)(n = 12)이 있는 환자와 연령 및 성별 일치된 건강한 대조군(n = 20)을 포함하는 발견 코호트로부터 전처리 혈청 샘플에서 분석되었다. 더욱이, PRO-C11-511은 PC(단계 I-IV)가 있는 686명의 PC 환자를 포함하는 검증 코호트로부터 전처리 혈청 샘플에서 분석되었다. 건강한 대조군은 상업적 공급업체인 Valley BioMedical(미국 버지니아주 소재)로부터 획득되었다(환자 인구통계는 표 2 참조). Valley BioMedical은 적절한 기관 검토 위원회/독립 윤리 위원회가 샘플 수집을 승인했으며 모든 대상체가 정보에 입각한 동의를 제출했다. 모든 PC 및 CP 환자는 덴마크 BIOPAC 연구 "췌장암이 있는 환자에서 BIOmarkers"(NCT03311776)로부터의 것이었다. 환자는 2008년 12월부터 2017년 9월까지 6개의 덴마크 병원에서 모집되었다. PC 환자는 조직학적으로 종양이 확인되었다. PC 환자는 국가 지침(www.gicancer.dk)에 따라 다양한 유형의 화학요법으로 치료를 받았다. 연구는 건강 연구 윤리에 관한 덴마크 지역 위원회의 권고에 따라 수행되었다. BIOPAC 프로토콜은 건강 연구 윤리에 관한 덴마크 지역 위원회(VEK ref. KA-20060113) 및 데이터 보호 기관(j.nr. 2006-41-6848)에 의해 승인되었다. 모든 대상체는 헬싱키 선언문 버전 8에 따라 서면 동의서를 제출했다. 혈액 샘플은 진단 시 또는 수술 전에 획득되었다. 샘플은 혈액에 대해 국가적으로 승인된 표준 운영 절차(www.herlevhospital.dk/biopac.dk)에 따라 처리되었다. 환자로부터 혈청 샘플과 임상 데이터가 전향적으로 수집되었다. 혈청 샘플은 맹검으로 측정되었다. 임상 데이터는: 연령, 성별, 전이 부위의 수, 간 전이, BMI, 단계, 당뇨병, 담배 사용, 알코올 사용, CA19-9(중앙값), 활동도(PS), Charlson 연령 동반이환 지수(CACI), 전반적인 생존(OS)을 포함했다.
표 2: 환자 인구통계 및 임상 프로필. A) 발견 코호트. B) 검증 코호트. DHAR: 덴마크 보건 당국 권장사항, CA19-9: 탄수화물 항원(U/mL).
A)
B)
전이성 흑색종이 있는 환자
PRO-C11-511 수준은 항-PD-1 요법(펨브롤리주맙)으로 치료받은 전이성 흑색종이 있는 환자 35명으로부터 치료전 혈청 샘플에서 측정되었다. 환자들은 1975년 헬싱키 선언에 따라 덴마크의 수도권 윤리 위원회의 정보에 입각한 동의 및 승인을 받은 후 허를레브 소재 코펜하겐 대학 병원에서 표준 치유로 펨브롤리주맙으로 치료를 받았다. 혈청 샘플은 맹검으로 측정되었다.
다양한 암 유형이 있는 환자
Pro-C11-511 수준은 222개의 암 샘플과 33개의 건강한 샘플로 구성된 추가 환자 코호트로부터의 샘플에서 측정되었다. 그것은 췌장암, 대장암, 신장암, 위암, 유방암, 방광암, 폐암, 흑색종, 두경부암, 전립선암의 각 20명 환자, 19명 난소암 환자, 3명 간암 환자, 33명 나이 일치된 건강한 대조군을 포함했다. 모든 암 샘플은 Proteogenex(미국 캘리포니아주 로스앤젤레스 소재)로부터 수득되었고 건강한 대조군은 BioIVT(미국 뉴욕주 웨스트버리 소재)로부터 수득되었다. 코호트 특성의 요약은 표 3에서 찾을 수 있다.
표 3: 코호트의 환자 인구통계.
통계적 분석
바이오마커 결과는 REMARK(종양 마커 예후 연구에 대한 보고 권장사항) 지침에 따라 보고된다.
Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 PC, CP 및 건강한 대조군의 PRO-C11-253과 PRO-C1-511 바이오마커 수준 간의 차이를 테스트했다. 카플란-마이어 곡선을 사용하여 높은(>75% 사분위수) 낮은(<75% 사분위수) PRO-C11-253 및 PRO-C511 바이오마커 수준과 전반적인 생존(OS) 사이의 차이를 평가했다. 환자는 BIOPAC 연구에 포함된 날짜부터 후속 조치의 종료까지 또는 어떤 원인으로든 사망할 때까지 중 먼저 도래하는 것까지 추적되었다. 단변량 Cox 비례-위험 회귀 모델은 PRO-C11-511 바이오마커 수준 및 임상 공변량인: 연령(연속적), 성별(여성 대 남성), 전이 부위의 수(<1 대 ≤1), 간 전이(예 대 아니오/기타), BMI(연속적), 단계(지속적 및 III+IV 대 I+II), 당뇨병(예 대 아니오), 담배 사용(항상 대 결코 아님), 알코올 사용(덴마크 보건 당국 권장사항 미만 대 남용), CA19-9(>중앙값), 활동도(PS)(2 대 ≤1, 2 대 0, 2+3 대 0+1) 및 Charlson 연령 동반이환 지수(CACI)(≥4 대 <4)에 따라 OS에 대한 95% 신뢰 구간(CI)으로 위험비(HR)를 계산하는 것이었다(Asano 등, 2017). PRO-C11-511, 연령, 전이 부위(<1 대 ≤1), 간 전이(예 대 아니오/기타), 단계(III+IV 대 I+II), CA19-9(>중앙값) 및 PS(2+3 대 0+1)를 포함한 다변량 Cox 비례-위험 회귀 모델을 사용하여 PRO-C11-511 바이오마커의 잠재적인 독립적 예후 가치를 평가했다. p<0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. GraphPad Prism 버전 8.2(GraphPad Software, Inc.) 및 MedCalc 버전 19.3(Medcalc Software)을 사용하여 그래프 디자인 및 통계적 분석을 수행하였다.
전이성 흑색종이 있는 환자에서 PRO-C11-511 수준과 무-진행 생존(PFS) 및 전반적인 생존(OS) 사이의 연관성은 카플란 마이어 분석 및 Cox 회귀 분석이 단독으로 그리고 종양 PDL1 발현 및 BRAF 돌연변이 상태에 대해 조정한 후 평가되었다.
다양한 암 유형을 갖는 환자로부터 얻은 샘플의 분석은 일반 일원 ANOVA를 사용한 그룹 간 PRO-C11-511 수준의 비교 후 이어지는 Dunnett 테스트를 사용한 대조군에 대한 쌍별 비교를 포함했다. 0.05 미만의 p-값은 유의한 것으로 간주되었다. 통계적 분석 및 그래프는 R 버전 4.0.4(R Core Team(2021), R Foundation for Statistical Computing, 오스트리아의 비엔나 소재, https://www.R-project.org)에서 수행되었다.
결과
PRO-C11-253 및 PRO-C11-511 항체의 특이성
그 각각의 결합 부위에 대한 PRO-C11-253 및 PRO-C11-511 항체의 항체 특이성을 보장하기 위해, 그 반응성이 상기에 논의한 바와 같이 예비 경쟁 ELISA에서 표준, 신장형, 절삭형 및 넌센스 표준 펩티드에 대한 테스트되었다. PRO-C11-511 항체에 대해 선택된 넌센스 펩티드는 PRO-C11-253 표준 펩티드였다(상기 표 1 참조). 더욱이, 그 반응성은 미스매치 아미노산 서열을 갖는 선택-해제 펩티드에 대해 테스트되었다. 선택 펩티드 둘 모두는 그 각각의 항체로 용량-의존적 방식으로 신호를 억제했다. 신장형, 절삭형 펩티드 및 넌센스 펩티드에 대해 반응성은 없었고, 선택-해제 펩티드에 대해 최소 반응성이 있었다. 더욱이, 넌센스 비오티닐화된 코팅 펩티드를 사용할 때 검출 가능한 신호가 관찰되지 않았다(도 2).
함께, 이들 데이터는 단일클론 항체가 그 각각의 표적 부위에 대해 높은 네오-에피토프 특이성을 나타낸다는 것을 시사한다.
PRO-C11-253 및 PRO-C11-511 ELISA의 기술적 평가
PRO-C11-253 및 PRO-C11-511 ELISA 검정의 기술적 성능은 표 4에 요약되어 있다. 검정의 측정 범위(LLMR 내지 ULMR)는 PRO-C11-253에 대해 3.1 - 103.0ng/mL 및 PRO-C11-511에 대해 1.6 - 117.5ng/mL로 측정되었다. PRO-C11-253에 대한 검정-내 및 검정-간 변동은 각각 5% 및 9%, PRO-C11-511%에 대해 5%였다. 인간 혈청에 대한 평균 희석 회수율은 비희석된 상태에서 1:2 희석으로 관찰된 PRO-C11-253의 경우 112%, PRO-C11-511의 경우 85.5%였다. PRO-C11-253의 경우 102.7%, PRO-C11-511의 경우 92.5%로 평균 스파이킹 회수율이 결정되었다. 분석물질 안정성은 동결/해동 주기와 4℃ 및 20℃에서의 샘플 안정성에 따라 분석되었다. 혈청 내 분석물질 회수율은 4회 동결/해동 주기 후 PRO-C11-253의 경우 99.9%, PRO-C11-511의 경우 93.0%였다. 분석물질은 4℃에서 2시간 내지 48시간 동안 인간 혈청의 장기간 보관한 후 회수되었으며, 그 결과 PRO-C11-253의 경우 105.2 - 92.2%, PRO-C11-511의 경우 91.5 - 90%의 범위인 회수율을 초래했다. 20℃, 2시간 내지 48시간 경우, PRO-C11-253에 대한 회수율 범위는 104.7 - 80.1% 및 PRO-C11-511에 대한 회수율 범위는 91.2 - 119.1%였다. 이들 데이터는 혈청 분석물질 PRO-C11-253 및 PRO-C11-511이 결합하여 4℃ 및 20℃에서 최대 48시간 동안 안정함을 나타낸다. PRO-C11-253의 경우 83.5 - 127.7% 및 PRO-C11-511의 경우 95.6 내지 107.9%의 범위인 회수율로 지질 또는 헤모글로빈의 낮거나 높은 함량으로부터 간섭이 감지되지 않았다.
표 4. PRO-C11-C253 및 PRO-C11-511 검정의 기술적 검증
건강한 공여자, CP가 있는 환자 및 PC가 있는 환자로부터 혈청에서 PRO-C11-253 및 PRO-C11-511의 임상 평가
PRO-C11-253 및 PRO-C11-511의 임상적 관련성을 평가하기 위해 건강한 대조군(n = 20), CP가 있는 환자(n = 12) 및 PC가 있는 환자(n = 39)의 코호트로부터의 혈청에서 바이오마커를 측정하였다. 건강한 대조군, CP 및 PC 환자 간에 PRO-C11-253에는 유의한 차이가 없었지만, PRO-C11-511은 건강한 대조군에 비해 CP(p = 0.0116) 및 PC(p < 0.0001)가 있는 환자에서 유의하게 증가했다(도 3a 및 b). 바이오마커 수준과 PC의 단계 사이에는 차이가 없었다(데이터는 도시되지 않음). 더욱이, PRO-C11-253과 PRO-C11-511 바이오마커 측정 사이에는 상관관계가 없었다(r, 0.14, p = 0.3827).
다음으로, PRO-C11-253 및 PRO-C11-511의 예후 가치는 상기에 언급된 39명의 PC 환자의 동일한 검증 코호트에서 카플란-마이어 곡선 및 Cox-비례 위험 모델을 사용하여 조사되었다. 카플란-마이어 곡선 및 Cox-비례 위험 모델은 PRO-C11-253의 높은(>75%) 및 낮은(<75%) 바이오마커 수준이 OS(p = 0.9958, HR 1.00, 95% Cl 0.42-2.35)와 연관되어 있지 않음을 보여주었다. 높은(>75%) 및 낮은(<75%) PRO-C11-253을 갖는 환자에 대한 중앙값 OS는 각각 1.2년 및 1.3년이었다(도 4a). 흥미롭게도, PRO-C11-511 바이오마커 수준과 생존 사이의 연관성을 평가할 때, 높은 PRO-C11-511(>75%)은 낮은 PRO-C11-511(<75%)에 비해 더 짧은 OS와 유의하게 연관되었다(p = 0.0045, HR 3.33, 95% CI 1.44-7.69). 더욱이, 높은(>7%: 0.3년) 및 낮은 PRO-C11-511(<75%: 2.2년)을 갖는 환자에 대한 중앙값 OS 간에는 7배의 차이가 있었다(도 4b). 이들 데이터는 PRO-C11-253이 아닌 PRO-C11-511이 PC가 있는 환자에서 예후 가능성을 가질 수 있고 동일한 단백질에서 특정 에피토프를 측정하면 다른 값을 제공할 수 있음을 나타낸다.
검증 코호트에서 예후 바이오마커로서의 PRO-C11-511의 확인
상기에 기재된 PC 발견 코호트에서 발견된 PRO-C11-511의 예후 바이오마커 가능성을 검증하기 위해 PRO-C11-511 수준을 PC가 있는 환자의 더 큰 코호트(n = 686)에서 측정했다. 흥미롭게도, 환자를 그 각각의 질환 단계(단계 I-IV)로 나누었을 때 단계 II-IV 및 단계 III 내지 IV로 PRO-C11-511에서 유의한 증가가 있었다(도 5). 다음으로, 본 발명자들은 높은(>75%) 및 낮은(<75%) PRO-C11-511과 OS 사이의 연관성을 관찰하였다. 발견 코호트와 마찬가지로, 높은 PRO-C11-511(>75%)은 낮은 PRO-C11-511(<7%)과 비교하여 더 큰 연구 모집단에서 더 짧은 OS와 유의하게 연관되었다(p < 0.0001, HR 1.68, 95% C1.40-2.02). 높은 PRO-C11-511(>75%)이 있는 환자에 대한 중앙값 OS는 0.48년이었고 낮은 PRO-C11-511(<75%)이 있는 환자의 경우 0.82년이었다(도 6a). 흥미롭게도, 기준선 이후 2년에 높은 PRO-C11-511 환자 그룹에서 7.0%만이 생존하여 낮은 PRO-C11-511 환자 그룹에서의 21%에 비교되었다(도 6b). 이들 데이터는 PRO-C11-511이 PC가 있는 환자에서 예후 가능성이 있음을 확인한다.
PRO-C11-511과 OS의 연관성이 임상 공변량과 독립적인지 평가하기 위해 PRO-C11-511을 연령, 전이 부위(<1 대 ≤1), 간 충족(예 대 없음/기타), 단계(III+IV 대 I+II), CA19-9(>중앙값) 및 PS(2+3 대 0+1)에 대해 조정한 다변량 Cox 분석을 수행하였다. 분석은 높은 수준의 PRO-C11-511(>75%)은 임상적 공변량에 의존하지 않았고 따라서 조정 후에도 여전히 PC 환자에서 OS를 예측할 수 있는 것으로 나타났다(p < 0.0021, HR 1.41, 95% Cl 1.13- 1.74(표 5A 및 B).
표 5: 췌장암이 있는 환자에 대한 바이오마커 수준, 임상 공변량 및 결과 간의 연관성. 단변량 (a) 및 다변량 (b) cox 비례-위험 회귀를 사용하여 95% CI 및 p-값으로 위험 비율(HR)을 계산했다. P<0.05는 유의한 것으로 간주된다. DHAR: 덴마크 보건 당국 권장사항, PS: 치료-전 수행 상태, CACI: Charlson 연령 동반이환 지수.
A)
B)
전이성 흑색종 환자에서 PRO-C11-511의 임상 평가
전이성 흑색종 환자에서 PRO-C11-511과 생존 결과 사이의 연관성을 카플란-마이어 분석에 의해 평가했다. 75번째 백분위수 컷 포인트를 사용하여, 높은 PRO-C11-511 수준(>75번째 백분위수)을 가진 환자가 PFS(p=0.032) 및 OS(p=0.020)가 유의하게 더 나쁜 것으로 밝혀졌다(도 7). 이를 뒷받침하기 위해 일변량 Cox 회귀 분석은 빈약한 PFS(HR=2.87, 95%CI=1.05-7.87, p=0.040) 및 OS(HR=4.58, 95%CI=1.13-18.65, p=0.034)의 예측인자로 높은(>75번째 백분위수) 기준선 PRO-C11-511을 식별했다. 더욱이, PRO-C11-511이 PDL1 발현(≥1%) 및 BRAF 돌연변이에 대해 조정되었을 때, 바이오마커는 불량한 PFS(HR=3.66, 95%CI=1.22-10.98, p=0.021) 및 OS( HR=7.85, 95%CI=1.32-46.78, p=0.024)를 독립적으로 예측하였다(표 6).
표 6. 무-진행 생존 및 전반적인 생존 결과를 예측하기 위한 Cox 회귀 분석
다양한 암 유형이 있는 환자에서 Pro-C11-511의 임상 평가
다른 유형의 암에서 PRO-C11-511의 임상적 관련성을 확인하기 위해 PRO-C11-511의 수준을 222개의 암 샘플로 구성된 추가 환자 코호트(각각 20명의 환자의 췌장암, 대장암, 신장암, 위암, 유방암, 방광암, 폐암, 흑색종암, 두경부암, 및 전립선암, 19명 난소암 환자, 3명 간암 환자) 및 33명의 연령 일치 건강한 대조군으로부터의 혈청 샘플에서 측정했다. PRO-C11-511 수준은 건강한 대조군과 비교하여 모든 암 유형에서 증가했고, 간암을 제외한 모든 암 유형에서 유의하게 증가했다(도 8).
본 명세서에서 명시적으로 달리 표시하지 않는 한, '또는'이라는 단어는 명시된 조건 중 하나 또는 둘 모두를 충족될 때 참 값을 반환하는 연산자의 의미로 사용되고, 조건 중 하나만 충족되도록 요하는 연산자 '배타적 또는'에 반대이다. '포함하는'이라는 단어는 '포괄하거나 구성하는'을 의미하는데 사용된다. 상기에 인정한 모든 이전 교시는 이로써 참조로 합체된다. 본 명세서에서 임의의 이전에 공개된 문서에 대한 어떠한 인정도 그 교시가 호주 또는 그 날짜에 다른 곳에서 공통적인 일반 지식이었다는 것을 인정하거나 진술하는 것으로 간주되어서는 안된다.
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SEQUENCE LISTING <110> Nordic Bioscience A/S <120> Assay for detecting Collagen XI biomarkers <130> P21235WO <150> GB2020399.8 <151> 2020-12-22 <160> 16 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Asp Gly Ser Lys Gly Pro Thr Ile Ser Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Asp Gly Ser Lys Gly Pro Thr Ile Ser Ala Gln 1 5 10 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Asp Gly Ser Lys Gly Pro Thr Ile Ser 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> Biotinylated via an optional linker <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Asp Gly Ser Lys Gly Pro Thr Ile Ser Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Asp Ser Ser Ala Pro Lys Ala Ala Gln Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> Covalently cross-linked to Keyhole Limpet Hemocyanin <220> <223> Synthetic peptide <400> 6 Cys Gly Gly Asp Ser Ser Ala Pro Lys Ala Ala Gln Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> Covalently cross-linked to Keyhole Limpet Hemocyanin <220> <223> Synthetic peptide <400> 7 Cys Gly Gly Asp Gly Ser Lys Gly Pro Thr Ile Ser Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> Biotinylated via an optional linker <220> <223> Synthetic peptide <400> 8 Asp Ser Ser Ala Pro Lys Ala Ala Gln Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 9 Asp Ser Ser Ala Pro Lys Ala Ala Gln Ala Gln 1 5 10 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 10 Asp Ser Ser Ala Pro Lys Ala Ala Gln 1 5 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 11 Leu Leu Ala Arg Asp Phe Glu Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> 11 <223> Biotinylated <400> 12 Leu Leu Ala Arg Asp Phe Glu Lys Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 13 Asp Pro Gln Val Gln Lys Ala Ala Gln Ala 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 14 Pro Asp Pro Gly Pro Glu Ala Ala Gln Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 15 Asp Glu Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gln Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 16 Val Pro Gln Asp Ala Pro Thr Ile Ser Ala 1 5 10

Claims (21)

  1. C-말단 아미노산 서열 DGSKGPTISA(서열번호: 1)를 갖는 펩티드의 C-말단을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 단일클론 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 C-말단 아미노산 서열 DGSKGPTISAQ(서열번호: 2)를 갖는 펩티드에는 특이적으로 결합하지 않는, 단일클론 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 C-말단 아미노산 서열 DGSKGPTIS(서열번호: 3)를 갖는 펩티드에는 특이적으로 결합하지 않는, 단일클론 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 C-말단 아미노산 서열 DGSKGPTISA(서열번호: 1)를 갖는 합성 펩티드에 맞서 생성된 것인, 단일클론 항체.
  5. 면역검정의 방법으로서, 상기 방법은:
    i) 환자로부터의 샘플을, C-말단 아미노산 서열 DGSKGPTISA(서열번호: 1)를 갖는 펩티드의 C-말단을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 단일클론 항체와 접촉시키는 것; 및
    ii) 상기 샘플에서 상기 단일클론 항체와 펩티드 사이의 결합의 양을 검출하고 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 방법은 환자에서 질환을 검출 및/또는 모니터링하고/하거나 환자에서 질환의 중증도 또는 예후를 평가하기 위한 면역검정의 방법이며, 상기 방법은 추가로:
    iii) 단계 (ii)에서 측정된 상기 단일클론 항체의 상기 결합의 양에 대해, 정상적인 건강한 대상체와 연관된 값, 및/또는 공지된 질환 중증도 또는 예후와 연관된 값 및/또는 이전 시점에서 상기 환자로부터 얻은 값, 및/또는 미리결정된 컷-오프 값과의 상관성을 보는 것을 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 질환은 췌장암 또는 만성 췌장염인, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 질환은 흑색종인, 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 질환은 기질- 및 암 연관된 섬유아세포-풍부 종양 미세 환경을 갖는 암인, 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 질환은 방광암, 유방암, 대장암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암 또는 위암인, 방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 질환은 암이고, 상기 방법은 하나 이상의 화학요법제 및/또는 면역 체크포인트 억제제로의 치료로 환자 생존 또는 무-진행 생존의 예상되는 기간을 평가하기 위한 방법인, 방법.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 C-말단 아미노산 서열 DGSKGPTISAQ(서열번호: 2)를 갖는 펩티드에는 특이적으로 결합하지 않는, 방법.
  13. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 C-말단 아미노산 서열 DGSKGPTIS(서열번호: 3)를 갖는 펩티드에는 특이적으로 결합하지 않는, 방법.
  14. 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 C-말단 아미노산 서열 DGSKGPTISA(서열번호: 1)를 갖는 합성 펩티드에 맞서 생성된 것인, 방법.
  15. 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 선택되는 생체액 샘플인, 방법.
  16. 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역검정은 경쟁 검정 또는 샌드위치 검정인, 방법.
  17. 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역검정은 방사면역검정 또는 효소 결합 면역흡착 검정인, 방법.
  18. 면역검정 키트로서, C-말단 아미노산 서열 DGSKGPTISA(서열번호: 1)를 갖는 펩티드의 C-말단을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 단일클론 항체 및; 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 면역검정 키트:
    - 스트렙타비딘 코팅된 웰 플레이트;
    - 비오티닐화된 펩티드 비오틴-L-DGSKGPTISA(서열번호: 4), 여기서 L은 선택적 링커임;
    - 샌드위치 면역검정에 사용하기 위한 2차 항체;
    - 서열 DGSKGPTISA(서열번호: 1)를 포함하는 캘리브레이터 단백질;
    - 항체 비오티닐화 키트;
    - 항체 HRP 표지 키트;
    - 항체 방사성표지 키트; 및
    - 검정 시각화 키트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 C-말단 아미노산 서열 DGSKGPTISAQ(서열번호: 2)를 갖는 펩티드에는 특이적으로 결합하지 않는, 면역검정 키트.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 C-말단 아미노산 서열 DGSKGPTIS(서열번호: 3)를 갖는 펩티드에는 특이적으로 결합하지 않는, 면역검정 키트.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 C-말단 아미노산 서열 DGSKGPTISA(서열번호: 1)를 갖는 합성 펩티드에 맞서 생성된 것인, 면역검정 키트.
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