ES2398328B1 - Métodos y productos para el diagnóstico in vitro, pronóstico in vitro y desarrollo de fármacos contra carcinomas invasivos. - Google Patents

Métodos y productos para el diagnóstico in vitro, pronóstico in vitro y desarrollo de fármacos contra carcinomas invasivos. Download PDF

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Abstract

Métodos y productos para el diagnóstico in vitro, pronóstico in vitro y desarrollo de fármacos contra carcinomas invasivos.#La presente invención se refiere a métodos y productos in vitro para detectar la presencia de un carcinoma invasivo en un individuo, para determinar y/o pronosticar el estadio y/o la invasividad de dicho carcinoma en un individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho carcinoma basados en la expresión del gen col11a1 y de la proteína proCOL11A1. La invención también se refiere a la búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia de dicho carcinoma, con el fin de desarrollar nuevos medicamentos. La invención también se refiere a agentes que inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína proCOL11A1 y/o los efectos de esta expresión.

Description

MÉTODOS Y PRODUCTOS PARA EL DIAGNÓSTICO IN VITRO, PRONÓSTICO IN VITRO Y DESARROLLO DE FÁRMACOS CONTRA CARCINOMAS INVASIVOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a métodos y productos in vitro para detectar la presencia de un carcinoma invasivo en un individuo, para determinar y/o pronosticar el estadío y/o la invasividad de dicho carcinoma en un individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho carcinoma. La invención también se refiere a la búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia de dicho carcinoma, con el fin de desarrollar nuevos medicamentos. La invención también se refiere a agentes que inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína proCOL11A1, y/o los efectos de esta expresión.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El Cáncer es uno de los principales problemas de salud pública a escala mundial. Según la base de datos GLOBOCAN, de la Agencia Internacional de Investigación en Cáncer, perteneciente a la Organización Mundial de la Salud, más de 10 millones de casos de cáncer se diagnosticaron en todo el mundo durante el año 2000, y el número de muertes debidas al cáncer el año 2.000 fue superior a 6 millones de personas.
A pesar de todos los avances que se han producido en los últimos 20 años, el cáncer es todavía una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Durante estos años se ha avanzado con éxito en la prevención y el tratamiento de estadíos tempranos de muchas de las distintas enfermedades que se engloban en este término. Sin embargo muy pocos han sido los avances en el desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico o de tratamiento de estadíos avanzados e invasivos de la enfermedad.
Las células tumorales durante el proceso de malignización cambian su patrón de expresión génica, lo que altera procesos celulares, tales como el mantenimiento de la arquitectura celular, la adhesión, la muerte y la proliferación celular. Estas modificaciones no sólo generan cambios en las propias células, sino que hacen que algunas células del estroma reciban señales moleculares alteradas y cambien su pauta de comportamiento y su patrón de expresión génica, adquiriendo una morfología típica de miofibroblastos. Lasmoléculas secretadas por estos miofibroblastos en respuesta al tumor adyacente pueden a su vez contribuir de diferente manera a promover el crecimiento e invasión tumoral, de manera que se establece un bucle paracrino entre tumor y estroma. En los últimos años, se han generado evidencias científicas que apuntan cada vez con mayor precisión hacia el estroma peritumoral, como uno de los principales promotores de la invasividad tumoral, así como de fenómenos de resistencia a terapia.
Los métodos y productos para diagnóstico y terapia que los autores de la presente invención reivindican, se enmarcan en este novedoso marco de investigación, ya que se basan en la explotación del gen col11a1 y de la proteína proCOL11A1, presente en células del estroma de carcinomas invasivos, como potencial marcador y/o diana terapéutica para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de estos carcinomas.
Un carcinoma invasivo es una neoplasia maligna compuesta por células epiteliales que infiltran y destruyen los tejidos que las rodean; en general, se trata de tumores malignos que, en su crecimiento, infiltran y rompen la lámina basal dando lugar a metástasis. Ejemplos ilustrativos de carcinomas invasivos incluyen el cáncer de páncreas, el carcinoma renal, el carcinoma transicional de vejiga, el carcinoma bronquioalveolar, y el cáncer de mama, entre otros. A diferencia de otros tumores, lo sorprendente del cáncer de páncreas es su homogeneidad clínica fenotípica. El comportamiento clínico del cáncer de páncreas es homogéneo y siempre infausto, sin diferencias notables en la supervivencia según el estadío. El número de pacientes con cáncer de páncreas de buen pronóstico es insignificante. Una posible explicación es que incluso en pacientes con tumores pequeños, encuadrados en el estadío I, la enfermedad está diseminada. Su diagnóstico en una fase inicial, salvo en casos fortuitos, es difícil; un 75% de los pacientes diagnosticados presentan enfermedad avanzada (Estadíos III y IV). Se trata de una neoplasia muy agresiva, resistente a los tratamientos citostáticos y sólo entre un 1 y un 4% de los casos permanecen vivos a los cinco años del diagnóstico, siempre que el tumor esté localizado y haya podido ser extirpado en su totalidad (Warshaw A.L., and Fernandes.del Castillo C., N. Eng. J. Med., 1992, 326:455-465; Ahlgren J.D., Semin. Oncol. 1996, 23:241-250). El adenocarcinoma ductal de páncreas fue la causa de más de138.000 muertes en el mundo, y de más de 2.600 en España, durante el año 2.008 (GLOBOCAN). Por todo ello, en el caso del cáncer de páncreas, tanto el desarrollo de sistemas de diagnóstico precoz como el de terapias eficaces, resultan cruciales para el control de la enfermedad (Byungwoo R., et al., Cancer Res., 2002, 62:819-826).
En el caso del carcinoma renal, el 50-60% de los pacientes diagnosticados desarrollan metástasis, y el 90-95% de estos pacientes que han desarrollado metástasis muere durante los 5 años siguientes al diagnóstico (Rabinovitch R.A., et al., J. Clin. Oncol., 1994, 12:206-212; Sandock, D.S., et al., J. Urol, 1995, 154:28-31). El carcinoma renal fue la causa de más de 72.000 muertes en el mundo, y de más de 1.200 en España, durante el año 2.008 (GLOBOCAN). Avances en el conocimiento de la Genética del cáncer de riñón han permitido la clasificación de distintos tipos de tumores renales. El subtipo más común es el carcinoma convencional de células renales, que es diferente de los subtipos papilar, cromófobo o ductal colector. El oncocitoma renal es una neoplasia benigna, indistinguible en ocasiones del carcinoma renal, que es una neoplasia maligna. Estudios previos han demostrado que todos estos subtipos histológicos son distintos genética y biológicamente, y que tanto su morfología como comportamiento están determinados por factores moleculares distintivos (Kovacs G., et al., J. Pathol., 1997, 183:131-133), pero todavía no hay ningún marcador que se haya demostrado útil en ensayos clínicos. El tratamiento del carcinoma renal es extremadamente difícil por su capacidad de extenderse sin producir síntomas, por su inherente resistencia a la quimioterapia sistémica convencional y por la incapacidad de la radioterapia para reducir los niveles de recaída tras la nefrectomía, incluso en pacientes con afectación nodal o tumores no reseccionados completamente (Kjaer M., et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1987, 13:665-672). Esto hace necesario el desarrollo de aproximaciones terapéuticas alternativas, para tratar los carcinomas renales con mayor eficacia.
El carcinoma transicional de vejiga fue la causa de más de 1.120.000 muertes en el mundo, y de más de 3.400 en España, durante el año 2.008 (GLOBOCAN). Los carcinomas de vejiga se gradúan desde G1 hasta G3 según la OMS (Organización Mundial de la Salud), por estado decreciente de diferenciación celular y creciente de agresividad de la enfermedad. Respecto al estadío, o invasividad, los carcinomas de células transicionales (TCCs) de vejiga se clasifican en superficial con y sin afectación de la lámina propria (Ta y T1), infiltrante de capas profundas (T2 a T4) y el poco común Carcinoma in situ o tumor in situ (TIS). Los tumores de bajo grado (G1) están normalmente confinados a la mucosa o infiltran capas superficiales (estadío Ta y T1). Nuevos sistemas de diagnóstico precoz son necesarios dado que el 80-90% de los pacientes en estadío T2 o mayor, son diagnosticados de novo en ese estadío de gran agresividad y no en estadíos previos (de Vere White, R.W. and Stapp, E., Oncology, 1998, 12:1717-1723). El pronóstico de los pacientes afectados de carcinoma transicional de vejiga invasivo es malo; el 50% de estos pacientes en estadío T2 o mayor, desarrolla metástasis distantes durante los 2 años posteriores al diagnóstico, y el 69% muere durante los 5 años posteriores al diagnóstico, incluso habiendo recibido tratamiento. Son necesarias aproximaciones terapéuticas alternativas para tratar el carcinoma transicional de vejiga invasivo muscular con una mayor eficiencia; también son necesarias aproximaciones terapéuticas alternativas para tratar tumores superficiales de una forma más eficiente que la cirugía, o para complementarla, con el fin de evitar la recidiva y la progresión de tumores a invasividad.
El carcinoma bronquioloalveolar (CBA), también denominado carcinoma de células acinares es un subtipo de adenocarcinoma pulmonar con características suficientemente definidas para ser separado del resto de subtipos. Según la clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS), el CBA es un adenocarcinoma en el que las células tumorales cilíndricas crecen sobre las paredes de un alveolo preexistente. Una característica clave de esta neoplasia, es la preservación del parénquima pulmonar subyacente a la misma. A pesar de que muchos adenocarcinomas pulmonares presentan áreas con patrón de crecimiento bronquioloalveolar, el diagnóstico de CBA debe quedar restringido a aquellas neoplasias que presenten únicamente éste patrón. Los CBA están compuestos fundamentalmente por dos tipos celulares, mucinosos o no mucinosos, siendo el último más común; muchos de los CBA no mucinosos presentan una región fibrosa central o foco de distorsión que puede simular invasión. En la mayoría de estudios los CBA comprenden del 1% al 5% de adenocarcinomas pulmonares, aunque algunos estudios recientes aumentan la incidencia al 15%. El 50% suelen presentarse sin sintomatología previa, como nódulos solitarios periféricos, muchas veces como hallazgo incidental en una radiografía de torax realizada por otras razones. Algunos de los CBA crecen lentamente por varios años sin diseminar, sin embargo, otros que inicialmente comienzan como nódulos solitarios, desarrollan rápidamente metástasis y diseminación bilateral de la enfermedad. Los adenocarcinomas que presenten un patrón bronquioloalveolar, pero muestren algún foco de invasión estromal, deben denominarse adenocarcinomas con patrón bronquioloalveolar; éstos suelen mostrar un mayor grado de atipia, principalmente en el foco de invasión. Los adenocarcinomas bronquioloalveolares plantean diversos diagnósticos diferenciales, tanto con procesos malignos como benignos. Estos pueden resultar complicados; sin embargo, uno de los que más relevancia tiene es con el adenocarcinoma ordinario de pulmón, ya que la supervivencia de los CBA a 5 años es superior a éstos. Los CBA pueden presentar invasión vascular, linfática y pleural, sin embargo, la cirugía puede resultar curativa entre la mitad y dos tercios de los casos.
El cáncer de mama es la neoplasia con mayor tasa de incidencia y mortalidad entre las mujeres, de ahí que su diagnóstico precoz y tratamiento sean de vital importancia. En los últimos años, con la introducción de la genética en la medicina (en especial en la oncología médica), se han realizado diversos descubrimientos que influyen en el pronóstico y tratamiento del cáncer de mama, que han llevado a reclasificar esta patología en cuanto a su perfil genético; los descubrimientos más significativos han sido acerca del componente epitelial de estos tumores, fundamentalmente los factores de crecimiento epidérmico (EGFr y Her-2), que se han convertido en dianas terapéuticas al igual que los receptores de estrógenos y progesterona (Perou C., Sorlie T., Eisen M., 2000, Nature, 406:747-752; Nielsen T., Hsu F., Jensen K., 2004, Clin. Cancer Res, 10:5367-5374). Además, se han desarrollado una serie de marcadores inmunohistoquímicos, de gran utilidad para diferenciar entre lesiones benignas y malignas en los casos en que las técnicas histoquímicas convencionales son insuficientes. En la mama existen lesiones benignas esclerosantes, principalmente la adenosis esclerosante y la cicatriz radial que, en ocasiones (debido a su patrón morfológico), plantean dificultad en el diagnóstico diferencial con lesiones malignas infiltrantes (tales como el carcinoma tubular y carcinoma ductal infiltrante); esta situación es aún más compleja en biopsia con aguja gruesa, ya que al no existir una representación total de la lesión no se pueden apreciar los contornos de la misma, lo cual es una de las claves para el diagnóstico diferencial, especialmente cuando con las tinciones habituales no se pueden reconocer las células basales mioepiteliales presentes en las lesiones benignas y ausentes en las lesiones malignas infiltrantes.
Existen marcadores inmunohistoquímicos (como la p63, la α-actina, la miosina de cadenas pesadas para músculo liso, la calponina, la proteína s100, o el CD10) que tiñen las células mioepiteliales de los conductos mamarios, ayudando a diferenciar entre este tipo de lesiones. Dentro de estos marcadores, la α-actina, la miosina de cadenas pesadas para el músculo liso y la calponina, presentan una alta sensibilidad (89%) para las células basales mioepiteliales; sin embargo, no son específicas de éstas, tiñendo igualmente a las células musculares lisas vasculares y a los miofibroblastos estromales; problemas semejantes se plantean con s100 y CD10 (Lerwill, M.F., 2004, Am J Surg Path, 28:10761091). Werling y colaboradores (Werling, R. W., Hwang, H., Yaziji, H., 2003, Am J Surg Path, 27:82-90) estudiaron una serie de casos correspondientes a adenosis esclerosante, carcinoma ductal infiltrante, carcinoma lobulillar y carcinoma ductal in situ, analizando el patrón de reactividad de los anticuerpos p63, miosina de músculo liso y calponina, demostrando que todos ellos tiñeron las células mioepiteliales de los casos benignos y malignos no infiltrantes, corroborando a su vez la positividad de miosina y calponina en miofibroblastos y células musculares lisas vasculares. En ese trabajo, p63 fue el marcador que menor reactividad cruzada presentó con los fibroblastos estromales, sin teñir ninguno de ellos, lo cual reveló su alta sensibilidad y especificidad para teñir células mioepiteliales en comparación con el resto de anticuerpos estudiados; no obstante, presentó algunas desventajas como la tinción en ocasiones discontinua de las células mioepiteliales (en particular en los carcinomas in situ) e, igualmente, la positividad focal hasta en un 11% de los casos de las células tumorales. Meryem y colaboradores describieron, por otra parte, la positividad con p63 de 13 casos de carcinoma mamario metaplásico de un total de 14 casos (Meryem, Koker, M., Kleer, C.G., 2004, Am J Surg Path, 28:1506-1512). Actualmente p63 es uno de los marcadores más usados para el diagnóstico diferencial entre lesiones benignas esclerosantes y malignas infiltrantes de la mama; sin embargo, hasta la fecha no existe ningún marcador estromal que ayude a diferenciar entre estas lesiones (Mattia Barbareschi, M., Pecciarini L., Cangi G., 2001, Am J Surg Path, 25:1054-1060). Existe una necesidad de marcadores específicos, en casos en los que las técnicas histoquímicas convencionales son insuficientes para diferenciar entre lesiones benignas esclerosantes y malignas infiltrantes de la mama.
El colágeno es el principal componente de la matriz extracelular (ECM). La correcta expresión de los genes que codifican para los distintos tipos de colágeno es necesaria para el correcto ensamblaje de la ECM durante el desarrollo embrionario y para su mantenimiento en el organismo adulto. El Colágeno XI (COL11) es un tipo de colágeno poco estudiado, pero juega un papel fundamental en la regulación de los entramados fibrilares en matrices cartilaginosas y no cartilaginosas (Li, Y., et la., Cell, 1995, 80:423430); estos entramados de fibras están implicados en distintos procesos de morfogénesis durante el desarrollo embrionario en animales vertebrados. Se han encontrado transcritos de la cadena alpha 1 del Colágeno XI (COL11A1) durante el desarrollo fetal en tejidos cartilaginosos y también en otros tejidos como hueso, riñón, piel, músculo, lengua, intestino, hígado, oído, cerebro y pulmón (Sandberg, J.M., et al., Biochem. J., 1993, 294:595-602; Yoshioka, H., et al., Dev. Dyn., 1995, 204: 41-47). La matriz extracelular tiene también un papel importante en determinados procesos biológicos, como la diferenciación, proliferación y migración celular; por tanto, la desregulación de la expresión de los genes que codifican para las proteínas que la componen, está asociada a procesos de carcinogénesis y metástasis (Boudreau, N., and Bissell, M.J., Curr. Opin. Cell Biol., 1998, 10:640-646; Stracke, M.L., et al., In vivo, 1994, 8:49-58). En el caso particular de COL11A1, se ha demostrado que los fibroblastos del estroma presentan niveles elevados de expresión del gen col11a1 en carcinomas colorrectales esporádicos, mientras que este gen no se expresa en colon sano (Fischer, H., et al., Carcinogenesis, 2001, 22:875-878). Se ha asociado también la expresión del gen col11a1 a cáncer de páncreas, mama, colon, pulmón, cabeza y cuello (Kim, H. et al., BMC Medical Genomics, 2010, 3:51; Iacobuzio-Donahue, C., Am. J. Pathology, 2002, 160(4):1239-1249; Ellsworth, R.E., et al., Clin. Exp. Metastasis, 2009, 26: 205–13; Feng, Y., et al., Breast Cancer Res. Treat., 2007, 103(3):319-329; J.Gast.Liv.dis., 2008; Fischer, H., et al., BMC Cancer, 2001, 1:17-18; Fischer, H., et al., Carcinogenesis, 2001, 22:875-878; Suceveanu, A.I., et al., J. Gastrointestin. Liver Dis, 2009, 18(1):33-38; Chong, IW, et al., Oncol Rep, 2006, 16(5):981-988; Whan, K., Oncogene, 2002, 21:7598-7604; OncolRep, 2007; Schmalbach., C.E., at al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 2004, 130(3):295-302) y vejiga (WO 2005/011619) y la expresión de la proteína COL11A1 a cáncer de páncreas y de colon (Pilarsky, C., et al., J. Cel. Mol. Med., 2008, 12(6B):2823-35; Erkan, M., et al., Mol. Cancer, 2010, 9:88-103; Bowen, K.B., et al., J. Hist. Cyt., 2008, 56(3):275-283); pero no se ha asociado la expresión del gen o la proteína COL11A1 a otros tipos de cáncer (por ejemplo, cáncer de riñón) y tampoco se ha asociado la expresión de la proteína COL11A1 al cáncer de mama, pulmón o cabeza y cuello (la expresión diferencial de un gen no infiere necesariamente la expresión diferencial de la proteína que codifica).
Aunque se dispone de algunos marcadores para diagnosticar diferentes tipos de cáncer y carcinomas, sigue existiendo la necesidad de identificar nuevos marcadores que permitan diferenciar entre diferentes tipos de cánceres y carcinomas cuyo pronóstico es muy diferente, por ejemplo, entre carcinomas renales y oncocitomas benignos renales, entre carcinoma transicional invasivo de vejiga y carcinomas transicionales superficiales de vejiga, entre adenocarcinomas infiltrantes de mama y adenosis esclerosantes de mama, y entre adenocarcinomas ductales de páncreas, pancreatitis y carcinomas de la ampolla de Vater (ampulomas), los cuales tienen mucho mejor pronóstico (21-61% de los pacientes sobreviven 5 años después del diagnóstico, frente al 1-5% de los adenocarcinomas ductales) (Takao S., et al., 1998, Am. J. Surg., 176:467-470; Warshaw A.L. and Fernández-del Castillo, 1992, N. Eng. J. Med., 326:455-465).
Por otra parte, los colágenos son componentes de la matriz extracelular que se sintetizan como procolágenos. Estos procolágenos tienen un dominio central triple-hélice con una estructura en forma de bastón. Este dominio está flanqueado por propéptidos no colagénicos en los extremos N- y C- terminal; estos propéptidos son eliminados por peptidasas específicas al ser secretados al exterior de la célula, donde trímeros de colágeno se ensamblan para formar fibras. Los Procolágenos a1 de los tipos V y XI (proCOL5A1 y proCOL11A1, respectivamente) están codificados por los genes col5a1 y col11a1, respectivamente. Presentan una homología de secuencia de aminoácidos del 75% aproximadamente. El subdominio VAR, en el propéptido N-terminal, presenta la mayor variación de secuencia entre colágenos. No obstante, los anticuerpos, algunos de ellos disponibles comercialmente, que se han utilizado hasta la actualidad para estudiar la expresión la proteína COL11A1, son anticuerpos policlonales que han sido desarrollados contra el dominio central triple-hélice, que está muy conservado entre distintos colágenos, por lo que no discriminan específicamente la expresión de COL11A1 de otros colágenos de similar secuencia aminoacídica, cuya expresión no varía necesariamente durante el proceso tumoral, por lo que pueden conducir a graves errores si se utilizan para el desarrollo de métodos y productos de diagnóstico y pronóstico de carcinomas. Este es el caso por ejemplo del anticuerpo anti-Col11A1 comercializado por la empresa Calbiochem, que presenta reactividad cruzada con la proteína COL9 (Colágeno IX), que no se expresa diferencialmente en carcinomas invasivos.
Recientemente se ha descrito el empleo de la proteína proCOL11A1 como marcador diferencial entre carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello y patologías benignas de cabeza y cuello (García-Ocaña et al., Póster “Immunohistochemical validation of procollagen COL11A1 as a desmoplastic tumor stroma marker”, 18 de noviembre de 2010, III Simposio Internacional del IUOPA, Oviedo); como marcador diferencial entre adenocarcinoma ductal infiltrante de mama y adenosis esclerosante (García Pravia et al., Abstract ESSR2009/218, “Anti-proCOL11A1, a new marker of infiltrating breast cancer”, British J. Surgery, 2009, 96 (S5):11 ; García-Ocaña et al., Póster “Immunohistochemical validation of procollagen COL11A1 as a desmoplastic tumor stroma marker”, 18 de noviembre de 2010, citado supra); y como marcador diferencial entre adenocarcinoma ductal pancreático y pancreatitis crónica [García Pravia et al., Abstract ESSR2009/272, “ProCOL11A1 is an efficient marker of pancreatic cancer” ” Bristish J. Surgery, 2009, 96 (S5):17; García-Ocaña et al., Póster “Immunohistochemical validation of procollagen COL11A1 as a desmoplastic tumor stroma marker”, 18 de noviembre de 2010, citado supra)].
No obstante, los anticuerpos disponibles hasta la fecha no permiten detectar específicamente la proteína proCOL11A1, por lo que el potencial empleo de dicha proteína como marcador diferencial entre distintas patologías, por ejemplo, entre patologías malignas y benignas, no puede ser puesto en práctica de forma fiable en toda su extensión.
Existe, por tanto, la necesidad de desarrollar anticuerpos que permitan detectar específicamente proCOL11A1. Dichos anticuerpos podrían ser utilizados para diferenciar entre diferentes patologías.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han descubierto, tras laboriosa investigación y empleando diferentes técnicas (DNA-chips y PCR cuantitativa para medir los niveles de expresión génica), que la expresión del gen col11a1:
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muy elevada en carcinomas renales, pero no en oncocitomas benignos renales,
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muy elevada en carcinoma transicional invasivo de vejiga, pero no en carcinomas transicionales superficiales de vejiga,
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muy elevada en adenocarcinomas infiltrantes de mama, pero no en adenosis esclerosantes de mama, y
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muy elevada en adenocarcinomas ductales de páncreas, pero no en pancreatitis, ni en carcinomas de la ampolla de Vater (ampulomas).
Por otra parte, los autores de la presente invención han desarrollado anticuerpos policlonales y monoclonales específicamente frente al subdominio VAR, en el propéptido N-terminal de proCOL11A1, que presenta la mayor variación de secuencia entre colágenos, generando así anticuerpos que detectan específicamente proCOL11A1, discriminándolo específicamente de otros colágenos cuya expresión no varía durante el proceso tumoral. Los autores, utilizando estos anticuerpos específicos de proCOL11A1 en técnicas de western-blot y/o inmunohistoquímica, han descubierto que la concentración de la proteína proCOL11A1:
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está aumentada en carcinomas renales, pero no en oncocitomas benignos renales;
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está aumentada en carcinoma transicional invasivo de vejiga, pero no en carcinomas transicionales superficiales de vejiga;
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está aumentada en adenocarcinomas infiltrantes de mama, pero no en adenosis esclerosantes de mama;
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está aumentada en adenocarcinomas pulmonares con patrón bronquioalveolar, pero no en adenocarcinomas bronquioalveolares;
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está aumentada en carcinomas escamosos infiltrantes de cabeza y cuello, pero no en otras patologías benignas de cabeza y cuello; está aumentada en adenocarcinomas de colon, pero no en otras patologías benignas de colon;
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está aumentada en adenocarcinomas ductales de páncreas, pero no en pancreatitis ni en ampulomas; y
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está aumentada en carcinomatosis peritoneales.
Estas evidencias convierten a dichos anticuerpos específicos de proCOL11A1 en los anticuerpos idóneos para el desarrollo de nuevos métodos y productos in vitro de diagnóstico y pronóstico de dichos carcinomas invasivos, y para el desarrollo de compuestos específicos para terapia de carcinomas, particularmente de carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma ductal de páncreas, adenocarcinoma infiltrante de mama, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinomas escamosos infiltrantes de cabeza y cuello y/o carcinomatosis peritoneales.
La presente invención proporciona, por tanto, métodos y productos para detectar in vitro, con alta sensibilidad y especificidad, la presencia de un carcinoma invasivo en un individuo, para determinar o pronosticar el estadío o la severidad de dicho carcinoma en un individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho carcinoma, basado en la detección y/o cuantificación de la proteína proCol11A1, del mRNA del gen col11a1 o el correspondiente cDNA en una muestra de dicho individuo. Asimismo, la presente invención proporciona dianas o herramientas para la búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para la terapia de un carcinoma invasivo. La invención también proporciona agentes inhibidores de la expresión y/o actividad de la proteína proCOL11A1 para el tratamiento de un carcinoma invasivo. En una realización particular, dicho carcinoma invasivo se selecciona entre carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinomas escamosos infiltrantes de cabeza y cuello, y carcinomatosis peritoneales.
Por tanto, en un aspecto, la presente invención se relaciona con unos métodos y unos productos para detectar in vitro, con alta sensibilidad y especificidad, la presencia de carcinomas invasivos, para determinar o pronosticar el estadío o la severidad de dichos carcinomas en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dichos carcinomas, basados en la expresión del gen col11a1 y/o en la proteína proCOL11A1. En una realización dichos carcinomas invasivos se seleccionan entre carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinomas escamosos infiltrantes de cabeza y cuello, y carcinomatosis peritoneales.
En otro aspecto, la invención se relaciona con unos métodos y unos productos para buscar, identificar, desarrollar y evaluar la eficacia de compuestos para la terapia de carcinomas invasivos, basados en la expresión del gen col11a1 y/o en la proteína proCOL11A1. En una realización dichos carcinomas invasivos se seleccionan entre carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma ductal de páncreas, adenocarcinoma infiltrante de mama, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinomas escamosos infiltrantes de cabeza y cuello, y carcinomatosis peritoneales.
En otro aspecto, la invención se relaciona con unos inhibidores de la expresión y/o actividad de la proteína proCOL11A1, o con unos inhibidores de la inducción de la expresión de la proteína proCOL11A1,o de sus efectos carcinogénicos, para su empleo en el tratamiento de carcinomas invasivos. En una realización particular, dichos carcinomas invasivos se seleccionan entre carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma ductal de páncreas, adenocarcinoma infiltrante de mama, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinomas escamosos infiltrantes de cabeza y cuello, y carcinomatosis peritoneales. En otra realización particular, dicho inhibidor es el anticuerpo monoclonal identificado como 1E8.33 o una variante funcional del mismo.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende al menos un agente inhibidor de la expresión y/o actividad de la proteína proCOL11A1, o un agente inhibidor de la inducción de la expresión de la proteína proCOL11A1, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Estos y otros aspectos inventivos y realizaciones particulares se describirán con mayor detalle en la descripción que sigue y en las reivindicaciones que la acompañan.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Salida del programa Multalin v5.4.1. Alineamiento múltiple de las secuencias aminoacídicas de los colágenos tipo I-XXVII. Se muestra la región de máxima homología (aa 2.400-2.500).
Figura 2: Salida del programa Lalin v2.0. Comparación de las secuencias aminoacídicas de los colágenos tipo XI alfa 1 (COL11A1) y V alfa 1 (COL5A1). La región más divergente, seleccionada como candidata para sintetizar el inmunógeno, aparece sombreada.
Figura 3: Gráfico de hidrofobicidad de la proteína COL11A1. En color negro (más oscuro) aparece la región utilizada para diseñar el inmunógeno.
Figura 4: A) Visualización del producto de LCR-PCR; se observa amplificación del fragmento de proCOL11A1-T esperado de 444 nucleótidos de longitud. B) Resultado del screening de las colonias transformantes; las colonias 1-7 resultaron contener el fragmento proCOL11A1-T.
Figura 5: Confirmación por Western-blotting con anti-GST-COL11A1 de la identidad de las proteínas de fusión expresadas.
Figura 6: Verificación de la ausencia de reactividad cruzada del anticuerpo monoclonal (AcM) 1E8.33 con el colágeno V. Calle 1: proCOL5A1 recombinante. Calle 2: pro-COL11A1-T. A) Gel teñido con azul de coomassie como control de carga de ambas proteínas. B) Western-Blot (WB) con el AcM 1E8.33; se observa una correcta detección de proCOL11A1 y ninguna detección de COL5A1.
Figura 7: Ensayos de innmunocitoquímica para comprobar la especificidad del AcM 1E8.33 para proCOL11A1 y la ausencia de reactividad cruzada con proCOL5A1. A y B) células de rabdomiosarcoma A204, que expresan mayoritariamente proCOL11A1. C y D) Células de osteosarcoma SAOS-2, que expresan mayoritariamente proCOL5A1. A y C) detección mediante el AcM 1E8.33 (1E8.33 mAb). B y D) detección mediante el policlonal de conejo anti-proCOL5A1. Se observa tinción intensa de proCOL11A1 en células A204, pero no en células SAOS-2. El anticuerpo frente a proCOL5A1 mostró el patrón inverso.
Figura 8: Test de bloqueo del AcM 1E8.33, para localización del epítopo, realizado mediante western blot de células A204. La detección se realizó con una mezcla del anticuerpo y diferentes péptidos. Calle 1: control negativo sin anticuerpo. Calle 2: FQEYNYG. Calle 3: YNYGTMES. Calle 4: FQEYNYGTMES. Calle 5: YNYGTMESYQTE. Calle 6: YNYGTMESYQTEAPR. Calle 7: control positivo con el AcM 1E8.33 sin bloquear. Solo se observó bloqueo completo en la calle 6.
Figura 9: Detección inmunohistoquímica de la proteína proCOL11A1 en cortes histológicos de biopsias de páncreas procedentes de individuos con adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC). (A) Panorámica del adenocarcinoma ductal de páncreas infiltrante, 25X. (B, C y D) Detalle del tumor y estroma. Se observa tinción citoplasmática de los fibroblastos del estroma desmoplásico. 200X, 200X y 400X.
Figura 10: Detección inmunohistoquímica de la proteína proCOL11A1 en cortes histológicos de biopsias de páncreas procedentes de individuos con ampuloma (A) y de individuos con pancreatitis crónica (B).
Figura 11: Detección inmunohistoquímica de proCOL11A1 en fibroblastos asociados a adenocarcinoma ductal de páncreas. Tinción con el AcM frente a proCOL11A1 (clon 1E8.33) (X400).
Figura 12: Inmunotinción de proCOL11A1 con el AcM 1E8.33 de tejido de mama con un tumor infilitrante (A) y de tejido de mama con adenosis esclerosante y sin presencia de tumor (B). Se observa una clara tinción en el tejido tumoral, y no en el tejido benigno.
Figura 13: Tinción de un tejido de mama con un carcinoma ductal infiltrante (A, C, E) y de un tejido de mama con adenosis esclerosante y sin ningún tumor (B, D, F), con hematoxilina-eosina (A, B), con anticuerpo anti proCOL11A1 1E8.33 (C, D) y con anticuerpo anti p63, que es un marcador de mal pronóstico empleado actualmente en la caracterización de los tumores mamarios (E, F). Se observa un patrón inverso entre la tinción de proCOL11A1 y la de p63, demostrando que proCOL11A1 resulta un indicador de agresividad tumoral.
Figura 14: Tinción de fibroblastos procedentes de cortes histológicos de biopsias de colon, procedentes de individuos con carcinoma de colon. Tinción con Eosina-Hematoxilina y AcM 1E8.33 frente a proCOL11A1.
Figura 15: Detección inmunohistoquímica de proCOL11A1 en fibroblastos procedentes de cortes histológicos de biopsias de laringe, procedentes de individuos con carcinoma de laringe. Tinción con el AcM anti proCOL11A1 (clon 1E8.33) (X400).
Figura 16: Tinción de fibroblastos procedentes de cortes histológicos de biopsias del estroma tumoral desmoplásico de implantes peritoneales, procedentes de individuos con adenocarcinomas de origen endometrial. Tinción con Eosina-Hematoxilina y con el AcM anti proCOL11A1 (clon 1E8.33).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones
Para facilitar la comprensión de la presente solicitud de patente, a continuación se expone el significado de algunos términos y expresiones tal y como se utilizan dentro del contexto de la presente invención.
El término “antagonista” se refiere a cualquier molécula que inhiba la actividad biológica de la molécula agonizada. Ejemplos de moléculas antagonistas incluyen, entre otros, proteínas, péptidos, variaciones de secuencia de péptidos naturales y pequeñas moléculas orgánicas (de peso molecular inferior a 500 daltons).
El término “anticuerpo” se refiere a una glucoproteína que exhibe una actividad de unión específica por una proteína particular, a la que se denomina “antígeno”. El término “anticuerpo” comprende anticuerpos monoclonales, o anticuerpos policlonales, intactos, o fragmentos de ellos; e incluye anticuerpos humanos, humanizados y de origen no humano. Los “anticuerpos monoclonales” son poblaciones homogéneas de anticuerpos, altamente específicos, que están dirigidos contra un único sitio o “determinante” antigénico. Los “anticuerpos policlonales” incluyen poblaciones heterogéneas de anticuerpos, que están dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos.
El término “cáncer” o “carcinoma” se refiere a la enfermedad que se caracteriza por una proliferación descontrolada de células anormales capaces de invadir tejidos adyacentes y diseminarse a órganos lejanos.
El término “cáncer de cabeza y cuello” o “carcinoma de cabeza y cuello” se refiere a cualquier desorden proliferativo maligno de células de la cabeza o el cuello.
El término “cáncer de colon” o “adenocarcinoma de colon” se refiere a cualquier desorden proliferativo maligno de células del colon.
El término “cáncer de mama” o “adenocarcinoma de mama” se refiere a cualquier desorden proliferativo maligno de células de la mama.
El término “cáncer de páncreas” o “adenocarcinoma de páncreas” se refiere a cualquier desorden proliferativo maligno de células ductales del páncreas.
El término “cáncer de riñón” o “carcinoma renal” se refiere a cualquier desorden proliferativo maligno de células del riñón.
El término “carcinoma transicional de vejiga” se refiere a cualquier desorden proliferativo maligno de células del epitelio transicional de vejiga.
El término “cDNA” se refiere a una secuencia de nucleótidos, complementaria de una secuencia de mRNA.
El término “diana terapéutica” se refiere a secuencias nucleotídicas o peptídicas, contra las que se puede diseñar y aplicar clínicamente un fármaco o compuesto terapéutico.
El término “DNA” se refiere al ácido desoxirribonucleico. Una secuencia de DNA es una secuencia de desoxirribonucleótidos.
El término “epítopo”, tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un determinante antigénico de una proteína, que es la secuencia de aminoácidos de la proteína que un anticuerpo específico reconoce.
El término “especificidad” se refiere a la detección de falsos positivos (diagnóstico positivo de carcinoma, cuando el paciente no está afectado de carcinoma); una especificidad del 100% significa que no hay falsos positivos.
El término “fase sólida”, tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una matriz no acuosa a la que se puede unir el anticuerpo. Ejemplos de materiales para fase sólida incluyen vidrio, polisacáridos, por ejemplo agarosa, poliacrilamida, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. Ejemplos de formas de fase sólida son el pocillo de una placa de ensayo o una columna de purificación.
El término “gen” se refiere a una cadena molecular de desoxirribonucleótidos, que codifica una proteína.
El término gen “col11a1” se refiere al gen que codifica un componente del colágeno XI denominado “cadena pro-α1(XI)” que se combina con otras dos cadenas de colágeno (pro-α2(XI) y pro-α1(II)) para formar una molécula de procolágeno (proCOL11A1) que es procesada enzimáticamente en las células para formar las fibras de colágeno XI. El gen col11a1 humano (también conocido como COLL6 o STL2), cuya secuencia génica de referencia es NG_008033.1, ocupa unas 150 kilobases (kb), contiene 68 exones, se localiza en el cromosoma 1 (1p21) entre los pares de bases 103342023 y 103574052, y codifica una proteína de 1806 aminoácidos (según la isoforma) y 181 KDa que contiene un péptido-señal (aminoácidos 1-36). Este gen está conservado en humanos, chimpancé, vaca, pollo, ratón, rata y pez cebra. Mutaciones en este gen se han asociado a los síndromes Stickler II y Marshall. Polimorfismos de un nucleótido en este gen se han asociado a susceptibilidad de padecer hernia discal lumbar. Se han descrito varios transcritos que se diferencian principalmente en la transcripción de las variantes del exón 6, por ejemplo, uno de 7,2 kb, que codifica la isoforma A (NM_001854.3 (GI:98985806), base de datos NCBI a fecha 21 de julio de 2011) de 1.806 aminoácidos, otro de 7,3 kb, que codifica la isoforma B (NM_080629.2 base de datos NCBI a fecha 21 de julio de 2011) de 1806 aminoácidos (GI:98985810), otro de 6,9 kb, que codifica la isoforma C (NM_080630.3 (GI:299523252), base de datos NCBI a fecha 21 de julio de 2011) de 1690 aminoácidos (GI:299523253), otro de 7,2kb que codifica la isoforma E (NM_001190709.1, base de datos NCBI a 1 de agosto de 2011) de 1767 aminoácidos (GI:299523257), etc. El término “col11a1”, tal y como se usa en la presente descripción, no se refiere únicamente al gen humano sino también a los ortólogos de otras especies. Se observa expresión baja y homogénea del gen col11a1 en todos los tejidos analizados excepto en adipocitos dónde es notablemente más elevada (BioGPS: Gene Atlas U133A). En líneas celulares, se detecta expresión elevada en células UASMC (células de músculo liso de arteria umbilical), HN_NP (precursores neuronales), HN_Os (osteoblastos), Panc-1 (células de cáncer de páncreas), H522 (células de cáncer de pulmón) y U251 (células de glioma) (RefExA), A-204 (células de rabdomiosarcoma de corazón), SAOS-2 (células de osteosarcoma de médula ósea) y SK-MEL28 (células de cáncer de piel) (GeneCards).
Los términos “individuo” o “sujeto” se refieren a miembros de especies de animales mamíferos, e incluye, pero no se limita, a animales domésticos, primates y humanos; el sujeto es preferiblemente un ser humano, masculino o femenino, de cualquier edad o raza.
El término “mRNA” se refiere al ácido ribonucleico mensajero, que es la fracción del RNA total que se traduce a proteínas.
La expresión “mRNA transcrito de” se refiere a la transcripción del gen (DNA) en mRNA, como primer paso para que el gen se exprese y traduzca a proteína.
La expresión “niveles elevados” significa que los niveles medidos en pacientes afectados de un carcinoma invasivo, por ejemplo, carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga o adenocarcinoma ductal de páncreas, etc., son superiores a los niveles medidos en una población control de sujetos sin historial de dicho carcinoma invasivo.
El término “oligonucleótido cebador” o “cebador” se refiere a una secuencia nucleotídica, que es complementaria de una secuencia nucleotídica del gen col11a1. Cada cebador hibrida con su secuencia nucleotídica diana y actúa como un sitio de inicio para la polimerización del DNA.
Los términos “péptido” y “polipéptido” se refieren a un fragmento proteico. Los términos “proteína”, “péptido” y “polipétido” se usan indistintamente en esta descripción.
El término “proCOL11A1” se refiere a la cadena a1 del colágeno XI, cuyo procesamiento da lugar al colágeno XI α1 (COL11A1). El proCOL11A1 tiene un dominio central triplehélice con una estructura en forma de bastón, el cual está flanqueado por propéptidos no colagénicos en los extremos N- y C- terminal; estos propéptidos pueden ser eliminados por peptidasas específicas al ser secretados al exterior de la célula generando el COL11A1 maduro, donde cadenas a1 de colágeno XI se ensamblan entre sí y con cadenas a2 y/o a3 para formar fibras de colágeno XI. El proCOL11A1 es codificado por el gen col11a1. Se han descrito varias isoformas de proCOL11A1 humano, por ejemplo, la isoforma A [NM_001854.3 (GI:98985806), base de datos NCBI a fecha 21 de julio de 2011] de 1.806 aminoácidos, la isoforma B [NP_542196.2 (GI:98985810), base de datos NCBI a fecha 21 de julio de 2011], la isoforma C [NM_080630.3 (GI:299523252), base de datos NCBI a fecha 21 de julio de 2011], etc. El término “proCOL11A1”, tal y como se usa en la presente descripción, no se refiere únicamente a la proteína proCOL11A1 humana sino también a los ortólogos de otras especies.
El gen COL11A1 codifica una proteína de 1806 aminoácidos, que presenta su región triple helicoidal entre los aminoácidos 529 y 1542. Posee dos dominios que no siempre están presentes en la proteína madura, el C-terminal (aminoácidos 1564-1806) y el Nterminal (aminoácidos 37-511). Forma parte del colágeno tipo XI, que en el cartílago está formado por tres cadenas que forman una triple hélice, la α1(XI), la α2(XI) (codificada por el gen COL11A2) y la α3(XI) (generada por sobreglicosilación de α1(II)) que puede ser sustituida por la α1(V). Es un componente de la matriz extracelular del cartílago hialino, aunque también se expresa en tejidos no cartilaginosos y en líneas celulares tumorales o transformadas por virus, pero en este caso no siempre se coexpresan las tres cadenas del colágeno tipo XI, lo que podría significar que las fibras presentaran una composición de cadenas diferente a la del cartílago, homotrimérica o heterotípica en estas localizaciones (Yoshioka,H., J Biol Chem, 1990; 265(11):6423-6426; Lui, LCH, Biochem J, 1995; 311:511-516). Se cree que participa en la fibrilogénesis, regulando el crecimiento lateral de las fibras de colágeno II, sirviendo de soporte para éstas, y situándose en el interior de la fibra formada (Weis, MA., J Biol Chem 2010; 285(4):2580-2590). Se sintetiza como procolágeno, que es proteolíticamente procesado tras la secreción, eliminándose los péptidos N (37-511) y C (1564-1806) terminales (Halsted, KC., Mod Pathol 2008; 21(10):1246-1254). Dentro del péptido amino terminal (NTD) está contenida una región Npp (amino propeptide) o TSP (38-229), que aparece también en otros 7 tipos de colágenos, en la laminina y en la trombospondina, y contiene un sitio de procesamiento para BMP-1 (Warner, L., J Biol Chem 2006; 281(51):39507-39515, Gregory, KE., J Biol Chem 2000; 275(15): 11498-11506). En el caso de α1(XI), esta región no siempre es eliminada, quedando en ocasiones expuesta en la superficie de las fibras de colágeno por largo tiempo (Fallahi, A., Prot Sci 2005; 14:1526-1537). Esta región es muy similar a los dominios LNS, presentando sitios de unión potenciales para heparina y calcio, lo que podría significar una actividad de comunicación célula-ME por unión a los proteoglicanos de heparán sulfato (Warner, L., J Biol Chem 2006; 281(51):39507-39515, Fallahi, A., Prot Sci 2005; 14:1526-1537), incluso después de ser proteolizada del dominio helicoidal. Además, el NTD abarca una región variable, que presenta secuencias y características diferentes según el splicing alternativo, combinando los exones 6-7-8 del gen. Estas variantes presentan especificidad tisular y temporal (Warner, L., J Biol Chem 2006; 281(51):39507-39515), e influyen en el tiempo de procesamiento del Npp.
El término “proteína” se refiere a una cadena molecular de aminoácidos, con una actividad biológica. El término incluye todas las formas de modificaciones posttraduccionales, por ejemplo glicosilación, fosforilación o acetilación.
El término “RNA” se refiere al ácido ribonucleico. Una secuencia de RNA es una secuencia de ribonucleótidos.
El término “secuencia de nucleótidos” o “secuencia nucleotídica” se refiere indistintamente a una secuencia de ribonucleótidos (RNA) o de desoxirribonucleótidos (DNA).
El término “sensibilidad” se refiere a la detección de falsos negativos (diagnóstico negativo de carcinoma, cuando el paciente está afectado de carcinoma); una sensibilidad del 100% significa que no hay falsos negativos.
El término “sonda” se refiere a una secuencia nucleotídica complementaria de una secuencia nucleotídica derivada del gen col11a1, que se puede utilizar para detectar esa secuencia nucleotídica derivada del gen col11a1.
El término “tumor” se refiere a cualquier masa anormal de tejido producto de un proceso neoplásico, benigno (no canceroso) o maligno (canceroso).
Métodos de diagnóstico/pronóstico
La presente invención se basa, entre otras cuestiones, en el descubrimiento de que tanto la expresión génica del gen col11a1, como la concentración de la proteína proCOL11A1 se ven incrementadas en carcinomas invasivos, en particular, en carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma ductal de páncreas, adenocarcinoma infiltrante de mama, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinomas escamosos infiltrantes de cabeza y cuello, y carcinomatosis peritoneales.
En un aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para detectar la presencia de un carcinoma invasivo en un individuo, para determinar o pronosticar la malignidad, la invasividad, el estadío y/o la severidad de dicho carcinoma en un individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho carcinoma, en adelante “primer método de la invención”, que comprende:
a) la detección y/o cuantificación de la proteína proCOL11A1 en una muestra de dicho individuo; y
b) la comparación de la presencia y/o cantidad de dicha proteína proCOL11A1 detectada en dicha muestra de dicho individuo con la cantidad de proteína proCOL11A1 detectada en una muestra control; y
c) correlacionar el resultado obtenido con la presencia de un carcinoma invasivo en un individuo, la determinación o pronóstico de la malignidad, invasividad, estadío y/o severidad de dicho carcinoma invasivo en dicho individuo, o la monitorización del efecto de la terapia administrada a dicho individuo que presente dicho carcinoma invasivo;
con la condición de que dicho carcinoma invasivo no es adenocarcinoma ductal infiltrante de mama ni adenocarcinoma ductal pancreático;
o, alternativamente
a) la detección y/o cuantificación del mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA en una muestra de dicho individuo; y
b) la comparación de la cantidad de mRNA del gen col11a1 o de la cantidad del correspondiente cDNA detectada en dicha muestra de dicho individuo, con la cantidad del mRNA del gen col11a1 o con la cantidad del correspondiente cDNA detectada en una muestra control; y
c) correlacionar el resultado obtenido con la presencia de un carcinoma invasivo en un individuo, la determinación o pronóstico de la malignidad, invasividad, estadío y/o severidad de dicho carcinoma invasivo en dicho individuo, o la monitorización del efecto de la terapia administrada a dicho individuo que presente dicho carcinoma invasivo;
con la condición de que dicho carcinoma invasivo no es carcinoma de vejiga y de que dicho carcinoma cuya invasividad se desea conocer no es cáncer de mama, colon, pulmón u ovario.
En una realización particular, dicho carcinoma invasivo se selecciona del grupo formado por carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello y carcinomatosis peritoneales.
El primer método de la presente invención es un método de alta sensibilidad y especificidad, y se basa en que sujetos o individuos diagnosticados de un carcinoma invasivo, presentan niveles elevados de mRNA transcrito del gen col11a1 (“niveles elevados de expresión del gen col11a1”), o concentraciones elevadas de la proteína codificada por el gen col11a1 (“proteína proCOL11A1”), en términos absolutos o en comparación con los correspondientes niveles en muestras control, procedentes de sujetos sin historial clínico de estos carcinomas o bien de cultivos de células que no expresan el gen col11a1 y/o no expresan la proteína proCOL11A1 (controles negativos).
Para la puesta en práctica del primer método de la invención, se obtiene una muestra, tal como una muestra biológica, del individuo a estudiar. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas muestras incluyen distintos tipos de fluidos biológicos, tales como bilis, exudado de flujo gástrico, heces, orina, plasma, líquido ascítico, líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido peritoneal, líquido pleural, líquido sinovial, orina, saliva, sangre, semen, suero, etc. Estas muestras de fluidos biológicos pueden ser obtenidas por cualquier método convencional conocido por los técnicos en la materia. Alternativamente, dicha muestra también puede ser una muestra de tejido del órgano afectado, por ejemplo páncreas, vejiga, riñón, etc., que puede obtenerse por cualquier método convencional, por ejemplo, mediante biopsia, cistoscopia, resección quirúrgica, etc.
Las muestras a analizar pueden ser obtenidas de sujetos previamente diagnosticados, o no diagnosticados, de un determinado tipo de carcinoma invasivo; o también de un sujeto en tratamiento, o que ha sido tratado previamente contra un carcinoma invasivo, en particular contra ese determinado tipo de carcinoma.
En una realización particular, el primer método de la invención comprende detectar y/o cuantificar de la proteína proCOL11A1, en una muestra de dicho individuo y su comparación con el de una muestra control, en donde la detección o un incremento en la cantidad (concentración o nivel) de dicha proteína con respecto a la cantidad de dicha proteína proCOL11A1 en la muestra control es indicativo de carcinoma invasivo.
La cantidad de proteína proCOL11A1 presente en dichas muestras puede ser cuantificada mediante cualquier método convencional que permita detectar y cuantificar dicha proteína en las muestras a analizar. En este caso, el primer método de la invención incluye la realización de una etapa de extracción con el fin de obtener un extracto proteico que contenga dicha proteína, lo que puede realizarse mediante técnicas convencionales (Chomczynski y cols., Anal. Biochem., 1987, 162:156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15:532).
Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y cuantificar la cantidad de proCOL11A1. A modo ilustrativo, no limitativo, la cantidad de dicha proteína puede ser cuantificada mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante el empleo de anticuerpos con capacidad de unirse a proCOL11A1 y posterior cuantificación de los complejos formados. En una realización particular, el primer método de la invención comprende poner en contacto el extracto de proteínas de la muestra con una composición que comprende uno o más anticuerpos específicos contra uno o más epítopos de la proteína proCOL11A1, y , posteriormente detectar y/o cuantificar los complejos formados por dichos anticuerpos y la proteína COL11A1.
Existe una amplia variedad de ensayos inmunológicos disponibles para detectar y/o cuantificar la formación de complejos específicos antígeno-anticuerpo; numerosos ensayos de unión de proteínas, competitivos y no competitivos, han sido previamente descritos, y un gran número de estos ensayos está disponible comercialmente. Así, la proteína proCOL11A1 se puede cuantificar con anticuerpos como, por ejemplo: anticuerpos monoclonales, policlonales, intactos o fragmentos recombinantes de ellos, combibodies y fragmentos Fab o scFv de anticuerpos, específicos contra la proteína proCOL11A1; siendo estos anticuerpos humanos, humanizados o de origen no humano. Existen anticuerpos que se unen a la proteína proCOL11A1, que están disponibles comercialmente o han sido descritos en la literatura científica; sin embargo, estos anticuerpos están desarrollados contra el dominio central triple-hélice de COL11A1, que está muy conservado entre distintos colágenos, por lo que no discriminan específicamente la expresión de COL11A1 de otros colágenos de similar secuencia aminoacídica, cuya expresión no varía necesariamente durante el proceso tumoral, por lo que pueden conducir a graves errores si se utilizan para el desarrollo de métodos y productos de diagnóstico y pronóstico de carcinomas. Los autores de la presente invención han desarrollado anticuerpos policlonales y monoclonales específicamente contra el subdominio VAR, en el propéptido N-terminal de proCOL11A1, que presenta la mayor variación de secuencia entre colágenos, generando así anticuerpos que detectan específicamente proCOL11A1, discriminándolo específicamente de otros colágenos cuya expresión no varía durante el proceso tumoral. En una realización particular, dicho anticuerpo es el anticuerpo monoclonal identificado como 1E8.33, cuyas características se describen más adelante.
Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no; los anticuerpos no marcados se pueden utilizar en ensayos de aglutinación; los anticuerpos marcados se pueden utilizar en una amplia variedad de ensayos. Las moléculas marcadoras que se pueden utilizar para marcar los anticuerpos incluyen radionucleótidos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes y derivados.
Existe una amplia variedad de ensayos bien conocidos, que se pueden utilizar en la presente invención, que utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas se incluyen el Western-blot o transferencia Western, ELISA (Enzyme-Linked inmunosorbent assay o ensayo inmunoabsorvente ligado a enzima), RIA (Radioinmunoassay o Radioinmunoensayo), EIA competitivo (Competitive enzyme immunoassay o Inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA (Double antibody sandwich-ELISA o ensayo ELISA sándwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas de detección multiplex, basadas en el empleo de microsferas, biochips o microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos, o ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar la proteína proCOL11A1, incluyen técnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando o ensayos de unión a lectina.
El primer método de la invención también comprende la etapa de comparar la presencia y/o cantidad de dicha proteína proCOL11A1, determinada en la muestra del individuo objeto de estudio, con la cantidad de proteína proCOL11 de la muestra control (valor de referencia). En una realización particular, la muestra control es una muestra procedente de individuos sin historial clínico de carcinoma invasivo, en cuyo caso, los resultados obtenidos podrían tener valor diagnóstico o pronóstico de malignidad, invasividad, estadio y/o severidad de dicho carcinoma en el individuo. En otra realización particular, dicha muestra control es una muestra procedente del mismo individuo pero sometido a tratamiento, en cuyo caso, los resultados obtenidos podrían tener valor para monitorizar el efecto de la terapia administrada a dicho individuo que presente dicho carcinoma. Adicionalmente, si se desea, se pueden usar un control positivo, por ejemplo, una línea celular que expresa la proteína proCOL11A1, y/o un control negativo, por ejemplo, una línea celular que no expresa la proteína proCOL11A1.
Adicionalmente, el primer método de la invención comprende la etapa de correlacionar el resultado obtenido al comparar la presencia y/o cantidad de la proteína proCOL11A1, determinada en la muestra del individuo objeto de estudio, con la cantidad de proteína proCOL11 de la muestra control, con la presencia de un carcinoma invasivo en un individuo, la determinación o pronóstico de la malignidad, invasividad, estadío y/o severidad de dicho carcinoma invasivo en dicho individuo, o la monitorización del efecto de la terapia administrada a dicho individuo que presente dicho carcinoma invasivo.
De acuerdo con el primer método de la invención, la detección o un incremento en la cantidad de dicha proteína proCOL11A1 en la muestra de dicho individuo con respecto al nivel de dicha proteína proCOL11A1 en dicha muestra control es indicativa de carcinoma invasivo. Dicha información también puede ser utilizada para determinar o evaluar o pronosticar la malignidad, invasividad, estadío y/o severidad de dicho carcinoma invasivo en dicho individuo; en este sentido, el experto en la materia, a la vista de la experiencia que hay ido adquiriendo, podrá correlacionar la cantidad de proteína proCOL11A1 determinada en la muestra del individuo bajo estudio con la malignidad, invasividad, estadío y/o severidad de dicho carcinoma invasivo en dicho individuo. Asimismo, cuando la muestra control es una muestra del propio individuo diagnosticado de un carcinoma invasivo, analizada antes o durante la administración de una terapia para tratar dicho carcinoma invasivo, la información relativa a la detección o a la variación en la cantidad de dicha proteína proCOL11A1 en la muestra de dicho individuo en un momento dado, posterior a la administración de dicha terapia, puede servir para monitorizar o evaluar el efecto o eficacia de la terapia administrada a dicho individuo que presente
dicho carcinoma invasivo y, en caso de que dicha terapia no sea eficaz, evaluar la posibilidad de cambiarla.
Esta realización particular del primer método de la invención es útil para la detección de carcinomas invasivos, con la condición de que dicho carcinoma no es adenocarcinoma ductal infiltrante de mama ni adenocarcinoma ductal pancreático.
En otra realización particular, el primer método de la invención comprende cuantificar el nivel de expresión del gen col11a1 en una muestra de dicho individuo y su comparación con el de una muestra control, en donde un incremento en el nivel de expresión de dicho gen respecto al nivel de dicho gen col11a1 en la muestra control es indicativo de un carcinoma invasivo.
El nivel de expresión de un gen puede ser cuantificado mediante la cuantificación del nivel de mRNA codificante de dicho gen (col11a1), o, alternativamente, del nivel del DNA complementario (cDNA) a dicho mRNA. En este caso, el método de la invención incluye la realización de una etapa de extracción con el fin de obtener el RNA total, lo que puede realizarse mediante técnicas convencionales (Chomczynski y cols., Anal. Biochem., 1987, 162:156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15:532; Molina, M.A., et al., Cancer Res., 1999, 59: 4356-4362).
Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y/o cuantificar los niveles de mRNA del gen col11a1 o de su correspondiente cDNA. A modo ilustrativo, no limitativo, el nivel del mRNA del gen col11a1 puede ser cuantificado mediante el empleo de métodos convencionales, por ejemplo, métodos que comprenden la amplificación del mRNA y la cuantificación del producto de la amplificación de dicho mRNA, tales como electroforesis y tinción, o alternativamente, mediante Southern blot y empleo de sondas apropiadas, Northern blot y empleo de sondas específicas del mRNA del gen col11a1 o de cDNA correspondiente, mapeo con la nucleasa S1, RT-LCR, hibridación, microarrays, etc. En una realización particular la amplificación y cuantificación del mRNA correspondiente al gen col11a1 se realiza a la vez mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real (Q-PCR). Análogamente, el nivel del cDNA correspondiente a dicho mRNA del gen col11a1 también puede ser cuantificado mediante el empleo de técnicas convencionales; en este caso, el método de la invención incluye una etapa de síntesis del correspondiente cDNA mediante transcripción inversa (RT) del mRNA correspondiente seguida de amplificación y cuantificación del producto de la amplificación de dicho cDNA. En una realización particular, la amplificación se lleva a cabo de manera cualitativa o cuantitativa, mediante una reacción en cadena de la polimerasa, por ejemplo, PCR o RT-PCT, usando oligonucleótidos cebadores que amplifican específicamente una región del gen col11a1; en una realización particular, dicha RT-PCR se lleva a cabo en presencia de la pareja de oligonucleótidos cebadores cuyas secuencias de nucleótidos se muestran en SEQ ID NO: 1 (5’-TGGTGATCAGAATCAGAAGTTCG-3’) y SEQ ID NO: 2 (5’-AGGAGAGTTGAGAATTGGGAATC-3’).
El primer método de la invención también comprende la etapa de comparar la presencia y/o cantidad de mRNA del gen col11a1 o de la cantidad del correspondiente cDNA detectada en dicha muestra de dicho individuo, con la cantidad del mRNA del gen col11a1 o con la cantidad del correspondiente cDNA detectada en una muestra control. En una realización particular, la muestra control es una muestra procedente de individuos sin historial clínico de carcinoma invasivo, en cuyo caso, los resultados obtenidos podrían tener valor diagnóstico o pronóstico de malignidad, invasividad, estadio y/o severidad de dicho carcinoma en el individuo. En otra realización particular, dicha muestra control es una muestra procedente del mismo individuo pero sometido a tratamiento, en cuyo caso, los resultados obtenidos podrían tener valor para monitorizar el efecto de la terapia administrada a dicho individuo que presente dicho carcinoma. Adicionalmente, si se desea, se pueden usar un control positivo, por ejemplo, una línea celular que expresa el gen col11a1, y/o un control negativo, por ejemplo, una línea celular que no expresa el gen col11a1.
Adicionalmente, el primer método de la invención comprende la etapa de correlacionar el resultado obtenido al comparar la presencia y/o cantidad de mRNA del gen col11a1 o de la cantidad del correspondiente cDNA detectada en dicha muestra de dicho individuo, con la cantidad del mRNA del gen col11a1 o con la cantidad del correspondiente cDNA detectada en una muestra control, con la presencia de
un carcinoma invasivo en un individuo, la determinación o pronóstico de la malignidad, invasividad, estadío y/o severidad de dicho carcinoma invasivo en dicho individuo, o la monitorización del efecto de la terapia administrada a dicho individuo que presente dicho carcinoma invasivo.
De acuerdo con el primer método de la invención, la detección o un incremento en la cantidad de dicho mRNA del gen col11a1 o de la cantidad del correspondiente cDNA detectada en dicha muestra de dicho individuo con respecto a la cantidad de mRNA del gen col11a1 o a la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra control es indicativa de carcinoma invasivo. Dicha información también puede ser utilizada para determinar o evaluar o pronosticar la malignidad, invasividad, estadío y/o severidad de dicho carcinoma invasivo en dicho individuo; en este sentido, el experto en la materia, a la vista de la experiencia que hay ido adquiriendo, podrá correlacionar la cantidad de mRNA del gen col11a1 o la cantidad del correspondiente cDNA determinada en la muestra del individuo bajo estudio con la malignidad, invasividad, estadío y/o severidad de dicho carcinoma invasivo en dicho individuo. Asimismo, cuando la muestra control es una muestra del propio individuo diagnosticado de un carcinoma invasivo, analizada antes o durante la administración de una terapia para tratar dicho carcinoma invasivo, la información relativa a la detección o a la variación en la cantidad de dicho mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA en la muestra de dicho individuo en un momento dado, posterior a la administración de dicha terapia, puede servir para monitorizar o evaluar el efecto o eficacia de la terapia administrada a dicho individuo que presente dicho carcinoma invasivo y, en caso de que dicha terapia no sea eficaz, evaluar la posibilidad de cambiarla.
Esta realización particular del primer método de la invención puede ser utilizada para detectar un carcinoma invasivo, con la condición de que dicho carcinoma invasivo no es carcinoma de vejiga y de que dicho carcinoma cuya invasividad se desea
conocer no es cáncer de mama, colon, pulmón u ovario.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para diagnosticar diferencialmente un carcinoma transicional de vejiga invasivo frente a un carcinoma transicional de vejiga superficial, en un individuo, en adelante “segundo método de la invención”, que comprende:
a) la detección y/o cuantificación de la proteína proCOL11A1 en una muestra de dicho individuo, y
b) la comparación de la presencia y/o cantidad de dicha proteína proCOL11A1 detectada en dicha muestra de dicho individuo con la cantidad de proteína proCOL11A1 detectada en una muestra control,
en donde la detección o un incremento en la cantidad de proteína proCOL11A1 en dicha muestra de dicho individuo con respecto al nivel de proteína proCOL11A en dicha muestra control es indicativa de carcinoma transicional de vejiga invasivo;
o, alternativamente
a) la detección y/o cuantificación del mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA en una muestra de dicho individuo, y
b) la comparación de la cantidad de mRNA del gen col11a1 o de la cantidad del correspondiente cDNA detectada en dicha muestra de dicho individuo, con la cantidad del mRNA del gen col11a1 o con la cantidad del correspondiente cDNA detectada en una muestra control,
en donde un incremento en la cantidad de mRNA del gen col11a1 o en la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra de dicho individuo con respecto a la cantidad de mRNA del gen col11a1 o a la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra control es indicativa de carcinoma transicional de vejiga invasivo.
Las características de la muestra del individuo, su obtención y preparación para obtener un extracto de proteínas sobre el que detectar y/o cuantificar la proteína proCOL11A1, o para obtener un extracto de ácidos nucleicos (e.g., RNA total, etc.) sobre el que detectar y/o cuantificar el mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA ya han sido mencionados en relación con el primer método de la invención y se incorporan aquí por referencia.
Asimismo, los métodos para detectar y/o cuantificar la proteína proCOL11A1, y para detectar y/o cuantificar el mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA ya han sido mencionados en relación con el primer método de la invención y se incorporan aquí por referencia.
La muestra control, en una realización particular, es una muestra procedente de uno o de un pool de individuos sanos o diagnosticados fidedignamente como individuos que padecen carcinoma transicional de vejiga superficial. Asimismo, si se desea, se pueden usar un control positivo, por ejemplo, una línea celular que expresa el gen col11a1, y/o un control negativo, por ejemplo, una línea celular que no expresa el gen col11a1.
De acuerdo con el segundo método de la invención, tras la comparación de los resultados obtenidos en la muestra del individuo bajo estudio con los resultados de la muestra control (o valor de referencia), la detección o un incremento en el nivel de proteína proCOL11A1 en la muestra de dicho individuo con respecto al nivel de proteína proCOL11A en la muestra control es indicativa de carcinoma transicional de vejiga invasivo, o alternativamente, un incremento en la cantidad de mRNA del gen col11a1 o en la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra de dicho individuo con respecto a la cantidad de mRNA del gen col11a1 o a la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra control es indicativa de carcinoma transicional de vejiga invasivo.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para diagnosticar diferencialmente un carcinoma renal frente a un oncocitoma, en un individuo, en adelante “tercer método de la invención”, que comprende:
a) la detección y/o cuantificación de la proteína proCOL11A1 en una muestra de dicho individuo, y
b) la comparación de la presencia y/o cantidad de dicha proteína proCOL11A1 detectada en dicha muestra de dicho individuo con la cantidad de proteína proCOL11A1 detectada en una muestra control,
en donde la detección o un incremento en la cantidad de proteína proCOL11A1 en dicha muestra de dicho individuo con respecto al nivel de proteína proCOL11A en dicha muestra control es indicativa de carcinoma renal;
o, alternativamente
a) la detección y/o cuantificación del mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA en una muestra de dicho individuo, y
b) la comparación de la cantidad de mRNA del gen col11a1 o de la cantidad del correspondiente cDNA detectada en dicha muestra de dicho individuo, con la cantidad del mRNA del gen col11a1 o con la cantidad del correspondiente cDNA detectada en una muestra control,
en donde un incremento en la cantidad de mRNA del gen col11a1 o en la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra de dicho individuo con respecto a la cantidad de mRNA del gen col11a1 o a la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra control es indicativa de carcinoma renal.
Las características de la muestra del individuo, su obtención y preparación para obtener un extracto de proteínas sobre el que detectar y/o cuantificar la proteína proCOL11A1, o para obtener un extracto de ácidos nucleicos (e.g., RNA total, etc.) sobre el que detectar y/o cuantificar el mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA ya han sido mencionados en relación con el primer método de la invención y se incorporan aquí por referencia.
Asimismo, los métodos para detectar y/o cuantificar la proteína proCOL11A1, y para detectar y/o cuantificar el mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA ya han sido mencionados en relación con el primer método de la invención y se incorporan aquí por referencia.
La muestra control, en una realización particular, es una muestra procedente de uno o de un pool de individuos sanos o diagnosticados fidedignamente como individuos que padecen oncocitoma. Asimismo, si se desea, se pueden usar un control positivo, por ejemplo, una línea celular que expresa el gen col11a1, y/o un control negativo, por ejemplo, una línea celular que no expresa el gen col11a1.
De acuerdo con el tercer método de la invención, tras la comparación de los resultados obtenidos en la muestra del individuo bajo estudio con los resultados de la muestra control (o valor de referencia), la detección o un incremento en el nivel de proteína proCOL11A1 en la muestra de dicho individuo con respecto al nivel de proteína proCOL11A en la muestra control es indicativa de carcinoma renal, o alternativamente, un incremento en la cantidad de mRNA del gen col11a1 o en la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra de dicho individuo con respecto a la cantidad de mRNA del gen col11a1 o a la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra control es indicativa de carcinoma renal.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para diagnosticar diferencialmente un adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioloalveolar frente a un adenocarcinoma bronquioalveolar, en un individuo, “cuarto método de la invención”, que comprende:
a) la detección y/o cuantificación de la proteína proCOL11A1 en una muestra de dicho individuo, y
b) la comparación de la presencia y/o cantidad de dicha proteína proCOL11A1 detectada en dicha muestra de dicho individuo con la cantidad de proteína proCOL11A1 detectada en una muestra control,
en donde la detección o un incremento en el nivel de proteína proCOL11A1 en dicha muestra de dicho individuo con respecto al nivel de proteína proCOL11A en dicha muestra control es indicativa de adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquiolo-alveolar;
o, alternativamente
a) la detección y/o cuantificación del mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA en una muestra de dicho individuo, y
b) la comparación de la cantidad de mRNA del gen col11a1 o de la cantidad del correspondiente cDNA detectada en dicha muestra de dicho individuo, con la cantidad del mRNA del gen col11a1 o con la cantidad del correspondiente cDNA detectada en una muestra control,
en donde un incremento en la cantidad de mRNA del gen col11a1 o en la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra de dicho individuo con respecto a la cantidad de mRNA del gen col11a1 o a la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra control es indicativa de adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioloalveolar.
Las características de la muestra del individuo, su obtención y preparación para obtener un extracto de proteínas sobre el que detectar y/o cuantificar la proteína proCOL11A1, o para obtener un extracto de ácidos nucleicos (e.g., RNA total, etc.) sobre el que detectar y/o cuantificar el mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA ya han sido mencionados en relación con el primer método de la invención y se incorporan aquí por referencia.
Asimismo, los métodos para detectar y/o cuantificar la proteína proCOL11A1, y para detectar y/o cuantificar el mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA ya han sido mencionados en relación con el primer método de la invención y se incorporan aquí por referencia.
La muestra control, en una realización particular, es una muestra procedente de uno o de un pool de individuos sanos o diagnosticados fidedignamente como individuos que padecen adenocarcinoma bronquioalveolar. Asimismo, si se desea, se pueden usar un control positivo, por ejemplo, una línea celular que expresa el gen col11a1, y/o un control negativo, por ejemplo, una línea celular que no expresa el gen col11a1.
De acuerdo con el cuarto método de la invención, tras la comparación de los resultados obtenidos en la muestra del individuo bajo estudio con los resultados de la muestra control (o valor de referencia), la detección o un incremento en el nivel de proteína proCOL11A1 en la muestra de dicho individuo con respecto al nivel de proteína proCOL11A en la muestra control es indicativa de adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioloalveolar, o alternativamente, un incremento en la cantidad de mRNA del gen col11a1 o en la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra de dicho individuo con respecto a la cantidad de mRNA del gen col11a1 o a la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra control es indicativa de adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioloalveolar.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para diagnosticar diferencialmente un adenocarcinoma de colon frente a una fibrosis benigna, en adelante “quinto método de la invención”, que comprende:
a) la detección y/o cuantificación de la proteína proCOL11A1 en una muestra de dicho individuo, y
b) la comparación de la presencia y/o cantidad de dicha proteína proCOL11A1 detectada en dicha muestra de dicho individuo con la cantidad de proteína proCOL11A1 detectada en una muestra control,
en donde la detección o un incremento en la cantidad de proteína proCOL11A1 en dicha muestra de dicho individuo con respecto al nivel de proteína proCOL11A en dicha muestra control es indicativa de adenocarcinoma de colon;
o, alternativamente
a) la detección y/o cuantificación del mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA en una muestra de dicho individuo, y
b) la comparación de la cantidad de mRNA del gen col11a1 o de la cantidad del correspondiente cDNA detectada en dicha muestra de dicho individuo, con la cantidad del mRNA del gen col11a1 o con la cantidad del correspondiente cDNA detectada en una muestra control,
en donde un incremento en la cantidad de mRNA del gen col11a1 o en la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra de dicho individuo con respecto a la cantidad de mRNA del gen col11a1 o a la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra control es indicativa de adenocarcinoma de colon.
Las características de la muestra del individuo, su obtención y preparación para obtener un extracto de proteínas sobre el que detectar y/o cuantificar la proteína proCOL11A1, o para obtener un extracto de ácidos nucleicos (e.g., RNA total, etc.) sobre el que detectar y/o cuantificar el mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA ya han sido mencionados en relación con el primer método de la invención y se incorporan aquí por referencia.
Asimismo, los métodos para detectar y/o cuantificar la proteína proCOL11A1, y para detectar y/o cuantificar el mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA ya han sido mencionados en relación con el primer método de la invención y se incorporan aquí por referencia.
La muestra control, en una realización particular, es una muestra procedente de uno o de un pool de individuos sanos o diagnosticados fidedignamente como individuos que padecen fibrosis benigna. Asimismo, si se desea, se pueden usar un control positivo, por ejemplo, una línea celular que expresa el gen col11a1, y/o un control negativo, por ejemplo, una línea celular que no expresa el gen col11a1.
De acuerdo con el quinto método de la invención, tras la comparación de los resultados obtenidos en la muestra del individuo bajo estudio con los resultados de la muestra control (o valor de referencia), la detección o un incremento en el nivel de proteína proCOL11A1 en la muestra de dicho individuo con respecto al nivel de proteína proCOL11A en la muestra control es indicativa de adenocarcinoma de colon, o alternativamente, un incremento en la cantidad de mRNA del gen col11a1 o en la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra de dicho individuo con respecto a la cantidad de mRNA del gen col11a1 o a la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra control es indicativa de adenocarcinoma de colon.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para diagnosticar diferencialmente un carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello frente a una patología benigna de cabeza y cuello, en un individuo, en adelante “sexto método de la invención”, que comprende:
a) la detección y/o cuantificación de la proteína proCOL11A1 en una muestra de dicho individuo, y
b) la comparación de la presencia y/o cantidad de dicha proteína proCOL11A1 detectada en dicha muestra de dicho individuo con la cantidad de proteína proCOL11A1 detectada en una muestra control,
en donde la detección o un incremento en la cantidad de proteína proCOL11A1 en dicha muestra de dicho individuo con respecto al nivel de proteína proCOL11A en dicha muestra control es indicativa de carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello;
o, alternativamente
a) la detección y/o cuantificación del mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA en una muestra de dicho individuo, y
b) la comparación de la cantidad de mRNA del gen col11a1 o de la cantidad del correspondiente cDNA detectada en dicha muestra de dicho individuo, con la cantidad del mRNA del gen col11a1 o con la cantidad del correspondiente cDNA detectada en una muestra control,
en donde un incremento en la cantidad de mRNA del gen col11a1 o en la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra de dicho individuo con respecto a la cantidad de mRNA del gen col11a1 o a la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra control es indicativa de carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello.
Las características de la muestra del individuo, su obtención y preparación para obtener un extracto de proteínas sobre el que detectar y/o cuantificar la proteína proCOL11A1, o para obtener un extracto de ácidos nucleicos (e.g., RNA total, etc.) sobre el que detectar y/o cuantificar el mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA ya han sido mencionados en relación con el primer método de la invención y se incorporan aquí por referencia.
Asimismo, los métodos para detectar y/o cuantificar la proteína proCOL11A1, y para detectar y/o cuantificar el mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA ya han sido mencionados en relación con el primer método de la invención y se incorporan aquí por referencia.
La muestra control, en una realización particular, es una muestra procedente de uno o de un pool de individuos sanos o diagnosticados fidedignamente como individuos que padecen una patología benigna de cabeza y cuello como inflamación, úlcera, hiperplasia, leucoqueratosis, liquen erosivo o fibrosis. Asimismo, si se desea, se pueden usar un control positivo, por ejemplo, una línea celular que expresa el gen col11a1, y/o un control negativo, por ejemplo, una línea celular que no expresa el gen col11a1.
De acuerdo con el sexto método de la invención, tras la comparación de los resultados obtenidos en la muestra del individuo bajo estudio con los resultados de la muestra control (o valor de referencia), la detección o un incremento en el nivel de proteína proCOL11A1 en la muestra de dicho individuo con respecto al nivel de proteína proCOL11A en la muestra control es indicativa de carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello, o alternativamente, un incremento en la cantidad de mRNA del gen col11a1 o en la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra de dicho individuo con respecto a la cantidad de mRNA del gen col11a1 o a la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra control es indicativa de carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para diagnosticar diferencialmente un adenocarcinoma ductal de páncreas frente a un ampuloma, en un individuo, que comprende:
a) la detección y/o cuantificación de la proteína proCOL11A1 en una muestra de dicho individuo, y
b) la comparación de la presencia y/o cantidad de dicha proteína proCOL11A1 detectada en dicha muestra de dicho individuo con la cantidad de proteína proCOL11A1 detectada en una muestra control,
en donde la detección o un incremento en la cantidad de proteína proCOL11A1 en dicha muestra de dicho individuo con respecto al nivel de proteína proCOL11A en dicha muestra control es indicativa de adenocarcinoma ductal de páncreas;
o, alternativamente
a) la detección y/o cuantificación del mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA en una muestra de dicho individuo, y
b) la comparación de la cantidad de mRNA del gen col11a1 o de la cantidad del correspondiente cDNA detectada en dicha muestra de dicho individuo, con la cantidad del mRNA del gen col11a1 o con la cantidad del correspondiente cDNA detectada en una muestra control,
en donde un incremento en la cantidad de mRNA del gen col11a1 o en la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra de dicho individuo con respecto a la cantidad de mRNA del gen col11a1 o a la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra control es indicativa de adenocarcinoma ductal de páncreas.
Las características de la muestra del individuo, su obtención y preparación para obtener un extracto de proteínas sobre el que detectar y/o cuantificar la proteína proCOL11A1, o para obtener un extracto de ácidos nucleicos (e.g., RNA total, etc.) sobre el que detectar y/o cuantificar el mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA ya han sido mencionados en relación con el primer método de la invención y se incorporan aquí por referencia.
Asimismo, los métodos para detectar y/o cuantificar la proteína proCOL11A1, y para detectar y/o cuantificar el mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA ya han sido mencionados en relación con el primer método de la invención y se incorporan aquí por referencia.
La muestra control, en una realización particular, es una muestra procedente de uno o de un pool de individuos sanos o diagnosticados fidedignamente como individuos que padecen pancreatitis crónica o ampuloma. Asimismo, si se desea, se pueden usar un control positivo, por ejemplo, una línea celular que expresa el gen col11a1, y/o un control negativo, por ejemplo, una línea celular que no expresa el gen col11a1.
De acuerdo con el séptimo método de la invención, tras la comparación de los resultados obtenidos en la muestra del individuo bajo estudio con los resultados de la muestra control (o valor de referencia), la detección o un incremento en el nivel de proteína proCOL11A1 en la muestra de dicho individuo con respecto al nivel de proteína proCOL11A en la muestra control es indicativa de adenocarcinoma ductal de páncreas, o alternativamente, un incremento en la cantidad de mRNA del gen col11a1 o en la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra de dicho individuo con respecto a la cantidad de mRNA del gen col11a1 o a la cantidad del correspondiente cDNA en dicha muestra control es indicativa de adenocarcinoma ductal de páncreas.
Métodos de screening
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para identificar y evaluar la eficacia de un compuesto para terapia de un carcinoma invasivo, que comprende:
a) poner en contacto un cultivo de células tumorales con el compuesto candidato, en las condiciones y durante el tiempo apropiados para permitir que interaccionen,
b) detectar y cuantificar los niveles de expresión del gen col11a1 o de la proteína proCOL11A1, y
c) comparar dichos niveles de expresión con los niveles de expresión de dicho gen col11a1 o de dicha proteína proCOL11A1 en un cultivo control de células tumorales sin tratar con dicho compuesto candidato.
Las células tumorales pueden proceder de cualquier carcinoma invasivo; no obstante, en una realización particular, dicho carcinoma invasivo se selecciona entre carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma ductal de páncreas, adenocarcinoma infiltrante de mama, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello y carcinomatosis peritoneales.
La cuantificación de los niveles de expresión del gen col11a1 o de la proteína proCOL11A1 se realizan de modo semejante a como se ha indicado en relación con el primer método de la invención, incorporado aquí por referencia.
Cuando un compuesto disminuye los niveles de expresión del gen col11a1, o de la proteína proCOL11A1, o revierte los efectos de la expresión elevada de dicho gen, preferiblemente disminuyendo los niveles de proliferación celular, ese compuesto se convierte en candidato para la terapia del carcinoma invasivo.
En una realización particular, dicho carcinoma invasivo se selecciona entre carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma ductal de páncreas, adenocarcinoma infiltrante de mama, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello y carcinomatosis peritoneales.
Inhibidores de proCOL11A1 y sus aplicaciones
En otro aspecto de la invención se relaciona con un inhibidor de proCOL11A1. En el contexto de la presente invención, se entiende por “inhibidor de proCOL11A1” a un compuesto que inhibe o disminuye la expresión y/o actividad de la proteína proCOL11A1,
o que inhibe los efectos carcinogénicos de la inducción de la expresión de la proteína proCOL11A1, e incluye cualquier compuesto que sea capaz de impedir o bloquear la transcripción y/o la traducción del gen col11a1 (es decir, impedir o bloquear la expresión de dicho gen), o que sea capaz de impedir que la proteína codificada por dicho gen proCOL11A1 realice su función (actividad); es decir, dicho término “inhibidor de proCOL11A1” incluye compuestos que actúan bien a nivel del RNA (e.g., oligonucleótidos antisentido (“antisense”), shRNA, siRNA, etc.), o bien a nivel de la proteína (e.g., anticuerpos, péptidos, compuestos orgánicos pequeños o moléculas pequeñas, etc.).
A modo ilustrativo, no limitativo, entre los inhibidores de proCOL11A1 se encuentran agentes inhibidores de la expresión del gen gol11a1 adecuados para su uso en la presente invención, e incluyen, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido específicos para el gen que col11a1, microARNs específicos, ARNs catalíticos o ribozimas específicos, ARNs de interferencia (ARNips) específicos, ARNs con actividad “decoy”, es decir, con capacidad para unirse específicamente a un factor (proteico generalmente) importante para la expresión del gen, de manera que la expresión del gen de interés, en este caso col11a1 sea inhibida, etc. Otros ejemplos ilustrativos, no limitativos, de inhibidores de proCOL11A1 incluyen compuestos o sustancias capaces de impedir que la proteína proCOL11A1 realice su función o actividad, por ejemplo, péptidos inhibidores de proCOL11A1, anticuerpos dirigidos específicamente contra epítopos de proCOL11A1, así como compuestos químicos de naturaleza no peptídica que reducen o inhiben la función de la proteína proCOL11A1.
Los inhibidores de proCOL11A1 pueden ser identificados y evaluados de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención; en particular, el método de screening previamete descrito puede ser utilizado. No obstante, pueden utilizarse otro tipo de métodos apropiados para identificar y evaluar inhibidores de proCOL11A1.
Los compuestos que provocan la reducción de los niveles de mRNA de col11a1 pueden ser identificados usando ensayos estándar para determinar los niveles de expresión de mRNA, tales como los mencionados en relación con el primer método de la invención. Los compuestos que provocan la reducción de los niveles proteicos de proCOL11A1 pueden ser identificados usando ensayos estándar para la determinación de niveles de expresión proteica tales como los mencionados en relación con el primer método de la invención.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de inhibidores de proCOL11A1, incluyen:
a) anticuerpos específicos contra uno o más epítopos presentes en la proteína proCOL11A1, preferiblemente anticuerpos monoclonales humanos o humanizados, o fragmentos funcionales de los mismos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos anti-idiotipo, etc.; en una realización particular, dicho anticuerpo es el anticuerpo monocloal 1E8.33, una variante del mismo, cuyas características se mencionan más adelante;
b) agentes citotóxicos, tales como toxinas, moléculas con átomos radiactivos, o agentes quimio-terapéuticos, entre los que se incluyen, sin limitación, pequeñas moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos, fosfopéptidos, moléculas antisentido, ribozimas, siRNAs, moléculas de triple hélice, etc., que inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína proCOL11A1; y
c) compuestos antagonistas de la proteína proCOL11A1, que inhiben una o más de las funciones de dicha proteína proCOL11A1.
En otro aspecto de la invención se relaciona con un inhibidor de proCOL11A1, para su empleo en el tratamiento de un carcinoma invasivo, o, expresado en otros términos, con el empleo de un inhibidor de proCOL11A1 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un carcinoma invasivo. En una realización particular, dicho carcinoma invasivo se selecciona entre carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma ductal de páncreas, adenocarcinoma infiltrante de mama, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello y carcinomatosis peritoneales.
En una realización particular, dicho inhibidor de proCOL11A1 es un anticuerpo que se une a proCOL11A1; ventajosamente, dicho anticuerpo se unirá específicamente a un epítopo situado en el dominio VAR del extremo N-terminal de la proteína proCOL11A1, ya que dicho dominio presenta la mayor variación de secuencia entre los distintos colágenos, lo que permite generar anticuerpos que se unen específicamente a proCOL11A1, y permiten detectar específicamente dicha proteína proCOL11A1, y discriminarla de otros colágenos cuya expresión no varía durante el proceso tumoral.
Anticuerpo de la invención y sus aplicaciones
Tal como se ha mencionado previamente, en una realización particular, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a proCOL11A1, en adelante “anticuerpo de la invención”, que comprende, dentro de la región variable de la cadena pesada (VH), analizada por el método IMGT/V-QUEST (ver más adelante), al menos una región determinante de complementariedad o “CDR” (del inglés “complementarity determining region”) seleccionada entre:
-
una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 (GYSFTGYY) [CDR-H1] o una variante de la misma;
-
una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 (INCYNGAT) [CDR-H2] o una variante de la misma; y
-
una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 (AIWDYEFHVMDY) [CDR-H3] o una variante de la misma.
En una realización particular, dicha CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, presente en la región VH del anticuerpo de la invención es una CDR1, dicha CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4, presente en la región VH del anticuerpo de la invención es una CDR2, y dicha CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, presente en la región VH del anticuerpo de la invención es una CDR3.
En una realización particular, el anticuerpo de la invención comprende, dentro de la región VH, al menos una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 [CDR-H1] o una variante de la misma, o una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 [CDR-H2] o una variante de la misma, o una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 [CDR-H3] o una variante de la misma, preferentemente, al menos, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 [CDR-H3] o una variante de la misma.
En otra realización particular, el anticuerpo de la invención comprende, dentro de la región VH, dos de dichas CDRs previamente mencionadas; en este caso, una de dichas CDR es, preferentemente, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 [CDR-H3] o una variante de la misma, y la otra CDR se selecciona entre una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 [CDR-H1] o una variante de la misma, y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 [CDR-H2] o una variante de la misma.
En otra realización particular, el anticuerpo de la invención comprende, dentro de la región VH, las tres CDRs previamente mencionadas, es decir, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 [CDR-H1] o una variante de la misma, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 [CDR-H2] o una variante de la misma, y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 [CDR-H3] o una variante de la misma.
En otra realización particular, el anticuerpo de la invención comprende, dentro de la región variable de la cadena ligera (VL), analizada por el método IMGT/V-QUEST (ver más adelante), al menos una CDR seleccionada del grupo formado por:
-
una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 (SSVNY) [CDR-L1] o una variante de la misma;
-
una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos YTS [CDR-L2] o una variante de la misma; y
-
una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 (QQFTSSPWT) [CDR-L3] o una variante de la misma.
En una realización particular, dicha CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 [CDR-L1], presente en la región VL del anticuerpo de la invención es una CDR1, dicha CDR que comprende la secuencia de aminoácidos YTS [CDR-L2], presente en la región VL del anticuerpo de la invención es una CDR2, y dicha CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 [CDR-L3], presente en la región VL del anticuerpo de la invención es una CDR3.
En una realización particular, el anticuerpo de la invención comprende, dentro de la región VL, al menos una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 [CDR-L1] o una variante de la misma, o una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos YTS [CDR-L2] o una variante de la misma, o una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 [CDR-L3] o una variante de la misma.
En otra realización particular, el anticuerpo de la invención comprende, dentro de la región VL, dos de dichas CDRs previamente mencionadas, por ejemplo, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 [CDR-L1] o una variante de la misma, y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos YTS [CDR-L2] o una variante de la misma, o bien, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 [CDR-L3] o una variante de la misma. Alternativamente, según esta realización particular, el anticuerpo de la invención comprende, dentro de la región VL, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos YTS [CDR-L2] o una variante de la misma, y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 [CDR-L3] o una variante de la misma.
En otra realización particular, el anticuerpo de la invención comprende, dentro de la región VL, las tres CDRs previamente mencionadas, es decir, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 [CDR-L1] o una variante de la misma, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos YTS [CDR-L2] o una variante de la misma, y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 [CDR-L3] o una variante de la misma.
El anticuerpo de la invención puede contener cualquier combinación de regiones VH y VL, cuyas características han sido mencionadas previamente; no obstante, en una realización particular, el anticuerpo de la invención comprende:
a) dentro de la región VH, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 [CDR-H1] o una variante de la misma, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 [CDR-H2] o una variante de la misma, y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 [CDR-H3] o una variante de la misma; y
b) dentro de la región VL, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 [CDR-L1] o una variante de la misma, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos YTS [CDR-L2] o una variante de la misma, y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 [CDR-L3] o una variante de la misma.
Las secuencias de las CDR pueden ser determinadas según los criterios convencionales, por ejemplo, mediante los criterios de la IMGT/V-QUEST: http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/ (Brochet X, Lefranc MP and Giudicelli V: IMGT/V-QUEST: the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis. Nucleic Acids Res Jul 1;36 (Web Server issue):W503508, 2008), como en el presente caso, o bien siguiendo la numeración de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991).
En una realización particular, la cadena pesada del anticuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8 [EVQLQESGPELVKTGSSVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSQGKSLEWIGYINCYNGAT SYNRNFKGKATFTVDTSSSTAYMQFNSLTSGDSAVYYCAIWDYEFHVMDYWGQRTSLT VSS] o una variante de la misma.
En otra realización particular, la cadena ligera del anticuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9 [ENVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYMYWYQQKSDASPKLWIYYTSNLAPGVP ARFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDADTYYCQQFTSSPWTFGGGTKLEIK] o una variante de la misma.
En una realización particular, el anticuerpo de la invención comprende:
-
una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8 [VH_1E8.33] o una variante de la misma, y
-
una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9 [Vkappa_1E8.33] o una variante de la misma.
En otra realización aún más particular, el anticuerpo de la invención es el anticuerpo monoclonal identificado como 1E8.33, cuya obtención se describe en el Ejemplo 5.
El anticuerpo de la invención se une específicamente a un epítopo situado en el dominio VAR del extremo N-terminal de la proteína proCOL11A1.
El término “anticuerpo”, tal como se ha definido previamente, incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, intactos, o fragmentos de ellos, por ejemplo, fragmentos Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2, single chain Fv (scFv), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de origen no humano y polipéptidos derivados de inmunoglobulinas producidos mediante técnicas de ingeniería genética, por ejemplo, fragmentos Fv estabilizados mediante puentes disulfuro (dsFv), moléculas con dominios de la región variable de cadena única (Abs), minibodies, etc.
En general, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que conserva la capacidad de unirse a proCOL11A1. Preferentemente, dichos anticuerpos son anticuerpos humanos o humanizados. Los anticuerpos humanizados puede prepararse, por ejemplo, a partir de anticuerpos monoclonales murinos y los anticuerpos monoclonales humanos puede prepararse, por ejemplo, utilizando ratones transgénicos o mediante la técnica de “phage display”. En general, los anticuerppos de la invención pueden ser preparados mediante una variedad de procedimientos conocidos por los técnicos en la materia. A modo ilustrativo, pueden citarse las siguientes publicaciones: Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988); Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, 3<rd> Edition, Academic Press (1996). Adicionalmente, los anticuerpos monoclonales secretados por hibridomas pueden ser purificados por métodos convencionales. En el Ejemplo 5 se describe la obtención de anticuerpos monoclonales y policlonales frente a proCOL11A1.
Los fragmentos con capacidad de unión a proCOL11A1 también pueden obtenerse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia. Dichos métodos pueden implicar el aislamiento del DNA que codifica la cadena polipeptídica (o un fragmento de la misma) de un anticuerpo monoclonal de interés y manipular el DNA mediante la tecnología del DNA recombinante. El DNA puede ser utilizado para generar otro DNA de interés, o alterado, (por ejemplo, mediante mutagénesis) para añadir, eliminar, o sustituir uno o más aminoácidos, por ejemplo, el DNA que codifica las cadenas polipeptídicas de un anticuerpo (e.g., las cadenas pesada o ligera, la región variable o el anticuerpo completo) puede ser aislado a partir de células B murinas inmunizadas con proCOL11A1. El DNA puede ser aislado y amplificado por métodos convencionales, por ejemplo, mediante PCR.
Los anticuerpos de cadena sencilla pueden obtenerse por métodos convencionales uniendo la región variable de las cadenas pesada y ligera (región Fv) mediante un puente aminoacídico. Los scFvs pueden prepararse fusionando DNA que codifica un linker peptídico entre los DNAs que codifican los polipéptidos de las regiones variables (VL y VH). La producción de scFvs se describe en numerosos documentos, por ejemplo, en la patente norteamericana US 4.946.778, Bird (Science 242: 423, 1988), Huston et al. (Proc. Natl. Acad Sci USA 85: 5879, 1988) y Ward et al. (Nature 334: 544, 1989).
El experto en la material entenderá que las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos de la invención pueden incluir una o más sustituciones de aminoácidos de manera que, aunque se altera la secuencia primaria del polipéptido, se mantenga la capacidad del anticuerpo de unirse a proCOL11A1 7. Dicha sustitución puede ser una sustitución conservativa y, en general, se aplica para indicar que la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido con propiedades similares (por ejemplo, la sustitución del ácido glutámico (aminoácido cargado) por el ácido aspártico sería una sustitución de aminoácidos conservativa).
La presente invención también contempla variantes de las secuencias de las cadenas pesada y ligera identificadas en esta descripción, las cuales caen dentro del ámbito de la presente invención. El término “variante”, tal como aquí se utiliza, se refiere a secuencias sustancialmente similares. En general, las variantes poseen la misma actividad biológica, desde el punto de vista cualitativo, que la secuencia nativa. Una variante de una secuencia polipeptídica puede ser un derivado de una secuencia polipeptídica identificada en esta descripción que comprende la adición, deleción o sustitución de uno
o más aminoácidos. Las variantes pueden diferir de las secuencias descritas dentro de las regiones marco (“framework regions”) o dentro de las CDRs de cualquiera de las cadenas pesada o ligera. A modo ilustrativo, la invención incluye anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos con capacidad de unión a proCOL11A1, que comprenden secuencias de aminoácidos que tienen al menos, aproximadamente, un 70% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NOs: 3 a 9, y con la secuencia YTS, preferentemente, al menos, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID Nos: 3 a 9, y con la secuencia YTS,.
El anticuerpo de la invención puede ser utilizado en el diagnóstico, pronóstico y/o diagnóstico diferencial de un carcinoma invasivo. Además, el anticuerpo de la invención puede ser utilizado en el tratamiento de un carcinoma invasivo.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un anticuerpo de la invención para el diagnóstico, pronóstico y/o diagnóstico diferencial de un carcinoma invasivo in vitro. En una realización particular, dicho carcinoma invasivo se selecciona entre carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma ductal de páncreas, adenocarcinoma infiltrante de mama, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello y carcinomatosis peritoneales.
En otro aspecto de la invención se relaciona con un anticuerpo de la invención para su empleo en el tratamiento de un carcinoma invasivo, o, expresado en otros términos, con el empleo de un anticuerpo de la invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un carcinoma invasivo. En una realización particular, dicho carcinoma invasivo se selecciona entre carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma ductal de páncreas, adenocarcinoma infiltrante de mama, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello y carcinomatosis peritoneales.
Composiciones farmacéuticas
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica, en adelante “composición farmacéutica de la invención” que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de, al menos, un inhibidor de proCOL11A1, junto con un excipiente o sustancia transportadora farmacéuticamente aceptable.
Los excipientes, sustancias transportadoras y, en su caso, sustancias auxiliares eventualmente presentes en la composición farmacéutica proporcionada por esta invención tienen que ser farmacéuticamente y farmacológicamente tolerables, de modo que puedan ser combinados con otros componentes de la formulación o preparación y no ejerzan efectos adversos en el organismo tratado. Las composiciones farmacéuticas o formulaciones incluyen aquellas que son adecuadas para la administración oral o parenteral (incluyendo subcutánea, intradérmica, intramuscular e intravenosa), aunque la mejor vía de administración depende del estado del paciente. Las formulaciones pueden ser en forma de dosis sencillas. Las formulaciones se preparan de acuerdo con métodos conocidos en el campo de la farmacología. Las cantidades de sustancias activas para administrarse pueden variar en función de las particularidades de la terapia.
En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende, además, uno o más ingredientes activos que inhiben la función de la proteína proCOL11A1.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma.
EJEMPLO 1 Análisis diferencial de expresión del gen col11a1 en muestras de tejido de riñón, utilizando los microarrays Human Genome U95 DNA arrays
1.1 Materiales y Métodos
Microarrays. Se utilizaron los microarrays GeneChip Test 3 (Affymetrix, Santa Clara), que permiten analizar la calidad del RNA, previamente al análisis de expresión con el microarray GeneChip Human Genome U95A (Affymetrix, Santa Clara), que representa
12.000 secuencias completas de genes anotados; el gen Colágeno XI, alfa 1 (col11a1) está representado en el microarray por el set de sondas 37892_at de Affymetrix, que son unos oligonucleótidos sentido de 25 nucleótidos de longitud, diseñados en base a la secuencia Hs.82772 de Unigene, o J04177 de GeneBank.
Muestras. El análisis se llevó a cabo con RNA total procedente de 1 muestra de tejido neoplásico de riñón de 1 individuo afectado de oncocitoma renal, con mezclas equimolares (pools) de RNAs totales procedentes de un conjunto de 8 muestras de tejido neoplásico de riñón de 8 individuos afectados de carcinoma renal convencional, con RNA total procedente de 1 muestra de tejido neoplásico de riñón de 1 individuo afectado de carcinoma renal cromófobo y, como control negativo, con mezclas equimolares de RNAs totales procedentes de un conjunto de muestras de tejido no neoplásico de riñón de individuos afectados de oncocitoma renal, carcinoma renal convencional y carcinoma renal cromófobo. Todas las muestras fueron clasificadas histológicamente en el servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Marqués de Valdecilla (Santander; España), el mismo hospital donde las muestras habían sido recogidas, siguiendo los preceptos de la Declaración de Helsinki. Las muestras se congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente tras su extracción y se mantuvieron a –80ºC hasta el momento de su análisis.
Tabla 1 Datos clinicopatológicos de los neoplasmas renales analizados
Caso Edad Género Diagnóstico histológico Estadío Evolución
1 58 Hombre CR Convencional II V&S (28 meses) 2 80 Hombre CR Convencional II V&S (16 meses) 3 78 Hombre CR Convencional II V&S (20 meses) 4 38 Hombre CR Convencional II V&S (24 meses) 5 68 Hombre CR Convencional II V&S (24 meses) 6 76 Mujer CR Convencional II V&S (22 meses) 7 51 Hombre CR Convencional III MDE (15 meses) 8 45 Hombre CR Convencional III MDE (11 meses) 9 57 Hombre CR Cromófobo II V&S (25 meses) 10 79 Hombre Oncocitoma renal II V&S (26 meses)
CR: Carcinoma renal V&S (n meses): Vivo y Sano, n meses después de diagnóstico. MDE (n meses): Muerto debido a la enfermedad, n meses después de diagnóstico.
Análisis GeneChip de expresión génica
Síntesis del cRNA
10 El RNA total de cada una de las biopsias se obtuvo homogenizando el tejido en TRIzol® Reagent (Life Technologies), siguiendo las recomendaciones del proveedor. El RNA total resultante se limpió con el kit Rneasy (QIAGEN) (Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532). De cada preparación de RNA total se usaron 10 g como material de partida para la síntesis de la primera hebra
15 de cDNA con la enzima transcriptasa inversa SuperScript™ II RNase (Life Technologies), usando como cebador un oligonucleótido oligo-dT que contenía la secuencia del promotor de la RNA polimerasa del fago T7. La segunda hebra de cDNA se sintetizó utilizando los enzimas DNA polimerasa I de E. coli (Invitrogen Life Technologies), DNA ligasa de E. coli (Invitrogen Life Technologies), Rnasa H de E. coli (Invitrogen Life Technologies), y DNA
20 polimerasa del fago T4 (Invitrogen Life Technologies). El cRNA marcado con biotina se sintetizó usando el kit ENZO BioArray™ HighYield™ Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics Inc). Después de la transcripción in vitro, se eliminaron los nucleótidos no incorporados usando las columnas Rneasy (QIAGEN).
25 Hibridación y escaneado del array
Se fragmentaron 15 μg de cada cRNA biotinilado a 94ºC durante 35 minutos en una solución tampón que contenía Tris-acetato 40 mM (pH 8,1), acetato potásico (KOAc) 100 mM y acetato magnésico (MgOAc) 30 mM. El cRNA fragmentado se mezcló con buffer de hibridación [ácido 2-(N_morfolino)etanosulfónico (MES) 100 mM, NaCl 1M, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 20 mM, 0,01% de Tween® 20] y se calentó a 99ºC durante 5 minutos y posteriormente a 45ºC durante 5 minutos para, a continuación, ser cargado en el array de Affymetrix. El primer array en el que se realizó la hibridación fue el Test 3 de Affymetrix. Este array permite analizar la calidad del RNA previo al análisis de expresión en el GeneChip Human Genome 95 A (HG-U95A) (Affymetrix, Santa Clara). Para la hibridación, los arrays se incubaron en un horno rotatorio a 45º durante 16 horas y con una rotación constante de 60 rpm. El lavado y tinción de cada array se llevó a cabo en la Estación de Fluidos de Affymetrix. Se usó un programa de lavado y tinción que incluía:
-
10x2 ciclos de lavado con SSPE-T 6x (NaCl 0,9 M, NaH2PO4 60 mM, EDTA 6 mM, 0,01% de Tween® 20) a 25ºC;
-
4x15 ciclos con MES 0,1 mM, NaCl 0,1M, 0,01% de Tween® 20 a 50ºC;
-
tinción del cRNA biotinilado con un conjugado estreptavidina-ficoeritrina (10 μg/ml)
(Molecular Probes); -10x4 ciclos de lavado con SSPE-T 6x a 25ºC;
-
tinción con un anticuerpo anti-estreptavidina (BA-0500, Vector Laboratories) durante 10 minutos;
-
tinción con un conjugado estreptavidina-ficoeritrina (1 mg/ml) (Molecular Probes)
durante 10 minutos; y -15x4 ciclos de lavado con SSPE-T a 30ºC.
Los arrays se escanearon a 560 nm usando un microscopio confocal que utiliza emisión láser (Agilent GeneArray Scanner). El análisis de las lecturas de intensidad se realizó con el software Microarray Suite 5.0. Para la comparación de arrays, éstos fueron escalados a una intensidad total de 100.
1.2 Resultados
El análisis diferencial de la expresión del gen col11a1 en las diferentes neoplasias renales con respecto al control, se realizó a partir de los datos de comparación de arrays obtenidos utilizando el software de Affymetrix. Los parámetros que se tuvieron en cuenta (en el orden en el que aparecen en la lista) fueron:
i)
Detección: Indica si el transcrito está Presente (P), Ausente (A) o Marginal
(M);
ii)
Cambio: Indica si la expresión de un determinado transcrito Aumenta (I),
Decrece (D), No Cambia (NC), Aumenta Marginalmente (MI), o Decrece
Marginalmente (MD); y
iii)
Signal Log Ratio (SLG): Indica el nivel de cambio de expresión entre la
línea base (control) y una muestra problema. Este cambio se expresa
como el log2 del ratio (fold change o número de veces que la expresión del
gen está elevada o reprimida en la muestra problema-tumoral frente a la
muestra control-sana). Se considera significativo un valor de SLR de 1
(equivalente a un fold change de 2), para transcritos cuya expresión
aumenta
frente al control) y de –1, para transcritos cuya expresión
disminuye frente al control.
El análisis de la expresión diferencial del gen col11a1 en los diferentes tipos de neoplasias renales analizadas frente al control, demostró que los niveles de expresión del gen col11a1 estaban ligeramente aumentados, 2 veces (SLR=1), en biopsias de oncocitoma (tumor benigno), y, muy aumentados, en tumores malignos, con un incremento proporcional a la invasividad del tipo de tumor, más de 8 veces (SLR>3) en biopsias de carcinomas convencionales y más de 120 veces (SLR>7) en biopsias de carcinoma cromófobo (Tabla 2).
Tabla 2
Resultados obtenidos con Genechip Human U95A array, para col11a1. N. Acc. J04177
Detección en muestra control
Detección en Oncocitoma SLR Oncocitoma vs Control Cambio en Oncocitoma vs Control
A
P 1 I
Detección en muestra control
Detección en Carcinoma Convencional SLR en Carcinoma Convencional vs Control Cambio en Carcinoma Convencional vs Control
A
P 3,9 I
Detección en muestra control
Detección en Carcinoma Cromófobo SLR en Carcinoma Cromófobo vs Control Cambio en Carcinoma Cromófobo vs Control
A
P 7,3 I
EJEMPLO 2 Análisis diferencial de expresión del gen col11a1 en muestras de tejido de páncreas, utilizando los microarrays Human Genome U133 DNA arrays
2.1 Materiales y Métodos
Microarrays. Se utilizaron los microarrays GeneChip Test 3 (Affymetrix, Santa Clara), que permiten analizar la calidad del RNA, previamente al análisis de expresión con el 15 microarray GeneChip Human Genome U133A (Affymetrix, Santa Clara), que representa
15.000 secuencias completas de genes anotados y 7.000 secuencias génicas expresadas sin anotar (ESTs o “expressed sequence tags”); el gen Colágeno XI, alfa 1 (col11a1) está representado en el microarray por el set de sondas 37892_at de Affymetrix, que son unos oligonucleótidos sentido de 25 nucleótidos de longitud,
20 diseñados en base a la secuencia Hs.82772 de Unigene, o J04177 de GeneBank.
Muestras. Las muestras estudiadas procedían de biopsias, obtenidas por resección quirúrgica, de (i) sujetos control sin adenocarcinoma ductal de páncreas (n = 1), (ii) tejido pancreático aparentemente no tumoral (“sano”) procedente de individuos que 25 presentaban adenocarcinoma ductal de páncreas (n = 1), (iii) sujetos control sin adenocarcinoma ductal de páncreas, pero con pancreatitis crónica (n = 2) y (iv) pacientes
que fueron clínicamente tipados posteriormente y que presentaban adenocarcinoma ductal de páncreas (n = 12) en uno de los siguientes estadíos: Estadío I, tumor limitado al páncreas; Estadío III, tumor extendido a ganglios linfáticos regionales; y Estadío IVB, existe metástasis en tejidos u órganos distantes. Todas las muestras fueron clasificadas
5 histológicamente (grado y estadío) en el Hospital Central de Asturias, el mismo hospital donde las muestras habían sido recogidas, siguiendo los preceptos de la declaración de Helsinki. Las muestras se congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente tras su extracción y se mantuvieron a –80ºC hasta el momento de su análisis. De cada tipo de tumor así como de las muestras sanas se recibieron varios casos:
10 Control de tejido sano: 2 muestras Control de tejido con pancreatitis: 2 muestras Tumor estadío I: 7 muestras Tumor estadío III: 1 muestra
15 Tumor estadío IV: 2 muestras Ampuloma: 2 muestras
Tabla 3 Descripción de las muestras analizadas
Código de la muestra
Tipo Clasificación TNM Estadí o
PA36
Control sano - -
PA26
Control sano - -
PA29
Control pancreatitis - -
PA46
Control pancreatitis - -
PA02
Adenocarcinoma ductal T2N0M0 I
PA03
Adenocarcinoma ductal T2N0M0 I
PA17
Adenocarcinoma ductal T1bN0M0 I
PA19
Adenocarcinoma ductal T1bN0M0 I
PA25
Adenocarcinoma ductal T1N0M0 I
PA27
Adenocarcinoma ductal T1N0M0 I
PA33
Adenocarcinoma ductal T1bN0M0 I
PA20
Ampuloma T1bN1M0 III
PA24
Adenocarcinoma ductal T3N1M0 III
PA31
Ampuloma T1bN1M0 III
PA16
Adenocarcinoma ductal T2N1M1 IV
PA23
Adenocarcinoma ductal T1bN1M1 IV
Análisis GeneChip de expresión génica
El análisis se llevó a cabo con RNA total procedente de sujetos individuales. Las 16 muestras analizadas fueron las descritas en la Tabla 3.
Síntesis del cRNA
El RNA total de cada una de las biopsias se obtuvo homogenizando el tejido en TRIzol® Reagent (Life Technologies), siguiendo las recomendaciones del proveedor. El RNA total resultante se limpió con el kit Rneasy (QIAGEN) (Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532). De cada preparación de RNA total se usaron 10 g como material de partida para la síntesis de la primera hebra de cDNA con la enzima transcriptasa inversa SuperScript™ II RNase (Life Technologies), usando como cebador un oligonucleótido oligo-dT que contenía la secuencia del promotor de la RNA polimerasa del fago T7. La segunda hebra de cDNA se sintetizó utilizando los enzimas DNA polimerasa I de E. coli (Invitrogen Life Technologies), DNA ligasa de E. coli (Invitrogen Life Technologies), Rnasa H de E. coli (Invitrogen Life Technologies), y DNA polimerasa del fago T4 (Invitrogen Life Technologies). El cRNA marcado con biotina se sintetizó usando el kit ENZO BioArray™ HighYield™ Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics Inc). Después de la transcripción in vitro, se eliminaron los nucleótidos no incorporados usando las columnas Rneasy (QIAGEN).
Hibridación y escaneado del array
Se fragmentaron 15 μg de cada cRNA biotinilado a 94ºC durante 35 minutos en una solución tampón que contenía Tris-acetato 40 mM (pH 8,1), KOAc 100 mM y MgOAc 30 mM. El cRNA fragmentado se mezcló con buffer de hibridación (MES 100 mM, NaCl 1M, EDTA 20 mM, 0,01% de Tween® 20) y se calentó a 99ºC durante 5 minutos y posteriormente a 45ºC durante 5 minutos para, a continuación, ser cargado en el array de Affymetrix. El primer array en el que se realizó la hibridación fue el Test 3 de Affymetrix. Este array permite analizar la calidad del RNA previo al análisis de expresión en el GeneChip Human Genome 133 A (HG-U133A) (Affymetrix, Santa Clara). Para la hibridación, los arrays se incubaron en un horno rotatorio a 45ºC durante 16 horas y con una rotación constante de 60 rpm. El lavado y tinción de cada array se llevó a cabo en la Estación de Fluidos de Affymetrix®. Se usó un programa de lavado y tinción que incluía:
-
10x2 ciclos de lavado con SSPE-T 6x (NaCl 0,9 M, NaH2PO4 60 mM, EDTA 6 mM, 0,01% de Tween® 20) a 25ºC;
-
4x15 ciclos con MES 0,1 mM, NaCl 0,1M, 0,01% de Tween® 20 a 50ºC;
-
tinción del cRNA biotinilado con un conjugado estreptavidina-ficoeritrina (10 μg/ml)
(Molecular Probes); -10x4 ciclos de lavado con SSPE-T 6x a 25ºC;
-
tinción con un anticuerpo anti-estreptavidina (BA-0500, Vector Laboratories) durante 10 minutos;
-
tinción con un conjugado estreptavidina-ficoeritrina (1 mg/ml) (Molecular Probes)
durante 10 minutos; y -15x4 ciclos de lavado con SSPE-T a 30ºC.
Los arrays se escanearon a 560 nm usando un microscopio confocal que utiliza emisión láser (Agilent GeneArray Scanner). El análisis de las lecturas de intensidad se realizó con el software Microarray Suite 5.0. Para la comparación de arrays, éstos fueron escalados a una intensidad total de 100.
2.2 Resultados
El análisis diferencial de la expresión del gen col11a1 en los estadíos tumorales con respecto al control, se realizó a partir de los datos de comparación de arrays obtenidos utilizando el software de Affymetrix. Los parámetros que se tuvieron en cuenta (en el orden en el que aparecen en la lista) fueron:
i) Detección: Indica si el transcrito está Presente (P), Ausente (A) o Marginal (M); ii) Cambio: Indica si la expresión de un determinado transcrito Aumenta (I), Decrece (D), o No Cambia (NC);
iii) Signal Log Ratio (SLG): Indica el nivel de cambio de expresión entre la línea base (control) y una muestra problema. Este cambio se expresa como el log2 del ratio (fold change o número de veces que la expresión del gen está elevada o reprimida en la muestra problema-tumoral frente a la muestra control-sana). Se considera significativo un valor de SLR de 1 (equivalente a un fold change de 2), para transcritos cuya expresión aumenta frente al control) y de –1, para transcritos cuya expresión disminuye frente al control.
El análisis de la expresión diferencial del gen col11a1 en los estadíos tumorales con respecto al control sano, demuestra que los niveles de expresión del gen col11a1 estaban claramente aumentados en todos los adenocarcinomas ductales de páncreas analizados (10), pero no se detectó expresión de col11a1 en los 2 ampulomas analizados. La sobreexpresión media respecto al Control Sano de las muestras de estadío temprano (Estadío I) fue de más de 30 veces (SLR>5) y de más de 60 veces (SLR>6) en biopsias de tumores avanzados (Estadío IVB) (Tabla 4). Estos valores son incluso mayores al comparar la expresión del gen col11a1 en los tumores respecto a la muestra procedente de individuos afectados de pancreatitis crónica pero no de adenocarcinoma ductal de páncreas (PA46), siendo el aumento de expresión medio de las muestras de estadío temprano (Estadío I) de más de 100 veces (SLR=6,7), y de más de 120 veces (SLR>7) en biopsias de tumores avanzados (Estadío IVB) (Tabla 5). La sobreexpresión de los niveles de expresión del gen col11a1 en muestras tumorales respecto a las muestras con pancreatitis crónica demostró que esta sobreexpresión es específica del proceso tumoral y no se debe a una proliferación estromática inherente al proceso de inflamación característico de las pancreatitis; inflamación que también es característica, como efecto colateral, de los procesos tumorales. El gen col11a1 fue detectado como Ausente por el software MAS 5.0 en los 4 controles analizados (Tablas 4 y 5).
Tabla 4 Resultados obtenidos con Genechip Human U133A array para col11a1. N. Acc. J04177. Resultado de las comparaciones frente al control sano (PA36)
Muestra*
Detección SLR Muestra* vs PA36 Cambio Muestra* vs PA36
Controles
PA36 (páncreas normal)
A - -
PA26 (páncreas normal)
A 1,8 NC
PA29 (pancreatitis)
A 0,1 NC
PA46 (pancreatitis)
A -1,1 NC
Tumores estadío I
PA02
P 4,6 I
PA03
P 7,3 I
PA17
P 4,2 I
PA19
P 4,7 I
PA33
P 4,7 I
PA25
P 4 I
PA27
P 7,3 I
Tumores estadío III
PA24
P 5,5 I
Tumores estadío IV
PA16
P 6,7 I
PA23
P 5,4 I
Ampulomas
PA31
A 0,8 NC
PA20
A 0,3 NC
Tabla 5 Resultados obtenidos con Genechip Human U133A array para col11a1. N. Acc. J04177. Resultado de las comparaciones frente al control con pancreatitis (PA46)
Muestra*
Detección SLR Muestra* vs PA46 Cambio Muestra* vs PA46
Controles
PA46 (pancreatitis)
A - -
PA29 (pancreatitis)
A 1,1 NC
PA36 (páncreas normal)
A 1,1 NC
PA26 (páncreas normal)
A 3,5 NC
Tumores estadío I
PA02
P 5,8 I
PA03
P 8,9 I
PA17
P 5,4 I
PA19
P 5,9 I
PA33
P 6,2 I
PA25
P 5,8 I
PA27
P 8,9 I
Tumores estadío III
PA24
P 7 I
Tumores estadío IV
PA23
P 7,1 I
PA16
P 8 I
Ampulomas estadío III
PA31
A 2,8 NC
PA20
A -0,3 NC
5
10
EJEMPLO 3 Análisis diferencial de expresión del gen col11a1 en muestras de tejido de vejiga, utilizando los microarrays Human Genome U95 DNA arrays 3.1 Materiales y Métodos
Microarrays. Se utilizaron los microarrays GeneChip Test 3 (Affymetrix, Santa Clara), que permiten analizar la calidad del RNA, previamente al análisis de expresión con el microarray GeneChip Human Genome U95A (Affymetrix, Santa Clara), que representa
12.000 secuencias completas de genes anotados; el gen col11a1 está representado en el microarray por el set de sondas 37892_at de Affymetrix, que son unos oligonucleótidos sentido de 25 nucleótidos de longitud, diseñados en base a la secuencia Hs.82772 de Unigene, o J04177 de GeneBanK.
Muestras. Las muestras estudiadas procedían de biopsias, obtenidas por resección quirúrgica transuretral, de (i) sujetos control sin carcinoma transicional de vejiga (n = 7), y
(ii) pacientes que fueron clínicamente tipados tras resección y que presentaban carcinoma transicional de vejiga (n = 22) en uno de los siguientes estadíos: Tumores de bajo grado que respetan la lámina propia (Ta G1), tumores de alto grado que infiltran la lámina propia (T1 G3) y tumores de alto grado que invaden tejido muscular (T2 G3). Todas las muestras fueron clasificadas histológicamente (grado y estadío) en el servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Marqués de Valdecilla (Santander, España), el mismo hospital donde las muestras habían sido recogidas, siguiendo los preceptos de la Declaración de Helsinki. Las muestras se congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente tras su extracción y se mantuvieron a –80ºC hasta el momento de su análisis. De cada tipo de tumor así como de las muestras sanas se recibieron varios casos:
Control de tejido sano (mucosa sin estrato muscular): 5 muestras Control de tejido sano (mucosa con estrato muscular): 2 muestras Tumor de bajo grado que respeta lámina propia (TaG1): 9 muestras Tumor de alto grado que infiltra lámina propia (T1G3): 7 muestras Tumor de alto grado que invade músculo (T2G3): 6 muestras
Análisis GeneChip de expresión génica
El análisis se llevó a cabo con RNA total procedente de sujetos individuales, y con mezclas equimolares (pools) de RNAs totales procedentes de distintos sujetos sanos, o afectados de carcinoma transicional de vejiga del mismo estadío (Tabla 6).
Tabla 6 Descripción y número de muestras analizadas
Control epitelial
Control muscular Ta G1 T1 G3 T2 G3
Muestras
3*(pC1)a , 2(pC3) 2(pC2) 1, 4(pTa.1)b , 4(pTa.2) 1, 2(pT1.1)c , 4(pT1.2) 1, 2(pT2.1)d , 3(pT2.2)
5 * número de muestras que forman parte de cada pool. a pC: pool de muestras control. Ejemplo: 3(pC1) = pool 1 de 3 muestras control. b pTa: pool de muestras de tumores de bajo grado (G1) que respetan la lámina propia (Ta).
Ejemplo: 4(pTa.1) = pool 1 de 4 muestras TaG1. 10 c pT1: pool de muestras de tumores de alto grado (G3) que infiltran la lámina
propia (T1). Ejemplo: 2(pT1.1) = pool 1 de 2 muestras T1G3. d pT2: pool de muestras de tumores de alto grado (G3) que invaden tejido muscular (T2).
15 Ejemplo: 2(pT2.1) = pool 1 de 2 muestras T2G3.
Síntesis del cRNA
El RNA total de cada una de las biopsias se obtuvo homogenizando el tejido en TRIzol®
20 Reagent (Life Technologies), siguiendo las recomendaciones del proveedor. El RNA total resultante se limpió con el kit Rneasy (QIAGEN) (Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532). De cada preparación de RNA total se usaron 10 g como material de partida para la síntesis de la primera hebra de cDNA con la enzima transcriptasa inversa SuperScript™ II RNase (Life Technologies),
25 usando como cebador un oligonucleótido oligo-dT que contenía la secuencia del promotor de la RNA polimerasa del fago T7. La segunda hebra de cDNA se sintetizó utilizando los enzimas DNA polimerasa I de E. coli (Invitrogen Life Technologies), DNA ligasa de E. coli (Invitrogen Life Technologies), Rnasa H de E. coli (Invitrogen Life Technologies), y DNA polimerasa del fago T4 (Invitrogen Life Technologies). El cRNA marcado con biotina se
30 sintetizó usando el kit ENZO BioArray™ HighYield™ Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics Inc). Después de la transcripción in vitro, se eliminaron los nucleótidos no incorporados usando las columnas Rneasy (QIAGEN).
Hibridación y escaneado del array
Se fragmentaron 15 μg de cada cRNA biotinilado a 94ºC durante 35 minutos en una solución tampón que contenía Tris-acetato 40 mM (pH 8,1), KOAc 100 mM y MgOAc 30 mM. El cRNA fragmentado se mezcló con buffer de hibridación (MES 100 mM, NaCl 1M, EDTA 20 mM, 0,01% de Tween® 20) y se calentó a 99ºC durante 5 minutos y posteriormente a 45ºC durante 5 minutos para, a continuación, ser cargado en el array de Affymetrix. El primer array en el que se realizó la hibridación fue el Test 3 de Affymetrix. Este array permite analizar la calidad del RNA previo al análisis de expresión en el GeneChip Human Genome 95 A (HG-U95A) (Affymetrix, Santa Clara). Para la hibridación, los arrays se incubaron en un horno rotatorio a 45ºC durante 16 horas y con una rotación constante de 60 rpm. El lavado y tinción de cada array se llevó a cabo en la Estación de Fluidos de Affymetrix®. Se usó un programa de lavado y tinción que incluía:
-
10x2 ciclos de lavado con SSPE-T 6x (NaCl 0,9 M, NaH2PO4 60 mM, EDTA 6 mM, 0,01% de Tween® 20) a 25ºC;
-
4x15 ciclos con MES 0,1 mM, NaCl 0,1M, 0,01% de Tween® 20 a 50ºC;
-
tinción del cRNA biotinilado con un conjugado estreptavidina-ficoeritrina (10 μg/ml) (Molecular Probes);
-
10x4 ciclos de lavado con SSPE-T 6x a 25ºC;
-
tinción con un anticuerpo anti-estreptavidina (BA-0500, Vector Laboratories) durante 10 minutos;
-
tinción con un conjugado estreptavidina-ficoeritrina (1 mg/ml) (Molecular Probes) durante 10 minutos; y
-
15x4 ciclos de lavado con SSPE-T a 30ºC.
Los arrays se escanearon a 560 nm usando un microscopio confocal que utiliza emisión láser (Agilent GeneArray Scanner). El análisis de las lecturas de intensidad se realizó con el software Microarray Suite 5.0. Para la comparación de arrays, éstos fueron escalados a una intensidad total de 100.
3.2 Resultados
El análisis diferencial de la expresión del gen col11a1 en los estadíos tumorales con respecto al control, se realizó a partir de los datos de comparación de arrays obtenidos utilizando el software de Affymetrix. Los parámetros que se tuvieron en cuenta (en el orden en el que aparecen en la lista) fueron:
i)
Detección: Indica si el transcrito está Presente (P), Ausente (A) o
Marginal (M);
ii)
Cambio: Indica si la expresión de un determinado transcrito Aumenta
(I), Decrece (D), No Cambia (NC), Aumenta Marginalmente (MI), o
Decrece Marginalmente (MD); y
iii)
Signal Log Ratio (SLG): Indica el nivel de cambio de expresión entre
la línea base (control) y una muestra problema. Este cambio se
expresa como el log2 del ratio (fold change o número de veces que
la expresión del gen está elevada o reprimida en la
muestra
problema-tumoral frente a la muestra control-sana). Se considera
significativo un valor de SLR de 1 (equivalente a un fold change de
2), para transcritos cuya expresión aumenta frente al control) y de –
1, para transcritos cuya expresión disminuye frente al control.
El análisis de la expresión diferencial del gen col11A1 en los estadíos tumorales con respecto al control, demuestra que la expresión del gen col11A1 en tumores de vejiga superficiales (carcinoma transicional de bajo grado TaG1 o carcinoma transicional de grado alto que invade la lamina propria T1 G3) no cambió respecto a la de los controles; aunque el SLR medio de los tres estadíos fue de 3,2, el software de Affymetrix empleado para determinar la fiabilidad de los datos consideró que el gen col11A1 no se expresaba en estos tumores (A). Por el contrario, los niveles de expresión del gen col11a1 estaban elevados más de 20 veces (SLR = 4,5) en biopsias de tumores de vejiga invasivos (carcinoma transicional de vejiga de alto grado que invade músculo T2G3) (Tabla 7).
Tabla 7 Resultados obtenidos con Genechip Human U95A array para coll11a1. N. Acc. J04177
Detección en muestra control
Detección en estadío TaG1 SLR Ta G1 vs Control Cambio en estadío TaG1
A
A
2,1 NC
Detección en muestra control
Detección en estadío T1 G3 SLR T1G3 vs Control Cambio en estadío T1G3
A
A
3 NC
Detección en muestra control
Detección en estadío T2 G3 SLR T2G3 vs Control Cambio en estadío T2G3
A
P 4,5 I
EJEMPLO 4 Análisis diferencial de expresión del gen col11a1 en muestras de tejido de 10 páncreas, utilizando RT-PCR cuantitativa a tiempo real
4.1 Materiales y Métodos
Método. El método empleado consiste en la transcripción inversa del mRNA a cDNA y su
15 posterior amplificación en un equipo LightCycler (Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Alemania), utilizando SYBR Green para la detección del producto amplificado. La cuantificación se realiza en tiempo real y permite calcular la expresión relativa de la secuencia en diferentes muestras en la fase de amplificación lineal de la reacción.
20 Muestras. Las muestras estudiadas procedían de biopsias, obtenidas por resección quirúgica, de tejido pancreático aparentemente no tumoral, procedente de (i) individuos que presentaban adenocarcinoma ductal de páncreas (n = 1), (ii) sujetos control sin adenocarcinoma ductal de páncreas con pancreatitis crónica (n = 1), y (iii) pacientes que fueron clínicamente tipados posteriormente y que presentaban adenocarcinoma ductal de
25 páncreas (n = 5) en uno de los siguientes estadíos: Estadío I, tumor limitado al páncreas y Estadío IV, existe metástasis en tejidos u órganos distantes. Todas las muestras fueron clasificadas histológicamente (grado y estadío) en el Hospital Central de Asturias, el mismo hospital donde las muestras habían sido recogidas. Las muestras se congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente tras su extracción y se mantuvieron a –80ºC hasta el
5 momento de su análisis.
RT-PCR Cuantitativa en Tiempo Real. El análisis se llevó a cabo con RNA total procedente de sujetos individuales. Las 7 muestras que fueron analizadas se describen en la Tabla 8.
10 Tabla 8 Descripción de las muestras analizadas
Código de la muestra
Tipo Clasificación TNM Estadío
PA36
Control sano - -
PA46
Control pancreatitis - -
PA19
Tumor T1bN0M0 I
PA27
Tumor T1N0M0 I
PA33
Tumor T1bN0M0 I
PA14
Tumor T3N1M1 IV
PA16
Tumor T2N1M1 IV
Síntesis del cDNA
El RNA total de cada una de las biopsias se obtuvo homogenizando el tejido en TRIzol® Reagent (Life Technologies), siguiendo las recomendaciones del proveedor. El RNA total 20 resultante se limpió con el kit Rneasy (QIAGEN) (Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532). El RNA se cuantificó espectrofotométricamente y se digirieron 5 μg de RNA total con DNasaI. Se utilizó 1 μg de RNA tratado con DNAsa como material de partida para la síntesis de la primera hebra de cDNA con la enzima transcriptasa inversa SuperScript™ II RNase (Life Technologies),
25 usando como cebador un oligonucleótido oligo-dT que contenía la secuencia del promotor de la RNA polimerasa del fago T7. Se prepararon alícuotas del cDNA diluído a la concentración de trabajo.
Amplificación
El cDNA sintetizado se amplificó utilizando cebadores específicos del gen humano col11a1 [5’-TGGTGATCAGAATCAGAAGTTCG-3’ (SEQ ID NO: 1) y 5’-AGGAGAGTTGAGAATTGGGA ATC-3’ (SEQ ID NO: 2)], y cebadores específicos del gen de la proteína ribosomal L10 humana (ribl10) [5’-TGCGATGGCTGCACACA-3’ (SEQ ID NO: 11) y 5’- TCCCTTAGAGCAACCCATACAAC-3’ (SEQ ID NO: 12)]. Las reacciones de PCR en tiempo real se prepararon utilizando el kit LightCycler-FastStart DNA master SYBR Green I kit (Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante. El programa de amplificación consistía en 1 ciclo de 95ºC durante 10 minutos (“hot start”), seguido de 45 ciclos de 95ºC (desnaturalización) durante 10 segundos, 60ºC (anillamiento) durante 5 segundos, 72ºC (amplificación y adquisición de fluorescencia) durante 10 segundos. El programa de análisis de curvas de desnaturalización consistía en un ciclo de un pulso de 95ºC, 65ºC durante 15 segundos, y un pulso de 95ºC durante el paso de amplificación y adquisición.
Cuantificación
En primer lugar se determinó la especificidad de los productos de PCR analizando las curvas de desnaturalización. Posteriormente, como medida relativa de la expresión génica, se calculó la relación entre la abundancia de mRNAs transcritos de col11a1 y la abundancia de transcritos de ribl10 y se normalizó el dato de la relación en cada una de las muestras tumorales en base a los valores de la muestra control. Para calcular la eficiencia de las reacciones de PCR (col11a1 y ribl10) se construyó, para cada secuencia génica, una curva patrón realizada con diluciones seriadas de cDNA. A las concentraciones de cDNA molde para las reacciones en la curva patrón se les dieron valores arbitrarios 10, 5, 2,5, 1,25 y 0,625. La eficiencia se calculó utilizando la ecuación:
E = 10 –1/p
donde
E es la eficiencia de amplificación, y
p es la pendiente de la recta patrón.
La relación de los valores de expresión génica se determinó utilizando la siguiente ecuación, que relaciona los datos experimentales de la amplificación y corrige el error originado por la diferencia de eficiencia de las reacciones de PCR:
-
(Cp diana control-Cp diana muestra)
Ediana Ratio =
-
(Cp referencia control – Cp referencia muestra) Ereferencia
donde
E es la eficiencia de amplificación,
Cp es el punto de cruce (“Crossing point”),
diana es col11a1,
referencia es ribl10,
control es la muestra control (sano o pancreatitis), y
muestra es la muestra tumoral.
4.2 Resultados Cuantificación del cambio de expresión del gen col11a1
Dos réplicas de cada muestra (sana y tumoral) se amplificaron con los cebadores específicos de col11a1 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) y ribl10 (SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11). A partir de los puntos de corte generados en estas amplificaciones, se calcularon los cambios de expresión del gen col11a1 en las muestras tumorales, respecto al control sano y al control de pancreatitis, aplicando la ecuación anteriormente descrita (Tabla 9).
Tabla 9 Valores de sobrexpresión de col11a1 en las 5 muestras tumorales respecto al control sano (PA36) y respecto al control con pancreatitis (PA46)
Muestras
PA14 PA16 PA19 PA27 PA33
Aumento de expresión respecto al control sano (PA36)
356,9 36,5 245,2 205,1 322,0
Aumento de expresión respecto a Pancreatitis (PA46)
381,6 39,0 262,1 219,3 344,2
5 Los resultados confirmaron los datos obtenidos midiendo la diferencia de expresión génica con DNA-chips (Ejemplo 2), esto es, la expresión del gen col11a1 estaba fuertemente incrementada en las muestras tumorales respecto a las muestras sanas y respecto a las muestras con pancreatitis.
10 EJEMPLO 5 Producción de anticuerpos monoclonales y policlonales específicos de la proteína proCOL11A1 5.1 Materiales y Métodos 5.1.1 Clonaje de genes diferenciales en un vector de expresión heterólogo. Estrategia de LCR (Ligase Chain Reaction), digestión y ligación
Dado que el gen col11a1 es muy grande y dada la gran homología y complejidad dentro
20 de la familia de los colágenos, se optó por generar un fragmento de DNA sintético correspondiente a la región más específica de la subunidad A1 del procolágeno tipo 11 (proCOL11A1). Para ello se llevó a cabo una reacción en cadena de la ligasa (LCR) acoplada a una PCR convencional, un método de síntesis in vitro de genes asistido por un programa informático (Au et al., Biochem Biophys Res Commun. 1998 Jul
25 9;248(1):200-3, Rouillard et al., Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32(Web Server issue):W176-80).
Comparación de secuencias
30 En primer lugar se llevó a cabo una comparación entre las secuencias aminoacídicas de todos los tipos de colágenos, realizando un alineamiento múltiple con el programa
ES 2 398 328 Bl
Multialin v5.4.1 del INRA (Corpet, et al., Nucleic Acids Res. 1998 Jan 1;26(1):323-6). En un segundo paso se buscaron las regiones de menor homología entre proCOL11A1 y los tipos de colágeno con mayor grado de similitud usando el programa Lalign v2.0 (Huang et al., Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357). Posteriormente se realizó un plot de 5 hidrofobicidad de la secuencia específica de proCOL11A1 mediante el programa ProtScale de Expasy Server (http://www.expasy.ch/tools/protscale.html) y se seleccionó una región hidrófila con probabilidad alta de estar expuesta (Gasteiger et al., The proteomics protocols Handbook, H.Press, 2005;571-607). Entre las zonas más hidrofílicas de la proteína, se identificó una (aminoácidos 350-400, señalada en negro en la Figura 3),
10 que abarcaba la región más específica de pro-COL11A1 (aminoácidos 363-393), por lo que fue seleccionada como inmunógeno. Se identificó la secuencia de nucleótidos que codificaba la región seleccionada y sobre ella se realizó el diseño de oligonucleótidos para la LCR.
15 Diseño de oligonucleótidos
Para el diseño de oligonucleótidos se empleó el programa Gene2Oligo (Rouillard et al., 2004, citado supra). Este programa permite el diseño automático de oligonucleótidos cuya secuencia se solapa parcialmente, con unas características de longitud y 20 temperatura de desnaturalización que permiten un anillamiento múltiple en condiciones homogéneas mediante LCR (Tabla 10). La salida del programa de diseño es el siguiente:
Tabla 10 Oligonucleótidos para síntesis in vitro de un fragmento de proCOL11A1 por LCR, 25 diseñados con Gene2Oligo. El número de cada oligonucleótido muestra la posición del nucleótido de comienzo. F: Forward (directo) y R: Reverse (reverso)
Código
Secuencia (5'-3') SEQ ID NO:
oligo
R0
TTGGGTGCTGAAGA
R14
TCTGAGGTTCCTGAGCTTGAGCAGCC
R40
GAAAATCATCAACGATGTTTGCCTCATCTA
R70
GGTAACTTTCCATTGTTCCATAGTTGTATTCTT
R103
CAGAAACATGCCTAGGAGCTTCTGTCT
R130
TCTTCAACTGGATTTGGCTCATTTGTCC
R158
CCTCTCCCGTTAGATATTCTTCAGTAAATATT
R190
ATCCTCAGAATTTTTCCTCTGGGAATCATAAT
R222
TGCCGTCTATTTCTTTGTTTTCATATAGTGT 28
F239
AGAAATAGACGGCAGGGATTCTGATCTTC 29
R253
AATCTCCATCTACCAGAAGATCAGAATCCC 30
R283
CATATTCTTTATATTCATAAAAATCATATTCGCCTA
R319
CTTCATTAGGGGGGCTTGTTGGTTTATCTT
R349
GTTTCTGCTGGTACACCTGGACCAAATT 36
F363
GTACCAGCAGAAACTGATATTACAGAAACAA 37
R377
ATGGCCATTTATGCTTGTTTCTGTAATATCA 38
R408
gtcaagcctccatcgcATATGCACC
Ligación y amplificación por LCR-PCR
Los 30 oligonucleótidos descritos en la Tabla 10 se diluyeron a una concentración de 5 μM. Se fosforilaron 25 pmol de cada oligo en un total de 5 reacciones (6 oligonucleótidos por reacción). Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 50 μl. Cada reacción estaba compuesta por 1,3 μl de MilliQ-H2O, 5 μl de 10X T4 Kinasa Buffer, 7 μl de oligonucleótidos (6 por reacción) 5 μM, 0,7 μl de ATP 75 mM y 1 μl de T4 Kinasa 10U/μl. Las 5 reacciones se incubaron a 37ºC durante 30 minutos y posteriormente se purificaron los oligonucleótidos fosforilados en una columna de Sephadex G-25 (Amersham). Para no saturar la columna se cargaron sólo 25 μl de reacción, se lavó con dos volúmenes y se cargaron los 25 μl restantes. Los dos eluídos se recogieron juntos. Con las 5 mezclas de oligonucleótidos fosforilados y purificados se llevó a cabo la reacción en cadena de la ligasa (LCR) en un volumen final de 25 μl. Cada vial contenía 4 μl de mezcla de oligonucleótidos (5 reacciones), 2,5 μl de Ligase Buffer y 2,5 μl de Taq Ligase 4U/μl (dilución 1:10). El programa de ligación fue 2 minutos a 94ºC y 20 ciclos de 30 segundos a 94ºC y 4 minutos a 51ºC. La "segunda" PCR se llevó a cabo en un volumen final de 50 μl. Cada vial contenía 31,5 μl de MilliQ-H2O, 5 μl de 10X PCR Buffer, 5 μl de MgCl2 25 mM, 2 μl de primer directo 25 μM, 2 μl de primer reverso 25 μM, 1 μl de dNTP's 10 mM, 0,5 μl de Taq polimerasa 5U/μl y 3 μl de la LCR. Los primers usados en la segunda PCR estaban modificados para clonaje y su secuencia fue:
Directo: ATCGGAGAATTCTCTTCAGCACCCAAGGCT (SEQ ID NO: 42);
Reverso: GCTTCGGACGTCAATTATACGTGGTACCGGTAAA (SEQ ID NO: 43)
El programa de amplificación consistió en 10 minutos a 95ºC, 30 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 55ºC y 1 minuto a 72ºC, más una incubación final de 5 minutos a 72ºC. El producto de PCR teñido con bromuro de etidio se verificó por electroforesis en gel de agarosa.
El fragmento de PCR amplificado y digerido con las enzimas apropiadas se ligó con el vector pET41a (Novagen), digerido a su vez con las mismas enzimas. pET41a es un vector de expresión en procariotas que incluye un tag de GST para la producción de proteínas de fusión. Se digirieron aproximadamente 2 μg del producto de PCR y 1 μg de vector. Las reacciones de digestión se llevaron a cabo en 20 μl y cada reacción contenía 2 μl del 10X Buffer específico de cada enzima (Promega, Madison, USA. New England Biolabs, Ipswich, USA), 0,2 μl de BSA 10mg/ml, 1 μl de enzima de restricción 10 U/μl, DNA (1-2 μg) y MilliQ-H2O hasta 20 μl. Las reacciones se incubaron durante 1-2 horas a 37ºC y 10 minutos de inactivación a 65ºC, cuando fue necesario. Los productos digeridos se purificaron por escisión de un gel de agarosa ultrapura (cloning grade) al 0,75% usando el QIAquick Gel Extraction Kit o el QIAquick DNA Kit (Qiagen). Las reacciones de ligación se llevaron a cabo en 10 μl y se incubaron toda la noche a 16ºC en un termociclador. Cada reacción contenía 1 μl de 10X Ligasa Buffer, 1 μl de T4 Ligasa (New England), 50-100 ng de vector digerido, inserto digerido (se optimizaron los ratios molares inserto/vector en cada caso) y MilliQ-H2O hasta 10 μl. Se transformaron células competentes JM109 (Promega) mediante choque térmico, con 1 μl de la reacción de ligación. Las células se sembraron en placas de medio LB con antibiótico, kanamicina, y se incubaron a 37ºC durante 16 horas en una estufa. Entre 2-24 de las colonias obtenidas se pincharon con palillos autoclavados y se crecieron con agitación en medio líquido LB con kanamicina (30 μg/ml) a 37ºC durante 16 horas en un incubador orbital. En paralelo se hizo un screening por PCR sobre las mismas colonias para identificar aquellas que contenían plásmido recombinante. Para ello se prepararon mezclas de PCR que incluían 25 μl de MilliQ-H2O, 5 μl de 10X PCR Buffer, 3 μl de MgCl2 25mM, 5 μl de primer directo [Directo: ATCGGAGAATTCTCTTCAGCACCCAAGGCT (SEQ ID NO: 42)] 25 μM, 5 μl de primer reverso [Reverso: GCTTCGGACGTCAATTATACGTGGTACCGGTAAA (SEQ ID NO 43)] 25 μM, 1 μl de dNTP's 10 mM y 1 μl de Taq polimerasa 5 U/μl. En un tubo con 100 μl de MilliQ-H2O se disolvió una colonia, se incubó durante 10 minutos a 100ºC y tras una centrifugación de 5 minutos a máxima velocidad, se tomaron 5 μl del sobrenadante y se añadieron a la mezcla de PCR. Aquellas colonias que resultaron positivas en la prueba de PCR se purificaron por miniprep (Promega), se verificaron por secuenciación y finalmente se purificaron a gran escala mediante midi- o maxi-prep (Qiagen).
5.1.2 Expresión y purificación de proteínas recombinantes Optimización de las condiciones de expresión
Para estimar las condiciones óptimas de expresión de las proteínas de fusión, se llevaron a cabo experimentos piloto de inducción. Se transformaron células competentes BL21-DE3 con todas las construcciones plasmídicas y se dejaron crecer a 37ºC toda la noche en 10 ml de LB con Kanamicina. Al día siguiente se inocularon 10 ml de LB-Kanamicina con 500 μl de cada cultivo anterior y se dejaron crecer 2 horas a 37ºC en agitación. Se dividieron los cultivos en dos partes, uno inducido con isopropil-β-D-1tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM y otro sin inducir. Tras añadir el IPTG se tomaron alícuotas de 500 μl a las 0, 1, 2, 3, 4 y 5 horas de cada uno de los cultivos. Las muestras de los cultivos recogidas se centrifugaron, los pellets celulares se resuspendieron en buffer SDS-PAGE 1X y se analizaron en gel de acrilamida al 12%. En determinados casos se emplearon células competentes BL21-AI que contienen un sistema extra de represión de expresión basal, en ausencia de inductor, que resulta muy útil en casos en los que la proteína recombinante expresada resulta tóxica para la bacteria o inhibe su crecimiento. En este caso, la inducción de los cultivos se llevó a cabo suplementando el medio con IPTG 1 mM y 0,2% de L-arabinosa. En caso de observar la aparición de una banda de proteína del tamaño esperado solamente en los cultivos inducidos, se verificó la identidad de la misma por Western-blotting usando anticuerpos contra la cola de GST o bien anticuerpos específicos contra la proteína expresada.
Producción de proteínas recombinantes
Una vez determinadas las condiciones óptimas de expresión se repitió el protocolo descrito en el apartado anterior escalando los volúmenes de cultivo. Se indujeron cultivos de 250 ml – 1000 ml para cada una de las proteínas recombinantes. Una vez transcurrido el tiempo óptimo (2-4 h) se recogieron las bacterias por centrifugación y se eliminó el medio de cultivo. Los pellets bacterianos secos se almacenaron a –80ºC hasta la extracción de proteína.
A partir de los pellets se obtuvieron extractos de proteína soluble e insoluble mediante el BugBuster Protein Extraction Reagent (Novagen). Se emplearon 5 ml de BugBuster Reagent, 5 KU de rLysozima (Novagen) y 10 μl de Benzonasa (Novagen) por cada 700 mg de pellet (100 ml de cultivo). Tras una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente se centrifugó a 16.000 g y se recogió el sobrenadante con la fracción soluble. Las proteínas insolubles (cuerpos de inclusión) se solubilizaron mediante un tratamiento con rLysozima y sonicación seguido de un buffer desnaturalizante (ácido N-ciclohexil-3aminopropanosulfónico (CAPS) 50 mM, 0,3% de N-laurilsarcosina, ditiotreitol (DTT) 1 mM DTT), para solubilizar la proteína. La proteína solubilizada se dializó en dos pasos; primero frente a Tris 20 mM con DTT 0,1 mM para promover su replegamiento mediante la formación de puentes disulfuro y finalmente frente a Tris 20 mM (Protein Refolding Kit -Novagen). Las proteínas recombinantes de la fracción soluble y los cuerpos de inclusión solubilizados y replegados se purificaron por cromatografía de afinidad.
Purificación de proteínas por cromatografía de afinidad
Las proteínas de fusión a GST se purificaron por cromatografía de afinidad usando GST-Bind Resin Chromatography Kit (Novagen). Tras equilibrar la resina de GST con 10 volúmenes de buffer de unión, se cargaron los extractos de proteína. Las proteínas recombinantes fusionadas a GST quedaron retenidas en la columna por unión específica al glutatión reducido que está inmovilizado en la matriz de agarosa. La mayoría de las proteínas pasaron a través de la columna y se recogieron como eluído (flow-through). Tras lavar la columna con 5 volúmenes de buffer de lavado para despegar las proteínas unidas de forma inespecífica, se recogió la proteína de fusión añadiendo 1,5 volúmenes de un buffer de elución que contiene glutatión reducido. Finalmente se dializó la proteína contra un buffer fosfato para eliminar el glutatión. Todo el proceso se monitorizó analizando por SDS-PAGE la proteína presente en cada una de las diferentes fracciones cromatográficas, en un gel de poliacrilamida al 12% teñido con Coomasie blue.
5.1.3 Producción de anticuerpos 5.1.3.1 Producción de anticuerpos policlonales
Se obtuvo suero pre-inmune de conejos New Zeland antes de iniciar las inmunizaciones para su uso como control en experimentos posteriores. Se inmunizaron estos conejos con 5 dosis sucesivas de antígeno (proteína recombinante purificada) en adyuvante incompleto de Freund por vía intramuscular. Cada dosis contenía unos 500 μg de proteína y se administraron con un intervalo de 15 días entre dosis. Dos semanas después de la quinta dosis se sangraron a muerte los conejos obteniendo unos 80 ml de suero por cada animal. Las IgGs se purificaron por cromatografía de afinidad en columnas pre-empaquetadas con Proteína A Sefarosa (HiTrap Protein A – Amersham Biosciences). Las IgGs se unieron a la columna en condiciones de pH neutro y tras varios lavados con un buffer fosfato (Na2HPO4 20mM, pH = 7) se eluyeron usando un buffer citrato 0,1 M a pH = 3,6. Para evitar la degradación de las IgGs debido a la acidez del buffer, se equilibró el pH usando una solución de TRIS-HCl. Para eliminar del suero purificado los anticuerpos reactivos contra la cola de GST, se inmovilizó proteína GST recombinante purificada mediante el método descrito anteriormente a una resina aminolink (Pierce). Esta resina de GST se empleó para aumentar la especificidad mediante depleción de todos los sueros producidos por inoculación de proteínas de fusión a GST. Para ello se incubó el suero purificado por HiTrap con la resina GST durante 30 minutos en agitación, se centrífugo y se recuperó el sobrenadante deplecionado en IgGs anti-GST. Este proceso se llevó a cabo tres veces usando cada vez una alícuota de resina nueva.
Además de la producción propia de anticuerpos se encargaron anticuerpos policlonales de conejo generados contra péptidos (Sigma-Genosys, Cambridge, UK), se utilizaron anticuerpos comerciales de diferentes compañías y se pidieron anticuerpos a otros grupos de investigación.
5.1.3.2 Producción de anticuerpos monoclonales
Para la generación de estos anticuerpos monoclonales, se hiperinmunizaron ratones BALB/c con las proteínas recombinantes previamente producidas. Posteriormente, empleando células de mieloma Sp2/0 como partner de fusión, se generaron hibridomas de células B, siguiendo la tecnología convencional. A continuación, los sobrenadantes, que contenían los anticuerpos, fueron cribados mediante ELISA frente a la proteína proCOL11A1-GST recombinante purificada.
5.2 Resultados
Estrategia de LCR (Ligase Chain Reaction), digestión y ligación
Comparación de secuencias de los colágenos
La comparación de secuencias de todos los tipos de colágeno (tipos I a XXVII) mostró gran homología entre el colágeno XI alfa 1 (COL11A1) y el colágeno V alfa 1 (COL5A1). El análisis mostró también homología entre COL11A1 y COL11A2. Como ejemplo, se muestra la región de mayor homología en la Figura 1.
Con el objetivo de poder generar anticuerpos contra un inmunógeno de máxima especificidad para proCOL11A1 se seleccionó la región de menor homología entre las isoformas de mayor similitud (75%), 11A1 y 5A1. Para ello se comparó la secuencia de estas dos isoformas mediante el programa Lalin 2.0. El algoritmo de comparación identificó una región de mínima homología entre los aminoácidos 363-393 (Figura 2).
Paralelamente, se realizó una gráfica de hidrofobicidad de COL11A1 con el programa ProtScale y el algoritmo de Kyte & Doolittle, que reveló varias regiones hidrófilas en la proteína. Los dominios hidrófilos de una proteína tienen mayor probabilidad de corresponder a zonas expuestas, y, por tanto, los anticuerpos generados contra esos dominios tendrán mayor probabilidad de reconocer a la proteína en su conformación nativa en células y tejidos. Curiosamente, entre dichas regiones hidrófilas se identificó una región entre los aminoácidos 350 y 400 que abarcaba la región más específica de COL11A1 (363-393) (Figura 3). Finalmente, se seleccionó la región comprendida entre los aminoácidos 268 y 400 para generar un inmunógeno hidrófilo y específico de proCOL11A1. Este péptido de 133 aminoácidos se encuentra en el subdominio VAR de la región N-terminal de la proteína intracelular proCOL11A1, que se procesa y elimina en la proteína extracelular COL11A1, que es la que se ensambla en las fibras de colágeno extracelulares. La secuencia nucleotídica que codifica este fragmento se utilizó para el diseño de oligonucleótidos para la LCR-PCR.
Ligación, amplificación por LCR-PCR y clonaje
Se diseñaron oligonucleótidos solapantes que cubrían la secuencia codificante del dominio hidrófilo específico (aminoácidos 268-400) de proCOL11A1, identificado según lo descrito en el apartado anterior. A este dominio se le denominó proCOL11A1-T (Truncado) para diferenciarlo de la proteína completa. Los oligonucleótidos se diseñaron mediante el programa Gene2Oligo y se ensamblaron mediante LCR seguida de PCR, usando para la PCR una pareja de primers externos modificados con sitios de corte únicos para enzimas de restricción [Primer directo, con sitio de restricción para EcoRI, secuencia: ATCGGAGAATTCTCTTCAGCACCCAAGGCT (SEQ ID NO: 42) y primer reverso, con sitio de restricción para PstI, secuencia: GCTTCGGACGTCAATTATACGTGGTACCGGTAAA (SEQ ID NO: 43)]. El fragmento sintético generado se visualizó en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (Figura 4A), observándose una amplificación del fragmento de proCOL11A1-T esperado de 444 nucleótidos de longitud. Una vez generado el inserto, la metodología de clonaje fue similar a la descrita anteriormente: digestión de inserto y vector con enzimas de restricción, purificación con minicolumnas de afinidad, ligación y transformación de células E. coli competentes de la cepa JM109. El screening de PCR realizado sobre lisados de colonias resistentes a kanamicina reveló 6 clones positivos y 2 negativos de las 8 colonias analizadas (Figura 4B, Resultado del screening de las colonias transformantes. Las colonias 1-7 resultaron contener el fragmento pro-COL11A1-T). Los plásmidos de las colonias positivas se purificaron como se ha descrito y se guardaron como cultivos stock en glicerol.
Expresión y purificación de proteínas recombinantes
Optimización de las condiciones de expresión
Tal y como se ha descrito en Materiales y Métodos, se realizaron cultivos de bacterias transformadas en medio LB, se indujo la expresión de las proteínas de fusión con IPTG/arabinosa, se extrajeron proteínas de dichos cultivos y se analizaron mediante SDS-PAGE seguida de tinción con azul de Coomasie. El análisis mediante SDS-PAGE de extractos proteicos de cultivos transformados con los diferentes plásmidos de expresión construidos reveló en la mayoría de los casos la aparición de una banda del tamaño esperado exclusiva del cultivo inducido con IPTG o IPTG/arabinosa. De esta manera, se verificó que los plásmidos generados por clonaje en el vector pET41a del gen col11a1-T eran funcionales; es decir, que dirigían la expresión de las correspondientes proteínas fusionadas a GST. También se confirmó la expresión de la proteína GST en cultivos transformados con el vector pET41a. En la mayoría de los casos se obtuvo un nivel de expresión máximo a las 4 h tras la inducción con IPTG 1 mM y 0,2% de arabinosa. Estas condiciones se fijaron para los experimentos de expresión a mayor escala. Además se determinó la localización de las proteínas recombinantes, así como sus niveles de expresión. Las proteínas GST-COL11A1-T y GST se expresaron a alto nivel y se localizaron en el sobrenadante.
Para confirmar la identidad de las proteínas expresadas se analizaron los extractos de cultivos bacterianos por Western-blotting usando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la cola de GST (anti-GST mouse mAb, Novagen). Este análisis confirmó que las bandas de tamaño esperado observadas en los geles SDS-PAGE correspondían a las proteínas de fusión a GST (Figura 5).
Producción de proteínas recombinantes a mayor escala
Se abordó la expresión a mayor escala de la proteína de fusión GST-COL11A1-T con el objetivo de purificarla e inyectarla en consejos para obtener anticuerpos policlonales. También se expresó la proteína GST libre para emplearla en experimentos de depleción posteriores. Para ello se escalaron los experimentos puestos a punto a pequeña escala.
Purificación de proteínas por cromatografía de afinidad
Siguiendo el protocolo descrito en Materiales y Métodos se purificó GST-COL11A1-T, mediante cromatografía de afinidad en columnas de glutatión (GST-Bind Kit, Novagen). La cuantificación de las bandas de proteína por densitometría (ImageJ) permitió establecer la eficiencia de recuperación de proteína en un 40-50% y enriquecimiento en proteína de fusión en las diferentes fracciones de la columna, que fue menor del 15% en el extracto inicial y superior al 80% en el eluído.
Producción de anticuerpos policlonales
Se inmunizaron dos conejos mediante inyección intramuscular de las proteínas de fusión purificadas GST-COL11A1-T en adyuvante de Freund. Tras las primeras inmunizaciones se realizaron sangrados cada 15 días para monitorizar el aumento del título y de la especificidad del anti-suero. Para ello se testó su reconocimiento del antígeno por Western-blotting. Se confirmó un aumento del título de los sueros y de su afinidad por las proteínas recombinantes GST-COL11A1-T, en especial en los dos últimos sangrados (6 y 7). La inmunización generó también una reactividad muy fuerte contra la proteína GST, lo que no es sorprendente dado el tamaño de GST respecto al de COL11A1-T. Para reducir posibles reacciones cruzadas de los anticuerpos anti-GST sobre otras proteínas en posteriores etapas del proyecto, se llevó a cabo una depleción de los sueros, mediante cromatografía de afinidad. Para ello se inmovilizó la proteína GST en una matriz de glutatión y se incubó el suero con dicha matriz-GST dos veces. De esta manera se mejoró la especificidad de los sueros anti-COL11A1-T.
Producción de anticuerpos monoclonales
Para la generación de estos anticuerpos monoclonales, se hiperinmunizaron ratones BALB/c con las proteínas recombinantes previamente producidas. Posteriormente, empleando células de mieloma Sp2/0 como partner de fusión, se generaron hibridomas de células B, siguiendo la tecnología convencional. A continuación, los sobrenadantes, que contenían los anticuerpos, fueron cribados mediante ELISA frente a la proteína proCOL11A1-T recombinante purificada. Finalmente, el sub-isotipado de los anticuerpos murinos, se llevó a cabo mediante el Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche Diagnostics GmbH). Se seleccionó un anticuerpo monoclonal (IgG1, kappa), correspondiente al clon 1E8.33, que presentó gran afinidad por la proteína proCOL11A1-
T. La especificidad del anticuerpo por proCOL11A1 y la ausencia de reactividad cruzada con el colágeno tipo V (el que mayor homología presenta respecto al tipo XI, se llevó a cabo mediante western-blot (Figura 6). Además, se comprobó por inmunocitoquímica, la detección del proCOL11A1 en líneas celulares de rabdomiosarcoma A204, que expresan mayoritariamente proCOL11A1 según análisis a nivel de mRNA, y en células de osteosarcoma SAOS-2, que expresan mayoritariamente COL5A1, observándose una tinción intracelular intensa en las células A204, y leve en las SAOS-2, y mostrando un patrón de tinción contrario al de proCOL5A1,que fue comprobado empleando un anticuerpo policlonal de conejo frente a dicha proteína (Figura 7).
5 Los dominios VL y VH del anticuerpo 1E8.33 fueron secuenciadas empleando procedimientos previamente descritos (Fernández-Sánchez et al. Immunol Letters 2009, 123:125-131), y comprobadas mediante las herramientas Chromas Lite 2.01 (Technelysium Pty Ltd.) y Bioedit sequence Alignment Editor 7.0.9 (Tom Hall, Ibis Biosciences, Carlsbad, USA), y analizadas por IMTG/V-QUEST (http://imtg.cines.fr) e
10 IgBLAST de GeneBank (http://www.ncbi.nih.gov). Las características nucleotídicas y aminoacídicas de las regiones VL y VH se resumen en la Tabla 11, y las características de la CDR, en la Tabla 12.
Tabla 11 15 Caracterización de los segmentos génicos y sustituciones aminoacídicas de las regiones VL y VH del anticuerpo monoclonal 1E8.33 según IMGT/V-QUEST
Genes de la línea germinal
Cambios en los aminoácidos
AcM 1E8.33
VH DH JH FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3
VH
IGHV1S34*01 IGHD5 IGHJ4*01 1 A17>S 0 1 H46>Q 1 S57>N 3 Q69>R K70>N E97>G 0
VL
IGKV4-50*01 N.A. IGKJ1*01 0 0 0 0 1 A100>D 0
N.A.: No aplicable 20 *: El asterisco forma parte de la manera establecida por le programa de designar alelos

Tabla 12 Características de las CDR del anticuerpo monoclonal 1E8.33 *: número de residuos en CDR1-CDR2-CDR3
AcM 1E8.33
Restos de aminoácidos en CDR1-CDR2-CDR3
CDR1
CDR2 CDR3
VH 8-8-12*
GYSFTGYY INCYNGAT AIWDYEFHVMDY
VL 5-3-9
SSVNY YTS QQFTSSPWT
*: número de residuos en CDR1-CDR2-CDR3
Se comprobó que el anticuerpo monoclonal (AcM) 1E8.33 es un anticuerpo nuevo que no había sido previamente descrito.
El epítopo del proCOL11A1 detectado por el anticuerpo 1E8.33 fue mapeado ensayándolo frente a varios péptidos de 15 aminoácidos (solapados en 12 aminoácidos), que cubrían los residuos 255-409 del proCOL11A1. Ensayos de bloqueo del anticuerpo con varios péptidos corroboraron esta afirmación, ya que solo el péptido mencionado impidió la detección de proCOL11A1 en células A204 por parte del monoclonal (Figura 8).
EJEMPLO 6 Expresión diferencial de la proteína proCOL11A1 en muestras de tejido de páncreas, utilizando anticuerpos policlonales y monoclonales específicos de proCOL11A1, mediante Inmunohistoquímica
6.1 Materiales y Métodos Inmunohistoquímica
Se realizaron cortes con microtomo de biopsias de tejido fijado en formol e incluído en parafina. Los cortes de 3-4 μm se secaron toda la noche a 54-56ºC en estufa. Se aplicó un pre-tratamiento con buffer citrato a pH = 6,4 en olla a presión durante 4 minutos. Tras una titulación para ajustar la dilución adecuada, se incubaron las preparaciones con los anticuerpos policlonales específicos de proCOL11A1 a una dilución 1:1200 en diluyente S2022 (Dako, Carpinteria, California) y con el anticuerpo monoclonal 1E8.33 a una dilución 1:500. Se empleó el sistema de detección EnVision K4003 (Dako) y se reveló con diaminobencidina (Dako).
Se analizaron cincuenta y tres casos de adenocarcinoma ductal de páncreas, 2 casos de ampuloma y 24 casos de pancreatitis crónica con el anticuerpo policlonal específico de proCOL11A1 obtenido en el Ejemplo 5.
Asimismo, se analizaron cincuenta y dos casos de adenocarcinoma ductal de páncreas y 19 casos de pancreatitis crónicas con el anticuerpo monoclonal específico de proCOL11A1 (clon 1E8.33) descrito en el Ejemplo 5.
La inmunotinción se realizó con un ensayo doble ciego por 2 patólogos diferentes. Las
puntuaciones fueron:
0 (sin tinción visible con ningún objetivo);
1 (tinción visible con objetivo 20X);
2 (tinción visible con objetivo 10X); y
3 (tinción visible con objetivo 4X).
Los portas inmunoteñidos también fueron cuantificados mediante análisis de imagen utilizando el programa QWin (Leica). Este estudio se realizó sobre imágenes de las áreas más teñidas. Las imágenes fueron tomadas a través de un objetivo de 20 aumentos (20X) de un microscopio Olympus BX61 y se almacenaron en una cámara Olympus Dp70. Se consideraron 7 parámetros diferentes: número de células positivas; superficie de las células positivas; superficie de las células teñidas; área de referencia; número de células positivas/área de referencia; superficie de las células teñidas/área de referencia; número de células positivas/mm2; e índice de saturación sobre un intervalo de 0 a 255.
Análisis de los datos estadísticos
Asumiendo unas varianzas desiguales, se utilizó el test de Welch para determinar el significado de las diferencias en los datos de imágenes entre adenocarcinoma ductal de páncreas (ACDP) y pancreatitis crónica. También se aplicó el test ANOVA. Se evaluó la correlación entre diversos parámetros de imagen con el test de correlación Spearman Rank. Se representó la sensibilidad y especificidad de proCOL11A1 como un análisis de las características del operador receptor (ROC). Un área bajo la curva ROC (AUC) de 1 indica una discriminación perfecta (ACDP vs pancreatitis crónica), mientras que un área de 0,5 indica que la discriminación no es mejor que la elección aleatoria. La posición del punto de corte (cut-off) en la curva determinará el número de verdaderos positivos, verdaderos negativos, falsos positivos y fasos negativos. Todos los análisis fueron implementados usando el “Statistical Package for the Social Sciences (SPSS 13)” y MedCalc v9.4.1.0.
6.2 Resultados Análisis de la expresión de la proteína proCOL11A1 por Inmunohistoquímica en muestras biológicas de individuos con ACDP, pancreatitis crónica y controles
Se estudió la expresión de la proteína proCOL11A1 en cortes histológicos de biopsias de páncreas procedentes de individuos con ACDP, individuos con ampuloma y de biopsias procedentes de individuos con pancreatitis crónica, sin cáncer. El objetivo de estos experimentos fue determinar el tipo celular responsable de la expresión de esta proteína así como evaluar su patrón de expresión en las tres patologías pancreáticas.
Por un lado, se empleó el anticuerpo policlonal generado contra COL11A1-T (Figuras 9 y 10). La detección inmunohistoquímica de proCOL11A1 en los 53 pacientes con ACDP moderadamente diferenciado analizados, resultó positiva en la gran mayoría de los fibroblastos del estroma desmoplásico que rodea al tumor, observándose un grado de tinción intracitoplasmática fuerte (+++). En las 24 muestras de pancreatitis, la mayor parte (>95%) de los fibroblastos resultaron negativos para proCOL11A1, aunque se observó tinción (++) muy focal en escasos fibroblastos de las zonas más dañadas. En las dos muestras de ampuloma la tinción con anti-COL11A1-T resultó negativa, si bien las áreas de estroma eran menos abundantes que en las muestras de ACDP. Los niveles de Especificidad: 83% y Sensibilidad: 96% demuestran que el anticuerpo policlonal antiproCOL11A1 se ha demostrado útil como marcador para determinar el pronóstico, diagnóstico y diagnóstico diferencial de adenocarcinoma ductal de páncreas vs pancreatitis.
Por otro lado, se procedió al análisis de la expresión de la proteína proCOL11A1 por Inmunohistoquímica en muestras biológicas de individuos con ACDP y pancreatitis crónica, utilizando el anticuerpo monoclonal 1E8.33. La alta sensibilidad y especificidad de la tinción de proCOL11A1 se mantuvo al utilizar el anticuerpo monoclonal 1E8.33 (Figura 11).
EJEMPLO 7 Evaluación de proCOL11A1 como marcador de diagnóstico y pronóstico de adenocarcinoma ductal de páncreas y como marcador de diagnóstico diferencial de adenocarcinoma ductal de páncreas vs pancreatitis crónica
Empleando el anticuerpo monoclonal 1E8.33 (Ejemplo 5), se llevó a cabo un análisis inmunohistoquímico de muestras tumorales procedentes de individuos con adenocarcinoma ductal de páncreas (ACDP) en las que existía una proliferación de estroma peritumoral y se comparó la inmunotinción con respecto a muestras control de individuos con pancreatitis crónica.
En un estudio llevado a cabo con 71 sujetos: 52 casos de cáncer de páncreas (ACDP) y 19 casos de pancreatitis crónica, la inmunodetección del proCOL11A1s mediante el anticuerpo monoclonal específico (1E8.33), permitió discriminar entre ACDP y pancreatitis crónica con una alta precisión: Especificidad: 74%, Sensibilidad: 94%. Esto es muy importante clínicamente porque existe un porcentaje significativo de casos en los que el diagnóstico diferencial del cáncer de páncreas (ACDP) y la pancreatitis crónica presenta dificultades. Incluso el análisis anatomopatológico de la biopsia pancreática puede no ser concluyente en casos en los que el parénquima pancreático está muy degradado o la cantidad de material biopsiado es escasa.
EJEMPLO 8 Evaluación de proCOL11A1 como marcador de diagnóstico, diagnóstico diferencial y pronóstico de diferentes tipos de carcinomas
Adicionalmente, empleando el anticuerpo monoclonal 1E8.33 (Ejemplo 5), se llevó a cabo una batería de análisis inmunohistoquímicos, en tejidos humanos, con el objetivo de evaluar el potencial de proCOL11A1 como marcador diagnóstico, diagnóstico diferencial y pronóstico en diferentes tipos de cáncer. Para ello se tomaron muestras tumorales en los que existía una proliferación de estroma peritumoral y se comparó la inmunotinción respecto a muestras control sanas y/o muestras fibróticas benignas del mismo órgano. Los resultados obtenidos hasta el momento ponen de manifiesto el potencial diagnóstico y pronóstico de este marcador proCOL11A1.
8.1 Carcinoma infiltrante de mama. Diagnóstico diferencial de adenocarcinoma ductal infiltrante de mama vs adenosis esclerosante
En un estudio llevado a cabo con 103 sujetos: 51 casos de carcinoma infiltrante de mama, y 52 casos de lesiones fibróticas benignas de mama (adenosis esclerosante), la inmunodetección de proCOL11A1 mediante el anticuerpo monoclonal específico 1E8.33, permitió discriminar entre adenocarcinoma ductal infiltrante de mama y fibrosis benigna con una alta precisión: AUC = 0,97, Especificidad: 92%, Sensibilidad: 96%.
Conclusiones: El anticuerpo monoclonal anti-proCOL11A1 1E8.33 ha demostrado ser útil como marcador para determinar el pronóstico, diagnóstico y diagnóstico diferencial de adenocarcinoma ductal infiltrante de mama vs adenosis esclerosante de mama (Figuras 12 y 13).
8.2 Carcinoma infiltrante de mama. Diagnóstico diferencial de carcinoma infiltrante de mama vs lesiones benignas
En un estudio llevado a cabo con 161 sujetos: 102 casos de carcinoma infiltrante de mama, y 59 casos de lesiones fibróticas benignas de mama, la inmunodetección de proCOL11A1 mediante el anticuerpo monoclonal específico 1E8.33, permitió discriminar entre cáncer infiltrante de mama y fibrosis benigna con una alta precisión: AUC = 0,88, Especificidad: 81%, Sensibilidad: 92%.
Conclusiones: El anticuerpo monoclonal anti-proCOL11A1 ha demostrado ser útil como marcador para determinar el pronóstico, diagnóstico y diagnóstico diferencial de a y adenocarcinoma ductal infiltrante de mama vs lesiones benignas.
8.3 Carcinoma infiltrante de mama. Diagnóstico diferencial de adenocarcinoma ductal infiltrante de mama vs carcinoma in situ
En un estudio llevado a cabo con 36 sujetos con carcinoma de mama: 29 de ellos presentaban un tumor infiltrante, y los 7 en restantes se trataba de un carcinoma in situ la inmunodetección de proCOL11A1 mediante el anticuerpo monoclonal específico 1E8.33, permitió discriminar entre adenocarcinoma ductal infiltrante de mama y carcinoma in situ con una alta precisión: Especificidad: 79.31%, Sensibilidad: 71.43%.
Conclusiones: El anticuerpo monoclonal anti-proCOL11A1 1E8.33 ha demostrado ser útil como marcador para determinar el pronóstico, diagnóstico y diagnóstico diferencial de adenocarcinoma ductal infiltrante de mama vs carcinoma in situ.
8.4 Adenocarcinoma bronquioalveolar. Pronóstico, Diagnóstico y Diagnóstico diferencial de adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioloalveolar versus adenocarcinoma bronquioalveolar
Con el objetivo de investigar la utilidad del anticuerpo monoclonal 1E8.33, específico de proCOL11A1, en la detección de invasión estromal en adenocarcionomas bronquioloalveolares, se llevó a cabo la inmunotinción con dicho anticuerpo monoclonal 1E8.33 en una serie de 9 casos de adenocarcinoma bronquioalveolar y 6 casos de adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioloalveolar.
Los resultados pusieron de manifiesto ausencia de tinción en 7 de los 9 casos de adenocarcinoma bronquioalveolar mientras que los 6 casos de adenocarcinoma con patrón bronquioloalveolar se tiñeron (p=0,0034).
Conclusiones: El anticuerpo monoclonal anti-proCOL11A1 1E8.33 ha demostrado ser útil como marcador para determinar la invasión estromal en casos dudosos de adenocarcinoma bronquioalveolar y, por tanto, es útil para el pronóstico, diagnóstico y diagnóstico diferencial de adenocarcionoma bronquioloalveolar, vs adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioloalveolar.
8.5 Adenocarcinoma de colon. Pronóstico, Diagnóstico y Diagnóstico diferencial de adenocarcionoma de colon vs fibrosis benignas
En un estudio llevado a cabo con 64 sujetos: 29 casos de adenocarcinoma de colon, 6 casos control de fibrosis benigna (2), infarto (2) y diverticulitis (2), y 29 controles internos extraídos de áreas no tumorales del correspondiente colon con cáncer, la inmunodetección de proCOL11A1 mediante el anticuerpo monoclonal 1E8.33 reveló la presencia de dicho marcador (proCOL11A1) en el estroma del 100% de los casos de cáncer de colon, y sólo en el 5% de los controles, así como la ausencia en el 100% de los fibroblastos de áreas no tumorales del correspondiente colon con cáncer (Figura 14)
: Tinción de fibroblastos procedentes de cortes histológicos de biopsias de colon, procedentes de individuos con carcinoma de colon. Tinción con Eosina-Hematoxilina y anticuerpo monoclonal proCOL11A1 (clon 1E8.33).).
Conclusiones: El anticuerpo monoclonal anti-proCOL11A1, 1E8.33, ha demostrado ser útil como marcador para el pronóstico, diagnóstico y diagnóstico diferencial de adenocarcinomas de colon versus otras patologías benignas de colon.
8.6 Carcinoma de cabeza y cuello. Diagnóstico, diagnóstico diferencial y pronóstico de carcinomas escamosos infiltrantes del área otorrinolaringológica
En una serie de 50 casos de tumores de malignos de cabeza y cuello (8 mujeres y 42 hombres de entre 45 y 85 años); 9 casos de cáncer de boca, 11 casos de cáncer de faringe; 11 casos de cáncer de laringe; 17 casos de cáncer de lengua; 1 caso de cáncer de nariz; y 1 caso de cáncer de seno maxilar, la inmunodetección de proCOL11A1 con el anticuerpo monoclonal 1E8.33, permitió confirmar la presencia de proCOL11A1 en el 90% de las muestras analizadas. Solamente en 1 muestra de cáncer de boca, 1 de cáncer de lengua y 3 de cáncer de laringe, se observó ausencia total de tinción específica. La ausencia de tinción en tejido normal, se confirmó analizando el tejido normal adyacente a las muestras tumorales estudiadas (epitelio escamoso benigno).
Conclusiones: El anticuerpo monoclonal anti-proCOL11A1 ha demostrado ser útil como marcador para determinar el pronóstico, diagnóstico y diagnóstico diferencial de carcinomas escamosos infiltrantes del área otorrinolaringológica vs otras patologías benignas (Figura 15).
8.7 Carcinoma peritoneal. Diagnóstico y pronóstico de carcinomatosis peritoneales
En una serie de muestras históricas parafinadas de implantes peritoneales de adenocarcinomas de las siguientes tumoraciones primarias: 6 casos de cáncer de colon y 5 casos de cáncer genital femenino (endometrio y ovario), la inmunodetección de proCOL11A1 con el anticuerpo monoclonal 1E8.33, permitió confirmar la presencia de proCOL11A1, que se expresa focalmente e intensamente en fibroblastos del estroma tumoral desmoplásico de implantes peritoneales de adenocarcinomas de origen colónico, endometrial y ovárico; la tinción era más intensa en los poco diferenciados.
Conclusiones: Este estudio preliminar demuestra que los fibroblastos peritumorales de implantes peritoneales expresan proCol11A1 (Figura 16). El anticuerpo monoclonal antiproCOL11A1, 1E8.33, ha demostrado ser útil como marcador para el pronóstico, diagnóstico y diagnóstico diferencial de carcinomatosis peritoneales.
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LISTA DE SECUENCIAS
<110> Oncomatrix, S.L.
<120> Métodos y productos para el diagnóstico in vitro, pronóstico in vitro y desarrollo de fármacos contra carcinomas invasivos
<130> P7143ES00
<160> 43
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cebador específico sentido del gen col11a1
<400> 1 tggtgatcag aatcagaagt tcg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cebador específico antisentido del gen col11a1
<400> 2 aggagagttg agaattggga atc 23
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-H1
<400> 3
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
ES 2 398 328 Bl
<220>
<223> CDR-H2
<400> 4
Ile Asn Cys Tyr Asn Gly Ala Thr1 5
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-H3
<400> 5
Ala Ile Trp Asp Tyr Glu Phe His Val Met Asp Tyr1 5 10
<210> 6
<211> 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-L1
<400> 6
Ser Ser Val Asn Tyr 1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-L3
<400> 7
Gln Gln Phe Thr Ser Ser Pro Trp Thr 1 5
<210> 8
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH_1E8.33
ES 2 398 328 Bl
<400> 8
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Thr Gly Ser1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Gln Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Cys Tyr Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Arg Asn Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Gln Phe Asn Ser Leu Thr Ser Gly Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ile Trp Asp Tyr Glu Phe His Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Arg 100 105 110
Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser 115
<210> 9
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vkappa_1E8.33
<400> 9
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45
Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
ES 2 398 328 Bl
50 55 60
Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu65 70 75 80
Asp Ala Asp Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Ser Ser Pro Trp Thr 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cebador específico sentido del gen de la proteína ribosomal L10humana
<400> 10 tgcgatggct gcacaca 17
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cebador específico antisentido del gen de la proteína ribosomalL10 humana
<400> 11 tcccttagag caacccatac aac 23
<210> 12
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido R0
<400> 12 ttgggtgctg aaga14
<210> 13
<211> 26
ES 2 398 328 Bl
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido F0
<400> 13 tcttcagcac ccaaggctgc tcaagc26
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido R14
<400> 14 tctgaggttc ctgagcttga gcagcc26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido F26
<400> 15 tcaggaacct cagatagatg aggcaaaca 29
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<223> Oligonucleótido R40
<400> 16 gaaaatcatc aacgatgttt gcctcatcta30
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido F55
ES 2 398 328 Bl
<400> 17
tcgttgatga ttttcaagaa tacaactatg ga32
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido R70
<400> 18 ggtaactttc cattgttcca tagttgtatt ctt33
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido F87
<400> 19 acaatggaaa gttaccagac agaagctcc 29
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido R103
<400> 20 cagaaacatg cctaggagct tctgtct 27
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido F116
<400> 21 taggcatgtt tctgggacaa atgagcc 27
<210> 22
ES 2 398 328 Bl
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido R130
<400> 22 tcttcaactg gatttggctc atttgtcc28
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido F143
<400> 23 aaatccagtt gaagaaatat ttactgaaga atat34
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido R158
<400> 24 cctctcccgt tagatattct tcagtaaata tt32
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido F177
<400> 25 ctaacgggag aggattatga ttcccagag 29
<210> 26
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido R190
ES 2 398 328 Bl
<400> 26 atcctcagaa tttttcctct gggaatcata at32
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido F206
<400> 27 gaaaaattct gaggatacac tatatgaaaa caa33
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido R222
<400> 28 tgccgtctat ttctttgttt tcatatagtg t31
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido F239
<400> 29 agaaatagac ggcagggatt ctgatcttc 29
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido R253
<400> 30 aatctccatc taccagaaga tcagaatccc30
ES 2 398 328 Bl
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido F268
<400> 31 tggtagatgg agatttaggc gaatatgatt t31
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido R283
<400> 32 catattcttt atattcataa aaatcatatt cgccta36
<210> 33
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido F299
<400> 33 ttatgaatat aaagaatatg aagataaacc aacaag36
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido R319
<400> 34 cttcattagg ggggcttgtt ggtttatctt30
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
ES 2 398 328 Bl
<223> Oligonucleótido F335
<400> 35 cccccctaat gaagaatttg gtccaggt28
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido R349
<400> 36 gtttctgctg gtacacctgg accaaatt28
<210> 37
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido F363
<400> 37 gtaccagcag aaactgatat tacagaaaca a31
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido R377
<400> 38 atggccattt atgcttgttt ctgtaatatc a31
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido F394
<400> 39 gcataaatgg ccatggtgca tatgcg26
ES 2 398 328 Bl
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido R408
<400> 40 gtcaagcctc catcgcatat gcacc 25
<210> 41
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido R420
<400> 41 atggaggctt gac 13
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido directo para PCR 2 y clonación
<400> 42 atcggagaat tctcttcagc acccaaggct30
<210> 43
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleótido reverso para PCR 2 y clonación
<400> 43 gcttcggacg tcaattatac gtggtaccgg taaa34

Claims (32)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método in vitro para detectar la presencia de un carcinoma invasivo en un individuo, para determinar o pronosticar la malignidad, la invasividad, el estadío y/o la severidad de dicho carcinoma en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho carcinoma, que comprende:
    a) la detección y/o cuantificación de la proteína proCOL11A1 en una muestra de dicho individuo;
    b) la comparación de la presencia y/o cantidad de dicha proteína proCOL11A1 detectada en dicha muestra de dicho individuo con la cantidad de proteína proCOL11A1 detectada en una muestra control; y
    c) correlacionar el resultado obtenido con la presencia de un carcinoma invasivo en un individuo, la determinación o pronóstico de la malignidad, invasividad, estadío y/o severidad de dicho carcinoma invasivo en dicho individuo, o la monitorización del efecto de la terapia administrada a dicho individuo que presente dicho carcinoma invasivo;
    con la condición de que dicho carcinoma a detectar no es adenocarcinoma ductal infiltrante de mama ni adenocarcinoma ductal pancreático ni carcinoma infiltrante escamoso de cabeza y cuello.
  2. 2.
    Método según la reivindicación 1, en el que dicho carcinoma invasivo se selecciona del grupo formado por carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, y carcinomatosis peritoneales.
  3. 3.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha muestra es una muestra de tejido, preferiblemente de tejido de riñón, vejiga, colon o pulmón.
  4. 4.
    Método según la reivindicación 3, en el que dicha muestra de tejido a analizar se obtiene mediante biopsia, cistoscopia o resección quirúrgica.
  5. 5.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 , en el que dicha muestra es una muestra de bilis, exudado de flujo gástrico, heces, orina, plasma, líquido ascítico, líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido peritoneal, líquido pleural, líquido sinovial, orina, saliva, sangre, semen o suero.
  6. 6.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha muestra a analizar es una muestra seleccionada entre:
    ES 2 398 328 Bl
    una muestra de un individuo al que no se le ha diagnosticado previamente un carcinoma;
    una muestra de un individuo al que se le ha diagnosticado previamente un carcinoma; y
    una muestra de un individuo en tratamiento, o que ha sido tratado previamente, contra un carcinoma.
  7. 7.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende, además, la obtención a partir de dicha muestra de un extracto de proteínas.
  8. 8.
    Método según la reivindicación 7, en el que la detección de la proteína proCOL11A1 comprende poner en contacto el extracto de proteínas de la muestra con un anticuerpo específico contra la proteína proCOL11A1 bajo condiciones que permiten la formación de un complejo anticuerpo-proteína proCOL11A1.
  9. 9.
    Método según la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo específico contra la proteína proCOL11A1 es un anticuerpo que reconoce un epítopo situado en el dominio VAR del extremo N-terminal de la proteína proCOL11A1.
  10. 10.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, que comprende, además, la detección y/o cuantificación del complejo anticuerpo-proteína proCOL11A1 formado.
  11. 11.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la detección y/o cuantificación del complejo anticuerpo-proteína proCOL11A1 formado comprende el empleo de una técnica seleccionada del grupo formado por Western-blot o transferencia Western, ELISA (Enzyme-Linked inmunosorbent assay o ensayo inmunoabsorvente ligado a enzima), RIA (Radioimmunoassay o Radioinmunoensayo), EIA competitivo (Competitive enzyme immunoassay o Inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA (Double antibody sandwich-ELISA o ensayo ELISA sandwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas de detección multiplex basadas en el empleo de microsferas, biochips o microarrays de proteínas que incluyen anticuerpos específicos, o ensayos basados en precipitación coloidal.
  12. 12.
    Método según la reivindicación 7, en el que la detección y/o cuantificación de la proteína proCOL11A1 se lleva a cabo mediante cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando o ensayos de unión a lectina.
  13. 13.
    Un anticuerpo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1, o un fragmento del mismo que mantiene la capacidad de unirse a la proteína proCOL11A1, en donde dicho anticuerpo reconoce un epítopo situado en el dominio VAR del extremo N-terminal de la proteína proCOL11A1.
  14. 14.
    Un anticuerpo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1, o un fragmento del mismo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1, que comprende, dentro de la región variable de la cadena pesada (VH), al menos una región determinante de complementariedad (CDR) seleccionada entre:
    ES 2 398 328 Bl
    -
    una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 (GYSFTGYY) [CDR-H1] o una variante de la misma;
    ES 2 398 328 Bl
    -
    una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 (INCYNGAT) [CDR-H2] o una variante de la misma; y
    -
    una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 (AIWDYEFHVMDY) [CDR-H3] o una variante de la misma.
  15. 15.
    Anticuerpo según la reivindicación 14, que comprende, dentro de la región VH, dos de dichas CDRs seleccionadas entre las CDRs cuyas secuencias de aminoácidos comprenden las secuencias mostradas en las SEQ ID NOs: 3 a 5.
  16. 16.
    Anticuerpo según la reivindicación 14, que comprende, dentro de la región VH, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 [CDR-H1] o una variante de la misma, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 [CDR-H2] o una variante de la misma, y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 [CDR-H3] o una variante de la misma.
  17. 17.
    Anticuerpo según la reivindicación 14, que comprende, además, dentro de la región variable de la cadena ligera (VL), al menos una CDR seleccionada del grupo formado por:
    -
    una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 (SSVNY) [CDR-L1] o una variante de la misma;
    -
    una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos YTS [CDR-L2] o una variante de la misma; y
    -
    una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 (QQFTSSPWT) [CDR-L3] o una variante de la misma.
  18. 18.
    Anticuerpo según la reivindicación 17, que comprende, dentro de la región VL, dos de dichas CDRs seleccionadas entre las CDRs cuyas secuencias de aminoácidos comprenden las secuencias mostradas en las SEQ ID NOs: 6 ó 7.
  19. 19.
    Anticuerpo según la reivindicación 17, que comprende, dentro de la región VL, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 [CDR-L1] o una variante de la misma, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos YTS [CDR-L2] o una variante de la misma, y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 [CDR-L3] o una variante de la misma.
  20. 20.
    Anticuerpo según la reivindicación 17, que comprende:
    -
    dentro de la región VH, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 [CDR-H1] o una variante de la misma, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 [CDR-H2] o una variante de la misma, y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 [CDR-H3] o una variante de la misma; y
    -
    dentro de la región VL, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 [CDR-L1] o una variante de la misma, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos YTS [CDR-L2] o una variante de la misma, y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 [CDR-L3] o una variante de la misma.
  21. 21.
    Anticuerpo según la reivindicación 14, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma.
  22. 22.
    Anticuerpo según la reivindicación 17, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9 o una variante de la misma.
  23. 23.
    Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, que comprende:
    -
    una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8 [VH_1E8.33] o una variante de la misma, y
    -
    una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9 [Vkappa_1E8.33] o una variante de la misma.
  24. 24.
    Anticuerpo según la reivindicación 14, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, o un fragmento de anticuerpo que mantiene la capacidad de unirse a la proteína proCOL11A1.
  25. 25.
    Uso de un anticuerpo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1, o un fragmento del mismo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1, según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 24, para el diagnóstico, pronóstico y/o diagnóstico diferencial de un carcinoma.
  26. 26.
    Uso de un anticuerpo según la reivindicación 25 para detectar in vitro la presencia de un carcinoma, en el que dicho carcinoma se selecciona entre carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma ductal de páncreas, adenocarcinoma infiltrante de mama, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello y carcinomatosis peritoneales.
  27. 27.
    Uso de un anticuerpo según la reivindicación 25, para:
    -el diagnóstico diferencial entre adenocarcinoma ductal de páncreas y pancreatitis crónica; o para -el diagnóstico diferencial entre adenocarcinoma ductal infiltrante de mama y adenosis esclerosante de mama; o para -el diagnóstico diferencial entre carcinoma infiltrante de mama y lesiones benignas de mama; o para -el diagnóstico diferencial entre adenocarcinoma ductal infiltrante de mama y carcinoma in situ de mama; o para -el diagnóstico diferencial entre adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar y adenocarcinoma bronquioalveolar; o para -el diagnóstico diferencial entre adenocarcinoma de colon y fibrosis benigna de colon.
  28. 28.
    Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 24, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un carcinoma invasivo.
  29. 29.
    Uso de un anticuerpo según la reivindicación 28, en el que dicho carcinoma se
    5 selecciona entre carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma ductal de páncreas, adenocarcinoma infiltrante de mama, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello y carcinomatosis peritoneales.
  30. 30. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de, al menos, un anticuerpo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1, o un fragmento del mismo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1, según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 24, junto
    15 con un excipiente o sustancia transportadora farmacéuticamente aceptable.
  31. 31. Composición farmacéutica según la reivindicación 30, que comprende, además, un ingrediente activo adicional, preferiblemente un ingrediente activo que inhibe la función de la proteína proCOL11A1.
    Figura 1
    190 200 210 220 230 240
    VA1 KKTTKFLDRSDHPMIDINGIIVFGTRILDEEVFEGDIQQLLFVSDHRAAYDYCEHYSPDC ::::: ::::.. ..: ::: ::::::::::::::::::.:...: .::::::::::::: XIA1 KKTTKPLDRSERAIVDTNGITVFGTRILDEEVFEGDIQQFLITGDPKAAYDYCEHYSPDC
    190 200 210 220 230 240
    250 260 270 280 290 300 VA1 DTAVPDTPQSQDPNPDEYYTEGDGEGETYYYEYPYYEDPEDLGKEPTPSKKPVEAAKETT :...: . :.:.:. ::: : : : ::: : : .:.. : XIA1 DSSAPKAAQAQEPQIDEYAPEDIIE---YDYEYGEAE------------YKEAESVTEGP250 260 270 280
    310 320 330 340 350 360
    VA1 EVPEELTPTPTEAAPMPETSEGAGKEEDVGIGDYDYVPSEDYYTPSPYDDLTYGEGEENP : :: : . ::: . . .: :.: :.: : .: . : .: :: XIA1 TVTEE-TIAQTEANIVDDFQE------------YNYGTMESYQTEAPRH--VSGTNEPNP
    290 300 310 320 330
    370 380 390 400 410 420
    VA1 DQP--TDPGAGAEIPTSTADTSNSSNPAPPPGEGADDLEGEFTEETIRNLDENYYDPYYD . :. .: : .:... .: :. ... . . : : : : XIA1 VEEIFTEEYLTGEDYDSQRKNSEDTLYENKEIDGRDS--DLLVDGDLGEYDFYEYKEYED
    340 350 360 370 380 390
    430 440 450 460 470
    VA1 -PTSSPSE-IGPGMPANQDTIYEGIGG--PRGEKGQKGEPAIIEPGMLIEGPPGPEGPAG ::: :.: .:::.::. : .:.: ::::::::::..:::::.:::::: :::: XIA1 KPTSPPNEEFGPGVPAETDITETSINGHGAYGEKGQKGEPAVVEPGMLVEGPPGPAGPAG
    400 410 420 430 440 450
    Figura 2 Figura 3
    Figura 4 Figura 5
    Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9
    (A) (B)
    Figura 10
    Figura 11 Figura 12
    Figura 13 Figura 14
    Figura 15 Figura 16
    OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS
    N.º solicitud: 201131374
    ESPAÑA
    Fecha de presentación de la solicitud: 09.08.2011
    Fecha de prioridad:
    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA
    51 Int. Cl. : G01N33/574 (2006.01)
    DOCUMENTOS RELEVANTES
    Categoría
    56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas
    X
    ZHAO Y. et al. A Potential Role of Collagens Expression in Distinguishing Between Premalignant and Malignant Lesions in Stomach. The Anatomical Record. 2009. Vol. 292, páginas: 692-700, todo el documento. 1-17
    X
    FISCHER H. et al. Colorectal carcinogénesis is associated with stromal expression of COL11A1 and COL5A2. Carcinogénesis. 2001. Vol. 22(6), páginas: 875-878. 2-17
    X
    WANG K. et al. Novel candidate tumor marker genes for lung adenocarcinoma. Oncogene. 2002, Vol. 21, páginas: 7598-7604. 2-17
    X
    GARCIA PRAVIA C. et al. Anti-pro COLL11A1, a new marker of infiltrating breast cancer. ESSR Abstract 2009. British Journal of Surgery. 2009. Vol. 96(S5), páginas: 1-72, página 11, abstract O-05-4. 18,31-36
    Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud
    El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:
    Fecha de realización del informe 22.02.2013
    Examinador M. D. García Grávalos Página 1/5
    INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA
    Nº de solicitud: 201131374
    Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) G01N Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de
    búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, NPL, BIOSIS, MEDLINE, EMBASE, USPTO PATENT DATABASE, PUBMED, GOOGLE PATENTS, GOOGLE SCHOLAR, EBI.
    Informe del Estado de la Técnica Página 2/5
    OPINIÓN ESCRITA
    Nº de solicitud: 201131374
    Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 22.02.2013
    Declaración
    Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)
    Reivindicaciones 2-17, 19-29 Reivindicaciones 1, 18, 31-36 SI NO
    Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)
    Reivindicaciones 19-29 Reivindicaciones 1-18, 31-36 SI NO
    Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).
    Base de la Opinión.-
    La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.
    Informe del Estado de la Técnica Página 3/5
    OPINIÓN ESCRITA
    Nº de solicitud: 201131374
    1. Documentos considerados.-
    A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.
    Documento
    Número Publicación o Identificación Fecha Publicación
    D01
    ZHAO Y. et al. The Anatomical Record. 2009. Vol. 292, páginas: 692-700. 2009
    D02
    FISCHER H. et al. Carcinogénesis. 2001. Vol. 22(6), páginas: 875-878. 2001
    D03
    WANG K. et al. Oncogene. 2002, Vol. 21, páginas: 7598-7604. 2002
    D04
    GARCIA PRAVIA C. et al. ESSR Abstract 2009. British Journal of Surgery. 2009. Vol. 96(S5), páginas: 1-72. 2009
  32. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración
    La presente invención divulga un método in vitro para detectar en un paciente la presencia de un carcinoma invasivo, para determinar o pronosticar el estadio o invasividad de dicho carcinoma, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un paciente que presenta dicho carcinoma, basado en la expresión del gen col11a1, o de la proteína proCOL11A1, en una muestra biológica (reivindicaciones 1-17). Se refiere también a un anticuerpo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1 y a su uso en la elaboración de un medicamento para tratamiento de un carcinoma invasivo (reivindicaciones 18-36).
    El documento D01 divulga los genes col11a1 y col1a1 como marcadores del cáncer de estómago en fases premaligna y maligna. Este documento se refiere a un estudio realizado con muestras de lesiones de estómago y muestras de tejido sano, utilizando el mRNA extraído de las muestras en ensayos de arrays de oligonucleótidos (ver todo el documento).
    El documento D02 divulga la asociación entre la carcinogénesis colorectal y la expresión de los genes col11a1 y col5a2 en el estroma gastrointestinal. Este documento se refiere a un estudio realizado con muestras procedentes de pacientes con carcinoma colorectal y empleando como control muestras de epitelio de colon de individuos adultos que no padecen la enfermedad. Utilizando el mRNA, se analiza la expresión de los genes y los resultados muestran que la mayoría de las muestras tumorales expresan el gen col11a1 que no es expresado en las células epiteliales normales (ver todo el documento).
    El documento D03 divulga una serie de genes, entre los que se encuentra col11a1, como posibles marcadores de adenocarcinoma de pulmón. Este documento se refiere a un estudio realizado con muestras de adenocarcinoma de pulmón y, como control, sus correspondientes muestras de tejido pulmonar normal (ver todo el documento).
    El documento D04 divulga un anticuerpo anti-proCOLL11A1 como nuevo marcador para diagnóstico de cáncer de mama (ver página 11, abstract O-05-4).
    1. NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 6.1 y Art. 8.1 LP 11/1986)
    La presente solicitud divulga un método in vitro para detectar en un paciente la presencia de un carcinoma invasivo, para determinar o pronosticar el estadio o invasividad de dicho carcinoma, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un paciente que presenta dicho carcinoma, basado en la expresión del gen col11a1, o de la proteína proCOL11A1, en una muestra biológica (reivindicaciones 1-17). Se refiere también a un anticuerpo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1 y a su uso en la elaboración de un medicamento para tratamiento de un carcinoma invasivo (reivindicaciones 18-36).
    1.1. REIVINDICACIONES 1-17
    La presente invención, según las reivindicaciones 1-17, divulga un método in vitro para detectar en un paciente la presencia de un carcinoma invasivo (a condición de que no sea cáncer de mama, colon, pulmón u ovario), basado en la expresión del gen col11a1 en una muestra biológica. El documento D01 se considera el más cercano al estado de la técnica, ya que anticipa la detección del mRNA del gen col11a1 en muestras de tejido gástrico como marcador del cáncer de estómago en fases premaligna y maligna.
    La diferencia entre el documento D01 y el objeto técnico de la invención radica en la exclusión de ciertos tipos de carcinoma según se busque la detección del mRNA o la expresión de la proteína proCOL11A1.
    Informe del Estado de la Técnica Página 4/5
    OPINIÓN ESCRITA
    Nº de solicitud: 201131374
    En consecuencia, según lo divulgado en D01, la reivindicación 1 no cumple con los requisitos de novedad y actividad inventiva (Art. 6.1 y Art. 8.1 LP11/1986).
    Según lo divulgado en D01, las reivindicaciones 2-17 cumplen con el requisito de novedad (Art. 6.1 LP 11/1986).
    Sin embargo, siendo el uso del gen col11a1 como marcador genético de carcinomas invasivos, comparando la expresión del mRNA de muestras tumorales y normales, ampliamente conocido en el estado de la técnica (de hecho, los documentos D02 y D03 también anticipan el gen coll11a1 como marcador genético de la carcinogénesis colorectal y de adenocarcinoma de pulmón), se considera que sería obvio para un experto en la materia el uso de este marcador para diagnóstico de otros tipos de carcinomas invasivos, así como el uso la expresión de la proteína que codifica dicho gen, empleando técnicas y aplicaciones de análisis de datos de uso corriente en microbiología.
    En consecuencia, las reivindicaciones 2-17 no cumplen con el requisito de actividad inventiva (Art. 8.1 LP 11/1986)
    1.2. REIVINDICACIONES 18-33
    La presente invención, según las reivindicaciones 18-33, divulga un anticuerpo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1 y a su uso en la elaboración de un medicamento para tratamiento de un carcinoma invasivo. El documento D04 se considera el más cercano al estado de la técnica, ya que anticipa un anticuerpo anti-proCOL11A1 con capacidad de unirse a la proteína proCOL11A1.
    La diferencia entre el documento D04 y el objeto técnico de la invención radica en la determinación del anticuerpo de la invención según reivindicaciones 19-30, que especifica la región que reconoce el epítopo y las secuencias de aminoácidos que lo forman.
    En consecuencia, según lo divulgado en D04, las reivindicaciones 18, 31-36 no cumplen con los requisitos de novedad y actividad inventiva (Art. 6.1 y Art. 8.1 LP11/1986).
    Según lo divulgado en D04, las reivindicaciones 19-30, cumplen con el requisito de novedad (Art. 6.1 LP 11/1986).
    Informe del Estado de la Técnica Página 5/5
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