JP6977105B2 - Ｉｇｆ−１ｒ抗体および癌の診断のためのその使用 - Google Patents

Description

本発明は、ＩＧＦ−１Ｒと結合し得る新規な抗体、特に、モノクローナル抗体、ならびに前記抗体をコードするアミノ酸配列および核酸配列に関する。

ＩＧＦ−ＩＲ（または時にはＩＧＦ１Ｒ）と呼ばれるインスリン様成長因子１受容体は、チロシンキナーゼ活性を有し、インスリン受容体ＩＲと７０％の相同性を有する受容体である。ＩＧＦ−１Ｒは、分子量が約３５０，０００の糖タンパク質である。これは、ヘテロ四量体の受容体であり、その半分はそれぞれジスルフィド架橋によって連結しており、細胞外α−サブユニットおよび膜貫通β−サブユニットからなる。ＩＧＦ−１Ｒは、極めて高い親和性（Ｋｄ＃１ｎＭ）でＩＧＦ１およびＩＧＦ２と結合するが、同様にインスリンとも１００分の１〜１０００分の１の親和性で結合し得る。逆に、ＩＧＦは１００分の１の親和性でしかインスリン受容体と結合しないが、ＩＲは極めて高い親和性でインスリンと結合する。α−サブユニット上に存在するシステインに富む領域とβ−サブユニットのＣ末端部分にそれぞれ相同性の低い区域があるが、ＩＧＦ−１ＲとＩＲのチロシンキナーゼドメインは極めて高い配列相同性を有している。α−サブユニットに見られる配列の差異はリガンドの結合区域に存在するため、それはＩＧＦとインスリンのそれぞれに対するＩＧＦ−１ＲとＩＲの相対的親和性の源となっている。β−サブユニットのＣ末端部分における差異は、２つの受容体のシグナル伝達経路における相違をもたらし、ＩＧＦ−１Ｒは細胞分裂促進作用、分化作用および抗アポトーシス作用を媒介し、一方、ＩＲの活性化は主として代謝経路のレベルでの作用に関与する。

発癌におけるＩＧＦ系の役割は、ここ２０年で集中的な研究の対象となってきている。
この関心は、ＩＧＦ−１Ｒが、その細胞分裂促進特性および抗アポトーシス特性に加えて、形質転換された表現型の確立と維持に必要であると思われるという事実の発見に従ったものである。実際に、ＩＧＦ−１Ｒの過剰発現または構成的活性化が、多様な細胞において、ウシ胎仔血清を含まない培地で補助に依存することなく細胞の増殖をもたらし、ヌードマウスにおいて腫瘍の形成をもたらすということが十分に確認されている。成長因子の多数の受容体を含め、過剰発現した遺伝子の多様な産物が細胞を形質転換し得ることから、このこと自体は固有の特性ではない。しかしながら、形質転換においてＩＧＦ−１Ｒが果たす主要な役割を明らかに立証した重要な発見は、ＩＧＦ−１Ｒをコードする遺伝子が不活性化されたＩＧＲ−１Ｒ⁻細胞が、ウシパピローマウイルスのＥ５タンパク質などの、通常は細胞を形質転換することができる様々な物質、ＥＧＦＲもしくはＰＤＧＦＲの過剰発現、ＳＶ４０のＴ抗原、活性化されたＲａｓ、またはこれら最後の２つの因子の組合せによる形質転換に全く不応であるということを立証している。

このような点で、ＩＧＦ−１Ｒは、長年、腫瘍学において興味深い標的と考えられてきた。ＩＧＦ−１Ｒ（ヒト化もしくはヒト抗体または小分子）を標的とする多数のプロジェクトが、癌の処置のためのＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの開発に着手し、様々な適応で７０を超える臨床試験が実施されてきた。しかしながら、現時点でこれらのプロジェクトに成功したものは無く、上市している抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は無い。

本発明は、発癌性障害、特に、ＩＧＦ−１Ｒの発現を特徴とするものまたは異常なＩＧＦ−１Ｒ発現により媒介されるものを検出および／または監視するための診断または予後予測バイオマーカーとして使用可能な少なくとも１つの試薬を提供することを目的とする。

適切な診断または予後予測ツールとして使用できる有用な抗体を開発するためのこれまでの試みが報告されているが、これらには満足のいくものは無い。

以下の例から明らかとなるように、本発明者らは、ＩＧＦ−１Ｒ発現腫瘍のスコア化にこれまで慣用されていた市販の抗体は、それらが偽陽性および／または偽陰性を示すことから適切でないと思われることを示していることに驚いた。この問題は、１つには、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の実際の活性というよりもむしろ患者の選択のために、ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いた臨床試験の失敗をもたらした。

さらに、市販の抗体を用いて実施した最初の研究は、ＩＧＦ−１Ｒのスコア化と標的ＡＤＣ療法の抗腫瘍活性の間の矛盾を示した。

本発明は、既存のものとは異なり、ＩＧＦ−１Ｒ標的療法の薬理学と相関するものを分離することができる新規な抗体を提供することによってこの問題を改善しようとするものである。

第１の態様において、本発明の主題は、ＩＧＦ−１Ｒ、好ましくは、ヒトＩＧＦ−１Ｒと高い親和性で結合する単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントであり、従って、ＩＧＦ−１Ｒ発現により媒介される病的過剰増殖性発癌性障害を診断するための方法において有用であり得る。

本発明の１つの実施態様は、配列番号１、２、３、４、５および６の配列の６つのＣＤＲを含んでなる抗体、またはその抗原結合フラグメントに関する。

特定の実施態様では、本発明は、
ｉ）配列番号１の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３の配列のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；
ｉｉ）配列番号４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号６の配列のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖と
を含んでなることを特徴とする、ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。

用語「抗体（単数）」、「抗体（複数）」、「ａｂ」、または「免疫グロブリン」は、最も広義で互換的に使用され、それらが所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体、単離された、操作された、化学的に合成された、または組換え型の抗体（例えば、全長または完全モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびまたその抗体フラグメントが含まれる。１つの実施態様では、本発明は、組換え抗体に関する。

本明細書で使用する場合、「ＩＧＦ−１Ｒ抗体」という表現は、「抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体」と同様と解釈されるべきであり、ＩＧＦ−１Ｒと結合し得る抗体を意味する。

抗体の「ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメント」または「抗原結合フラグメント」は、抗体のＩＧＦ−１Ｒ標的（一般には抗原とも呼ばれる）と結合する能力を保持するいずれのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質も示すものとする。１つの実施態様では、このような「抗原結合フラグメント」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは一本鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントもしくはダイアボディ、またはポリ（エチレン）グリコール（「ペグ化」）（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）_２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれるペグ化フラグメント）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコール）などのポリ（アルキレン）グリコールの添加などの化学修飾により、または本発明による抗体の特徴的ＣＤＲのうち少なくとも１つを有する前記フラグメントをリポソーム内に組み込むことによりその半減期が延長されている任意のフラグメントからなる群において選択される。好ましくは、前記「抗原結合フラグメント」は、それらが由来する抗体の可変重鎖または軽鎖の部分配列から構成されるか、または前記部分配列を含んでなり、前記部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性、および標的に対して十分な、好ましくは、それが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましい様式では少なくとも１／１０に相当する親和性を保持するのに十分なものである。

好ましくは、前記「ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメント」または「抗原結合フラグメント」は、少なくとも
ｉ）配列番号１の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３の配列のＣＤＲ−Ｈ３；ならびに
ｉｉ）配列番号４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番５の配列のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号６の配列のＣＤＲ−Ｌ３
を含んでなる。

「結合」または「結合する」などとは、抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントが抗原と、生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成することが意図される。特異的結合は、少なくとも約１×１０^−６Ｍ以下の平衡解離定数を特徴とし得る。２分子が結合するかどうかを決定するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析および表面プラズモン共鳴などが挙げられる。疑念を避けるため、それは前記抗体が別の抗原と、低レベルで結合または干渉できないことを意味するものではない。しかしながら、１つの実施態様として、前記抗体は前記抗原のみと結合する。

ＣＤＲ領域またはＣＤＲとは、ＩＭＧＴにより定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すことが意図される。

ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、抗原受容体であれ、鎖型であれ、または種であれ、可変ドメインを比較するために定義されている[Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]。ＩＭＧＴ独自ナンバリングでは、保存されているアミノ酸は、常に同じ位置を持ち、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）などである。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、フレームワーク領域の標準的な画定（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域の標準的な画定：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番を提供する。ギャップは占有されていない位置を表すので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧内に示され、ドットで仕切られる、例えば［８．８．１３］）は重要な情報となる。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、ＩＭＧＴ Ｃｏｌｌｉｅｒｓ ｄｅ Ｐｅｒｌｅｓ[Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]と呼ばれる２Ｄグラフ、およびＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]における３Ｄ構造において使用される。

本明細書に相反する記載がなければ、相補性決定領域またはＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味するものと理解されるべきである。

しかしながら、ＣＤＲはまたＫａｂａｔナンバリングシステム(Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 第5版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991,および後続版)に従って定義することもできる。３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。本明細書では、用語ＣＤＲ（単数または複数）は、場合に応じて、抗体が認識する抗原またはエピトープに対するその抗体の結合親和性を担うアミノ酸残基の大多数を含むこれらの領域の１以上もしくはさらには全体を示すために使用される。本出願の通読を簡単にするために、ＫａｂａｔによるＣＤＲは定義しない。
しかしながら、ＩＭＧＴによるＣＤＲの定義を用いてＫａｂａｔによるＣＤＲを定義することは当業者には自明であろう。

特定の実施態様では、本発明によるＩＧＦ−１Ｒ抗体は、配列番号７の配列、または配列番号７の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインを含んでなることを特徴とする。

特定の実施態様では、本発明によるＩＧＦ−１Ｒ抗体は、配列番号８の配列、または配列番号８の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなることを特徴とする。

さらに別の実施態様によれば、８１６Ｃ１２と呼ばれる抗体は、配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列番号７の配列と最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の相同性を有する配列を含んでなる重鎖可変ドメイン配列を含んでなること；ならびに／または配列番号８のアミノ酸配列もしくは配列番号８の配列と最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の相同性を有する配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン配列を含んでなることを特徴とする。

本発明の意味において、核酸またはアミノ酸の２配列間の「相同性パーセンテージ」は、最適なアラインメントの後に得られる、比較する２配列間の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは、純粋に統計学的なものであり、２配列間の差異はそれらの長さに沿ってランダムに分布している。２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の比較は、それらを最適にアラインした後に配列を比較することによって慣例的に行われ、前記比較はセグメントにより、または「アラインメントウインドウ」を使用することによって行うことができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手による比較の他、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性検索法の手段によるか、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウエア（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウエアＢＬＡＳＴ ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ Ｐによる）の手段によって行うことができる。参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％および９８％の相同性を示すアミノ酸配列については、好ましい例として、参照配列、特定の改変、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または延長を含むものが挙げられる。１以上の連続または非連続アミノ酸の置換の場合、置換アミノ酸が「等価な」アミノ酸により置換される置換が好ましい。ここで、「等価なアミノ酸」という表現は、構造アミノ酸の１つに関しておそらく置換されるが、対応する抗体の、また、以下に定義される具体例の、生物活性を変更しないいずれのアミノ酸も示すものとする。

等価なアミノ酸は、それらが置換されるアミノ酸との構造的相同性か、または生成される可能性のある種々の抗原結合タンパク質間の生物活性の比較試験の結果かのいずれかに基づいて決定され得る。

限定されない例として、下表１は、対応する改変抗原結合タンパク質の生物活性に有意な改変をもたらさずに行えると思われる潜在的置換をまとめたものであり、同じ条件下で逆の置換も当然可能である。

本発明の特定の態様は、前記抗体、またはその抗原結合フラグメント体がインスリン受容体（ＩＲ）に結合しないというものである。

別の実施態様では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体からなる。

用語「モノクローナル抗体」または「Ｍａｂ」は、本明細書で使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、その集団の個々の抗体は、わずかな量で見られ得る潜在的な自然発生突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープに向けられている。このようなモノクローナル抗体は、Ｂ細胞の単一のクローンまたはハイブリドーマにより生産され得る。モノクローナル抗体はまた、組換え型であってもよく、すなわち、タンパク質工学により生産され得る。モノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。加えて、一般に種々の決定基またはエピトープに対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体の作製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに対するものである。本発明は、天然源から単離されたもしくは精製により得られた、または遺伝子組換えもしくは化学合成により得られた抗体に関する。

別の実施態様では、本発明の抗体は組換え抗体からなる。用語「組換え抗体」は、生きた細胞内での組換えＤＮＡの発現から生じる抗体を意味する。本発明の組換え抗体は、当業者に周知の遺伝子組換えの実験法を用いて生物には見られないＤＮＡ配列を作出することにより得られる。

別の実施態様では、本発明の抗体は化学的に合成された抗体からなる。

「ＩＧＦ−１Ｒ抗体」は、（相反する記載がなければ）マウスを含み、前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体のキメラ型およびヒト化型も含む。

より明確にするために、下表２にＩＭＧＴに従って定義される抗体８１６Ｃ１２の配列を示す。

１つの実施態様では、本明細書のモノクローナル抗体は、マウス、キメラおよびヒト化抗体を含む。抗体は、微生物培養物の仏国コレクション（ＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリ、フランス）に提出されたマウス起源のハイブリドーマに由来してもよく、前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞／リンパ球と骨髄腫Ｓｐ ２／Ｏ−Ａｇ １４細胞株の細胞の融合βにより得られたものである。

別の態様によれば、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を分泌し得るマウスハイブリドーマ、特に、Ｉ−４８９４の番号で２０１４年９月１７日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリ、フランスに寄託されたマウス起源のハイブリドーマに関する。

前記ハイブリドーマＩ−４８９４により分泌される、本明細書で８１６Ｃ１２と呼ばれるモノクローナル抗体またはその任意の抗原結合フラグメントは、明らかに本発明の一部をなす。

本発明は、Ｉ−４８９４の番号で２０１４年９月１７日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリに寄託されたハイブリドーマにより分泌されることを特徴とする、ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。

本発明はまた、Ｉ−４８９４の番号で２０１４年９月１７日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリに寄託されたマウスハイブリドーマを記載する。

本発明の新規な態様は、以下の核酸：
ａ）本発明による抗体をコードする核酸；
ｂ）配列番号９もしくは１０の配列、または配列番号９もしくは１０の配列と最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の相同性を有する配列から選択される配列を含んでなる核酸；ならびに
ｅ）ａ）またはｂ）に定義される核酸の相補的核酸
から選択されることを特徴とする単離された核酸に関する。

以下の表３に、本発明の抗体８１６Ｃ１２に関する種々のヌクレオチド配列をまとめる。

本明細書において互換的に使用される用語「核酸」、「核配列」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、非天然ヌクレオチドを含有するまたは含有しない核酸のフラグメントまたは領域を定義し、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは前記ＤＮＡの転写産物のいずれかである、修飾されたまたは修飾されていないヌクレオチドの厳密な配列を意味する。

また、本発明はそれらの天然の染色体環境の、すなわち、天然状態のヌクレオチド配列に関するもではないということも本明細書に含まれるべきである。本発明の配列は単離および／または精製されたものであり、すなわち、それらは例えば複製により直接的または間接的にサンプリングされたものであり、それらの環境は少なくとも部分的に改変されている。組換え遺伝学により、例えば宿主細胞の手段により得られた、または化学合成により得られた単離された核酸もまた本明細書に記載されるべきである。

本発明はまた、本発明に記載される核酸を含んでなるベクターに関する。

本発明は特に、このようなヌクレオチド配列を含むクローニングおよび／または発現ベクターを対象とする。

本発明のベクターは好ましくは、所与の宿主細胞内でヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能とするエレメントを含む。よって、ベクターは、ベクターは、プロモーター、翻訳開始および終結シグナル、ならびに好適な転写調節領域を含まなければならない。ベクターは宿主細胞内で安定に維持可能でなければならず、場合により、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特異的シグナルを有してよい。これらの種々のエレメントは使用する宿主細胞に応じて当業者により選択および最適化される。この目的で、ヌクレオチド配列は、選択された宿主内で自己複製するベクターに挿入できるか、または選択された宿主の組み込みベクターであり得る。

このようなベクターは当業者により一般に使用される方法によって作製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショックまたは化学法などの標準的方法により好適な宿主に導入することができる。

ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。ベクターは本発明のヌクレオチド配列をクローニングまたは発現するように、宿主細胞を形質転換させるために使用される。

本発明はまた、本発明に記載のベクターにより形質転換されたまたは本発明に記載のベクターを含んでなる宿主細胞を含んでなる。

宿主細胞は、原核生物系または真核生物系、例えば、細菌細胞、また例えば、酵母細胞または動物細胞、特に哺乳動物細胞の中から選択することができる。昆虫または植物細胞も使用可能である。

本発明はまた、本発明による形質転換細胞を有する、ヒト以外の動物に関する。

本発明の別の態様は、本発明による抗体、またはその機能的フラグメントの１つの生産のための方法に関し、前記方法は以下の工程：
ａ）本発明による宿主細胞の培地および好適な培養条件での培養；および
ｂ）このようにして生産された前記抗体、またはその機能的フラグメントの、前記培養培地または前記培養細胞からの回収
を含んでなることを特徴とする。

本発明による形質転換細胞は、本発明による組換えポリペプチドの作製のための方法に使用される。本発明によるベクターおよび／または本発明によるベクターにより形質転換された細胞を使用することを特徴とする、組換え型の本発明によるポリペプチドの作製のための方法もまた本発明に含まれる。好ましくは、本発明によるベクターにより形質転換された細胞は、前記ポリペプチドの発現および前記組換えペプチドの回収を可能とする条件下で培養される。

既述のように、宿主細胞は、原核生物系または真核生物系の中から選択することができる。特に、このような原核生物系または真核生物系において分泌を促進する本発明のヌクレオチド配列を特定することができる。よって、このような配列を有する本発明によるベクターは、分泌される組換えタンパク質の生産に有利に使用することができる。実際に、対象とするこれらの組換えタンパク質の精製は、それらのタンパク質が宿主細胞内部ではなく細胞培養の上清中に存在するという事実により容易となる。

また、本発明の抗体のバイオマーカーとしての使用も開示される。これらの方法は、限定されるものではないが、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、膠芽腫、結腸癌、胃癌、腎臓癌、膵臓癌、頭頸部癌またはＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する他の任意の癌により例示される、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する種々の過剰増殖性発癌性障害を検出または診断するために使用可能である。当業者に認識されているように、特定の障害に関連する抗体発現のレベルは、既存の病態の性質および／または重篤度によって異なる。

当業者に公知の従来の方法（例えば、局所、非経口、筋肉内など）のいずれかにおける本発明の抗体の投与は、サンプル中の異形成細胞を検出する、ならびに臨床医がＩＧＦ−１Ｒの発現に関連するまたはその発現により媒介される過剰増殖性障害の処置下の患者の治療計画を監視することを可能とする、極めて有用な方法を提供する。

本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する種々の病態の検出、診断、予後予測および病期分類を含む、種々の医学目的または研究目的で使用が見出せる。

本発明の１つの実施態様は、ＩＧＦ−１Ｒ発現腫瘍細胞の検出用の薬剤として使用するための、上記のようなＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。

本発明のもう１つの実施態様は、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する発癌性障害のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断または予後予測において使用するための、上記のようなＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントである。

本明細書で使用する場合、疾患を「診断する」とは、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連するまたはその発現により媒介される病的過剰増殖性発癌性障害の存在を特定または検出する、前記疾患の進行を監視する、およびＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する障害の指標となる細胞またはサンプルを特定または検出するプロセスを意味する。

本明細書で使用する場合、「予後予測」とは、疾患からの回復の見込みまたは起こり得る疾患の発生または転帰の予測を意味する。例えば、被験体由来のサンプルがＩＧＦ−１Ｒ抗体による染色に対して陰性であれば、その被験体の「予後予測」は、サンプルがＩＧＦ−１Ｒ染色に対して陽性である場合よりも良好である。サンプルは、以下により詳細に説明されるように、ＩＧＦ−１Ｒ発現レベルに関して適当な尺度でスコア化できる。

ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、検出可能／定量可能なシグナルを得るために免疫複合体または標識抗体の形態で存在してもよい。好適な標識または他の適当な検出可能な生体分子または化学物質と併用すれば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの診断および予後予測の用途に特に有用となる。

イムノアッセイで使用するための標識は一般に当業者に知られ、酵素、放射性同位元素、および蛍光、発光および発色物質（金コロイドまたはラテックスビーズなどの有色粒子を含む）を含む。好適なイムノアッセイとしては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。以下に示されるものなど、様々なタイプの標識およびそれらの標識をＩＧＦ−１Ｒ抗体とコンジュゲートする方法は当業者に周知である。

本明細書で使用する場合、用語「ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する発癌性障害」は、障害に罹患している被験体における高レベルのＩＧＦ−１Ｒ（異常）の存在がその障害の病態生理またはその障害の増悪に寄与する因子のいずれかを担うことが示されているまたは疑われる疾患および他の障害を含むことが意図される。あるいは、このような障害は、例えば、その障害に罹患している被験体の、影響を受けた細胞または組織の細胞表面におけるＩＧＦ−１Ｒのレベルの増大をエビデンスとし得る。ＩＧＦ−１Ｒレベルの増大は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いて検出され得る。

特定の実施態様では、「発現の増大」は、それがＩＧＦ−１Ｒに関する場合、対照と比べて発現の統計学的に有意な増大（ＲＮＡ発現またはタンパク質発現により測定）を示すタンパク質または遺伝子発現レベルを意味する。

１つの実施態様は、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする阻害剤、好ましくは、ＩＧＦ−１Ｒ抗体単独、組合せまたはコンジュゲートによる処置から利益を受け得るかどうかの決定において使用するための、上記のようなＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントである。

本明細書で使用する場合、「ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする阻害剤」という表現は、ＩＧＦ−１Ｒの１もしくは複数のリガンドへのまたはＩＧＦＲそれ自体への結合により、ＩＧＦ−１Ｒのチロシンキナーゼ活性を低下させるまたは阻害することができるいずれの化合物も意味する。このような阻害剤の例は、タンパク質、ペプチド、抗体もしくは抗体−薬物コンジュゲート、またはＩＧＦ−１Ｒ遺伝子もしくはＩＧＦＲリガンドの１つをコードする遺伝子の発現を阻害するＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡとして作用する任意の化学化合物、または当業者に公知の他の任意の薬物もしくは化合物である。

より詳しくは、本明細書の意味において、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする阻害剤は、ＩＧＦ−１Ｒと結合し、その１または複数のリガンドの結合を阻害することができるいずれの化合物または分子も包含することが意図される。

いっそうより詳しくは、本明細書の意味において、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする阻害剤は、ＩＧＦ−１Ｒと結合するいずれのモノクローナル抗体も包含することが意図される。

別の好ましい実施態様では、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする阻害剤は抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）からなり、ここで、抗体部分はＩＧＦ−１Ｒを標的とし、薬物成分は細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、毒素などの任意の薬物から選択することができる。１つの例示的実施態様では、薬物成分はアウリスタチン、類似体または誘導体からなり得る。

また、被験体においてＩＧＦ−１Ｒ発現腫瘍細胞の存在および／または位置をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで検出するための方法を記載することも本発明の目的であり、前記方法は、
（ａ）前記被験体由来の生体サンプルを上記のような本発明によるＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；および
（ｂ）前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの、前記生体サンプルとの結合を検出する工程
を含んでなる。

本発明はまた、被験体の細胞内、好ましくは細胞の表面のＩＧＦ−１Ｒの発現を検出するおよび／またはそのレベルを定量および／または決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ法を対象とし、前記方法は、
（ａ）前記被験体由来の生体サンプルを上記のような本発明によるＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；および
（ｂ）前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの、前記生体サンプルとの結合を検出するおよび／またはそのレベルを定量および／または決定する工程
を含んでなる。

ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合は、当業者に利用可能な種々のアッセイにより検出および／または定量および／または決定することができる。アッセイを実施するためのいずれの好適な手段も本発明内に含まれるが、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法および免疫組織化学（ＩＨＣ）が特に挙げられる。好ましい方法として、ＩＨＣおよびＦＡＣＳが含まれる。

本発明はまた、被験体においてＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞のパーセンテージをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで検出するための方法も記載し、前記方法は、
（ａ）前記被験体由来の生体サンプルを上記のようなＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；および
（ｂ）前記生体サンプルにおいてＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞のパーセンテージを定量する工程
を含んでなる。

別の実施態様は、被験体において腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒの発現レベルをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで決定するための方法であり、前記方法は、
（ａ）前記被験体由来の生体サンプルを上記のようなＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；および
（ｂ）前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの、前記生体サンプル中のＩＧＦ−１Ｒとの結合のレベルを定量する工程
を含んでなる。

当業者に明らかなように、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合レベルは、当業者に公知のいずれの手段により定量してもよい。好ましい方法は、ＥＬＩＳＡアッセイ、免疫蛍光、ＩＨＣ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、またはＦＡＣＳなどの免疫酵素的方法の使用を含む。

本発明の方法によれば、ＩＧＦ−１Ｒに対する前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの結合レベルは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）により定量される。

「生体サンプル」は、被験体から採取可能名いずれのサンプルであってもよい。このようなサンプルは、本発明のバイオマーカーの発現レベルの決定を可能とするものでなければならない。よって、サンプルの性質は腫瘍の性質に依存する。

好ましい生体サンプルには、癌が液性腫瘍であれば、血液サンプル、血漿サンプル、またはリンパサンプルなどのサンプルが含まれる。

好ましい生体サンプルには、癌が固形腫瘍であれば、生検サンプルまたは外科的切除療法から採取されるサンプルなどのサンプルが含まれる。

好ましくは、生体サンプルは、ヒト起源の血清、全血細胞、組織サンプルまたは生検などの体液である。サンプルは例えば、好都合にはＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する病的発癌性障害の存在に関してアッセイ可能な生検組織を含み得る。

供試生体サンプルにおいてＩＧＦ−１Ｒ発現レベルの決定がひと度なされれば、それらの結果を対照サンプルの結果と比較することができ、対照サンプルの結果は、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する発癌性障害を持たない個体から、供試生体サンプルと同様にして得られる。ＩＧＦ−１Ｒのレベルが供試生体サンプルにおいて有意に高ければ、それが由来した被験体が前記障害を有するまたは発症する高い見込みが存在すると結論付けることができる。

本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ発現腫瘍のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断または予後予測の方法に関し、前記方法は、（ｉ）本発明に従い、上記のように、被験体において腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒの発現レベルをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで決定するための方法により、ＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを決定する工程、および（ｉｉ）工程（ｉ）の発現レベルをＩＧＦ−１Ｒ非発現組織からのＩＧＦ−１Ｒの参照発現レベルと比較する工程を含んでなる。

標的抗腫瘍療法の開発に関して、免疫組織学的技術を用いた診断は、受容体発現レベルに関するｉｎ ｓｉｔｕ情報を与え、従って、このような処置に必要とされる受容体の発現レベルに従って処置可能な患者を選択することを可能とする。

病期決定は潜在的予後予測値を持ち、最適な療法を計画するための基準を提供する。Simpson et al., J. Clin. Oncology 18:2059 (2000)。例えば、固形腫瘍のための処置選択は腫瘍の病期分類に基づき、この分類は通常、米国癌合同委員会(American Joint Committee on Cancer)（ＡＪＣＣ）の腫瘍／結節／転移（ＴＮＭ）検査を用いて実施される。この検査および病期分類体系は患者において固形癌が診断された病期に関していくつかの有用な情報を提供するが、それは不正確かつ不十分であると一般に認識されている。特に、これは腫瘍進行の最初期病期を特定することができない。

別の実施態様は、被験体において腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒスコアをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで決定するための方法からなり、前記方法は、
（ａ）前記被験体由来の生体サンプルを上記のようなＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；
（ｂ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）により、前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの、前記生体サンプル中のＩＧＦ−１Ｒとの結合のレベルを定量する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた定量レベルを、染色強度および陽性細胞のパーセンテージという２つのパラメーターに基づく適当な尺度と比較することにより、腫瘍細胞または腫瘍をスコア化する工程
を含んでなる。

１つの実施態様において、ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、組織サンプルがホルマリン固定、ホルモール置換固定、Ｇｌｙｃｏ−ｆｉｘｘ固定、パラフィン包埋および／または凍結された際もＩＧＦ−１Ｒと結合し得る。

ＩＧＦ−１Ｒの予後予測値を推定するために、いずれの従来のハザード分析法を用いてもよい。代表的な分析方法にはＣｏｘ回帰分析が含まれ、この分析は、打ち切り例の存在下で生存または事象までの時間のデータをモデル化するためのセミパラメトリック法である(Hosmer and Lemeshow, 1999; Cox, 1972)。例えば生命表またはカプラン−マイヤーなどの他の生存分析とは対照的に、Ｃｏｘは、モデルに予測因子変数（共変量）の包含を可能とする。例えばＣｏｘなどの慣例の分析法を用い、原発腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ発現状態と、いずれかの疾患再発の発症までの時間（無病生存期間、または転移性疾患までの時間）、または疾患による死亡までの時間（全生存期間）との相関に関する仮説を検定することができる可能性がある。Ｃｏｘ回帰分析はまた、Ｃｏｘ比例ハザード分析としても知られる。この方法は、患者生存期間に対して腫瘍マーカーの予後予測値を検定するために標準的なものである。多変量モードで使用する場合、いくつかの共変量の影響が並行して検定され、その結果、独立した予後予測値を有する個々の共変量、すなわち、最も有用なマーカーが同定できる。陰性または陽性「ＩＧＦ−１Ｒ状態」という用語はまた、［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］または［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］と表すこともできる。

癌の診断または監視の際にサンプルを「スコア化」することができる。その最も簡単な形では、スコア化は、免疫組織化学によるサンプルの視覚的検査により判断されるカテゴリー的陰性または陽性であり得る。より定量的なスコア化は、サンプリングされる細胞の染色強度または染色（「陽性」）比率の２つのパラメーターを判断することを含む。

「ＩＧＦ−１Ｒ状態」は、本発明の意味の範囲内で、免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光活性化細胞選別ＦＡＣＳ、または当業者ｎ公知の他の方法などの任意の方法により測定されるＩＧＦ−１Ｒの発現レベルの決定に基づく、ＩＧＦ−１Ｒ陽性［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］またはＩＧＦ−１Ｒ陰性［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］クラスへの腫瘍の分類に関する。

１つの実施態様では、標準化を保証するために、サンプルをＩＧＦ−１Ｒ発現レベルに関して異なる尺度でスコア化することができ、それらのほとんどは反応生成物の強度および陽性細胞のパーセンテージの評価に基づく(Payne et al., Predictive markers in breast cancer − the present, Histopathology 2008, 52, 82-90)。

別の実施態様では、前記スコア化は、特に本発明の方法の工程（ｃ）において、染色強度および陽性細胞のパーセンテージに基づく適当な尺度を使用することを含んでなる。

第１の例として、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のＩＨＣ評価のためのＱｕｉｃｋ Ａｌｌｒｅｄスコアリングを用いた類推により、サンプルは、反応性の強度と染色された細胞の比率のスコアを合算した０〜８のグローバル尺度でＩＧＦ−１Ｒ発現レベルに関してスコア化することができる(Harvey JM, Clarck GM, Osborne CK, Allred DC; J. Clin. Oncol. 1999; 17; 1474-1481)。より詳しくは、反応性の強度の第１の基準は、０〜３の尺度でスコア化され、０は「反応性無し」に相当し、３は「強い反応性」に相当する。反応性の比率の第２の基準は、０〜５の尺度でスコア化され、０は「反応性無し」に相当し、５は「６７〜１００％の比率の反応性」に相当する。次に、反応性強度のスコアおよび反応性比率のスコアが合算され、合計スコア０〜８となる。合計スコア０〜２は陰性と見なされ、合計スコア３〜８は陽性と見なされる。

この尺度によれば、本明細書で使用される腫瘍または腫瘍細胞の陰性または陽性「ＩＧＦ−１Ｒ状態」という用語は、それぞれＡｌｌｒｅｄ尺度でスコア０〜２または３〜８に相当するＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを意味する。

下記の表４は、Ａｌｌｒｅｄ法によるＩＨＣ結果を解釈するためのガイドラインを示す。

本発明によれば、前記方法は、前記適当な尺度が０〜８の尺度であることを特徴とし、反応性無しは０、６７〜１００％の反応性比率の強い反応性は８のスコアとされる。

よって、好ましい実施態様では、本発明に従い、被験体において腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒスコアをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで決定するための方法は、工程（ｃ）において、前記適当な尺度が０〜８の尺度であることを特徴とし、反応性無しは０、６７〜１００％の反応性比率の強い反応性は８のスコアとされる。

言い換えれば、被験体由来の腫瘍または腫瘍細胞の状態をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ
ｖｉｖｏで決定する方法が記載および特許請求され、前記方法は、
（ａ）被験体由来の腫瘍または腫瘍細胞をＡｌｌｒｅｄ尺度に従ってスコア化する工程；および
（ｂ）−ｉ）腫瘍または腫瘍細胞の状態が３〜８のＡｌｌｒｅｄスコアを有する［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］であると決定する工程；または
−ｉｉ）腫瘍または腫瘍細胞の状態が０〜２のＡｌｌｒｅｄスコアを有する［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］であると決定する工程
を含んでなる。

本発明の特定の態様では、腫瘍または腫瘍細胞の状態は、３のＡｌｌｒｅｄスコアを有する［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。

本発明の特定の態様では、腫瘍または腫瘍細胞の状態は、４のＡｌｌｒｅｄスコアを有する［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。

本発明の特定の態様では、腫瘍または腫瘍細胞の状態は、５のＡｌｌｒｅｄスコアを有する［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。

本発明の特定の態様では、腫瘍または腫瘍細胞の状態は、６のＡｌｌｒｅｄスコアを有する［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。

本発明の特定の態様では、腫瘍または腫瘍細胞の状態は、７のＡｌｌｒｅｄスコアを有する［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。

本発明の特定の態様では、腫瘍または腫瘍細胞の状態は、８のＡｌｌｒｅｄスコアを有する［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。

本発明の別の特定の態様では、腫瘍または腫瘍細胞の状態は、３〜８のＡｌｌｒｅｄスコアを有する［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。

本明細書では、被験体において腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ状態のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの決定に関して本明細書に記載される別の特定の方法は、
（ａ）請求項１８の方法に従って、前記被験体由来の腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒをスコア化する工程；および
（ｂ）腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ状態を、３〜８のスコアを有する［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］であると決定する工程；または
（ｃ）腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ状態を、０〜２のスコアを有する［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］であると決定する工程
を含んでなることを特徴とする。

第２の例として、例えばＨＥＲ−２受容体のＩＨＣ評価のための従来のスコア化を用いた類推により、サンプルは、染色の強度（好ましくは膜染色）および染色を示す細胞の比率を０〜３＋の合算尺度に統合するいくらか簡素なスコア化法でＩＧＦ−１Ｒ発現レベルに関してスコア化してもよい。

簡易尺度と呼ばれるこの尺度において、０および１＋は陰性であり、２＋および３＋は陽性染色を表す。しかしながら、スコア１＋〜３＋は、各陽性スコアは、スコア０（陰性）と比較した場合に再発および致命的疾患の有意に高いリスクと関連付けることができるので、陽性として記録することができるが、陽性スコアの中での強度増加はさらなるリスク軽減をもたらし得る。

一般的に言えば、本明細書で使用される腫瘍または腫瘍細胞の陰性または陽性「ＩＧＦ−１Ｒ状態」という用語は、それぞれ簡易尺度でスコア０〜１＋または２＋〜３＋に相当するＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを意味する。浸潤性腫瘍の完全な周囲膜性反応性だけが考慮されるべきであり、しばしば「金網」の外観になぞらえられる。原稿のガイドラインでは、ＩＧＦ−１Ｒのベースライン（スコア２＋または３＋）としてスコア化されたサンプルはさらなる評価を受ける必要がある。ＩＨＣ分析は拒絶されるべきであり、反復されるか、または限定されない例として、対照が予想通りではない場合には、ＦＩＳＨまたは他の任意の方法により試験され、アーチファクトはほとんどのサンプルを巻き込み、サンプルは正常な乳管（内部対照）の強い膜性陽性を持ち、過度な抗原賦活を示唆する。

より明瞭にするために、以下の表５にこれらのパラメーターをまとめる。

本発明の方法は、前記適当な尺度が尺度０〜３^＋であることを特徴とし、ここで、腫瘍細胞の膜性反応性にスコア０が付けられるものはなく、１０％を超える腫瘍細胞における強い完全な反応性にスコア３^＋が付けられる。

より詳細には、上記のように、前記適当な尺度は０〜３の尺度であり、腫瘍細胞の膜性反応性にスコア０が付けられ；１０％を超える腫瘍細胞のかすかに知覚できる膜性反応性にスコア１＋が付けられ；１０％を超える腫瘍細胞の弱い〜中等度の完全な膜性反応性にスコア２＋が付けられ；１０％を超える腫瘍細胞の強い完全な反応性にスコア３＋が付けられる。

言い換えれば、被験体由来の腫瘍または腫瘍細胞(a tumor of of tumoral cells)の状態をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで決定する方法が記載され、特許請求され、前記方法は、（ａ）上記のような簡易尺度に従って被験体由来の腫瘍または腫瘍細胞をスコア化する工程；および（ｂ）腫瘍または腫瘍細胞の状態がスコア２＋または３＋を有する［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］であることを決定する工程；または（ｃ）腫瘍または腫瘍細胞の状態がスコア０または１＋を有する［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］であることを決定する工程を含んでなる。

本発明の特定の態様では、腫瘍または腫瘍細胞は、スコア２＋を有する［ＩＧＦ−１Ｒ
（＋）］である。

本発明の特定の態様では、腫瘍または腫瘍細胞は、スコア３＋を有する［ＩＧＦ−１Ｒ
（＋）］である。

本発明の別の特定の態様では、腫瘍または腫瘍細胞は、スコア２＋または３＋を有する［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。

別の実施態様では、本発明は、被験体における腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ状態をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで決定するための方法に関し、前記方法は、
（ａ）従前に記載の本発明の方法に従い、前記被験体由来の前記ＩＧＦ−１Ｒ腫瘍細胞または前記腫瘍をスコア化する工程；および
（ｂ）−ｉ）腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ状態が、スコア２^＋または３^＋を有する［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である工程；または
−ｉｉ）腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒ状態が、スコア０または１^＋を有する［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］である工程
を含んでなる。

一般に、試験またはアッセイの結果は、様々な形式のいずれかで提示することができる。これらの結果は質的に提示することができる。例えば、試験報告書は、おそらくは検出限界の指標も伴って、特定のポリペプチドが検出されたかどうかだけを示してもよい。これらの結果は半定量的と表示されてもよい。例えば、様々な範囲が定義されてよく、その範囲に、定量的情報の特定の程度を示すスコアを割り当ててもよい（例えば、使用する尺度に応じて０〜３＋または０〜８）。このようなスコアは、例えば、ＩＧＦ−１Ｒが検出される細胞の数、シグナルの強度（ＩＧＦ−１ＲまたはＩＧＦ−１Ｒ保有細胞の発現レベルを示し得る）などの様々な因子を反映し得る。結果は、例えば、ＩＧＦ−１Ｒが検出される細胞のパーセンテージとして、タンパク質濃度としてなど、定量的方式で表示してもよい。

当業者が認識しているように、試験により提供される出力のタイプは、その試験の技術的限界およびそのポリペプチドの検出に関連する生物学的重要性によって異なり得る。例えば、特定のポリペプチドの場合、単に質的な出力（例えば、ポリペプチドが特定の検出レベルで検出されるかどうか）は、重要な情報を提供する。他の場合では、より定量的な出力（例えば、正常レベルに対して供試サンプルのポリペプチドの発現レベルの比）が必要である。

別の態様では、被験体において病的過剰増殖性発癌性障害またはＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する病状に対する感受性を診断する方法が記載され、前記方法は、
（ａ）ＩＧＦ−１Ｒ発現細胞の検出のための、および／または本発明に従いＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを決定するための方法により、サンプルにおいてＩＧＦ−１Ｒ保有細胞の有無を決定する工程；
（ｂ）前記ＩＧＦ−１Ｒ保有細胞の有無に基づいて病状または病状に対する感受性を診断する工程
を含んでなる。

本明細書に記載の方法では、ＩＧＦ−１Ｒ発現細胞の検出またはＩＧＦ−１Ｒのレベルの増加は一般に、ＩＧＦ−１Ｒ介在障害を有するまたは呈する疑いのある患者の指標となる。

本発明はまた、個体の癌発症リスクを予測するための方法を提供し、前記方法は、ＩＧＦ−１Ｒ発現細胞の検出のための、および／または本発明に従いＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを決定するための方法により、組織サンプルにおいてＩＧＦ−１Ｒの発現レベル検出することを含んでなり、高レベルのＩＧＦ−１Ｒ発現が高い癌発症リスクの指標となる。

本発明はまた、腫瘍侵襲性を評価するための方法に関する。

「腫瘍侵襲性」は、本明細書で使用する場合、急速に増殖する腫瘍および急速に拡散する傾向を意味する。

１つの実施態様では、腫瘍侵襲性を評価するための前記方法は、
（ａ）ＩＧＦ−１Ｒ発現細胞の検出のための、および／または本発明に従いＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを決定するための方法により、腫瘍サンプルにおいて細胞により発現されるＩＧＦ−１Ｒのレベルを決定する工程、
（ｂ）ＩＧＦ−１Ｒ発現細胞の検出のための、および／または本発明に従いＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを決定するための方法により、その後の時点で同じ個体から採取した等価の組織サンプルで発現されるＩＧＦ−１Ｒのレベルを決定する工程、および
（ｃ）工程（ａ）で得られた発現レベルと工程（ｂ）で得られた比の間の比を決定する工程
を含んでなり、時間に対する腫瘍サンプルのＩＧＦ−１Ｒ発現の比は、癌進行のリスクに関する情報を提供する。

好ましい実施態様では、工程（ｂ）で得られたレベルに対する工程（ａ）で得られたレベルの比が１より大きい場合、侵襲性を示す。別の実施態様では、１以下の比は、非侵襲性を示す。

本発明の別の態様は、本発明に従い、発現の検出のため、および／またはＩＧＦ−１Ｒを定量するため、および／または発現のレベルを決定するための方法を含むことにより、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする療法の投与に応答したＩＧＦ−１Ｒ発現の監視である。このような監視は、前記療法がＩＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーションおよび／または分解を標的とする場合に極めて有用であり得る。

発癌性障害がＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬による処置に感受性があるかどうかを決定するための方法を記載することも本発明の目的であり、前記方法は、
（ａ）上記のような本発明のスコア化の方法に従い、被験体の腫瘍の腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒ状態をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで決定する工程、および
（ｂ）腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ状態がＩＧＦ−１Ｒ（＋）である場合に、発癌性障害が、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬による処置に感受性があると決定する工程
を含んでなる。

特に、細胞表面でのＩＧＦ−１Ｒ発現の監視は、臨床試験および「個別化」療法の際に処置の有効性を評価するための重要なツールであり得る。

よって、本出願は、被験体に適当な治療計画を決定するための方法を提供する。

本発明に従い、発現の検出のため、および／または発現のレベルを決定するための方法により決定され得るＩＧＦ−１Ｒレベルの増大または低減は、ＩＧＦ−１Ｒに関連する癌の評価の指標となる。よって、ＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞の数の増加または種々の組織もしくは細胞に存在するＩＧＦ−１Ｒの濃度の変化を測定することにより、ＩＧＦ−１Ｒに関連する悪性腫瘍の改善を狙いとする特定の治療計画が効果的であるかどうかを決定することができる。

本発明のもう１つの目的はまた、ＩＧＦ−１Ｒに関連する発癌性障害に罹患している被験体において前記障害を緩和するように計画された治療計画の有効性をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで決定するための方法であり、前記方法は、
（ａ）前記処置の第１の時点に相当する第１の生体サンプルにおいて、上記のように本発明に従い、発現の検出のための、および／または発現のレベルを決定するための方法により、ＩＧＦ−１Ｒの第１の発現レベルを決定する工程；
（ｂ）前記処置のその後の第２の時点に相当する第２の生体サンプルにおいて、上記のように本発明に従い、発現の検出のための、および／または発現のレベルを決定するための方法により、ＩＧＦ−１Ｒの第２の発現レベルを決定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた前記第２の発現レベルに対する工程（ａ）で得られた前記第１の発現レベルの比を計算する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）の比が１より大きい場合に前記治療計画の有効性が高いと決定する；または工程（ｃ）の比が１以下である場合に前記治療計画の有効性が低いと決定する工程を含んでなる。

好ましい実施態様では、ＩＧＦ−１Ｒに関連する発癌性障害に罹患している被験体において前記障害を緩和するように計画された前記治療計画は、前記被験体に対するＩＧＦ−１Ｒ経路標的療法の投与を含む。

また、本発明に従い、発現の検出のための、および／または発現のレベルを決定するための方法を用いて、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する発癌性障害をイメージングするｉｎ ｖｉｖｏ法を提供することも本発明の目的である。このような方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を位置決定し、ならびにそれらの浸潤性を監視するために有用である。同様に、本方法は、ＩＧＦ−１Ｒ介在癌と従前に診断された患者において進行および／または処置に対する応答を監視するために有用である。

１つの実施態様は、被験体においてＩＧＦ−１Ｒ発現腫瘍細胞の位置を検出するための方法であり、前記方法は、
ａ）前記被験体に本発明によるＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する工程；および
ｂ）前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合を検出する工程
を含んでなり、
前記結合は腫瘍細胞の存在を示す。

発現腫瘍の存在の検出については、当業者に公知の多くの技術を使用することができる。しかしながら、好ましい手段はＩＨＣおよびＦＡＣＳである。

別の態様では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏイメージング試薬を提供し、前記試薬は、本発明によるＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなり、前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、好ましくは標識され、より好ましくは放射性標識される。

本発明はまた、ＩＧＦ−１Ｒ介在癌に罹患している患者のメディカルイメージングにおける前記試薬の使用も企図する。

本発明の方法は、
（ａ）前記患者にイメージングに有効な量の本発明の造影試薬を投与する工程、および
（ｂ）前記試薬を検出する工程
を含んでなる。

好ましい実施態様では、前記造影剤は、本発明によるＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと活性部分を含んでなる。

「活性部分」は、本明細書で使用する場合、前記造影試薬のｉｎ ｖｉｖｏ検出を可能とする薬剤である。本発明による有効部分としては、特に、テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）、銅−６７（Ｃｕ−６７）、スカンジウム−４７（Ｓｃ−４７）、Ｌｕｔｈｅｔｉｕｍ−７７（Ｌｕ−１７７） 銅−６４（Ｃｕ−６４）、イットリウム−８６（Ｙ−８６）またはヨウ素−１２４（Ｉ−１２４）などの放射性元素が含まれる。

造影剤は、ヒトなどの哺乳動物における診断使用に有効な量で投与され、その後、造影剤の局在および蓄積が検出される。造影剤の局在および蓄積は、放射性核種イメージング、ラジオシンチレーショングラフィー、核磁気共鳴画像法、コンピューター断層撮影法、ポジトロン放出断層撮影法、コンピューター体軸断層撮影法、Ｘ線または磁気共鳴画像法、蛍光検出、および化学発光検出により検出可能である。

標的抗腫瘍療法の開発に関して、免疫組織学的技術による診断は、ｉｎ ｓｉｔｕで受容体発現レベルに関する、例えば、腫瘍の大きさおよび／または位置に関する情報を与える。よって、診断は、このような処置に必要とされる受容体の発現レベルに従い、処置を受け得る患者を選択することを可能とする。

本発明の特に興味深い態様は、治療量のＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬の投与から利益を受けるまたは受けないと予測される癌患者を選択するための方法であり、前記方法は、
（ａ）上記の本発明の方法に従い、ＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを決定する工程；
（ｂ）前工程（ａ）の発現レベルを参照発現レベルと比較する工程；および
（ｃ）参照発現レベルに対する（ａ）で得られた発現レベルの比が１より大きい場合に、前記患者をＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬による処置から利益を受けると予測されるとして選択する工程；または
（ｄ）参照発現レベルに対する（ａ）で得られた発現レベルの比が１以下である場合に、前記患者をＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬による処置から利益を受けると予測されないとして選択する工程
を含んでなる。

ＩＧＦ−１Ｒの発現レベルは、有利には、「参照レベル」または「参照発現レベル」とも呼ばれる対照細胞またはサンプル中のレベルに関して比較または測定される。「参照レベル」、「参照発現レベル」、「対照レベル」および「対照」は本明細書では互換的に使用される。「対照レベル」は、同等の対照細胞、すなわち、一般には無病または無癌で測定される個別のベースラインレベルを意味する。前記対照細胞は、癌患者であっても、腫瘍の部位である組織はまだ非腫瘍性の健康な組織を含んでいるので、同じ個体に由来してもよい。前記対照細胞はまた、正常な別の個体に起源してもよく、または罹患または試験サンプルが得られたものと同じ疾患を呈しない。本発明の範囲内で、用語「参照レベル」は、癌細胞を含有する患者のサンプルにおいてＩＧＦ−１Ｒの発現の試験レベルを評価するために使用されるＩＧＦ−１Ｒの発現の「対照レベル」を意味する。例えば、患者の生体サンプルにおけるＩＧＦ−１ＲのレベルがＩＧＦ−１Ｒの参照レベルよりも高い場合、それらの細胞はＩＧＦ−１Ｒの高レベルの発現または過剰発現を有すると考えられる。参照レベルは、複数の方法により決定することができる。よって、発現レベルは、ＩＧＦ−１Ｒ保有細胞あるいはまたＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞の数に依存しないＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを定義し得る。従って、各患者の参照レベルはＩＧＦ−１Ｒの参照比により規定され得、参照比は本明細書に記載の参照レベルを決定するための方法のいずれかによって決定することができる。

例えば、対照は所定の値であってよく、それは様々な形態と採ることができる。対照は中央値または平均値などの単一のカットオフ値であり得る。「参照レベル」は、総ての患者に個々に等しく適用可能な単一の数であり得るか、または参照レベルは、患者の特定の部分集団によって異なり得る。よって、例えば、同じ癌に関して高齢者は若年者とは異なる参照レベルを持ち得、同じ癌に関して女性は男性とは異なる参照レベルを持ち得る。あるいは、「参照レベル」は、供試される新生細胞の組織と同じ組織に由来する非腫瘍形成性の癌細胞においてＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを測定することにより決定することもできる。同様に、「参照レベル」は、同じ患者内の非腫瘍細胞におけるＩＧＦ−１Ｒレベルに対する、患者の新生細胞のＩＧＦ−１Ｒの特定の比であってもよい。「参照レベル」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞のＩＧＦ−１Ｒのレベルであり得、培養細胞は腫瘍細胞を模倣するように操作してもよく、または参照レベルを正確に決定する発現レベルを得る他のいずれの様式で操作してもよい。他方、「参照レベル」は、ＩＧＦ−１Ｒレベルが上昇していない群およびＩＧＦ−１Ｒレベルが上昇している群などの比較群に基づいて確立することもできる。比較群の別の例は、特定の疾患、病態または症状を有する群および疾患を有さない群である。例えば、試験集団が低リスク群、中リスク群および高リスク群などの群に等分割（不等分割）されるような所定の値を構成することができる。

参照レベルはまた、同じ癌を有する患者の集団においてＩＧＦ−１Ｒのレベルを比較することにより決定することもできる。これは、例えばヒストグラム分析により達成することができ、この場合、患者の全コホートがグラフ表示され、第１軸はＩＧＦ−１Ｒのレベルを表し、第２軸は腫瘍細胞が所与のレベルでＩＧＦ−１Ｒを発現するコホート内の患者の数を表す。２以上の別個の患者群を、同じまたは類似のレベルのＩＧＦ−１Ｒを有するコホートの集団のサブセットの同定により決定することができる。次に、参照レベルの決定は、これらの別個の群を最も良く識別するレベルに基づいてなすことができる。参照レベルはまた、２以上のマーカー（そのうちの１つはＩＧＦ−１Ｒである）のレベルを表し得る。２以上のマーカーは、例えば、各マーカーのレベルの値の比により表すことができる。

同様に、外見的に健康な集団は、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する病態を有することが分かっている集団が有するものとは異なる「正常」範囲を有する。よって、選択された所定の値は、ある個体が入るカテゴリーを考慮したものであってよい。適当な範囲およびカテゴリーは、当業者により慣例の実験だけを用いて選択することができる。「上昇」「増大」とは、選択された対照に比べて高いことを意味する。一般に、対照は適当な年齢層における外見的に健康な正常個体に基づく。

また、本発明による対照は、所定の値に加え、その試験材料と並行して試験された材料のサンプルであってもよいということも理解されるであろう。例としては、同じ対照から同時に得られた組織または細胞、例えば、単一の生検の一部、または被験体由来の単細胞サンプルの一部が含まれる。

別の実施態様では、本発明は、標識された、上記の本発明によるＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント、またはその抗原結合そのフラグメントと薬学上許容可能な担体とを含んでなるＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する発癌性障害のｉｎ ｖｉｖｏイメージングのための医薬組成物に関する。

別の態様においてはまた、患者においてＩＧＦ−１Ｒ発現腫瘍細胞を検出するためのキットも記載され、前記キットは上記のようなＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント、好ましくは抗体８１６Ｃ１２を少なくとも含んでなることを特徴とする。

所定量の試薬の組合せを、診断アッセイを実施するための説明書とともに含んでなるパッケージングされた材料、例えばキットも本発明の範囲内にある。このキットはｉｎ ｖｉｔｒｏでの、例えば、ＥＬＩＳＡでのＩＧＦ−１Ｒの検出および定量のためのＩＧＦ−１Ｒ抗体を含有する。ＩＧＦ−１Ｒ抗体が酵素で標識される場合、このキットは前記酵素に必要とされる基質および補因子（例えば、検出可能な発色団または蛍光団をもたらす基質前駆体）を含む。加えて、安定剤、バッファー（例えば、ブロッキングバッファーまたは溶解バッファー）などの他の添加剤が含まれてもよい。このようなキットは、バイアルおよびチューブなどの１以上の容器を受容するための区画化された受器を含んでなってよく、このような容器は本発明の別個の要素を保持する。例えば、１つの容器は、不溶性または部分的可溶性の担体と結合した第１の抗体を含有し得る。第２の容器は、凍結乾燥形態または溶液として可溶性の検出可能に標識された第２の抗体を含有し得る。この受器はまた、検出可能に標識された第３の抗体を凍結乾燥形態または溶液として保持する第３の容器を含有する。この性質のキットは、本発明のサンドイッチアッセイで使用可能である。ラベルまたは添付文書は、組成物の説明ならびに意図されるｉｎ ｖｉｔｒｏまたは診断使用に関する説明書を提供し得る。

種々の試薬の相対的量は、アッセイの感受性を実質的に 最適化する試薬の溶液中の濃度をもたらすように広く変更可能である。特に、これらの試薬は、溶解時に適当な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含むドライパウダー、通常には凍結乾燥品として提供され得る。

なおさらなる態様では、検出可能な部分で標識された、本発明に従って本明細書に詳説されるＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、これにより、それらは上述の抗原を有する細胞を診断または同定するために、例えばキットとしてパッケージングされ使用され得る。このような標識の限定されない例としては、フルオレセインイソチオシアネートなどの蛍光団；発色団、放射性核種、ビオチンまたは酵素が挙げられる。このような標識ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、例えば、抗原の組織学的局在、ＥＬＩＳＡ、細胞選別、ならびにＩＧＦ−１Ｒおよびこの抗原を有する細胞検出または定量するための他の免疫学的技術に使用可能である。

本発明はまたキットを対象とし、前記キットは、本発明に従い、ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなることを特徴とする。

本発明はまたキットを対象とし、前記キットは、本発明に従い、ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの配列番号１〜６の配列の配列を有する６つのＣＤＲから得ることができる、キメラもしくはヒト化ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなることを特徴とする。

また、細胞からＩＧＦ−１Ｒを精製するまたは免疫沈降させるための陽性対照として有用なキットも提供される。ＩＧＦ−１Ｒの単離および精製のためには、キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）にカップリングした本発明に従って本明細書に詳説されるＩＧＦ−１Ｒ抗体または抗原結合フラグメントを含有し得る。例えば、ＥＬＩＳＡにおけるＩＧＦ−１Ｒの検出および定量化のための抗体を含有するキットが提供可能である。
キットは、容器と容器上のまたは容器に不随したラベルまたは添付文書を含んでなる。例えば、希釈剤およびバッファー、対照抗体を含有するさらなる容器が含まれてもよい。ラベルまたは添付文書は、組成物の説明ならびに意図されるｉｎ ｖｉｔｒｏまたは診断使用に関する説明書を提供し得る。

より詳しくは、本発明は、本明細書に記載の方法による被験体における腫瘍の腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒ状態のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ決定のためのキットに関する。好ましい実施態様では、例に記載されるように、本発明は、ＩＨＣおよび／またはＦＡＣＳ法により腫瘍または腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒ状態の決定のためのキットに関する。

特定の実施態様では、本発明は、上記のような本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを少なくとも含んでなるキットからなり、前記抗体が標識されている。

好ましい実施態様では、本発明によるキットは、前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体とＩＧＦ−１Ｒの間の結合の程度を検出するために有用な試薬をさらに含んでなる。

別の好ましい実施態様では、ＩＧＦ−１Ｒ発現腫瘍におけるＩＧＦ−１Ｒの発現レベルをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで決定するために有用な本発明のキットは、前記標識ＩＧＦ−１Ｒ抗体とＩＧＦ−１Ｒの間の結合レベルの定量に有用な試薬をさらに含んでなる。

さらに別の実施態様では、本発明によるキットは、ｉ）前記標識ＩＧＦ−１Ｒ抗体とＩＧＦ−１Ｒの間の結合の程度を検出するために有用な試薬；およびｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒ発現レベルのスコア化に有用な陽性および陰性対照サンプルをさらに含んでなる。

前記キットは、マウス抗体またはヒト／ヒト化抗体に特異的なポリクローナル抗体をさらに含んでなり得、好ましくは、前記マウス、ヒト化またはヒト抗体に特的なポリクローナル抗体は標識される。

本発明の特定の実施態様によれば、ＩＧＦ−ＩＲ経路を標的とする阻害剤の治療的投与から地益を受けるまたは受けないと予測される癌患者をｉｎ ｖｉｔｒｏで選択するためのキットは、ｉ）前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体とＩＧＦ−１Ｒの間の結合の程度を検出するために有用な試薬；ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤に対する感受性と相関が見出されている対照レベル、および／またはｉｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤に対する耐性と相関が見出されている対照レベルを含んでなり得る。

本発明はまた、発癌性障害を有する患者がＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬による処置から利益を受ける可能性があるかどうかを決定するキットに関し、前記キットは、上記のような本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを少なくとも含んでなることを特徴とする。

別の実施態様では、前記キットは、
ｉ）腫瘍細胞の表面での前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体とＩＧＦ−１Ｒの間の結合の程度を検出するための試薬；および／または
ｉｉ）腫瘍細胞の表面での前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体とＩＧＦ−１Ｒの間の結合の程度を定量するための試薬
をさらに含んでなることを特徴とする。

本発明の他の特徴および利点は、実施例および図面による説明の続きで明らかとなり、図面の凡例を以下に示す。

図１：ｒｈＩＧＦ１Ｒ ＥＬＩＳＡにおいて８１６Ｃ１２抗体で得られたＯＤ値のグラフ表示。データフィッティングおよびＥＣ_５０の決定はプリズムアプリケーションを用いて決定される。 図２Ａ〜２Ｃ：８１６Ｃ１２（図２Ａ）、Ｇ１１抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｖｅｎｔａｎａ）（図２Ｂ）またはＡＦ−３０５（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（図２Ｃ）を用いた、パラフィン包埋腫瘍ＭＣＦ−７の認識の免疫組織化学（ＩＨＣ）パターン。 図３：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおける抗ＩＧＦ−１Ｒ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ活性。 図４Ａ〜４Ｃ：８１６Ｃ１２、Ｇ１１抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｖｅｎｔａｎａ）（図４Ｂ）またはＡＦ−３０５（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（図４Ｃ）によるパラフィン包埋腫瘍ＳＢＣ−５の認識の免疫組織化学（ＩＨＣ）パターン。 図５：ＳＢＣ−５異種移植モデルにおける抗ＩＧＦ−１Ｒ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ活性。

実施例１：８１６Ｃ１２の作出および選択
ＩＧＦ−１Ｒに対して生成されるＭａｂを下記のように生産し、選択した。

雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、フロイントのアジュバントを伴う１０μｇの組換えヒトＩＧＦ−１Ｒタンパク質（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３９１−ＧＲ）の皮下注射により免疫誘導した。免疫誘導は２週間間隔で３回繰り返した。４回目の注射はアジュバントの存在下、腹腔内注射により行った。

３日後、脾細胞を、５０％ＰＥＧを用いてＳＰ２ＯＡｇ１４骨髄腫細胞と融合させた。
１４日のＨＡＴ代謝選択の後、ハイブリドーマ上清を、ヒトＭＣＦ７乳癌細胞を用いてＦＡＣＳにより試験した。ＭＣＦ７結合抗体のみを維持した。

次に、対象抗体を限界希釈によりクローニングした。クローニング８日後に、上清を、ＭＣＦ７細胞を用いるＦＡＣＳによりもう一度選択した。３つの陽性クローンを維持した。分泌される抗体のアイソタイプを、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＳＢＡクロノタイピングシステム−ＨＲＰキット（Ｃａｔ：５３００−０５）を用いて決定する。最後に、１つのクローンを拡大培養し、凍結させる。

次に、８１６Ｃ１２抗体のさらなる特性決定を、ｒｈＩＧＦ−１ＲまたはｒｍＩＧＦ−１ＲまたはｒｈＩＲ ＥＬＩＳＡなど、ハイブリドーマ上清を用いて行った。総ての直接ＥＬＩＳＡにおいて、対象タンパク質を各ウェルの底部に固定化した（１μｇ／ｍｌ）。
飽和後、ハイブリドーマ上清をウェルに加えた。１時間のインキュベーション期間と洗浄工程の後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ標識ポリクローナル抗体の溶液を検出に使用し、その後、ＴＭＢ基質を加えた。反応を１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４溶液で停止させた後、分光光度計にて４５０ｎｍの波長でＯＤを読み取った。データを表６に示す。

ｒｈＩＧＦ−１Ｒコーティングに対する８１６Ｃ１２抗体の用量応答極性を図１に示す。ＥＣ_５０値はプリズムアプリケーションを用いて決定する。

データは、８１６Ｃ１２抗体はＥＣ_５０ ０．４１ｎＭでｒｈ ＩＧＦ−１Ｒのみを認識すること示した。前記抗体はマウス型のＩＧＦ−１ＲにもヒトＩＲにも結合しない。

実施例２：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおける病期分類と本発明の抗体との相関およびＩＧＦ−１Ｒを標的とするＡＤＣの活性の評価
腫瘍グレードと薬理学とを相関させるために、腫瘍グレードを決定し（第２．１節）、その後、ＭＣＦ−７異種移植モデルにて、内部移行されることが知られているＩＧＦ−１Ｒを標的とする抗体部分と、アウリスタチンからなる薬物成分とを含んでなるＡＤＣを用いてｉｎ ｖｉｖｏ試験を行った（第２．２節）。

２．１：ＭＣＦ−７異種移植モデルでのＩＧＦ−１Ｒ発現の免疫組織化学的検出
ＭＣＦ−７異種移植片由来組織の切片を脱パラフィンし、再水和させ、熱誘導エピトープ賦活化のため、９８℃に予温した沸騰浴中のＴａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌバッファー１×（Ｄａｋｏ Ｓ１６９９）中に９８℃で４０分間、次いで、Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌバッファー中にさらに２０分間置いた。トリス緩衝生理食塩水−０．０５％ツィーン２０（ＴＢＳ−Ｔ）（Ｄａｋｏ Ｓ３００６）中で３回洗浄した後、内因性のペルオキシダーゼ活性を、ペルオキシダーゼブロッキング試薬（Ｄａｋｏ Ｋ４００７）を用いて５分間遮断した。切片をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、ブロッキング試薬（ＵｌｔｒａＶ
ｂｌｏｃｋ−ＴＡ−１２５ＵＢ−ＬａｂＶｉｓｉｏｎ）とともに５分間インキュベートした後、８１６Ｃ１２モノクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）または陰性対照としてのマウスＩｇＧ１／κ（５μｇ／ｍｌ、Ｘ０９３１、Ｄａｋｏ）のいずれかとともに室温で１時間インキュベートした。切片をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｄａｋｏ）とともに３０分間インキュベートした。褐色の反応生成物の現像のためにジアミノベンジジンを使用した（Ｄａｋｏ Ｋ３４６８）。これらのスライドを対比染色のためヘマトキシリン中に２分間浸漬した（Ｄａｋｏ Ｓ３３０９）。

本発明の抗ＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体８１６Ｃ１２は、ＭＣＦ−７の細胞膜を差次的に染色する。このＩＨＣ手順では、褐色の反応生成物は細胞膜の陽性染色に相関し、褐色の反応生成物の欠如は、細胞膜の陰性染色および可視化されないことに関連する。膜アルゴリズムを用い、ＭＣＦ−７腫瘍細胞の染色に関するスコアは３＋であった（図２Ａ）。Ｇ１１抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｖｅｎｔａｎａ）またはＡＦ−３０５（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いたところ、同じ腫瘍の切片はスコア２＋であった（それぞれ図２Ｂおよび２Ｃ）。

２．２：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおける抗ＩＧＦ−１Ｒ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ活性
抗ＩＧＦ−１Ｒ ＡＤＣを、ＭＣＦ−７異種移植モデルにてｉｎ ｖｉｖｏで評価した。

全動物手順は、科学目的で使用される動物の保護に関する２０１０／６３／ＵＥ指令の指針に従って実施した。プロトコールは、ピエール・ファーブル・インスティテュートの動物倫理委員会により承認された。５００万個のＭＣＦ−７細胞を７週齢のスイス／ヌードマウスに皮下注射した。細胞の注射前に、ＭＣＦ−７腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ増殖に必要なエストロゲンを放出するために、マウスの左側腹部にエストロゲンペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を移植した。

ＭＣＦ−７細胞移植７日後、腫瘍が１２０〜１５０ｍｍ^３の平均サイズに達したところで、動物を腫瘍サイズと外観に従って６個体のマウス群に分けた。抗ＩＧＦ−１Ｒ ＡＤＣを、４日ごとに６回の注射（Ｑ４ｄ４）の腹腔内注射により接種した。動物の健康状態を毎日監視した。腫瘍体積を試験の終了まで週に２回、電子カリパスで測定した。腫瘍体積は、下式：π／６×長さ×幅×高さに従って計算する。毒性は、週に３回、動物の体重を追跡して評価した。統計分析は各測定でマン・ホイットニー検定を用いて行った。

抗ＩＧＦ−１Ｒ ＡＤＣの注射は有意に阻害し、さらには予想されたように、腫瘍グレード３＋については腫瘍増殖の完全な退縮を誘導したが（図３）、腫瘍グレード２＋についてはそうではなかった。

実施例３：ＳＢＣ−５異種移植モデルにおける病期分類と本発明の抗体との相関およびＩＧＦ−１Ｒを標的とするＡＤＣの活性の評価
腫瘍グレードと薬理学とを相関させるために、腫瘍グレードを決定し（第３．１節）、その後、ＳＢＣ−５異種移植モデルにて、内部移行されることが知られているＩＧＦ−１Ｒを標的とする抗体部分と、アウリスタチンからなる薬物成分とを含んでなるＡＤＣを用いてｉｎ ｖｉｖｏ試験を行った（第３．２節）。

３．１ ＳＢＣ−５異種移植モデルに対するＩＧＦ−１Ｒ発現の免疫組織化学的検出
ＩＧＦ−１Ｒのレベルは、以上の実施例２の第２．１節に記載されているものと同じプロトコールを用いて分析した。

ＩＧＦ−１Ｒを８１６Ｃ１２で検出した場合、低レベルが検出された（１＋）（図４Ａ）。ＩＧＦ−１ＲをＧ１１抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｖｅｎｔａｎａ）またはＡＦ−３０５（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体で検出した場合、同じ腫瘍からの切片がスコア３＋とされた（それぞれ図４Ｂおよび４Ｃ）。

３．２：ＳＢＣ−５異種移植モデルにおける抗ＩＧＦ−１Ｒ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ活性
抗ＩＧＦ−１Ｒ ＡＤＣを、ＳＢＣ−５異種移植モデルにてｉｎ ｖｉｖｏで評価した。

全動物手順は、科学目的で使用される動物の保護に関する２０１０／６３／ＵＥ指令の指針に従って実施した。プロトコールは、ピエール・ファーブル・インスティテュートの動物倫理委員会により承認された。５００万個のＳＢＣ−５細胞を７週齢の無胸腺マウスに皮下注射した。細胞移植１２日後、腫瘍が１５０ｍｍ^３の平均サイズに達したところで、動物を腫瘍サイズと外観に従って６個体のマウス群に分けた。抗ＩＧＦ−１Ｒ ＡＤＣを、４日ごとに６回の注射（Ｑ４ｄ４）の腹腔内注射により接種した。動物の健康状態を毎日監視した。腫瘍体積を試験の終了まで週に２回、電子カリパスで測定した。腫瘍体積は、下式：π／６×長さ×幅×高さに従って計算する。毒性は、週に３回、動物の体重を追跡して評価した。統計分析は各測定でマン・ホイットニー検定を用いて行った。

予想されたように、腫瘍グレード１＋については、ＳＢＣ−５腫瘍細胞の腫瘍進行は抗ＩＧＦ−１Ｒ ＡＤＣの注射により影響を受けなかったが（図５）、腫瘍グレード３＋についてはそうではなかった。

Claims (16)

1. ｉ）配列番号１の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３の配列のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；
   ｉｉ）配列番号４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号６の配列のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖と
   を含んでなる、ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
2. 配列番号７の配列の重鎖可変ドメイン；および／または配列番号８の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項１に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体。
3. Ｉ−４８９４の番号で２０１４年９月１７日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリに寄託されたハイブリドーマにより分泌される、ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
4. ＩＧＦ−１Ｒ発現腫瘍細胞の検出のため、またはＩＧＦ−１Ｒ発現腫瘍細胞の発現レベルを決定するための薬剤として使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
5. ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する発癌性障害のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断または予後予測において使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
6. 発癌性障害を有する患者がＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする阻害剤による処置から利益を受け得るかどうかの決定において使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
7. 前記処置が、ＩＧＦ−１Ｒ抗体単独、組合せまたはコンジュゲートによるものである、請求項６に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
8. 被験体においてＩＧＦ−１Ｒ発現腫瘍細胞の存在および／または位置をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで検出するための方法であって、
   （ａ）前記被験体由来の生体サンプルを請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；および
   （ｂ）前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの、前記生体サンプルとの結合を検出する工程
   を含んでなる、方法。
9. 被験体においてＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞のパーセンテージをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで検出するための方法であって、
   （ａ）前記被験体由来の生体サンプルを請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；および
   （ｂ）前記生体サンプルにおいてＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞のパーセンテージを定量する工程
   を含んでなる、方法。
10. 被験体において腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒの発現レベルをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで決定するための方法であって、
    （ａ）前記被験体由来の生体サンプルを請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；および
    （ｂ）前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの、前記生体サンプル中のＩＧＦ−１Ｒとの結合のレベルを定量する工程
    を含んでなる、方法。
11. 被験体において腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒスコアをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで決定するための方法であって、
    （ａ）前記被験体由来の生体サンプルを請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；
    （ｂ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）により、前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの、前記生体サンプル中のＩＧＦ−１Ｒとの結合のレベルを定量する工程；および
    （ｃ）工程（ｂ）で得られた定量レベルを、染色強度および陽性細胞のパーセンテージという２つのパラメーターに基づく適当な尺度と比較することにより、腫瘍細胞または腫瘍をスコア化する工程
    を含んでなる、方法。
12. 発癌性障害が、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬による処置に感受性があるかどうかを決定するための方法であって、
    （ａ）請求項１１に記載の方法に従い、被験体の腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ状態をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで決定する工程、および
    （ｂ）腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ状態がＩＧＦ−１Ｒ（＋）である場合に、前記発癌性障害が、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬による処置に感受性があると決定する工程
    を含んでなる、方法。
13. 発癌性障害に罹患している被験体において、ＩＧＦ−１Ｒに関連する前記障害を緩和するように計画された治療計画の有効性をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで決定するための方法であって、
    （ａ）発癌性障害に罹患している被験体において、ＩＧＦ−１Ｒに関連する前記障害を緩和するための処置の第１の時点に相当する第１の生体サンプルにおいて、請求項１０に従い、ＩＧＦ−１Ｒの第１の発現レベルを決定する工程；
    （ｂ）前記処置のその後の第２の時点に相当する第２の生体サンプルにおいて、請求項１０に従い、ＩＧＦ−１Ｒの第２の発現レベルを決定する工程；
    （ｃ）工程（ｂ）で得られた前記第２の発現レベルに対する工程（ａ）で得られた前記第１の発現レベルの比を計算する工程；および
    （ｄ）工程（ｃ）の比が１より大きい場合に前記治療計画の有効性が高いと決定する；または工程（ｃ）の比が１以下である場合に前記治療計画の有効性が低いと決定する工程
    を含んでなる、方法。
14. 治療量のＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬の投与から利益を受けるまたは受けないと予測される癌患者を選択するための方法であって、
    （ａ）請求項１０に記載の方法に従い、ＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを決定する工程；（ｂ）前工程（ａ）の発現レベルを参照発現レベルと比較する工程；および
    （ｃ）参照発現レベルに対する（ａ）で得られた発現レベルの比が１より大きい場合に、前記患者をＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬による処置から利益を受けると予測されるとして選択する工程；または
    （ｄ）参照発現レベルに対する（ａ）で得られた発現レベルの比が１以下である場合に、前記患者をＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬による処置から利益を受けると予測されないとして選択する工程
    を含んでなる、方法。
15. 患者におけるＩＧＦ−１Ｒ発現腫瘍細胞の検出のためのキットであって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを少なくとも含んでなる、キット。
16. 発癌性障害を有する患者がＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬による処置から利益を受け得るかどうかを決定するためのキットであって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを少なくとも含んでなる、キット。

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