RS62024B1 - Antitelo na igf-1r i njegova upotreba u dijagnozi kancera - Google Patents

Antitelo na igf-1r i njegova upotreba u dijagnozi kancera

Info

Publication number
RS62024B1
RS62024B1 RS20210687A RSP20210687A RS62024B1 RS 62024 B1 RS62024 B1 RS 62024B1 RS 20210687 A RS20210687 A RS 20210687A RS P20210687 A RSP20210687 A RS P20210687A RS 62024 B1 RS62024 B1 RS 62024B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
igf
antibody
antigen
determining
subject
Prior art date
Application number
RS20210687A
Other languages
English (en)
Inventor
Alexandra Jouhanneaud
Original Assignee
Pf Medicament
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pf Medicament filed Critical Pf Medicament
Publication of RS62024B1 publication Critical patent/RS62024B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4745—Insulin-like growth factor binding protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na novo antitelo, konkretno monoklonsko antitelo, sposobno da se veže za IGF-1R, kao i na sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina koje kodiraju navedeno antitelo.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Receptor faktora rasta 1 sličan insulinu pod nazivom IGF-1R (ili ponekad IGF1R) je receptor sa aktivnošću tirozin kinaze koji ima 70% homologije sa insulinskim receptorom IR. IGF-1R je glikoprotein molekulske težine približno 350.000. To je hetero-tetramerni receptor čija je svaka polovina - vezana disulfidnim mostovima - sastavljena od vanćelijske αpodjedinice i transmembranske β-podjedinice. IGF-1R vezuje IGF1 i IGF2 vrlo visokim afinitetom (Kd #1 nM), ali je jednako sposoban da veže insulin sa afinitetom 100 do 1000 puta manjim. Domeni tirozin kinaze IGF-1R i IR imaju vrlo visoku sekvencnu homologiju, mada se zone slabije homologije respektivno odnose na region bogat cisteinom, situiran na αpodjedinici i C-terminalnom delu β-podjedinice. Razlike sekvenci koje se vide u αpodjedinici su smeštene u zoni vezivanja liganada i time su u korenu relativnih afiniteta IGF-1R i IR za IGF-ove i insulin, respektivno. Razlike u C-terminalnom delu β-podjedinice dovode do divergencije signalnih puteva dva receptora; IGF-1R posreduje u efektima mitogeneze, diferencijacije i antiapoptoze, dok aktivacija IR u principu uključuje efekte na nivou metaboličkih puteva.
[0003] Uloga sistema IGF u karcinogenezi je postala predmet intenzivnog istraživanja u poslednjih 20 godina. Ovaj interes je sledio otkriće činjenice da je, pored svojih mitogenih i antiapoptoznih osobina, IGF-1R, izgleda, potreban za ustanovljavanje i održavanje transformisanog fenotipa. U stvari, već je dobro poznato da preterana ekspresija ili konstitutivna aktivacija IGF-1R, u širokom spektru ćelija, dovodi do rasta ćelija nezavisno od podloge u medijumima bez fetalnog telećeg seruma i do formiranja tumora u golim miševima. Ovo samo po sebi nije jedinstvena osobina, jer široki spektar proizvoda preterano eksprimiranih gena može da transformiše ćelije, uključujući dobar broj receptora faktora rasta. Ovo samo po sebi nije jedinstvena osobina, jer široki spektar proizvoda preterano eksprimiranih gena može da transformiše ćelije, uključujući dobar broj receptora faktora rasta. Međutim, glavno otkriće koje je jasno pokazalo da glavnu ulogu u transformaciji igra IGF-1R je demonstracija da su IGR-1R<->ćelije, u kojima je inaktiviran gen koji kodira IGF-1R, potpuno refraktorne na transformaciju različitim agensima koji su obično u stanju da transformišu ćelije, kao što je E5 protein goveđeg papiloma virusa, preterana ekspresija EGFR ili PDGFR, T antigen SV40, aktiviran Ras ili kombinacija ova dva poslednja faktora.
[0004] U tom kontekstu, već duže vreme se IGF-1R smatra interesantnom metom u onkologiji. Započet je veliki broj projekata koji ciljaju IGF-1R (humanizovana ili humana antitela ili mali molekuli) da bi se razvili antagonisti IGF-1R za tretman kancera i izvedeno je više od 70 kliničkih ispitivanja u različitim indikacijama. Međutim, do danas, nijedan od ovih projekata nije bio uspešan i na tržištu nema antitela na IGF-1R. Na primer, WO 2007/126876 opisuje antitela koja vezuju IGF-1R i njihove upotrebe, naročito u dijagnzi i tretmanu kancera. US 2013/084243 opisuje sisarsko antitelo, označeno sa 12B1 i njegove fragmente koji vezuju antigen, koji se specifično vezuju za IGF-1R i mogu da se koriste i za dijagnostikovanje i za tretiranje kancera zavisnih od IGF-1R.
OPIS
[0005] Pronalazak je definisan pridruženim zahtevima i svi drugi aspekti ili rešenja data ovde su samo kao informacija.
[0006] Ovde je obnezbeđen bar jedan reagens koji se može koristiti kao dijagnostički ili prognostički biomarker za detektovanje i/ili praćenje onkogenih poremećaja, naročito onih koje odlikuje ekspresija IGF-1R ili onih u kojima posreduje aberantna ekspresija IGF-1 R.
[0007] Objavljeni su prethodni pokušaji da se razvije vredno antitelo koje se može koristiti kao relevantna dijagnostička ili prognostička alatka, ali nijedan od njih nije zadovoljavajući.
[0008] Kao što će biti jasno iz primera koji slede, pronalazači su se iznenadili kad su pokazali da komercijalna antitela koja se danas obično koriste za procenjivanje tumora koji eksprimiraju IGF-1R izgleda nisu relevantna, jer daju lažno pozitivne i/ili lažno negativne rezultate. Ovo pitanje je delimično dovelo do neuspeha kliničkih ispitivanja sa antitelima na IGF-1R zbog selekcije pacijenata pre nego prave aktivnosti antitela na IGF-1R.
[0009] Štaviše, prve studije koje su izvedene uz upotrebu komercijalnih antitela su pokazale raskorak između ocene IGF-1R i anti-tumorske aktivnosti ciljne terapije ADC-ovima.
[0010] Taj problem je ovde ispravljen obezbeđivanjem novog antitela koje je, za razliku od postojećih, sposobno za bojenje koje koreliše sa farmakologijom terapije usmerene na IGF-1R.
[0011] Prvi aspekt se odnosi na izolovano antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje se vezuje za IGF-1R, poželjno humani IGF-1R, sa visokim afinitetom i koje stoga može biti korisno u metodima za dijagnostikovanje patoloških hiperproliferativnih onkogenih poremećaja u kojima posreduje ekspresija IGF-1R.
[0012] Specifično, ovde je obezbeđeno antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži šest CDR sekvenci SEQ ID Nos.1, 2, 3.4, 5 i 6.
[0013] U jednom posebnom aspektu, pronalazak se odnosi na antitelo na IGF-1R, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje se odlikuje time što obuhvata:
i) težak lanac sa CDR-H1 sekvence SEQ ID No. 1, CDR-H2 sekvence SEQ ID No. 2 i CDR-H3 sekvence SEQ ID No.3; i
ii) lak lanac sa CDR-L1 sekvence SEQ ID No. 4, CDR-L2 sekvence SEQ ID No. 5 i CDR-L3 sekvence SEQ ID No.6.
[0014] Termini "antitelo", "antitela" "ab" ili "imunoglobulin" se koriste u istom značenju u najširem smislu i uključuju monoklonska antitela, izolovana, inženjerisana, hemijski sintetisana ili rekombinantna antitela (npr., cela ili intaktna monoklonska antitela), poliklonska antitela, multivalentna antitela ili multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), a i fragment antitela, dok god ona ispoljavaju željenu biološku aktivnost. U jednom daljem aspektu, pronalazak se odnosi na rekombinantno antitelo.
[0015] Kao što se koristi u predmetnoj prijavi, izraz "antitelo na IGF-1R" treba interpretirati slično kao "anti-IGF-1R antitelo" i označava antitelo koje je sposobno da se veže za IGF-1R.
[0016] Pod "fragment koji vezuje IGF-1R" ili "fragment koji vezuje antigen" antitela, podrazumeva se svaki peptid, polipeptid ili protein koji zadržava sposobnost da se veže za IGF-1R metu (o kojoj se ovde uopšteno govori kao o antigenu) antitela. U jednom aspektu, takvi "fragmenti koji vezuju antigen" su izabrani iz grupe koja se sastoji od Fv, scFv (sc za jedan lanac), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc fragmenata ili dijatela, ili bilo kog fragmenta čije bi poluvreme života bilo povećano hemijskom modifikacijom, kao što je dodavanje poli(alkilen) glikola, kakav je poli(etilen) glikol ("PEGilacija") (pegilovani fragmenti, koji se zovu Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG ili Fab'-PEG) ("PEG" za Poli(Etilen) Glikol), ili ugrađivanjem u lipozom, gde navedeni fragmenti imaju bar jednu od osobina CDR-ova predmetnog antitela. Poželjno, navedeni "fragmenti koji vezuju antigene" će biti konstituisani ili će sadržati delimičnu sekvencu teškog ili lakog varijabilnog lanca antitela iz kog su izvedeni, gde je navedena parcijalna sekvenca dovoljna da zadrži istu specifičnost vezivanja kao antitelo iz kog su potekli i dovoljan afinitet, poželjno bar jednak 1/100, na poželjniji način, do bar 1/10 afiniteta antitela iz kog su potekli, u odnosu na metu.
[0017] Poželjno je da navedeni "fragment koji vezuje IGF-1R" ili "fragment koji vezuje antigen" sadrži bar:
i) CDR-H1 sekvence SEQ ID No. 1, CDR-H2 sekvence SEQ ID No. 2 i CDR-H3 sekvence SEQ ID No.3; i
ii) CDR-L1 sekvence SEQ ID No. 4, CDR-L2 sekvence SEQ ID No. 5 i CDR-L3 sekvence SEQ ID No.6.
[0018] Pod "vezivanje", "vezuje" ili slično, podrazumeva se da antitelo, ili bilo koji njegov fragment koji vezuje antigen, formira kompleks sa antigenom koji je relativno stabilan u fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje se može okarakterisati ravnotežnom konstantom disocijacije od bar oko 1x10<-6>M ili manjom. Metodi za određivanje da li se dva molekula vezuju su dobro poznati u struci i uključuju, na primer, ravnotežnu dijalizu, površinsku plazmonsku rezonancu i slično. Da bi se izbegla sumnja, to ne znači da navedeno antitelo ne bi moglo da se veže ili da interferira, na niskom nivou, sa nekim drugim antigenom. Ipak, kao rešenje, navedeno antitelo se vezuje samo za navedeni antigen.
[0019] Pod CDR regionima ili CDR(-ovima), podrazumevaju se hipervarijabilni regioni teških i lakih lanaca imunoglobulina, kao što su definisani u IMGT.
[0020] Jedinstvena numeracija IMGT je definisana za poređenje varijabilnih domena na kom god antigenskom receptoru, tipu lanca, ili vrsti [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudićelijai, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. U jedinstvenoj numeraciji IMGT, konzervisane aminokiseline uvek imaju istu poziciju, na primer, cistein 23 (1. -CYS), triptofan 41 (CONSERVED-TRP), hidrofobna aminokiselina 89, cistein 104 (2.-CYS), fenilalanin ili triptofan 118 (J-PHE ili J-TRP). Jedinstvena numeracija IMGT obezbeđuje standardizovano razgraničenje okvirnih regiona (FR1-IMGT: pozicije 1 do 26, FR2-IMGT: 39 do 55, FR3-IMGT: 66 do 104 i FR4-IMGT: 118 do 128) i regiona koji određuju komplementarnost: CDR1-IMGT: 27 do 38, CDR2-IMGT: 56 do 65 i CDR3-IMGT: 105 do 117. Pošto jazovi (gaps) predstavljaju pozicije koje nisu zauzete, dužine CDR-IMGT (prikazane u zagradama i razdvojene tačkama, npr. [8.8.13]) postaju krucijalna informacija. Jedinstvena numeracija IMGT se koristi u 2D grafičkim prezentacijama, označenim kao IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] i u 3D strukturama u IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T ćelija receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].
[0021] Mora se razumeti da, bez kontradiktorne specifikacije u predmetnoj prijavi, regioni koji određuju komplementarnost ili CDR-ovi, označavaju hipervarijabilne regione teških i lakih lanaca imunoglobulina, kao što je definisano prema sistemu numeracije IMGT.
[0022] Ipak, CDR se mogu definisati i prema Kabatovom sistemu numeracije (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, i kasnija izdanja). Postoje tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca. Ovde, termini "CDR" i "CDR-ovi" se koriste da označe, u zavisnosti od slučaja, jedan ili više, ili čak sve, regione koji sadrže većinu aminokiselinskih ostataka odgovornih za afinitet vezivanja antitela za antigen ili epitop koji ono prepoznaje. Da bi se uprostilo čitanje predmetne prijave, CDR-ovi prema Kabatu nisu definisani. Ipak, za stručnjaka bi bilo očigledno, primenom definicije CDR prema IMGT, da definiše CDR prema Kabatu.
[0023] U jednom posebnom rešenju, predmetno antitelo na IGF-1R se odlikuje time što sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID No. 7 ili bilo koju sekvencu sa bar 90% homologije sa sekvencom SEQ ID No.7.
[0024] U jednom posebnom rešenju, predmetno antitelo na IGF-1R se odlikuje time što sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID No. 8, ili bilo koju sekvencu sa bar 90% homologije sa sekvencom SEQ ID No.8.
[0025] A prema još jednom rešenju, antitelo označeno sa 816C12, se odlikuje time što sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 7 ili sekvencu sa bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% homologije posle optimalnog poravnavanja sa sekvencom SEQ ID No.7 i/ili time što sadrži sekvencu varijabilnog domena lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 8 ili sekvencu sa bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% and 98% i 98% homologije posle optimalnog poravnavanja sa sekvencom SEQ ID No.8.
[0026] Kao što se ovde koristi, "procenat homologije" dve sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina znači procenat identičnih nukleotida ili aminokiselinskih ostataka u dve sekvence koje se porede, dobijen posle optimalnog poravnavanja, gde je ovaj procenat čisto statistički i razlike između dve sekvence su nasumično distribuirane duž njihovih dužina. Poređenje dve sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina se tradicionalno vrši poređenjem sekvenci pošto su one optimalno poravnate, gde navedeno poređenje može da se vrši po segmentima ili korišćenjem "prozora poravnavanja". Optimalno poravnavanje sekvenci za poređenje se može vršiti, pored poređenja rukom, putem algoritma lokalne homologije Smith-a i Waterman-a (1981) [Ad. App. Math. 2:482], putem algoritma lokalne homologije Neddleman-a i Wunsch-a (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], metodom traženja sličnosti Pearson-a i Lipman-a (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] ili pomoću kompjuterskog softvera koji koristi ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Grupa, 575 Science Dr., Madison, WI, ili pomoću softvera za poređenje BLAST NR ili BLAST P). Za aminokiselinsku sekvencu koja ispoljava bar 80%, poželjno bar 85%, 90%, 95% i 98% homologije sa referennom aminokiselinskom sekvencom, poželjni primeri uključuju one koji sadrže referentnu sekvencu, određene modifikacije, naročito deleciju, adiciju ili supstituciju bar jedne aminokiseline, odsecanje ili produžavanje. U slučaju supstitucije jedne ili više uzastopnih ili neuzastopnih aminokiselina, poželjne su supstitucije u kojima su supstituisane aminokiseline zamenjene "ekvivalentnim" aminokiselinama. Ovde je izraz "ekvivalentne aminokiseline" namenjen da označava bilo koje aminokiseline koje će verovatno biti supstituisane jednom od strukturnih aminokiselina, ali ne modifikujući biološke aktivnosti odgovarajućih antitela i onih iz specifičnih primera definisanih niže.
[0027] Ekvivalentne aminokiseline se mogu odrediti bilo po njihovoj strukturnoj homologiji sa aminokiselinama kojima su supstituisane, bilo na osnovu rezultata komparativnih testova biološke aktivnosti različitih proteina koji vezuju antigen, koji će verovatno biti generisani.
[0028] Kao neograničavajući primer, u tabeli 1 koja sledi su sumirane moguće supstitucije koje će se verovatno izvršiti, a da ne dovedu do značajnih modifikacija biološke aktivnosti odgovarajućeg modifikovanog proteina koji vezuje antigen; inverzne supstitucije su prirodno moguće u istim uslovima.
Tabela 1
[0029] Poseban aspekt pronalaska je da se antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, ne vezuje za insulinski receptor (IR).
[0030] U jednom drugom aspektu, predmetno antitelo je monoklonsko antitelo.
[0031] Termin "monoklonsko antitelo" ili "Mab", kao što se ovde koristi, se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela u populaciji su identična osim za moguće prirodne mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična i usmerena na jedan jedini epitop. Takvo monoklonsko antitelo može da bude proizvedeno iz jednog klona B ćelija ili hibridoma. Monoklonska antitela mogu biti i rekombinantna, tj. proizvedena proteinskim inženjeringom. Monoklonska antitela se mogu i izolovati iz fagnih biblioteka antitela. Pored toga, za razliku od dobijanja poliklonskih antitela koja tipično uključuju različita antitela usmerena na različite determinante, ili epitope, svako monoklonsko antitelo je usmereno na jedan jedini epitop antigena. Antitelo je izolovano ili dobijeno prečišćavanjem iz prirodnih izvora ili dobijeno genetičkom rekombinacijom ili hemijskom sintezom.
[0032] U jednom drugom aspektu, predmetno antitelo je rekombinantno antitelo. Termin "rekombinantno antitelo" se odnosi na antitelo koje je rezultat ekspresije rekombinantne DNK unutar živih ćelija. Rekombinantno antitelo se dobija korišćenjem laboratorijskih metoda genetičke rekombinacije, dobro poznatih stručnjaku, kreiranjem sekvenci DNK koje se ne bi našle u biološkim organizmima.
[0033] U jednom drugom aspektu, predmetno antitelo je hemijski sintetisano antitelo.
[0034] "Antitelo na IGF-1R" uključuje (bez suprotne specifikacije) mišje, ali i himerne i humanizovane forme navedenog antitela na IGF-1R.
[0035] Da bi bilo jasnije, sledeća tabela 2 ilustruje sekvence antitela 816C12, definisane prema IMGT.
Tabela 2
[0036] U jednom aspektu, monoklonska antitelo ovde uključuje mišje, himerno i humanizovano antitelo. Antitelo može biti izvedeno iz hibridoma mišjeg porekla zavedenog u okviru francuske kolekcije kultura mikroorganizama (CNCM, Pasteur Institute, Paris, Francuska), gde je navedeni hibridom dobijen fuzijom splenocita/limfocita Balb/C imunizovanih miševa i ćelija mijeloma Sp 2/O-Ag 14 ćelijske linije.
[0037] Prema jednom drugom aspektu, pronalazak se odnosi na mišji hibridom sposoban da sekretuje monoklonsko antitelo kao što je opisano gore, naročito hibridom mišjeg porekla deponovan u CNCM, Institut Pasteur, Paris, Francuska, 17. septembra 2014, pod brojem I-4894.
[0038] Monoklonsko antitelo, ovde označeno sa 816C12, ili bilo koji njegov fragment koji vezuje antigen, sekretovan od strane navedenog hibridoma I-4894, očigledno formira deo predmetnog pronalaska.
[0039] Pronalazak se odnosi na antitelo na IGF-1R, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji se odlikuje time što ga sekretuje hibridom zaveden u CNCM, Institut Pasteur, Paris, 17. septembra 2014, pod brojem I-4894.
[0040] Pronalazak opisuje i mišji hibridom zaveden u CNCM, Institut Pasteur, Paris, 17. septembra 2014, pod brojem I-4894.
[0041] Nov aspekt se odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu, koja se odlikuje time što je odabrana od sledećih nukleinskih kiselina:
a) nukleinska kiselina koja kodira antitelo kao što je opisano gore;
b) nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu odabranu od sekvenci SEQ ID No.9 ili 10, ili sekvence sa bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% homologije posle optimalnog poravnavanja sa sekvencama SEQ ID No.9 ili 10; i
c) nukleinska kiselina koja je komplementarna nukleinskim kiselinama definisanim u a) ili b).
[0042] Tabela 3 ispod sumira različite nukleotidne sekvence vezane za antitelo 816C12.
Tabela 3
[0043] Termini "nukleinska kiselina", "nukleinska sekvenca", "sekvenca nukleinske kiseline", "polinukleotid", "oligonukleotid", "polinukleotidna sekvenca" i "nukleotidna sekvenca", koji se u predmetnom opisu ravnopravno koriste, označavaju preciznu sekvencu nukleotida, modifikovanu ili ne, koja definiše fragment ili region nukleinske kiseline, koji sadrži ili ne sadrži neprirodne nukleotide i koja je ili dvolančana DNK, jednolančana DNK ili je proizvod transkripcije navedenih DNK.
[0044] Ovde bi trebalo uključiti i da se predmetno otkriće ne odnosi na nukleotidne sekvence u njihovom prirodnom hromozomskom okruženju, tj., u prirodnom stanju. predmetne sekvence su izolovane i/ili prečišćene, tj., one su uzorkovane direktno ili indirektno, na primer, kopiranjem, gde je njihovo okruženje bar delimično modifikovano. Treba pomenuti i izolovane nukleinske kiseline dobijene rekombinantnom genetikom, putem, na primer, ćelija domaćina, ili dobijene hemijskom sintezom.
[0045] Pronalazak se odnosi i na vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu kao što je opisano gore.
[0046] Posebno su obezbeđeni vektori za kloniranje i/ili ekspresiju koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu.
[0047] Predmetni vektori poželjno sadrže elemente koji dozvoljavaju ekspresiju i/ili sekreciju nukleotidnih sekvenci u datoj ćeliji domaćinu. Prema tome, vektor mora da sadrži promoter, signale za početak i kraj translacije, kao i pogodne regione za regulaciju transkripcije. On mora da bude u stanju da se održi na stabilan način u ćeliji domaćinu i može opciono da ima specifične signale koji specifikuju sekreciju transliranog proteina. Ovi različiti elementi su izabrani i optimizovani od strane stručnjaka u skladu sa ćelijom domaćinom koja se upotrebljava. U ovu svrhu, nukleotidne sekvence se mogu insertovati u samoreplicirajuće vektore unutar izabranog domaćina ili mogu da budu integrativni vektori izabranog domaćina.
[0048] Takvi vektori se dobijaju metodima koje stručnjak tipično koristi i dobijeni klonovi mogu da se uvedu u pogodnog domaćina standardnim metodima kao što je lipofekcija, elektroporacija, toplotni šok ili hemijski metodi.
[0049] Vektori su, na primer, vektori plazmidnog ili virusnog porekla. Koriste se za transformaciju ćelija domaćina da bi se klonirale ili eksprimirale nukleotidne sekvence opisane ovde.
[0050] Pronalazak sadrži i ćelije domaćine transformisane pomoću ili koje sadrže vektor kakav je opisan ovde.
[0051] Ćelija domaćin se može izabrati među prokariotskim ili eukariotskim sistemima, kao što su, na primer, bakterijske ćelije, ali i ćelije kvasca ili životinjske ćelije, naročito sisarske ćelije. Ćelije insekta ili biljke se takođe mogu koristiti.
[0052] Otkriće se odnosi i na životinje koje nisu čovek, koje imaju transformisanu ćeliju opisanu ovde.
[0053] Jedan drugi aspekt se odnosi na metod za proizvodnju antitela opisanih ovde, ili jednog od njegovih funkcionalnih fragmenata, koji se odlikuje time što naveden metod obuhvata sledeće korake:
a) kultura u medijumu sa pogodnim uslovima za kulturu za ćeliju domaćina kao što je opisano ovde; i
b) sakupljanje navedenih antitela, ili jednog od njegovih funkcionalnih fragmenata, ovako proizvedenih, iz medijuma za kulturu ili iz navedenih gajenih ćelija.
[0054] Navedene transformisane ćelije se koriste u metodima za dobijanje rekombinantnih polipeptida opisanih ovde. Metodi za dobijanje ovih polipeptida u rekombinantnoj formi, koji se odlikuju time što navedeni metodi koriste vektor i/ili ćeliju transformisanu vektorom opisanim ovde, su takođe sadržani u predmetnom pronalasku. Poželjno je da se ćelija transformisana navedenim vektorom gaji u uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju gorenavedenog polipeptida i sakupljanje navedenog rekombinantnog peptida.
[0055] Kao što je već pomenuto, ćelija domaćin se može izabrati od prokariotskih ili eukariotskih sistema. Konkretno, moguće je identifikovati nukleotidne sekvence koje olakšavaju sekreciju u takvom prokariotskom ili eukariotskom sistemu. Vektor koji nosi takvu sekvencu se, dakle, može preimućstveno koristiti za proizvodnju rekombinantnih proteina koje treba sekretovati. Zaista, prečišćavanje ovih rekombinantnih proteina od interesa će biti olakšano činjenicom da su oni prisutni u supernatantu ćelijske kulture više nego unutar ćelija domaćina.
[0056] Upotreba predmetnog antitela kao biomarkera je takođe opisana. Metodi se mogu koristiti za detektovanje ili dijagnostikovanje različitih hiperproliferativnih onkogenih poremećaja vezanih za ekspresiju IGF-1R, čiji su primeri, ali bez ograničenja, kancer prostate, osteosarkomi, kancer pluća, kancer dojke, kancer endometrijuma, glioblastom, kancer kolona, gastrični kancer, renalni kancer, kancer pancreasa, kancer glave i vrata ili bilo koji drugi kancer vezan za ekspresiju IGF-1R. Kao što bi stručnjak uobičajenog nivoa prepoznao, nivo ekspresije antitela vezan za određeni poremećaj će varirati u zavisnosti od prirode i/ili jačine prethodnog stanja.
[0057] Administracija predmetnih antitela na bilo koji od konvencionalnih načina poznatih stručnjak (npr., topički, parenteralno, intramuskularno, itd.), će obezbediti krajnje koristan metod detektovanja displastičnih ćelija u uzorku, a i dozvoliće kliničaru da prati terapijski režim pacijenta podvrgnutog tretmanu za hiperproliferativni poremećaj vezan za ekspresiju IGF-1R ili u kome ona posreduje.
[0058] Predmetno antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, će naći upotrebu u različite medicinske ili istraživačke svrhe, uključujući detekciju, diagnozu, prognozu i određivanje stadijuma različitih patologija povezanih sa ekspresijom IGF-1R.
[0059] Jedan aspekt prijave se odnosi na antitelo na IGF-1R, ili njegov fragment koji vezuje antigen, kao što je gore opisano, za upotrebu kao agens za detekciju tumorskih ćelija koje eksprimiraju IGF-1R.
[0060] Jedno drugo rešenje je antitelo na IGF-1R, ili njegov fragment koji vezuje antigen, kao što je gore opisano, za upotrebu u in vitro ili ex vivo dijagnostikovanju ili prognoziranju onkogenog poremećaja vezanog za ekspresiju IGF-1R.
[0061] "Dijagnostikovanje" bolesti, kao što se ovde koristi, se odnosi na postupak identifikovanja ili detektovanja prisustva patološkog hiperproliferativnog onkogenog poremećaja vezanog za ekspresiju IGF-1R ili posredovanog njom, praćenja napredovanja bolesti i identifikovanja ili detektovanja ćelija ili uzoraka koji ukazuju na poremećaj vezan za ekspresiju IGF-1R.
[0062] "Prognoziranje", kao što se ovde koristi, znači verovatnoću oporavka od bolesti ili predviđanje verovatnog razvoja ili ishoda bolesti. Na primer, ako je uzorak iz subjekta negativan na bojenje antitelom na IGF-1R, onda je "prognoza" za tog subjekta bolja nego ako je uzorak pozitivan na bojenje IGF-1R. U uzorcima se može ocenjivati nivo ekspresije IGF-1R na odgovarajućoj skali, kao što će kasnije ovde biti dato sa više detalja.
1
[0063] Antitelo na IGF-1R može biti prisutno u vidu imunokonjugata ili obeleženog antitela da bi se dobio detektabilan/kvantifikabilan signal. Kad se koristi sa obeleživačima ili drugim odgovarajućim detektabilnim biomolekulima ili hemikalijama, antitelo na IGF-1R je naročito korisno za primene u in vitro i in vivo dijagnozi i prognozi.
[0064] Obeleživači za upotrebu u imunoesejima su generalno poznati stručnjacima i uključuju enzime, radioizotope i fluorescentne, luminiscentne i hromogene supstance, uključujući obojene čestice kao što su kuglice od koloidnog zlata ili lateksa. Pogodni imunoeseji uključuju enzimske imunoeseje (ELISA). Različiti tipovi obeleživača i metoda konjugovanja obeleživača sa antitelima na IGF-1R, kao što su oni dati niže, su dobro poznati stručnjacima.
[0065] Kao što se ovde koristi, termin "onkogeni poremećaj vezan za ekspresiju IGF-1R" treba da uključuje bolesti i druge poremećaje u kojima je pokazano ili se sumnja da je prisustvo visokih nivoa (aberantnog) IGF-1R u subjektu koji pati od poremećaja odgovorno za patofiziologiju poremećaja ili je faktor koji doprinosi pogoršanju poremećaja. Alternativno, takvi poremećaji mogu biti dokazani, na primer, povećanjem nivoa IGF-1R na ćelijskoj površini u pogođenim ćelijama ili tkivima subjekta koji pati od poremećaja. Povećanje nivoa IGF-1R se može detektovati pomoću antitela na IGF-1R.
[0066] U određenim aspektima, "povećana ekspresija" kad se odnosi na IGF-1R, označava nivoe ekspresije proteina ili gena koji prikazuju statistički značajno povećanje ekspresije (mereno preko ekspresije RNK ili ekspresije proteina) u odnosu na kontrolu.
[0067] Jedno rešenje je antitelo na IGF-1R, ili njegov fragment koji vezuje antigen, kao što je gore opisano, za upotrebu u određivanju da li je verovatno da će pacijent sa onkogenim poremećajem imati koristi od tretmana inhibitorom koji cilja putanju IGF-1R, poželjno samim, kombinovanim ili konjugovanim antitelom na IGF-1R.
[0068] Kao što se koristi u predmetnoj prijavi, izraz "inhibitor koji cilja putanju IGF-1R" označava svako jedinjenje koje je sposobno da smanji ili inhibira tirozin kinaznu aktivnost IGF-1R, bilo vezivanjem za ligand(e) IGF-1R, bilo za sam IGFR. Primeri takvih inhibitora su protein, peptidi, antitela ili konjugati antitelo-lek ili bilo koja hemijska jedinjenja koja deluju kao antagonisti IGF-1R, antisens oligonukleotidi ili siRNK, koji inhibiraju ekspresiju gena za IGF-1R ili gena koji kodira jedan od liganada IGFR ili bilo koji drugi lek ili jedinjenje poznato stručnjaku.
[0069] Konkretnije, u smislu predmetne prijave, namera je da inhibitor koji cilja putanju IGF-1R obuhvati svako jedinjenje ili molekul sposoban da se veže za IGF-1R i da inhibira vezivanje njegovih liganada.
[0070] Još konkretnije, u smislu predmetne prijave, namera je da inhibitor koji cilja putanju IGF-1R obuhvati svako monoklonsko antitelo koje se vezuje za IGF-1R.
[0071] U jednom drugom poželjnom aspektu, inhibitor koji cilja putanju IGF-1R se sastoji od konjugata antitelo-lek (ADC), gde funkcionalna grupa antitela cilja IGF-1R, a funkcionalna grupa leka može biti odabrana od bilo kojih lekova kao što su citotoksici, citostatici, toksini, itd... U jednom primernom rešenju, funkcionalna grupa leka može da se sastoji od auristatina, analoga ili derivata.
[0072] Ovde je opisan i metod za detektovanje in vitro ili ex vivo prisustva i/ili lokacije tumorskih ćelija koje eksprimiraju IGF-1R u subjektu, gde navedeni metod obuhvata korake:
(a) dovođenje biološkog uzorka iz navedenog subjekta u dodir sa antitelom na IGF-1R, ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, kao što je gore opisano; i
(b) detektovanje vezivanja navedenog antitela na IGF-1R, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, sa navedenim biološkim uzorkom.
[0073] Obezbeđen je i in vitro ili ex vivo metod za detektovanje i/ili kvantifikovanje i/ili za određivanje nivoa ekspresije IGF-1R u subjektu, poželjno na površini ćelija, gde navedeni metod obuhvata korake:
(a) dovođenje biološkog uzorka iz navedenog subjekta u dodir sa antitelom na IGF-1R, ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, kao što je gore opisano; i
(b) detektovanje i/ili kvantifikovanje i/ili određivanje nivoa vezivanja navedenog antitela na IGF-1R, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, sa navedenim biološkim uzorkom.
[0074] Vezivanje antitela za IGF-1R se može detektovati i/ili kvantifikovati i/ili određivati različitim esejima dostupnim iskusnom stručnjaku. Iako su uključena sva pogodna sredstva za vršenje eseja, posebno se mogu pomenuti protočna citofluorimetrija (FACS), ELISA, western blot i imunohistohemija (IHC). Poželjni metodi uključuju IHC i FACS.
[0075] Obezbeđen je i metod za detektovanje in vitro ili ex vivo procenta tumorskih ćelija koje eksprimiraju IGF-1R u subjektu, gde navedeni metod obuhvata korake:
(a) dovođenje biološkog uzorka iz navedenog subjekta u dodir sa antitelom na IGF-1R, ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, kao što je gore opisano; i
(b) kvantifikovanje procenta ćelija koje eksprimiraju IGF-1R u navedenom biološkom uzorku.
[0076] Jedan drugi aspekt je metod za određivanje in vitro ili ex vivo nivoa ekspresije IGF-1R u tumorskim ćelijama ili u tumoru subjekta, gde navedeni metod obuhvata korake:
(a) dovođenje biološkog uzorka iz navedenog subjekta u dodir sa antitelom na IGF-1R, ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, kao što je gore opisano; i
(b) kvantifikovanje nivoa vezivanja navedenog antitela na IGF-1R, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, za IGF-1R u navedenom biološkom uzorku.
[0077] Kao što će iskusnom stručnjaku biti očigledno, nivo vezivanja antitela na IGF-1R za IGF-1R se može kvantifikovati sredstvima poznatim stručnjaku. Poželjni metodi uključuju upotrebu imunoenzimskih procesa, kao što su eseji ELISA, imunofluorescencija, IHC, radioimunoesej (RIA) ili FACS.
[0078] Prema predmetnom metodu, nivo vezivanje navedenog antitela na IGF-1R, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, za IGF-1R se kvantifikuje protočnom citofluorimetrijom (FACS) ili imunohistohemijom (IHC).
[0079] "Biološkom uzorak" može biti bilo koji uzorak koji se može uzeti iz subjekta. Takav uzorak mora da omogući određivanje nivoa ekspresije prisutnog biomarkera. Priroda uzorka će, prema tome, zavisiti od prirode tumora.
[0080] Poželjni biološki uzorci uključuju uzorke kao što su uzorak krvi, uzorak plazme ili uzorak limfe, ako je kancer tečni tumor.
[0081] Poželjni biološki uzorci uključuju uzorke kao što su uzorak biopsije ili uzorak uzet iz hirurške resekcione terapije, ako je kancer čvrst tumor.
[0082] Poželjno je da biološki uzorak bude biološka tečnost, kao što je serum, ćelije cele krvi, uzorak tkiva ili biopsija iz humanog izvora. Uzorak može da uključuje, na primer, tkivo iz biopsije, koje se može pogodno testirati na prisustvo patološkog onkogenog poremećaja vezanog za ekspresiju IGF-1R.
[0083] Kad se jednom odredi nivo ekspresije IGF-1R u testiranim biološkim uzorcima, rezultati se mogu uporediti sa onima na kontrolnim uzorcima, koji su dobijeni na način sličan kao sa testiranim biološkim uzorcima, ali iz osoba koji nemaju onkogeni poremećaj vezan za ekspresiju IGF-1R. Ako je nivo IGF-1R značajno podignut u testiranom biološkom uzorku, može se zaključiti da postoji povećana verovatnoća da subjekt iz koga je on uzet ima ili će razviti navedeni poremećaj.
[0084] Ovde je obezbeđen postupak in vitro ili ex vivo dijagnoze ili prognoze tumora koji eksprimira IGF-1R, gde navedeni postupak obuhvata korake (i) određivanja nivoa ekspresije IGF-1R metodom za određivanje in vitro ili ex vivo nivoa ekspresije IGF-1R u tumorskim ćelijama ili u tumoru subjekta, kao što je gore opisano, i (ii) poređenje nivoa ekspresije iz koraka (i) sa referentnim nivoom ekspresije IGF-1R iz normalnog tkiva ili onog tkiva koje ne eksprimira IGF-1R.
[0085] U vezi razvoja ciljane antitumorske terapije, dijagnoza imunohistološkim tehnikama daje in situ informaciju o nivou ekspresije receptora i tako omogućava da se izaberu pacijenti pogodni da se tretiraju sledeći nivo ekspresije receptora potreban za takav tretman.
[0086] Određivanje stadijuma ima potencijalnu prognostičku vrednost i obezbeđuje kriterijume za dizajniranje optimalne terapije. Simpson et al., J. Clin. Oncology 18:2059 (2000). Na primer, izbor tretmana za čvrste tumore se zasniva na određivanju stadijuma tumora, koje se obično obavlja primenom testa tumor/čvor/metastaza (TNM) od Američkog udruženog komiteta za kancer (AJCC). Opšte je poznato da, dok ovaj test i sistem stadijuma obezbeđuju neke dragocene informacije u vezi stadijuma čvrstog kancera koji je dijagnostikovan u pacijentu, oni su neprecizni i nedovoljni. Konkretno, on ne uspeva da identifikuje najranije stadijume napretka tumora.
[0087] Jedan drugi aspekt se sastoji od metoda za određivanje in vitro ili ex vivo ocene IGF-1R tumorskih ćelija ili tumora u subjektu, gde navedeni metod obuhvata korake:
(a) dovođenje biološkog uzorka iz navedenog subjekta u dodir sa antitelom na IGF-1R, ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, kao što je gore opisano;
1
(b) kvantifikovanje protočnom citofluorimetrijom (FACS) ili imunohistohemijom (IHC) nivoa vezivanja navedenog antitela na IGF-1R, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, za IGF-1R u navedenom biološkom uzorku; i
(c) ocenjivanje tumorskih ćelija ili tumora poređenjem kvantifikovanog nivoa dobijenog u koraku (b) sa odgovarajućom skalom na osnovu dva parametra koji su intenzitet bojenja i procenat pozitivnih ćelija.
[0088] U jednom aspektu, antitelo na IGF-1R je sposobno za vezivanje IGF-1R kad su uzorci tkiva fiksirani u formalinu, fiksirani u formaldehidu, fiksirani u Glyco-fixx-u, utisnuti u parafin i/ili zamrznuti.
[0089] Svaki konvencionalni metod analize rizika se može koristiti za procenu prognostičke vrednosti IGF-1R. Reprezentativni metodi analize uključuju Cox-ovu regresionu analizu, koja je semiparametrijski metod za modelovanje preživljavanja ili podatke o vremenu do događaja (time-to-event data) u prisustvu cenzurisanih slučajeva (Hosmer i Lemeshow, 1999; Cox, 1972). Za razliku od drugih analiza preživljavanja, npr. životne tabele ili Kaplan-Meyer, Coxova dozvoljava inkluziju prediktorskih promenljivih (kovarijata) u modele. Korišćenjem konvencionih metoda analize, npr. Cox-ove, mogu se testirati hipoteze u vezi sa korelacijom statusa ekspresije IGF-1R u primarnom tumoru sa vremenom početka bilo relapsa bolesti (vreme preživljavanja bez bolesti ili vreme do metastatske bolesti), bilo vremena do smrti od bolesti (ukupno vreme preživljavanja). Cox-ova regresiona analiza je poznata i kao Cox-ova analiza proporcionalnog rizika. Ovaj metod je standard za testiranje prognostičke vrednosti tumor markera za pacijentovo vreme preživljavanja. Kad se koristi u multivarijatnom modusu, efekat nekoliko kovarijata se testira paralelno, tako da se mogu identifikovati pojedinačni kovarijati koji imaju nezavisnu prognostičku vrednost, tj. najkorisniji markeri. Termin negativan ili pozitivan "IGF-1R status" se može obeležavati sa [IGF-1R (-)] ili [IGF-1R (+)].
[0090] Uzorak može biti "ocenjen" tokom dijagnoze ili praćenja kancera. U svom najprostijem obliku, ocena može da bude kategorički negativna ili pozitivna, što se određuje vizualnim pregledom uzoraka pomoću imunohistohemije. Kvantitativnije ocenjivanje uključuje procenjivanje dva parametra intenziteta bojenja i udeo obojenih ("pozitivnih") ćelija koje su uzorkovane.
[0091] "IGF-1R status", kao što se ovde koristi, se odnosi na klasifikaciju tumora u IGF-1R pozitivnu [IGF-1R (+)] ili IGF-1R negativnu [IGF-1R (-)] klasu, na osnovu određivanja nivoa ekspresije IGF-1R, što se meri bilo kojim metodima, kao što je imunohistohemija (IHC), protočna citofluorimetrija FACS ili drugim metodima poznatim stručnjaku.
[0092] U jednom aspektu, da bi se osigurala standardizacija, uzorci se mogu ocenjivati za nivoe ekspresije IGF-1R na različitim skalama, od kojih se većina zasniva na proceni intenziteta proizvoda reakcije i procenta pozitivnih ćelija (Payne et al., Predictive markers in breast cancer - the present, Histopathology 2008, 52, 82-90).
[0093] U jednom drugom aspektu, navedeno ocenjivanje, naročito u koraku (c) predmetnog metoda, obuhvata korišćenje odgovarajuće skale na osnovu intenziteta bojenja i procenta pozitivnih ćelija.
[0094] Kao prvi primer, po analogiji sa Quick Allred ocenjivanjem za procenu IHC estrogenog receptora i progesteronskog receptora, uzorci se mogu ocenjivati za nivoe ekspresije IGF-1R na globalnoj skali od 0 do 8, kombinujući ocene za intenzitet reaktivnosti i za udeo obojenih ćelija (Harvey JM, Clarck GM, Osborne CK, Allred DC; J. Clin. Oncol.
1999; 17; 1474-1481). Konkretnije, prvi kriterijum intenziteta reaktivnosti se ocenjuje na skali od 0 do 3, gde 0 odgovara "nema reaktivnosti", a 3 odgovara "jakoj reaktivnosti". Drugi kriterijum reaktivnog udela se ocenjuje na skali od 0 do 5, gde 0 odgovara "nema reaktivnosti", a 5 odgovara "67-100% reaktivnog udela". Ocena intenziteta reaktivnosti i ocena reaktivnog udela se zatim saberu da daju ukupnu ocenu od 0 do 8. Ukupna ocena od 0-2 se smatra negativnom, dok ukupna ocena od 3-8 se smatra pozitivnom.
[0095] Prema ovoj skali, termini negativan ili pozitivan "IGF-1R status" tumora ili tumorskih ćelija koji se koriste u predmetnom opisu se odnose na nivoe ekspresije IGF-1R koji odgovaraju ocenama 0-2 ili 3-8 na Allred skali, respektivno.
[0096] Tabela 4 niže ilustruje smernice za interpretiranje IHC rezultata prema Allred metodu.
[0097] Metod se odlikuje time što navedena odgovarajuća skala je skala od 0 do 8, gde se izostanak reaktivnosti ocenjuje sa 0, a jaka reaktivnost u procentu od 67-100% reaktivnosti se ocenjuje sa 8.
[0098] Prema tome, u jednom poželjnom rešenju, metod za određivanje in vitro ili ex vivo ocene IGF-1R tumorskih ćelija ili tumora u subjektu, se odlikuje time što je u koraku (c) navedena odgovarajuća skala skala od 0 do 8, gde se izostanak reaktivnosti ocenjuje sa 0, a jaka reaktivnost u procentu od 67-100% reaktivnosti se ocenjuje sa 8.
[0099] Drugim rečima, opisan je i zahteva se postupak određivanja in vitro ili ex vivo statusa tumora ili tumorskih ćelija iz subjekta, gde navedeni postupak obuhvata korake:
(a) ocenjivanje tumora ili tumorskih ćelija iz subjekta prema Allred skali i
(b)
- i) određivanje da je status tumora ili tumorskih ćelija [IGF-1R(+)] sa Allred ocenom od 3 do 8 ili
1
-ii) određivanje da je status tumora ili tumorskih ćelija [IGF-1R(-)] sa Allred ocenom od 0 do 2.
[0100] U jednom konkretnom aspektu, status tumora ili tumorskih ćelija je [IGF-1R (+)] sa Allred ocenom od 3.
[0101] U jednom konkretnom aspektu, status tumora ili tumorskih ćelija je [IGF-1R (+)] sa Allred ocenom od 4.
[0102] U jednom konkretnom aspektu, status tumora ili tumorskih ćelija je [IGF-1R (+)] sa Allred ocenom od 5.
[0103] U jednom konkretnom aspektu, status tumora ili tumorskih ćelija je [IGF-1R (+)] sa Allred ocenom od 6.
[0104] U jednom konkretnom aspektu, status tumora ili tumorskih ćelija je [IGF-1R (+)] sa Allred ocenom od 7.
[0105] U jednom konkretnom aspektu, status tumora ili tumorskih ćelija je [IGF-1R (+)] sa Allred ocenom od 8.
[0106] U jednom drugom konkretnom aspektu, status tumora ili tumorskih ćelija je [IGF-1R (+)] sa Allred ocenom od 3 do 8.
[0107] Jedan drugi konkretan metod opisan ovde za određivanje in vitro ili ex vivo IGF-1R statusa tumorskih ćelija ili tumora u subjektu se odlikuje time što obuhvata korake:
(a) ocenjivanje IGF-1R tumorskih ćelija ili tumora iz navedenog subjekta prema metodu iz zahteva 18; i
(b) određivanje da je IGF-1R status tumorskih ćelija ili tumora [IGF-1R(+)] sa ocenom od 3 do 8; ili
(c) određivanje da je IGF-1R status tumorskih ćelija ili tumora [IGF-1R(-)] sa ocenom od 0 do 2.
[0108] Kao drugi primer, po analogiji sa konvencionalnim ocenjivanjem za IHC procenu HER-2 receptora, na primer, uzorci mogu da se ocenjuju za nivoe ekspresije IGF-1R nešto prostijim metodom ocenjivanja integrisanjem intenziteta bojenja (poželjno, membranskog bojenja) i dela ćelija koje ispoljavaju bojenje u kombinovanu skalu od 0 do 3+.
[0109] Na ovoj skali, tzv. uprošćenoj skali, 0 i 1+ su negativni, dok 2+ i 3+ predstavljaju pozitivno bojenje. Ipak, ocene 1+-3+ se mogu prevesti u pozitivne, zato što svaka pozitivna ocena može biti povezana sa značajno višim rizikom za relaps i fatalnu bolest kad se poredi sa ocenom 0 (negativan), ali povećan intenzitet među pozitivnim ocenama može da omogući dodatno smanjenje rizika.
[0110] Uopšteno govoreći, termini negativan ili pozitivan "IGF-1R status" tumora ili tumorskih ćelija, koji se koriste u predmetnom opisu, se odnose na nivoe ekspresije IGF-1R koji odgovaraju ocenama 0-1+ ili 2+-3+ na uprošćenoj skali, respektivno. Samo potpuna cirkumferentna membranska reaktivnost invazivnog tumora treba da se uzme u obzir i često
1
podseća na pojavu "žice za kokošinjac". U aktuelnim smernicama, uzorci ocenjeni kao granični (ocena 2+ ili 3+) za IGF-1R zahtevaju da se podvrgnu daljoj proceni. IHC analiza bi trebalo da se odbaci i ili da se ponovi ili da se testira FISH-em ili bilo kojim drugim metodom ako, kao neograničavajući primer, kontrole nisu kao što se očekivalo, artefakti uključuju većinu uzorka i uzorak ima jaku membransku pozitivitnost normalnih kanala dojke (interne kontrole) koja sugeriše nalaženje suvišnog antigena.
[0111] Da bi bilo jasnije, tabela 5 niže sumira ove parametre.
Tabela 5
[0112] Predmetni metod se odlikuje time što je navedena odgovarajuća skala skala od 0 do 3<+>, gde se izostanak membranske reaktivnosti tumorskih ćelija ocenjuje sa 0, a jaka potpuna reaktivnost u više od 10% tumorskih ćelija se ocenjuje sa 3<+>.
[0113] Detaljnije, kao što je gore opisano, navedena odgovarajuća skala je skala od 0 do 3, gde se izostanak membranske reaktivnosti tumorskih ćelija ocenjuje sa 0; jedva primetna membranska reaktivnost u više od 10% tumorskih ćelija se ocenjuje sa 1+; slaba do umerena potpuna membranska reaktivnost u više od 10% tumorskih ćelija se ocenjuje sa 2+ i jaka potpuna reaktivnost u više od 10% tumorskih ćelija se ocenjuje sa 3+.
[0114] Drugim rečima, opisan je i zahtevan postupak određivanja in vitro ili ex vivo statusa tumora ili tumorskih ćelija iz subjekta, gde navedeni postupak obuhvata korake (a) ocenjivanje tumora ili tumorskih ćelija iz subjekta prema uprošćenoj skali, kao što je gore opisano i (b) određivanje da je status tumora ili tumorskih ćelija [IGF-1R(+)] sa ocenom od 2+ ili 3+ ili (c) određivanje da je status tumora ili tumorskih ćelija [IGF-1R(-)] sa ocenom od 0 ili 1+.
[0115] U jednom konkretnom aspektu, tumor ili tumorske ćelije su [IGF-1R (+)] sa ocenom od 2+.
[0116] U jednom konkretnom aspektu, tumor je, ili tumorske ćelije su [IGF-1R (+)] sa ocenom od 3+.
[0117] U jednom drugom konkretnom aspektu, tumor je, ili tumorske ćelije su [IGF-1R (+)] sa ocenom od 2+ ili 3+.
[0118] U jednom drugom aspektu, obezbeđen je metod za određivanje in vitro ili ex vivo IGF-1R statusa tumorskih ćelija ili tumora u subjektu, gde navedeni metod obuhvata korake:
1
(a) ocenjivanje navedenog IGF-1R tumorskih ćelija ili navedenog tumora iz navedenog subjekta, opisano gore i
(b)
-i) određivanje da je IGF-1R status tumorskih ćelija ili tumora [IGF-1R(+)] sa ocenom od 2<+>ili 3<+>; ili
-ii) određivanje da je IGF-1R status tumorskih ćelija [IGF-1R(-)] sa ocenom od 0 ili 1<+>.
[0119] Uopšteno, rezultati testa ili eseja mogu biti predstavljeni u bilo kom iz spektra formata. Rezultati mogu biti predstavljeni kvalitativno. Na primer, izveštaj testa može ukazivati samo nato da li je detektovan određen polipeptid, možda uz indikaciju granica detekcije. Rezultati se mogu izložiti kao semikvantitativni. Na primer, mogu se definisati različiti opsezi i opsezima se može dodeliti ocena (npr., 0 do 3+ ili 0 do 8, u zavisnosti od upotrebljene skale) koja obezbeđuje određen nivo kvantitativne informacije. Takva ocena može da odražava različite faktore, npr., broj ćelija u kojima je detektovan IGF-1R, intenzitet signala (koji može da ukazuje na nivo ekspresije IGF-1R ili na ćelije koje nose IGF-1R), itd. Rezultati se mogu izložiti na kvantitativan način, npr., kao procenat ćelija u kojima je detektovan IGF-1R, kao koncentracija proteina, itd.
[0120] Kao što će stručnjaku uobičajenog nivoa biti jasno, tip autputa koji daje test će varirati u zavisnosti od tehničkih ograničenja testa i biološke značajnosti vezane za detekciju polipeptida. Na primer, u slučaju određenih polipeptida, čisto kvalitativan autput (npr., da li je polipeptid detektovan na određenom nivou detekcije) obezbeđuje značajnu informaciju. U drugim slučajevima, neophodan je više kvantitativan autput (npr., odnos nivoa ekspresije polipeptida u uzorku koji se testira u odnosu na normalan nivo).
[0121] U jednom drugom aspektu, opisan je metod dijagnostikovanja patološkog hiperproliferativnog onkogenog poremećaja ili podložnosti patološkom stanju vezanom za ekspresiju IGF-1R u subjektu, gde navedeni metod obuhvata korake:
(a) određivanje prisustva ili odsustva ćelija koje nose IGF-1R u uzorku metodom za detektovanje ćelija koje eksprimiraju IGF-1R i/ili za određivanje nivoa ekspresije IGF-1R, opisanim gore i
(b) dijagnostikovanje patološkog stanja ili podložnosti patološkom stanju na osnovu prisustva ili odsustva navedenih ćelija koje nose IGF-1R.
[0122] U metodima opisanim ovde, detekcija ćelija koje eksprimiraju IGF-1R ili povećanje nivoa IGF-1R je generalno indikativno za pacijenta sa ili suspektnog da ima poremećaj u kom učestvuje IGF-1R.
[0123] Ovde je obezbeđen metod za predviđanje rizika za osobu da će razviti kancer, gde navedeni metod obuhvata detektovanje nivoa ekspresije IGF-1R u uzorku tkiva metodom za detekciju ćelija koje eksprimiraju IGF-1R i/ili za određivanje nivoa ekspresije IGF-1R, opisanim gore, gde je visok nivo ekspresije IGF-1R indikativan za visok rizik od razvoja kancera.
[0124] Ovde je obezbeđen i metod za procenu agresivnosti tumora.
1
[0125] "Agresivnost tumora", kao što se ovde koristi, se odnosi na tumor koji brzo raste i koji ima tendenciju da se brzo širi.
[0126] U jednom aspektu, navedeni metod za procenu agresivnosti tumora obuhvata korake:
(a) određivanje nivoa IGF-1R koji eksprimiraju ćelije u uzorku tumora, metodom za detekciju ćelija koje eksprimiraju IGF-1R i/ili za određivanje nivoa ekspresije IGF-1R, opisanim gore,
(b) određivanje nivoa IGF-1R eksprimiranog u ekvivalentnom uzorku tkiva uzetom iz iste osobe kasnije metodom za detekciju ćelija koje eksprimiraju IGF-1R i/ili za određivanje nivoa ekspresije IGF-1R opisanim gore i
(c) određivanje odnosa između nivoa ekspresije dobijenog u koraku (a) i dobijenog u koraku (b)
gde odnos ekspresije IGF-1R u uzorku tumora tokom vremena obezbeđuje informaciju o rizicima napredovanja kancera.
[0127] U jednom poželjnom aspektu, odnos nivoa dobijenog u koraku (a) prema nivou dobijenom u koraku (b) veći od 1 indikuje agresivnost. U jednom drugom rešenju, odnos manji od ili jednak 1 indikuje neagresivnost.
[0128] Jedan drugi aspekt se odnosi na praćenje ekspresije IGF-1R kao odgovor na administraciju terapije koja cilja na putanje IGF-1R uključivanjem metoda detekcije i/ili kvantifikovanja IGF-1R i/ili određivanja nivoa ekspresije, opisanih gore. Takvo praćenje može biti vrlo korisno kad navedena terapija uključi nizvodnu regulaciju i/ili degradaciju IGF-1R.
[0129] Pored toga, ovde je obezbeđen metod za određivanje da li je onkogeni poremećaj podložan tretmanu antitelnim lekom koji cilja putanju IGF-1R, gde navedeni metod obuhvata korake:
(a) određivanje in vitro ili ex vivo the IGF-1R statusa tumorskih ćelija tumora subjekta prema metodu za ocenjivanje kao što je gore opisan i
(b) određivanje da je, ako je IGF-1R status tumorskih ćelija ili tumora IGF-1R(+), onkogeni poremećaj podložan tretmanu antitelnim lekom koji cilja putanju IGF-1R.
[0130] Konkretno, praćenje ekspresije IGF-1R na površini ćelija bi mogla da bude kritična alatka za procenu efikasnosti tretmana tokom kliničkih ispitivanja i "personalizovanih" terapija.
[0131] Primena tako obezbeđuje metode za određivanje odgovarajućeg terapijskog režima za subjekta.
[0132] Povećanje ili smanjenje nivoa IGF-1R koji se može odrediti metodom za detekciju i/ili za određivanje nivoa ekspresije, opisanim ovde, je indikativno za evoluciju kancera vezanog za IGF-1R. Tako, merenjem povećanja broja ćelija koje eksprimiraju IGF-1R ili promena koncentracije IGF-1R prisutanog u različitim tkivima ili ćelijama, moguće je odrediti da li je konkretan terapijski režim, usmeren na smanjenje maligniteta vezanog za IGF-1R, efektivan.
1
[0133] Ovde je obezbeđen metod za određivanje in vitro ili ex vivo efikasnosti terapijskog režima dizajniranog da ublaži onkogeni poremećaj vezan za IGF-1R u subjektu koji pati od navedenog poremećaja, gde navedeni metod obuhvata korake:
(a) određivanje prvog nivoa ekspresije IGF-1R, metodom za detekciju i/ili za određivanje nivoa ekspresije, kao što je gore opisan, u prvom biološkom uzorku, gde navedeni prvi biološki uzorak odgovara prvoj vremenskoj tački navedenog tretmana;
(b) određivanje drugog nivoa ekspresije ekspresije IGF-1R metodom za detekciju i/ili za određivanje nivoa ekspresije, opisanim ovde, kao što je gore opisano, u drugom biološkom uzorku, gde navedeni drugi biološki uzorak odgovara drugoj, kasnijoj, vremenskoj tački navedenog tretmana;
(c) računanje odnosa navedenog prvog nivoa ekspresije dobijenog u koraku (a) prema navedenom drugom nivou ekspresije dobijenog u koraku (b); i
(d) određivanje da je efikasnost navedenog terapijskog režima visoka kad je odnos iz koraka (c) veći od 1 ili određivanje da je efikasnost navedenog terapijskog režima niska kad je odnos iz koraka (c) manji ili jednak 1.
[0134] U jednom poželjnom aspektu, navedeni terapijski režim, dizajniran da ublaži onkogeni poremećaj vezan za IGF-1R u subjektu koji pati od navedenog poremećaja, uključuje administraciju terapije koja cilja na putanju IGF-1R navedenom subjektu.
[0135] Ovde je obezbeđen i in vivo metod snimanja onkogenog poremećaja vezanog za ekspresiju IGF-1R primenom metoda za detekciju i/ili za određivanje nivoa ekspresije, opisanog ovde. Takav metod je koristan za lokalizovanje tumorskih ćelija in vivo, kao i za praćenje njihove invazivnosti. Takođe, metod je koristan za praćenje progresije i/ili odgovora na tretman u pacijentima kojima je prethodno dijagnostikovan kancer sa učešćem IGF-1R.
[0136] Jedan aspekt prijave je metod za detektovanje lokacije tumorskih ćelija koje eksprimiraju IGF-1R u subjektu, gde navedeni metod obuhvata korake:
a) administriranje antitela na IGF-1R, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, opisanog ovde, subjektu; i
b) detektovanje vezivanja navedenog antitela na IGF-1R,
gde navedeno vezivanje indikuje prisustvo tumorskih ćelija.
[0137] Što se tiče detekcije prisustva tumora koji eksprimira, mogu se koristiti mnoge tehnike poznate stručnjaku. Međutim, poželjna sredstva su IHC i FACS.
[0138] U jednom drugom aspektu, obezbeđen je in vivo reagens za snimanje, gde navedeni reagens sadrži predmetno antitelo na IGF-1R, ili njegov fragment koji vezuje antigen, gde je poželjno da navedeno antitelo na IGF-1R bude obeleženo, poželjnije, radioaktivno obeleženo.
[0139] Upotreba navedenog reagensa u medicinskom snimanju pacijenta koji pati od kancera sa učešćem IGF-1R je takođe ovde predviđena.
[0140] Sadašnji metod obuhvata korake:
2
(a) administriranje navedenom pacijentu količine efektivne za snimanje reagensa opisanog ovde i
(b) detektovanje navedenog reagensa.
[0141] U jednom poželjnom aspektu, agens za snimanje sadrži predmetno antitelo na IGF-1R, ili njegov fragment koji vezuje antigen i aktivnu funkcionalnu grupu.
[0142] "Aktivna funkcionalna grupa", kao što se ovde koristi, je agens koji dozvoljava in vivo detekciju navedenog reagensa za snimanje. Aktivna grupa posebno uključuje radioaktivne elemente, kao što su tehnicijum-99m (99mTc), bakar-67 (Cu-67), skandijum-47 (Sc-47), lutecijum-77 (Lu-177), bakar-64 (Cu-64), itriujm-86 (Y-86) ili jod-124 (I-124).
[0143] Agens za snimanje se daje u količini efektivnoj za dijagnostičku upotrebu u sisaru kakav je čovek, a zatim se detektuju lokalizacija i akumulacija agensa za snimanje. Lokalizacija i akumulacija agensa za snimanje se mogu detektovati radionuklidenim snimanjem, radioscintigrafijom, nuklearnom magnetnom rezonancom, kompjuterizovanom tomografijom, pozitron emisionom tomografijom, kompjuterizovanom aksijalnom tomografijom, X-zracima ili metodom magnetne rezonance, fluorescentnom detekcijom i hemiluminiscentnom detekcijom.
[0144] U vezi sa razvojem ciljane antitumorske terapije, dijagnoza imunohistološkim tehnikama daje in situ informaciju o receptorskom nivou ekspresije, npr. vezanu za veličinu i/ili lokaciju tumora. Dijagnoza time omogućava da se izaberu pacijenti susceptibilni za tretiranje sledeći nivo ekspresije receptora potreban za takav tretman.
[0145] Posebno interesantan aspekt se odnosi na metod za biranje pacijenta s kancerom za koga se predviđa ili ne da će imati koristi od administracije terapijske količine antitelnog leka koji cilja na putanju IGF-1R, gde navedeni metod obuhvata korake:
(a) određivanje nivoa ekspresije IGF-1R prema metodu opisanom gore;
(b) poređenje nivoa ekspresije iz prethodnog koraka (a) sa referentnim nivoom ekspresije; i
(c) biranje pacijenta za koga se predviđa da će imati koristi od tretmana antitelnim lekom koji cilja na putanju IGF-1R, ako je odnos nivoa ekspresije dobijenog u (a) prema referentnom nivou ekspresije veći od 1; ili
(d) biranje pacijenta za koga se predviđa da neće imati koristi od tretmana antitelnim lekom koji cilja na putanju IGF-1R, ako je odnos nivoa ekspresije dobijenog u (a) prema referentnom nivou ekspresije manji od ili jednak 1.
[0146] Nivo ekspresije IGF-1R se poželjno poredi ili se meri u odnosu na nivoe u kontrolnoj ćeliji ili uzorku, koji se nazivaju "referentni nivoi" ili "referentni nivoi ekspresije". "Referentan nivo", "referentan nivo ekspresije", "kontrolni nivo" i "kontrola" se koriste u istom značenju u ovoj specifikaciji. "Kontrolni nivo" označava odvojen osnovni nivo meren u uporedivoj kontrolnoj ćeliji, koja je generalno bez bolesti ili kancera. Navedena kontrolna ćelija može biti iz iste osobe, pošto čak i kod pacijenta s kancerom, tkivo koje je mesto tumora ipak sadrži netumorsko zdravo tkivo. Ona može da potiče i iz druge osobe koja je normalna ili ne ispoljava istu bolest iz koje je bolestan ili testirani uzorak dobijen. Kao što se ovde koristi, termin "referentni nivo" se odnosi na "kontrolni nivo" ekspresije IGF-1R koji se koristi za procenu testiranog nivoa ekspresije IGF-1R u kancerskoj ćeliji koja sadrži uzorak pacijenta. Na primer, kad je nivo IGF-1R u biološkom uzorku pacijenta viši od referentnog nivoa IGF-1R, smatraće se da ćelije imaju visok nivo ekspresije, ili prekomernu ekspresiju IGF-1R. Referentan nivo se može određivati mnoštvom metoda. Nivoi ekspresije tako mogu da definišu ćelije koje nose IGF-1R ili, alternativno, nivo ekspresije IGF-1R nezavisan od broja ćelija koje eksprimiraju IGF-1R. Time referentan nivo za svakog pacijenta može da se odredi referentnim odnosom IGF-1R, gde se referentan odnos određivati bilo kojim metodima za određivanje referentnih nivoa opisanim ovde.
[0147] Na primer, kontrola može biti unapred određena vrednost, koja može imati spektar oblika. Ona može biti jedna granična vrednost, kao što je medijana ili srednja vrednost. "Referentan nivo" može biti jedan broj, koji vredi za svakog pojedinačnog pacijenta, ili referentan nivo može da varira, prema specifičnim subpopulacijama pacijenata. Tako, na primer, stariji muškarci mogu da imaju različit referentan nivo od mlađih muškaraca za isti kancer, a žene mogu da imaju različit referentan nivo od muškaraca za isti kancer. Alternativno, "referentan nivo" se može određivati merenjem nivoa ekspresije IGF-1R u neonkogenim kancerskim ćelijama iz istog tkiva kao što je tkivo neoplastičnih ćelija koje se testiraju. Isto tako, "referentan nivo" može da bude određen odnos IGF-1R u neoplastičnim ćelijama pacijenta i nivoa IGF-1R u netumorskim ćelijama unutar istog pacijenta. "Referentan nivo" može da bude i nivo IGF-1R in vitro gajenih ćelija, kojima se može manipulisati da simuliraju tumorske ćelije, ili se može manipulisati na bilo koji drugi način koji daju nivoe ekspresije koji tačno određuju referentan nivo. S druge strane, "referentan nivo" se može utvrditi na osnovu komparativnih grupa, kao što su grupe koje nemaju povišen nivo IGF-1R i grupe koje imaju povišen nivo IGF-1R. Još jedan primer komparativnih grupa bi bile grupe koje imaju određenu bolest, stanje ili simptome i grupe bez bolesti. Unapred određena vrednost se može postaviti, na primer, kad je testirana populacija jednako (ili nejednako) podeljena u grupe, kao što je grupa niskog rizika, grupa srednjeg rizika i grupa visokog rizika.
[0148] "Referentan nivo" se može određivati i poređenjem nivoa IGF-1R u populacijama pacijenata koji imaju isti kancer. To se može postići, na primer, analizom histograma, u kom je cela grupa pacijenata grafički predstavljena, gde prva osa predstavlja nivo IGF-1R, a druga osa predstavlja broj pacijenata u grupi čije tumorske ćelije eksprimiraju IGF-1R na datom nivou. Dve ili više odvojenih grupa pacijenata se mogu odrediti identifikacijom podskupova populacija grupe, koje imaju isti ili slične nivoe IGF-1R. Određivanje referentnog nivoa se zatim može uraditi na osnovu nivoa koji najbolje razlikuje ove odvojene grupe. Referentni nivoi takođe mogu da predstavljaju nivoe dva ili više markera, od kojih je jedan IGF-1R. Dva ili više markera mogu biti predstavljeni, na primer, odnosom vrednosti za nivo svakog markera.
[0149] Takođe, pojavno zdrava populacija će imati različit 'normalan' opseg od populacije za koju se zna da ima stanje vezano za ekspresiju IGF-1R. U skladu s tim, izabrana unapred određena vrednost može da uzme u obzir kategoriju u koju osoba spada. Odgovarajući opsezi kategorija se mogu izabrati na način ne teži od rutinske eksperimentacije koju rade stručnjaci uobičajenog niova. Pod "povišen", "povećan", misli se na visok u odnosu na izabranu kontrolu. Tipično će kontrola biti zasnovana na pojavno zdravim normalnim osobama u odgovarajućem opsegu starosti.
[0150] Takođe će se podrazumevati da kontrole mogu da budu, pored unapred određenih vrednosti, uzorci materijala koji se testiraju paralelno sa eksperimentalnim materijalima.
Primeri uključuju tkivo ili ćelije dobijene u isto vreme iz istog subjekta, na primer, delovi jedne iste biopsije ili delovi jednog istog uzorka ćelija iz subjekta.
[0151] U jednom drugom rešenju, ovde je obezbeđen farmaceutski sastav za in vivo snimanje onkogenog poremećaja vezanog za ekspresiju IGF-1R, koji sadrži antitelo na IGF-1R, ili njegov fragment koji vezuje antigen, gore opisan, ili njegov fragment koji vezuje antigen koji je obeležen i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0152] U jednom drugom aspektu, opisan je i komplet za detekciju tumorskih ćelija koje eksprimiraju IGF-1R u pacijentu, koji se odlikuje time što navedeni komplet sadrži bar antitelo na IGF-1R, ili njegov fragment koji vezuje antigen, kao što je gore opisano i, poželjno, antitelo 816C12.
[0153] Upakovani materijali koji sadrže kombinaciju reagenasa u unapred određenim količinama sa instrukcijama za obavljanje dijagnostičkog testa, npr. kompleti, su takođe unutar opsega predmetne prijave. Komplet sadrži antitela na IGF-1R za detekciju i kvantifikaciju IGF-1R in vitro, npr. u ELISA. Kad je antitelo na IGF-1R obeleženo enzimom, komplet će uključivati supstrate i kofaktore koji su potrebni enzimu (npr., prekursor supstrata koji obezbeđuje detektabilnu hromoforu ili fluoroforu). Pored toga, mogu biti uključeni drugi aditivi, kao što su stabilizatori, puferi (npr., pufer za blokiranje ili pufer za lizu) i slično. Takav komplet može da sadrži kutiju sa odeljcima za jedan ili više kontejnera kao što su fiole, epruvete i slično, gde takvi kontejneri sadrže odvojene elemente. Na primer, jedan kontejner može da sadrži prvo antitelo vezano za nerastvorljiv ili delimično rastvorljiv nosač. Drugi kontejner može da sadrži rastvorljiv, detektabilno obeleženo drugo antitelo, u liofilizovanom vidu ili u rastvoru. Kutija može da sadrži i treći kontejner za držanje detektabilno obeleženog trećeg antitela u liofilizovanom vidu ili u rastvoru. Komplet ove prirode se može koristiti u sendvič testu. Etiketa ili umetak u paketu mogu da obezbede opis sastava, kao i uputstvo za namenu in vitro ili za dijagnostičku upotrebu.
[0154] Relativne količine različitih reagenasa mogu široko da variraju, da bi obezbedile koncentracije reagenasa u rastvoru koje suštinski optimizuju osetljivost testa. Konkretno, reagensi mogu da budu obezbeđeni kao suvi prahovi, obično liofilizovani, uključujući ekscipijente koji, po rastvaranju, obezbeđuju da rastvor reagens ima odgovarajuću koncentraciju.
[0155] A u još jednom aspektu, antitela na IGF-1R ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, kao što je ovde dato detaljno, su obezbeđeni obeleženi detektabilnom grupom, tako da se mogu pakovati i koristiti, na primer, u kompletima, da se dijagnostikuju ili identifikuju ćelije koje imaju gorepomenuti antigen. Neograničavajući primeri takvih obeleživača uključuju fluorofore kakav je fluorescein izotiocijanat; hromofore, radionuklide, biotin ili enzime. Takva obeležena antitela na IGF-1R se mogu koristiti za histološku lokalizaciju antigena, ELISA, citometriju, kao i za druge imunološke tehnike za detektovanje ili kvantifikovanje IGF-1R i ćelija koje nose ovaj antigen, na primer.
[0156] Ovde je obezbeđen komplet, gde se navedeni komplet odlikuje time što sadrži antitelo na IGF-1R ili njegove fragmente koji vezuju antigen, kao što je opisano ovde.
[0157] Obezbeđen je i komplet, gde se navedeni komplet odlikuje time što sadrži himerno ili humanizovano antitelo na IGF-1R ili njegove fragmente koji vezuju antigen, koje se može
2
dobiti iz 6 CDR-ova koji imaju sekvence SEQ ID No.1 do 6 antitela na IGF-1R ili njegovih fragmenata koji vezuju antigen.
[0158] Obezbeđeni su i kompleti koji su korisni kao pozitivna kontrola za prečišćavanje ili imunoprecipitaciju IGF-1R iz ćelija. Za izolovanje i prečišćavanje IGF-1R, komplet može da sadrži antitelo na IGF-1R ili njegove fragmente koji vezuju antigen, kao što je detaljno dato ovde, kuplovane sa kuglicama (npr., kuglicama od sefaroze). Mogu biti obezbeđeni kompleti koji sadrže antitela za detekciju i kvantifikaciju IGF-1R in vitro, npr. u ELISA. Komplet sadrži kontejner i etiketu ili umetak u paket ili je vezan za kontejner. Mogu biti uključeni dodatni kontejneri koji sadrže, npr., razblaživače i pufere, kontrolna antitela. Etiketa ili umetak u paket može da obezbeđuje opis sastava, kao i uputstvo za namenu in vitro ili za dijagnostičku upotrebu.
[0159] Konkretnije, obezbeđen je komplet za in vitro ili ex vivo određivanje IGF-1R statusa tumorskih ćelija tumora u subjektu ovde opisanim metodima. U jednom poželjnom rešenju, kao što će biti opisano u primeru, obezbeđen je komplet za određivanje IGF-1R statusa tumora ili tumorskih ćelija IHC i/ili FACS metodima.
[0160] U jednom konkretnom aspektu, obezbeđen je komplet, koji sadrži bar antitelo na IGF-1R, ili njegov fragment koji vezuje antigen, kao što je gore opisano, gde je navedeno antitelo obeleženo.
[0161] U jednom poželjnom aspektu, komplet dalje sadrži reagens koristan za detektovanje mere vezivanja između navedenog antitela na IGF-1R i IGF-1R.
[0162] U jednom drugom poželjnom aspektu, komplet koristan za određivanje in vitro ili ex vivo nivoa ekspresije IGF-1R u tumoru koji eksprimira IGF-1R, dalje sadrži reagens koristan za kvantifikovanje nivoa vezivanja između navedenog obeleženog antitela na IGF-1R i IGF-1R.
[0163] A u još jednom drugom poželjnom aspektu, komplet dalje sadrži: i) reagens koristan za detektovanje mere vezivanja između navedenog obeleženog antitela na IGF-1R i IGF-1R i ii) pozitivne i negativne kontrolne uzorke korisne za ocenjivanje nivoa ekspresije IGF-1R.
[0164] Navedeni komplet može još da sadrži poliklonsko antitelo specifično za mišja antitela ili za humana/humanizovana antitela, gde je poželjno da navedeno poliklonsko antitelo specifično za mišja, humanizovana ili humana antitela bude obeleženo.
[0165] Prema jednom konkretnom aspektu, komplet za biranje in vitro pacijenta sa kancerom, za koga se predviđa da će imati ili da neće imati koristi od terapijske administracije inhibitora koji cilja na putanju IGF-IR, može da sadrži: i) reagens koristan za detektovanje mere vezivanja između navedenog antitela na IGF-1R i IGF-1R; ii) kontrolni nivo koji je korelisan sa osetljivošću na inhibitor IGF-1R i/ili iii) kontrolni nivo koji je korelisan sa otpornošću na inhibitor IGF-1R.
[0166] Obezbeđen je i komplet, gde je navedeni komplet za određivanje da li je verovatno da će pacijent sa onkogenim poremećajem imati koristi od tretmana antitelnim lekom koji cilja na putanju IGF-1R, koji se odlikuje time što navedeni komplet sadrži bar antitelo na IGF-1R, ili njegov fragment koji vezuje antigen, kao što je gore opisano.
[0167] U jednom drugom rešenju, navedeni komplet se odlikuje time što još sadrži
i) reagens za detektovanje mere vezivanja između navedenog antitela na IGF-1R i IGF-1R na površini tumorskih ćelija; i/ili
ii) reagens za kvantifikovanje nivoa vezivanja između navedenog antitela na IGF-1R i IGF-1R na površini tumorskih ćelija.
PRIKAZ SLIKA
[0168]
Slika 1: Grafičko predstavljanje OD vrednosti dobijenih sa antitelom 816C12 u rhIGF1R ELISA. Fitovanje podataka i određivanje EC50su određeni pomoću appikacije Prism. Slike 2A-2C: Imunohistohemijski (IHC) obrasci prepoznavanja tumora MCF-7 ukalupljenih u parafin sa 816C12 (Slika 2A), sa antitelom na IGF-1R G11 (Roche Ventana) (Slika 2B) ili sa antitelom na IGF-1R AF-305 (R&D system) (Slika 2C).
Slika 3: In vivo aktivnost anti-IGF-1R ADC u modelu ksenografta MCF-7.
Slike 4A-4C: Imunohistohemijski (IHC) obrasci prepoznavanja tumora SBC-5 ukalupljenih u parafin sa 816C12, sa antitelom na IGF-1R G11 (Roche Ventana) (Slika 4B) ili sa antitelom na IGF-1R AF-305 (R&D system) (Slika 4C).
Slika 5: In vivo aktivnost anti-IGF-1R ADC u modelu ksenografta SBC-5.
PRIMERI
Primer 1: pravljenje i selekcija 816C12
[0169] Mab-ovi generisani na IGF-1R su proizvedeni i izabrani kao što je opisano niže.
[0170] Ženke Balb/C miševa su imunizovane subkutanom injekcijom sa 10 µg rekombinantnog humanog IGF-1R proteina (R i D Systems, 391-GR) sa Freund-ovim adjuvantom. Imunizacija je ponovljena tri puta u intervalima od 2 po nedelje. Četvrta injekcija je data intraperitonealno u prisustvu adjuvanta.
[0171] Tri dana kasnije, ćelije slezine su fuzionisane sa ćelijama mijeloma SP20Ag14 sa PEG 50 %. Posle 14 dana HAT metaboličke selekcije, supernatanti hibridoma su testirani FACS-om uz upotrebu humanih ćelija kancera dojke MCF7. Zadržana su samo antitela vezana za MCF7.
[0172] Antitela od interesa su zatim klonirana iz graničnog razblaženja. Osam dana posle kloniranja, supernatanti su odabrani još jedanput pomoću FACS uz upotrebu MCF7 ćelija. Tri pozitivna klona su sačuvana. Izotipovi sekretovanih antitela su određivani pomoću SBA sistema za klonotipiranje - HRP kompleta od Southern Biotechnologies (Cat: 5300-05). Konačno, jedan klon je umnožen i zamrznut.
[0173] Dalja karakterizacija antitela 816C12 je zatim rađena korišćenjem supernatanata hibridoma, kao što je rhIGF-1R ili rmIGF-1R ili rhIR ELISA. U svim direktnim ELISA-ma, proteini od interesa su imobilisani (1 µg/ml) na dnu svog udubljenja. Posle zasićenja, hibridom supernatanti hibridoma su dodati u udubljenja. Posle 1-časovnog perioda inkubacije
2
i koraka pranja, rastvor kozjeg anti-mišjeg IgG poliklonskog antitela obeleženog HRP-om je korišćen za detekciju, pre dodavanja supstrata TMB. Reakcija je zaustavljena 1M rastvorom H2SO4pre čitanja OD na spektrofotometru na talasnoj dužini 450 nm. Podaci su predstavljeni u Tabeli 6.
Tabela 6
[0174] Kriva doza-odgovor za antitelo 816C12 na oblozi rhIGF-1R je predstavljena na Slici 1. Vrednosti EC50su određivane pomoću aplikacije Prism.
[0175] Podaci su pokazali da antitelo 816C12 prepoznaje samo rh IGF-1R sa EC50od 0,41 nM. Ne vezuje se za mišji oblik IGF-1R, niti za humani IR.
Primer 2: Procena korelacije stadijuma sa sadašnjim antitelom i aktivnost ADC koje cilja na IGF-1R u modelu ksenografta MCF-7
[0176] Da bi se korelisalo ocenjivanje tumora sa farmakologijom, tumori su ocenjeni (odeljak 2.1), a zatim su urađeni in vivo eksperimenti na modelu ksenografta MCF-7 sa ADC koji sadrži antitelnu funkcionalnu grupu koja cilja na IGF-1R za koji se zna da je internalizovan i funkcionalnu grupu leka koja se sastoji od auristatina (odeljak 2.2).
2.1: Imunohistohemijsko detektovanje ekspresije IGF-1R u modelu ksenografta MCF-7
[0177] Isečci tkiva iz ksenografta MCF-7 su deparafinisani, rehidrirani i stavljeni u Target Retrieval Pufer 1X (Dako S1699) na ključalom kupatilu, prethodno ugrejanom na 98°C, za povraćaj epitopa indukovan toplotom na 98°C 40 minuta, a zatim još 20 minuta u Target Retrieval pufer. Posle 3 pranja Tris Pufer slanim rastvorom-0,05% tween 20 (TBS-T) (Dako S3006), aktivnost endogene peroksidaze je blokirana pomoću reagensa za blokiranje peroksidaze (Dako K4007) na pet minuta. Isečci su oprani TBS-T-om i inkubirani 5 minuta sa reagensom za blokiranje (UltraV block-TA-125UB- LabVision) pre inkubacije bilo sa monoklonskim antitelom 816C12 (pri 5 µg/ml), bilo sa mišjim IgG1/kapa (5 µg/ml, X0931, Dako) kao negativnom kontrolom 1 sat, na sobnoj temperaturi. Isečci su oprani TBS-T-om i inkubirani 30 minuta sa Envision (Dako). Diaminobenzidin je korišćen za razvoj braon reakcionog proizvoda (Dako K3468). Predmetna stakla su zatim uronjena u hematoksilin na 2 minuta za kontra bojenje (Dako S3309).
[0178] Anti-IGF-1R monoklonsko antitelo 816C12 diferencijalno boji ćelijsku membranu MCF-7. U toj IHC proceduri, braon reakcioni proizvod korelira sa pozitivnim bojenjem ćelijske membrane, a nedostatak braon reakcionog proizvoda korelira sa negativnim bojenjem i ne vidi se ćelijska membrana. Primenom membranskog algoritma, ocenjivanje bojenja tumorskih ćelija MCF-7 je bilo 3+ (Slika 2A). Uz korišćenje antitela G11 (Roche Ventana) ili
2
anti-IGF-1R antitela AF-305 (R&D system), isečak istog tumora je ocenjen sa 2+ (Slika 2B i 2C, respektivno).
2.2: In vivo aktivnost anti-IGF-1R ADC u modelu ksenografta MCF-7
[0179] Anti-IGF-1R ADC je ocenjen in vivo, u modelu ksenografta MCF-7.
[0180] Sve procedure sa životinjama su rađene prema smernicama 2010/63/UE Direktive o zaštiti životinja koje se koriste u naučne svrhe. Protokol je odobren od strane etičkog komiteta za životinje instituta Pierre Fabre. Pet miliona MCF-7 ćelija je injektirano subkutano u Swiss/gole miševe stare 7 nedelja. Pre injektiranja ćelija, peleti estrogena (Innovative Research of America) su implantirani u levi bok miševa da bi se oslobodili estrogeni neophodni za in vivo rast MCF-7 tumora.
[0181] Dvadeset dana posle implantacije MCF-7 ćelija, kad su tumori dostigli prosečnu veličinu od 120-150 mm<3>, životinje su podeljene u grupe od po 6 miševa, prema veličini i aspektu tumora. Anti-IGF-1R ADC je inokulisan intraperitonealnim injekcijama, ciklus od po 6 injekcija na svaka četiri dana (Q4d4). Zdravstveni status životinja je praćen svaki dan. Zapremina tumora je merena dvaput nedeljno elektronskim mikrometrom do kraja studije. Zapremina tumora je računata po sledećoj formuli: π/6 x dužina x širina x visina. Toksičnost je procenjivana praćenjem težine životinja tri puta nedeljno. Statističke analize su rađene za svaku meru primenom Mann-Whitney testa.
[0182] Injekcija anti-IGF-1R ADC je značajno inhibirala i čak indukovala potpunu regresiju rasta tumora (Slika 3), kao što se očekivalo za tumor ocenjen sa 3+, ali ne za tumor ocenjen sa 2+.
Primer 3: Procena korelacije ocene tumora sa predmetnim antitelom i aktivnost ADC koji cilja na IGF-1R u modelu ksenografta SBC-5
[0183] Da bi se korelisalo ocenjivanje tumora sa farmakologijom, tumori su ocenjeni (odeljak 3.1), a zatim su urađeni in vivo eksperimenti na modelu ksenografta SBC-5 sa ADC koji sadrži antitelnu funkcionalnu grupu koja cilja na IGF-1R i funkcionalnu grupu leka koja se sastoji od auristatina (odeljak 3.2).
3.1 Imunohistohemijska detekcija ekspresije IGF-1R u modelu ksenografta SBC-5
[0184] Nivo IGF-1R je analiziran korišćenjem istog protokola opisanog u odeljku 2.1 primera 2 prethodno.
[0185] Kad je IGF-1R detektovan pomoću 816C12, detektovani su niski nivoi (1+). (Slika 4A). Kad je IGF-1R detektovan pomoću antitela G11 (Roche Ventana) ili anti-IGF-1R antitela AF-305 (R&Dsystem), odeljci iz istog tumora su ocenjeni sa 3+ (Slika 4B i 4C respektivno).
3.2: In vivo aktivnost anti-IGF-1R ADC u modelu ksenografta SBC-5
[0186] Anti-IGF-1R ADC je ocenjen in vivo, u model ksenografta SBC-5.
[0187] Sve procedure na životinjama su izvođene prema smernicama 2010/63/UE Direktive o zaštiti životinja koje se koriste u naučne svrhe. Protokol je odobren od strane etičkog komiteta
2
za životinje instituta Pierre Fabre. Pet miliona SBC-5 ćelija je injektirano subkutano u atimične miševe stare 7 nedelja. Dvanaest dana posle implantacije ćelija, kad su tumori dostigli prosečnu veličinu od 150 mm<3>, životinje su podeljene u grupe od po 6 miševa, prema veličini i aspektu tumora. Anti-IGF-1R ADC je inokulisan intraperitonealnim injekcijama, ciklus od po 6 injekcija na svaka četiri dana (Q4d6). Zdravstveni status životinja je praćen svaki dan. Zapremina tumora je merena dvaput nedeljno elektronskim mikrometrom do kraja studije. Zapremina tumora je računata po sledećoj formuli: π/6 x dužina x širina x visina. Toksičnost je procenjivana praćenjem težine životinja tri puta nedeljno. Statističke analize su rađene za svaku meru primenom Mann-Whitney testa.
[0188] Napredovanje tumora tumorskih ćelija SBC-5 nije pogođeno injekcijom anti-IGF-1R ADC (Slika 5) kao što je očekivano za tumor stepena 1+, ali ne za tumor stepena 3+.
2
2
1
2

Claims (13)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Antitelo na IGF-1R, ili njegov fragment koji vezuje antigen, naznačen time što sadrži: i) težak lanac sa CDR-H1 sekvence SEQ ID No.1, CDR-H2 sekvence SEQ ID No.2 i CDR-H3 sekvence SEQ ID No.3; i
ii) lak lanac sa CDR-L1 sekvence SEQ ID No. 4, CDR-L2 sekvence SEQ ID No. 5 i CDR-L3 sekvence SEQ ID No.6.
2. Antitelo na IGF-1R prema zahtevu 1, naznačeno time što sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID No.7 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID No.8.
3. Antitelo na IGF-1R, ili njegov fragment koji vezuje antigen, naznačen time što ga sekretuje hibridom zaveden u CNCM, Institut Pasteur, Paris, 17. septembra 2014, pod brojem I-4894.
4. In vitro ili ex vivo upotreba antitela na IGF-1R, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, prema bilo kom od zahteva 1 do 3, za detekciju tumorskih ćelija koje eksprimiraju IGF-1R ili za određivanje nivoa ekspresije tumorskih ćelija koje eksprimiraju IGF-1R.
5. In vitro ili ex vivo upotreba antitela na IGF-1R, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, prema bilo kom od zahteva 1 do 3, za dijagnostikovanje tumora koji eksprimira IGF-1R.
6. Metod detektovanja in vitro ili ex vivo prisustva i/ili lokacije tumorskih ćelija koje eksprimiraju IGF-1R u subjektu, gde navedeni metod obuhvata korake:
(a) dovođenje biološkog uzorka iz navedenog subjekta u dodir sa antitelom na IGF-1R, ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, prema bilo kom od zahteva 1 do 3; i b) detektovanje vezivanja navedenog antitela na IGF-1R, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, sa navedenim biološkim uzorkom.
7. Metod detektovanja in vitro ili ex vivo procenta tumorskih ćelija koje eksprimiraju IGF-1R u subjektu, gde navedeni metod obuhvata korake:
(a) dovođenje biološkog uzorka iz navedenog subjekta u dodir sa antitelom na IGF-1R, ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, prema bilo kom od zahteva 1 do 3 i
(b) kvantifikovanje procenta ćelija koje eksprimiraju IGF-1R u navedenom biološkom uzorku.
8. Metod određivanja in vitro ili ex vivo nivoa ekspresije IGF-1R u tumorskim ćelijama u subjektu, gde navedeni metod obuhvata korake:
(a) dovođenje biološkog uzorka iz navedenog subjekta u dodir sa antitelom na IGF-1R, ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, prema bilo kom od zahteva 1 do 3; i
4
(b) kvantifikovanje nivoa vezivanja navedenog antitela na IGF-1R, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, sa IGF-1R u navedenom biološkom uzorku.
9. Metod određivanja in vitro ili ex vivo ocene IGF-1R tumorskih ćelija ili tumora u subjektu, gde navedeni metod obuhvata korake:
(a) dovođenje biološkog uzorka iz navedenog subjekta u dodir sa antitelom na IGF-1R, ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, prema bilo kom od zahteva 1 do 3 i (b) kvantifikovanje pomoću protočne citofluorimetrije (FACS) ili imunohistohemije (IHC) nivoa vezivanja navedenog antitela na IGF-1R, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, za IGF-1R u navedenom biološkom uzorku i
(c) ocene tumorskih ćelija ili tumora poređenjem kvantifikovanog nivoa dobijenog u koraku (b) sa odgovarajućom skalom zasnovanom na dva parametra koji su intenzitet bojenja i procenat pozitivnih ćelija.
10. Metod određivanja da li je onkogeni poremećaj pogodan za tretman antitelnim lekom protiv IGF-1R, gde navedeni metod obuhvata korake:
(a) određivanje in vitro ili ex vivo IGF-1R statusa tumorskih ćelija ili tumora subjekta prema metodu iz zahteva 9 i
(b) odredivši da, ako je IGF-1 R status tumorskih ćelija ili tumora IGF-1 R(+), onkogeni poremećaj je pogodan za tretman antitelnim lekom protiv IGF-1R.
11. Metod određivanja in vitro ili ex vivo efikasnosti terapijskog režima dizajniranog da ublaži kancer koji eksprimira IGF-1R u subjektu koji pati od navedenog poremećaja, gde navedeni metod obuhvata korake:
(a) određivanje prvog nivoa ekspresije IGF-1R, prema zahtevu 8, u prvom biološkom uzorku, gde navedeni prvi biološki uzorak odgovara prvoj vremenskoj tački navedenog tretmana;
(b) određivanje drugog nivoa ekspresije IGF-1R, prema zahtevu 8, u drugom biološkom uzorku, gde navedeni drugi biološki uzorak odgovara drugoj, kasnijoj, vremenskoj tački navedenog tretmana;
(c) računanje odnosa navedenog prvog nivoa ekspresije dobijenog u koraku (a) i navedenog drugog nivoa ekspresije dobijenog u koraku (b); i
(d) određivanje da je efikasnost navedenog terapijskog režima visoka kad je odnos iz koraka (c) veći od 1 ili određivanje da je efikasnost navedenog terapijskog režima niska kad je odnos iz koraka (c) manji ili jednak 1.
12. Metod izbora pacijenta sa kancerom za koga se predviđa da će imati ili da neće imati koristi od administracije terapijske količine antitelnog leka protiv IGF-1R, gde navedeni metod obuhvata korake:
(a) određivanje nivoa ekspresije IGF-1R prema metodu iz zahteva 8;
(b) poređenje nivoa ekspresije iz prethodnog koraka (a) sa referentnim nivoom ekspresije; i
(c) biranje pacijenta za koga se predviđa da će imati koristi od tretmana antitelnim lekom protiv IGF-1R, ako je odnos nivoa ekspresije dobijenog u (a) prema referentnom nivou ekspresije veći od 1; ili
(d) biranje pacijenta za koga se predviđa da neće imati koristi od tretmana antitelnim lekom protiv IGF-1R, ako je odnos nivoa ekspresije dobijenog u (a) prema referentnom nivou ekspresije manji od ili jednak 1.
13. Komplet za detekciju tumorskih ćelija koje eksprimiraju IGF-1R u pacijentu, naznačen time što navedeni komplet sadrži bar antitelo na IGF-1R, ili njegov fragment koji vezuje antigen, prema bilo kom od zahteva 1 do 3.
RS20210687A 2015-04-27 2016-04-27 Antitelo na igf-1r i njegova upotreba u dijagnozi kancera RS62024B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15305642 2015-04-27
PCT/EP2016/059338 WO2016174053A1 (en) 2015-04-27 2016-04-27 Igf-1r antibody and its use for the diagnosis of cancer
EP16722812.1A EP3288979B1 (en) 2015-04-27 2016-04-27 Igf-1r antibody and its use for the diagnosis of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62024B1 true RS62024B1 (sr) 2021-07-30

Family

ID=53039833

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210687A RS62024B1 (sr) 2015-04-27 2016-04-27 Antitelo na igf-1r i njegova upotreba u dijagnozi kancera

Country Status (31)

Country Link
US (2) US10753937B2 (sr)
EP (1) EP3288979B1 (sr)
JP (2) JP2018516877A (sr)
KR (1) KR102350251B1 (sr)
CN (1) CN107690439B (sr)
AR (1) AR104413A1 (sr)
AU (1) AU2016254661B2 (sr)
BR (1) BR112017022974A2 (sr)
CA (1) CA2983548C (sr)
CY (1) CY1124070T1 (sr)
DK (1) DK3288979T3 (sr)
ES (1) ES2875753T3 (sr)
HR (1) HRP20210858T1 (sr)
HU (1) HUE054402T2 (sr)
IL (1) IL255273B (sr)
LT (1) LT3288979T (sr)
MA (1) MA41987B1 (sr)
MX (1) MX382055B (sr)
MY (1) MY187583A (sr)
NZ (1) NZ736924A (sr)
PL (1) PL3288979T3 (sr)
PT (1) PT3288979T (sr)
RS (1) RS62024B1 (sr)
RU (1) RU2706967C2 (sr)
SA (1) SA517390248B1 (sr)
SI (1) SI3288979T1 (sr)
TN (1) TN2017000451A1 (sr)
TW (1) TWI740824B (sr)
UA (1) UA121047C2 (sr)
WO (1) WO2016174053A1 (sr)
ZA (1) ZA201707249B (sr)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6968790B2 (ja) 2015-10-26 2021-11-17 ピエール、ファーブル、メディカマン Ｉｇｆ−１ｒ発現癌の処置のための組成物
CN111065653A (zh) * 2017-05-23 2020-04-24 中央研究院 藉由预靶向的双特异性聚乙二醇结合抗体将聚乙二醇化试剂条件性内吞用于诊断和治疗
RU2713795C1 (ru) * 2019-06-13 2020-02-07 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ прогнозирования возможности озлокачествления опухоли яичника у женщин репродуктивного возраста

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101415728A (zh) * 2006-03-28 2009-04-22 比奥根艾迪克Ma公司 抗-igf-1r抗体及其用途
EA200802061A1 (ru) * 2006-03-28 2009-04-28 Байоджен Айдек Эмэй Инк. Антитело или его фрагмент, специфично связывающееся с рецептором 1 инсулиноподобного фактора роста (igf-r1) (варианты), композиция на его основе, полинуклеотид, кодирующий вариабельную область антитела (варианты), содержащие полинуклеотид композиция (варианты) и вектор, содержащая вектор клетка-хозяин (варианты), способ продуцирования антитела или его фрагмента (варианты) и способ лечения гиперпролиферативного заболевания у животного организма
FR2906533B1 (fr) * 2006-09-28 2013-02-22 Pf Medicament Procede de generation d'anticorps actifs contre un antigene de resistance,anticorps obtenus par ledit procede et leurs utilisations
WO2008079849A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Genentech, Inc. Antibodies to insulin-like growth factor receptor
US20130084243A1 (en) * 2010-01-27 2013-04-04 Liliane Goetsch Igf-1r specific antibodies useful in the detection and diagnosis of cellular proliferative disorders
WO2009032145A1 (en) * 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Anti-igf-1r antibodies and uses thereof
EP2172485A1 (en) * 2008-10-01 2010-04-07 Pierre Fabre Medicament Novel anti CXCR4 antibodies and their use for the treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
TWI740824B (zh) 2021-10-01
AU2016254661A1 (en) 2017-11-23
CN107690439A (zh) 2018-02-13
JP2020143122A (ja) 2020-09-10
SA517390248B1 (ar) 2021-12-02
RU2017140467A3 (sr) 2019-05-31
IL255273B (en) 2020-04-30
HRP20210858T1 (hr) 2021-07-23
HUE054402T2 (hu) 2021-09-28
RU2706967C2 (ru) 2019-11-21
MA41987A (fr) 2018-03-07
JP2018516877A (ja) 2018-06-28
CY1124070T1 (el) 2022-05-27
WO2016174053A1 (en) 2016-11-03
MA41987B1 (fr) 2021-05-31
IL255273A0 (en) 2017-12-31
PT3288979T (pt) 2021-04-30
KR20170138466A (ko) 2017-12-15
CA2983548C (en) 2021-12-14
AU2016254661B2 (en) 2020-04-23
DK3288979T3 (da) 2021-04-26
CN107690439B (zh) 2021-10-29
MX2017013808A (es) 2018-06-13
UA121047C2 (uk) 2020-03-25
HK1243434A1 (zh) 2018-07-13
MX382055B (es) 2025-03-13
KR102350251B1 (ko) 2022-01-11
AR104413A1 (es) 2017-07-19
US20190049457A1 (en) 2019-02-14
LT3288979T (lt) 2021-05-10
MY187583A (en) 2021-09-30
US20210018508A1 (en) 2021-01-21
ZA201707249B (en) 2020-03-25
US10753937B2 (en) 2020-08-25
CA2983548A1 (en) 2016-11-03
EP3288979B1 (en) 2021-03-17
EP3288979A1 (en) 2018-03-07
SI3288979T1 (sl) 2021-09-30
TW201643191A (zh) 2016-12-16
NZ736924A (en) 2022-05-27
TN2017000451A1 (en) 2019-04-12
PL3288979T3 (pl) 2021-09-13
JP6977105B2 (ja) 2021-12-08
ES2875753T3 (es) 2021-11-11
BR112017022974A2 (pt) 2018-07-24
RU2017140467A (ru) 2019-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6977105B2 (ja) Ｉｇｆ−１ｒ抗体および癌の診断のためのその使用
EP3288978B1 (en) Igf-1r antibody and its use for the diagnosis of cancer
BR112017022635B1 (pt) Anticorpo anti-igf-1r, kits, e métodos para a detecção in vitro ou ex vivo da presença e/ou localização de células tumorais expressando igf-1r em um indivíduo, para a detecção in vitro ou ex vivo da percentagem de células tumorais que expressam igf-1r em um indivíduo, para a determinação in vitro ou ex vivo do nível de expressão de igf-1r em células tumorais em um indivíduo, para a determinação in vitro ou ex vivo da pontuação de igf-1r de células tumorais ou de um tumor em um indivíduo, para determinar se um transtorno oncogênico é suscetível ao tratamento com uma droga de anticorpo tendo como alvo a via de igf-1r, para a determinação in vitro ou ex vivo da eficácia de um regime terapêutico conce(...)
HK1243434B (zh) Igf-1r抗体及其诊断癌症的用途
OA18453A (en) IGF-1R antibody and its use for the diagnosis of cancer
HK1248730B (zh) Igf-1r抗体及其用於癌症诊断的用途
HK1183311A (en) Novel antibody for the diagnosis and/or prognosis of cancer