CN101415728A - 抗-igf-1r抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及结合胰岛素样生长因子受体－1(IGF－1R)的抗体及其用途，特别在癌症诊断和治疗中的用途。提供了抑制IGF－1R－介导的促生存和肿瘤增殖途径的特异性人和鼠单克隆抗体及其变体，片段和衍生物。还提供了阻断配体，胰岛素样生长因子1(IGF－1)和胰岛素样生长因子2(IGF－2)结合IGF－1R的能力的特异性人和鼠单克隆抗体，以及该种抗体的片段，变体和衍生物。本发明还包括编码上述抗体或其片段，变体或衍生物的多聚核苷酸，以及包含该种多聚核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步包括采用本发明的抗体诊断和治疗癌症的方法。
Description
背景技术
[0001]一系列流行病学研究显示高于正常循环水平的IGF-1与多种常见癌症风险的提高密切相关，其中包括乳腺癌(Hankinson等人，Lancet 1998.351：1393-6)，前列腺癌(Chan等人，Science.1998.279：563-6)，肺癌(Yu等人，J.Natl.Cancer Inst.1999.91：151-6)和结直肠癌(Ma等人，J.Natl.Cancer Inst.1999.91：620-5)。IGF-2循环水平的上升同样显示与子宫内膜癌的风险上升有关(Jonathan等人，Cancer Biomarker & Prevention.2004.13：748-52)。与此相反，据观察IGF结合蛋白，IGF-BP3之一和癌症风险的水平上升则呈负相关。此外，还在癌症患者中发现了IGFs的水平上升(Peyrat等人Eur.J.Cancer.1993.351：1393-6；Jonathan等人，Cancer Biomarker &Prevention.2004.13：748-52)。
[0002]IGF系统在调节细胞增殖，分化，凋亡和转化中扮演了重要的角色(Jones等人，Endocrinology Rev.1995.16：3-34)。IGF系统包含了两种不相关的受体类型，胰岛素样生长因子受体1(IGF-1R；CD221)和胰岛素样生长因子受体2(IGF-2R；CD222)；两种配体，胰岛素样生长因子1(IGF-1和IGF-2)；多种IGF结合蛋白(IGFBP-1至IGFBP-6)。此外，多种IGFBP蛋白酶(例如，半胱天冬酶，金属蛋白酶，前列腺-特异性抗原)可水解IGF结合的IGFBP以释放游离IGFs，后者随后与IGF-1R和IGF-2R相互作用。IGF系统还可紧密结合胰岛素和胰岛素受体(Moschos等人.Oncology 2002.63：317-32；Baserga等人.，Int J.Cancer.2003.107：873-77；Pollak等人.，Nature Reviews Cancer.2004.4：505-516)。
[0003]在癌症细胞中，受体酪氨酸激酶(TK)在胞外肿瘤微环境和控制多种细胞功能(例如，细胞分裂周期，存活，凋亡，基因表达，细胞骨架结构，细胞附着以及细胞迁移)的胞内信号转导途径的联系中扮演重要的角色。由于控制细胞信号转导的机制已经得到了较好的理解，因而可通过靶向信号转导事件中的配体结合，受体表达/循环，受体激活和所涉及蛋白的水平来开发破毁一种或多种该类细胞功能的治疗策略(Hanahan和Weinberg，Cell 2000.100：57-70)。
[0004]I型胰岛素样生长因子受体(IGF-1R，CD221)属于受体酪氨酸激酶(RTK)家族(Ullrich等人.，Cell.1990.，61：203-12)。IGF-1R被广泛表达，其配体IGF-1和IGF-2在出生前和出生后发育，生长激素响应，细胞转化，存活中具有重要作用，并与扩散和转移肿瘤表型的获得具有关联(Baserga，Cell.1994.79：927-30；Baserga等人.，Exp.Cell Res.1999.253：1-6，Baserga等人.，Int J.Cancer.2003.107：873-77)。免疫组化研究显示一系列人肿瘤表达更高水平的IGF-1R。
[0005]IGF-1R的分子构造包含两个胞外α亚基(130-135 kD)和两个包含胞浆催化激酶区的跨膜β亚基(95kD)。与胰岛素受体(InsR)相同，IGF-1R由于具有共价二聚体(α2β2)结构而区别于其它RTK家族成员。IGF-1R在结构上与LnsR高度相关(Pierre De Meyts和Whittaker，Nature Reviews Drug Discovery.2002，1：769-83)。IGF-1R在激酶区与InsR具有84％的序列一致性，而在近膜区和c-末端区分别占有61％和44％的序列一致性(Ulrich等人.，EMBO J.，1986，5：2503-12；Blakesley等人.，Cytokine Growth Factor Rev.，1996.7：153-56)。
[0006]IGF-1和IGF-2是IGF-1R的两个激活配体。IGF-1和IGF-2与α链的结合可诱发构型变化，从而导致在特定酪氨酸残基的各β-链发生自身磷酸化，将受体由未磷酸化状态转化为激活状态。激酶区活化环中三个酪氨酸残基(在1131，1135和1136的Tyr残基)的活化可增强催化活性，该活性可引发如IRS-I和She衔接蛋白等底物的对接和磷酸化。这些底物的活化导致了存活(PI3K，AKT，TOR，S6)和/或增殖(丝裂原活化的蛋白激酶，p42/p44)的信号转导级联中涉及的其它蛋白的磷酸化(PoUak等人.，NatureReviews Cancer.2004.4：505-516；Baserga等人.，Biochem BiophysAct.1997.1332：F105-F126；Baserga等人，Int.J.Cancer.2003.107：873-77)。
[0007]尽管在IGF-1R和InsR之间具有高度的同源性，有证据显示这两个受体具有截然不同的生物作用；InsR是葡萄糖运输和糖原和脂肪生物合成等生理功能的关键调节剂，而IGF-1R是细胞生长和分化的潜在调节剂。与InsR不同，IGF-1R在组织中普遍表达并对组织生长产生作用，它受到调节IGF-1的生长激素(GH)的控制。尽管据显示IGF-1R活化促进普通细胞生长，实验证据提示IGF-1R并非绝对必需(Baserga等人，Exp Cell Res.1999.253：1-6；Baserga等人，Int.J.Cancer.2003.107：873-77)。
[0008]IGFs在调节细胞增殖，分化和凋亡中具有至关重要的作用。据显示对IGF-1R介导的信号转导的抑制可以降低肿瘤生长率，增加凋亡，提高化疗和其它分子靶向治疗对肿瘤的杀伤(综述参见Pollak等人.，Nature Reviews Cancer.2004.4：505-516；Zhang等人.，Breast Cancer Res.2000.2：170-75；Chakravarti等人，CancerRes.2002.62：200-07)。
[0009]抑制肿瘤中IGF-1R功能实验取得了鼓舞人心但也颇为有限的成就，且它们在治疗癌症中的作用尚待临床检验。这些实验方法包括：针对IGF-1R的抗体(KuIl等人.，J.Biol.Chem.1983，258：6561-66；Kalebic等人.，Cancer Res.1994.54：5531-4)，针对IGF-1或IGF-2的中和抗体(Fang等人，Mol.Cancer Therapy.2006.5：114-20；Miyamoto等人，Clin.Cancer Res.2005，11：3494-502)，小分子酪氨酸激酶抑制剂(Garcia-Escheverria等人，Cancer Cell.2004.5：231-9；Scotlandi等人，Cancer Res.2005.65：3868-76)，反义寡聚核苷酸(Shapiro等人，J.Clin.Invest.1994.94：1235-42；Wraight等人.NatureBiotech.2000.18：521-26；Scotlandi等人，Cancer GeneTherapy.2002.9：296-07)，IGF-1R的显性-阴性突变体(Prager等人，Proc.Natl.Acad.Sci.1994，91：2181-85；Kalebic等人.，Int.J.Cancer1998.76：223-7；Scotlandi等人.，Int J.Cancer.2002：101：11-6)，IGF配体类似物(Pietrzkowski等人，Mol.Cell.Biol.1992.12：3883-89)，重组IGF结合蛋白(Yee等人.Cell growth Differ.1994.5：73-77；VanDen Berg等人，Eur.J.Cancer.1997，33：1108-1113；Jerome等人AACR 2004，Abstract # 5334)，GH释放激素拮抗剂，GHRH(Szereday等人，Cancer Res.2003.63：7913-19；Letsh等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA.2003.100：1250-55)以及GH(Kopchick等人，2002.Endocr.Rev.23，623-46)。
[0010]抗体抑制IGF-1R功能的能力首先可通过靶向IGF-1Rα亚基中未知表位的小鼠单克隆抗体(α-IR3)得到证实(KuIl等人.，J.Biol.Chem.1983，258：6561-66)。后续开发的针对IGF-1R α亚基的其它抗体在不同的实验癌症模型中显示了对IGF-1R功能不同程度的抑制(Maloney等人.Cancer Res.2003.63：5073-83；Burtrum等人，Cancer Res.2003.63：8912-21；Sachdev D等人，Cancer Res.2003.63，627-35；Cohen等人，Clin.Cancer Res.2005.11：3065-74；Goetsch等人，Intl.J.Cancer.2005.113：316-28.Lu等人，J.Biol.Chem.2004.280：19665-72)。
[0011]在癌症细胞中，除了促生存和增殖信号转导，IGF-1R的活化还显示参与运动和侵入(Ress等人.，Oncogene 2001.20：490-00，Nolan等人，Int.J.Cancer.1997.72：828-34，Stracke等人，J.Biol.Chem.1989.264：21544-49；Jackson等人，Oncogene，2001.20：7318-25)。
[0012]据显示肿瘤细胞可生产IGF系统的一种或多种成分(IGF-1，IGF-2，IGF-1R，IGF-2R和IGF-BPs)。尽管体外研究表明肿瘤可以生产IGF-1或IGF-2，翻译研究表明IGF-2在肿瘤中为更加相关的更普遍表达的IGF。这是由于肿瘤中沉默IGF-2等位基因由于表遗传变异而印迹丢失(LOI)时导致了IGF-2基因的双等位基因表达(Fienberg等人.，Nat.Rev.Cancer 2004.4：143-53；Giovannucci等人，Horm.Metab.Res.2003.35：694-04；De Souza等人，FASEB J.等人，1997.11：60-7)。这反过来向癌症细胞和支持肿瘤生长的微环境提供了更多的IGF-2。
[0013]IGF-1R敏感肿瘤接受来自循环的IGF-1(肝生成)和来自肿瘤的IGF-2的受体活化信号，因此目标为同时破坏IGF-1和IGF-2介导的生物活性的方法应能提供更好的抗肿瘤应答。因此，能同时有效阻断IGF-1和IGF-2介导的生物功能的抗-IGF-1R抗体方法可相对其它未能有效阻断肿瘤微环境中IGF-1和IGF-2介导的IGF-1R信号转导的生物功能的方法提供更好的疗效。
[0014]对于安全性，IGF-1R有着普遍表达，因此针对IGF-1R的抗体对于避免由普通组织中ADCC和CDC活性产生的毒性具有极小的或是不具有效应功能。开发该类抗体的一种可能是包含不介导ADCC或CDC功能的人gamma4Fc区的非糖基化形式。
[0015]IGF-1R涉及致癌基因介导的细胞转化。
[0016]IGF/IGF-1R活化介导癌症细胞中的促分裂和促生存信号转导。
[0017]IGF-1R活化还促进细胞运动和转移。
[0018]IGF-1R在多种癌症中过量表达。
[0019]具有高于普通的循环IGF水平的个体形成癌症的风险更高。
[0020]在许多癌症患者中发现了提高的IGF 1和2的血浆水平。
[0021]人肿瘤生产IGF-2作为自分泌生长因子。
[0022]以单种制剂和联合化疗和生物制剂均证实了肿瘤生长的抑制。
[0023]在本领域仍存在对用于治疗各种肿瘤性疾病(包括癌症及其转移瘤)的具有不同的或是改善的结合，效力和安全特性的IGF-1R抗体的需求。
发明概述
[0024]本发明基于IGF系统在调节细胞增殖，分化，凋亡和转化中的重要作用。特别的，I型胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)及其配体IGF-1和IGF-2在出生前和出生后发育，生长激素响应，细胞转化，存活中具有重要作用，并与扩散和转移肿瘤表型的获得具有关联。本发明一般涉及IGF-1R抗体，其抗原结合片段或衍生物。特定的IGF-1R抗体和抗原结合片段抑制IGF-1R功能或阻断IGF-1和IGF-2介导的IGF-1R信号转导的生物功能。此外，本发明一般涉及各种肿瘤性疾病(包括癌症和转移瘤)，以及各种与IGF-1R信号转导相关的高度增殖疾病，紊乱或损伤的治疗方法。
[0025]在部分实施方式中，本发明提供了与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同IGF-R1表位的分离抗体或其抗原结合片段。
[0026]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段竞争性抑制选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体结合IGF-R1。
[0027]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体相同的抗原结合区。
[0028]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的重链可变区(VH)包含与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63的参考氨基酸序列至少具有90％一致性的氨基酸序列。
[0029]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的轻链可变区(VL)包含与选自SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118的参考氨基酸序列至少具有90％一致性的氨基酸序列。
[0030]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了20个或更少保守氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQID NO：14，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：32，SEQ IDNO：38，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：53，SEQ IDNO：58和SEQ ID NO：63的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列。
[0031]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了20个或更少保守氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：73，SEQID NO：78，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：93，SEQ IDNO：98，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：113和SEQID NO：118的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列。
[0032]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含选自SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63的氨基酸序列。
[0033]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含选自SEQ IDNO：68，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：83，SEQ IDNO：88，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：103，SEQ IDNO：108，SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118的氨基酸序列。
[0034]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH和VL分别包含与选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ IDNO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；和SEQ IDNO：63和118的参考氨基酸序列具有至少90％一致性的氨基酸序列。
[0035]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH和VL分别包含除了各有20个或更少的保守氨基酸替换以外与选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ IDNO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQID NO：58和SEQ ID NO：113；和SEQ ID NO：63和118的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列。
[0036]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH和VL分别包含选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ IDNO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；和SEQ IDNO：63和118的氨基酸序列。
[0037]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了两个或更少氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：15，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：33，SEQ IDNO：44，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：59和SEQ IDNO：64的参考VH-CDR1氨基酸序列一致的Kabat重链决定簇互补区-1(VH-CDR1)氨基酸序列。在进一步的实施方式中，该VH-CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64。
[0038]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：11，SEQ IDNO：16，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：34，SEQ IDNO：45，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：60和SEQ IDNO：65的参考VH-CDR2氨基酸序列一致的Kabat重链决定簇互补区-2(VH-CDR2)氨基酸序列。在进一步的实施方式中，该VH-CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：65。
[0039]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：17，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：35，SEQ IDNO：46，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：61和SEQ IDNO：66的参考VH-CDR3氨基酸序列一致的Kabat重链决定簇互补区-3(VH-CDR3)氨基酸序列。在进一步的实施方式中，该VH-CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：66。
[0040]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：74，SEQ IDNO：79，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：94，SEQ IDNO：104，SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：114以及SEQ ID NO：119的参考VL-CDR1氨基酸序列一致的Kabat轻链决定簇互补区1(VL-CDR1)氨基酸序列。在进一步的实施方式中，该VL-CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：114以及SEQ ID NO：119。
[0041]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了两个或更少氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：75，SEQ IDNO：80，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：95，SEQ IDNO：105，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：115以及SEQ ID NO：120的参考VL-CDR2氨基酸序列一致的Kabat轻链决定簇互补区-2(VL-CDR2)氨基酸序列。在进一步的实施方式中，该VL-CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：115以及SEQ ID NO：120。
[0042]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：76，SEQ IDNO：81，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：96，SEQ IDNO：106，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：116以及SEQ ID NO：121的参考VL-CDR3氨基酸序列一致的Kabat轻链决定簇互补区-3(VL-CDR3)氨基酸序列。在进一步的实施方式中，该VL-CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：116以及SEQ ID NO：121。
[0043]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了在至少一个所述VH-CDRs中一个，两个，三个或四个氨基酸替换外选自SEQ ID NOs：5，6和7；SEQ ID NOs：10，11和12；SEQ ID NOs：15，16和17；SEQ ID NOs：21，22和23；SEQ ID NOs：27，28和29；SEQID NOs：33，34和35；SEQ ID NOs：39，40和41；SEQ ID NOs：44，45和46；SEQ ID NOs：49，50和51；SEQ ID NOs：54，55和56；SEQ IDNOs：59，60和61；以及SEQ ID NOs：64，65和66的VH-CDR1，VH-CDR2，和VH-CDR3氨基酸序列。
[0044]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含选自SEQ IDNOs：5，6和7；SEQ ID NOs：10，11和12；SEQ ID NOs：15，16和17；SEQ ID NOs：21，22和23；SEQ ID NOs：27，28和29；SEQ ID NOs：33，34和35；SEQ ID NOs：39，40和41；SEQ ID NOs：44，45和46；SEQ ID NOs：49，50和51；SEQ ID NOs：54，55和56；SEQ ID NOs：59，60和61；以及SEQ ID NOs：64，65和66的VH-CDR1，VH-CDR2，和VH-CDR3氨基酸序列。
[0045]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了在至少一个所述VL-CDRs中一个，两个，三个或四个氨基酸替换外选自SEQ ID NOs：69，70和71；SEQ ID NOs：74，75和76；SEQ ID NOs：79，80和81；SEQ ID NOs：84，85和86；SEQ ID NOs：89，90和91；SEQ ID NOs：94，95和96；SEQ ID NOs：99，100和101；SEQ ID NOs：104，105和106；SEQ ID NOs：109，110和111；SEQ ID NOs：114，115和116；和SEQ ID NOs：119，120和121的VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列。
[0046]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含选自SEQ IDNOs：69，70和71；SEQ ID NOs：74，75和76；SEQ ID NOs：79，80和81；SEQ ID NOs：84，85和86；SEQ ID NOs：89，90和91；SEQ IDNOs：94，95和96；SEQ ID NOs：99，100和101；SEQ ID NOs：104，105和106；SEQ ID NOs：109，110和111；SEQ ID NOs：114，115和116；和SEQ ID NOs：119，120和121的VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列。
[0047]在上述抗体或其片段的不同实施方式中，该VH框架区和/或VL框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
[0048]在部分实施方式中，上述抗体或其片段结合线性表位或非线性构型表位。
[0049]在部分实施方式中，上述抗体或其片段为多价体，并包含至少两条重链和至少两条轻链。
[0050]在部分实施方式中，上述抗体或其片段为多特异性抗体或片段。在进一步的实施方式中，上述抗体或其片段为双特异性抗体或片段。
[0051]在上述抗体或其片段的不同实施方式中，该重和轻链可变区为完全人源。在进一步的实施方式中，该重和轻链可变区为选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的单克隆Fab抗体片段。
[0052]在上述抗体或其片段的不同实施方式中，该重和轻链可变区为完全鼠源。在进一步的实施方式中，该重和轻链可变区来自于由选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的单克隆抗体。
[0053]在不同的实施方式中，上述抗体或其片段为人源化抗体或片段。
[0054]在不同的实施方式中，上述抗体或其片段为嵌合抗体或片段。
[0055]在不同的实施方式中，上述抗体或其片段为灵长源化抗体或片段。
[0056]在不同的实施方式中，上述抗体或其片段为完全人源抗体或片段。
[0057]在特定实施方式中，上述抗体或其片段为Fab片段，Fab’片段，F(ab)2片段，或Fv片段。
[0058]在特定实施方式中，上述抗体或其片段为单链抗体。
[0059]在特定实施方式中，上述抗体或其片段包含选自人kappa恒定区和人lambda恒定区的轻链恒定区。
[0060]在特定实施方式中，上述抗体或其片段包含重链恒定区或其片段。在进一步的实施方式中，该重链恒定区或其片段为人IgG4。在其它特定的实施方式中，该IgG4被突变去除糖基化位点。在进一步的实施方式中，该IgG4突变包含Kabat编号系统的S241P和T318A。
[0061]在特定的实施方式中，上述抗体或其片段通过以解离常数(KD)低于对所述参考单克隆抗体的KD表征的亲和力特异性结合IGF-R1多肽或其片段，或是IGF-R1变体多肽。在进一步的实施方式中，该解离常数(KD)不大于5 x 10-2M，10-2M，5 x 10-3M，10-3M，5 x 10-4M，10-4M，5 x 10-5M，10-5M，5 x 10-6M，10-6M，5 x 10-7M，10-7M，5 x 10-8M，10-8M，5 x 10-9M，10-9M，5 x 10-10M，10-10M，5 x10-11M，10-11M，5 x 10-12M，10-12M，5 x 10-13M，10-13M，5 x 10-14M，10-14M，5 x 10-15M或10-15。
[0062]在部分实施方式中，上述抗体或其片段相对于鼠IGF-R1多肽或其片段或者非人灵长动物IGF-R1多肽或其片段优先结合人IGF-R1多肽或其片段。
[0063]在其它特定的实施方式中，上述抗体或其片段结合人IGF-R1多肽或其片段，还结合非人灵长动物IGF-R1多肽或其片段。
[0064]在部分实施方式中，上述抗体或其片段结合在细胞表面表达的IGF-R1。在进一步的实施方式中，该细胞为恶性细胞，肿瘤性细胞，肿瘤细胞，或转移细胞。
[0065]在部分实施方式中，上述抗体或其片段阻断胰岛素生长因子与IGF-R1的结合。在进一步的实施方式中，该胰岛素生长因子为胰岛素生长因子-1(IGF-1)或胰岛素生长因子-2(IGF-2)。在特定的实施方式中，上述抗体或其片段同时阻断IGF-1和IGF-2与IGF-R1的结合。
[0066]在部分实施方式中，上述抗体或其片段抑制IGF-R1介导的细胞增殖，IGF-1或IGF-2-介导的IGF-R1磷酸化，肿瘤细胞生长，或IGF-R1内在化。
[0067]在进一步的实施方式中，上述抗体或其片段进一步包含与其融合的外源多肽。
[0068]在部分实施方式中，上述抗体或其片段结合至选自细胞毒性剂，治疗剂，细胞抑制剂，生物毒素，前药，肽，蛋白，酶，病毒，脂质，生物应答调节剂，药物制剂，淋巴因子，外源抗体或其片段，可测标记，聚乙二醇(PEG)的制剂以及两个或多个任意所述制剂的组合。在进一步的实施方式中，该细胞毒性剂选自放射性核素，生物毒素，酶活毒素，细胞抑制或细胞毒性治疗剂，前药，免疫活性配体，生物应答调节剂，或是两个或多个任意所述细胞毒性剂的组合。在进一步的实施方式中，该可测标记选自酶，荧光标记，化学发光标记，生物发光标记，放射活性标记，或是两个或多个任意所述可测标记的组合。
[0069]在附加实施方式中，本发明包括包含上述抗体或其片段，以及载体的组合物。
[0070]本发明的特定实施方式包括包含编码抗体VH多肽的核酸的分离多聚核苷酸，其中该VH多肽的氨基酸序列与选自SEQID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：26，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：43，SEQ IDNO：48，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63的参考氨基酸序列至少具有90％一致性，且其中包含该VH多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。在进一步的实施方式中，该VH多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63。
[0071]在特定的实施方式中，编码该VH多肽的核苷酸序列在不改变该VH多肽氨基酸序列的情况下进行优化以提高表达。在进一步的实施方式中，该优化包括鉴别并去除剪接供体和剪接受体位点和/或用于表达该多聚核苷酸的细胞的密码子的优化。在进一步的实施方式中，该核酸包含选自SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQID NO：13，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：24，SEQ IDNO：25，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：36，SEQ IDNO：37，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：52，SEQ IDNO：57和SEQ ID NO：62的核苷酸序列。
[0072]在部分实施方式中，本发明提供了包含编码抗体VL多肽的核酸的分离多聚核苷酸，其中该VL多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：113以及SEQ ID NO：118的参考氨基酸序列至少具有90％一致性；且其中包含该VL多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。在进一步的实施方式中，该VL多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：113，和SEQ ID NO：118。
[0073]在特定的实施方式中，编码该VL多肽的核苷酸序列在不改变所述VL多肽氨基酸序列的情况下进行优化以提高表达。在进一步的实施方式中，该优化包括鉴别并去除剪接供体和剪接受体位点和/或用于表达该多聚核苷酸的细胞的密码子的优化。在进一步的实施方式中，该核酸包含选自SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：107，SEQ ID NO：112，和SEQ ID NO：117的核苷酸序列。
[0074]在其它特定的实施方式中，本发明提供了包含编码抗体VH多肽的核酸的分离多聚核苷酸，其中该VH多肽的氨基酸序列除了20个或更少的保守氨基酸替换之外与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63的参考氨基酸序列一致；且其中包含所述VH多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。
[0075]在部分实施方式中，本发明提供了包含编码抗体VL多肽的核酸的分离多聚核苷酸，其中该VL多肽的氨基酸序列除了20个或更少的保守氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：68，SEQ IDNO：73，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：88，SEQ IDNO：93，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：108，SEQ IDNO：113以及SEQ ID NO：118的参考氨基酸序列一致；且其中包含该VL多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。
[0076]在部分实施方式中，本发明提供了分离多聚核苷酸，其包含除了两个或更少的氨基酸替换之外与选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64的参考VH-CDR1氨基酸序列一致的VH-CDR1氨基酸序列的编码核酸；且其中包含该VH-CDR1的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。在进一步的实施方式中，该VH-CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO：5，SEQID NO：10，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：27，SEQID NO：33，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：49，SEQID NO：54，SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64。
[0077]在部分实施方式中，本发明提供了分离多聚核苷酸，其包括编码除了四个或更少的氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：65的参考VH-CDR2氨基酸序列一致的VH-CDR2氨基酸序列的核酸；且其中包含所述VH-CDR2的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。在进一步的实施方式中，该VH-CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO：6，SEQ IDNO：11，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：28，SEQ IDNO：34，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：50，SEQ IDNO：55，SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：65。
[0078]在部分实施方式中，本发明提供了分离多聚核苷酸，其包括编码除了四个或更少的氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：66的参考VH-CDR3氨基酸序列一致的VH-CDR3氨基酸序列的核酸；且其中包含所述VH-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。在进一步的实施方式中，该VH-CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：12，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：35，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：51，SEQ IDNO：56，SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：66。
[0079]在部分实施方式中，本发明提供了分离多聚核苷酸，其包括编码除了四个或更少的氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：119的参考VL-CDR1氨基酸序列一致的VL-CDR1氨基酸序列的核酸；且其中包含该VL-CDR1的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。在进一步的实施方式中，该VL-CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：119。
[0080]在部分实施方式中，本发明提供了分离多聚核苷酸，其包括编码除了两个或更少的氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120的参考VL-CDR2氨基酸序列一致的VL-CDR2氨基酸序列的核酸；且其中包含所述VL-CDR2的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。在进一步的实施方式中，该VL-CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120。
[0081]在部分实施方式中，本发明提供了分离多聚核苷酸，其包括编码除了四个或更少的氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121的参考VL-CDR3氨基酸序列一致的VL-CDR3氨基酸序列的核酸；且其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。在进一步的实施方式中，该VL-CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121。
[0082]在部分实施方式中，本发明提供了分离多聚核苷酸，其包含编码抗体VH多肽的核酸，其中该VH多肽包含选自SEQ IDNOs：5，6和7；SEQ ID NOs：10，11和12；SEQ ID NOs：15，16和17；SEQ ID NOs：21，22和23；SEQ ID NOs：27，28和29；SEQ ID NOs：33，34和35；SEQ ID NOs：39，40和41；SEQ ID NOs：44，45和46；SEQ ID NOs：49，50和51；SEQ ID NOs：54，55和56；SEQ ID NOs：59，60和61；以及SEQ ID NOs：64，65和66的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列；且其中包含该VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。
[0083]在部分实施方式中，本发明提供了分离多聚核苷酸，其包含编码抗体VL多肽的核酸，其中所述的VL多肽包含选自SEQID NOs：69，70和71；SEQ ID NOs：74，75和76；SEQ ID NOs：79，80和81；SEQ ID NOs：84，85和86；SEQ ID NOs：89，90和91；SEQ IDNOs：94，95和96；SEQ ID NOs：99，100和101；SEQ ID NOs：104，105和106；SEQ ID NOs：109，110和111；SEQ ID NOs：114，115和116；和SEQ ID NOs：119，120和121的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列；且其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。
[0084]在部分实施方式中，上述多聚核苷酸进一步包含融合至抗体VH多肽或抗体VL多肽的信号肽的编码核酸。
[0085]在其它特定的实施方式中，上述多聚核苷酸进一步包含编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH1区，编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH2区，编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH3区，或是编码融合至所述VH多肽的重链铰链区的核酸。在进一步的实施方式中，该重链恒定区为人IgG4。在其它特定的实施方式中，该IgG4被突变去除糖基化位点。在进一步的实施方式中，该IgG4突变包含Kabat编号系统的S241P和T318A。
[0086]在部分实施方式中，上述多聚核苷酸包含编码融合至所述VL多肽的轻链恒定区的核酸。在进一步的实施方式中，该轻链恒定区为人kappa。
[0087]在上述多聚核苷酸的不同实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含由该核酸编码的，与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同IGF-R1表位的多肽。
[0088]在上述多聚核苷酸的其它不同实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含由该核酸编码的，竞争性抑制选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体的多肽。
[0089]在上述多聚核苷酸的不同实施方式中，该VH多肽或VL多肽的框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
[0090]在上述多聚核苷酸的不同实施方式中，本发明提供了包含由该核酸编码的，结合线性表位或非线性构型表位的多肽的抗体或其抗原性结合片段。
[0091]在上述多聚核苷酸的不同实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为多价体，且包含了至少两条重链和至少两条轻链。
[0092]在上述多聚核苷酸的特定实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为多特异性抗体或片段。在进一步的实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为双特异性抗体或片段。
[0093]在上述多聚核苷酸的不同实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段包含了完全人源的重和轻链可变区。在进一步的实施方式中，该重和轻链可变区与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的单克隆Fab抗体片段一致。
[0094]在上述多聚核苷酸的其它特定实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段包含鼠源重和轻链可变区。在进一步的实施方式中，该重和轻链可变区与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的单克隆抗体一致。
[0095]在上述多聚核苷酸的不同实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或片段。
[0096]在上述多聚核苷酸的不同实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为灵长源化抗体或片段。
[0097]在上述多聚核苷酸的不同实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或片段。
[0098]在上述多聚核苷酸的部分实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为完全人源抗体或片段。
[0099]在上述多聚核苷酸的不同实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为Fab片段，Fab’片段，F(ab)2片段，或Fv片段。在上述多聚核苷酸的特定实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为单链抗体。
[0100]在上述多聚核苷酸的部分实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段通过以解离常数(KD)不大于5x 10-2M，10-2M，5 x 10-3M，10-3M，5 x -10-4M，10-4M，5 x 10-5M，10-5M，5 x 10-6M，10-6M，5 x 10-7M，10-7M，5 x 10-8M，10-8M，5 x10-9M，10-9M，5 x 10-10M，10-10M，5 x 10-11M，10-11M，5 x 10-12M，10-12M，5 x 10-13M，10-13M，5 x 10-14M，10-14M，5 x 10-15M或10-15M表征的亲和力特异性结合IGF-R1多肽或其片段，或IGF-R1变体多肽。
[0101]在上述多聚核苷酸的部分实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段相对于鼠IGF-R1多肽或其片段或者非人灵长动物IGF-R1多肽或其片段优先结合人IGF-R1多肽或其片段。
[0102]在上述多聚核苷酸的部分实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合人IGF-R1多肽或其片段，还结合非人灵长动物IGF-R1多肽或其片段。
[0103]在上述多聚核苷酸的部分实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合细胞表面表达的IGF-R1。在进一步的实施方式中，该细胞为恶性细胞，肿瘤性细胞，肿瘤细胞，或转移细胞。
[0104]在上述多聚核苷酸的部分实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段阻断胰岛素生长因子与IGF-R1的结合。在进一步的实施方式中，该胰岛素生长因子为胰岛素生长因子1(IGF-1)或胰岛素生长因子-2(IGF2)。在上述多聚核苷酸的其它特定实施方式中，该抗体或其抗原结合片段同时阻断IGF-1和IGF-2与IGF-R1的结合。
[0105]在上述多聚核苷酸的部分实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制IGF-R1-介导的细胞增殖，抑制IGF-1或IGF-2-介导的IGF-R1磷酸化，抑制肿瘤细胞生长或抑制IGF-R1内在化。
[0106]在部分实施方式中，上述多聚核苷酸进一步包含编码外源多肽的核酸。
[0107]在上述多聚核苷酸的部分实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段被结合至选自细胞毒性剂，治疗剂，细胞抑制剂，生物毒素，前药，肽，蛋白，酶，病毒，脂质，生物应答调节剂，药物制剂，淋巴因子，外源抗体或其片段，可测标记，聚乙二醇(PEG)的制剂以及两个或多个任意所述制剂的组合。在进一步的实施方式中，该细胞毒性剂选自放射性核素，生物毒素，酶活毒素，细胞抑制或细胞毒性治疗剂，前药，免疫活性配体，生物应答调节剂，或是两个或多个任意所述细胞毒性剂的组合。在其它特定的实施方式中，该可测标记选自酶，荧光标记，化学发光标记，生物发光标记，放射活性标记，或是两个或多个任意所述可测标记的组合。
[0108]在部分实施方式中，本发明提供了包含上述多聚核苷酸的组合物。
[0109]在其它特定的实施方式中，本发明提供了包含上述多聚核苷酸的载体。在进一步的实施方式中，该多聚核苷酸被可操作地连接至启动子。在附加的实施方式中，本发明提供了包含该种载体的宿主细胞。在进一步的实施方式中，本发明提供了其中多聚核苷酸被可操作地连接至启动子的载体。
[0110]在附加的实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的生产方法，其包括培养带有包含上述多聚核苷酸的载体的宿主细胞，并回收所述抗体或其片段。在进一步的实施方式中，本发明提供了通过上述方法生产的分离多肽。
[0111]在部分实施方式中，本发明提供了由上述多聚核苷酸编码的分离多肽。
[0112]在上述多聚核苷酸的进一步实施方式中，该抗体或其片段包含特异性结合IGF-1R的多肽。其它实施方式包括包含上述多肽的分离抗体或其片段。
[0113]在部分实施方式中，本发明提供了包含分离VH编码多聚核苷酸和分离VL编码多聚核苷酸的组合物，其中该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸分别包含与选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ IDNO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQID NO：58和SEQ ID NO：113；和SEQ ID NO：63和118的参考氨基酸序列具有至少90％一致性的氨基酸序列的编码核酸；且其中由该VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段特异性结合IGF-R1。在进一步的实施方式中，该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸分别包含选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ IDNO：113；和SEQ ID NO：63和118的氨基酸序列的编码核酸。
[0114]在其它特定实施方式中，本发明提供了包含分离VH编码多聚核苷酸和分离VL编码多聚核苷酸的组合物，其中该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸分别包含除了少于20个保守氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ IDNO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ IDNO：113；和SEQ ID NO：63和118的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列的编码核酸；且其中由该VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段特异性结合IGF-R1。在进一步的实施方式中，该VH编码多聚核苷酸编码包含选自SEQ ID NOs：5，6和7；SEQ ID NOs：10，11和12；SEQ ID NOs：15，16和17；SEQ ID NOs：21，22和23；SEQ ID NOs：27，28和29；SEQ ID NOs：33，34和35；SEQ ID NOs：39，40和41；SEQ ID NOs：44，45和46；SEQ ID NOs：49，50和51；SEQ ID NOs：54，55和56；SEQ ID NOs：59，60和61；以及SEQ IDNOs：64，65和66的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列的VH多肽；其中该VL编码多聚核苷酸编码包含选自SEQ ID NOs：69，70和71；SEQ ID NOs：74，75和76；SEQ ID NOs：79，80和81；SEQ ID NOs：84，85和86；SEQ ID NOs：89，90和91；SEQ ID NOs：94，95和96；SEQ ID NOs：99，100和101；SEQ ID NOs：104，105和106；SEQ ID NOs：109，110和111；SEQ ID NOs：114，115和116；和SEQ ID NOs：119，120和121的VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列的VL多肽；且其中由该VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段特异性结合IGF-R1。
[0115]在上述组合物的不同实施方式中，该VH编码多聚核苷酸进一步包含编码被融合至抗体VH多肽的信号肽的核酸。
[0116]在上述组合物的不同实施方式中，该VL编码多聚核苷酸进一步包含编码被融合至抗体VL多肽的信号肽的核酸。
[0117]在上述组合物的部分实施方式中，该VH编码多聚核苷酸进一步包含编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH1区的核酸，进一步包含编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH2区的核酸，进一步包含编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH3区的核酸，或是进一步包含编码融合至所述VH多肽的重链铰链区的核酸。在进一步的实施方式中，该重链恒定区为人IgG4。在其它特定的实施方式中，该IgG4被突变去除糖基化位点。在进一步的实施方式中，该IgG4突变包含Kabat编号系统的S241P和T318A。
[0118]在上述组合物的部分实施方式中，该VL编码多聚核苷酸进一步包含编码被融合至该VL多肽的轻链恒定区的核酸。在进一步的实施方式中，该轻链恒定区为人kappa。
[0119]在上述组合物的部分实施方式中，由该VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同IGF-R1表位。
[0120]在上述组合物的部分实施方式中，由该VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段竞争性抑制选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合IGF-R1。
[0121]在上述组合物的部分实施方式中，该VH多和VL多肽的框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
[0122]在上述组合物的部分实施方式中，由该VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段结合线性表位或非线性构型表位。
[0123]在上述组合物的部分实施方式中，由该VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段为多价体，且包含了至少两条重链和至少两条轻链。
[0124]在上述组合物的部分实施方式中，由该VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段为多特异性抗体或片段。在进一步的实施方式中，由该VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段为双特异性抗体或片段。
[0125]在上述组合物的部分实施方式中，由该VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段包含完全人源的重和轻链可变区。在进一步的实施方式中，该重和轻链可变区与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的单克隆Fab抗体片段一致。
[0126]在上述组合物的部分实施方式中，由该VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段包含鼠源重和轻链可变区。在进一步的实施方式中，该重和轻链可变区与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的单克隆抗体一致。
[0127]在上述组合物的不同实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或片段。
[0128]在上述组合物的不同实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为灵长源化抗体或片段。
[0129]在上述组合物的不同实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或片段。
[0130]在上述组合物的部分实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为完全人源抗体或片段。
[0131]在上述组合物的不同实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为Fab片段，Fab’片段，F(ab)2片段，或Fv片段。在上述组合物的特定实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为单链抗体。
[0132]在上述组合物的部分实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段通过以解离常数(KD)不大于5 x 102M，10-2M，5 x 2-3M，106-3M，5 x -10-4M，10-4M，5 x 10-5M，10-5M，5 x 10-6M，10-6M，5 x 10-7M，10-7M，5 x 10-8M，10-8M，5 x 10-9M，10-9M，5 x 15-10M，10-10M，5 x 10-11M，10-11M，5 x 10-12M，10-12M，5 x 10-13M，10-13M，5 x 10-14M，10-14M，5 x 10-15M或10-15M表征的亲和力特异性结合IGF-R1多肽或其片段，或IGF-R1变体多肽。
[0133]在上述组合物的部分实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段相对于鼠IGF-R1多肽或其片段或者非人灵长动物IGF-R1多肽或其片段优先结合人IGF-R1多肽或其片段。
[0134]在上述组合物的部分实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合人IGF-R1多肽或其片段，还结合非人灵长动物IGF-R1多肽或其片段。
[0135]在上述组合物的部分实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合细胞表面表达的IGF-R1。在进一步的实施方式中，该细胞为恶性细胞，肿瘤性细胞，肿瘤细胞，或转移细胞。
[0136]在上述组合物的部分实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段阻断胰岛素生长因子与IGF-R1的结合。在进一步的实施方式中，该胰岛素生长因子为胰岛素生长因子1(IGF-1)或胰岛素生长因子-2(IGF2)。在上述组合物的其它特定实施方式中，该抗体或其抗原结合片段同时阻断IGF-1和IGF-2与IGF-R1的结合。
[0137]在上述组合物的部分实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制IGF-R1-介导的细胞增殖，抑制IGF-1或IGF-2-介导的IGF-R1磷酸化，抑制肿瘤细胞生长或抑制IGF-R1内在化。
[0138]在上述组合物的部分实施方式中，该VH编码多聚核苷酸，该VL编码多聚核苷酸，或是该VH和该VL编码多聚核苷酸两者进一步包含编码外源性多肽的核酸。
[0139]在上述组合物的部分实施方式中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段被结合至选自细胞毒性剂，治疗剂，细胞抑制剂，生物毒素，前药，肽，蛋白，酶，病毒，脂质，生物应答调节剂，药物制剂，淋巴因子，外源抗体或其片段，可测标记，聚乙二醇(PEG)的制剂以及两个或多个任意所述制剂的组合。在进一步的实施方式中，该细胞毒性剂选自放射性核素，生物毒素，酶活毒素，细胞抑制或细胞毒性治疗剂，前药，免疫活性配体，生物应答调节剂，或是两个或多个任意所述细胞毒性剂的组合。在其它特定的实施方式中，该可测标记选自酶，荧光标记，化学发光标记，生物发光标记，放射活性标记，或是两个或多个任意所述可测标记的组合。
[0140]在上述组合物的部分实施方式中，该VH编码多聚核苷酸包含于第一载体，而该VL编码多聚核苷酸包含于第二载体。在进一步的实施方式中，该VH编码多聚核苷酸被选择性连接至第一启动子而该VL编码多聚核苷酸被选择性地连接至第二启动子。在其它特定的实施方式中，该第一和第二启动子为同一启动子的拷贝。在进一步的实施方式中，该第一和第二启动子不一致。
[0141]在上述组合物的不同实施方式中，该第一和第二载体包含于单个宿主细胞。
[0142]在上述组合物的其它特定实施方式中，该第一和第二载体包含于独立的宿主细胞。
[0143]在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的生产方法，其包括培养上述宿主细胞，并回收该抗体或其片段。
[0144]在其它实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的生产方法，其包括共培养上述独立的宿主细胞，并回收该抗体或其片段。在上述方法的进一步实施方式中，本发明提供了合并该VH和VL编码多肽，并回收该抗体或其片段。
[0145]在部分实施方式中，本发明提供了由上述方法生产的特异性结合IGF-1R的抗体或其片段。
[0146]在部分实施方式中，本发明提供了其中该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸在相同载体上的组合物，及其中的载体。
[0147]在上述载体的不同实施方式中，该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸分别可操作地连接至启动子。
[0148]在上述载体的不同实施方式中，该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸进行框内融合，从与之可操作连接的单个启动子进行共同转录，并共同翻译成一种单链抗体或其抗原结合片段。
[0149]在上述载体的不同实施方式中，该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸从与之可操作连接的单个启动子进行共同转录，但单独翻译。在进一步的实施方式中，该载体进一步包含位于该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸之间的一种IRES序列。在其它特定的实施方式中，该编码VH的多聚核苷酸编码和该编码VL的多聚核苷酸分别可操作地连接至单独启动子并单独转录。在进一步的实施方式中，该独立的启动子为同一启动子的拷贝或该独立的启动子不一致。
[0150]在部分实施方式中，本发明提供了包含上述载体的宿主细胞。
[0151]在其它实施方式中，本发明提供了特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的生产方法，其包括培养上述宿主细胞，并回收该抗体或其片段。
[0152]在部分实施方式中，本发明提供了由上述方法生产的特异性结合IGF-1R的抗体或其片段。
[0153]在部分实施方式中，本发明提供了在动物中治疗高度增殖紊乱的方法，其包括向需要治疗的动物施用包含以下成分的组合物：a)上述分裂抗体或其片段；以及b)药学可接受的载体。在进一步的实施方式中，该高度增殖疾病或紊乱选自癌症，肿瘤，瘤，恶性肿瘤或其转移瘤。
[0154]在上述方法的不同实施方式中，该抗体或其片段特异性结合在恶性细胞表面表达的IGF-1R。在进一步的实施方式中，该抗体或其片段与恶性细胞的结合导致该恶性细胞的生长抑制。
[0155]在上述方法的不同实施方式中，该抗体或其片段抑制IGF结合该恶性细胞。在进一步的实施方式中，该IGF为IGF-1或IGF-2。
[0156]在上述方法的不同实施方式中，该抗体或其片段抑制IGF-1结合所述恶性细胞但不抑制IGF-2。在其它特定的实施方式中，该抗体或其片段抑制IGF-2结合所述恶性细胞但不抑制IGF-1。
[0157]在上述方法的不同实施方式中，该抗体或其片段将IGF-1R内在化进入该恶性细胞。
[0158]在上述方法的不同实施方式中，该抗体或其片段抑制IGF磷酸化或抑制肿瘤增殖。在进一步的实施方式中，通过预防或延缓转移生长抑制该肿瘤细胞增殖。
[0159]在上述方法的不同实施方式中，该抗体或其片段抑制肿瘤细胞转移。在进一步的实施方式中，通过预防或延缓肿瘤扩散至邻近组织抑制该肿瘤细胞增殖。
[0160]在上述方法的不同实施方式中，该高度增殖疾病或紊乱为处于如下位置的肿瘤：前列腺，结肠，腹部，骨，乳腺，消化系统，肝脏，胰脏，腹膜，肾上腺，甲状旁腺，脑下垂体，睾丸，卵巢，胸腺，甲状腺，眼睛，头部，颈部，中枢神经系统，周围神经系统，淋巴系统，骨盆，皮肤，软组织，脾脏，胸部，或泌尿生殖道。
[0161]在上述方法的不同实施方式中，该高度增殖疾病为癌症，所述癌症选自上皮鳞状细胞癌，黑色素瘤，白血病，骨髓瘤，胃癌，脑癌，肺癌，胰腺癌，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，肾癌，前列腺癌，睾丸癌，甲状腺癌，以及头颈部癌。在进一步的实施方式中，该癌症选自胃癌，肾癌，脑癌，膀胱癌，结肠癌，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，卵巢癌和前列腺癌。
[0162]在上述方法的不同实施方式中，该动物为哺乳动物。在进一步的实施方式中，该哺乳动物为人类。
附图说明
[0163]图1：IGF-1R特异性Fabs的结合活性。(a)由ELISA所得的纯化抗-IGF1R Fab抗体对重组IGF1R-His和IGF1R-Fc蛋白的结合。(b)通过流式细胞仪所得的纯化抗-IGF1R Fab抗体对在3T3上表达的人IGF1R的结合。
[0164]图2：Fabs对MCF-7细胞上表达的IGF-1R的结合活性。
[0165]图3：抗-IGF-1R Fabs在MCF7细胞中抑制(a)IGF-1和(b)IGF-2诱导的磷酸化。
[0166]图4：由ELISA所得的IGF-1R Fab片段抗体与可溶性IGF-1R(a)和INSR(b)的结合。
[0167]图5：M13-C06，M14-G11，M14-C03和M14-B01的原始和修饰的VH和VL链的核苷酸和氨基酸序列。(a)(SEQ ID NO：13)显示了重链M13-C06的单链DNA序列。(b)(SEQ ID NO：77)显示了轻链M13-C06的单链DNA序列。(c)(SEQ ID NO：14)显示了重链M13-C06的氨基酸序列。(d)(SEQ ID NO：78)显示了轻链M13-C06的氨基酸序列。(e)(SEQ ID NO：25)显示了重链M14-C03的单链DNA序列。(f)(SEQ ID NO：87)显示了轻链M14-C03的单链DNA序列。(g)(SEQ ID NO：26)显示了重链M14-C03的氨基酸序列。(h)(SEQ ID NO：88)显示了轻链M14-C03的氨基酸序列。(i)(SEQ ID NO：31)显示了重链M14-G11的单链DNA序列。(j)(SEQID NO：92)显示了轻链M14-G11的单链DNA序列。(k)(SEQ ID NO：32)显示了重链M14-G11的氨基酸序列。(1)(SEQ ID NO：93)显示了轻链M14-G11的氨基酸序列。(m)(SEQ ID NO：19)显示了重链M14-B01的单链DNA序列。(n)(SEQ ID NO：82)显示了轻链M14-B01的单链DNA序列。(o)(SEQ ID NO：20)显示了重链M14-B01的氨基酸序列。(p)(SEQ ID NO：83)显示了轻链M14-B01的氨基酸序列。(q)(SEQ ID NO：18)显示了序列优化的重链M13-C06的单链DNA序列。(r)(SEQ ID NO：14)显示了序列优化的重链M13-C06的氨基酸序列。(s)(SEQ ID NO：30)显示了序列优化的重链M14-C03的单链DNA序列。(t)(SEQ ID NO：26)显示了序列优化的重链M14-C03的氨基酸序列。(u)(SEQ ID NO：36)显示了序列优化的重链M14-G11的单链DNA序列。(v)(SEQ ID NO：32)显示了序列优化的重链M14-G11的氨基酸序列。(w)(SEQ ID NO：24)显示了序列优化的重链M14-B01的单链DNA序列。(x)(SEQ ID NO：20)显示了序列优化的重链M14-B01的氨基酸序列。(y)(SEQ ID NO：153)显示了轻链恒定区的单链DNA序列。(z)(SEQ ID NO：154)显示了轻链恒定区的氨基酸序列。(aa)(SEQ ID NO：155)显示了重链agly.IgG4.P恒定区的单链DNA序列。(bb)(SEQ ID NO：156)显示了重链aglyIgG4.P恒定区的氨基酸序列。
[0168]图6：对G4.P.agly型全人源M13-C06和M14-C03抗体的非还原型和还原型SDA PAGE分析。
[0169]图7：由ELISA测定的全人源G4.P(a)和G4.P.agly(b)型抗-IGF-1R抗体的结合活性。
[0170]图8：由流式细胞仪测定的全人源抗体对MCF-7(8.a)，IGF-1R/3T3(8.b)细胞上表达的IGF-1R的结合。在MCF-7上的结合在2.7-12 x 10-10nM范围内。
[0171]图9：由RIA测定的G4型全人源抗体阻断IGF-1(a)和IGF-2(b)结合IGF-1R的能力。
[0172]图10：(a)G4型全人源抗体对H-23肿瘤细胞响应IGF-1的增殖的抑制；(b)G4型全人源抗体对H-23肿瘤细胞响应IGF-2的增殖的抑制；(c)G4型全人源抗体对Calu-6肿瘤细胞响应IGF-1的增殖的抑制。
[0173]图11：M13.C06.G4.P.agly，M14.C03.G4.P.agly和M14.G11.P抗体对IGF-1(a)和IGF-2(b)驱动的受体磷酸化的抑制。
[0174]图12：M13.C06.G4.P.agly对下游信号转导的抑制。(a).磷酸化Akt(Thr308)和总Akt分别在顶部和底部行中显示，(b)磷酸化p44/42 MAPK和总p44/42 MAPK分别在顶部和底部行显示。
[0175]图13：通过人源抗-IGF-1R抗体对IGF-1R的内在化。在0，15和60分钟通过共焦显微镜观察的M13-C06.G4.P.agly抗体(a)对IGF-1R的内在化。在实验中抗小鼠IGF-1R抗体克隆24-31为阳性对照(b)而小鼠7F2抗体和人G4.P抗体IDEC-151.G4.P为同型匹配的阴性对照(c)。
[0176]图14：由选定的IGF-1R单抗对IGF-1介导的肿瘤细胞生长的抑制。(a)H23；(b)Calu-6；(c)Panc-1；(d)BxPC3；(e)MaPaCa；和(f)Colo205。条块显示平均和SD。
[0177]图15：抗-IGF-1R抗体对IGF-1和IGF-2驱动的H-23细胞增殖的抑制。
[0178]图16：M13-C06.G4.P.agly抗体对BxPC3细胞增殖(由重组人IGF-1和IGF-2驱动)的抑制。
[0179]图17：M13-C06.G4.P.agly抗体对NCI-H23细胞增殖(由重组人IGF-1和IGF-2驱动)的抑制。
[0180]图18：M13-C06.G4.P.agly抗体对A549细胞增殖(由重组人IGF-1和IGF-2驱动)的抑制。
[0181]图19：全人源IGF-1R抗体对IGF-1和IGF-2诱导的Akt的氨基酸残基Ser473磷酸化的抑制。
[0182]图20：全人源M13.C06.G4.P.agly抗体在胰腺癌模型中显示了体内剂量依赖型的肿瘤生长抑制。
[0183]图21：全人源M13.C06.G4.P.agly抗体在肺癌模型中显示了体内剂量依赖型的肿瘤生长抑制。
[0184]图22：全人源M13.C06.G4.P.agly抗体联合吉西他滨施用在抑制肿瘤生长中显示了增强的效力。
[0185]图23：全人源M13.C06.G4.P.agly抗体与建立的猕猴成纤维细胞系上表达的IGF-1R的结合。
[0186]图24：IGF-1R抗体结合表位的交叉竞争性结合分析。
[0187]图25：IRS-1和p85(PI3K的调节亚基)共免疫沉淀证实了M13-C06.G4.P.agly介导的IGF-1R信号转导抑制。
[0188]图26：IGF-1R和INSR在哺乳动物细胞中的免疫沉淀证实了M13.C06.G4.P.agly抗体结合IGF-1R但不结合胰岛素受体。以采用小鼠抗-人IR(A)或小鼠抗-人IGF-1R(B)免疫印迹(Western印迹)分析检测IGF-1R和INSR蛋白。
[0189]图27：M13-C06 Fab对(A)hIGF-1R-Fc和(B)mIGF-1R-Fc的相对结合亲和力测定。(A)和(B)的X-和y-轴比例相同。在各图的底部显示了用于结合拟合的残余物以表明该1：1结合模型在测定M13-C06对各个受体的相对亲和力中的适用性。
[0190]图28：M13.C06抗体在SPR测定中结合hIGF-1R-Fc和mIGF-1R-Fc对照与抗体结合IGF-1R突变蛋白SD006(结合阳性)和SD015(结合阴性)的实施例。
[0191]图29：IGF-1R和INSR的结构化表示：A)IGF-1R的结构示意图。A)FnIII-2包含如图所示的体内蛋白水解处理的环状结构。跨膜区显示为横跨磷酯双层图的螺旋环。IGF-1R中的IGF-1/IGF-2结合位点的位置以星号显示。经证明仅一种IGF-1/IGF-2分子结合至各IGF-1R异源二聚分子。B&C)定位至同源INSR结构表面的M13-C06 IGF-1R结合表位。M13-C06 IGF-1R结合表位基于高度同源性INSR晶体结构建模。B)具有对应IGF-1R中同源性位置V462-H464的氨基酸残基位置(即INSR中的L472-K474)的INSR结构的表面表示以黑色阴影显示。对应IGF-1R的前三个结构域(即L1-CR-L2)(例如包含在此处所述构建体的平头IGF-1R(1-462)-Fc)显示为灰色阴影。C)具有暴露表面区域至溶剂以及在对应IGF-1R 462-464(即INSR中472-474)的残基的
(埃)半径(或
直径)之内的残基的INSR结构的表面表示以黑色阴影显示。对应IGF-1R氨基酸462-464的残基的具有灰色阴影以显示实验确认的该目标表位的表面区域。
[0192]图30：在以M13.C06.G4.P.agly抗体处理的小鼠肿瘤中体内IGF-1R表达的免疫印迹(Western印迹)分析。
[0193]图31：由原发人结肠肿瘤生成的肿瘤中M13-C06.G4.P.agly的体内抗肿瘤活性。
[0194]图32：由乳腺癌(MCF-7)细胞生成的肿瘤中M13-C06.G4.P.agly的体内抗肿瘤活性。
[0195]图33：M13-C06抗体不显示体外ADCC活性。
发明详述
I.定义
[0196]应当注意术语“一个”或“一种”实体指一个或多个该种实体；例如，“一种IGF-1R抗体”应理解为代表一个或多个IGF-1R抗体。因此，术语“一个”(或“一种”)，“一个或多个”以及“至少一个”在此处可进行互换。
[0197]此处所用的术语“多肽”同时包括了单数和复数的“多肽”，并指由酰胺键(也称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)所组成的一种分子。术语“多肽”指两个或多个氨基酸的任何链，且不指定产物的具体长度。因此，肽，二肽，三肽，寡肽，“蛋白”，“氨基酸链”或任何其它用来指代两个或多个氨基酸链的术语都包含在“多肽”的定义之内，且术语“多肽”可用来取代任何上述术语或与之互换。术语“多肽”还指多肽表达后修饰的产物，该种修饰包括但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/阻断基团进行衍生化，蛋白水解裂解，或通过非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可衍生自天然的生物来源或通过重组技术生产，但不一定需要转译自指定的核酸序列。它可通过任何方式生成，包括化学合成。
[0198]本发明的多肽的大小约为3个或更多，5个或更多，10个或更多，20个或更多，25个或更多，50个或更多，75个或更多，100个或更多，200个或更多，500个或更多，1000个或更多，或者2000个或更多的氨基酸。多肽可具有一种指定的三维结构，但并非必须具有该种结构。具有指定三维结构的多肽被称为折叠结构，而不具有指定三维结构，但可采用多种构型的多肽被称为未折叠结构。此处所用的术语糖蛋白指一种至少与一个糖部分连接的蛋白，该糖部分通过一种氨基酸残基(例如丝氨酸残基或天冬氨酸残基)的含氧或含氮侧链与蛋白连接。
[0199]“分离的”多肽或其片段，变体或衍生物指一种不存在于其天然环境中的多肽。不要求达到特定的纯化水平。例如，一种分离的多肽可取自其自然的或天然的环境中。在宿主细胞中表达的重组生产的多肽和蛋白被认为对于本发明的目的而言是分离的，因为它们是通过任何合适的技术分离，分割，或者部分或充分纯化的天然或重组多肽。
[0200]本发明的多肽还包括前述多肽的片段，衍生物，类似物或变体及其任意组合。在涉及本发明的IGF-1R抗体或抗体多肽时术语“片段”，“变体”，“衍生物”和“类似物”包括任何至少保留了相应天然抗体或多肽的部分抗原结合属性的多肽。除在本发明其它地方讨论的特定抗体片段之外，本发明的多肽片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。本发明的IGF-1R抗体和抗体多肽的变体包括如上所述的片段，还包括具有由氨基酸替换，缺失或插入所得的变更氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在的或是非天然存在的。非天然存在的变体可通过本领域已知的突变技术进行制备。变体多肽可包含保守或非保守氨基酸替换，缺失或添加。本发明的IGF-1R抗体和抗体多肽的衍生物为经过变更后可显示出未在天然多肽上发现的附加特性的多肽。其范例包括融和蛋白。变体多肽在此也可称为“多肽类似物”。此处所用的IGF-1R抗体或抗体多肽“衍生物”指具有经过功能性侧基团反应化学衍生得到的一个或多个残基的主体多肽。“衍生物”还包括包含了二十个标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可替换脯氨酸；5-羟基赖氨酸可替换赖氨酸；3-甲基组氨酸可替换组氨酸；高丝氨酸可替换丝氨酸；以及鸟氨酸可替换赖氨酸。
[0201]术语“多聚核苷酸”包括了单数或复数的核酸，并指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多聚核苷酸可包括常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，于肽核酸(PNA)等发现的酰胺键，)。术语“核酸”指在多聚核苷酸中存在的任何一个或多个核酸片段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多聚核苷酸指从其天然环境中分离的核酸分子，DNA或RNA。例如，包含在载体中的一种编码IGF-1R抗体的重组多聚核苷酸被认为对于本发明的目的而言是分离的。分离多聚核苷酸的进一步范例包括存在于外源宿主细胞中的重组多聚核苷酸或在溶液中(部分或完全)纯化的多聚核苷酸。分离的RNA分子包括对本发明多聚核苷酸的体内或体外RNA转录物。如本发明所述的分离的多聚核苷酸或核酸进一步包括合成制备的该种分子。此外，多聚核苷酸或核酸可以是启动子，核糖体结合位点或转录终止子等调节元件或是包含该种调节元件。
[0202]此处所用的“编码区”指由转译氨基酸的密码子组成的一部分核酸。尽管“终止密码子”(TAG，TGA，或TAA)不翻译成氨基酸，它仍可被认为是编码区域的一部分，但如启动子，核糖体结合位点，转录终止子等侧翼序列不是编码区域的一部分。本发明的两个或多个编码序列可存在于一个单独的多聚核苷酸构建体(例如，单独的载体)中或分离的多聚核苷酸构建体(例如，分离的(不同)载体)中。此外，任何载体可包含一个单独的编码区，或包含两个或多个编码区，例如，一种单独载体可分别编码一种免疫球蛋白的重链可变区和一种免疫球蛋白的轻链可变区。此外，本发明的载体，多聚核苷酸或核酸可编码与编码IGF-1R抗体或其片段，变体或衍生物的核酸融和或未融合的外源编码区域。外源编码区包括但不限于专门的元件或基序，例如分泌腺信号肽或外源功能性区域。
[0203]在特定的实施方式中，该多聚核苷酸或核酸为DNA。当为DNA时，一种包含了编码多肽的核酸的多聚核苷酸通常包括与一个或多个编码区域可操作连接的一个启动子和/或其它转录或转译控制元件。可操作的连接指当某种基因产物(例如，多肽)的编码区域与一个或多个调节序列以一种特定方式连接时，基因产物的表达受到调节序列的影响或控制。如果启动子功能的诱导可使mRNA的转录编码目标基因产物，并且如果两个DNA片段之间的接头的性质不干扰表达调节序列引导基因产物表达的能力或干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(例如一个多肽编码区域和与之连接的启动子)被“可操作地连接”。因此，如果一个启动子能够影响一种编码多肽的核酸的转录，则该启动子区域将被可操作地连接至该核酸。该启动子可以是一种仅能在预定细胞中引导DNA的充分转录的细胞特异性启动子。除启动子外的其它转录控制元件，如增强子，操作子，阻遏子以及转录终止信号可与多聚核苷酸进行可操作连接以引导细胞特异性转录。此处披露了合适的启动子和其它转录控制区。
[0204]各种转录控制区域已为本领域技术人员所熟知。其包括，但不限于，在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区域，例如，但不限于，来自细胞巨化病毒的启动子和增强子片段(立即早期启动子，与内含子-A相连接)，猿病毒40(早期启动子)以及逆转录酶病毒(例如禽劳斯肉瘤病毒)。其它的转录控制区域包括衍生自肌动蛋白，热休克蛋白，牛生长激素和兔β-球蛋白的脊椎动物基因的区域以及其它能够在真核细胞中控制基因表达的序列。其它合适的转录控制区域包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子-诱导型启动子(例如，受干扰素或白介素诱导的启动子)。
[0205]类似地，各种转译控制元件已为本领域的普通技术人员所熟知。其包括，但不限于核糖体结合位点，转译启动和终止密码子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点，或是IRES，也被称为CITE序列)。
[0206]在其它的实施方式中，本发明的多聚核苷酸为RNA，例如，以信使RNA(mRNA)的形式存在。
[0207]本发明的多聚核苷酸和核酸编码区可与编码分泌腺或信号肽的附加编码区(引导本发明的多聚核苷酸编码的多肽的分泌)相连接。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白具有一种信号肽或分泌型前导序列，后者在生长蛋白链向粗面内质网的输出被启动时从成熟蛋白上被裂解。本领域的普通技术人员均了解由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合到多肽N末端的信号肽，它从完整或“全长”多肽序列裂解以生产分泌或“成熟”型多肽。在特定实施方式中采用了如免疫球蛋白重链或轻链信号肽等天然信号肽，或保留了引导与之可操作连接的多肽分泌能力的该序列的功能性衍生物。此外还可以使用外源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，野生型前导序列可被人组织型纤溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶的前导序列替换。
[0208]本发明的目标在于特定的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物。除非另行指明为天然存在的抗体等全长抗体，术语“IGF-1R抗体”包含了全长抗体以及该种抗体的抗原结合片段，变体，类似物，或衍生物，例如，天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或工程改造的抗体分子或以类似方式与抗体分子结合的片段。
[0209]术语“抗体”和“免疫球蛋白”在此处可以替换使用。一种抗体或免疫球蛋白至少包含重链的可变区，并通常至少包含重链和轻链的可变区。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构已得到较为充分的了解。例如，参见Harlow等人，Antibodies：A LaboratoryManual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)。
[0210]如将在下文具体讨论的那样，术语“免疫球蛋白”包含了能够以生化方式区分的多种大类的多肽。本领域的技术人员均了解重链被分类为gamma，mu，alpha，delta，或epsilon，(γ，μ，α，δ，ε)，其中还有一些亚类(例如，γ1-γ4)。由该链的性质决定了抗体的“类别”分别为IgG，IgM，IgA IgG或IgE。免疫球蛋白小类(同型)如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1等均得到了很好的区分并赋予了功能定位。熟练的技术人员能够轻易辨别这些类别和同型的各修饰型，且它们均在本发明的范围之内。本发明范围内的所有免疫球蛋白类别均非常明确，且下述讨论将一般指向免疫球蛋白分子的IgG分类。对于IgG，一个标准的免疫球蛋白分子包含了两个相同的分子量约为23,000道尔顿的轻链多肽，以及两个相同的分子量为53,00070,000的重链多肽。这四条链通常通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链自“Y的嘴部支持重链并持续至可变区域。
[0211]轻链被分类为kappa或lambda(κ，λ)。各重链分类均能与kappa或lambda轻链的任意一种相结合。一般而言，轻链和重链彼此共价连接，而两条重链的“尾”部以二硫键彼此共价连接或当免疫球蛋白产自杂交瘤，B细胞或遗传工程改造的宿主细胞时彼此非共价连接。在重链中，氨基酸序列自Y构型叉端的N末端延续至各链底部的C末端。
[0212]轻链和重链均被划分为具有结构和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”具有功能性含义。就此而言，应当理解轻(VL)和重(VH)链区的可变区决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1，CH2 or CH3)的恒定区则赋予了重要的生物功能，例如分泌，经胎盘活动性，Fc受体结合，补体结合等。根据惯例随恒定区域越为远离抗体的抗原结合位点或氨基酸末端，其数量有所上升。N末端区为可变区而C末端区为恒定区；CH3和CL区实际分别包含了重链和轻链的羧基末端。
[0213]如上文指出，可变区允许抗体选择性识别特异性结合抗原上的表位。即，抗体的VL区和VH区，或决定簇互补区(CDRs)的亚群结合形成定义三维抗原结合位点的可变区。该四级抗体结构形成了存在于各个Y臂末端的抗原结合位点。更具体的说，该抗原结合位点可通过各VH和VL链上的三个CDRs定义。在一些情况下，例如对于源自骆驼类或基于骆驼类免疫球蛋白工程改造的免疫球蛋白分子，一个完整的免疫球蛋白分子可能仅由重链组成，而不含轻链。例如，参见Hamers-Casterman等人.，Nature 363：446-448(1993)。
[0214]在自然存在的抗体中，各抗原结合区的六个“决定簇互补区”或“CDRs”是当抗体在水环境中呈现三维构型时经特别定位形成抗原结合区的非相邻的短序列。抗原结合区的剩余氨基酸称为“框架”区，显示了较低的分子间可变性。框架区大体呈β-折叠构型，而CDRs形成与β-折叠结构连接(在某些情况下形成其一部分)的环形。因此，框架区通过链间非共价相互作用形成了支持CDRs以正确方向定位的支架。由定位CDRs形成的抗原结合区定义了免疫反应性抗原上的表位补体。该互补表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。由于已有明确的描述，本领域的普通技术人员可简单地在任何给定重或轻链可变区鉴别该种分别包含了CDRs和框架区的氨基酸(参见，＂Sequences of Proteins of Immunological Interest，＂Kabat，E.，等人，U.S.Department of Health and Human Services，(1983)；以及Chothia和Lesk，J.MoI.Biol.，196：901-917(1987)，在此全文引用作为参考)。
[0215]当一个术语有两个或更多地定义为本领域所使用和/或接受时，除非另行指明，此处所用的术语定义意在包括所有该种含义。一个具体的范例为使用术语“决定簇互补区”(＂CDR＂)描述重链和轻链多肽的可变区范围内均发现的非邻近抗原结合位点。该特定区域的描述参见Kabat等人.，U.S.Dept.of Health and HumanServices，＂Sequences of Proteins of Immunological Interest＂(1983)以及Chothia等人.，J.MoI.Biol.196：901-917(1987)，其在此引用作为参考，其中该定义在彼此进行比较时包括氨基酸残基的重叠或亚群。然而，抗体或其变体的CDR的任意定义的采用均意在落入此处所定义和使用的术语的范围之内。下文表1中列举了包含分别由上述引用的参考文献定义的CDRs的适当氨基酸残基以供比较。包含特定CDR的确切残基数将随着该CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员可在给定抗体可变区氨基酸序列的情况下确定包含特定CDR的残基。
表1.CDR定义1
| Kabat | Chothia | |
| VH CDR1 | 31-35 | 26-32 |
| VH CDR2 | 50-65 | 52-58 |
| VH CDR3 | 95-102 | 95-102 |
| VL CDR1 | 24-34 | 26-32 |
| VL CDR2 | 50-56 | 50-52 |
| VL CDR3 | 89-97 | 91-96 |
1表1中所有CDR定义的编号均参照Kabat等人.
(参见下文)。
[0216]Kabat等人.还定义了适用于任何抗体的可变区序列编号系统。本领域普通技术人员可毫无疑义地将该“Kabat编号”系统指定给任意可变区序列，且无需依赖该序列本身以外的任何实验数据。此处所用的“Kabat编号”指由Kabat等人.，U.S.Dept.of Healthand Human Services，＂Sequence of Proteins of Immunological Interest＂(1983)提出的编号系统。除非另行指明，对本发明的IGF-1R抗体或抗原结合片段，变体，或其衍生物的特定氨基酸残基位置的编号均参照Kabat编号系统。
[0217]在骆驼类物种中，该重链可变区(称为VHH)形成了完整的抗原结合区。骆驼类VHH可变区和来自常规抗体(VH)的可变区的主要区别包括(a)与VHH中的相应区域相比，VH的轻链接触表面中具有更多的疏水氨基酸，(b)VHH中具有更长的CDR3，以及(c)VHH中的CDR1和CDR3之间二硫键出现的频率。
[0218]本发明的抗体或其抗原结合片段，变体，或衍生物包括，但不限于，多克隆，单克隆，多特异性，人类的，人源化的，灵长动物源化的，或嵌合抗体，单链抗体，表位结合片段，如Fab，Fab′和F(ab′)2，Fd，Fvs，单链Fvs(scFv)，单链抗体，二硫键连接Fvs(sdFv)，包含VL或VH区的片段，由Fab表达库制备的片段，以及抗独特型(抗Id)抗体(例如，包括此处披露的IGF-1R抗体的抗Id抗体)。ScFv分子已为本领域所知，其描述参见美国专利5,892,019等。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何形式(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，类别(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或小类。
[0219]包括单链抗体在内的抗体片段可以仅单独包含可变区，或是包含铰链区，CH1，CH2和CH3区的全部或部分。本发明还包括了同样包含可变区与铰链区，CH1，CH2和CH3区任意组合的抗原结合片段。本发明的抗体或其免疫特异性片段可来自包括鸟类和哺乳动物的任何动物来源。该抗体优选人，鼠，驴，兔，山羊，豚鼠，骆驼，羊驼，马或鸡抗体。在另一实施方式中，可变区可来自不同的来源(例如，来自鲨鱼)。此处所述的“人类”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，以及包括从人免疫球蛋白库或从表达一种或多种人免疫球蛋白且不表达内源免疫球蛋白的转基因动物分离的抗体，如下文描述，并可参见Kucherlapati等人的美国专利5,939,598。
[0220]此处所用的术语“重链部分”包括来自于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。一种包含重链部分的多肽至少包含CHI区，铰链区(例如，上，中和/或下铰链区)，CH2区，CH3区，或其变体或片段之一。例如，本发明中采用的结合多肽可以包括含有CH1区的多肽链；含有CH1区，至少铰链区的一部分，以及CH2区的多肽链；含有CH1区和CH3区的多肽链；含有CH1区，至少铰链区的一部分，以及CH3区的多肽链，或含有CH1区，至少铰链区的一部分，CH2区以及CH3区的多肽链。在另一实施方式中，本发明的多肽包括了一种含有CH3区的多肽链。本发明中所采用的结合多肽可进一步至少缺失CH2区的一部分(例如，CH2区的全部或部分)。如上所述，本领域的普通技术人员应当可以理解这些区域(例如，重链部分)可以进行修饰从而不同于天然存在的免疫球蛋白分子中的氨基酸序列。
[0221]在此处所披露的特定IGF-1R抗体或其抗原结合片段，变体或衍生物中，多聚体的一条多肽链中的重链部分与该多聚体的其它多肽链的重链部分相同。此外，本发明中含重链部分的单体并不相同。例如，各单体可包含不同的目标结合位点，形成双特异性抗体等产物。
[0222]此处披露的用于诊断和治疗方法的结合多肽的重链部分可来自于不同的免疫球蛋白分子。例如，一种多肽的重链部分可包含了来自IgG1分子的CH1和来自IgG3分子的铰链区。在另一实施例中，重链部分可包含部分来自于IgG1分子及部分来自于IgG3分子的铰链区。在另一实施例中，重链部分可包含部分来自于IgG1分子及部分来自于IgG4分子的嵌合铰链。
[0223]此处所用的术语“轻链部分”包括来自于免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。该轻链部分优选至少包含VL或CL区之一。
[0224]此处披露的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物可通过抗原的表位或部分(例如可被它们识别或特异结合的目标多肽(IGF-1R))进行描述或说明。目标多肽中与抗体的抗原结合区特异性相互作用的部分为“表位”或“抗原决定簇”。根据抗原的大小，构型和类型，目标多肽可能包含单个表位，但通常包含至少两个表位，并可能包含任意数量的表位。应当进一步指出目标多肽上的“表位”可以是非多肽元件或包括非多肽元件，例如，“表位”可包括一种糖类侧链。
[0225]一种抗体的肽或多肽表位的最小大小约为4-5个氨基酸。肽或多肽表位优选包含至少七个氨基酸，更优选至少包含九个氨基酸，最优选包含约15-约30个氨基酸。由于CDR可在其三级形态识别抗原性肽或多肽，包含表位的氨基酸不需要相邻，并且在某些情况下，甚至不需要在同一肽链上。在本发明中，由本发明的IGF-1R抗体识别的肽或多肽表位包含IGF-1R的至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，更优选至少8个，至少9个，至少10，至少15个，至少20个，至少25个，或是约15至约30个邻近或非邻近的氨基酸的序列。
[0226]“特异性结合”通常指一种抗体通过其抗原结合区与表位结合，且该种结合需要抗原结合区和表位之间的补体。根据该定义，当一种抗体通过其抗原结合区与一种表位的结合比它与任意的，不相关的表位的结合更为容易时，则称该抗体“特异性结合”该表位。术语“特异性”在此处用于限定一种特定抗体与一种特定表位结合的相对亲和力。例如，抗体“A”可能被认为比抗体“B”对一种给定表位具有更高的特异性，或是可认为抗体“A”与表位“C”的结合比其与相关表位“D”的结合具有更高的特异性。
[0227]“特异性结合”指该抗体与一种表位的特异性结合比它与相关的，相似的，同源的或是类似的表位的结合更为容易。因此，与一种给定表位“特异性结合”的抗体与该表位的结合比与相关的表位更为容易，即使该种抗体可能与该相关表位交叉反应。
[0228]通过非限定范例法，如一种抗体与一种第一表位结合的解离常数(KD)小于该抗体对第二表位的KD，则认为该抗体优先结合该第一抗体。在另一非限定范例中，如一种抗体与一种第一表位结合的亲和性至少比该抗体对第二表位的KD小一个数量级，则认为该抗体优先结合该第一抗体。在另一非限定范例中，如一种抗体与一种第一表位结合的亲和性至少比该抗体对第二表位的KD小两个数量级，则认为该抗体优先结合该第一表位。
[0229]在另一非限定范例中，如一种抗体与一种第一表位结合的解离速率(k(off))小于该抗体对第二表位的k(off)，则认为该抗体优先结合该第一表位。在另一非限定范例中，如一种抗体与一种第一表位结合的亲和性至少比该抗体对第二表位的k(off)小一个数量级，则认为该抗体优先结合该第一表位。在另一非限定范例中，如一种抗体与一种第一表位结合的亲和性至少比该抗体对第二表位的k(off)小两个数量级，则认为该抗体优先结合该第一表位。
[0230]此处披露的抗体或抗原结合片段，变体或衍生物可认为与此处披露的目标多肽或其片断或变体结合的解离速率小于或等于5 X 10-2/秒，10-2/秒，5 X 10-3/秒或10-3/秒。此处披露的抗体或抗原结合片段，变体或衍生物更优选认为与此处披露的目标多肽或其片断或变体结合的解离速率小于或等于5 X 10-4/秒，10-4/秒，5 X10-5/秒，或10-5/秒5 X 10-6/秒，10-6/秒，5 X 10-7/秒或10-7/秒。
[0231]此处披露的抗体或抗原结合片段，变体或衍生物可认为与此处披露的目标多肽或其片断或变体结合的结合速率(k(on))大于或等于103M-1/秒，5 X 103M-1/秒，104M-1/秒或5 X 104M-1/秒。本发明的抗体更优选认为与此处披露的目标多肽或其片断或变体结合的结合速率(k(on))大于或等于105M-1/秒，5 X 105M-1/秒，106M-1/秒或5 X 106M-1/秒或107M-1/秒。
[0232]如果一种抗体以能够一定程度阻断一种参考抗体与一种特定表位结合的方式与该表位优先结合，则认为该抗体竞争性地抑制该参考抗体与该表位的结合。竞争性抑制可通过竞争ELISA分析等任何本领域已知的方法进行测定。当一种抗体对参考抗体与给定表位的结合的抑制为至少90％，至少80％，至少70％，至少60％或至少50％时，则认为该抗体竞争性抑制该参考抗体与该表位的结合。
[0233]此处所用的术语“亲和性”指一种单独表位与免疫球蛋白分子的CDR结合强度的量度。例如，参见Harlow等人.Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)，页码27-28。此处所用的术语“亲和力”指一组免疫球蛋白和抗原的复合物的整体稳定性，即一种免疫球蛋白混合物与抗原的功能性结合强度。例如，参见Harlow，第29-34页。亲和力既与该组中的个体免疫球蛋白分子与特定表位的亲和性相关，也与该免疫球蛋白和该抗原的化合价相关。例如，二价单克隆抗体与聚合体等具有高度重复表位结构的抗原的相互作用将具有较高的亲和力。
[0234]本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段，变体或衍生物同样可根据它们的交叉反应性进行描述或说明。此处所用的术语“交叉反应性”指一种对某种抗原特异的抗体与一种第二抗原反应的能力；两种不同的抗原性物质之间相关性的衡量。因此，当一种抗体能与未包含在其构成中的表位结合时该抗体具有交叉反应性。交叉反应性表位通常含有与诱导表位相同的多个互补结构特征，在某些情况下可能比原始表位更为匹配。
[0235]例如，某些抗体具有一定程度地交叉反应性，因此它们可以结合相关但并不相同的表位，例如，与参考表位具有至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少60％，至少55％，至少50％的一致性(通过本领域已知的并在此处描述的方法进行计算)的表位。如果一种抗体不结合与一种参考表位具有小于95％，小于90％，小于85％，小于80％，小于75％，小于70％，小于65％，小于60％，小于55％，小于50％的一致性(通过本领域已知的并在此处描述的方法进行计算)的表位，则认为该抗体不具有或具有极小的交叉反应性。如果一种抗体不与某种表位的任何其它类似物，直系同源物或同源物相结合，则可认为该抗体对该表位具有“高度特异性”。
[0236]本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段，变体或衍生物同样可根据它们与本发明的多肽的结合亲和性进行描述或说明。优选结合亲和性包括解离常数或Kd小于5 X 10-2M，10-2M，5 X10-3M，10-3M，5 X 10-4M，10-4M，5 X 10-5M，10-5M，5 X 10-6M，10-6M，5 X 10-7M，10-7M，5 X 10-8M，10-8M，5 X 10-9M，10-9M，5 X 10-10M，10-10M，5 X 10-11M，10-11M，5 X 10-12M，10-12M，5 X 10-13M，10-13M，5 X10-14M，10-14M，5 X 10-15M或10-15M的亲和性。
[0237]本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段，变体或衍生物可以具有“多特异性”，例如，双特异性，三特异性或更大的多特异性，这意味着它可同时识别和结合在一个或多个不同的抗原(例如，蛋白)上的两个或多个不同的表位。因此，一种IGF-1R抗体为“单特异性”或“多特异性”(例如，“双特异性”)指结合多肽反应的不同表位的数量。多特异性抗体可对此处所述的目标多肽的不同表位具有特异性，或可能对目标多肽和外源表位(如外源多肽或固相支持材料)具有特异性。
[0238]此处所用的术语“化合价”指IGF-1R抗体，结合多肽或抗体中的潜在结合区(例如，抗原结合区)的数量。每个结合区特异性结合一个表位。当一种IGF-1R抗体，结合多肽或抗体包含了超过一个结合区时，对于带有两个结合区且各结合区可特异性结合相同的表位，称为“双价单特异性”，对于带有两个结合区且各结合区特异性结合不同表位，称为“双价双特异性”。抗体对每一种特异性也可以是双特异性和双价的(称为“双特异性四价抗体”)。在另一实施方式中，可制备缺失四价微抗体或区域的抗体。
[0239]双特异性二价抗体及其制备方法可参见美国专利5,731,168；5,807,706；5,821,333；以及美国申请公开2003/020734和2002/0155537等，上述文献在此全文引用作为参考。双特异性四价抗体及其制备方法的描述可参见WO 02/096948和WO 00/44788，上述文献在此全文引用作为参考。一般可参见PCT公布的WO93/17715：WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人，J.Immunol.147：6069(1991)；U.S.Pat.Nos.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny等人，J.Immunol.74S：1547-1553(1992)。
[0240]如前文所述，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维构型已众所周知。此处所用的术语“VH区”包含了免疫球蛋白重链的氨基末端可变区，而术语“CH1区”包含了免疫蛋白重链的第一(大多数为氨基末端)恒定区。该CH1区邻近VH区，并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
[0241]此处所用的术语“CH2区”包含了重链分子的一部分，例如采用常规编号方案时从促凝剂244至残基360(Kabat编号系统中为残基244至360；EU编号系统中为残基231-340；参见Kabat EA等人op.cit.)。CH2区的独特之处在于它不与其它区域紧密配对。但有两条N末端连接的分支糖链插入完整的自然IgG分子的两个CH2区域之间。另有记录显示CH3区由CH2区延伸至IgG分子的C末端并包含约108个残基。
[0242]此处所用的术语“铰链区”包含了将CH1区连接至CH2区的重链分子部分。该铰链区包含了约25个残基并且是柔性的，从而使得两个N末端抗原结合区可以独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的区域：上，中，下铰链区(Roux等人，J.Immunol 161：4083(1998))。
[0243]此处所用的术语“二硫键”包括了两个硫分子间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含了能与另一硫醇基团形成二硫键或桥的硫醇基团。在多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，且两条重链在Kabat编号系统的239和242位置(EU编号系统的226或229位置)通过二硫键相连接。
[0244]此处所用的术语“嵌合抗体”将用于指代任何免疫反应性区域或位点来自于一个种类而(根据本发明为完整的，部分的或修饰的)恒定区来自于另一种类的抗体。在优选实施方式中，该目标结合区域或位点来自于非人类来源(例如，小鼠或灵长动物)而恒定区来自人类。
[0245]此处所用的术语“工程抗体”指一种重链和轻链中的一个或全部可变区通过被来自已知特异性的抗体的一个或多个CDRs至少部分替换，或在需要时通过部分框架区替换和序列更改所修饰得到抗体。尽管CDRs可来自于与获得该框架区的抗体相同的类别或小类，应考虑来自于不同类别抗体的CDRs，并优先考虑来自于不同种类抗体的CDRs。将一个或多个来自于已知特异性的非人类抗体的“供体”CDRs嫁接至人重链或轻链框架区的工程抗体在此称为“人源化抗体”。无需将来自供体可变区的完整CDRs替换所有的CDRs以将一个可变区的抗原结合能力转换至另一个。事实上仅需要转移那些维持该目标结合位点活性所必需的残基。通过美国专利5,585,089，5,693,761，5,693,762和6,180,370等所给出的解释，本领域的技术人员应当能够通过常规试验或试错法试验获取功能性的工程或人源化抗体。
[0246]此处所用的术语“正确折叠的多肽”包括了所有由多肽组成的功能区均具有明显活性的多肽(例如，IGF-1R抗体)。此处所用的“不正确折叠的多肽”包括至少一个多肽功能区没有活性的多肽。在一个实施例中，正确折叠的多肽包含了至少由一个二硫键连接的多肽链，不正确折叠的多肽包含了未经至少一个二硫键连接的多肽链。
[0247]此处所用的术语“工程改造的”包括通过人工方法(例如，通过重组技术，体外肽合成，肽的酶催化或化学偶合或是这些技术的组合)处理核酸或多肽分子。
[0248]此处所用的术语“连接的”，“融合的”或“融合”可相互替换。这些术语指通过化学连接或重组技术等任何方法连接两个或多个元件或成分。“框内融合”指以能够维持原始开放阅读框架(ORFs)的正确翻译阅读框的方式连接两个或多个多聚核苷酸ORFs以形成一个更长的连续ORF。因此，重组融合蛋白是一种含有两个或更多与原始ORFs所编码的多肽相应的片段的单独蛋白(该片段一般在天然状态下不进行该种连接)。尽管该阅读框架在融合片段中彼此连续，该片段可被框内接头序列等序列物理或空间分隔。例如，编码免疫球蛋白可变区CDRs的多聚核苷酸可框内融合，但只要该”融合的”CDRs被共转译为连续多肽的一部分，它可被编码至少一个免疫球蛋白框架区或附加CDR区的多聚核苷酸所分隔。
[0249]在有关多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”指多肽中的由氨基向羧基末端方向排列的氨基酸，其中序列内彼此相邻的残基在多肽的一级结构内邻近。
[0250]此处所用的术语”表达”指基因生产RNA或多肽等生化物质的通过过程。该过程包括该基因的功能存在的任何显现，包括但不限于，基因阻抑以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于将基因转录为信使RNA(mRNA)，转移RNA(tRNA)，小发夹RNA(shRNA)，小干扰RNA(siRNA)或任何其它RNA产物，以及将mRNA翻译为多肽。如果该最终产物是一种生化产物，则表达包括了该种生化产物和任何前体的生成。基因的表达产生了”基因产物”。此处所用的基因产物既可以是核酸(例如，由基因转录生成的信使RNA)，也可以是通过转录物翻译得到的多肽。此处所述的基因产物进一步包括经过转录后修饰(例如，多聚腺苷酸化)的核酸，或是经转译后修饰(例如，甲基化，糖基化，以及脂质的添加，与其它蛋白亚基的结合，蛋白水解裂解等)的多肽。
[0251]此处所用的术语“治疗”指治疗性或预防性措施，其目的为预防或延缓(减轻)有害的生理变化或紊乱，例如癌症的形成或扩散。有益或目标临床结果包括，但不限于，可测或不可测的症状的缓和，疾病程度的减轻，疾病状态的稳定(即，不恶化)，疾病进展的延迟或减缓，疾病状态的改善或减轻，以及(部分或完全)消除。“治疗”还指与未接受治疗的预计存活相比更长的存活时间。需要接受治疗的对象包括已经患有疾病或紊乱以及容易患该疾病或紊乱的对象或是需要预防该疾病或紊乱的对象。
[0252]“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”指需要进行诊断，预后或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人，驯养动物，畜牧动物以及动物园，运动或宠物动物，例如狗，猫，豚鼠，兔子，大鼠，小鼠，马，家畜，牛等。
[0253]此处所用的短语如“可由结合分子的施用获益的对象”和“需要接受治疗的动物”等包括了可从用于，例如，对结合分子识别的抗原的检测(例如，用于诊断过程)和/或用于治疗(即，通过特异性结合给定目标蛋白的结合分子对癌症等疾病的减轻或预防)的结合分子的施用受益的对象，包括哺乳动物对象。如此处更为具体的描述，该结合分子可在与药物，前药或同位素等物质相结合或不相结合的形式下进行使用。
[0254]“高度增殖疾病或紊乱”指所有的肿瘤细胞生长和增殖(不管是恶性还是良性)，包括所有转化的细胞和组织以及所有的癌症细胞和组织。高度增殖疾病或紊乱包括，但不限于，癌前病变，异常细胞生长，良性肿瘤，恶性肿瘤，以及“癌症”。在本发明的特定实施方式中，该度增殖疾病或紊乱，例如，癌前病变，异常细胞生长，良性肿瘤，恶性肿瘤，以及“癌症”包含表达，过量表达或异常表达IGF-1R的细胞。
[0255]高度增殖疾病，紊乱和/或症状的其它范例包括，但不限于处于如下位置的良性或恶性的肿瘤：前列腺，结肠，腹部，骨，乳腺，消化系统，肝脏，胰脏，腹膜，内分泌腺(肾上腺，甲状旁腺，垂体，睾丸，卵巢，胸腺，甲状腺)，眼部及头颈部，神经(中枢和外周)，淋巴系统，盆腔，皮肤，软组织，脾脏，胸以及泌尿生殖道。在特定实施方式中，该肿瘤表达，过量表达或异常表达IGF-1R。
[0256]其它的高度增殖紊乱包括，但不限于：位于上述器官的高丙球蛋白血症，淋巴细胞增生性紊乱，病变蛋白血症，紫癜，肉状瘤病，Sezary综合征，Waldenstron巨球蛋白血症，Gaucher病，组织细胞增多病，以及除了肿瘤外的其它任何高度增殖疾病。在本发明的特定实施方式中该疾病包含表达，过量表达或异常表达IGF-1R的细胞。
[0257]此处所用的术语“肿瘤”或“肿瘤组织”指由过量细胞分裂产生的异常组织块，在特定的情况下该组织包含表达，过量表达或异常表达IGF-1R的细胞。肿瘤或肿瘤组织包含具有异常生长属性且没有有用的身体功能的“肿瘤细胞”。肿瘤，肿瘤组织和肿瘤细胞可以是良性或恶性的。肿瘤或肿瘤组织还可包含“肿瘤相关的非肿瘤细胞”，例如，形成血管供应肿瘤或肿瘤组织的血管细胞。非肿瘤细胞可由肿瘤细胞诱导复制和发育，例如，在肿瘤或肿瘤组织中诱导血管形成。
[0258]此处所用的术语“恶性肿瘤”指非良性肿瘤或癌症。此处所用的术语“癌症”指代包括以反常或失控细胞生长表征的恶性肿瘤的一类高度增殖疾病。癌症的范例包括，但不限于，癌，淋巴瘤，胚细胞瘤，肉瘤以及白血病或淋巴系统恶性肿瘤。下文指出了该种癌症更特定的范例，其包括：鳞状细胞癌(如上皮鳞状细胞癌)，肺癌，包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌与肺鳞状细胞癌，腹膜癌，肝癌，胃癌(包括胃肠道癌)，胰腺癌，胶质母细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺肿瘤，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，以及头部和颈部癌症。术语“癌症”包括原发恶性细胞或肿瘤(例如，其细胞未转移至对象体内原始恶性肿瘤或肿瘤位点以外的位点的恶性细胞或肿瘤)以及次生恶性细胞或肿瘤(例如，来自恶性细胞或肿瘤细胞转移至与原始肿瘤位点不同的其它位点的转移肿瘤的恶性细胞或肿瘤)。适于本发明的治疗方法的癌症带有过量表达或异常表达IGF-1R的细胞。
[0259]癌症或恶性肿瘤的其它范例包括，但不限于：位于上述列举的器官的儿童急性淋巴细胞性白血病，急性成淋巴细胞性白血病，急性淋巴性白血病，急性髓细胞性白血病，肾上腺皮质癌，成人(原发)肝癌，成人(原发)肝癌，成人急性淋巴细胞白血病，成人急性髓系白血病，成人Hodgkin病，成人Hodgkin淋巴瘤，成人淋巴细胞性白血病，成人非Hodgkin淋巴瘤，成人原发性肝癌，成人软组织肉瘤，艾滋病相关的淋巴瘤，艾滋病相关的恶性肿瘤，肛门癌，星形细胞瘤，胆道癌，膀胱癌，骨肿瘤，脑干胶质瘤，脑肿瘤，乳腺癌，肾盂和输尿管癌，中枢神经系统(原发)淋巴瘤，中枢神经系统淋巴瘤，小脑星形细胞瘤，脑星形细胞瘤，子宫颈癌，儿童(原发)肝癌，儿童(原发)肝癌，儿童急性淋巴细胞白血病，儿童急性髓细胞性白血病，儿童脑干胶质瘤，儿童小脑星形细胞瘤，脑星形细胞瘤的童年，儿童颅外生殖细胞肿瘤，儿童Hodgkin病，童年Hodgkin淋巴瘤的，儿童下丘脑和视觉通路胶质瘤，儿童淋巴细胞白血病，儿童髓母细胞瘤，儿童非Hodgkin淋巴瘤，儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童原发性肝癌，儿童横纹肌肉瘤，儿童软组织肉瘤，儿童的视觉途径和下丘脑胶质瘤，慢性淋巴细胞性白血病，慢性粒细胞性白血病，结肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤，内分泌胰岛细胞癌，子宫内膜癌，室管膜瘤，上皮癌，食道癌，Ewing肉瘤和相关的肿瘤，外分泌胰腺癌，颅外生殖细胞肿瘤，性腺外生殖细胞肿瘤，肝外胆管肿瘤，眼癌，女性乳癌，Gaucher症，胆囊癌，胃癌，胃肠道良性肿瘤，胃肠道肿瘤，生殖细胞肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，毛细胞白血病，头部和颈部癌症，肝癌，Hodgkin病，Hodgkin淋巴瘤，高丙球蛋白血症，下咽骨癌，肠道癌，眼内黑色素瘤，胰岛细胞癌，胰岛细胞胰腺癌，Kaposi肉瘤，肾癌，喉癌，唇和口腔癌，肝癌，肺癌，淋巴细胞增生性疾病，巨球蛋白血症，男性乳腺癌，恶性间皮瘤，恶性胸腺瘤，髓母细胞瘤，恶性黑色素瘤，间皮瘤，转移隐匿性原发性鳞状头颈癌，转移性原发性鳞状头颈癌，转移性鳞状颈部癌症，多发性骨髓瘤，多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤，骨髓增生异常综合征，粒细胞性白血病，骨髓性白血病，骨髓增殖性疾病，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，怀孕期间的非Hodgkin淋巴瘤，非黑素瘤皮肤癌，非小细胞肺癌，不明的原发转移性鳞状头颈癌，口咽癌，骨恶性纤维肉瘤，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤，骨的骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，卵巢低恶性潜能的肿瘤，胰腺癌，病变蛋白血症，紫癜，甲状腺癌，阴茎癌，嗜铬细胞瘤，垂体瘤，浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，原发性肝癌，前列腺癌，直肠癌，肾细胞癌，肾盂和输尿管癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺肿瘤，结节病肉瘤，Sezary综合征，皮肤癌，小细胞肺癌，小肠肿瘤，软组织肉瘤，鳞状颈部癌症，胃癌，幕上原始神经及松果体肿瘤，T细胞淋巴瘤，睾丸癌，胸腺瘤，甲状腺癌，肾盂和输尿管的移行细胞癌，过渡性肾盂和输尿管癌，滋养细胞肿瘤，输尿管和肾盂肾细胞癌，尿道癌，子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，视觉通路和下丘脑胶质瘤，外阴癌症，Waldenstrom巨球蛋白血症，Wilms肿瘤，以及除肿瘤外任何其他高度增殖疾病。
[0260]本发明的方法可用于治疗癌变前症状，并用于预防肿瘤或恶性状态进展，包括但不限于上述的紊乱。该种用途体现在肿瘤或癌症的症状或在先进展，特别地，由增生，转化组成的非肿瘤细胞的生长，更特别地，已发生的发育不良(有关该异常生长条件的综述，参见Robbins和Angell，Basic Pathology，2d Ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.68-79(1976)。该种细胞开始表达，过量表达或异常表达IGF-1R的症状特别适于本发明的方法进行治疗。
[0261]增生是一种受控制的细胞增殖形式，其涉及在组织或器官内细胞数量的增长，且不明显改变结构或功能。可通过本发明的方法治疗的增生性紊乱包括，但不限于，血管纵隔淋巴结增生，伴有嗜酸性粒细胞性非典型黑色素细胞增生的血管淋巴增生，基底细胞增生，良性巨大淋巴结增生，牙骨质增生症，先天性肾上腺增生症，先天性皮脂腺增生，囊性增生症，囊性增生症的乳房，全口义齿增生，导管增生，子宫内膜增生，纤维增生，局灶性上皮增生，牙龈增生，炎症骨纤维异常增殖症，炎性乳头状增生，血管内乳头状内皮增生症，结节性前列腺增生症，结节性再生性增生，假性增生症，老年性皮脂腺增生和疣状增生。
[0262]化生是一种受控的细胞生长形式，其中一类成熟或完全分化细胞取代了另一类成熟细胞。可被本发明的方法治疗的化生型紊乱包括，但不限于，病因不明性髓性化生，顶浆化生，非典型化生，字体实质性化生，结缔组织化生，上皮化生，肠内化生，变形性贫血，化生骨化，化生息肉，髓样化生，原生髓性化生，次生髓性化生，鳞状化生，鳞状化生羊膜以及症状髓化生。
[0263]发育不良常是癌症的前兆，并主要发现于上皮；它是非肿瘤细胞生长最紊乱的形式，包括个体细胞均一性和细胞构筑取向的丧失。发育不良细胞通常异常增大，具有深度染色的细胞核，并显示出多型性。发育不良典型出现在出现慢性刺激或炎症时。可通过本发明的方法治疗的发育不良包括，但不限于，无汗性外胚层发育不良，前面部发育不良，窒息性胸廓发育不良，心一指发育不良，肺支气管发育不良，脑发育不良，宫颈发育不良，软骨外胚层发育不良，锁骨颅骨发育不良，先天性外胚层发育不良，颅面骨干发育不良，颅腕跗骨发育不良，颅干骺发育不良，牙齿发育不良，骨干结构发育不良，外胚层发育不良，牙釉质发育不全，脑眼发育不良，偏侧骨骺发育不良，多发性骨骺发育不良，点状骨骺发育不良，上皮发育不良，面-指-生殖器发育不良，家族性颌骨纤维发育不良，家族性白色折叠发育不良，肌纤维发育不良，骨纤维发育不良，旺盛骨性发育不良，遗传性肾脏视网膜发育不良，汗外胚层发育不良，少外胚层发育不良，淋巴细胞减少性胸腺发育不良，乳腺发育不良，颌面部发育不良，干髓端软骨发育不良，Mondini发育不良，单骨纤维性骨发育不良，肌上皮发育不良，多发性骨骺发育不良，眼耳脊椎发育不良，眼-齿-指发育不良，眼脊椎发育不良，齿源性发育不良，眼下颌肢发育不良，根尖周牙骨质发育不良，多骨性纤维性结构不良，假性软骨发育发育不良，视网膜发育不良，隔-视神经发育不良，脊柱骨骺发育不良以及脑室径向发育不良。
[0264]其它可通过本发明的方法治疗的肿瘤前紊乱包括，但不限于，良性高度增殖紊乱(例如，良性肿瘤，纤维囊性症状，组织肥大，肠息肉，结肠息肉，以及食管发育不良)，粘膜白斑病，角化病，Bowen病，农户皮肤病，日光性唇炎以及日光性角化病。
[0265]在优选的实施方式中，本发明的方法用于抑制癌症，特别是上述癌症的生长，进展，和/或转移。
[0266]其它的高度增殖疾病，紊乱和/或症状包括，但不限于，恶性肿瘤的进展和/或转移瘤以及相关的紊乱，如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病，急性髓性白血病(包括成髓细胞，前髓细胞，髓单核细胞，单核细胞以及红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))，真性红细胞增多症，淋巴瘤(例如，Hodgkin和非Hodgkin病)，多发性骨髓瘤，Waldenstrom巨球蛋白血症，重链疾病，以及实体肿瘤，包括但不限于，肉瘤和癌，如纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，Ewing肿瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，肺癌，肾细胞癌，肝癌，胆道癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎瘤，Wilm瘤，子宫颈癌，睾丸肿瘤，肺癌，小细胞肺癌癌，膀胱癌，上皮癌，胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤，胶质瘤，脑膜瘤，黑色素瘤，神经母细胞瘤，以及视网膜母细胞瘤。
II.IGF-1R
[0267]天然存在的胰岛素样生长因子受体-1(IGF-1R)IGF-1R是由二硫键连接的两个α-亚基(各为130kDa)和两个β-亚基(各为90kDa)构成的异四聚体质膜糖蛋白。Massagué，J.和Czech，M.P.J.Biol.Chem.257：5038-5045(1992)。IGF-1R在本领域中还以CD221和JTK13的名称出现。人IGF-1R mRNA的核酸序列可通过GenBank索取号NM_000875获得，并作为SEQ ID NO：1在下文显示。
SEQ IDNO：1
>gi|11068002|ref|NM_000875.2|人胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)，mRNA
TTTTTTTTTTTTTTGAGAAAGGGAATTTCATCCCAAATAAAAGGAATGAAGTCTGGCTCCGGAGGAGGGT
CCCCGACCTCGCTGTGGGGGCTCCTGTTTCTCTCCGCCGCGCTCTCGCTCTGGCCGACGAGTGGAGAAAT
CTGCGGGCCAGGCATCGACATCCGCAACGACTATCAGCAGCTGAAGCGCCTGGAGAACTGCACGGTGATC
GAGGGCTACCTCCACATCCTGCTCATCTCCAAGGCCGAGGACTACCGCAGCTACCGCTTCCCCAAGCTCA
CGGTCATTACCGAGTACTTGCTGCTGTTCCGAGTGGCTGGCCTCGAGAGCCTCGGAGACCTCTTCCCCAA
CCTCACGGTCATCCGCGGCTGGAAACTCTTCTACAACTACGCCCTGGTCATCTTCGAGATGACCAATCTC
AAGGATATTGGGCTTTACAACCTGAGGAACATTACTCGGGGGGCCATCAGGATTGAGAAAAATGCTGACC
TCTGTTACCTCTCCACTGTGGACTGGTCCCTGATCCTGGATGCGGTGTCCAATAACTACATTGTGGGGAA
TAAGCCCCCAAAGGAATGTGGGGACCTGTGTCCAGGGACCATGGAGGAGAAGCCGATGTGTGAGAAGACC
ACCATCAACAATGAGTACAACTACCGCTGCTGGACCACAAACCGCTGCCAGAAAATGTGCCCAAGCACGT
GTGGGAAGCGGGCGTGCACCGAGAACAATGAGTGCTGCCACCCCGAGTGCCTGGGCAGCTGCAGCGCGCC
TGACAACGACACGGCCTGTGTAGCTTGCCGCCACTACTACTATGCCGGTGTCTGTGTGCCTGCCTGCCCG
CCCAACACCTACAGGTTTGAGGGCTGGCGCTGTGTGGACCGTGACTTCTGCGCCAACATCCTCAGCGCCG
AGAGCAGCGACTCCGAGGGGTTTGTGATCCACGACGGCGAGTGCATGCAGGAGTGCCCCTCGGGCTTCAT
CCGCAACGGCAGCCAGAGCATGTACTGCATCCCTTGTGAAGGTCCTTGCCCGAAGGTCTGTGAGGAAGAA
AAGAAAACAAAGACCATTGATTCTGTTACTTCTGCTCAGATGCTCCAAGGATGCACCATCTTCAAGGGCA
ATTTGCTCATTAACATCCGACGGGGGAATAACATTGCTTCAGAGCTGGAGAACTTCATGGGGCTCATCGA
GGTGGTGACGGGCTACGTGAAGATCCGCCATTCTCATGCCTTGGTCTCCTTGTCCTTCCTAAAAAACCTT
CGCCTCATCCTAGGAGAGGAGCAGCTAGAAGGGAATTACTCCTTCTACGTCCTCGACAACCAGAACTTGC
AGCAACTGTGGGACTGGGACCACCGCAACCTGACCATCAAAGCAGGGAAAATGTACTTTGCTTTCAATCC
CAAATTATGTGTTTCCGAAATTTACCGCATGGAGGAAGTGACGGGGACTAAAGGGCGCCAAAGCAAAGGG
GACATAAACACCAGGAACAACGGGGAGAGAGCCTCCTGTGAAAGTGACGTCCTGCATTTCACCTCCACCA
CCACGTCGAAGAATCGCATCATCATAACCTGGCACCGGTACCGGCCCCCTGACTACAGGGATCTCATCAG
CTTCACCGTTTACTACAAGGAAGCACCCTTTAAGAATGTCACAGAGTATGATGGGCAGGATGCCTGCGGC
TCCAACAGCTGGAACATGGTGGACGTGGACCTCCCGCCCAACAAGGACGTGGAGCCCGGCATCTTACTAC
ATGGGCTGAAGCCCTGGACTCAGTACGCCGTTTACGTCAAGGCTGTGACCCTCACCATGGTGGAGAACGA
CCATATCCGTGGGGCCAAGAGTGAGATCTTGTACATTCGCACCAATGCTTCAGTTCCTTCCATTCCCTTG
GACGTTCTTTCAGCATCGAACTCCTCTTCTCAGTTAATCGTGAAGTGGAACCCTCCCTCTCTGCCCAACG
GCAACCTGAGTTACTACATTGTGCGCTGGCAGCGGCAGCCTCAGGACGGCTACCTTTACCGGCACAATTA
CTGCTCCAAAGACAAAATCCCCATCAGGAAGTATGCCGACGGCACCATCGACATTGAGGAGGTCACAGAG
AACCCCAAGACTGAGGTGTGTGGTGGGGAGAAAGGGCCTTGCTGCGCCTGCCCCAAAACTGAAGCCGAGA
AGCAGGCCGAGAAGGAGGAGGCTGAATACCGCAAAGTCTTTGAGAATTTCCTGCACAACTCCATCTTCGT
GCCCAGACCTGAAAGGAAGCGGAGAGATGTCATGCAAGTGGCCAACACCACCATGTCCAGCCGAAGCAGG
AACACCACGGCCGCAGACACCTACAACATCACCGACCCGGAAGAGCTGGAGACAGAGTACCCTTTCTTTG
AGAGCAGAGTGGATAACAAGGAGAGAACTGTCATTTCTAACCTTCGGCCTTTCACATTGTACCGCATCGA
TATCCACAGCTGCAACCACGAGGCTGAGAAGCTGGGCTGCAGCGCCTCCAACTTCGTCTTTGCAAGGACT
ATGCCCGCAGAAGGAGCAGATGACATTCCTGGGCCAGTGACCTGGGAGCCAAGGCCTGAAAACTCCATCT
TTTTAAAGTGGCCGGAACCTGAGAATCCCAATGGATTGATTCTAATGTATGAAATAAAATACGGATCACA
AGTTGAGGATCAGCGAGAATGTGTGTCCAGACAGGAATACAGGAAGTATGGAGGGGCCAAGCTAAACCGG
CTAAACCCGGGGAACTACACAGCCCGGATTCAGGCCACATCTCTCTCTGGGAATGGGTCGTGGACAGATC
CTGTGTTCTTCTATGTCCAGGCCAAAACAGGATATGAAAACTTCATCCATCTGATCATCGCTCTGCCCGT
CGCTGTCCTGTTGATCGTGGGAGGGTTGGTGATTATGCTGTACGTCTTCCATAGAAAGAGAAATAACAGC
AGGCTGGGGAATGGAGTGCTGTATGCCTCTGTGAACCCGGAGTACTTCAGCGCTGCTGATGTGTACGTTC
CTGATGAGTGGGAGGTGGCTCGGGAGAAGATCACCATGAGCCGGGAACTTGGGCAGGGGTCGTTTGGGAT
GGTCTATGAAGGAGTTGCCAAGGGTGTGGTGAAAGATGAACCTGAAACCAGAGTGGCCATTAAAACAGTG
AACGAGGCCGCAAGCATGCGTGAGAGGATTGAGTTTCTCAACGAAGCTTCTGTGATGAAGGAGTTCAATT
GTCACCATGTGGTGCGATTGCTGGGTGTGGTGTCCCAAGGCCAGCCAACACTGGTCATCATGGAACTGAT
GACACGGGGCGATCTCAAAAGTTATCTCCGGTCTCTGAGGCCAGAAATGGAGAATAATCCAGTCCTAGCA
CCTCCAAGCCTGAGCAAGATGATTCAGATGGCCGGAGAGATTGCAGACGGCATGGCATACCTCAACGCCA
ATAAGTTCGTCCACAGAGACCTTGCTGCCCGGAATTGCATGGTAGCCGAAGATTTCACAGTCAAAATCGG
AGATTTTGGTATGACGCGAGATATCTATGAGACAGACTATTACCGGAAAGGAGGCAAAGGGCTGCTGCCC
GTGCGCTGGATGTCTCCTGAGTCCCTCAAGGATGGAGTCTTCACCACTTACTCGGACGTCTGGTCCTTCG
GGGTCGTCCTCTGGGAGATCGCCACACTGGCCGAGCAGCCCTACCAGGGCTTGTCCAACGAGCAAGTCCT
TCGCTTCGTCATGGAGGGCGGCCTTCTGGACAAGCCAGACAACTGTCCTGACATGCTGTTTGAACTGATG
CGCATGTGCTGGCAGTATAACCCCAAGATGAGGCCTTCCTTCCTGGAGATCATCAGCAGCATCAAAGAGG
AGATGGAGCCTGGCTTCCGGGAGGTCTCCTTCTACTACAGCGAGGAGAACAAGCTGCCCGAGCCGGAGGA
GCTGGACCTGGAGCCAGAGAACATGGAGAGCGTCCCCCTGGACCCCTCGGCCTCCTCGTCCTCCCTGCCA
CTGCCCGACAGACACTCAGGACACAAGGCCGAGAACGGCCCCGGCCCTGGGGTGCTGGTCCTCCGCGCCA
GCTTCGACGAGAGACAGCCTTACGCCCACATGAACGGGGGCCGCAAGAACGAGCGGGCCTTGCCGCTGCC
CCAGTCTTCGACCTGCTGATCCTTGGATCCTGAATCTGTGCAAACAGTAACGTGTGCGCACGCGCAGCGG
GGTGGGGGGGGAGAGAGAGTTTTAACAATCCATTCACAAGCCTCCTGTACCTCAGTGGATCTTCAGTTCT
GCCCTTGCTGCCCGCGGGAGACAGCTTCTCTGCAGTAAAACACATTTGGGATGTTCCTTTTTTCAATATG
CAAGCAGCTTTTTATTCCCTGCCCAAACCCTTAACTGACATGGGCCTTTAAGAACCTTAATGACAACACT
TAATAGCAACAGAGCACTTGAGAACCAGTCTCCTCACTCTGTCCCTGTCCTTCCCTGTTCTCCCTTTCTC
TCTCCTCTCTGCTTCATAACGGAAAAATAATTGCCACAAGTCCAGCTGGGAAGCCCTTTTTATCAGTTTG
AGGAAGTGGCTGTCCCTGTGGCCCCATCCAACCACTGTACACACCCGCCTGACACCGTGGGTCATTACAA
AAAAACACGTGGAGATGGAAATTTTTACCTTTATCTTTCACCTTTCTAGGGACATGAAATTTACAAAGGG
CCATCGTTCATCCAAGGCTGTTACCATTTTAACGCTGCCTAATTTTGCCAAAATCCTGAACTTTCTCCCT
CATCGGCCCGGCGCTGATTCCTCGTGTCCGGAGGCATGGGTGAGCATGGCAGCTGGTTGCTCCATTTGAG
AGACACGCTGGCGACACACTCCGTCCATCCGACTGCCCCTGCTGTGCTGCTCAAGGCCACAGGCACACAG
GTCTCATTGCTTCTGACTAGATTATTATTTGGGGGAACTGGACACAATAGGTCTTTCTCTCAGTGAAGGT
GGGGAGAAGCTGAACCGGC
[0268]该前体多肽序列可通过GenBank索取号NP_000866获得，并作为SEQ ID NO：2在下文显示
SEQ ID NO：2
>gi I 4S57665|ref|NP_000866.1|胰岛素样生长因子1受体前体[人类]
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGYLHILLISKAEDY
RSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGA
IRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNR
CQKMCPSTCGKRACTENNECCHPECLGSCSAPDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDRD
FCANILSAESSDSEGFVIHDGECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQML
QGCTIFKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSF
YVLDNQNLQQLWDWDHRNLTIKAGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCES
DVLHFTSTTTSKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNK
DVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVK
WNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDIEEVTENPKTEVCGGEKGPCC
ACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADTYNITDPEE
LETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTW
EPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSL
SGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIHLIIALPVAVLLIVGGLVIMLYVFHRKRNNSRLGNGVLYASVNPEY
FSAADVYVPDEWEVAREKITMSRELGQGSFGMVYEGVAKGVVKDEPETRVAIKTVNEAASMRERIEFLNE
ASVMKEFNCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIMELMTRGDLKSYLRSLRPEMENNPVLAPPSLSKMIQMAGEIA
DGMAYLNANKFVHRDLAARNCMVAEDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMSPESLKDGVFT
TYSDVWSFGVVLWEIATLAEQPYQGLSNEQVLRFVMEGGLLDKPDNCPDMLFELMRMCWQYNPKMRPSFL
EIISSIKEEMEPGFREVSFYYSEENKLPEPEELDLEPENMESVPLDPSASSSSLPLPDRHSGHKAENGPG
PGVLVLRASFDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSSTC
[0269]据报道SEQ ID NO：2的氨基酸1至30编码IGF-1R信号肽，SEQ ID NO：2的氨基酸31至740编码IGF-1Rα-亚基，而SEQID NO：2的氨基酸741至1367编码IGF-1Rβ-亚基。NP_000866GenBank登记项目所报导的人IGF-1R的以上和其它特征显示于表2。
表2
| SEQ ID NO：2 | 特征(来自NP_000866) |
| 1至30 | 信号肽 |
| 31至740 | 胰岛素样生长因子1受体α链 |
| 51至161 | 受体L结构域 |
| 230至277 | Furin样重复 |
| 372至467 | 受体L结构域 |
| 494至606 | 3型纤连蛋白结构域 |
| 611至>655 | 3型纤连蛋白结构域 |
| 741至1367 | 胰岛素样生长因子1受体β |
| 835至924 | 3型纤连蛋白结构域 |
| 931至955 | 跨膜区 |
| 973 | 磷酸化 |
| 980 | 磷酸化 |
| 991至1268 | 酪氨酸激酶，催化区 |
| 1161 | 磷酸化 |
| 1165 | 磷酸化 |
| 1166 | 磷酸化 |
[0270]本发明还涉及特异性，优先或竞争性结合非人IGF-1R蛋白(例如，来自啮齿动物或非人灵长动物的IGF-1R)的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物。
[0271]IGF-1R在多种肿瘤细胞中表达，包括，但不限于以下某些肿瘤：膀胱肿瘤(Hum.Pathol.34：803(2003))；脑部肿瘤(ClinicalCancer Res.8：1822(2002))；乳腺肿瘤(Eur.J.Cancer 30：307(1994)和Hum Pathol.36：448-449(2005))；结肠肿瘤，如腺癌，转移瘤和腺瘤(Human Pathol.30：1128(1999)，Virchows.Arc.443：139(2003)，和Clinical Cancer Res.10：843(2004))；胃部肿瘤(Clin.Exp.Metastasis21：755(2004))；肾脏肿瘤，如透明细胞，不染色细胞和乳突RCC(Am.J.Clin.Pathol.122：931-937(2004))；肺部肿瘤(Hum.Pathol.34：803-808(2003)和J.Cancer Res.Clinical Oncol.119：665-668(1993))；卵巢肿瘤(Hum.Pathol.34：803-808(2003))；胰腺肿瘤，例如，导管腺癌(Digestive Diseases.Sci.48：1972-1978(2003)和ClinicalCancer Res.11：3233-3242(2005))；以及前列腺肿瘤(Cancer Res.62：2942-2950(2002))。
III.IGF-1R抗体
[0272]在一个实施方式中，本发明提供了IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物。例如，本发明至少包括表3和表4中显示的特定的单克隆抗体，及其片段，变体和衍生物的抗原结合区。表3列举了从噬菌体展示库鉴定的人抗-人IGF-1R Fab区以及该抗体的各种结合属性，该内容在实施例中有具体的描述。表4列举了通过杂交瘤技术鉴定的鼠抗-人IGF-1R单克隆抗体以及该抗体的各种结合属性，该内容在实施例中有具体的描述。
表3：IGF-1R特异性Fabs的功能属性。
pTy-IGF-1R >30％@0.1ug/ml +++ 配体阻断>30％@o.1ug/ml +++
>30％@1ug/ml ++ >30％@1ug/ml ++
>30％@10ug/ml + >30％@10ug/ml +
>OD2×bkg
ELISA @0.1ug/ml +++
>OD2×bkg@1ug/ml ++
>OD2×bkg
@10ug/ml +
表4：鼠单克隆抗体的功能属性
1MCF-1＝乳腺癌细胞；H-23和Calu-6＝肺癌细胞；Panc-1＝胰腺癌细胞；
Colo205＝结肠癌细胞
pTy-IGF-1R 配体阻断 ＊Ki67抑制(MCF-7) 增殖抑制
>30％@0.1μg/ml +++ >40％@0.1μg/ml +++ >50％@0.01μg/ml ++++ >30％@0.01μg/ml ++++
>30％@1μg/ml ++ >40％@1μg/ml ++ >50％@0.1μg/ml +++ >30％@0.1μg/ml +++
>30％@10μg/ml + >40％@10μg/ml + >50％@1μg/ml ++ >30％@1μg/ml ++
>50％@10μg/ml + >30％@10μg/ml +
[0273]表达全长抗体M13-C06和M14-C03的中国仓鼠卵巢细胞系于2006年3月28日保藏在美国典型菌种保藏中心(＂ATCC＂)，其ATCC保藏编号分别为PTA-7444和PTA-7445。表达全长Fab抗体片段M14-G11的中国仓鼠卵巢细胞系于2006年8月29日保藏在美国典型菌种保藏中心(＂ATCC＂)，其ATCC保藏编号为PTA-7855。
[0274]表达全长人源抗体P2A7.3E11，20C8.3B8和P1A2.2B11的杂交瘤细胞系分别于2006年3月28日，2006年6月13日和2006年3月28日保藏在ATCC，其ATCC保藏编号分别为PTA-7458，PTA-7732和PTA-7457。表达全长人源抗体20D8.24B11，P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤细胞系分别于2006年3月28日，2006年7月11日和2006年7月11日保藏在ATCC，其ATCC保藏编号分别为PTA-7456，PTA-7730和PTA-7731。参见ATCC保藏表(下文)以了解抗体和保藏细胞系之间的关系。
[0275]ATCC位于美国弗吉尼亚州20110-2209，马纳萨斯，大学路10801号。该ATCC保藏系参照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约进行。
[0276]本发明的部分实例保藏于美国典型菌种保藏中心，如下表(“ATCC保藏表”)所示。
ATCC保藏表
[0277]此处所用的术语”抗原结合区”包括特异性结合抗原上的表位(例如，IGF-1R的表位)的位点。抗体的抗原结合区通常包括至少部分的免疫球蛋白重链可变区和至少部分的免疫球蛋白轻链可变区。由这些可变区形成的结合位点决定了该抗体的特异性。
[0278]本发明更具体地提供了IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物，其中该IGF-1R抗体与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同IGF-R1表位。
[0279]本发明进一步涉及IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物，其中该IGF-1R抗体竞争性抑制选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体结合IGF-1R。
[0280]本发明还涉及IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物，其中该IGF-1R抗体包含与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体具有一致的抗原结合区。
[0281]制备抗体的方法在本领域公知并在此描述。一旦对各种片段或对无信号序列的全长IGF-1R的抗体制备得到，该抗体或抗原结合片段所结合的IGF-1R的氨基酸或表位可通过此处所述并为本领域公知的表位定位方案(例如，在＂Chapter 11-Immunology，＂Current Protocols in Molecular Biology，Ed.Ausubel等人.，v.2，JohnWiley & Sons，Inc.(1996)中描述的双抗体夹心ELISA)进行测定。其它的表位定位方案可参见Morris，G.Epitope Mapping Protocols，New Jersey：Humana Press(1996)，其全文在此引用作为参考。表位定位还可以采用现有的商业方法(即，ProtoPROBE，Inc.(Milwaukee，Wisconsin))进行。
[0282]此外，所生产的结合IGF-1R任意部分的抗体可通过其作为IGF-1R拮抗剂的能力(例如，抑制胰岛素生长因子与例如IGF-1，IGF-2的结合，或抑制IGF-1和IGF-2两者与IGF-1R的结合，促进IGF-1R的内在化，抑制IGF-1R的磷酸化，抑制例如Akt或p42/44MAPK的下游磷酸化，或是抑制肿瘤细胞增殖，运动或转移)进行筛选。可参照实施例中详细描述的方法通过这些或其它的属性筛选抗体。本发明的抗体的其它功能可采用此处实施例中描述的其它测定方法进行测试。
[0283]在其它实施方式中，本发明包括特异性或优先结合IGF-1R的至少一个表位的抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物，其中该表位包含，主要包含，或由SEQ ID NO：2的至少四至五个，至少七个，至少九个，或介于至少约15至约30个氨基酸组成。所述的SEQ ID NO：2的给定表位的氨基酸可以是(但并非必需)邻近或线性的。在特定的实施方式中，GF-1R的至少一个表位包括，主要包括，或由在细胞表面表达的或作为可溶性片段的GF-1R胞外区形成的(例如，融合至IgG Fc区)非线性表位组成。因此，在特定的实施方式中，IGF-1R的至少一个表位包括，主要包括，或由SEQID NO：2的至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少15个，至少30个，介于约15至约30个，或至少10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100个邻近或非邻近氨基酸组成，其中非邻近氨基酸通过蛋白折叠形成表位。
[0284]在其他实施方式中，本发明包括特异性或优先结合IGF-1R至少一个表位的抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物，其中该表位在上述的一个，两个，三个，四个，五个，六个或更多个SEQ ID NO：2的邻近或非邻近氨基酸的基础上包含，主要包含，或由修饰蛋白的附加部分(例如，可包括糖部分，从而使IGF-1R抗体能够对修饰目标蛋白以高于未修饰蛋白的亲和性进行结合)组成。替代性地，该IGF-1R抗体完全不与未经修饰的该目标蛋白相结合。
[0285]在特定方面，本发明包括了与解离常数(KD)小于给定参考单克隆抗体KD的亲和性特征的IGF-1R多肽或其片段，或IGF-1R变体多肽特异性结合的抗体，其抗原结合片段，变体或衍生物。
[0286]在特定的实施方式中，本发明的抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物可特异性结合上述IGF-1R或片段或变体的至少一个表位(即，与不相关的或随机表位相比更轻易地与该表位结合)；优先结合上述IGF-1R或片段或变体的至少一个表位(即，与不相关的，相近的，同源的，或类似表位相比更轻易地与该表位结合)；竞争性抑制本身与上述IGF-1R或片段或变体的至少一个表位或片段或变体的特定表位结合的参考抗体的结合；或以解离常数KD小于约5 x 10-2M，约10-2M，约5 x 10-3M，约10-3M，约5x 10-4M，约10-4M，约5 x 10-5M，约10-5M，约5 x 10-6M，约10-6M，约5 x 10-7M，约10-7M，约5 x 10-8M，约10-8M，约5 x 10-9M，约10-9M，约5 x 10-10M，约10-10M，约5 x 10-11M，约10-11M，约5 x 10-12M，约10-12M，约5 x 10-13M，约10-13M，约5 x 10-14M，约10-14M，约5 x 10-15M，约10-15M表征的亲和性结合上述IGF-1R或片段或变体的至少一个表位。在一个特定的方面，该抗体或其片段相对鼠IGF-1R多肽或其片段优先结合人IGF-1R多肽或其片段。在另一特定的方面，该抗体或其片段优先结合一种或多种IGF-1R多肽或其片段(例如，一种或多种哺乳动物IGF-1R多肽)，但不结合胰岛素受体(InsR)多肽。不希望受限于理论，已知胰岛素受体多肽具有部分与IGF-1R多肽类似的序列，且与InsR交叉反应的抗体可在体内产生有害副作用，例如，干扰葡萄糖代谢。
[0287]在抗体结合解离常数上下文所用的术语“约”允许了用于测量抗体亲和性的方法的内在变差程度。例如，依据所用仪器的精度，基于所测样本的样本数的标准误差，以及常规误差，术语约“10-2M”可包括，如从0.05M至0.005M。
[0288]在特定实施方式中，本发明的抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物以小于或等于5 X 10-2/秒，10-2/秒，5 X 10-3/秒或10-3/秒的解离速率(k(off))与IGF-1R多肽或其片段或变体相结合。此外，本发明的抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物以小于或等于5 X 10-4/秒，10-4/秒，5 X 10-5/秒，或10-5/秒5 X 10-6/秒，10-6/秒，5 X 10-7/秒或10-7/秒的解离速率(k(off))与IGF-1R多肽或其片段或变体相结合。
[0289]在其他实施方式中，本发明的抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物以大于或等于103M-1/秒，5 X 103M-1/秒，104M-1/秒或5 X 104M-1/秒的结合速率(k(on))与IGF-1R多肽或其片段或变体相结合。替代性地，本发明的抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物以大于或等于105M-1/秒，5 X 105M-1/秒，106M-1/秒或5 X106M-1/秒或107M-1/秒的结合速率(k(on))与IGF-1R多肽或其片段或变体相结合。
[0290]在各实施方式中，此处所述的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物为IGF-1R活性的拮抗剂。例如，在特定实施方式中，拮抗剂IGF-1R抗体与肿瘤细胞上表达的IGF-1R的结合抑制胰岛素生长因子(例如，IGF-1，IGF-2，或IGF-1和IGF-2两者)与IGF-1R的结合，促进IGF-1R的内在化，从而抑制其信号转导能力，抑制IGF-1R的磷酸化，抑制该信号转导途径下游分子(例如，Akt或p42/44 MAPK)的磷酸化，或抑制肿瘤细胞增殖，运动和转移。
[0291]除非另行指出，此处所用的“其片段”指与一种抗原结合片段有关的抗体，即，与该抗原特异性结合的该抗体的部分。在一个实施方式中，IGF-1R抗体(如本发明抗体)为对超过一个表位(例如，超过一个抗原或超过一个在相同抗原上的表位)具有结合特异性的双特异性IGF-1R抗体(例如，双特异性抗体)，微抗体，区域删除抗体或融合蛋白。在一个实施方式中，双特异性IGF-1R抗体对此处披露的目标多肽(例如，IGF-1R)的至少一个表位具有至少一个特异性的结合区域。在另一个实施方式中，双特异性IGF-1R抗体对目标多肽的一个表位具有至少一个特异性的结合区域，或对药物或毒素具有至少一个特异性的目标结合区。在另一个实施方式中，一种双特异性IGF-1R抗体对此处所述的目标多肽的一个表位具有至少一个特异性的结合区域，或对一种前药具有至少一个特异性的结合区。双特异性IGF-1R抗体可以是一种四价抗体，其带有两个对此处所述的目标多肽的表位具特异性的目标结合区，以及两个对第二目标具有特异性的目标结合区。因此，四价双特异性IGF-1R抗体可以对各特异性为双价。
[0292]如本领域普通技术人员所知，本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物可包含介导一种或多种效应功能的恒定区。例如，补体的Cl成分与抗体恒定区的结合可激活补体系统。补体的激活对于细胞病原体的调理和溶解非常重要。补体的激活还刺激炎症应答，并且还可参与自身免疫超敏性。此外，抗体通过Fc区结合各种细胞上的受体，其中抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合细胞上的Fc受体(FcR)。有多种Fc受体对不同类别的抗体具有特异性，包括IgG(gamma受体)，IgE(epsilon受体)，IgA(alpha受体)和IgM(mu受体)。抗体与细胞表面上Fc受体的结合可引发一系列重要的和多样的生物应答，包括抗体包裹粒子吞没和破坏，免疫复合物的清除，杀伤细胞对抗体包裹的目标细胞的溶解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒，或ADCC)，炎症介质的释放，胎盘转移和免疫球蛋白生产的控制。
[0293]相应地，本发明特定的实施方式包括IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物，其中一个或多个恒定区域的至少一个部分被删除或以其它方式改造从而提供所需的生化性质，例如下降的效应功能，非共价二聚化的能力，提高的肿瘤位点定位能力，下降的血清半衰期，或是与具有大致相同免疫原性的完整，未改造的抗体相比具有提高的血清半衰期。例如，此处所述的诊断和治疗方法中采用的特定抗体为包含了与免疫球蛋白重链类似的多肽链，但缺失了一个或多个重链区的至少一部分的区域缺失抗体。例如，在特定的抗体中，修饰抗体的恒定区中的一个完整区域将被删除，例如，CH2区的全部或部分将被删除。在其它实施方式中，此处所述的诊断和治疗方法中采用的特定抗体的恒定区(例如，IgG4重链恒定区)经改造去除了糖基化，在本文别处称为“agly”抗体。不希望受限于理论，据认为“agly”抗体体内具有提高的安全性和稳定性。
[0294]在此处所述的特定IGF-1R抗体或其抗原结合片段，变体或衍生物中，可采用本领域已知技术对Fc部分进行突变以降低效应功能。例如，(通过点突变或其它方法)对恒定区域的删除或灭活可降低循环修饰抗体的Fc受体结合从而提高肿瘤定位。在其它情况下恒定区修饰与本发明的适度互补结合相一致从而减少了血清半衰期以及与结合细胞毒素的非特异性结合。恒定区的另一种修饰可用于修饰二硫键或寡糖部分从而通过提高抗原特异性或抗体灵活性来增强定位。通过修饰得到的生理功能，生物相容性以及其它生化作用(例如肿瘤定位，生物分布以及血清半衰期)可通过公知的免疫技术在不采取附加试验的情况下轻易地进行检测和定量。
[0295]本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段，变体或衍生物的修饰形式可采用本领域已知技术由完整前体或亲代抗体制备得到。此处对示范性技术进行了更具体的讨论。
[0296]在特定实施方式中，IGF-1R抗体或其抗原结合片段，变体或衍生物的可变和恒定区均为完全人源。全人源抗体可通过本领域已知的以及此处描述的技术进行制备。例如，针对特异性抗原的全人源抗体可通过向经修饰在应答抗原性攻击时生产该种抗体同时其内源性基因座被灭活的转基因动物施用抗原进行制备。可用于制备该种抗体的示范性技术参见美国专利6,150,584；6,458,592；6,420,140。其它的技术已为本领域所知。如本文其它部分将作更具体讨论，全人源抗体还可通过各种展示技术进行制备，例如噬菌体展示或其它病毒展示系统。
[0297]本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段，变体或衍生物可通过本领域已知的技术进行制备或生产。在特定的实施方式中，抗体分子或其片段可进行“重组生产”，即，采用重组DNA技术进行生产。制备抗体分子或其片段的示范性技术将在本文其它部分作更详细的讨论。
[0298]本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物还包括经修饰的衍生物，例如，将任何类型的分子共价连接至该抗体，并使该共价连接不阻止抗体特异性结合其同源表位。例如，但非限制，该抗体衍生物包括通过糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酰化，酰胺化，通过已知的保护/阻断基团进行衍生化，蛋白水解裂解，与细胞配体或其它蛋白连接等方法修饰得到的抗体。各种化学修饰中的任意一种均可通过已知技术实现，包括，但不限于特异性化学裂解，乙酰化，甲酰化，衣霉素代谢合成等。此外，该衍生物可包含一个或多个非传统氨基酸。
[0299]在特定的实施方式中，本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物不会引起待治疗动物(例如，人)体内的有害免疫应答。在一个实施方式中，本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物可通过本领域认可的技术进行修饰以降低其免疫原性。例如，可对抗体进行人源化，灵长源化，去免疫化，或可制备嵌合抗体。这些抗体类型来自于非人源抗体，通常为保留或充分保留了父代抗体的抗原结合功能，但在人体内具有更低免疫原性的鼠或灵长动物抗体。这可通过多种方法实现，包括(a)将完整非人类可变区嫁接至人恒定区以生成嵌合抗体；(b)将一个或多个非人类决定簇互补区(CDRs)的至少一部分嫁接至保留或未保留关键框架残基的人框架和恒定区；或(c)移植整个非人类可变区，但通过替换表面残基以类人切片将其“包覆”。该类方法参见Morrison等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.57：6851-6855(1984)；Morrison等人，Adv.Immunol.44：65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science239：15341536(1988)；Padlan，Molec.Immun.25：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.37：169217(1994)，以及U.S.Pat.Nos.5,585,089，5,693,761，5,693,762和6,190,370，其全文在此引用作为参考。
[0300]去免疫化还可用于降低一种抗体的免疫原性。此处所用的术语“去免疫化”包括对抗体进行改造以修饰T细胞表位(例如，参见WO9852976A1，WO0034317A2)。例如，对来自起始抗体的VH和VL序列进行分析，由各V区“定位”的人T细胞表位显示了与序列内的决定簇互补区(CDRs)和其它关键残基相关的表位定位。对来自于T细胞表位图谱的单独T细胞表位进行分析，以在不轻易改变终抗体活性的情况下鉴定选择性的氨基酸替代物。经设计得到了一系列包括氨基酸替代物组合物的替代VH和VL序列，随后这些序列被整合进入一系列的结合多肽(例如，IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段)以用于此处所述的诊断和治疗方法，并对功能进行测验。通常可生成和测验12-24个变体抗体。然后将包含修饰后的V区和人C区的完整重链和轻链基因克隆进入表达载体，将该后续质粒导入细胞系进行全抗体生产。对该类抗体通过适当的生化和生物测定进行比较，并鉴定得到最佳变体。
[0301]发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片断，变体或衍生物可通过本领域已知的任何方法生成。针对目标抗原的多克隆抗体可通过各种本领域公知的方法生产。例如，一种IGF-1R抗体(如一种IGF-1R特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)可给用至各种宿主动物，包括但不限于，兔子，小鼠，大鼠，鸡，仓鼠，山羊，驴等，以诱导包含了对该抗原特异的多克隆抗体的血浆的生产。依据宿主种类不同，各种佐剂可用于提高免疫应答，其包括但不限于，弗氏试剂(完全或不完全)，矿物凝胶(如氢氧化铝)，表面活性物质如溶血卵磷脂，pluronic多元醇，聚阴离子，肽，油乳剂，匙孔血蓝蛋白，二硝基酚以及潜在有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。该类佐剂已为本领域熟知。
[0302]单克隆抗体可通过本领域已知的多种技术进行制备，包括杂交瘤，重组和噬菌体展示技术的应用及其组合。例如，单克隆抗体可通过本领域已知的杂交瘤技术进行生产，该技术还在许多文献中得到描述，例如，Harlow等人，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.(1988)；Hammerling等人，in：Monoclonal Antibodies and T-CeIl HybridomasElsevier，N.Y.，563-681(1981)(所述文献在此全文引用作为参考)。此处所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”指由单个克隆(包括真核，原核或噬菌体克隆)得到的抗体，而非它的生产方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。单克隆抗体可采用IGF-1R敲除小鼠生产以增加表位识别的区域。单克隆抗体可通过本领域已知的多种技术进行制备，包括本文其它部分所述的杂交瘤和重组和噬菌体展示技术的应用。
[0303]在一个实施例中，采用本领域认可的方案，可通过多次皮下或腹腔注射相关抗原(例如，纯化的IGF-1R抗原，如包含IGF-1R的细胞或细胞萃取物)和佐剂在哺乳动物体内产生抗体。该免疫作用通常可引发包含了从激活的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反应抗体的免疫应答。尽管可从动物血浆获取所得的抗体以进行多克隆制备，通常可从脾，淋巴结或外周血分离单独的淋巴细胞以进行单克隆抗体(MAbs)的均一制备。优选地，该淋巴细胞从脾中获取。
[0304]在该种总所周知的方法中(Kohler等人.，Nature256：495(1975))，该取自注射了抗原的哺乳动物的相对短命或终会死亡的淋巴细胞与一个永生肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)相融合，从而得到了永生的并能生产B细胞的转基因编码抗体的杂交细胞或“杂交瘤”。所得的杂交物通过对包含了能够形成单独抗体的特定基因的单独株系进行挑选，稀释和再生而分离得到单独遗传株系。它们可生产针对目标抗原的相似抗体，并由于其单纯的遗传亲缘而被称为“单克隆”。
[0305]将由此制备的杂交瘤细胞接种和培养至适当的培养基中，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合的，亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。本领域的技术人员均了解用于杂交瘤形成，挑选和培养的试剂，细胞系和介质可从多个来源购买，且已充分建立了标准化的方案。通常对杂交瘤细胞生长的培养基进行分析以测定针对目标抗原的单克隆抗体的生产。优选地，由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀，放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸收分析(ELISA)等体外分析进行测定。当杂交瘤经鉴定能够生产具有所需特异性，亲和性和/或活性的抗体后，该克隆可通过有限稀释法进行亚克隆并以标准方法培养(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，Academic Press，pp 59-103(1986))。进一步会了解，由亚克隆分泌的单克隆抗体可通过蛋白-A，羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和层析等传统方法进行纯化，从培养基，腹水或血浆中分离。
[0306]识别特定表位的抗体片段可通过已知技术生成。例如，可采用木瓜蛋白酶(生产Fab片段)或胃蛋白酶(生产F(ab′)2片段)等酶通过蛋白水解裂解免疫球蛋白分子或重组生产Fab和F(ab′)2片段。F(ab′)2片段包含了可变区，轻链恒定区和重链CH1区。
[0307]本领域技术人员还可理解编码抗体或抗体片段(例如，抗原结合位点)的DNA还可以从抗体库(例如噬菌体展示库)获得。该种噬菌体可特别用于展示由抗体库或组合抗体库(例如，人或鼠)表达的抗原结合区。表达能够结合目标抗原的抗原结合区的噬菌体可通过抗原(例如，采用标记抗原或者固体表面或珠子结合或捕获的抗原)进行选择或鉴别。在这些方法中使用的噬菌体通常为丝状噬菌体，包括fd和M13结合区，该结合区可由Fab，Fv OEDAB(单独轻或重链Fv区)或二硫键稳定的Fv抗体区融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白的噬菌体进行表达。示范性方法可参见，例如，EP 368 684 B1；美国专利5,969,108，Hoogenboom，H.R.以及Chames，Immunol.Today 21：371(2000)；Nagy等人.Nat.Med.5：801(2002)；Huie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：2682(2001)；Lui等人.，J.MoI.Biol.375：1063(2002)，分别在此引用作为参考。许多文献(例如，Marks等人，Bio/Technology 70：779-783(1992))均已描述了通过链替换，以及作为构建大型噬菌体库的策略的组合感染和体内重组对高亲和性人抗体的生产。在另一实施方式中，可采用核糖体展示替代噬菌体作为展示平台(例如，参见Hanes等人，Nat.Biotechnol 18：1287(2000)；Wilson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：3750(2001)；或Irving等人，J.Immunol Methods 248：31(2001))。在另一实施方式中，可通过细胞表面库筛选抗体(Boder等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：10701(2000)；Daugherty等人.，J.Immunol.Methods 243：211(2000))。该类方法可为用于单克隆抗体的分离和后续克隆的传统杂交瘤技术提供替代方法。
[0308]在噬菌体展示方法中，功能性抗体区被展示在携带了对其编码的多聚核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。例如，可从动物cDNA库(例如，人或鼠淋巴组织cDNA库)或合成cDNA库扩增或以其它方式分离编码VH和VL区的DNA序列。在特定实施方式中，该编码VH和VL区的DNA在PCR中通过scFv接头相连接并被克隆进入一个噬菌粒载体(例如，p CANTAB或pComb 3HSS)。将该载体导入E.coli并以辅助噬菌体感染该E.coli。这些方法中所用的噬菌体通常为丝状噬菌体，包括fd和M13，通常将VH或VL区重组融合至噬菌体基因III或基因VIII。表达能够结合目标抗原(即，IGF-1R多肽或其片段)的抗原结合区的噬菌体可通过抗原(例如，采用标记抗原或者固体表面或珠子结合或捕获的抗原)进行选择或鉴别。
[0309]可用于制备该抗体的噬菌体展示方法的附加示范可参见Brinkman等人，J.Immunol.Methods 752：41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods 754：177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等人，Gene 757：9-18(1997)；Burton等人，Advances in Immunology 57：191-280(1994)；PCT公布PCT/GB91/01134；PCT公布WO 90/02809：WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO95/20401；以及U.S.Pat.Nos.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；其全文在此引用作为参考。
[0310]如上述参考文献所述，在噬菌体筛选后，可从该噬菌体分离该抗体编码区并用于生成包括人抗体或任何其它目标抗原结合片段的完整抗体，并在包括哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母和细菌的目标宿主中表达。例如，用于重组生产Fab，Fab′和F(ab′)2片段的技术也可采用本领域已知的技术，例如参见PCTpublication WO 92/22324；Mullinax等人，BioTechniques12(6)：864-869(1992)；以及Sawai等人，AJRI 34：26-34(1995)；和Better等人，Science 240：1041-1043(1988)(所述参考文献全文引用作为参考)。
[0311]可用于生产单链Fvs和抗体的技术示范可参见U.S.Pat.Nos.4,946,778和5,258,498；Huston等人，Methods in Enzymology203：46-88(1991)；Shu等人，PNAS 901995：-1999-7999(1993)；以及Skerra等人，Science 240：1038-1040(1988)。对于某些用途，包括抗体在人体的体内应用和体外检测分析，优选使用嵌合，人源化或人源抗体。嵌合抗体是一种抗体的不同部分来自不同动物种类的分子，例如一种包含了鼠单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法在已为本领域所知。例如，参见Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等人，J.Immunol.Methods 725：191-202(1989)；美国专利5,807,715；4,816,567；和4,816397，其全文在此引用作为参考。人源化抗体指能够与具有一个或多个来自非人类决定簇互补区(CDRs)和人免疫球蛋白分子框架区的目标抗原相结合的由非人类抗体衍生的抗体分子。人框架区的框架残基通常可被CDR供体抗体的相应残基所替代从而改变，优选提高抗原结合。这些框架替换可通过本领域公知的方法进行鉴定，例如，可通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基，可通过序列比较鉴定在特定位点的反常框架残基。(例如，参见Queen等人.，U.S.Pat.No.5,585,089；Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，其全文在此引用作为参考)。抗体可通过多种本领域已知的技术进行人源化，例如，CDR-嫁接(EP 239,400；PCT公布WO 91/09967；美国专利5,225,539；5,530,101；和5,585,089)，镶饰或重塑(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人.，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等人.，PNAS91：969-913，1994)，以及链替换(美国专利5,565,332)。
[0312]完整人类抗体可特别用于人类患者的治疗。人类抗体可通过本领域已知的多种方法制备，包括上述采用来自人免疫球蛋白序列的抗体库进行的噬菌体展示方法。还可参见美国专利4,444,887和4,716,111；以及PCT公布WO 98/46645，WO98/50433，WO98/24893，WO98/16654，WO96/34096，WO96/33735，和WO91/10741；分别全文引用作为参考。
[0313]人类抗体还可采用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行生产。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可随机导入或通过同源重组进入小鼠胚胎干细胞。替代性地，除人重链和轻链基因外，还可将人可变区，恒定区和多样区导入鼠胚胎干细胞。鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可通过同源重组导入的人免疫球蛋白基因座进行单独或同时的非功能性修饰。特别地，JH区纯合子的删除防止了内源抗体的生产。扩增该修饰后的胚胎干细胞并注射进入胚泡以生产嵌合小鼠。然后饲养该嵌合小鼠以生产表达人抗体的纯合子型后代。该转基因小鼠以选择抗原(例如，所需目标多肽的全部或部分)通过常规方式进行免疫。针对该抗原的单克隆抗体可采用常规杂交瘤技术从免疫后的转基因小鼠获取。转基因小鼠包含的人免疫球蛋白转基因在B-细胞分化时重排，随后进行类型转换和体细胞突变。因此，通过该种技术可生产治疗有效的IgG，IgA，IgM和IgE抗体。该技术生产人类抗体的综述可参见Lonberg和Huszar Int.Rev.Immunol.73：65-93(1995)。对技术用于生产人类抗体和人类单克隆抗体以及生产该类抗体的方案的具体讨论可参见PCT公布WO 98/24893；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318和5,939,598等，其全文在此引用作为参考。此外，可委托Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)和GenPharm(San Jose，Calif.)等公司通过与上述类似的技术提供针对选定抗原的人类抗体。
[0314]识别选定表位的完整人类抗体可通过一种称为“定向选择”的技术进行生产。在该方法中采用一种选定的非人类单克隆抗体(例如，小鼠抗体)引导识别相同表位的完整人类抗体的筛选。(Jespers等人，Bio/Technology 72：899-903(1988).还可参见，美国专利5,565,332)。
[0315]此外，针对本发明目标多肽的抗体反过来可通过本领域技术人员公知的技术用于生成“模仿”目标多肽的抗个体型抗体(例如，参见Greenspan和Bona，FASEB J.7(5)：437437(1989)和Nissinoff，J.Immunol.147(8)：2429-2438(1991))。例如，结合和竞争性抑制多肽多聚化和/或本发明多肽与配体的结合的抗体可用于生成“模仿”该抗体多聚化和/或结合区，从而结合和中和多肽和/或其配体的抗独特型。该中和性抗独特型或该抗独特型的Fab片段可用于在治疗领域中和多肽配体。例如，该抗独特型抗体可用于结合所需的目标多肽和/或结合其配体/受体，从而阻断其生物活性。
[0316]在另一实施方式中，编码所需单克隆抗体的DNA可采用常规方法简单分离和测序(例如，可采用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链基因的寡核苷酸探针)。分离的亚克隆杂交瘤细胞可用作该DNA的优选来源。该DNA在分离后可导入表达载体，随后将后者转染进入不生产免疫球蛋白的原核或真核宿主细胞，例如，但不限于，大肠杆菌细胞，猿COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。更具体的说，如1995年1月25日Newman等人提交的美国专利5,658,570所述(在此引用作为参考)，该分离DNA(如此处所述，可为合成DNA)可用于为制备抗体克隆恒定和可变区序列。简要而言，将来自该选定细胞的RNA遗传提取物转化为cDNA，然后以Ig特异性引物进行PCR扩增。能够完成该目的的合适引物还可参见美国专利5,658,570。如下文所将详述，可相对大量培养该表达所需抗体的转化细胞以提供临床或商业所需的免疫球蛋白。
[0317]在一个实施例中，本发明的一种IGF-1R抗体包含一种抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一实施例中，本发明的IGF-1R抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少两个CDRs。在另一实施例中，本发明的IGF-1R抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少三个CDRs。在另一实施例中，本发明的IGF-1R抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少四个CDRs。在另一实施例中，本发明的IGF-1R抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少五个CDRs。在另一实施例中，本发明的IGF-1R抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少六个CDRs。示范性抗体分子至少包含一个能包含在此处所述的对象IGF-1R抗体的CDR。
[0318]在特定的实施方式中，该重链和/或轻链可变区的氨基酸序列可通过本领域公知的方法检查以确定决定簇互补区(CDRs)的序列，例如，可通过比较已知氨基酸序列和其它重链和轻链可变区以确定高可变序列区。可采用常规重组DNA技术将一个或多个CDRs插入框架区，例如，插入人框架区以将非人类抗体人源化。该框架区可以是天然存在的或为共有框架区，且优选人框架区(例如，参见Chothia等人.，J.MoI.Biol.278：457-479(1998)的人框架区列表)。由框架区和CDRs的组合生成的多聚核苷酸优选编码一种能与所需多肽(例如，IGF-1R)的至少一个表位特异性结合的抗体。在框架区内可优选进行一个或多个氨基酸替换，该氨基酸替换优选能够提高抗体与其抗原的结合。此外，该类方法可用于对参与链间二硫键的半胱氨酸残基的一个或多个可变区进行氨基酸替换或删除，从而生成缺失一个或多个链间二硫键的抗体分子。其它对多聚核苷酸的改造在本发明和本领域的现有技术范围内。
[0319]此外，可采用通过拼接具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子基因和具有适当生物活性的人类抗体分子基因生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci 81：851-855(1984)；Neuberger等人，Nature 11,372：604-608(1984)；Takeda等人，Nature314：452-454(1985))。此处所用的嵌合抗体是一种抗体的不同部分来自不同动物种类的分子，例如包含了鼠单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体，如人源化抗体。
[0320]替代性地，根据描述用于生产单链抗体的技术(U.S.Pat.No.4,694,778；Bird，Science 242：423-442(1988)；Huston等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)以及Ward等人，Nature354：544-554(1989))也可用于生成单链抗体。可通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段生成单链抗体。也可采用在大肠杆菌内组装功能性Fv片段的技术(Skerra等人，Science 242：1038-1041(1988))。
[0321]本发明的另一实施方式包含了在不能生成内源免疫球蛋白的转基因动物(例如，小鼠)体内生成人或实质人抗体(例如，参见U.S.Pat.Nos.6,075,181，5,939,598，5,591,669和5,589,369，分别在此引用作为参考)。例如，据描述在嵌合和胚系突变小鼠中的抗体重链结合区的纯合子缺失可导致内源抗体生产的完全抑制。人免疫球蛋白基因阵列向该胚系突变小鼠的转移可导致在抗原攻击下的人抗体生产。另一使用SCID小鼠生成人抗体的优选方法可参见美国专利5,811,524，该文献在此引用作为参考。应当可以理解与这些人抗体相关的遗传材料也可以依照此处所述进行分离和操作。
[0322]用于生成重组抗体的另一高效方法可参见Newman，Biotechnology 10：1455-1460(1992)。该技术可特别生成包含了猴可变区和人恒定区的灵长动物源化抗体。该参考文献在此全文引用作为参考。此外，该技术还可参见共同受让的美国专利5,658,570，5,693,780和5,756,096，该文献在此引用作为参考。
[0323]在另一实施方式中，可通过显微操作选择淋巴细胞并分离可变基因。例如，可从免疫哺乳动物分离外周血单核细胞并在体外培养7天。筛选该培养物以获得达到筛选标准的IgGs。可对阳性孔的细胞进行分离。可通过FACS或补体介导的溶血空斑检测的鉴定分离得到生产Ig的单独B细胞。可通过显微操作将生成Ig的B细胞转移至试管，并可采用RT-PCR等方法扩增VH和VL基因。将VH和VL基因克隆至抗体表达载体并转染进入细胞(例如，真核或原核细胞)以进行表达。
[0324]替代性地，可采用本领域技术人员公知的技术筛选抗体生成细胞系并进行培养。该类技术可从各种试验手册和出版物中得到描述。在此方面，适用于本发明的技术的描述可见下文，并可参见Current Protocols in Immunology，Coligan等人.，Eds.，GreenPublishing Associates and Wiley-Interscience，John Wiley and Sons，New York(1991)，其内容全文(包括附录)在此引用作为参考。
[0325]本发明的抗体可通过本领域已知的任何抗体合成方法，特别是化学合成方法或是优选此处所述的重组表达技术进行制备。
[0326]在一个实施方式中，本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物包含了一种其中一个或多个结构域被部分或全部删除的合成恒定区(“结构域删除抗体”)。在特定实施方式中的相容性修饰抗体包含了整个CH2区被去除的结构域删除构建体或变体(ΔCH2构建体)。在其它实施方式中可采用短连接肽替换缺失区域以提供可变区的灵活性和自由移动性。本领域的技术人员将可以理解由于CH2区对抗体分解率的调节属性，因而特别优选该构建体。结构域删除构建体可由编码IgG1人恒定区的载体获得(例如，参见WO 02/060955 A2和WO02/096948A2)。该载体经工程改造缺失了CH2区并提供了表达区域缺失IgG1恒定区的合成载体。
[0327]在特定实施例中，本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物为微抗体。微抗体可通过本领域已描述的方法进行制备(例如，参见，美国专利5,837,821或WO94/09817A1)。
[0328]在一个实施方式中，本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物包含了一种具有能支持单体亚基间结合的数个或者甚至单个氨基酸缺失或替换的免疫球蛋白重链。例如，在CH2区选定部位的单个氨基酸突变可足以降低Fc结合并从而增强肿瘤定位。类似地，可能仅需要删除控制带调节效应功能(例如，补体结合)的一个或多个恒定区。该恒定区的部分缺失可能提高该抗体的选定特性(血浆半衰期)，同时保留其它与对象恒定区相关的所需功能的完整性。此外，如上文指出，所披露抗体的恒定区可通过对增强所得构建体作用的一个或多个氨基酸的突变或替换进行合成。就此而言，可以在破坏保守结合位点(例如，Fc结合)的活性的同时充分保留修饰抗体的构型和免疫原性作用。另一实施例包含了向恒定区添加一个或多个氨基酸以增强所需的特性(例如效应功能)或者提供更多细胞毒素或糖附着。在该类实施例中可能需要插入或复制来自选定恒定区的特定序列。
[0329]本发明还提供了包含，主要包含，或由此处所述的抗体分子(例如，VH区和或VL区)的变体(包括衍生物)组成的抗体，该抗体或其片段免疫特异性结合IGF-1R多肽或其片段或变体。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码IGF-1R抗体的核苷酸序列引入突变，包括但不限于，可导致氨基酸替换的定点突变和PCR-介导的突变。优选地，该变体(包括衍生物)相对参考VH区，VH-CDR1，VH-CDR2，VH-CDR3，VL区，VL-CDR1，VL-CDR2或VL-CDR3编码少于50个氨基酸替换，少于40个氨基酸替换，少于30个氨基酸替换，少于25个氨基酸替换，少于20个氨基酸替换，少于15个氨基酸替换，少于10个氨基酸替换，少于5个氨基酸替换，少于4个氨基酸替换，少于3个氨基酸替换，或少于2个氨基酸替换。“保守氨基酸替换”是以具有类似电荷侧链的氨基酸残基替换其中一个氨基酸残基。本领域内已经定义了有类似电荷侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，未带电极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，无极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，β-分支侧链(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)的氨基酸。此外，该突变可沿全部或部分编码序列进行(例如饱和突变)，对所得的突变进行生物活性筛选以鉴定保留活性(例如，结合IGF-1R多肽的能力)的突变体。
[0330]例如，可以仅在抗体分子的框架区或CDR区引入突变。所引入的突变可以是同义或中性错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有或具有很少的影响，事实上该种突变有些不改变任何氨基酸序列。这些类型的突变可能对优化密码子用途或提高杂交瘤的抗体生产非常有用。编码本发明IGF-1R抗体的密码子优化编码区在本文别处披露。替代性地，非中性错义突变可改变一种抗体结合抗原的能力。多数同义或中性错义突变的位点可能在框架区中，而多数非中性错义突变的位点可能在CDR中，尽管这并非绝对。本领域的技术人员均能设计和测试具有所需属性(例如未改变抗原结合活性或改变了结合活性(例如，提高了抗原结合活性或改变了抗体特异性))的突变分子。突变后可对编码蛋白进行常规表达，编码蛋白的功能性和/或生物活性(例如，免疫特异性结合IGF-1R多肽的至少一个表位的能力)可通过此处所述的技术或本领域已知的常规修饰技术进行测定。
IV.编码IGF-1R抗体的多聚核苷酸
[0331]本发明还提供了编码本发明IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物的核酸分子。
在一个实施方式中，本发明提供了包含，主要包含，或由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸组成的分离多聚核苷酸，其中该重链可变区的至少一个CDRs或该重链可变区的至少两个VH-CDRs与来自此处所述的单克隆IGF-1R抗体的参考重链VH-CDR1，VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列具有至少80％，85％，90％或95％的一致性。或者该VH的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3区与来自此处所述的单克隆IGF-1R抗体的参考重链VH-CDR1，VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列具有至少80％，85％，90％或95％的一致性。因此，如该实施例所述的本发明的重链可变区具有与表5中多肽序列相关的VH-CDR1，VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列：
表5：参考VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列*
| 抗体 | VH序列PN/P(VH-CDR1，VH-CDR2，以及VH-CDR3带下划线) | VH CDR1 | VH CDR2 | VH CDR3 |
| M12-E01 | GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTCCTTACTCTATGCTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCTATCGGTTCTTCTGGTGGCTCTACTCGTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACCGCCATGTATTACTGTGCACGGGTACGGGGGATCCTTCATTACGATATTTTGATTGGTAGAAATCTCTACTACTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGC(SEQ ID NO：3)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPY SMLWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGSTRYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCARVRGILHYDILIGRNLYYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：4) | PYSML(SEQ IDNO：5) | SIGSSGGSTRYADSVKG(SEQID NO：6) | VRGILHYDILIGRNLYYYYMDV(SEQ IDNO：7) |
| M12-G04 | GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTAAGTACACTATGCATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCTATCGTTTCTTCTGGTGGCTGGACTGATTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGGAGTATAGCAGCAGCTGGTACCGGTTGGTCTGTGAGTTTTGTGGACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC(SEQ ID NO：8)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKY | KYTMH(SEQ IDNO：10) | SIVSSGGWTDYADSVKG(SEQIDNO：11) | DRSIAAAGTGWSVSFVDWFDP(SEQ IDNO：12) |
| 抗体 | VH序列PN/PP(VH-CDR1，VH-CDR2，以及VH-CDR3带下划线) | VH CDR1 | VH CDR2 | VH CDR3 |
| TMHWVRQAPGKGLEWVSSIVSSGGWTDYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRSIAAAGTGWSVSFVDWFDPWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：9) | ||||
| M13-C06 | GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTATTTACCGTATGCAGTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTGGTATCTCTCCTTCTGGTGGCACTACTTGGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGAGCGGGGGTTCGGGCTATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGC(SEQ ID NO：13)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIY RMQWVRQAPGKGLEWVSGISPSGGTTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWSGGSGYAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ IDNO：14) | IYRMQ(SEQ IDNO：15) | GISPSGGTTWYADSVKG(SEQIDNO：16) | WSGGSGYAFDI(SEQIDNO：17) |
| M13-C06优化 | GAGGTCCAGCTGTTGGAGTCCGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCATTTACCGTATGCAGTGGGTGCGCCAGGCTCCTGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCCGGTATCTCTCCCTCTGGTGGCACGACGTGGTATGCTGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACAATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACTCTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGCCAGATGGTCCGGGGGCTCCGGATACGCCTTCGACATCTGGGGACAGGGAACCATGGTCACCGTCTCAAGC(SEQ ID NO：18)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIY RMQWVRQAPGKGLEWVSGISPSGGTTWYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWSGGSGYAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ IDNO：14) | IYRMQ(SEQ IDNO：15) | GISPSGGT TWYADSVK G(SEQIDNO：16) | WSGGSGYA FDI(SEQIDNO：17) |
| M14-B01 | GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTAATTACCATATGGCTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTGTTATCTCTCCTACTGGTGGCCGTACTACTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCGAGAGCGGGGTACAGCTATGGTTATGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC(SEQ ID NO：19)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNY HMAWVRQAPGKGLEWVSVISPTGGRTTYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARAGYSYGYGYFDYWGQGTLVTVSS(SEQID NO：20) | NYHMA(SEQ IDNO：21) | VISPTGGRTTYADSVKG(SEQIDNO：22) | AGYSYGYGYFDY(SEQ IDNO：23) |
| 抗体 | VH序列PN/PP(VH-CDR1，VH-CDR2，以及VH-CDR3带下划线) | VH CDR1 | VH CDR2 | VH CDR3 |
| M14-B01优化 | GAGGTCCAGCTGTTGGAGTCCGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAATTACCACATGGCCTGGGTGCGCCAGGCTCCTGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCCGTGATCTCTCCTACCGGTGGCAGGACCACTTACGCTGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACAATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACTCTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGATACTGCAACATACTACTGCGCCAGAGCCGGGTACTCCTACGGCTACGGATACTTCGACTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC(SEQ ID NO：24)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNY HMAWVRQAPGKGLEWVSVISPTGGRTTYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARAGYSYGYGYFDYWGQGTLVTVSS(SEQID NO：20) | NYHMA(SEQ IDNO：21) | VISPTGGRTTYADSVKG(SEQIDNO：22) | AGYSYGYGYFDY(SEQIDNO：23) |
| M14-C03 | GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTAAGTACATGATGTCTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTATATCTCTCCTTCTGGTGGCCTTACTTGGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGAGCTAGAGGCTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGC(SEQ ID NO：25)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKY MMSWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGLTWYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGARGYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ IDNO：26) | KYMMS(SEQ IDNO：27) | YISPSGGLTWYADSVKG(SEQIDNO：28) | DGARGYGMDV(SEQIDNO：29) |
| M14-C03优化 | GAGGTCCAGCTGTTGGAGTCCGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAAGTACATGATGTCTTGGGTGCGCCAGGCTCCTGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCCTATATCTCTCCCTCTGGTGGCCTGACGTGGTATGCTGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACAATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACTCTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGCCAGAGATGGGGCTAGAGGATACGGAATGGACGTCTGGGGACAGGGAACCACCGTCACCGTCTCAAGC(SEQ ID NO：30)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKY MMSWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGLTWYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGARGYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ IDNO：26) | KYMMS(SEQ IDNO：27) | YISPSGGLTWYADSVKG(SEQIDNO：28) | DGARGYGMDV(SEQIDNO：29) |
| M14-G11 | GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTAATTACCCTATGTATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAA | NYPMY(SEQ IDNO：33) | RISSSGGRTVYADSVKG(SEQID | DRWSRSAAEYGLGGY(SEQ IDNO：35) |
| 抗体 | VH序列PN/PP(VH-CDR1，VH-CDR2，以及VH-CDR3带下划线) | VE CDR1 | VE CDR2 | VE CDR3 |
| AGGTTTGGAGTGGGTTTCTCGTATCTCTTCTTCTGGTGGCCGTACTGTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGATGGTCCAGATCTGCAGCTGAATATGGGTTGGGTGGCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC(SEQ IDNO：31)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNY PMYWVRQAPGKGLEWVSRISSSGGRTVYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRWSRSAAEYGLGGYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：32) | NO：34) | |||
| H14-G11优化 | GAGGTCCAGCTGTTGGAGTCCGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAATTACCCCATGTACTGGGTGCGCCAGGCTCCTGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCCAGGATCTCTAGCAGCGGTGGCAGGACCGTGTACGCTGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACAATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACTCTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGCCAGAGATAGGTGGTCCAGATCTGCAGCCGAGTACGGACTGGGGGGCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC(SEQ IDNO：36)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNY PMYWVRQAPGKGLEWVSRISSSGGRTVYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRWSRSAAEYGLGGYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：32) | NYPMY(SEQ IDNO：33) | RISSSGGRTVYADSVKG(SEQIDNO：34) | DRWSRSAAEYGLGGY(SEQ IDNO：35) |
| P2A7.3E11 | CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTAGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGAAACACATTCACTGACTATGTTATAAACTGGGTGAAGCAGAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTGGAAATGAAAATACTTATTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAGTAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGGGATTTATTACTACGGTAGTAGGACGAGGACTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：37)QVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGNTFTDYVINWVKQRTGQGLEWIGEIYPGNENTYYNEKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGIYYYGSRTRTMDYWGQGTSVTVSS(SEQID NO：38) | DYVIN(SEQ IDNO：39) | IYPGNENT YYNEKFKG(SEQ IDNO：40) | GIYYYGSR TRTMDY(SEQ IDNO：41) |
| 20C8.3B8 | GACGTCCAACTGCAGGAGTCTGGACCTGACCTGGTGAAACCTTCTCAGTCACTTTCACTCACCTSCACTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATAGCTGGCACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATACACTACAGTGGTGGCACTAACTACAACCCATCTCTC | SGYSWH(SEQ IDNO：44) | YIHYSGGT | SGYGYRSA |
| 抗体 | VH序列PN/PP(VH-CDR1，VH-CDR2，以及VH-CDR3带下划线) | VHCDR1 | VH CDR2 | VH CDR3 |
| AAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTCCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGATCGGGGTACGGCTACAGGAGTGCGTACTATTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：42)DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGYIHYSGGTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARSGYGYRSAYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQID NO：43) | ||||
| P1A2.2B11 | CAAATACAGTTGGTTCAGAGCGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACCATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTCCACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGTTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTTTTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTTCATATTTCTGTGCAAGTCCCCTCTACTATATGTACGGGCGGTATATCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCGCGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：47)QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNHGMNWVKQAPGKGLKWMGWNTSTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLKNEDTASYFCASPLYYMYGRYIDVWGAGTAVTVSS(SEQ IDNO：48) | NHGMN(SEQ IDNO：49) | NTSTGEPT YADDFKG(SEQ IDNO：50) | PLYYMYGR YIDV(SEQ IDNO：51) |
| 20D8.24B11 | ACGTCCAACTGCAGGAGTCTGGACCTGACCTGGTGAAACCTTCTCAGTCACTTTCACTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATAGCTGGCACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATACACTACAGTGGTGGCACTAACTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTCCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGATCGGGGTACGGCTACAGGAGTG(SEQID NO：52)DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGYIHYSGGTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARSGYGYRSAYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQID NO：53) | SGYSWH(SEQ IDNO：54) | YIHYSGGT NYNPSLKS(SEQ IDNO：55) | SGYGYRSA YYFDY(SEQ IDNO：56) |
| P1G10.2B8 | CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGACCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACCATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGATTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCAACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGTCCCCTCTACTATAGGAACGGGCGATA | NHGMN(SEQ IDNO：59) | WINTNTGE PTYADDFK G(SEQIDNO：60) | PLYYRNGR YFDV(SEQ IDNO：61) |
| 抗体 | VH序列PN/PP(VH-CDR1，VHCDR2，以及VH-CDR3带下划线) | VH CDR1 | VH CDR2 | VH CDR3 |
| CTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCC(SEQ ID NO：57)QIQLVQSGPDLKKPGETVKISCKASGYTFTNHGMNWVKQAPGKDLKWMGWINTNTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCASPLYYRNGRYFDVWGAGTTVTVSS(SEQID NO：58) | ||||
| P1E2.3B12 | CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTACCTACGGTCGTAGTAATTACAATGAGAAGTTCAAGAGTAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATTAGTACGCCTACGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：62)QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPTYGRSNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARLVRLRYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ IDNO：63) | SYWMH(SEQ IDNO：64) | EINPTYGR SNY NEKFKS(SEQ IDNO：65) | LVRLRYFD V(SEQIDNO：66) |
*通过Kabat系统确定(见上文)。
N＝核苷酸序列，P＝多肽序列。
[0333]如本领域所知，两个多肽或两个多聚核苷酸之间的“序列一致性”可通过将一个多肽或多聚核苷酸的氨基酸或核酸序列与另一个多肽或多聚核苷酸的序列比较得到。此处讨论的任何特定多肽与另一多肽是否具有至少约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％的一致性可通过本领域已知的方法和计算机程序/软件(例如，但不限于，BESTFIT程序(WisconsinSequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics ComputerGroup，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI53711))进行测定。BESTFIT采用了Smith和Waterman，Advances inApplied Mathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法以发现两个序列间的最佳同源性片段。在采用BESTFIT或任何其它序列比对程序测定一个特定序列与如本发明所述的参考序列是否具有如95％的一致性时，该参数当然会设定为对参考多肽序列的全长计算相似度百分比且允许最大同源性差距为参考序列中总氨基酸数的5％。
[0334]在特定实施例中，一种包含了该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。在特定实施方式中，该编码VH多肽的核苷酸序列进行了改造，但不改变其编码的氨基酸序列。例如，该序列的改造可用于提高密码子在给定物种中的用途，去除剪接位点，或是去除限制性酶切位点。该种序列优化已在实施例中描述并已总所周知，且可由本领域普通技术人员常规实施。
[0335]在另一实施方式中，本发明提供了包含，主要包含，或由编码一种免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸组成的分离多聚核苷酸，其中该VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3区具有与表5所示的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3基团已知的多肽序列。在特定实施方式中，包含该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0336]在特定实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含，主要包含，或由一种或多种上述多聚核苷酸编码的VH，或与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同IGF-R1表位的VH，或是竞争性抑制该种单克隆抗体或片段结合IGF-1R的VH所组成。
[0337]在特定实施方式中，包含，主要包含，或通过由一个或多个上述多聚核苷酸编码的VH组成的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)不大于5 x 10-2M，10-2M，5 x 10-3M，3-3M，5 x 10-4M，10-4M，5 x 10-5M，10-5M，5 x 10-6M，10-6M，5 x -10-7M，10-7M，5 x10-8M，10-8M，5 x 10-9M，10-9M，5 x 10-10M，10-10M，5 x 10-11M，11-11M，5 x 10-12M，10-12M，5 x 10-13M，10-13M，5 x 10-14M，10-14M，5 x 10-15M或10-15M为特征的亲和性特异性或优先结合IGF-1R多肽或其片段，或IGF-1R变体多肽。
[0338]在另一实施方式中，本发明提供了包含，主要包含，或由编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸组成的分离多聚核苷酸，其中该轻链可变区的至少一个VL-CDR或该轻链可变区的至少两个VL-CDRs与来自此处所述的单克隆IGF-1R抗体的参考轻链VL-CDR1，VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列具有至少80％，85％，90％或95％的一致性。替代性地，该VL的VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3区与来自此处所述的单克隆IGF-1R抗体的参考轻链VL-CDR1，VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列具有至少80％，85％，90％或95％的一致性。因此，如该实施例所述的本发明的轻链可变区具有与表6中多肽序列相关的VL-CDR1，VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列：
表6：参考VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列*
| 抗体 | VL序列PN/PP(VL-CDR1，VL-CDR2以及VL-CDR3带划线) | VL CDR1 | VL CDR2 | VL CDR3 |
| M12-E01 | CAGTACGAATTGACTCAGCCGCCCTCGGTGTCTGAGGCCCCCCGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAATAATGCTATAAACTGGTACCAGCAACTCCCAGGAAAGCCTCCCAAACTCCTCATCTATTATGATGATCTGTTGCCCTCAGGGGTCTCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGGCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTGCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAACCTGAATGGTGTGATTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA(SEQ IDNO：67)QYELTQPPSVSEAPRQRVTISCSGSSSNIGN NAINWYQQLPGKPPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSGSLAISGLQSEDEADYYCAAWD DNLNGVIFGGGTKLTVL(SEQ IDNO：68) | SGSSSNIGNNAIN(SEQID NO：69) | YDDLLPS(SEQ IDNO：70) | AAWDDNLNGVI(SEQIDNO：71) |
| M12-G04 | GACATCCAGATGACCCAGTCTCCACTCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAACGGCTACTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGATCTACGCTACATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCA | RASQSINGYLN(SEQID NO：74) | ATSSLQS(SEQ IDNO：75) | QQSYSTPPYT(SEQIDNO：76) |
| 抗体 | VL序列PN/PP(VL-CDR1，VL-CDR2，以及VL-CDR3带下划线) | VL CDR1 | VL CDR2 | VL CDR3 |
| AGCTGGAGATCAAA(SEQ ID NO：72)DIQMTQSPLSLSASVGDRVTITCRASQSING YLNWYQQKPGKAPNLLIYATSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYS TPPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：73) | ||||
| M13-C06 | GACATCCAGATGACCCAGTCTCCACTCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCGGGACATTAGAAACTATTTAAATTGGTATCAACAAAAACCAGGGAAAGCCCCGAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAGTTTGCAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCGGTGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTTAGTTTCACCATCGGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTTTGATAGTCTCCCTCACACTTTTGGCCAGGGGACCAAACTGGAGATCAAA(SEQ ID NO：77)DIQMTQSPLSLSASVGDRVTITCQASRDIRN YLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSLQTGVPSRFGGSGSGTDFSFTIGSLQPEDIATYYCQQFDS LPHTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：78) | QASRDIRNYLN(SEQID NO：79) | DASSLQT(SEQ IDNO：80) | QQFDSLPHT(SEQIDNO：81) |
| M14-B01 | GACATCCAGATGACCCAGTTTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTATGAGGAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGCCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAAAAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGCCTTCACTCTCACCATCAGCAACCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCACCAACGTAGCACCTGGCCTCTGGGGACTTTCGGCCCTGGGACCAAACTGGAGGCCAAA(SEQ ID NO：82)DIQMTQFPATLSVSPGERATLSCRASQSVMR NLAWYQQKPGQPPRLLIYGASKRATGIPARFSGSGSGTAFTLTISNLEPEDFAVYYCHQRST WPLGTFGPGTKLEAK(SEQ ID NO：83) | RASQSVMRNLA(SEQID NO：84) | GASKRAT(SEQ IDNO：85) | HQRSTWPL3T(SEQIDNO：86) |
| M14-C03 | GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGGAGGTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA(SEQ IDNO：87)DIQMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSS YLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN WPPEVTFGPGTKVDIK(SEQ ID NO：88) | RASQSVSSYLA(SEQID NO：89) | DASNRAT(SEQ IDNO：90) | QQRSNWPPEVT(SEQIDNO：91) |
| M14-G11 | GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCAT | KSSQSVLYSSNNKNYLA | LASTRES(SEQ ID | QQYYSTWT(SEQ ID |
| 抗体 | VL序列PN/PP(VL-CDR1，VL-CDR2，以及VL-CDR3带下划线) | VL CDR1 | VL CDR2 | VL CDR3 |
| CAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTTGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGTACTTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA(SEQID NO：92)DIQMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLY SSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYLASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTWTFGQGTKVEIK(SEQ IDNO：93) | (SEQ IDNO：94) | NO：95) | NO：96) | |
| P2A7.3E11 | GAAGTTGTGCTCACCCAGTCTCCAACCGCCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGCAGTGCCAGCTCAACTTTAAGTTCCAATTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAACTCTTGATTTATAGGACATCCAATCTGGCCTCTGGAGTCCCAGGTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGTAGTATACCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAG(SEQ ID NO：97)EVVLTQSPTAMAASPGEKITITCSASSTLSSNYLHWYQQKPGFSPKLLIYRTSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO：98) | SASSTLSSN YLH(SEQID NO：99) | RTSNLAS(SEQ IDNO：100) | QQGSSIPL T(SEQIDNO：101) |
| 20C8.3B8 | GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGCCTATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTTCCGTATACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATC(SEQ IDNO：102)DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSAYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPYTFGGGTKLEIK(SEQ IDNO：103) | RASKSVSTS AYSYMH(SEQ IDNO：104) | LASNLES(SEQ IDNO：105) | QHSRELPY T(SEQIDNO：106) |
| P1A2.2B11 | GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTATCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTATTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTC | RASQDISNY LN(SEQIDNO：109) | TSRLHS(SEQ IDNO：110) | QQGKTLPW T(SEQIDNO：111) |
| 抗体 | VL序列PN/PP(VL-CDR1，VL-CDR2，以及VL-CDR3带下划线) | VL CDR1 | VL CDR2 | VLCDR3 |
| TCACCATTAGCAACCTGGAACAAGAAGATTTTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAAAACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO：107)DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTIKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGKTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：108) | ||||
| 20D8.24B11 | 与20C8相同 | |||
| P1G10.2B8 | GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAATTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGATCTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAACAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGAAAGACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO：112)DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGSVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGKTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：113) | RASQDISNY LN(SEQIDNO：114) | TSRLH(SEQ IDNO：115) | QQGKTLPW T(SEQIDNO：116) |
| P1E2.3B12 | GATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTAATGGCATCACTTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQID NO：117)DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIK(SEQ IDNO：118) | RSSKSLLHS NGITYLY(SEQ IDNO：119) | QMSNLAS(SEQ IDNO：120) | AQNLELPY T(SEQIDNO：121) |
*通过Kabat系统确定(见上文)。
PN＝核苷酸序列，PP＝多肽序列。
[0339]在特定实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0340]在另一实施方式中，本发明提供了包含，主要包含，或由编码一种免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸组成的分离多聚核苷酸，其中该VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3区具有与表6所示的VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3基团已知的多肽序列。在特定实施方式中，包含该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0341]在进一步的方面，本发明提供了包含，主要包含，或由编码一种免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸组成的分离多聚核苷酸，其中该VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3区具有与编码表6所示的VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3的核苷酸序列一致的编码核苷酸序列。在特定实施方式中，包含该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0342]在特定实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含，主要包含，或由一种或多种上述多聚核苷酸编码的VL，或与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性或优先结合相同IGF-R1表位的VL，或是竞争性抑制该种单克隆抗体或片段结合IGF-1R的VL所组成。
[0343]在特定实施方式中，包含，主要包含，或通过由一个或多个上述多聚核苷酸编码的VL组成的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)不大于5 x 10-2M，10-2M，5 x 10-3M，10-3M，5 x 10-4M，10-4M，5 x 10-5M，10-5M，5 x 10-6M，10-6M，5 x 10-7M，10-7M，5 x10-8M，10-8M，5 x 10-9M，10-9M，5 x 10-10M，10-10M，5 x 10-11M，10-11M，5 x 1-12M，10-12M，5 x 10-13M，10-13M，5 x 10-14M，10-14M，5 x 10-15M或10-15M为特征的亲和性特异性或优先结合IGF-1R多肽或其片段，或IGF-1R变体多肽。
[0344]在进一步的实施方式中，本发明包括包含，主要包含，或由能编码与选自SEQ ID NOs：4，9，14，20，26，32，38，43，48，53，58和63的参考VH序列至少具有80％，85％，90％，95％或100％一致性的VH的核酸组成的分离多聚核苷酸。在特定的实施例中，包含了该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0345]在另一方面，本发明包括了包含，主要包含，或由能编码具有选自SEQ ID NOs：4，9，14，20，26，32，38，43，48，53，58和63的多肽序列的VH的核酸组成的分离多聚核苷酸。在特定的实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0346]在进一步的实施方式中，本发明包括包含，主要包含，或由与选自SEQ ID NOs：3，8，13，18，19，24，25，30，31，36，37，42，47，52，57和62的参考核酸序列至少具有80％，85％，90％，95％或100％一致性的VH-编码核酸组成的分离多聚核苷酸。在特定的实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0347]在另一方面，本发明包括了包含，主要包含，或由编码本发明VH的核酸序列组成的分离多聚核苷酸，其中该VH的氨基酸序列选自SEQ ID NOs：4，9，14，20，26，32，38，43，48，53，58和63。本发明进一步包括包含，主要包含，或由编码本发明VH的核酸序列组成的分离多聚核苷酸，其中该核酸序列选自SEQ ID NOs：3，8，13，18，19，24，25，30，31，36，37，42，47，52，57和62。在特定的实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0348]在特定实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含，主要包含，或由一种或多种上述多聚核苷酸编码的VH，或与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性或优先结合相同IGF-R1表位，或是竞争性抑制该种单克隆抗体或片段结合IGF-1R，或是竞争性抑制该种单克隆抗体结合IGF-1R的VH所组成。
[0349]在特定实施方式中，包含，主要包含，或通过由一个或多个上述多聚核苷酸编码的VH组成的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)不大于5 x 10-2M，10-2M，5 x 10-3M，10-3M，5 x 10-4M，10-4M，5 x 10-5M，10-5M，5 x 10-6M，10-6M，5 x 10-7M，10-7M，5 x10-8M，10-8M，5 x 10-9M，10-9M，5 x 10-10M，10-10M，5 x 10-11M，10-11M，5 x 10-12M，10-12M，5 x 10-13M，10-13M，5 x 10-14M，10-14M，5 x 10-15M或10-15M为特征的亲和性特异性或优先结合IGF-1R多肽或其片段，或IGF-1R变体多肽。
[0350]在进一步的实施方式中，本发明包括了包含，主要包含，或由编码与具有选自SEQ ID NOs：68，73，78，83，88，93，98，103，108，113和118的参考VL多肽序列具有至少80％，85％，90％95％或100％一致性的VL的核酸组成的分离多聚核苷酸。在更进一步的实施方式中，本发明包括了包含，主要包含，或由与具有选自SEQID NOs：67，72，77，82，87，92，97，102，107，112和117的参考核酸序列具有至少80％，85％，90％95％或100％一致性的VL编码核酸组成的分离多聚核苷酸。在特定的实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0351]在另一方面，本发明包括了包含，主要包含，或由编码本发明VL的核酸序列组成的分离多聚核苷酸，其中该VL的氨基酸序列选自SEQ ID NOs：68，73，78，83，88，93，98，103，108，113和118。本发明进一步包括包含，主要包含，或由编码本发明VL的核酸序列组成的分离多聚核苷酸，其中该核酸序列选自SEQ IDNOs：67，72，77，82，87，92，97，102，107，112和117。在特定的实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0352]在特定实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含，主要包含，或由一种或多种上述多聚核苷酸编码的VL，或与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同IGF-R1表位的VL，或是竞争性抑制该种单克隆抗体或片段结合IGF-1R的VL所组成。
[0353]在特定实施方式中，包含，主要包含，或通过由一个或多个上述多聚核苷酸编码的VL组成的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)不大于5 x 10-2M，10-2M，5 x 10-3M，10-3M，5 x 10-4M，10-4M，5 x 10-5M，10-5M，5 x 10-6M，10-6M，5 x 10-7M，10-7M，5 x10-8M，10-8M，5 x 10-9M，10-9M，5 x 10-10M，10-10M，5 x 10-11M，10-11M，5 x 10-12M，10-12M，5 x 10-13M，10-13M，5 x 10-14M，10-14M，5 x 10-15M或10-15M为特征的亲和性特异性或优先结合IGF-1R多肽或其片段，或IGF-1R变体多肽。
[0354]上述多聚核苷酸的任意一种可进一步包括附加核苷酸，其可编码如引导编码多肽分泌的信号肽，此处所述的抗体恒定区，或此处所述的其它外源多肽等。
[0355]此外，如此处所作的具体描述，本发明包括了包含上述一个或多个多聚核苷酸组合物。在一个实施方式中，本发明包括了包含一种第一多聚核苷酸和一种第二多聚核苷酸的组合物，其中所述的第一多聚核苷酸编码一种此处所述的VH多肽，而所述的第二核苷酸编码一种此处所述的VL多肽。特别是包含，主要包含，或由VH多聚核苷酸，以及VL多聚核苷酸组成的组合物，其中该VH多聚核苷酸和该VL多聚核苷酸编码与选自SEQ ID NOs：4和68，8和73，14和78，20和83，26和88，32和93，38和98，43和103，48和108，53和103，58和113以及63和118的参考VL和VL多肽氨基酸序列分别具有至少80％，85％，90％95％或100％一致性的多肽。或者替代性的，包含，主要包含，或由与选自SEQ ID NOs：3和67，8和72，13和77，18和77，19和82，24和82，25和87，30和87，31和92，36和92，37和97，42和102，47和107，58和102，57和112以及62和117的参考VL和VL序列分别具有至少80％，85％，90％95％或100％一致性的VH多聚核苷酸和VL多聚核苷酸的组合物。在特定的实施方式中，包含了该组合物中的多聚核苷酸编码的VH和VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0356]如别处所述，本发明还包括了本发明多聚核苷酸的片段。此外如此处所述的编码融合多聚核苷酸的多聚核苷酸，Fab片段，以及其它衍生物同样在本发明的预期之内。
[0357]该多聚核苷酸可通过任何本领域已知的方法进行生产或制备。例如，如果已知该抗体的核苷酸序列，编码该抗体的多聚核苷酸可通过化学合成的寡聚核苷酸进行装配(例如，如Kutmeier等人，BioTechniques 17：242(1994))所述)，其主要包括包含编码该抗体的部分序列的重叠寡聚核苷酸的合成，该寡聚核苷酸的退火和连接，以及通过PCR对连接寡聚核苷酸进行扩增。
[0358]替代性地，编码IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物的多聚核苷酸可通过来自于适当来源的核酸生成。如果没有包含编码特定抗体的核酸的克隆，但已知抗体分子的序列，编码该抗体的核酸可通过化学合成，或采用从该序列的3’到5’端杂交的合成引物通过PCR扩增从适当来源(例如，抗体cDNA库，或从任何表达该抗体或其它IGF-1R抗体的组织或细胞(例如经选定用于表达一种抗体的杂交瘤细胞)分离得到的cDNA库或和核酸，优选poly A+RNA)获取，或采用对待鉴定的特定基因序列(例如，一种来自编码该抗体或其它IGF-1R抗体的cDNA库的cDNA克隆)具有特异性的寡聚核苷酸探针进行克隆。然后可用本领域公知的任何技术将PCR生成的扩增核酸克隆进入可复制克隆载体。
[0359]当对该核苷酸序列和该IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物的相应氨基酸进行测定后，可采用本领域公知的操作核苷酸序列的方法(如重组DNA技术，定点突变，PCR等(例如，参见Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2dEd.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)以及Ausubel等人，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，NY(1998)所述的技术，其全文在此引用作为参考))对其核苷酸序列进行操作，以生成具有不同氨基酸序列的抗体，例如形成氨基酸替换，删除，和/或插入。
[0360]编码IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物的多聚核苷酸可由任何可以是未修饰RNA或DNA或者修饰RNA或DNA的多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸组成。例如，编码IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物的多聚核苷酸可由单链和双链DNA，由单链和双链区混合得到的DNA，单链和双链RNA，以及由单链和双链区混合得到的RNA，包含了可能是单链，或者更典型为双链或单链和双链区混合物的DNA和RNA的杂交分子所组成。此外，编码IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物的多聚核苷酸可由包含RNA或DNA或者同时包含RNA和DNA的三链区所组成。编码IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物的多聚核苷酸还可包含为稳定或为其它目的进行修饰的一个或多个修饰碱基或者DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基和异常碱基如肌苷。DNA和RNA可进行多种修饰；因此，”多聚核苷酸”包括了化学，酶或代谢修饰的形式。
[0361]通过对免疫球蛋白的核苷酸序列引入一个或多个核苷酸替代，添加或删除可生成编码免疫球蛋白多肽(例如，免疫球蛋白重链区或轻链区)非天然变体的分离多聚核苷酸，从而在编码蛋白中引入一个或多个氨基酸替换，添加或删除。可通过定点突变和PCR介导突变等标准技术引入突变。优选在一个或多个非必需氨基酸残基上进行保守氨基酸替换。
V.IGF-1R抗体多肽
[0362]本发明进一步提供了构成IGF-1R抗体的分离多肽，以及编码该多肽的多聚核苷酸。本发明的IGF-1R抗体包含了如编码来自免疫球蛋白分子的IGF-1R-特异性抗原结合区的氨基酸序列等多肽。多肽或氨基酸序列“来自于”指定蛋白指出了具有特定氨基酸序列的多肽的来源。在某些情况下，来自于特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有与该其实序列或其部分充分一致的氨基酸序列，其中该部分至少由10-20个氨基酸，至少20-30个氨基酸，至少30-50个氨基酸组成，或者本领域的普通技术人员可以确认其来源于该起始序列。
[0363]在一个实施方式中，本发明提供了包含，主要包含，或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成的分离多肽，其中该重链可变区的至少一个VH-CDR或该重链可变区的至少两个VH-CDRs与来自此处披露的单克隆IGF-1R抗体的参考重链VH-CDR1，VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列具有至少80％，85％，90％或95％的一致性。替代性的，该VH的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3区与来自此处披露的单克隆IGF-1R抗体的参考重链VH-CDR1，VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列具有至少80％，85％，90％或95％的一致性。因此，如该实施方式所述的本发明的重链可变区具有与上文表5中所示的基团相关的VH-CDR1，VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列。尽管表5显示了通过Kabat系统定义的VH-CDRs，本发明还包括了其它VH-CDRs，例如通过Chothia系统定义的VH-CDRs。在特定实施方式中，一种包含了该VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0364]在另一实施方式中，本发明提供了包含，主要包含，或由一种免疫球蛋白重链可变区(VH)组成的分离多肽，其中该VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3区具有与表5所示的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3基团一致的多肽序列。在特定实施方式中，包含该VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0365]在另一实施方式中，本发明提供了包含，主要包含，或由一种免疫球蛋白重链可变区(VH)组成的分离多肽，其中该VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3区具有除了在任意一个VH-CDR中的一个，两个，三个，四个，五个或六个氨基酸替换外与表5所示的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3基团一致的多肽序列。在更大的(例如，VH-CDR-3)中，只要包含该VH-CDR的VH能够特异性或优先结合IGF-1R，可在CDR中进行附加替换。在特定实施方式中，该氨基酸替换为保守替换。在特定实施方式中，一种包含了该VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0366]在进一步的实施方式中，本发明包括包含，主要包含，或由与选自SEQ ID NOs：4，9，14，20，26，32，38，43，48，53，58和63的参考VH序列至少具有80％，85％，90％，95％或100％一致性的VH多肽组成的分离多肽。在特定的实施方式中，包含了VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0367]在另一方面，本发明包括了包含，主要包含，或由选自SEQ ID NOs：4，9，14，20，26，32，38，43，48，53，58和63的VH多肽组成的分离多肽。在特定的实施方式中，包含了该VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0368]在特定实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含，主要包含，或由上述与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性或优先结合相同IGF-R1表位，或是竞争性抑制该种单克隆抗体或片段结合IGF-1R的VH多肽所组成。
[0369]在特定的实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含，主要包含，或由以解离常数(KD)不大于5 x 10-2M，10-2M，5 x 10-3M，10-3M，5 x 10-4M，10-4M，5 x 10-5M，10-5M，5 x 10-6M，10-6M，5 x10-7M，10-7M，5 x 10-8M，10-8M，5 x 10-9M，10-9M，5 x 10-10M，10-10M，5 x 10-11M，10-11M，5 x 10-12M，10-12M，5 x 10-13M，10-13M，5 x10-14M，10-14M，5 x 10-15M或10-15M为特征的亲和性特异性或优先结合IGF-1R多肽或其片段，或IGF-1R变体多肽的上述一种或多种VH多肽组成。
[0370]在另一实施方式中，本发明提供了包含，主要包含，或由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成的分离多肽，其中该轻链可变区的至少一个VL-CDR或该轻链可变区的至少两个VL-CDRs与来自此处所述的单克隆IGF-1R抗体的参考轻链VL-CDR1，VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列具有至少80％，85％，90％或95％的一致性。替代性地，该VL的VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3区与来自此处所述的单克隆IGF-1R抗体的参考轻链VL-CDR1，VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列具有至少80％，85％，90％或95％的一致性。因此，如该实施方式所述本发明的轻链可变区具有与上文表6中多肽序列相关的VL-CDR1，VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列：尽管表6显示了通过Kabat系统定义的VL-CDRs，本发明还包括了其它VL-CDRs，例如通过Chothia系统定义的VL-CDRs。在特定实施方式中，一种包含了该VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0371]在另一实施方式中，本发明提供了包含，主要包含，或由一种免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成的分离多肽，其中该VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3区具有与表6所示的VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3基团一致的多肽序列。在特定实施方式中，包含该VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0372]在另一实施方式中，本发明提供了包含，主要包含，或由一种免疫球蛋白重链可变区(VL)组成的分离多肽，其中该VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3区具有除了在任意一个VL-CDR中的一个，两个，三个，四个，五个或六个氨基酸替换外与表6所示的VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3基团一致的多肽序列。在更大的，只要包含该VL-CDR的VL能够特异性或优先结合IGF-1R，可在VL-CDR中进行附加替换。在特定实施方式中，该氨基酸替换为保守替换。在特定实施方式中，一种包含了该VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0373]在进一步的实施方式中，本发明包括包含，主要包含，或由与选自SEQ ID NOs：68，73，78，83，88，93，98，103，108，113和118的参考VL序列至少具有80％，85％，90％，95％或100％一致性的VL多肽组成的分离多肽。在特定的实施方式中，包含了VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0374]在另一方面，本发明包括了包含，主要包含，或由选自SEQ ID NOs：68，73，78，83，88，93，98，103，108，113和118的VL多肽组成的分离多肽。在特定的实施方式中，包含了该VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0375]在特定实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含，主要包含，或由上述与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性或优先结合相同IGF-R1表位，或是竞争性抑制该种单克隆抗体或片段结合IGF-1R的一种或多种上述VL多肽所组成。
[0376]在特定实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含，主要包含，或由以解离常数(KD)不大于5 x 10-2M，10-2M，5 x 10-3M，10-3M，5 x 10-4M，10-4M，5 x 10-5M，10-5M，5 x 10-6M，10-6M，5 x10-7M，10-7M，5 x 10-8M，10-8M，5 x 10-9M，107-9M，5 x 10-10M，10-10M，5 x 10-11M，10-11M，5 x 10-12M，10-12M，5 x 10-13M，10-13M，5 x 10-14M，10-14M，5 x 10-15M或10-15M为特征的亲和性特异性或优先结合IGF-1R多肽或其片段，或IGF-1R变体多肽的一个或多个上述VL多肽组成。
[0377]在另一实施方式中，抗体或抗原结合片段包含，主要包含，或由VH多肽和VL多肽组成，其中该VH多肽和VL多肽分别与选自SEQ ID NOs：4和68，8和73，14和78，20和83，26和88，32和93，38和98，43和103，48和108，53和103，58和113，和63和118的参考VL和VL多肽氨基酸序列具有至少80％，85％，90％95％或100％的一致性。在特定的实施方式中，包含该VH和VL多肽的抗体或其抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0378]上述多肽的任意一种可进一步包括附加多肽，例如，引导编码多肽分泌的信号肽，此处所述的抗体恒定区，或此处所述的其它外源多肽。此外，本发明的多肽包括了别处所述的多肽片段。本发明的附加多肽包括此处所述的融合多肽，Fab片段，以及其它衍生物。
[0379]此外，如此处更为具体的描述，本发明包括了包含上述多肽的组合物。
[0380]本领域的普通技术人员应当能够理解此处披露的IGF-1R抗体多肽可进行修饰，从而与作为其来源的天然结合多肽具有不同的氨基酸序列。例如，一种来自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可与起始序列具有一定的一致性，例如，它可与起始序列具有60％，70％，75％，80％，85％，90％或95％的一致性。
[0381]此外，还可通过核苷酸或氨基酸替换，删除或插入进行保守替换或“非必需”氨基酸区的改变。例如，除了一个或多个单独氨基酸替换，插入或删除外(例如，一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个，十个，十五个，二十个或更多单独氨基酸替换，插入或删除)，来自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可与起始序列相一致，除了一个或多个单独氨基酸替换，插入或删除外(例如，一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个，十个，十五个，二十个或更多单独氨基酸替换，插入或删除)，来自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可与起始序列相一致。在其它实施方式中，除了两个或更少，三个或更少，四个或更少，五个或更少，六个或更少，七个或更少，八个或更少，九个或更少，十个或更少，十五个或更少，或者二十个或更少的单独氨基酸替换，插入，或删除外，来自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可与起始序列相一致。在特定实施例中，一种来自指定蛋白的多肽或氨基酸序列相对起始序列具有一至五个，一至十个，一至十五个，或一至二十个单独氨基酸替换，插入或删除。
[0382]本发明的特定IGF-1R抗体多肽包含一种来自人氨基酸序列的氨基酸序列，主要由其组成，或由其组成。然而，特定IGF-1R抗体多肽包含了一个或多个来自另一哺乳动物种类的邻近氨基酸。例如，本发明的一种IGF-1R抗体可包括一种灵长类动物的重链区，铰链区，或抗原结合区。在另一范例中，非鼠抗体多肽(例如，IGF-1R抗体的抗原结合位点)中可能存在一个或多个鼠源氨基酸。在又一个范例中，IGF-1R抗体的抗原结合位点为全鼠源。在特定的治疗应用中，IGF-1R-特异性抗体，或其抗原结合片段，变体或类似物经设计对施用该抗体的动物没有免疫原性。
[0383]在特定实施例中，一种IGF-1R抗体多肽包含通常与抗体无关的氨基酸序列或者一个或多个部分。下文更为具体地描述了示范性修饰。例如，本发明的一种单链fv抗体片段可包含一个柔性接头序列，或经修饰添加一个功能性部分(例如，PEG，药物，毒素，或标记)。
[0384]本发明的一种IGF-1R抗体多肽可包括一种融合蛋白，主要由其组成，或由其组成。融合蛋白为一种嵌合蛋白，其包括，例如一种具有至少一个目标结合区和至少一个外源部分(即，天然情况下不与其连接的部分)的免疫球蛋白抗原结合区。在融合多肽中，通常存在于单独蛋白中的氨基酸序列被放在一起，或是通常在同一蛋白的氨基酸序列被重新排列。融合蛋白可通过化学合成，生成和翻译以所需关系编码肽区的多聚核苷酸等方法生成。
[0385]应用于多聚核苷酸或多肽的术语“外源”指该多聚核苷酸或多肽来自与其余实体相比不同的实体。例如，如此处所述，融合至一种IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或类似物的“外源多肽”来自于相同物种的非免疫球蛋白多肽，或不同物种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
[0386]“保守氨基酸替换”是以具有类似侧链的氨基酸残基替换其中一个氨基酸残基。本领域内已经定义了有类似侧链的氨基酸残基家族，包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，未带电极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，无极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，β-分支侧链(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)的氨基酸。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸优选被来自同一侧链家族的另一氨基酸残基所替代。在另一实施方式中，一连串氨基酸可通过与侧链家族成员顺序和/或组成不同的结构类似串进行替换。
[0387]替代性地，在另一实施方式中，也可通过饱和突变等引入任意长度的全部或部分免疫球蛋白编码序列，将突变体整合进入IGF-1R抗体以用于此处披露的诊断和治疗方法，并对其结合所需抗原(例如，IGF-1R)的能力进行筛选。
VI.融合蛋白和抗体结合物
[0388]如本文别处更为具体的描述，本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物可进一步在N或C末端重组融合至外源多肽或者化学结合(包括共价和非共价结合)至多肽或其它组合物。例如，IGF-1R-特异性IGF-1R抗体可重组融合或结合至可用于检测测定标记的分子或外源多肽，药物，放射性核素，或毒素等效应分子。例如，参见PCT公布WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利5,314,995和EP 396,387。
[0389]本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物包括经修饰的衍生物，即，将任何类型的分子共价连接至该抗体，并使该共价连接不阻碍抗体结合IGF-1R。例如，但非限制，该抗体衍生物包括通过糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/阻断基团进行衍生化，蛋白水解裂解，与细胞配体或其它蛋白连接等方法修饰得到的抗体。各种化学修饰中的任意一种均可通过已知技术实现，包括，但不限于特异性化学裂解，乙酰化，甲酰化，衣霉素代谢合成等。此外，该衍生物可能包含一个或多个非传统氨基酸。
[0390]本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物可由通过肽键或修饰肽键(即，肽等排物)彼此连接的氨基酸所组成，并可包含20个基因编码氨基酸以外的氨基酸。IGF-1R-特异性抗体可通过转译后作用等自然作用，或通过本领域公知的化学修饰技术进行修饰。该修饰在基本文本和更具体的专著，以及大量的研究文献中得到了具体的描述。IGF-1R-特异性抗体的任何部位均可进行修饰，包括肽骨架，氨基酸侧链以及氨基或羧基终端，或在糖等部分上。应当可以理解在给定IGF-1R-特异性抗体的多个位点可出现相同或不同程度的相同类型的修饰。此外，一种给定IGF-1R-特异性抗体可包含多种类型的修饰。IGF-1R-特异性抗体可因为泛素化等原因而带有分支，它们也可呈带或不带分支的环状。环状，分支和带分支的环状IGF-1R-特异性抗体可通过转译后自然作用或合成方法形成。修饰包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄素的共价结合，亚铁血红素部分的共价结合，核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合，脂质或脂质衍生物的共价结合，磷脂酰肌醇的共价结合，交联，环化，形成二硫键，脱甲基，共价交联的形成，半胱氨酸的形成，焦谷氨酸的形成，甲酰化，γ-羧化，糖基化，GPI锚形成，羟基化，碘处理，甲基化，豆蔻酰化，氧化，聚乙二醇化，蛋白水解作用，磷酸化，异戊烯化，外消旋，硒化，硫酸盐化，如精胺酰化等经转移RNA介导向蛋白添加氨基酸，泛素化。(例如，参见Proteins-Structure And Molecular Properties，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York 2nd Ed.，(1993)；Posttranslational Covalent Modification Of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pgs 1-12(1983)；Seifter等人.，MethEnzymol 182：626-646(1990)；Rattan等人.，Ann NY Acad Sci663ΛS-62(1992))。
[0391]本发明还提供了包含IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物以及一种外源多肽的融和蛋白。该抗体融合的外源多肽可具有功能性或可用于靶向IGF-1R多肽表达细胞。在一个实施例中，本发明的融合蛋白包括一种具有本发明抗体任意一个或多个VH区氨基酸序列或本发明抗体或其片段或变体的任意一个或多个VL区氨基酸序列，以及一种外源多肽序列的多肽，主要由其组成，或由其组成的。在另一实施方式中，用于此处披露的诊断和治疗方法的融合蛋白包括具有一种IGF-1R-特异性抗体或其片段，变体或衍生物的任意一个，两个，三个VH-CDRs氨基酸序列，或一种IGF-1R-特异性抗体或其片段，变体或衍生物的任意一个，两个，三个VL-CDRs氨基酸序列，以及一种外源多肽序列的多肽，主要由其组成，或由其组成。在一个实施方式中，该融合蛋白包含了一种本发明IGF-1R-特异性抗体或其片段，变体或衍生物的一种VH-CDR3氨基酸序列，以及一种外源多肽序列的多肽，该融合蛋白特异性结合IGF-1R的至少一个表位。在另一实施方式中，一种融合蛋白包含了一种具有本发明IGF-1R-特异性抗体的至少一个VH区氨基酸序列和一种本发明IGF-1R-特异性抗体或其片段，衍生物或变体的至少一个VL区氨基酸序列，以及一种外源多肽序列的多肽。该融合蛋白的VH和VL区优先对应一种特异性结合IGF-1R至少一个表位的单独来源抗体(或scFv或Fab片段)。在另一实施例中，用于此处披露的诊断和治疗方法的融合蛋白包括具有一种IGF-1R-特异性抗体的任意一个，两个，三个或更多VH CDRs氨基酸序列以及一种IGF-1R-特异性抗体或其片段或变体的任意一个，两个，三个或更多VL CDRs氨基酸序列，以及一种外源多肽序列的多肽，主要由其组成，或由其组成。优选对应本发明单独来源抗体(或scFv或Fab片段)的两个，三个，四个，五个，六个，或更多VH-CDR(s)或VL-CDR(s)。本发明还包含了编码这些融和蛋白的核酸分子。
[0392]文献报导的示范性融和蛋白包括与T细胞受体(Gascoigne等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 54：2936-2940(1987))；CD4(Capon et ah，Nature 537：525-531(1989)；Traunecker等人，Nature 339：68-70(1989)；Zettmeissl等人，DNA Cell Biol.USAP：347-353(1990)；以及Byrn等人，Nature 344：667670(1990))；L-选择素(归巢受体)(Watson等人，J.Cell.Biol.110：2221-2229(1990)；以及Watson等人，Nature 349：164-167(1991))；CD44(Aruffo等人，Cell 61：1303-1313(1990))；CD28和B7(Linsley等人，J.Exp.Med.773：721-730(1991))；CTLA-4(Lisley等人，J.Exp.Med.174：561-569(1991))；CD22(Stamenkovic等人，Cell 66：1133-1144(1991))；TNF受体(Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 55：10535-10539(1991)；Lesslauer等人，Eur.J.Immunol.27：2883-2886(1991)以及Peppel等人，J.Exp.Med.774：1483-1489(1991))；以及IgE受体a(Ridgway和Gorman，J.Cell.Biol.Vol.115，Abstract No.1448(1991))相融合。
[0393]如本文别处讨论，本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物可通过本领域已知方法融合至外源多肽以提高该多肽的体内半衰期或用于免疫测定。例如，在一个实施例中，可将PEG连接至本发明IGF-1R抗体提高其体内半衰期。Leong，S.R.，等人，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；或Weir等人.，Biochem.Soc.Transactions 30：512(2002)。
[0394]此外，本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物可融合至标记序列(如肽)以促进其纯化或检测。在优选实施方式中，该标记氨基酸序列为一种六组氨酸肽，例如一种载体中所提供的pQE标签(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)，其中多数已上市销售。如Gentz等人.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 86：821821(1989)所述，例如，用于融和蛋白快速纯化的六组氨酸。其它可用于纯化的肽标签包括，但不限于，对应一种来自流感血凝集素蛋白的表位的“HA”标签(Wilson等人.，Cell 37：767(1984))以及“flag”标签。
[0395]融和蛋白可通过本领域公知的方法进行制备(例如，参见美国专利5,116,964和5,225,538)。可根据经验选择进行融合的精确位点以优化该融和蛋白的分泌或结合特性。然后将编码该融合蛋白的DNA转染进入表达宿主细胞。
[0396]本发明的IGF-1R抗体可以非结合形式使用或与多种分子中的至少一种相结合，例如，可提高该分子的治疗属性，促进靶标检测，或患者的显像或治疗。本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物可在纯化前或纯化后，纯化进行时进行标记或连接。
[0397]本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物可特别连接至治疗剂，前药，肽，蛋白，酶，病毒，脂质，生物应答调节剂，药物制剂或PEG。
[0398]本领域的技术人员应能理解根据待连接的选定试剂的不同，可通过多种技术实现该连接。例如，与生物素的连接物可通过结合多肽与生物素的活化酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)反应得到。类似的，与荧光标记的结合物可在偶合剂(例如，此处所列举的偶合剂)的存在下，或通过与异硫氰酸(优选荧光素-异硫氰酸)的反应进行制备。本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物的结合物可以类似方式进行制备。
[0399]本发明进一步包含了与一种诊断或治疗剂相结合的本发明IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物。该IGF-1R抗体可在作为检测特定治疗和/或预防方案的有效性的临床测试步骤中，用于检测神经疾病的发展或进展。可通过将该IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物与一种可测物质偶合以促进检测。可测物质的范例包括各种酶，辅基，荧光材料，发光材料，生物发光材料，放射性材料，使用各种正电子发射断层的正电子发射金属，以及非放射性顺磁性金属离子。例如，可连接至抗体并用于本发明所述诊断的金属离子可参见美国专利4,741,900。适用酶的范例包括辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或是乙酰胆碱酯酶；适用辅基的范例包括抗生蛋白链菌素-生物素和亲和素-生物素；适用荧光材料的范例包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸萤光素，丹磺酰，二氯三嗪野芝麻碱荧光素，丹磺酰氯或藻红素；发光材料的范例包括发光氨；生物发光材料的范例包括荧光素酶，虫荧光素和发光蛋白质；适用放射性物质的范例包括125I，131I，111In或99Tc。
[0400]IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物还可通过与化学发光化合物偶合进行可测标记。然后可通过检测化学反应过程中产生的发光以测定化学发光标记IGF-1R抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的范例为发光氨，异鲁米诺，theromatic吖啶酯，咪唑，吖啶盐和草酸酯。
[0401]对IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物进行可测标记的方法之一为将其连接至一种酶并将连接产物用于酶免疫测定(EIA)(Voller，A.，＂The Enzyme Linked ImmunosorbentAssay(ELISA)＂Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons 2：1-7(1978))；Voller等人.，J.Clin.Pathol.37：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73：482-523(1981)；Maggio，E.(ed.)，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，FIa.，(1980)；Ishikawa，E.等人.，(eds.)，EnzymeImmunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo(1981)。该种与IGF-1R抗体连接的酶将以特定方式适当的底物(优选发色底物)反应从而生成可通过分光光度计，荧光计或视觉方法检测的化学部分。可用于可测标记该抗体的酶包括，但不限于，苹果酸脱氢酶，葡萄球菌核酸酶，delta-5-类固醇异构酶，酵母乙醇脱氢酶，alpha-甘油磷酸脱氢酶，丙糖磷酸盐异构酶，辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，beta-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，过氧化氢酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，可通过采用针对该酶的发色底物的比色法实现该检测。还可通过对一种底物的酶反应程度与类似建立的标准的视觉比较实现该检测。
[0402]还可通过多种其它免疫测定方法实现该检测。例如，在放射性标记该IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物后，可采用放射性免疫测定(RIA)检测该抗体(例如，参见Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh TrainingCourse on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，(March，1986))，其内容在此引用作为参考)。该放射性同位素的检测手段包括，但不限于，伽马计数器，闪烁计数器，自动射线摄影。
[0403]IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物还可采用152Eu或其它镧系元素等荧光发射金属进行可测标记。这些金属可通过二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金属鳌合基团连接该抗体。
[0404]将各种部分连接至IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物的技术已总所周知，例如，参见Arnon等人，＂Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy＂，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.(1985)；Hellstrom等人，＂Antibodies For Drug Delivery＂，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等人.(eds.)，Marcel Dekker，Inc.，pp.623--53(1987)；Thorpe，＂Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：AReview＂，in Monoclonal Antibodies‘84：Biological And ClinicalAPPlications，Pinchera等人.(eds.)，pp.475-506(1985)；＂Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy＂，in Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy，Baldwin等人.(eds.)，AcademicPress pp.303-16(1985)，以及Thorpe等人.，＂The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates＂，Immunol.Rev.(62：119-58(1982)。
[0405]特别地，用于此处披露的诊断和治疗方法的结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)可被结合至细胞毒性(例如放射性同位素，细胞毒性药物，或毒素)治疗剂，细胞抑制剂，生物毒素，前药，肽，蛋白，酶，病毒，脂质，生物应答调节剂，药物制剂，免疫活性配体(例如，淋巴因子或其它抗体，其中所得的分子同时结合肿瘤细胞和效应细胞(如T细胞))，或PEG。在另一实施方式中，用于此处披露的诊断和治疗方法的结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)可被结合至降低肿瘤血管形成的分子。在其它实施方式中，所披露的组合物可包含结合分子，例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽。本发明的其它实施方式包含了结合分子的用途，例如，与特异性生物毒素或其细胞毒性片段(例如，蓖麻毒素，白树毒素，假单胞菌外毒素或白喉毒素)结合的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽的用途。结合或未结合的结合分子的使用选择将依赖于癌症的类型和阶段，辅助治疗的使用(例如，化疗或外部辐射)以及患者的状态。可以理解本领域的技术人员将能够根据此处的启示容易地作出选择。
[0406]可以理解，在过去的研究中，带有同位素标记的抗肿瘤抗体曾成功地被用于破坏动物模型，部分情况下在人体内的实体肿瘤和淋巴瘤/白血病中的细胞。示范性的放射性同位素包括：90Y，125I，131I，123I，111In，105Rh，153Sm，67Cu，67Ga，166Ho，177Lu，186Re和188Re。该放射性核通过生成致电离辐射，在核DNA中引起多条链的断裂，从而导致细胞死亡。用于生成治疗性结合物的同位素通常可产生具有短光程长的高能量α-或β-粒子。该种放射性核可以杀死它们极为接近的细胞，例如该结合物吸附或进入的肿瘤细胞。它们对于非定域细胞作用很小或没有作用。放射性核基本上为非免疫原性。
[0407]对于在本发明中使用放射标记结合物，结合分子，例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽可直接标记(例如通过碘化)或可以通过使用螯合剂间接标记。此处所用的短语“间接标记”和“间接标记方法”均指螯合剂被共价吸附至结合分子，且至少一个放射核与该螯合剂结合。该种螯合剂通常指双功能螯合剂，因为它们同时结合多肽和放射性同位素。特别优选的螯合剂包括1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(＂MX-DTPA＂)和环己基二乙烯三胺五乙酸(＂CHX-DTPA＂)衍生物。其它的螯合剂包括P-DOTA和EDTA衍生物。特别优选的用于间接标记的放射性核包括11In和90Y。
[0408]此处所用的短语“直接标记”和“间接标记方法”同时指放射性核被共价直接吸附至多肽(通常通过氨基酸残基)。更具体地，这些连接技术包括随机标记和定点标记。对于后者，该标记发生在多肽上的特定位点，例如仅在该结合物的Fc部分存在的N-连接的糖残基。此外，各种直接标记技术和方案在本发明适用。例如，锝-99标记的多肽可通过配体交换过程制备，其中通过锡粒子溶液还原高锝酸(TcO4 -)，将还原的锝螯合至Sephadex柱，并向该柱应用结合多肽，或者也可采用批量标记技术，例如，孵育高锝酸，还原剂(例如SnCl2)，缓冲溶液(例如邻苯二甲酸钠-钾溶液)以及抗体。在任何情况下，优选用于直接标记抗体的放射性核素已为本领域公知，并特别优选的用于直接标记的放射性核为通过酪氨酸残基共价吸附的131I。用于此处披露的诊断和治疗方法的结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)可通过放射活性碘化钠或钾以及化学氧化剂(例如，次氯酸钠，氯胺T等)，或是酶氧化剂(例如乳过氧化酶，葡萄糖氧化酶和葡萄糖)进行衍生。
[0409]有关螯合剂和螯合剂结合物的专利已为本领域所知。例如，Gansow的美国专利4,831,175涉及了多取代二乙烯三胺五乙酸螯合剂以及包含它的蛋白结合物，以及它们的制备方法。Gansow的美国专利5,099,069，5,246,692，5,286,850，5,434,287和5,124,471同样涉及多取代DTPA螯合剂。这些专利均在此全文引用作为参考。适用金属螯合剂的其它范例为乙二胺四乙酸(EDTA)，二乙烯三胺五乙酸(DPTA)，1，4，8，11-四氮杂十四烷，1，4，8，11-四氮杂十四烷-1，4，8，11-四乙酸，或特别优选并在下文多次体现的类似物环己基-DTPA或CHX-DTPA。其它的适用螯合剂包括尚待发现的螯合剂，这些螯合剂可由技术人员简单地辨别，且明确包含在本发明的范围之内。
[0410]优先选择相容性螯合剂(包括用于促进螯合的特异性双功能螯合剂)，美国专利6,682,134，6,399,061和5,843,439，在此全文引用作为参考，以提供对三价金属的高亲和性，显示更高的肿瘤对非肿瘤比例，更低的骨吸收以及放射性核在目标位点(即，B-细胞淋巴瘤位点)更大的体内保留。然而，具有或不具有所有这些特征的其它的双功能螯合剂已为本领域所知并可在肿瘤治疗中形成益处。
[0411]还可以认识到，根据此处的启示，结合分子可因诊断和治疗目的被结合至不同的放射性标记。为此前述美国专利6,682,134，6,399,061和5,843,439披露了放射性标记的治疗性结合物，用于在治疗性抗体施用前的肿瘤诊断“成像”。“In2B8”结合物包含了通过双功能螯合剂，即MX-DTPA(二乙烯三氨五乙酸)(其包含1-异硫氰苄基-3-甲基-DTPA和1-甲基-3-异硫氰苄基-DTPA的1:1混合物)连接至111In的特异性针对人CD20抗原的鼠单克隆抗体2B8。111In是特别优选的诊断性放射性核，因为在约1至约10mCi的放射性核可以安全施用而没有可测的毒性；且该成像数据可一般预测后续90Y-标记的抗体分布。大部分成像研究采用5mCi111In-标记的抗体，因为该剂量既安全又与更低剂量相比具有更大的成像效率，在抗体施用后三至六日出现最佳成像。例如，参见Murray，J.Nuc.Med.26：3328(1985)和Carraguillo等人，J.Nuc.Med.26：67(1985)。
[0412]如上文所指出，多种放射性核适用于本发明，且本领域技术人员可以在不同的条件下容易地确定何种放射性核最为适当。例如，131I是公知的用于标靶型免疫疗法的放射性核素。然而，131I的临床使用可受到多种因素限制，包括：八天物理半衰期；在血液和肿瘤位点中碘化抗体的脱卤；以及排放特性(例如，大伽玛组成)，它可以次优化在肿瘤中局部剂量沉积。随着优势螯合剂的出现，将金属螯合基团连接至蛋白的机会提高了采用其它放射性核如111In和90Y的机会。90Y在放射免疫治疗应用中提供了多种益处：90Y的64小时半衰期足以允许肿瘤积聚抗体，且与131I等不同，90Y是纯高能β-发射体，在其衰减过程中不伴有γ辐射，且在组织中的范围为100至1000细胞直径。此外，最小的穿透辐射量允许90Y-标记抗体的门诊施用。另外，细胞杀死不要求标记抗体的内在化，且电离辐射的局部排放对缺乏目标分子的邻近肿瘤细胞是致命的。
[0413]其它优选的针对结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)的结合制剂为细胞毒性药物，特别是用于癌症治疗的细胞毒性药物。此处所用的“细胞毒素或细胞毒性剂”指对细胞的生长和增殖不利且能减少，抑制或破坏细胞或恶性肿瘤的任意制剂。示范性的细胞毒素包括，但不限于，放射性核，生物毒素，酶活毒素，细胞抑制或细胞毒性治疗剂，前药，免疫活性配体和生物应答调节剂如细胞因子。能够延迟或减缓免疫活性细胞或恶性细胞生长的任何细胞毒素均在本发明的范围之内。
[0414]一般来说，示范性的细胞毒素包括，细胞抑制剂，烷基化剂，抗代谢剂，抗增殖剂，微管蛋白结合剂，激素和激素拮抗剂等。适用于本发明的示范性细胞抑制剂包括烷基化物质，如氮芥，三亚乙基磷酰胺，环磷酰胺，异环磷酰胺，苯丁酸氮芥，甲磺酸丁二醇二酯，苯丙酸氮芥或三亚胺苯醌，以及亚硝基脲化合物，如卡莫司汀，洛莫司汀或司莫司汀。其它优选的细胞毒性剂类别包括，例如，美登醇家族药物其它优选的细胞毒性剂类别包括，例如，蒽环类家族药物，长春花药物，丝裂霉素，博莱霉素，细胞毒性核苷，蝶啶家族药物，二炔和足叶草毒素。这些类别中特别有用的成员包括，例如，阿霉素，洋红霉素，柔红霉素(柔红霉素)，阿霉素，氨喋呤，甲氨蝶呤，甲喋呤，光神霉素，链黑菌素，二氯甲胺蝶呤，丝裂霉素C，放线菌素-D，紫菜霉素，5氟脲嘧啶，氟尿苷，呋氟尿嘧啶，6-巯基嘌呤，阿糖胞苷，阿糖胞苷，鬼臼毒素，或鬼臼毒素衍生物，如依托泊苷或依托泊苷磷酸盐，美法仑，长春花碱，长春新碱，异长春碱，长春地辛，长春罗新等。适用于此处启示的其它细胞毒素包括紫杉醇，紫杉烷，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，替尼泊苷，秋水仙碱，二羟基炭疽菌素二酮，米托蒽醌，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔，嘌呤霉素及其类似物或同系物。激素和激素拮抗剂如皮质类固醇，例如泼尼松，孕酮，例如羟孕酮或安宫孕酮，雌激素，例如己烯雌酚，抗雌激素，例如他莫昔芬，雄激素，例如睾酮以及芳香酶抑制剂，例如氨鲁米特同样适用于此处的启示。本领域的技术人员可对目标化合物进行化学修饰以该化合物的反应更利于制备本发明结合物的目的。
[0415]特别优选的细胞毒素的一个实施例包括抗肿瘤抗生素烯二炔家族的成员或衍生物，包括卡奇霉素，埃斯培拉霉素或动力霉素(dynemicins)。这些毒素非常有效，并通过裂解核DNA，导致细胞死亡产生作用。与能在体内裂解产生许多无活性但具有免疫原性的多肽片段不同，如卡奇霉素，埃斯培拉霉素和其它烯二炔等毒素为基本无免疫原性的小分子。这些非肽毒素被通过前述用于标记单克隆抗体和其它分子的技术化学连接至二聚体或四聚体。该类连接技术包括通过仅存在于该构建体Fc部分的N-连接的糖残基进行的位点特异性连接。该种定点连接方法具有减少对构建体结合属性上的连接键的可能影响的优势。
[0416]如上文指出，用于制备结合物的相容性细胞毒素可包括前药。此处所用的术语“前药”指与母体药物相比对肿瘤细胞的细胞毒性更小，且能够被酶活化或转化成为更具活性的母体形式的药物活性物质的前体或衍生形式。适用于本发明的前药包括，但不限于能被转化为更具活性的细胞毒性游离药物的含磷酸盐前药，含硫代磷酸盐前药，含硫酸盐前药，含肽前药，含β-内酰胺前药，含可选取代的苯氧乙酰胺的前药，或含可选取代的苯乙酰胺的前药，5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前药。可被衍生成为在本发明中使用的前药形式的细胞毒性药物的其它范例包括上述化疗剂。
[0417]除了其它细胞毒素外，可以理解此处披露的结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫原性片段等结合多肽)也可被连接或结合至蓖麻毒素A，相思豆毒素，白喉毒素，肉毒杆菌，蓝藻毒素，蛤蚌毒素，志贺毒素，破伤风，河豚毒素，单端孢霉烯，青霉颤抖毒素或有毒的酶等生物毒素。优选地，该构建体可通过允许抗体-生物素构建体直接表达的遗传工程技术进行制备。其它可与此处披露的结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫原性片段等结合多肽)连接的生物应答调节剂包括细胞因子，例如淋巴因子和干扰素。鉴于本发明的披露，可以认为本领域的技术人员能够通过常规的技术容易地形成该类构建体。
[0418]其它可与所披露的结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫原性片段等结合多肽)连接或结合的适用细胞毒素的种类为能够有效导向肿瘤或免疫活性细胞的放射敏感性药物。该种药物增强对电离辐射的敏感型，从而提高放射治疗的效力。被肿瘤细胞内在化的抗体结合物可将放射敏化剂传递至更靠近放射敏化作用最大的细胞核处。连接了游离放射敏化剂的本发明的结合分子将被快速从血液中清除，剩余放射敏化剂将定位在目标肿瘤中，并提供正常组织中的最小吸收。从血液中快速清除后，将通过以下三种方法中的一种施用辅助放射治疗：1)特异性针对肿瘤的外部辐射束，2)移植进入肿瘤的放射能或者3)通过相同的靶向抗体进行全身放射免疫治疗。对该方法存在潜在吸引力的变化为将治疗性放射性同位素连接至放射敏化免疫结合物，从而提供向患者施用单种药物的便利。
[0419]在特定的实施方式中，可结合能提高结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)稳定性或效力的部分。例如，在一个实施方式中，可向本发明的结合分子结合PEG以提高其体内半衰期。Leong，S.R.，等人，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；或Weir等人.，Biochem.Soc.Transactions 30：512(2002)。
[0420]本发明进一步包含了与诊断或治疗剂结合的结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)的用途。例如，该结合分子可在作为检测特定治疗和/或预防方案的有效性的临床测试步骤中，用于检测肿瘤的发展或进展。可通过将结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)偶合至可测物质帮助检测。可测物质的范例包括各种酶，辅基，荧光材料，发光材料，生物发光材料，放射性材料，使用各种正电子发射断层的正电子发射金属，以及非放射性顺磁性金属离子。例如，可连接至抗体并用于本发明所述诊断的金属离子可参见美国专利4,741,900。适用酶的范例包括辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或是乙酰胆碱酯酶；适用辅基的范例包括抗生蛋白链菌素-生物素和亲和素-生物素；适用荧光材料的范例包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸萤光素，丹磺酰，二氯三嗪野芝麻碱荧光素，丹磺酰氯或藻红素；发光材料的范例包括发光氨；生物发光材料的范例包括荧光素酶，虫荧光素和发光蛋白质；适用放射性物质的范例包括125I，131I，111In或99Tc。
[0421]结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)还可通过与化学发光化合物偶合进行可测标记。然后可通过检测化学反应过程中产生的发光以测定化学发光标记结合分子的存在。特别有用的化学发光标记化合物的范例为发光氨，异鲁米诺，theromatic吖啶酯，咪唑，吖啶盐和草酸酯。
[0422]对结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)进行可测标记的方法之一为将其连接至一种酶并将连接产物用于酶免疫测定(EIA)(Voller，A.，＂The EnzymeLinked Immunosorbent Assay(ELISA)＂Microbiological AssociatesQuarterly Publication，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons 2：1-7(1978))；Voller等人.，J.Clin.Pathol.37：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.75：482-523(1981)；Maggio，E.(ed.)，EnzymeImmunoassay，CRC Press，Boca Raton，FIa.，(1980)；Ishikawa，E.等人.，(eds.)，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo(1981)。该种与结合分子连接的酶将以特定方式适当的底物(优选发色底物)反应从而生成可通过分光光度计，荧光计或视觉方法检测的化学部分。可用于可测标记该抗体的酶包括，但不限于，苹果酸脱氢酶，葡萄球菌核酸酶，delta-5-类固醇异构酶，酵母乙醇脱氢酶，alpha-甘油磷酸脱氢酶，丙糖磷酸盐异构酶，辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，beta-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，过氧化氢酶，葡萄糖6-磷酸脱氢酶，葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，可通过采用针对该酶的发色底物的比色法实现该检测。还可通过对一种底物的酶反应程度与类似建立的标准的视觉比较实现该检测。
[0423]还可通过多种其它免疫测定方法实现该检测。例如，在放射性标记该结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)后，可采用放射性免疫测定(RIA)检测该抗癌剂(例如，参见Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，TheEndocrine Society，(March，1986))，其内容在此引用作为参考)。该放射性同位素的检测手段包括，但不限于，伽马计数器，闪烁计数器，自动射线摄影。
[0424]结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)还可采用152Eu或其它镧系元素等荧光发射金属进行可测标记。这些金属可通过二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金属鳌合基团连接该抗体。
[0425]将各种部分连接至结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)的技术已总所周知，例如，参见Arnon等人，＂Monoclonal Antibodies For Immunotargeting OfDrugs In Cancer Therapy＂，in Monoclonal Antibodies And CancerTherapy，Reisfeld等人.(eds.)，PP.243-56(Alan R.Liss，Inc.(1985)；Hellstrom等人，＂Antibodies For Drug Delivery＂，in Controlled DrugDelivery(2nd Ed.)，Robinson等人.(eds.)，Marcel Dekker，Inc.，pp.623--53(1987)；Thorpe，＂Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy：A Review＂，in Monoclonal Antibodies‘84：BiologicalAnd Clinical Applications，Pinchera等人.(eds.)，pp.475-506(1985)；＂Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy＂，in Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy，Baldwin等人.(eds.)，AcademicPress pp.303-16(1985)，以及Thorpe等人.，＂The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates＂，Immunol.Rev.(62：119-58(1982)。
VII.抗体多肽的表达
[0426]众所周知，RNA可通过标准技术(例如在异硫氰酸胍萃取和沉淀后进行离心或层析)从原始杂交瘤细胞或其它转化细胞分离。在需要时可通过oligo dT纤维素层析等标准技术从总RNA分离mRNA。适用的技术已为本领域熟知。
[0427]在一个实施例中，编码该抗体轻链和重链的cDNAs可参照公知的方法采用逆转录酶和DNA聚合酶同时或单独制备。可通过共有恒定区引物或基于公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更具特异性的引物启动PCR。如上文讨论，PCR还可用于分离编码该抗体轻链和重链的DNA克隆。在此处可用共有引物或更具同源性探针如鼠恒定区探针筛选该库。
[0428]DNA，通常是质粒DNA，可采用本领域已知技术从细胞分离，并参考标准的，公知技术(例如，其具体内容可参见前述有关重组DNA技术的参考文献)获得限制性酶图谱和测序。当然，该DNA可在分离过程或后续分析中参照本发明在任意点进行合成。
[0429]在对分离的遗传物质进行操作以提供本发明IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物后，编码该IGF-1R抗体的多聚核苷酸通常被插入一种表达载体并引导进入可用于生产所需数量IGF-1R抗体的宿主细胞。
[0430]抗体，或其片段，衍生物或类似物，例如结合此处所述的目标分子(例如，IGF-1R)的抗体的重链或轻链的重组表达需要构建一种包含了编码该抗体的多聚核苷酸的表达载体。在获得编码本发明抗体分子或者抗体的重链或轻链，或其部分(优选包含该重链或轻链可变区)的多聚核苷酸后，可通过本领域公知的重组DNA技术制备生产该抗体分子的载体。因此，此处描述了通过表达包含抗体编码核苷酸序列的多聚核苷酸制备一种蛋白的方法。可采用本领域技术人员公知的方法构建包含抗体编码序列和适当的转录和转译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体内重组DNA技术，合成技术，以及体内遗传重组。因此，本发明提供了包含可操作地连接至启动子的编码本发明抗体分子，或其重链或轻链，或重链或轻链可变区的核苷酸序列的可复制载体。该类载体可包含编码该抗体分子恒定区的核苷酸序列(例如，参见PCT公布WO 86/05807；PCT公布WO 89/01036以及U.S.Pat.No.5,122,464)，且该抗体的可变区可被克隆进入该种载体以表达完整的重或轻链。
[0431]该宿主细胞可被两个本发明的表达载体共转染，该第一载体编码一种重链衍生多肽，该第二载体编码一种轻链衍生多肽。这两种载体可包含相同的能使重和轻链多肽同等表达的可选择标记。替代性地，也可使用一种同时编码重和轻链多肽的单独载体。在该种情况下，该轻链被优先放置在重链之前以防止过量的无毒重链(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197(1980))。该重和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
[0432]此处所用的术语“载体”或“表达载体”指根据本发明所用的作为导入和在宿主细胞表达目标基因的工具的载体。如本领域技术人员所知，该种载体可从由质粒，噬菌体，病毒和逆转录病毒构成的组合简单地进行选择。一般而言，适用本发明的载体将包含一种选择性标记，帮助目标基因进行克隆的适当限制性酶切位点以及进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。
[0433]可采用多种表达载体系统实现本发明目的。例如，一类利用来自动物病毒(例如牛乳头瘤病毒，多瘤病毒，腺病毒，痘苗病毒，杆状病毒，逆转录病毒(RSV，MMTV或MOMLV)或SV40病毒)的DNA元件的载体。其它包括了具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的应用。此外，将该DNA整合至其染色体的细胞可通过导入一个或多个支持转染宿主细胞选择的标记进行选择。该标记可向一种营养缺陷型宿主提供原营养，耐受抗微生物剂(例如，抗生素)或耐受铜等重金属。该选择性标记基因既可直接连接至待表达的DNA序列，也可通过共转化导入相同的细胞。为优化mRNA的合成可能还需要附加的元件。这些元件可包括信号序列，剪接信号，以及转录启动子，增强子，以及终止信号。
[0434]在特定优选实施例中该克隆可变区基因与上述方法合成的(优选人)重和轻链恒定区一起插入表达载体。在一个实施例中，这可通过称为NEOSPLA(披露于美国专利6,159,730)的BiogenIDEC，Inc.的专有表达载体作用。该载体包含了细胞巨化病毒启动子/增强子，小鼠beta球蛋白主启动子，SV40复制起始区，牛生长激素多聚腺苷酸化序列，新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2，二氢叶酸还原酶基因和前导序列。据发现通过结合可变和恒定区基因，在CHO细胞内转染，在含G418培养基筛选并通过氨甲喋呤扩增时，该载体可导致极高水平的抗体表达。当然，任何能在真核细胞引发表达的表达载体均可用于本发明。适用载体的范例包括，但不限于质粒pcDNA3，pHCMV/Zeo，pCR3.1，pEF1/His，pIND/GS，pRc/HCMV2，pSV40/Zeo2，pTRACER-HCMV，pUB6/V5-His，pVAX1和pZeoSV2(可从Invitrogen，San Diego，CA购买)，以及质粒pCI(可从Promega，Madison，WI购买)。一般而言，对大量的转染细胞进行筛选以确定其是否表达了适当高水平免疫球蛋白重和轻链是一种常规实验，其可通过机器人系统等形式开展。载体系统的描述还可参见美国专利5,736,137和5,658,570，其全文在此引用作为参考。该系统提供了很高的表达水平，例如，>30pg/细胞/天。其它示范性载体系统披露于美国专利6,413,777。
[0435]在其它优选实施例中，本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物可采用多顺反子构建体进行表达，例如可参见2002年11月18日提交的美国专利申请公开2003-0157641A1，其全文在此引用。在这些新型表达系统中，多个目的基因产物例如抗体的重和轻链可通过单个多顺反子构建体生产。这些系统利用了一种内部核糖体进入位点(IRES)以在真核宿主细胞内提供相对高水平的IGF-1R抗体，例如，结合多肽，例如，IGF-1R特异性抗体或其免疫特异性片段。适用IRES序列可参见在此引用的美国专利6,193,980。本领域技术人员应当可以理解该种表达系统可被用于有效生产本发明披露的全系列的IGF-1R抗体。
[0436]更普遍而言，一旦制备得到编码IGF-1R抗体的单体亚基的载体或DNA序列，该表达载体可被导入一种合适的宿主细胞。质粒相宿主细胞的导入可采用本领域技术人员公知的多种技术实现。这些技术包括，但不限于，转染(包括电泳和电穿孔)，原生质体融合，磷酸钙沉淀，带有套膜DNA的细胞融合，显微注射以及用完整病毒感染。参见Ridgway，A.A.G.＂Mammalian ExpressionVectors＂Vectors，Rodriguez and Denhardt，Eds.，Butterworths，Boston，Mass.，Chapter 24.2，pp.470-472(1988).质粒通常通过电穿孔导入宿主细胞。在适于轻链和重链生产的条件下培养带有表达构建体的宿主细胞，并对重和/或轻链蛋白合成进行测定。示范性的检测技术包括酶联免疫吸附分析(ELISA)，放射性免疫测定(RIA)，或荧光激活细胞分类分析(FACS)，免疫组化等。
[0437]该表达载体通过常规技术转入宿主细胞，然后以常规技术培养该转染细胞以生产用于此处所述方法的抗体。因此，本发明包括了包含可操作地连接至一种外源启动子的编码本发明抗体，或其重或轻链的多聚核苷酸的宿主细胞。在针对表达双链抗体的优选实施例中，如下文详述，同时编码重和轻链的载体可在宿主细胞中共表达以表达完整免疫球蛋白分子。
[0438]此处所述的“宿主细胞”指能够接受使用重组DNA技术构建并至少编码一种外源基因的载体的细胞。在对从重组宿主分离抗体的方法的描述中所用的术语“细胞”和“细胞培养物”可相互替换地说明抗体的来源(除非另行清楚指明)。换言之，可回收多肽的“细胞”即可指离心得到的全细胞，也可指包含了培养基和悬浮细胞的细胞培养。
[0439]可采用多种宿主表达载体系统来表达用于此处所述方法的抗体分子。该种宿主表达系统代表了可生产和后续纯化目标编码序列的载体，还代表了在以适当核苷酸编码序列进行转化或转染后原位表达本发明抗体分子的细胞。其包括但不限于微生物，如以包含了抗体编码序列的重组噬菌体DNA，质粒DNA或粘粒DNA表达载体转染的细菌(例如，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌)；以包含抗体编码序列的重组酵母表达载体转染的酵母(例如，毕赤酵母)；以包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；以包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转染的植物细胞系统；或包含了带有哺乳动物细胞基因组启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5k启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS，CHO，BLK，293，3T3细胞)。优选地，可使用细菌细胞如大肠杆菌，更优选使用真核细胞表达重组抗体分子，特别是完整重组抗体分子。例如，结合来自人细胞巨化病毒的中间早期基因启动子元件等载体的哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是一种有效的抗体表达系统(Foecking等人.，Gene 4.5：101(1986)；Cockett等人.，Bio/Technology 8：2(1990))。
[0440]该用于蛋白表达的宿主细胞系通常来源于哺乳动物；本领域技术人员应当具有优选适用于表达目标基因产物的特定宿主细胞系的能力。示范性宿主细胞系包括，但不限于，CHO(中国仓鼠卵巢细胞)，DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR缺陷型)，HELA(人子宫颈癌)，CVI(猴肾细胞系)，COS(带有SV40T抗原的CVI衍生物)，VERY，BHK(y幼仓鼠肾)，MDCK，293，WI38，R1610(中国仓鼠纤维原细胞)BALBC/3T3(小鼠纤维原细胞)，HAK(仓鼠肾细胞系)，SP2/O(小鼠骨髓瘤)，P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)，BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)，RAJI(人淋巴细胞)以及293(人肾)。特别优选CHO细胞。通常可从商业服务机构，美国组织培养保藏中心(American Tissue Culture Collection)或公开文献获取。
[0441]此外，还可选择以特定形式调节插入序列表达，或修饰和处理基因产物的宿主细胞株。对该蛋白产物的该种修饰(例如，糖基化)和处理(例如，裂解)可对该蛋白的功能非常重要。不同的宿主细胞可对蛋白和基因产物的转译后处理和修饰均有不同的特性和特殊的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白的正确修饰和处理。为此，可使用具有正确处理基因产物的初级转录，糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。
[0442]优选稳定表达以进行重组蛋白的长期高产量生产。例如，可通过工程改造得到稳定表达该抗体分子的细胞系。宿主细胞可通过由适当表达控制元件(例如，启动子，增强子，序列，转录终止子，聚腺苷酸化位点等)和选择性标记控制的进行转化，而非使用包含病毒复制起始区的表达载体。在导入外源DNA后，将工程细胞在富集培养基中培养1-2天，然后转入选择性培养基。重组质粒中的选择性标记可带来对选择因素的耐受并使细胞将该质粒稳定整合进入其染色体，然后生长得到可进行后续克隆并扩展入细胞系的病灶。该方法可用于工程改造可稳定表达抗体分子的细胞系。
[0443]多种选择系统可供使用，包括但不限于可分别应用于tk-，hgprt-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell11：223(1977))，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci USA 48：202(1992))，以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人.，Cell 22：8171980)基因。此外，抗代谢物抗性可用作下列基因选择的基础：具有对氨甲喋呤的抗性的dhfr(Wigler等人.，Natl.Acad.Sci USA 77：357(1980)；O′Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 78：1527(1981))；具有对麦考酚酸的抗性的gpt(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci USA 78：2072(1981))；具有对氨基糖苷G-418的抗性的neo(Clinical Pharmacy 2：488505；Wu和Wu，Biotherapy 5：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；以及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.(62：191-217(1993)；，TIBTECH 11(5)：155-215(1993年5月)；具有对潮霉素的抗性的hygro(Santerre等人.，Gene 30：147(1984)。本领域公知的可供使用的重组DNA技术可参见Ausubel等人.(eds.)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，GeneTransfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；以及Dracopoli等人.(eds)，Current Prolocols in HumanGenetics，第12和13章，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等人，J.MoI.Biol.150：1(1981)，其全文在此引用作为参考。
[0444]抗体分子的表达水平可通过载体扩增得到提高(其综述参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammalian cells inDNA cloning，Academic Press，New York，Vol.3.(1987))。当表达抗体的载体系统中的标记可进行扩增时，宿主细胞培养中抑制剂水平的提升可提高标记基因拷贝数。由于扩增区与抗体基因关联，因而抗体的产量也会得到提高(Grouse等人，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。
[0445]体外生产可以放大，以获得大量的所需多肽。在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术已为本领域所知并包括均匀悬浮培养(例如，在气升式反应器或连续搅拌反应器中)，或是固定化或包埋细胞培养(例如，在中空纤维，微胶囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷芯上)。在必须和/或需要时，例如，在合成铰链区多肽的生物合成后，或在此处所述的HIC层析步骤前后，该多肽溶液可通过常规层析方法进行纯化，例如凝胶过滤，离子交换层析，DEAE-纤维素层析或(免疫-)亲和层析。
[0446]编码本发明IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物的基因还可通过非哺乳动物细胞(例如细菌或昆虫或酵母或植物细胞)进行表达。较容易接受核酸的细菌包括肠杆菌成员，例如大肠杆菌或沙门氏菌菌株；芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌；链球菌，以及流感嗜血杆菌。应当进一步指出，在细菌中表达时该外源多肽通常作为包含体的一部分。该外源多肽可进行分离，纯化然后组装入功能性分子。在需要抗体的四价形式时，该亚基将自动装配进入四价抗体(WO 02/096948A2)。
[0447]在细菌系统中，根据被表达的抗体分子的目标用途，可选择使用多种表达载体。例如，当需要生产大量该种蛋白，以得到一种抗体分子的药物组合物时，可采用能够引导高水平表达易纯化融和蛋白产物的载体。该类载体包括，但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，EMBO J.2：1791(1983))，其中该抗体克隆序列可在与lacZ编码区同框的情况下单独连接至该载体从而生产融和蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye，Nucleic Acids Res.73：31013109(1985)；Van Heeke和Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))；pGEX载体也可用于将外源多肽以谷胱甘肽S转移酶(GST)融和蛋白的形式进行表达。一般而言，该种融和蛋白具有可溶性，并能通过吸附，结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖珠，然后在自由谷胱甘肽存在下洗脱进行简单的纯化。通过设计该pGEX载体包括了凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点，从而使该克隆的目标基因产物可以从GST部分释放。
[0448]除了原核生物外，还可采用真核微生物。尽管许多其它的菌株(例如，毕赤酵母)已上市销售，酿酒酵母，或普通面包酵母在真和微生物中最为常用。
[0449]通常可使用质粒YRp7(Stinchcomb等人，Nature 252：39(1979)；Kingsman等人.，Gene 7：141(1979)；Tschemper等人，Gene10：157(1980))等在酵母中进行表达。该质粒已包含了可为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变菌株(例如ATCC No.44076或PEP4--1(Jones，Genetics 85：12(1977)))提供选择性标记的TRP1基因。然后作为酵母宿主细胞基因组特征的Trp1病斑的存在为色氨酸缺失生长下转化的检测提供了有效的环境。
[0450]在昆虫系统中，通常使用苜蓿尺蠖核多角体病毒(AcNPV)作为表达外源基因的载体。该病毒生长于草地夜蛾细胞。该抗体编码序列可单独克隆进入该病毒的非必须区(例如多角体蛋白基因)并位于AcNPV启动子(例如该多角体蛋白启动子)的控制下。
[0451]当本发明的抗体分子被重组表达后，可通过本领域已知的任意免疫球蛋白分子纯化方法对其进行纯化，例如，层析(例如，离子交换层析，亲和层析，特别是对蛋白A特异性抗原的亲和层析，筛分柱层析)，离心，微分溶出，或通过任何其它蛋白纯化标准技术。替代性地，提高本发明抗体亲和性的优选方法参见US2002 0123057 A1。
VIII.采用治疗性特异性IGF-1R-抗体或其免疫特异性片段的治疗方法
[0452]本发明的一种实施方式提供了在患有该种疾病或易于染上该种疾病的动物体内治疗高度增殖疾病或紊乱(例如，癌症，恶性肿瘤，肿瘤或其转移瘤)的方法，该方法包括，主要包括，或由向该动物施用有效量的结合IGF-1R或IGF-1R变体的抗体或其免疫特异性片段组成。适用的抗体包括此处所述的所有抗体及其抗原特异性片段。范例包括，但不限于，与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异结合相同IGF-R1表位的分离抗体或其抗原结合片段，特异性结合IGF-R1的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段竞争性抑制选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体结合IGF-R1，或是特异性结合IGF-R1的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体一致的抗原结合区。
[0453]在特定的实施方式中，本发明的特异性结合IGF-1R或其变体的抗体抑制一种或多种胰岛素生长因子(例如，IGF-1，IGF-2，或IGF-1和IGF-2两者)与IGF-1R的结合。在其它实施方式中，本发明的特异性结合IGF-1R或其变体的抗体抑制IGF-1R在结合一种或多种胰岛素生长因子时的磷酸化。在进一步的实施方式中，在细胞上(特别地，在肿瘤细胞上)表达的本发明的特异性结合IGF-1R或其变体的抗体抑制涉及细胞增殖，运动和/或转移的下游信号转导分子的磷酸化。该种分子包括，但不限于Akt和p42/44MAPK。在进一步的实施方式中，在细胞上表达的本发明的特异性结合IGF-1R或其变体的抗体促进表面表达的IGF-1R的内在化，限制其与IGF的相互作用的有效性。在更进一步的实施方式中，在细胞上(特别地，在肿瘤细胞上)表达的本发明的特异性结合IGF-1R或其变体的抗体抑制细胞增殖，运动和/或转移。
[0454]可在此处披露的治疗方法中采用的本发明的特异性结合IGF-1R或其变体的抗体可作为停止，减少，防止或抑制涉及细胞增殖的细胞活性(例如，通常与高度增殖疾病或紊乱相关的可诱导血管形成模式改变或异常的细胞活性)的治疗剂进行制备和使用。
[0455]本发明的抗体或其免疫特异性片段包括，但不限于特异性结合肿瘤相关蛋白如IGF-1R的单克隆，嵌合或人源化抗体，以及抗体的片段。该抗体可以是单价，双价，多价或双功能抗体，且该抗体片段包括Fab、F(ab′)2和Fv。
[0456]如本发明所述的治疗性抗体可作为未标记或未结合形式使用，或可被偶合或连接至细胞毒性部分(例如放射性标记和生化细胞毒素)以生成发挥治疗性作用的制剂。
[0457]在特定的实施方式中，本发明的抗体，或其抗原特异性片段包括抗原结合区。抗原结合区由随抗体变化的抗体可变区形成。天然存在的抗体包含至少两个抗原结合区，即，它们至少为双价。此处所用的术语“抗原结合区”包括特异性结合抗原上的表位(例如，细胞表面或可溶性抗原)的位点。抗体的抗原结合区通常包括至少部分的免疫球蛋白重链可变区和至少部分的免疫球蛋白轻链可变区。由这些可变区形成的结合位点决定了该抗体的特异性。
[0458]本发明提供了通过抑制肿瘤生长等手段在哺乳动物中治疗各种高度增殖紊乱的方法，其包括，主要包括，或由向该哺乳动物施用有效量的特异性或优先结合IGF-R1(例如，人IGF-R1)的抗体或其抗原结合片段组成。
[0459]本发明更具体地涉及在动物(例如，哺乳动物)中治疗高度增殖疾病(例如，抑制或防止肿瘤形成，肿瘤生长，肿瘤侵染和/或转移瘤形成)的方法，其包括，主要包括，或由向有此需要的动物施用有效量的特异性或优先结合IGF-1R的一个或多个表位的抗体或其免疫特异性片段组成。
[0460]在其它实施方式中，本发明包括了在动物(例如，人类患者)中治疗高度增殖疾病(例如，抑制肿瘤形成，肿瘤生长，肿瘤侵染和/或转移瘤形成)的方法，其中该方法包括向需要该种治疗的动物施用有效量的组合物，该组合物除了药学可接受的载体外包含，主要包含，或由特异性结合IGF-1R的至少一个表位的抗体，或其免疫特异性片段组成，其中该表位包含，主要包含，或由SEQID NO：2的至少约四个至五个氨基酸，SEQ ID NO：2的至少约九个，或至少约15至约30个氨基酸组成。SEQ ID NO：2的给定表位氨基酸可以，但不必需是相邻的。在特定的实施方式中，GF-1R的至少一个表位包括，主要包括，或由在细胞表面表达的GF-1R胞外区形成的非线性表位组成。因此，在特定的实施方式中，IGF-1R的至少一个表位包括SEQ ID NO：2的至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少20个，至少25个，介于至少约15至约30个，或至少10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100个邻近或非邻近氨基酸，主要由其组成，或由其组成，其中非邻近氨基酸通过蛋白折叠形成表位。
[0461]在其它实施方式中，本发明包括了在动物(例如，人类患者)中治疗高度增殖疾病(例如，抑制肿瘤形成，肿瘤生长，肿瘤侵染和/或转移瘤形成)的方法，其中该方法包括向需要该种治疗的动物施用有效量的组合物，该组合物除了药学可接受的载体外包含，主要包含，或由特异性结合IGF-1R的至少一个表位的抗体，或其免疫特异性片段组成，其中该表位除了如上所述的SEQ IDNO：2的一个，两个，三个，四个，五个，六个或更多个邻近或非邻近氨基酸外包含，主要包含，或由修饰该蛋白的附加部分组成，例如，可包括糖部分，从而使该结合分子以高于对未修饰蛋白类型的亲和性结合修饰的目标蛋白。替代性地，该结合分子完全不与未经修饰的该目标蛋白相结合。
[0462]更特定地，本发明提供了在人体内治疗癌症的方法，其包括向需要该种治疗的人施用包含有效量的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段，以及药学可接受载体的组合物。待治疗的癌症类型包括，但不限于，胃癌，肾癌，脑癌，膀胱癌，结肠癌，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，卵巢癌和前列腺癌。
[0463]在特定实施方式中，抗体或其结合片段特异性地结合上述IGF-1R或片段或变体的至少一个表位，即，与该表位的结合比它与不相关的，随机的表位的结合更容易；优先结合上述IGF-1R或片段或变体的至少一个表位，即，与该表位的结合比它与相关的，相似的，同源的，或类似的表位的结合更容易；竞争性地抑制(自身与上述特定IGF-1R或片段或变体的表位特异性或优先结合的)参考抗体的结合；或以解离常数KD小于约5 x 10-2M，约10-2M，约5 x 10-3M，约10-3M，约5 x 10-4M，约10-4M，约5 x 10-5M，约10-5M，约5 x 10-6M，约10-6M，约5 x 10-7M，约10-7M，约5 x 10-8M，约10-8M，约5 x 10-9M，约10-9M，约5 x 10-10M，约10-10M，约5 x 10-10M，约10-11M，约5 x 10-12M，约10-12M，约5 x 10-13M，约10-13M，约5 x 10-14M，约10-14M，约5 x 10-15M或约10-15M为特征的亲和性与上述IGF-1R或片段或变体的至少一个表位相结合。在抗体结合解离常数上下文所用的术语“约”允许了用于测量抗体亲和性的方法的内在变差程度。例如，依据所用仪器的精度，基于所测样本的样本数的标准误差，以及常规误差，术语”约10-2M”可包括，如从0.05M至0.005M。在特定的实施方式中，本发明的抗体或其片段与来自其它物种的IGF-1R蛋白交叉反应，例如，特异性结合人IGF-1R的抗体或其片段也结合灵长动物IGF-1R和/或鼠IGF-1R。本发明的其它适用抗体或其片段包括具有高度物种特异性的抗体或片段。
[0464]在特定的实施方式中，此处披露的抗体或其免疫特异性片段以小于或等于5 X 10-2/秒，10-2/秒，5 X 10-3/秒或10-3/秒的解离速率(k(off))与IGF-1R多肽或其片段或变体相结合。此处披露的其它抗体或其免疫特异性片段以小于或等于5 X 10-4/秒，10-4/秒，5 X 10-5/秒，或10-5/秒5 X 10-6/秒，10-6/秒，5 X 10-7/秒或10-7/秒的解离速率(k(off))与IGF-1R多肽或其片段或变体相结合。
[0465]在其他实施方式中，此处披露的抗体或其免疫特异性片段以大于或等于103M-1/秒，5 X 103M-1/秒，104M-1/秒或5 X 104M-1/秒的结合速率(k(on))与IGF-1R多肽或其片段或变体相结合。此处披露的其它抗体或其免疫特异性片段以大于或等于105M-1/秒，5 X105M-1/秒，106M-1/秒或5 X 106M-1/秒或107M-1/秒的结合速率(k(on))与IGF-1R多肽或其片段或变体相结合。
[0466]在不同的实施方式中，如上所述的一种或多种结合分子为IGF-1R活性的拮抗剂，例如，拮抗剂IGF-1R抗体与肿瘤细胞上表达的IGF-1R的结合抑制胰岛素生长因子(例如，IGF-1，IGF-2，或IGF-1和IGF-2两者)与IGF-1R的结合，促进IGF-1R的内在化，从而抑制其信号转导能力，抑制IGF-1R的磷酸化，抑制该信号转导途径下游分子(例如，Akt或p42/44 MAPK)的磷酸化，或抑制肿瘤细胞增殖，运动和转移。
IX.采用IGF-1R-特异性结合分子和核酸扩增测定的诊断或预断方法
[0467]IGF-1R-特异性抗体，或其片段，衍生物，或类似物可用于诊断目的，以检测，诊断或监测与IGF-1R异常表达和/或活性相关的疾病，紊乱，和/或症状。IGF-1R表达在肿瘤组织或其它肿瘤症状中上升。
[0468]IGF-1R-特异性抗体或其片段可用于对哺乳动物(优选人)体内的高度增殖紊乱进行诊断，治疗，预防和/或预后。该种紊乱包括，但不限于，癌症，瘤，肿瘤和/或本文别处所述，特别是IGF-1R-相关的癌症，例如胃癌，肾癌，脑癌，膀胱癌，结肠癌，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，卵巢癌和前列腺癌。
[0469]例如，如此处所述，IGF-1R表达至少与胃，肾，脑，膀胱，结肠，肺，乳腺，胰腺，卵巢和前列腺肿瘤组织相关。相应地，针对IGF-1R的抗体(和抗体片段)可用于检测表达上升水平的IGF-1R的特定组织。这些诊断测定可在体内或体外进行，例如，在血液样本，切片组织或解剖组织上进行。
[0470]因此，本发明提供了可用于癌症或其它高度增殖紊乱诊断的诊断方法，其包括检测一种个体的组织或其它细胞或体液中的IGF-1R蛋白或转录物表达水平，并将测得的表达水平与普通组织或体液中的标准IGF-1R表达水平相比较，表达水平与标准相比的提高变意味着紊乱。
[0471]一个实施方式中提供了在体液或组织样本中检测异常高度增殖细胞(例如，癌前或癌细胞)存在的方法，其包括测定一种个体的组织或体液样本中的IGF-1R表达水平，并将该样本中测得的IGF-1R的存在或水平与一组标准组织或体液样本中的IGF-1R的存在或水平相比较，但测得IGF-1R表达或IGF-1R表达比标准更高则意味着异常高度增殖细胞生长。
[0472]更特定地，本发明提供了在体液或组织样本中检测异常高度增殖细胞(例如，癌前或癌细胞)存在的方法，其包括(a)通过使用本发明中IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段测定一种个体的组织或体液样本中的IGF-1R表达水平，并(b)将该样本中测得的IGF-1R的存在或水平与一组标准组织或体液样本中的IGF-1R的存在或水平相比较，但测得IGF-1R表达或IGF-1R表达比标准更高则意味着异常高度增殖细胞生长。
[0473]对于癌症，来自个体的切片组织中相对大量的IGF-1R蛋白的存在可能意味着肿瘤或其它恶性生长的存在，可能意味着该种恶性肿瘤或肿瘤的易患病体制，或可能提供在实际临床症状出现以前检测疾病的手段。更确定的该种类型的诊断可允许健康专家更早地采用预防性措施或积极治疗，从而防止癌症的形成或进一步进展。
[0474]本发明的IGF-1R-特异性抗体可通过本领域技术人员已知的经典免疫组化方法用于测定生物样本中的蛋白水平(例如，参见Jalkanen，等人，J.Cell.Biol.707：976-985(1985)；Jalkanen，等人，J.Cell Biol.705：3087-3096(1987))。其它可用于检测蛋白表达的基于抗体的方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸收分析(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)。适用的抗体测定标记已为本领域所知并包括酶标记，例如，葡萄糖氧化酶；放射性同位素，例如碘(125I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(112In)，以及锝(99Tc)；发光标记，例如发光氨；以及荧光标记，例如荧光素和若丹明，以及生物素。适用测定在本文别处有更具体的描述。
[0475]本发明的一方面是在动物(优选哺乳动物，最优选人)体内检测或诊断与IGF-1R异常表达相关的高度增殖疾病或紊乱的方法。在一个实施方式中，诊断包括：a)向对象施用(例如，肠胃外，皮下或腹腔内)有效量的本发明特异性结合IGF-1R的标记抗体或其片段；b)在施用后等待一定时间，以允许标记抗体结合分子在对象体内表达IGF-1R的位点优先浓缩(以及允许未结合标记分子被清除至背景水平)；c)测定背景水平；以及d)检测对象体内的标记分子，在背景水平以上的标记分子的测得意味着该对象具有与IGF-1R的异常表达相关的特定疾病或紊乱。背景水平可通过多种方法进行测定，包括将测得的标记分子的量与对之前测得的特定系统的标准值相比较。
[0476]本领域中将可理解对象的大小以及所用的成像系统将决定生成诊断图像所需的成像部分的数量。对于放射性同位素部分和人类对象，所注射的放射能的数量通常在约5至29mCi的范围内，例如，99Tc。标记的结合分子(例如，抗体或抗体片段)将优先在包含该特异性蛋白的细胞的位置聚集。体内肿瘤成像可参见S.W.Burchiel等人.，＂Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodiesand Their Fragments.＂(Chapter 13 in Tumor Imaging：TheRadiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes，eds.，Masson Publishing Inc.(1982)。
[0477]依赖于多种变量，包括所用标记的类型和施用的模式，在施用后允许标记分子在对象体内位点优先浓缩并使未结合标记分子清除至背景水平的时间间隔为6至48小时或6至24小时或6至12小时。在另一实施方式中，该施用后的时间间隔为5至20天或7至10天。
[0478]患者体内标记分子的存在可通过本领域已知的体内扫描的方法进行检测。这些方法取决于所用标记的类型。技术人员将能够确定用于检测特定标记的适当方法。可用于本发明的诊断方法的方法和仪器包括，但不限于，计算机断层扫描(CT)，全身扫描如正电子发射断层成像(PET)，磁共振成像(MRI)以及超声波扫描术。
[0479]在特定的实施方式中，该结合分子以放射性同位素标记并采用辐射响应手术器械在患者体内检测(Thurston等人.，美国专利5,441,050)。在另一实施方式中，该结合分子以荧光化合物标记并采用荧光响应扫描器械在患者体内检测。在另一实施方式中，该结合分子以正电子发射金属标记并采用正电子发射断层扫描在患者体内检测。在另一实施方式中，该结合分子以顺磁性材料标记并采用磁共振成像(MRI)在患者体内检测。
[0480]用于IGF-1R表达的体内成像的抗体标记包括通过X光，核磁共振成像(NMR)，MRI，CAT-扫描或电子自旋共振成像(ESR)可测的标记。对于X光，适用的标记包括放射性同位素，例如钡或铯，其能发射出可测的辐射，但不明显损伤对象。适用的NMR和ESR的标记包括具有可测的特征自旋的标记，例如氘，该标记可通过标记相关杂交瘤的营养物质被整合进入抗体。当使用体内成像检测提高的IGF-1R表达以进行人体诊断时，优选使用人抗体或本文别处所述的“人源化”嵌合单克隆抗体。
[0481]在上述相关的实施方式中，对已经诊断的疾病或紊乱可通过重复任意一种用于诊断该疾病或紊乱的方法在例如首次诊断后一个月，首次诊断后六个月，首次诊断后一年进行监测。
[0482]当已经根据常规方法进行紊乱诊断(包括肿瘤诊断)时，此处所述的检测方法可作为有用的预断指示，其中继续显示提高的IGF-IR表达的患者相对其表达水平下降至更接近标准水平的患者将获得更差的临床结果。
[0483]“测定肿瘤相关的IGF-1R多肽的表达水平”意在直接地(例如，测量或估计绝对蛋白水平)或相对地(例如，与第二生物样本的癌症相关多肽水平相比较)定性或定量测量或估计IGF-1R多肽在第一生物样本中的水平。优选地，第一生物样本中的IGF-1R多肽表达水平被测量或估计后与标准IGF-1R多肽水平相比较，该标准取自于来自未患有紊乱的个体的第二生物样本，或由未患该紊乱的群体的平均水平制定。如本领域所能理解，一旦已知该“标准”IGF-1R多肽水平，它可作为比较的标准重复使用。
[0484]“生物样本”指任何取自于潜在表达IGF-1R的个体，细胞系，组织培养，或其它细胞来源的生物样本。如上所示，生物样本包括体液(例如血清，血浆，尿液，关节滑液以及脊髓液)，以及包含潜在表达IGF-1R的细胞的其它组织来源。从哺乳动物获取组织切片和体液的方法已为本领域公知。
[0485]在附加的实施方式中，针对IGF-1R的构型表位的抗体或抗体的免疫特异性片段可用于定性或定量检测IGF-1R基因产物或其保守变体或肽片段的存在。这可通过，例如，结合了光镜，流式细胞仪，或荧光检测的采用荧光标记抗体的免疫荧光技术得以实现。
[0486]可采用此处所述的方法进行诊断和/或预测的癌症包括但不限于胃癌，肾癌，脑癌，膀胱癌，结肠癌，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，卵巢癌和前列腺癌。
X.免疫测定
[0487]此处披露的IGF-1R-特异性抗体，或其免疫特异性片段可通过本领域的任何已知方法测定其免疫特异性结合。可采用的免疫测定包括但不限于，使用western印迹，放射性免疫测定，ELISA(酶联免疫吸收分析)，“夹心”免疫测定，免疫沉淀分析，沉淀素反应，凝胶扩散沉淀素反应，免疫扩散测定，凝集测定，补体-固定测定，免疫放射分析，荧光免疫测定，蛋白A免疫测定等技术的竞争性和非竞争性测定系统。这些均为常规测定并在本领域公知(例如，参见Ausubel等人，eds，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.，New York，Vol.1(1994)，其全文在此引用作为参考)。下文简述了示范性的免疫测定(但并非进行限制)。
[0488]免疫沉淀方案通常包括在添加了蛋白磷酸酯酶和/或蛋白酶抑制剂(例如，EDTA，PMSF，抑肽酶，钒酸钠)的溶解缓冲液如RIPA缓冲液(1％ NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸盐，0.1％SDS，0.15M NaCl，pH7.2的0.01M磷酸钠，1％特血尔(Trasylol))中溶解一定量的细胞，向细胞溶解产物添加目标抗体，在4摄氏度下培养一定时间(例如，1-4小时)，向细胞溶解产物添加蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠，在4摄氏度下培养一小时或更多时间，以溶解缓冲液洗涤珠子并将珠子重新悬浮于SDS/样本缓冲液中。目标抗体免疫沉淀特定抗原的能力可通过例如western印迹分析进行评估。本领域的技术人员应能理解可对该参数进行调整以提高抗体与抗原的结合，并降低背景干扰(例如，以琼脂糖珠预先去除细胞溶解产物)。有关免疫沉淀方案的进一步讨论可参见，例如Ausubel等人.，eds，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York，Vol.1(1994)at 10.16.1。
[0489]Western印迹分析通常包括制备蛋白样本，将蛋白样本在聚丙烯酰胺凝胶(例如，根据抗原的分子量选择8％-20％SDS-PAGE)中进行电泳，将蛋白样本从聚丙烯酰胺凝胶转移到一种膜(例如硝化纤维，PVDF或尼龙)上，在封闭液(例如，带有3％ BSA或脱脂牛奶的PBS)中封闭膜，以洗涤缓冲液(例如，PBS-Tween 20)清洗膜，以稀释于封闭缓冲液的一抗(该目标抗体)封闭膜，以洗涤缓冲液清洗膜，以稀释于封闭缓冲液的结合至酶底物(例如，辣根过氧化酶，碱性磷酸酶)或放射性分子(例如，32p或1251)的二抗(可识别该一抗，例如，抗人抗体)封闭膜，以洗涤缓冲液清洗膜，并检测抗原的存在。本领域的技术人员应能理解可对该参数进行调整以提高测得信号并降低背景噪音。有关western印迹方案的进一步讨论可参见，例如Ausubel等人.，eds，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New YorkVol.1(1994)第10.8.1节。
[0490]ELISAs包括制备抗原，以抗原涂布96孔微量滴定板的孔，向孔中添加与可测化合物如酶底物(例如，辣根过氧化酶，碱性磷酸酶)结合的目标抗体并培养一段时间，检测抗原的存在。在ELISAs中该目标抗体并非必须连接至可测化合物；事实上可向孔中添加一种结合了可测化合物的第二抗体(可识别目标抗体)。此外，除了用抗原涂布微孔外，也可以使用抗体涂布微孔。在这一情况下，在添加目标抗原后可能要向涂布微孔添加结合了可测化合物的一种第二抗体。本领域的技术人员应能理解可对该参数进行调整以提高测得信号以及其它本领域已知的ELISAs变量。有关ELISAs的进一步讨论可参见，例如Ausubel等人.，eds，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York，Vol.1(1994)第11.2.1节。
[0491]抗体与抗原的结合亲和性以及抗体-抗原相互作用的解离速率可通过竞争性结合测定进行检测。竞争性结合测定的一个范例是放射性免疫测定，其包括在未标记抗原的数量不断增长的情况下培养标记抗原(例如，3H或125I)和目标抗体，并检测结合至标记抗原的抗体。目标抗体对特定抗原的亲和性以及结合解离速率可通过Scatchard作图分析的数据测定。与一种第二抗体的竞争性也可通过放射性免疫测定进行检测。此时，该抗原与结合了标记化合物(例如，3H或125I)的目标抗体在未标记第二抗体逐渐增加的情况下进行培养。
[0492]此外，IGF-1R-特异性抗体还可以通过免疫荧光，免疫电镜或非免疫学分析等组织学方法原位测定癌症抗原基因产物或其保留变体或肽片段。原位检测可通过从患者体内取出一个组织学样本，并使其接触一种标记的IGF-1R-特异性抗体或其片段，优选将标记抗体(或片段)覆盖至组织学样本上得以实现。通过采用该种方法不仅可以检测IGF-1R蛋白，或其保守变体或肽片段的存在，还可测得其在被检组织中的分布。通过本发明，普通技术人员均能理解可对各种各样的组织学方法(例如染色法)中的任意方法进行改造以实现该种原位检测。
[0493]对IGF-1R基因产物或其保守变体或肽片段的免疫测定或非免疫测定通常包括在能够结合IGF-1R基因产物或其保守变体或肽片段的标记抗体的存在下培养一种样本(例如，生物流体，组织萃取物，新鲜采集的细胞或经细胞培养后的细胞溶解产物)，并通过本领域公知的任意技术检测结合抗体。
[0494]该生物样本可接触或固定至一种固相支持物或载体(例如硝化纤维)，或其它能够固定细胞，细胞颗粒或可溶蛋白的固相支持物。使用适当的缓冲液洗涤支持物后以可检测标记的IGF-1R-特异性抗体进行处理。然后以缓冲液在此清洗该固相支持物以去除未结合抗体。该抗体可根据需要进行后续标记。然后可通过常规方法检测固相支持物上结合标记的数量。
[0495]“固相支持物或载体”指任何能够结合抗原或抗体的支持物。公知支持物或载体包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，右旋糖苷，尼龙，淀粉酶，天然或修饰纤维素，聚丙烯酰胺，辉长岩，以及磁铁矿。根据本发明的目的，该载体的性质可以是一定程度可溶的或是不溶的。只要偶合分子能够集合抗体或抗原，该支持材料可采用任何可能的构造。因此，该支持物的构型可以是球形(例如，珠子)，或圆柱形(例如试管的内表面或是棒的外表面)。此外，该表面可以是平面的，例如薄片，试纸等。优选支持物包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员将了解多种能够结合抗体或抗原的适用载体，或可通过常规实验进行验证。
[0496]给定量的IGF-1R-特异性抗体的结合活性可通过公知技术进行测定。本领域的技术人员应当能够进行有效测定并通过常规实验优化每次测定的测试条件。
[0497]多种方法可用于测定抗体-抗原相互作用的亲和性，但可测定速率常数的则相对较少。多数方法依赖于标记抗体或抗原，从而不可避免地使常规测定复杂化，并对测定数量引入了不确定性。
[0498]运行于BIAcore的表面等离子共振仪(SPR)相对传统的测量抗体-抗原相互作用亲和性的方法带来了多种优点：(i)无需标记抗体或抗原；(ii)无需事先纯化抗体，可直接使用细胞培养悬浮液；(iii)实时检测，支持对不同单克隆抗体相互作用进行快速半定量比较，可支持和满足多种评估用途；(iv)生物特异性表面可再生，从而使一系列不同的单克隆抗体可在相同的条件下简单地进行比较；(v)分析过程完全自动化，多种测量可在无用户干涉的情况下进行。BIAapplications Handbook，version AB(1998再版)，BIACORE codeNo.BR-1001-86；BIAtechnology Handbook，version AB(1998再版)，BIACORE code No.BR-1001-84。
[0499]基于SPR的结合研究要求将一定量的结合对固定在传感器表面上。固定的结合伴侣指配体。溶液中的结合伴侣指分析物。在某些情况下，该配体通过与另一固定化分子(称为捕获分子)的结合间接附着在表面上。SPR响应反映了当分析物结合或解离时探测器表面质量浓度的变化。
[0500]基于SPR，实时BIAcore测量可在相互作用发生时对其直接监测。该技术非常适于检测动力学参数。相对亲和性排序可极为简单的实现，动力学和亲和性常数均可从感应图数据获得。
[0501]当被分析物以不连续脉冲注射至配体表面时，所得的感应图可分为三个基本阶段：(i)样本注射过程中被分析物与配体的结合；(ii)样本注射过程中的平衡或稳定状态，此时被分析物的结合与其从复合物的解离向平衡；(iii)缓冲液流过时被分析物从表面的解离。
[0502]该结合和解离阶段提供了有关被分析物-配体相互作用的动力学信息(ka和kd，复合物形成和解离速率，kd/ka＝KD)。该平衡阶段提供了有关被分析物-配体相互作用的亲和性信息(KD)。
[0503]BIAevaluation软件提供了使用数值积分和全面拟合算法进行曲线拟合的全面的工具。通过对数据的适当分析可从单次BIAcore考察获得相互作用的分离速率和亲和常数。该技术可检测的亲和性范围非常宽广，可从mM到pM。
[0504]表位特异性是一种单克隆抗体的重要性质。与采用放射性免疫测定，ELISA或其它表面吸附方法的传统技术不同，通过BIAcore进行的表位定位不需要标记或纯化抗体，并支持采用一种多个单克隆抗体的序列进行多位点特异性测试。此外，还可自动化处理大量的分析。
[0505]成对结合实验测试了两个MAbs同时结合相同抗原的能力。针对不同表位的MAbs可单独结合，而针对相同或相近表位的MAbs则会干扰彼此的结合。这一通过BIAcore进行的结合实验非常易于开展。
[0506]例如，可采用一种捕获分子结合该第一Mab，然后先后添加抗原和第二Mab。该感应图可以显示：1.多少抗原与第一Mab结合，2.第二MAb与表面附着抗原的结合程度，3.如果该第二MAb未结合，逆转成对测试的顺序是否改变结果。
[0507]肽抑制是另一种用于表位定位的技术。该方法可完善成对抗体结合研究，并能在抗原的初级序列已知的情况下关联功能性表位与结构特征。该方法将对肽或抗原片段对不同MAbs与固定化抗原结合的抑制进行测试。能干扰给定MAb结合的肽被认为与该MAb所定义的表位结构相关。
XI.药物组合物和施用方法
[0508]IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段的制备以及向需要该药物的对象进行施用的方法已为本领域技术人员熟知。结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)的施用途径可以是，例如，口服，肠胃外，通过吸入或局部施用。此处所用的术语肠胃外施用包括，例如，静脉内，动脉内腹膜内，肌肉内，皮下，直肠或阴道施用。尽管所有这些施用的剂型均明确在本发明的预期范围内，其中一种给药剂型可以是供注射，特别是供静脉或动脉注射或者滴注的溶液。一种注射用的合适的药物组合物通常包括一种缓冲液(例如，醋酸盐，磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)，一种表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)，可选择性包括一种稳定剂(例如，人白蛋白)等。然而，在另一种与此技术一致的方法中，结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)可直接传递至有害细胞群，从而提高该疾病组织对该治疗剂的暴露。
[0509]肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液，悬浮液，乳剂。非水溶液的范例为丙二醇，聚乙烯乙二醇，植物油(例如橄榄油)，以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。水溶液载体包括水，酒精/水溶液，乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。本发明中药学可接受的载体包括，但不限于，0.01-0.1M，优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其它常用的肠胃外载体包括磷酸钠溶液，Ringer右旋糖，右旋糖和氯化钠，Ringer乳酸盐，或固定油。静脉内载体包括液体和营养补充剂，电解质补充剂，例如基于Ringer右旋糖的电解质补充剂等。还可包括防腐剂和其它添加剂，例如，抗菌剂，抗氧化剂，鳌合剂，以及惰性气体等。
[0510]更具体地，适于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(溶于水时)或分散液以及用作可无菌注射溶液或分散液的临时制剂的无菌粉末。此时，该组合物应当无菌且具有足够的流动性以进行注射。它应在生产和贮存条件下保持稳定，并优选可耐受微生物(例如细菌和真菌)的污染。该载体可以是一种溶剂或分散介质，其包含，例如，水，乙醇，多羟基化合物(丙三醇，丙二醇，以及液体聚乙二醇等)，及其适当的混合物。适当的流动性可通过多种方式维持，例如，通过适用卵磷脂等覆层，对于分散剂通过保持所需的颗粒尺寸以及通过表面活性剂的使用。用于此处披露的治疗方法的合适制剂披露于Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，16th ed.(1980)。
[0511]微生物作用的预防可通过各种抗菌和抗真菌剂(例如，防腐剂，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸，噻汞撒等)实现。在许多情况下该组合物中优选包含等张剂，例如，糖，多元醇(例如甘露醇，山梨糖醇)，或氯化钠。可注射组合物的长期吸收可通过在组合物中包含一种延缓吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和白明胶)来实现。
[0512]在任意情况下，无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物(例如，IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段，其自身或与其它活性试剂的组合物)与此处所列成份的一种或组合溶于一种适当的溶剂中，并根据要求过滤灭菌而制备得到。一般而言，分散剂可通过将活性化合物与包含了基础分散介质和所需其它上述成分的无菌载体结合得到。对于可用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，其优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，通过制备得到的粉末包含活性成分和从其无菌过滤溶液得到的任何附加所需成分。该注射制剂经处理后将根据本领域已知方法填充入容器(例如安瓿，袋，瓶，注射器或小瓶)，并在无菌条件下密封。此外，该制剂可经过包装以试剂盒的形式出售，如共同未决申请U.S.S.N.09/259,337(US-2002-0102208 A1)所述，其全文在此引用作为参考。该产品优选包含标签或说明书以指示该相关组合物可用于治疗患有或易患自体免疫或新生细胞紊乱的对象。
[0513]用于治疗高度增殖紊乱的本发明组合物的有效剂量取决于多种因素，包括施用方法，靶标位点，患者的生理状态，该患者是人或动物，施用的其它药物，以及用于治疗还是预防。该患者通常为人，但也可治疗包括转基因动物在内的非人类哺乳动物。可采用本领域技术人员已知的常规方法对治疗剂量进行滴定测量以获得最佳的安全性和有效性。
[0514]采用抗体或其片段对高度增殖紊乱进行治疗时，该剂量相对宿主体重可以为，例如，从约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg，2mg/kg等)。例如该剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内，优选至少1mg/kg。上述范围的中间剂量在本发明的范围之内。对象给药可采取每天施用，隔日施用，每周施用或根据任何其它通过实证分析得到的进度施用。一种示范性的治疗需要在较长的期限内(例如，至少六个月)进行多剂量施用。一种示范性的治疗方案需要每两周或每月一次或是每3至6个月一次施用。示范性的剂量给法包括连续每天1-10mg/kg或15mg/kg，隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中同时给用两种或多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，其中各抗体的给用剂量均在指示的范围之内。
[0515]此处披露的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可在多种时间施用。单独剂量之间的间隔可以为数周，数月或数年。根据对患者体内目标多肽或目标分子血液水平的测量所示，该间隔也可是不规律的。在一些方法中可对剂量进行调整以使血浆多肽浓度在1-1000μg/ml，在一些方法中该浓度为25-300μg/ml。替代性地，结合分子可作为缓释制剂施用，此时可减少给药频率。剂量和频率的变化取决于抗体在患者体内的半衰期。结合分子还可通过与稳定多肽或部分(例如，白蛋白或PEG)相融合来延长半衰期。一般而言，人源化抗体显示了最长的半衰期，其次是嵌合抗体和非人源抗体。在一个实施方式中，本发明的结合分自可以未结合形式施用。在另一实施方式中，该结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)可以结合形式多次施用。在另一实施方式中，本发明的结合分子可先以不结合方式，再以结合方式施用，或以相反的顺序施用。
[0516]剂量和施用频率可依据该治疗为预防性或治疗性而发生变化。在预防性应用中，包含抗体或其混合物的组合物被施用至未处于疾病状态或在疾病前状态的患者以增强该患者的抵抗力。该种数量被定义为“预防有效剂量”。对于该用途，其确切的数量在以依赖于患者的健康和总体免疫力状态，但通常在每个剂量约0.1至25mg的范围内，特别在每个剂量0.5至2.5mg的范围内。可以相对低的剂量在较长的一段时间内以相对较低的频率施用。部分患者将接受终生持续治疗。
[0517]在治疗性应用中，有时需要以相对高的剂量(例如，从约1至400mg/kg的结合分子，例如，每个剂量的抗体，放射免疫结合物通常采用从5至25mg的剂量，细胞毒素药物结合的分子将采用更高的剂量)在相对短的间隔内施用直至疾病的进展被减缓或终止，并优选直至该患者显示部分或完全改善疾病症状。此后，该患者可以预防方案进行施用。
[0518]在一个实施方案中，可采用编码IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段的核酸分子(例如，包含在载体中)治疗对象。编码多肽的核酸的剂量范围为每个患者约10ng至1g，100ng至100mg，1μg至10mg，或30-300μg DNA。传染性病毒载体的剂量在每剂10-100或更多病毒体。
[0519]用于预防性和/或治疗性治疗的治疗剂可通过肠胃外，局部，静脉内，口服，皮下，动脉内，头颅内，腹膜内，鼻内或肌肉内的方式施用。在部分方法中，药剂被直接注射进入特定的IGF-1R-表达细胞被积聚的组织，例如头颅内注射。抗体施用优选采用肌肉注射或静脉输注。在部分方法中，特定的治疗性抗体被直接注射入颅内。在一些方法中，该抗体作为缓释组合物或仪器(例如MedipadTM仪)进行给药。
[0520]本发明的IGF-1R抗体或其片段可选择与其它对紊乱或症状的治疗(例如，预防或治疗)有效的试剂联合施用。
[0521]90Y-标记的结合多肽的有效单独治疗剂量(即，治疗有效量)在约5和约75mCi的范围内，更优选在约10和约40mCi范围内。131I-标记的抗体的有效单独治疗非骨髓清除性剂量在约5和约70mCi的范围内，更优选在约5和约40mCi范围内。131I-标记的抗体的有效单独治疗清除性剂量(即，可能需要自体骨髓移植)在约30和约600mCi的范围内，更优选在约50和约500mCi范围内。对于嵌合抗体，由于其相对鼠源抗体更长的循环半衰期，131I-标记的嵌合抗体的有效单独治疗非骨髓清除性剂量在约5和约40mCi的范围内，更优选小于约30mCi。对于如111In的成像标准通常小于约5mCi。
[0522]尽管对于131I和90Y已获得了大量的临床经验，其它放射性标记已为本领域所知并被用于类似的目的。还有其它放射性同位素被用于成像。例如，包含在本发明的范围内的其它放射性同位素包括，但不限于，123I，125I，32P，57Co，64Cu，67Cu，77Br，81Rb，81Kr，87Sr，113In，127Cs，129Cs，132I，197Hg，203Pb，206Bi，177Lu，186Re，212Pb，212Bi，47Sc，105Rh，109Pd，153Sm，188Re，199Au，225Ac，211At和213Bi。在此方面α，γ和β发射体均适用于本发明。此外，通过本披露可与认为本领域的技术人员能够在不进行额外实验的情况下容易地确定哪一种放射性核与选定的治疗过程相匹配。为此，已用于临床诊断的其它放射性核包括125I，123I，99Tc，43K，52Fe，67Ga，68Ga和111In。抗体也可通过多种放射性核标记以潜在用于标靶型免疫疗法(Peirersz等人.Immunol.Cell Biol.65：111-125(1987))。这些放射性核包括188Re和186Re以及较少采用的199Au和67Cu。美国专利5,460,785提供了有关该类放射性同位素的其它数据并在此引用作为参考。
[0523]不管此处披露的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段为结合或未结合的形式，可以理解本发明的主要优点在于能够在骨髓抑制患者(特别是正经历，或曾经经历放射疗法或化学疗法等辅助疗法的患者)中使用这些分子。也就是说，该分子有益的传递能力(即，相对短的血清停留时间，高结合亲和性和增强的定位)使其可特别用于治疗具有减少的红骨髓储备并对骨髓中毒性敏感的患者。就此而言，该分子独特的传递能力使其能非常有效的向骨髓抑制癌症患者施用放射性标记的结合物。因此，此处披露的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可以结合或未结合形式用于曾经经历外部辐射束或化疗等辅助疗法的患者。在其它优选的实施方式中，结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)(处于结合或未结合形式)可用于联合化学治疗试剂的联合治疗方案。本领域的技术人员将能理解该治疗方案可包括顺序，同时，并行或同延施用所披露抗体或其它结合分子和一种或多种化学治疗剂。本发明该方面特别优选的实施方式包括施用放射标记的结合多肽。
[0524]尽管IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可按上文所述进行施用，必须强调在其它的实施方式中，结合和未结合的结合分子可作为一线治疗剂施用给在其它方面健康的患者。在该种实施方式中，结合分子可施用给具有正常或平均红骨髓储存的患者和/或未曾，以及未在经历如外部辐射束或化疗等辅助疗法的患者。
[0525]然而，如上文所讨论，本发明选定的实施方式中包括向骨髓抑制患者施用IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段，或者与一种或多种如放射疗法或化学疗法等辅助疗法联合或结合施用(即，联合治疗方案)。如此处所用，结合或联合辅助疗法施用IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段指顺序，同时，同延，并行，伴随或同期施用或采用疗法及此处披露的结合分子。本领域的技术人员将能理解联合治疗方案的各种成分的施用或应用可能需要定时以增强该治疗的整体疗效。例如，可在标准的，公知的治疗过程中施用化疗剂，并在随后的几周内施用此处所述的放射性免疫结合物。相反地，细胞毒素结合的结合分子可进行静脉施用，然后采用肿瘤定位外部辐射束。在另一实施方式中，结合分子可与一种或多种选定的化学治疗剂在单次诊疗中并行施用。技术人员(例如，有经验的肿瘤专家)能够根据所选的辅助疗法和本说明书的启示在不进行额外实验的基础上容易地辨别有效的联合治疗方案。
[0526]就此而言，可以理解结合分子(带有或不带有细胞毒素)和化疗剂可在能向患者提供治疗性益处的任意顺序和任意时间段内联合施用。也就是说，化疗剂和IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可以任意顺序或并行施用。在选定的实施方式中，本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段将被施用于曾经历化疗的患者。在另一实施方式中，本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段将于化学疗法治疗疾病同时或并行充分施用。例如，该患者可在经历化疗的过程中接受结合分子。在优选的实施方式中，该结合分子将在接受任意化疗剂或治疗的1年内施用。在其它优选的实施方式中，该多肽将在接受任意化疗剂或治疗的10，8，6，4或2个月内施用。在其它优选的实施方式中，该结合分子将在接受任意化疗剂或治疗的4，3，2或1周内施用。在其它实施方式中，该结合分子将在接受任意化疗剂或治疗的5，4，3，2或1天内施用。可以进一步理解该两种药剂或治疗可在数小时或分钟内(即，基本同时)向患者施用。
[0527]此外，如本发明所述的骨髓抑制患者应当指代任何显示出降低的血球计数的患者。本领域的技术人员将能理解有多种血球计数参数被常规用作骨髓抑制的临床指标，人们可以容易地测定患者体内骨髓抑制的程度。为本领域接受的骨髓抑制测量的范例为嗜中性细胞绝对计数(ANC)或血小板计数。该种骨髓抑制或部分骨髓抑制可能是各种生化紊乱或疾病的结果，或者更可能是先前的化疗或放疗的结果。就此而言，本领域的技术人员将能理解接受传统化疗的患者通常会显示降低的红骨髓储存。如上文讨论，该类对象常常不能采用最优水平的细胞毒素(即，放射性核)进行治疗，因为这可能产生导致死亡率或发病率上升的贫血或免疫抑制等副作用。
[0528]更具体地，本发明的结合或未结合的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可用于有效治疗ANCs低于约2000/mm3或血小板计数低于约150,000/mm3的患者。更优选地，本发明的结合或未结合的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可用于治疗ANCs低于约1500/mm3，低于约1000/mm3，或更优选地低于约500/mm3的患者。类似地，本发明的结合或未结合的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可用于治疗血小板计数低于约75,000/mm3，低于约50,000/mm3，或更优选地低于约10,000/mm3的患者。从更普遍意义上讲，本领域的技术人员将能够容易地采用政府实施的指南和程序确定患者何时被骨髓抑制。
[0529]如上文指出，许多骨髓抑制患者曾经历包括化疗，移植放疗或外束放疗等治疗过程。对于后者，外部辐射源用于对恶性肿瘤进行局部照射。对于放疗移植法，放射活性试剂通过手术定位在恶性肿瘤内，从而选择性地照射疾病位点。在任意情况下，本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段能够用于治疗显示了骨髓抑制(不论其原因)的患者体内的紊乱。
[0530]就此而言，可以进一步理解IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可与消除，减少，抑制或控制体内肿瘤细胞生长的任意化疗剂或药剂结合或联合使用(例如，提供联合治疗方案)。如同讨论，该种药剂常会导致红骨髓储存的减少。这种减少可被有利于该类患者体内肿瘤的积极治疗的本发明化合物减弱的骨髓中毒性所完全或部分抵消。在其它实施方式中，此处披露的放射性标记的免疫结合物可与提高肿瘤细胞对放射核易感性的放射敏化剂一起有效使用。例如，可在肿瘤标记的结合分子被从血流中大量清除但在肿瘤位点或肿瘤上仍保持治疗有效水平之后施用放射敏化化合物。
[0531]对于本发明的这些方面，适用于本发明的示范性化疗剂包括烷基化剂，长春生物碱(例如，长春新碱和长春碱)，甲基苄肼，甲氨蝶呤和泼尼松。四药物组合MOPP(氮芥，长春新碱，丙卡巴肼和泼尼松)在治疗多种类型的淋巴瘤中非常有效并构成了本发明的一个优选实施方式。在MOPP-耐性患者中，可采用组合ABVD(例如，阿霉素，博莱霉素，长春碱和达卡巴嗪)，ChIVPP(苯丁酸氮芥，长春碱，丙卡巴肼和泼尼松)，CABS(洛莫司汀，阿霉素，博莱霉素和链脲佐菌素)，MOPP加ABVD，MOPP加ABV(阿霉素，博莱霉素和长春碱)或BCVPP(卡氮芥，环磷酰胺，长春碱，丙卡巴肼和泼尼松)。Arnold S.Freedman和Lee M.Nadler，Malignant Lymphomas，in Harrison′s Principles of InternalMedicine 1774-1788(Kurt J.Isselbacher等人，eds.，13th ed.1994)以及V.T.DeVita等人.(1997)且该参考文献针对标准剂量和方案在此引用。这些疗法可不加改变地，或根据特定患者的需要进行改动后联合一种或多种本发明的特异性抗体或其免疫特异性片段进行使用。
[0532]其它在本发明的上下文中有用的方案包括单个烷基化剂如环磷酰胺或苯丁酸氮芥，或组合如CVP(环磷酰胺，长春新碱和泼尼松)，CHOP(CVP和多柔比星)，C-MOPP(环磷酰胺，长春新碱，强的松和丙卡巴肼)，CAP-BOP(CHOP加丙卡巴肼和博莱霉素)，m-BACOD(CHOP加甲氨蝶呤，博莱霉素和亚叶酸钙)，ProMACE-MOPP(泼尼松，甲氨蝶呤，多柔比星，环磷酰胺，足叶乙甙和亚叶酸钙加标准MOPP)，ProMACE-CytaBOM(泼尼松，多柔比星，环磷酰胺，足叶乙甙，阿糖胞苷，博莱霉素，长春新碱，甲氨蝶呤和亚叶酸钙)以及MACOP-B(甲氨蝶呤，阿霉素，环磷酰胺，长春新碱，固定剂量强的松，博莱霉素和亚叶酸钙)的使用。本领域的技术人员将能轻易地对该类方案中的每一种确定标准剂量和方案。CHOP还与博莱霉素，甲氨蝶呤，丙卡巴肼，氮芥，阿糖胞苷和足叶乙甙联用。其它适用的化疗剂包括，但不限于，2-氯脱氧腺苷(2-CDA)，2′-脱氧肋间型霉素和氟达拉滨。
[0533]对于患有中级和高级恶性肿瘤的患者，在无法实现缓解或者复发时，可使用挽救疗法。挽救疗法单独或组合使用如阿糖胞苷，顺铂，卡铂，足叶乙甙和异环磷酰胺等药物。对于特定肿瘤紊乱的复发或侵染形势常可采用如下的方案：IMVP-16(异环磷酰胺，甲氨蝶呤和依托泊苷)，MIME(甲基-gag，异环磷酰胺，甲氨蝶呤和依托泊苷)，DHAP(地塞米松，高剂量阿糖胞苷和顺铂)，ESHAP(依托泊苷，甲基泼尼松龙，HD阿糖胞苷，顺铂)，CEPP(B)(环磷酰胺，足叶乙甙，丙卡巴肼，强的松和博莱霉素)和CAMP(洛莫司汀，米托蒽醌，阿糖胞苷和泼尼松)，分别采用其公知的给药速率和方案。
[0534]与本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段联合使用的化疗剂的数量可随对象变化，或可更加本领域已知的情况使用。例如参见，Bruce A Chabner等人.，Antineoplastic Agents，inGoodman & Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics1233-1287(Joel G.Hardman等人，eds.，9th ed.(1996))。
[0535]在另一实施方式中，本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可与生物制品结合施用。可用于癌症治疗的生物制品已为本领域所知，且本发明的结合分子可与该种已知生物制品结合施用。
[0536]例如，FDA批准了下列用于治疗乳腺癌的生物制品：
(曲妥珠单抗，Genentech Inc.，South San Francisco，CA；对HER2-阳性乳腺癌具有抗肿瘤活性的人源化单克隆抗体)；
(氟维司群，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP，Wilmington，DE；用于治疗乳腺癌的雌激素受体拮抗剂)；
(阿纳托唑，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP；能阻断制造雌激素所需的芳香化酶的非甾体芳香化酶抑制剂)；
(依西美坦，Pfizer Inc.，New York，NY；用于治疗乳腺癌的不可逆，甾体类芳香化酶灭活剂)；
(来曲唑，Novartis Pharmaceuticals，East Hanover，NJ；FDA批准的治疗乳腺癌的非甾体芳香化酶抑制剂)；以及
(它莫西芬，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP；FDA批准的治疗乳腺癌的非类固醇抗雌激素)。本发明的结合分子可联用的其它生物制品包括：AvastinTM(贝伐单抗，Genentech Inc.；FDA批准的首个抑制血管生成的疗法)；以及
(替伊莫单抗，Biogen Idec，Cambridge，MA；目前被批准用于治疗B-细胞淋巴瘤的放射性标记单克隆抗体)。
[0537]此外，FDA批准了用于治疗结肠直肠癌的下列生物制品：AvastinTM；ErbituxTM(西妥昔单抗，ImClone Systems Inc.，NewYork，NY，and Bristol-Myers Squibb，New York，NY；针对表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体)；
(伊马替尼；蛋白激酶抑制剂)；以及
(盐酸左旋咪唑，Janssen PharmaceuticaProducts，LP，Titusville，NJ；FDA于1990年批准的在患有Dukes C阶段结肠癌的患者手术切除后与5-氟脲嘧啶合用进行辅助治疗的免疫调节剂)。
[0538]在目前已被批准的用于治疗非Hodgkin淋巴瘤的疗法中使用的生物制品包括：
(托西莫单抗和碘I-131托西莫单抗，GlaxoSmithKline，Research Triangle Park，NC；涉及连接了放射性标记(碘I-131)的小鼠单克隆抗体(托西莫单抗)的多步骤治；
A(干扰素α-2b，Schering Corporation，Kenilworth，NJ；一类批准结合含蒽环的联合化疗(如环磷酰胺，阿霉素，长春新碱，强的松[CHOP])治疗滤泡性非Hodgkin淋巴瘤的干扰素；
(利妥昔单抗，Genentech Inc.，South San Francisco，CA，和Biogen Idec，Cambridge，MA；批准治疗非Hodgkin淋巴瘤的单克隆抗体；(denileukin diftitox，Ligand Pharmaceuticals Inc.，San Diego，CA；白喉毒素片段遗传融合至白细胞介素-2所得的融合蛋白)；以及
(伊莫单抗，Biogen Idec；被FDA批准用于治疗B-细胞非Hodgkin淋巴瘤的放射性标记单克隆抗体)。
[0539]对于白血病，可与本发明的结合分子联用的示范性生物制品包括
(阿来组单抗，BerlexLaboratories，Richmond，CA；一类用于治疗慢性淋巴细胞性白血病的单克隆抗体)。此外，Genasense(奥利默森，Genta Corporation，Berkley Heights，NJ；一种开发中的用于治疗白血病(例如，单用或与如氟达拉滨和环磷酰胺等一种或多种化疗药物联用)的BCL-2反义疗法)可与所主张的结合分子一起施用。
[0540]对于治疗肺癌，示范性的生物制品包括TarcevaTM(盐酸厄洛替尼，OSI Pharmaceuticals Inc.，Melville，NY；设计靶向人上皮生长因子受体1(HER1)途径的小分子)。
[0541]对于治疗多发性骨髓瘤，示范性生物制品包括
Velcade(硼替佐米，Millennium Pharmaceuticals，Cambridge MA；一种蛋白酶体抑制剂)。其它的生物制品包括
(沙立度胺，Clegene Corporation，Warren，NJ；一种免疫调节剂，并表现为具有多种作用，包括抑制骨髓瘤细胞生长和存活以及抗血管生成的能力)。
[0542]其它示范性生物制品包括由ImClone Systems，Inc.，New York，NY开发的MOAB EMC-C225。
[0543]如前文所述，本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段，或其重组产物可通过药学有效量施用进行哺乳动物高度增殖紊乱的体内治疗。就此而言，可以理解所披露的抗体可进行制剂以便于施用并促进该活性药剂的稳定性。优选地，如本发明所述的药物组合物包含药学可接受的，无毒的，无菌载体，例如生理盐水，无毒缓冲液，防腐剂等。为达到本申请的目的，结合或未结合治疗剂的本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段，或其重组产物的药学有效量应当指一种足以实现对靶标的有效结合并取得成效(例如，改善疾病或紊乱的症状或是检测一种物质或细胞)的数量。对于肿瘤细胞，该结合分子优选能够与肿瘤或免疫活性细胞，或在非肿瘤细胞(例如，与该肿瘤细胞相关的血管细胞)上的选定免疫活性抗原相互作用，并使这些细胞的死亡率上升。当然，本发明的药物组合物可作为单独或多重剂量施用以提供该结合分子的药学有效剂量。
[0544]在当前披露的范围内，本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可通过上述治疗方法在足以产生治疗或预防效果的数量下施用于人或其它动物。本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可以常规剂型施用于人或其它动物，该剂型可参照已知技术将本发明抗体结合常规药学可接受载体或稀释液进行制备。本领域技术人员均可理解该药学可接受的载体或稀释液的形式和特征由其结合的活性成分的量，给药途径和其它公知变量所决定。本领域技术人员将进一步理解包含一种或多种如本发明所述的结合分子的混合剂可能会特别有效。
[0545]本发明的实施将采用(除非另行指出)细胞生物学，细胞培养，分子生物学，转基因生物学，微生物学，重组DNA，以及免疫学的常规技术，其均在本领域的技术范围之内。该类技术在文献中得到了充分的解释。例如，参见Molecular Cloning ALaboratory Manual，2nd Ed.，Sambrook等人，ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press：(1989)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook等人，ed.，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1992)，DNA Cloning，D.N.Glover ed.，Volumes I and II(1985)；Oligonucleotide Synthesis，M.J.Gait ed.，(1984)；Mullis等人U.S.Pat.No：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization，B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984)；Transcription And Translation，B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984)；Culture Of Animal Cells，R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，(1987)；Immobilized Cells And Enzymes，IRL Press，(1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology，Academic Press，Inc.，N.Y.；Gene TransferVectors For Mammalian Cells，J.H.Miller和M.P.Calos eds.，ColdSpring Harbor Laboratory(1987)；Methods In Enzymology，Vols.154和155(Wu等人eds.)；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology，Mayer和Walker，eds.，Academic Press，London(1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-TV，D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，(1986)；Manipulating the MouseEmbryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1986)；以及Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)。
[0546]抗体工程的一般原则可参见Antibody Engineering，2ndedition，C.A.K.Borrebaeck，Ed.，Oxford Univ.Press(1995)。蛋白工程的一般原则可参见Protein Engineering，A Practical Approach，Rickwood，D.，等人，Eds.，IRL Press at Oxford Univ.Press，Oxford，Eng.(1995)。抗体和抗体-半抗原结合的一般原则可参见Nisonoff，A.，Molecular Immunology，2nd ed.，Sinauer Associates，Sunderland，MA(1984)；以及Steward，M.W.，Antibodies，Their Structure and Function，Chapman and Hall，New York，NY(1984)。此外，本领域已知且未具体描述的免疫学标准方法可参照Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，New York；Stites等人.(eds)，Basic and Clinical-Immunology(8th ed.)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)以及Mishell和Shiigi(eds)，Selected Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)。
[0547]阐述了免疫学基本原理的标准参考著作包括CurrentProtocols in Immunology，John Wiley & Sons，New York；Klein，J.，Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination，John Wiley& Sons，New York(1982)；Kennett，R.，等人.，eds.，MonoclonalAntibodies，Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses，Plenum Press，New York(1980)；Campbell，A.，＂Monoclonal AntibodyTechnology＂in Burden，R.，等人.，eds.，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Vol.13，Elsevere，Amsterdam(1984)，Kuby Immunology 4th ed.Ed.Richard A.Goldsby，Thomas J.Kindt和Barbara A.Osborne，H.Freemand & Co.(2000)；Roitt，L，Brostoff，J.和Male D.，Immunology 6th ed.London：Mosby(2001)；Abbas A.，Abul，A.和Lichtman，A.，Cellular and MolecularImmunology Ed.5，Elsevier Health Sciences Division(2005)；Kontermann和Dubel，Antibody Engineering，Springer Verlan(2001)；Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Press(2001)；Lewin，Genes VIII，Prentice Hall(2003)；Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress(1988)；Dieffenbach和Dveksler，PCR Primer Cold SpringHarbor Press(2003)。
[0548]前文及此处引用的所有参考文献均在此全文引用作为参考。
具体实施方式
实施例1
IGF-1R特异性Fabs从噬菌体库的选择
[0549]重组人IGF-1R胞外区结构域被用于筛选包含了3.5 x1010个独特克隆的人原态噬菌粒Fab库(Hoet，R.M.，等人.NatBiotechnol.23(3)：344-8(2005)，(＂Hoet等人.＂)在此全文引用作为参考)。在两个不同的淘选臂之后使用生物素化的IGF1R-his和IGF1R-Fc蛋白。以链霉亲和素涂覆的磁珠捕获蛋白，然后与噬菌体孵育。对于IGF1R-Fc，生物素化的抗-Fc抗体被捕获在磁珠上，然后捕获Fc融合蛋白。参照Hoet等人的描述进行选择。3轮淘选之后，通过MluI消化去除479bp基因III残余部分，且该载体被重新连接以在TG1细胞中进行可溶性Fab表达。对生物素化IGF1R-His臂的920个克隆的ELISA分析获得了593个阳性克隆，其中包含33个独特的序列。对IGF1R-Fc臂的920个克隆的ELISA分析获得了163个阳性克隆，其中包含12个独特的序列。对所有克隆的序列分子确定在淘选策略的两个臂中分离得到12个克隆。纯化独特的克隆，并通过ELISA和以全长人IGF-1R稳定转染的3T3细胞再次确认与重组人IGF-1R胞外区结构域的结合(图1A和1B)。根据结合数据，从两条臂中分离得到的12个独特克隆中的6个被选定用于进一步分析。
实施例2
Fabs对肿瘤细胞上表达的IGF-1R的结合活性
[0550]Fabs结合野生型IGF-1R的能力可通过采用MCF-7肿瘤细胞系的流式细胞术进行测定。
[0551]在建立测定前24小时分裂MCF-7细胞(来自NCI的人乳腺癌细胞)以获得70％汇合的单层。MCF-7细胞系被常规维持在20代以内。以细胞解离缓冲液(Gibco目录编号13151-014)解离细胞，计数，洗涤并调整至1 x 106细胞/ml，然后向每个管(12 x 75mm管Falcon目录编号352054)中添加1ml的细胞。在1200rpm下离心5分钟聚集细胞并去除上清液，然后向细胞团添加100μl稀释抗体。测试的纯化Fabs的起始浓度可以是210或60μg/ml以1:3稀释于FACS缓冲液，直至0.001μg/ml。在整个测定中使用的FACS缓冲液为含1％ BSA(Sigma目录编号A-7906)和0.1％叠氮化钠(Sigma目录编号S2002)的PBS(无Ca++/Mg++)。鼠源抗体IR3(Ab-1；Calbiochem#GR1IL)被用作阳性对照。在冰上孵育样本1小时15分钟，然后以2ml FACS缓冲液洗涤，并在4℃ 1200rpm离心5分钟。吸出上清液，并向每个相应的管中添加含于FACS缓冲液的100μl二级检测抗体。在暗处和冰上孵育样本30分钟。按如上洗涤细胞，然后以每管/样本250μl FACS缓冲液重悬浮。
[0552]使用FITC-结合的亲和性纯化的F(ab′)2片段特异性山羊抗-人-IgG(Jackson ImmunoResearch Lab目录编号109-096-006；在5μg/ml下使用)检测结合Fabs的细胞，而阳性鼠对照抗体采用F(ab′)2FITC结合的山羊抗-小鼠IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch，目录编号115-096-062；在5μg/ml下使用)进行检测。对细胞染色，以采用碘化吡啶溶液进行活细胞测定(以PI进行死亡细胞排除；BDPharmingen目录编号51-66211E或556463；最终以1:500含于FACS缓冲液)。在FACSCalibur仪器(Becton Dickinson)上以每个样本10000生活事件运行样本。使用GraphPad Prism version 4.0软件(www.graphpad.com)(GraphPad Software，Inc.，11452 E1 CaminoReal，，#215，San Diego，CA 92130 USA)分析数据。
[0553]一旦样本被运行并测得几何平均数，可通过GraphpadPrism(Prism Graph)制图程序绘制抗体浓度(X轴)相对几何平均值(Y轴)的log10的图。然后将数据组转化(X值数据组＝抗体浓度)为X＝Log(X)，并通过S型剂量响应(Sigmoidal dose-response)非线性回归曲线拟合绘图。通过Prism Graph软件生成EC50值和R2值。
[0554]所有6个Fabs显示出对肿瘤细胞上表达的野生型IGF-1R的良好的结合活性(图2)。结合的EC50在9至42nM范围内(表3)。
实施例3
Fabs对配体结合IGF-1R的抑制
[0555]Fabs阻断IGF-1和IGF-2配体与IGF-1R结合的能力可通过放射性免疫测(RIA)定进行检测。
[0556]配体阻断测定(RIA)。重组人IGF-1(Cat #291-G1)，IGF-2(Cat #292-G2)，胰岛素(Cat # Custom02)人胰岛素受体(Cat#1544-1R)购自R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN。胰岛素(Arg-胰岛素，Cat#01-207)购自Upstate Cell Signaling Solutions(Lake Placid，NY(现为Millipore，Concord，MA(USA)的一部分)。125I-rhIGF-1(Cat # IM172)，125I-rhIGF-2(Cat# IM238)和125I-rhInsulin(Cat# IM166)购自Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)。AffiPure山羊抗-人IgG，Fcγ片段特异性抗体(Cat #109-005-098，Jackson Irnmuno Research，WestGrove，PA)被用于捕获IGF-1R-Fc。山羊抗-小鼠IgG HRP(Cat#1030-05，Southern Biotech Birmingham，AL)被用作检测抗体。
[0557]IR3(Ab-1，Cat.#GR11LSP5，Calbiochem，La Jolla，CA)和1H7(特异性针对IGF-1Rα-链sc-461的小鼠单克隆，IgG1 SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)分别被用作IGF-1和IGF-2阻断的阳性对照。人胰岛素受体α-亚基特异性抗克隆83-14，(Cat#AHR0221，Biosource International，Inc.，Camarillo，CA)和47-9(Cat#E55502M，Biodesign International，Saco，ME)被用作胰岛素-胰岛素受体结合实验中的阳性对照阻断。重组IGF-1R-Fc融合蛋白由Biogen Idec(Cambridge，MA)生产。
[0558]2B8(鼠α-CD20.IgG1)和2B8mkm.G2a(鼠α-CD20MAb，IgG2a，Biogen Idec，Lot#NB3304-87，San Diego，CA)被用作亚型匹配小鼠阴性对照抗体。Fabs的阴性对照为Christilyn Graff(Biogen Idec，Cambridge，MA)提供的R001-1B。在缓冲液中使用的PBS来自于BioWhittaker(Cat.# 17-513F，Walkersville，MD)。
[0559]重组人IGF-1R(组氨酸标记型)或IGF-1R-Fc被涂布在IMMULON2 HB(高结合)Removawell条带上(DynexTechnologies，Inc.，cat.#6302)并以pH 9.5的碳酸盐涂覆缓冲液稀释至浓度为250ng/微孔。在4℃孵育过夜后，以洗涤缓冲液(0.05％Tween 20/PBS)洗涤三次，然后以阻断缓冲液(3％BSA/PBS)在室温下阻断一小时。去除阻断缓冲液，继续洗涤微孔三次。以稀释缓冲液(1％ BSA/0.05％ Tween 20/PBS)将抗体，Fab或配体制备物稀释至目标浓度，并以每微孔50μl双份涂布。室温下45分钟后，向每个微孔添加含于50μl稀释缓冲液的100,000cpm[125I]rhIGF-1或[125I]rhIGF-2。再在室温下孵育1小时。再次洗涤微孔三次，并在最后一次洗涤后不留下液体。使用Isodata伽马计数器对空气干燥的微孔计数。
[0560]替代性地，可通过改良的捕获测定评估Fabs，其中采用固定化至平板的抗-人IgG捕获IGF-1R-Fc。可通过在碳酸盐涂覆缓冲液中将山羊抗-人片IgG，Fcγ段特异性抗体(200ng/微孔)孵育过夜进行固定化。洗涤微孔，阻断并向每个微孔添加250ngIGF-1R-Fc。
[0561]表3中显示了6种不同Fabs阻断IGF-1或IGF-2或两种配体的结合的能力。具有不同阻断活性的上面6个Fabs被选择进行进一步分析。
实施例4
Fabs抑制IGF-1和IGF-2介导的IGF-1R磷酸化
[0562]细胞系：表达人乳腺癌细胞系MCF-7(NCI)的IGF1R被维持于37℃和5％CO2下含10％ FBS，1X非必需氨基酸，2mML-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠以及1000U/ml青霉素和链霉素的MEMeagle(ATCC)中。细胞被每周两次传代培养以进行维持和测定，所用的细胞最大为12代。
[0563]将含于2ml生长培养基的MCF-7细胞以2 X 105至4.0X 105细胞/微孔涂布于涂覆了聚-D-赖氨酸的12孔板(BD Biosciences，#35-6470)上并在37℃，5％ CO2下培养。48小时后，去除培养基并使细胞在37℃，5％ CO2下血清饥饿过夜。去除无血清培养基，添加含于350ul新鲜无血清培养基的指定浓度的对照或测试抗体，并在室温下或37℃孵育1小时。Fabs在200nM，20nM和2nM的浓度系测试，而mAbs在67，6.7和0.67nM的浓度下测试。所用的商业抗-IGF-1R对照抗体为αIR3(EMD biosciences，致癌基因研究产品，#D27249)。向微孔中添加含于35ul无血清培养基的13nM人重组IGF-1或27nM的IGF-2(R & D Systems，#291-G1，#292-G2)并在37℃孵育15分钟。配体在室温下孵育并用于37℃抗体实验。在具有1mM PMSF的1X细胞溶解缓冲液(Cell Signal technologies，#9803)中于室温下溶解细胞1小时。
[0564]向预涂覆了IGF-1Rβ抗体(克隆1-2，BiosourceInternational，#AHR0361)的ELISA平板添加细胞溶解产物并孵育2小时。随后洗涤平板，并以生物素标记的抗-磷酸酪氨酸抗体4G10(Catalog#16-103，Upstate Cell Signaling Solutions(Lake Placid，NY(现为Millipore，Concord，MA(USA)的一部分)和链霉素-HRP(BDPharmingen，#554066)检测结合磷酸化受体的平板。通过添加TMB底物(Kierkegaard & Perry，#50-76-00)开始测定并通过添加4NH2SO4-4(LabChem，Cat#LC25830-1)终止显色。使用Molecular Devices平板读取器在450nm下读取光密度，并计算每个抗体-配体样本相对配体对照的抑制百分比。
[0565]表3总结了Fabs对MCF-7细胞中IGF-1和IGF-2介导的IGF-1R磷酸化的抑制。通过ELISA共筛选了16个IGF-1R Fabs对受体磷酸化的抑制。九个抗体在200nM浓度下对IGF-1，IGF-2或两者显示了阳性响应“+”或更好的响应。这些抗体被选择进行数量放大，并进行剂量依赖型抑制响应的测试。基于抑制配体结合和受体磷酸化的能力，四种Fabs被选为全长抗体阳转的主要候选物(参见，实施例6)。
[0566]图3(A和B)显示了顶部6个IGF-1R Fabs的放大物质对IGF-1R磷酸化的抑制。
实施例5
抗体相对INSR对IGF-1R的结合特异性和亲和性
[0567]I部分：通过酶联免疫吸附分析(ELISA)对抗体相对可溶性INSR与可溶性IGF-1R的结合的分析。
[0568]通过ELISA测定检测Fab片段抗体相对于胰岛素受体对可溶性IGF-1R的特异性结合。以10ug/ml的rh-IGF-1R(R & DSystems，#305-GR)或rh-INSR(R&D Systems，#1544-IR)涂覆平板过夜并以5％牛奶阻断。针对Fabs添加浓度在2μM-0.2nM范围内的1:10稀释抗体或针对鼠Mabs添加浓度在667-0.067nM范围内的1:10稀释抗体并在室温下孵育1小时。以针对Fabs的HRPO标记的山羊α-人kappa(Southern Biotechnology Associates，#2060-05)和针对鼠Mabs的山羊α-小鼠IgG Fcγ(Jackson Immunoresearch，#115-035-164)检测结合抗体。通过添加4N H2SO4终止颜色形成，使用Molecular Devices平板读取器在450nm下读取光密度并生成结合曲线。
[0569]IGF-1R在任何浓度下均未对可溶性胰岛素受体显示出特异性结合(表3)，然而与预期相同，它们很好地结合IGF-1R-Fc。
[0570]图4(A和B)显示了由Fabs M14-B01，M14-C03和M12-G04得到的代表性的结合曲线。对M13-C06，M14-G11和M12-E01观察到了类似的结合模式(数据未显示)。
[0571]II部分：通过表面等离子共振(SPR)和时间分辨荧光共振能量转移(tr-FRET)分析抗体相对于可溶性INSR与可溶性IGF-1R的结合
[0572]通过通过表面等离子共振(Biacore)和时间分辨荧光共振能量转移(tr-FRET)对M13-C06，M14-C03和M14-G11抗体与可溶性人IGF-1R和胰岛素受体胞外区结构域的结合亲和性进行比较；进一步证实M13-C06抗体未显示与胰岛素受体，鼠IGF-1R，或平头型人IGF-1R(即，hIGF-1R氨基酸残基1-462仅包含第一和第二亮氨酸富集重复区以及半胱氨酸富集重复区，但缺失IGF-1R在结构域中的三个纤维连接蛋白类型)具有明显的交叉反应性。
[0573]表面等离子体共振(SPR)分析
[0574]SPR分析通过Biacore3000进行。该仪器被设置为25℃，并使用购自Biacore(Biacore，Cat.No.BR-1001-88)的运行缓冲液HBS-EP pH 7.2进行测定。参照Biacore提供的方法使用标准的NHS/EDC-胺反应化学品将全人源抗体M13-C06，M14-C03和M14-G11以～10,000RU固定化至Biacore CM5研究级SensorChip表面。该抗体在10mM醋酸盐pH 4.0缓冲液中被稀释至40μg/mL以进行固定化。为了考察人IGF-1R(1-902)-His10(hIGF-1R-His10(R&Dsystems))和人INSR(28-956)-His10(INSR(R&D systems))的全长胞外区结构域对各个人抗体的结合和解离的相对动力学，向sensorchip表面注射上升浓度的hIGF-1R-His10或INSR。hIGF-1R-His10浓度介于1.0nM至250nM，而INSR浓度介于1.0nM至2μM。所有的抗体表面均以pH 2.0的100mM甘氨酸进行可靠地再生。重复再生不会导致任意抗体表面的活性损失。流速为20μl/min。(“His10”指在构建体C-末端的10-残基组氨酸标记)。
[0575]时间分辨荧光共振能量转移(tr-FRET)测定
[0576]参照染料生产商的方法使用标准NHS化学品将hIGF-1R-His10和M13-C06分别共价结合至Cy5和铕螯合物。将从6.25μg(50μl 125μg/ml的储备溶液)开始的系列稀释的多种未标记可溶性胞外区结构域受体竞争剂(1)hIGF-1R-His10，(2)人IGF-1R(1-903)-FlagHis10(hIGF-1R-FlagHis10，Biogen Idec)，(3)人IGF-1R(I-903)-Fc(hIGF-1R-Fc，Biogen Idec)，(4)人IGF-1R(I-462)-Fc(hIGF-1R(1-462)-Fc，Biogen Idec)，(5)鼠IGF-1R(1-903)-Fc(mIGF-1R-Fc，Biogen Idec)或(6)INSR，起始6.25μg(50μl 125μg/ml的储备溶液)与0.1μg hIGF1R-Hislo-Cy5(25μl 4μg/ml的储备溶液)和0.075μg Eu-C06(25μl 3μg/ml的储备溶液)混合于96孔微量滴定板(黑色，来自于Costar)。通过检测各个染料相对蛋白浓度的吸收可以看到hIGF-1R-HiS10-Cy5的结合水平为6.8:1(Cy5:IGF-1R-His10)，而Eu-C06的结合水平为10.3:1(Eu:C06)。每个样本的总体积为100μl。将平板在平板振荡器上室温孵育1小时。采用激发波长为340nm，发射波长为665nm的LANCE方案以Wallac Victor2荧光平板读取器(Perkin Elmer)进行荧光检测。所有的构建体至少采用两个重复样本。
[0577]所有来自Biogen Idec的可溶性IGF-1R受体胞外区结构域构建体被通过所述的方法亚克隆进入Biogen Idec PV-90载体以进行CHO表达(Brezinsky等人，2003)。参照前述采用单独蛋白ASEPHAROSE FFTM(GE Heathcare)步骤亲和纯化每个包含C-末端IgG-Fc标记的受体。参照前述(Demarest等人.，2006)采用Ni2+-琼脂糖(Qiagen)纯化hIGF-1R-FlagHis10。
结果：
[0578]采用表面等离子共振(SPR)评估全人源抗-IGF-1R抗体，M13-C06，M14-C03和M14-G11对可溶性IGF-1R和INSR胞外区结构域构建体的竞争性结合活性。采用相同的方案将hIGF-1R-His10和INSR注射至固定化抗体表面。经证实hIGF-1R-His10即使在最低浓度0.5nM下仍可结合所有三种抗-IGF-1R抗体(数据未显示，浓度范围从1至250nM，且该受体注射期400-2200秒，然后为缓冲液解离期，并以甘氨酸进行后续再生，pH 2.0。)hIGF-1R-His10对M13-C06相反地，经证实INSR即使在浓度高达2μM(高于对IGF-1R结合时1000倍以上)受体时对M13-C06表面仍仅有极小的活性(数据未显示：浓度范围从1.0nM至22μM，受体注射期500-1000秒，然后为缓冲液解离期)。同样证实M14-C03和M14-G11表面对INSR的结合活性很小。
[0579]然后，采用基于竞争的tr-FRET测定检测各种重组IGF-1R和INSR构建体对M13-C06的亲和性。测定了所有重组受体构建体(如下文描述)的最佳拟合结合曲线(数据未显示)。所有的数据均拟合至单位点结合模型，并由此测得相应的IC50值。三种全长人IGF-1R胞外区结构域构建体(hIGF-1R-Fc，hIGF-1R-His10和hIGF-1R-FlagHis10)均以浓度依赖方式竞争，其IC50值分别为2.9，2.0，5.2μg/ml。平头人IGF-1R(1-462)-Fc构建体，全长小鼠IGF-1R-Fc构建体，以及全长人INSR-His10构建体在重组全场人IGF-1R构建体的IC50以上100倍的浓度下不抑制Cy5-标记的hIGF-1R-His10，提示前者构建体与后者全长人IGF-1R而言对M13-C06不显示明显的结合活性。
[0580]III部分：M13-C06抗体相对于鼠IGF-1R对可溶性人IGF-1R的相对结合亲和性
[0581]此处比较了M13-C06对于鼠和人IGF-1R的相对结合亲和性。使用表面等离子共振(SPR)测定M13-C06对鼠IGF-1R Fc和人IGF-1R Fc的亲和性。将Biacore 3000设置为25℃，并以HBS-EP(Biacore，Cat.No.BR-1001-88)为运行缓冲液进行实验。通过注射将HBS-EP缓冲液中的500nM抗-人IgG-Fc抗体(2C11来自于Biogenesis，Cat.No.5218-9850)在Biacore CM5芯片(Cat.No.BR-1000-14)表面上固定化至饱和。mIGF-1R-Fc或hIGF-1R-Fc通过以3μL/min注射40μL 20nM受体被捕获至芯片表面。在受体捕获后，以3μL/min注射40μL M13-C06 Fab。在～27分钟检测Fab的解离。将Fab由25至0.4nM系列稀释以获得浓度依赖型动力学结合曲线。通过在60μL/min下的3 x 10μL注射pH 2.0的100mM甘氨酸在各注射系列间进行表面芯片再生。通过(1)没有抗-IgG抗体2C11的CM5芯片表面获得的数据以及(2)初次注射受体后再注射HBS-EP缓冲液所得的数据对各条曲线进行双重参考。M13-C06 Fab针对各个受体的浓度系列被拟合至生产商的BiaEvaluation软件中所提供的1:1结合模型。为了获得M13-C06对mIGF-1R-Fc结合的kd，以25nM的M13-C06 Fab和20nM的mIGF-IR-Fc重复实验，其中原始方法中唯一的变化是将解离期延伸至三小时。
结果：
[0582]将M13-C06 Fab应用于含hIGF-IR-Fc或mIGF-1R-Fc的Biacore表面以测定该抗体对两类受体的相对亲和性。C-末端IgG1-Fc的存在导致IGF-1R-Fc受体构建体的额外多聚化(数据未显示)；因此，该结合模型拟合提供了M13-C06对各个受体的相对或表观亲和性的测量。M13-C06 Fab对人和鼠IGF-1R Fc的亲和性分别为0.978nM和89.1nM。在比较显示了结合和解离曲线，动力学速率常数和平衡解离常数的图27A和B时，对鼠IGF-1R的结合的100倍下降显而易见。图27A显示了M13-C06 Fab对人IGF-1R的浓度依赖型结合特征(ka(1/Ms)＝8.52e5M-1s-1；kd(1/s)＝8.33e-4s-1；且KD＝9.78e-10M)。图27B显示了M13-C06对mIGF-1R-Fc的慢连接和解离结合特征(ka(1/Ms)＝471M-1s-1；kd(1/s)＝4.20e-5s-1；KD＝8.91e-8M)。由于M13-C06 Fab从mIGF-1R-Fc极慢的解离，无法通过初始数据组测定动力学解离速率常数kd。采用3小时解离期进行第二次实验以获得解离速率常数kd(4.20e-5s-1)，其被用于从原始数据组获得平衡解离常数KD(如上所述)。C-末端IgG1-Fc的存在导致IGF-1R-Fc受体构建体的额外多聚化(数据未显示)；因此，该结合模型拟合提供了M13-C06对各个受体的相对或表观亲和性的测量。
[0583]IV部分：M13-C06全长抗体特异性结合哺乳动物细胞中表达的IGF-1R而不结合INSR。
[0584]重组IGF-1R和胰岛素受体(IR)在哺乳动物细胞(3T3或CHO)中独立表达。以1％ Triton X-100溶解细胞，并以偶合至阴性对照抗体(IDEC-151)，M13.C06.G4.P.agly抗体(C06)，M14-G11.G4.P.agly抗体(G11)或INSR抗体(α-IR)的蛋白-A/G珠免疫沉淀受体。通过酸处理从珠中释放抗体/抗原复合物，加载至Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶并印至硝化纤维膜。使用小鼠抗-人IR(图26A)或小鼠抗-人IGF-1R(图26B)和山羊α-小鼠IgG进行检测。结果：M13.C06.G4.P.agly抗体结合哺乳动物细胞中表达的IGF-1R但不结合INSR。
实施例6
全长抗-IGF-1R IgGs构建体
[0585]四种Fabs被转化为IgG4.P.agly型并在CHO细胞中表达。通过重组人IGF-1R胞外区结构域-Fc融合蛋白从人抗体噬菌体库(Dyax Corp)生物淘选编码四种不同的抗-IGF-1R Fabs-M13-C06(图5(A)-(D))，M14-C03(图5(E)-(H))，M14-G11(图5(I)-(L))，和M14-B01(图5(M)-(P))的DNA序列。四种抗-IGF-1R Fabs均包含VH3-23人重链胚系框架且为kappa轻链。Fab基因序列被用于通过pV90AS表达载体系统构建编码全长抗-IGF-R1抗体的表达质粒，从而在哺乳动物细胞中生产抗体。pV90AS是改良的pV90表达载体，其经设计可通过初级转录体的替代剪接从单个启动子生成转录体(参考文献：美国专利申请WO2005/089285)。天然CMV剪接供体可被剪接为部分受损剪接受体以生成抗体轻链-编码转录物，或剪接为CMV剪接受体以生成抗体重链-编码转录物。该部分受损剪接受体经工程改造以得到类似数量的重和轻链转录物。各个抗-IGF-1R Fab(M13-C06；M14-C03；M14-G11和M14-B01)的轻链可变(VL)和恒定(CL)区(SEQ ID NOs：153和154，图5(Y)-(Z))通过PCR扩增。(表7)。5′轻链PCR引物IGF1R-FK包括Sfi I限制性核酸内切位点，随后为根据Nakamura T，等人，Int JImmunopharmacol22：131-41(2000)(在此全文引用作为参考)所述的方法与对应VL区氨基-末端的序列同框的编码免疫球蛋白轻链信号肽MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：157)的序列。所有四个成熟的IGF1R轻链序列具有一致的氨基末端。该3′轻链PCR引物IGF1R-RK包括对应CL区羰基末端和Asc I位点的序列。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化，通过QIAquickGelExtration试剂盒法(QIAGEN CA)萃取，以限制性核酸内切酶SfiI和Asc I消化，并与Sfi I/Asc I消化的pHLP025载体(Holly Prentice)连接。该pHLP025载体除了天然CMV剪接供体位点序列，部分损伤的剪接受体位点序列以及poly A信号序列外包含用于接受作为Sfi I/Asc I消化的PCR片段的抗体轻链(信号肽-VL-CL)的Sfi I/AscI限制性核酸内切酶位点(参考文献：美国专利申请WO2005/089285)。
[0586]各抗-IGF-1R Fab(M13-C06；M14-C03；M14-G11和M14-B01)的重链可变(VH)区通过PCR扩增。5′重链VH PCR引物IGF1R-FH包含Nco I限制性核酸内切酶位点，其后带有与如上所述的对应VH区氨基末端的序列同框的编码合成重链信号肽MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO：122))的序列。该3′重链VH PCR引物IGF1R-RH包括对应VH区羰基末端和Sfi I位点的序列。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化，通过QIAquick GelExtration试剂盒法(QIAGEN CA)萃取，以限制性核酸内切酶Nco I和Sfi I消化，并与Nco I/Sfi I消化的pHLP029载体(Holly Prentice)连接。该pHLP029载体除了上游poly A信号序列，天然CMV剪接受体位点序列以及下游poly A信号序列外包含用于接受作为Nco I/Sfi II消化的PCR片段的抗体信号肽-VH序列的Nco I/Sfi I位点(参考文献：美国专利申请WO2005/089285)。
[0587]采用如上所述的5′轻链IGF1R-FK和3′重链VHIGF1R-RH PCR引物通过在两个载体中的公共重叠序列经PCR扩增组装将pHLP025中编码(Sfi I位点-轻链信号肽-抗-IGF-1R VL和CL)和pHLP029中编码(重链信号肽-抗-IGF-1R VH-Sfi I位点)的基因序列进入单个DNA片段。以琼脂糖凝胶电泳纯化所得的PCR产物，并采用QIAquick GelExtration试剂盒法(QIAGEN，CA)进行萃取，并与Dra III消化的pXWU007载体连接。简单而言，首先通过将在IgG4铰链区包含S228P突变和在CH2区包含T299A突变(EU编号系统(Kabat，E，Wu，TT，Perry，HM，Gottesman，KS，Foeller，C：Sequencesof Proteins of Immunological Interest.Bethesda，US Department ofHealth and Human Services，NIH，1991)(SEQ ID NOs：155和156，图5(AA)-(BB))的Age I/BamHI人IgG4恒定区片段从质粒pEAG1808(由Ellen Garber提供)亚克隆进入Age I/BamHI消化的pHLP028载体构建pXWU007。pHLP028为经修饰包含用于接受如上所述的单独SfiI-消化PCR产物的Dra III位点的pV90 IgG4载体(参考文献：美国专利申请WO2005/08928)。
[0588]所得的质粒可生成双效前体转录物，后者可在替代剪接时形成化学计量相当的翻译活性抗体重和轻链mRNAs。表8显示了用于生产全长糖苷化(aglycosylated)人抗-IGF-1R IgG4.P抗体的中间体和表达载体。正确的序列通过DNA序列分析进行确认。来自质粒pXWU020，pXWU022，pXWU024和pXWU025的全长抗体在哺乳动物细胞中的表达可导致稳定，糖苷化人IgG4.P抗体的生产。
表7 用于人抗体结构域PCR扩增的寡聚核苷酸
正向5′轻链PCR引物包含Sfi I限制性核酸内切酶位点(下划线)和编码轻链信号肽的序列；
反向3′轻链PCR引物包含Asc I位点(下划线)。
正向5′重链可变PCR引物包含Nco I限制性核酸内切酶位点(下划线)和编码重链信号肽的序列。
反向3′重链可变PCR引物包含Sfi I位点(下划线)。
| LC引物 | |
| IGF1R-FK | 5′-CGAACAGGCCCAGCTGGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTTCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAG-3′(SEQ ID NO：123) |
| IGF1R-RK | 5′-TCGCACGGCGCGCCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3′(SEQ ID No：124) |
| VH引物 | |
| IGF1R-FH | 5′-CGGCCACCATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGTTGCTACGCGTGTCCTGTCCGAAGTTCAATTGTTAGAG-3′(SEQ ID NO：125) |
| IGF1R-RH | 5′-GGGATCGGCCAGCTGGGCCCCTTCGTTGAGGCGCTTGAGACGGTGAC-3′(SEQ ID NO：126) |
表8 编码抗-IGF-1R抗体的中间体和表达质粒
| 载体 | 组成 | 抗体链 |
| pXWU008 | pHLP025+C03L | C03 VL-CL |
| pXWU010 | pHLP025+C06L | C06 VL-CL |
| pXWU012 | pHLP025+G11L | G11 VL-CL |
| pXWU013 | pHLP025+B01L | B01 VL-CL |
| pXWU014 | pHLP029+C03 VH | C03 VH |
| pXWU016 | pHLP029+C06 VH | C06 VH |
| pXWU018 | pHLP029+G11 VH | G11 VH |
| pXWU019 | pHLP029+B01 VH | B01 VH |
| pXWU020 | pXWU007+C03L-VH | C03 VL-CL+C03 VH-agly γ4.P |
| pXWU022 | pXWU007+C06L-VH | C06 VL-CL+C06 VH-agly γ4.P |
| pXWU024 | pXWU007+G11L-VH | G11 VL-CL+G11 VH-agly γ4.P |
| pXWU025 | pXWU007+B01L-VH | B01 VL-CL+B01 VH-agly γ4.P |
实施例7
构建全长抗-IGF-1R IgGs以提高在哺乳动物细胞中的表达
[0589]为了提高抗体表达产率和产物质量，对来自抗-IGF-1RFabs M13-C06，M14-C03，M14-G11和M14-B01的原始VH基因序列进行了修饰。首先，通过公共序列识别程序(www.tigr.org/tdb/GeneSplicer/gene_spl.html(The Institute forGenomic Research，9712 Medical Center Drive，Rockville，MD 20850)，www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)(Martin G.Reese和Frank H.Eeckman，Lawrence Berkeley National Laboratory，GenomeInformatics Group，1 Cyclotron Road，Berkeley，CA，94720；还可参见，Reese MG，Eeckman，FH，Kulp，D，Haussler，D，1997.＂ImprovedSplice Site Detection in Genie＂.J Comp Biol 4(3)，311-23.)。在抗-IGF-1R VH序列中分析包含公认剪接位点的序列。其次，以来自曾在CHO细胞中成功表达的抗体中相同Kabat位置的密码子替换抗-IGF-1R Fabs重链可变区中的密码子，且不引发抗原始抗-IGF-1R VH多肽序列中的任何改变。第二步主要去除了公认剪接位点，但在同类密码子替换后进行附加剪接位点分析以减少公认剪接位点存在的可能性。
[0590]编码与抗-IGF-1R Fabs-M13-C06(SEQ ID NO：18，图5(Q))，M14-C03(SEQ ID NO：30，图5(S))，M14-G11(SEQ ID NO：36，图5(U))以及M14-B01(SEQ ID NO：24，图5(W))的序列优化VH序列同框的合成重链前导的DNA片段可作为化学合成双链DNA序列从供应商(Blue Heron Biotechnology，Inc.Bothell WA)处获得。该合成片段包含了在5′和3′的Nco I和Sfi I限制性核酸内切酶位点。将前导和抗-IGF1R序列优化VH区片段克隆进入如上文实施例6所述的Nco I/Sfi I消化的pHLP029载体中。参照上文实施例6所述与pHLP025内适当对应的轻链重组并将单独片段亚克隆进入pXWU007。表9显示了用于生产序列优化全长糖苷化人抗-IGF-1RIgG4.P抗体的表达构建体。正确的序列通过DNA序列分析进行确认。来自质粒系列pXWU029-pXWU032的全长抗体在哺乳动物细胞中的表达可导致稳定，糖苷化人IgG4.P抗体的生产。
表9 编码抗-IGF-1R抗体的序列优化表达质粒。优化重链序列前带有“m”。
| 载体 | 组成 | 抗体链 |
| pXWU029 | pXWU007+C03L-mVH | C03 VL-CL+mC03 VH-agly γ4.P |
| pXWU030 | pXWU007+C06L-mVH | C06 VL-CL+mC06 VH-agly γ4.P |
| pXWU031 | pXWU007+G11L-mVH | G11 VL-CL+mG11 VH-agly γ4.P |
| pXWU032 | pXWU007+B01L-mVH | B01 VL-CL+mB01 VH-agly γ4.P |
实施例8
IGF-1R抗体的瞬时表达和表征
[0591]使用质粒DNAs转化CHO DG44以瞬时生产抗体蛋白。在0.4mL的1 X PBS中合并的20μg质粒DNA和4 x 106细胞。将混合物添加至0.4cm玻璃管(BioRad)并置于冰上15分钟。以GenePulser电穿孔仪(BioRad)在600uF和350伏特下对细胞进行电穿孔。将细胞放入含有CHO-SSFM II培养基以及100uM次黄嘌呤和16uM胸苷的T-25烧瓶中，并在37℃孵育4天。收集上清液，通过Western印迹生化表征，并以ELISA测试抗原结合。
[0592]替代性地，同样将选定的Fabs转化为全长人IgG4.P型，并以如下所述的方法通过不同的载体系统表达。将编码五个不同的抗-IGF1R Fab抗体M12-E01，M12-G04，M13-C06，M14-C03，和M14-G11的DNA序列转移进入载体，以表达全长人IgG4.P。所有五个抗体使用VH3-23人重链胚系片段。通过限制性酶MfeI和BstEII的消化从可溶性Fab表达载体去除可变重链。所得的片段通过QIAquick凝胶萃取试剂盒(Qiagen，CA)以琼脂糖凝胶电泳纯化，并结合进入Mfel/BstEII消化的pRR253载体(Rachel Rennard)。所得的质粒包含重链信号肽(MGWSCIILFLV AT ATGAHS，SEQ ID NO：127)，以及随后的人IgG4.P抗-IGFIR VH和恒定区。
[0593]五个抗体中有四个(M12-G04，M13-C06，M14-C03和M14-G11)包含轻链。可变轻链通过PCR扩增，所用引物可向可变区导入EcoRV位点5′和BsgI3′。所得的PCR片段通过QIAquick凝胶萃取试剂盒(Qiagen，CA)以琼脂糖凝胶电泳纯化，并结合进入TOPO2.1 TA载体(Invitrogen，CA)。以限制性酶EcoRV和BsgI消化从TOPO载体去除可变kappa轻链并纯化。将片段连接进入EcoRV/BsgI消化的pRR237载体，该载体包含免疫球蛋白轻链信号肽(MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC，SEQ ID NO：128)和恒定kappa区。以BamHI和NotI消化所得的载体，纯化完整的表达盒(信号序列，可变和恒定kappa区)，并连接进入BamHI/NotI消化的pRR223。
[0594]M12-E01抗体包含lambda轻链。可变轻链通过PCR扩增，所用引物可导入可变区的AgeI位点5′。所得的PCR片段通过QIAquick凝胶萃取试剂盒(Qiagen，CA)以琼脂糖凝胶电泳纯化，并结合进入TOPO2.1 TA载体(Invitrogen，CA)。以限制性酶AgeI和AvrII消化从TOPO载体去除可变lambda轻链并纯化。将片段连接进入AgeI/AvrII消化的pRR237载体(Xin Wang)，该载体包含免疫球蛋白轻链信号肽(METDTLLLWVLLLWVPGSTG，SEQ ID NO：129)和恒定lambda区。以NotI消化所得的载体，纯化完整的表达盒(信号序列，可变和恒定lambda区)，并连接进入NotI消化的pRR223。
[0595]使用质粒DNA转染293E细胞以瞬时表达抗体蛋白。通过Qiagen的Effectene转染法(Qiagen，CA)将1.2μg各种(重和轻)质粒DNA转染进入2 x 106细胞。将细胞在37℃孵育3天。收集上清液并同时通过Western印迹和ELISA法确认全长抗体。通过ELISA确认全.IgG4.P结合IGF-1R的能力。
实施例9
生产抗-IGF-1R抗体的CHO细胞系的开发
[0596]本实施例给出了抗-IGF-1R抗体(包含作为全长铰链连接的修饰agly gamma 4，kappa(在此成为＂agly.IgG4.P＂或＂G4.P.agly″)抗体的Fab M13-C06结合区)表达的详细描述。此处所述的其它Fabs(即，表3列举的Fabs)以类似的方式表达。M13-C06的可变和恒定来自人源序列。完整轻链和重链可变区来自通过DYAX噬菌体展示技术针对人IGF-1R生成的Fab。将可变和轻链恒定区亚克隆进入替代剪接表达载体。替代剪接构型通过使用具有两个剪接受体的单个剪接供体连接轻和重链，其中各个剪接受体生成编码两条链其中一条的转录物。将编码免疫球蛋白基因的表达载体DNA电穿孔进入非胰岛素依赖型中国仓鼠卵巢细胞(CHODG44i)。根据生产目的选自CHO转染瘤(细胞系40B5)。
[0597]“空”表达载体pXWU007包含用于在哺乳动物细胞中进行基因表达的人gamma 4恒定区(重链)以及单独启动器-增强子和多聚腺苷酸化区。在表达和翻译后，该重链多肽包含两个氨基酸替换(S228P和T299A)，分别用于减少“半抗体”形成和消除N-连接的糖基化。
[0598]将来自相应M13-C06轻链基因的可变(VL)和恒定(CL)区和的M13-C06重链可变(VH)区的互补DNA克隆进入表达载体pXWU007。该pXWU007载体包含用于在紧邻人重链恒定区上游插入完整轻链和可变中cDNAs的克隆位点。除了Ig基因，该表达载体包含可用于在哺乳动物细胞中选择的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。
[0599]然后将所得的表达载体转染进入CHO细胞以形成分泌抗-IGF-1R的CHO细胞系(40B5)。
[0600]将PXWU022电穿孔进入CHO细胞。可使用免疫球蛋白轻链特异性PCR引物对Fab轻链cDNA进行PCR扩增。该5′特异性低聚序列包含来自Biogen Idec抗-CD23分子轻链的原态信号肽。该5′和3′低聚体分别包含Sfi I和Asc I限制性核酸内切酶识别序列以亚克隆进入中间载体(pHLP025)。VH cDNA采用包含合成重链信号肽的5′低聚物进行PCR扩增。该5′和3′低聚体分别包含NcoI和Sfi I限制性核酸内切酶识别序列以亚克隆进入中间载体(pHLP029)。
[0601]以5′和VH 3′低聚物以及pHLP025和pHLP029作为模板进行重叠PCR，从而将轻链和VH区合并为一个cDNA片段。将所得产物亚克隆进入pXWU007的Dra III位点，从而建立最终的替代剪接表达载体pXWU022。该替代剪接构型通过初级转录物的替代剪接从单个启动子生成两个转录物。天然CMV剪接供体可被剪接为次优剪接受体以生成轻链-编码转录物，或剪接为CMV剪接受体以生成重链-编码转录物。该次优剪接受体经设计可生成类似数量的两种转录物。
[0602]在HEBS缓冲液中以～700ng/μL的浓度制备该DNA载体(pXWU022)，然后电穿孔进入CHO细胞。使用不同浓度的DNA(15，20，30，40和45μg)进行五次电穿孔。各电穿孔分别在具有含4 x 106对数期CHO细胞的0.7ml无菌HEBS缓冲液和含DNA的0.1mLHEBS(总体积0.8mL)的一次性0.4cm玻璃管(Invitrogen)中进行。使用设置为290伏特，950μF的Bio-Rad基因脉冲仪XCELL进行电击。然后将电击细胞在室温下保持10分钟，然后与10mL室温无胰岛素CHOM16培养基混合，离心(3′@1000rpm)，并吸取。将细胞重悬浮于12mL(室温)无胰岛素CHOM16培养基并转移至T-75组织培养瓶。
[0603]细胞和培养基：在电穿孔前将CHO细胞培养于添加了1X核苷的无血清培养基(CHOM24)。CHOM24是一种不含任何动物成分的化学成分明确的内部培养基配方。甲氨蝶呤选择在无核苷CHOM16和CHOM24化学成分明确的培养基中进行。
[0604]电穿孔后，将4 x 106CHO细胞汇集进入T-75瓶。在细胞被接种进入无核苷培养基后立即进行DHFR表达选择。最终将细胞扩增至125mL摇瓶中的CHOM24(～3周)。为了分离克隆细胞系，将转染的稳定汇集物稀释并以1细胞/微孔(含于200μLCHOM 16)涂布于四块96孔板。将平板维持在36℃，直至进行抗体滴度筛选。
[0605]以特异性针对人kappa链的ELISA测定细胞悬浮液中免疫球蛋白生产以筛选CHO克隆(涂布后21至28日)。在ELISA中所用的捕获抗体为多克隆山羊抗-人IgG(SouthernBiotech)而检测抗体为结合了过氧化酶的多克隆山羊抗-人kappa(SouthernBiotech)。扩增分泌免疫球蛋白数量最高的克隆。
[0606]接种1920微孔中总计381个接近汇合微孔并测定。在381个微孔中，扩增60个以供进一步研究，并扩增该60个中的4个克隆(15A7，40B3，40B5，40F6)。
实施例10
全人源抗-IGF-1R IgG4.P.agly抗体的纯化和表征
[0607]通过如下所述的方法纯化并表征CHO细胞生产的抗体。
[0608]蛋白A捕获：使用3倍柱体积的1X PBS(平衡缓冲液)以100-150cm/hr预平衡蛋白A柱。以150cm/hr，每毫升树脂最大10mg αIGF-1R加载上清液。加载后，以5倍柱体积的平衡缓冲液洗柱。然后，以100mM pH3.0的甘氨酸以上流方向逐步洗脱。采集目标组分并以2M Tris碱滴定至中性pH。用IX PBS透析采集的组分并浓缩物质以准备进行尺寸排阻步骤。
[0609]SUPERDEXTM 200(尺寸排阻)聚集体去除步骤包括用1.5柱体积的1XPBS以36cm/hr的流速平衡SUPERDEXTM 200，然后加载蛋白，并采集目标组分。
鉴定测试按如下进行
[0610]1).通过质谱进行完整质量分析，其中在分子量测定在电喷雾质谱分光计(ESI-MSD)上进行。在分析前，还原样品以去除二硫键。退卷积质谱代表了重和轻链的质量。
[0611]2).以配备了在线PTH分析仪的ABI蛋白测序仪通过Edman降解进行N-末端序列分析。鉴定得到轻链和重链的初始氨基酸序列。
[0612]3).以质谱分析进行肽定位：通过分析各个肽生成的LC/MS数据进行胰蛋白酶或/和EndoLysC肽定位以获得完整的序列覆盖。此外，测定了位点，并对氧化和脱氨基的数量进行了检测。
[0613]通过如下手段进行纯度测试：1)SDS-Page或CE-SDS：还原或非还原样本，该技术用于测量抗体碎裂，聚集和杂质，2)以配合LS和RI的SEC-HPLC技术检测聚集和碎裂，以光散射测定样本成分的摩尔质量。3)以SDS凝胶或毛细管IEF法测定可由C-或N-末端不均匀性和/或脱氨基形成的带电亚型的等电聚焦模式和PI分布。
[0614]最后，通过鲎基质显色(LAL)动力学浊度法测定内毒素浓度。
[0615]图6显示了对G4.P.agly型全人源M13-C06和M14-C03抗体的非还原型和还原型SDS PAGE分析。生产得到G4.P和G4.P.agly型的抗体M13-C06，M14-C03，M14-B01和M14-G11。所生产的M12-E01和M12-G04为G4.P型。
实施例11
全人源抗-IGF-1R抗体的结合活性
[0616]以ELISA测定G4.P.agly和G4.P型的可溶性IGF-1R的结合活性。将含于pH 9.6，0.025M碳酸盐缓冲液的2.5μg/ml可溶性IGF-1受体融合蛋白(Biogen Idec)以50μl/微孔涂布于96孔板(IMMULON2 HB，Dynex Technologies，Inc.，Cat.#3455)并在4℃孵育过夜。用添加了0.025％ Tween 20的磷酸盐缓冲盐(PBS，IrvineScientific，Cat#9240)在Skan Washer 300(Skatron Instruments)中洗涤平板，在含有1％脱脂牛奶，含于PBS的0.05％ Tween 20的pH 7.4缓冲液中阻断，然后在室温下孵育1小时。孵育后以PBS加0.025％Tween 20在Skan Washer 300中洗涤平板。为进行测定，在可溶性IGF-1受体涂覆的平板上孵育以1％脱脂牛奶，含于PBS的0.05％Tween 20稀释的50μl/微孔的对照和测试抗体。室温下孵育一小时后，以PBS和0.025％ Tween 20在Skan Washer 300中洗涤平板。添加50μl/微孔的在1％脱脂牛奶，含于PBS的0.05％ Tween 20中2000倍稀释的山羊抗-人Kappa-HRP(Southern Biotech Cat#2060-05)以检测结合抗体。将平板在室温下孵育1小时，并以PBS和0.025％Tween 20在Skan Washer 300中洗涤。以100μl/微孔添加TMB溶液(KIRKEGAARD & PERRY LABS，INC.cat：50-76-00)，并在两分钟后以50ul/微孔4N H2SO4终止反应。在450nm，背景540nm下以Molecular Devices平板读取器测定TMB的吸收。以4.3 LS版的SOFTMAX PRO软件包(Molecular Devices Corp.)分析数据。
[0617]图7(A)显示了G4型M13-C06，M14-C03，M14-G11，M12-E01和M12-G04的浓度依赖型结合，其中该对照抗体IDEC-151(G4.P)依然未显示对IGF-1R.Fc的任何结合。
[0618]图7(B)显示了以ELISA测定的G4.P.agly型M13-C06，M14-C03和M14-B01对可溶性IGF-1R.Fc的浓度依赖型结合。作为阴性对照的不相关特异性的G4.P抗体(IDEC-151)未显示对IGF-1R.Fc的任何结合。
[0619]以流式细胞仪测定人源抗体对肿瘤细胞上表达的野生型IGF-1R的结合活性。在添加了10％胎牛血清(FBS)(IrvineScientific，Cat#3000A)和50μg/ml庆大霉素(Gibco Invitrogen，Cat#15750-060)的最小必需培养基Eagle(ATCC，Cat#30-2003)中培养肿瘤细胞系MCF-7和Calu-6。在添加了10％ FBS和50μg/ml庆大霉素的RPMI-1640(ATCC，Cat#30-2001)中培养Panc-1，Colo-205，NCI-H23和ZR-75。使用胰蛋白酶-EDTA(Sigma，Cat#T4049)溶液从培养容器中去除吸附细胞。
[0620]以pH7.4的磷酸缓冲盐(PBS)(Irvine Scientific，Cat#9240)洗涤细胞两次，胰蛋白酶化并在PBS和10％ FBS中洗涤一次。将细胞在FACS缓冲液(0.05％叠氮化钠，2％FBS，10％普通山羊血清和含于PBS的100μg/ml普通山羊IgG)中调整至细胞107/ml，并置于冰上至少15分钟。将对照和测试抗体等分至Corning 3790平板。将50μl/微孔的细胞添加至Corning 3799平板。将来自Coming3790平板的一抗以50μl/微孔添加至Corning 3799平板的对应微孔。然后，将细胞(0.5 x 106细胞/样本)在冰上孵育45分钟。孵育后将平板1500rpm离心4分钟，然后吸取上清液。将细胞重悬浮于150μl FACS缓冲液。将平板1500rpm离心4分钟并吸取上清液。以100μl/微孔添加在FACS缓冲液中750倍稀释的山羊抗-人IgG-RPE(Southern Biotech Cat#2040-09)。然后，将细胞(0.5 x 106细胞/二抗)在冰上孵育45分钟。以50μl/微孔添加在FACS缓冲液中500倍稀释的7AAD(Molecular Probes，Cat#A1310)，并在冰上孵育5分钟。孵育后将平板1500rpm旋转4分钟，然后吸取上清液。将细胞重悬浮于150μl FACS缓冲液。将平板1500人rpm离心4分钟并吸取上清液。将细胞重悬浮于100μl/微孔FACS缓冲液。将细胞转移至具有200μl FACS缓冲液的12 x 75mm FACS管。最后，在FACSCalibur上使用CellQuest软件(均来自Becton Dickinson)检测细胞的荧光强度。
[0621]图8显示了M13-C06.G4.P.agly，M14-C03.G4.P.agly和M14-G11.G4.P与MCF-7细胞上表达的IGF-1R的浓度依赖型结合(图8(A))。通过测试与IGF-1R/3T3转染体和3T3亲代细胞的结合确认抗体的细胞表面结合特异性。所有的先导抗体显示了对表达IGF-1R的3T3细胞而非对3T3细胞的特异性反应性(图8(B))。
实施例12
全人源抗体对配体结合IGF-1R的抑制
[0622]测定了G4.P.agly和G4.P型人源抗体阻断IGF-1和IGF-2结合可溶性IGF-1R-Fc的能力。IgG4型M13-C06，M14-G11，M14-B01，M12-E01和M12-G04阻断IGF-1和IGF-2两者结合IGF-1R，而M14-C03仅阻断IGF-2(图9(A)和(B))。
[0623]抗-IGF-1R抗体的配体阻断能力可通过实施例3所述的固相RIA捕获法进行测定。简单而言，将不同浓度(100nM-0.01nM)的抗体与100,000cpm的125I-标记的IGF-1或125I-1GF-2共培养于96孔IMMULON2平板，其中人IGF-1R-Fc已被固定化(200ng/微孔)。室温孵育一小时后，洗涤微孔并通过伽马计数器对结合放射活性计数。IDEC-151(人G4)被用作亚型匹配阴性抗体对照。抑制百分比(％)计算为＝[1-(带抗体的平均CPM)/(带缓冲液的平均CPM)] x100％。
[0624]该结果证实全人源抗体M13-C06.G4.P，M13-C06.G4.P.agly，M14-G11.G4.P，M14-G11.G4.P.agly，M14-B01.G4.P.agly，M12-E01.G4.P和M12-G04.G4.P同时阻断IGF-1和IGF-2与IGF-1R的结合，而抗体M14-C03.G4.P和M14-C03.G4.P.agly仅阻断IGF-2与IGF-IR的结合。参见，图9(A)-(B)。
实施例13
全人源抗-IGF-1R抗体对肿瘤细胞生长的抑制
[0625]抗体阻断IGF-1和IGF-2驱动的肿瘤细胞生长的能力可通过细胞活性测定进行测验。
[0626]NCI-H23，Calu-6，Colo-205，Panc-1，BxPC-3(ATCC)肿瘤系购自ATCC。细胞系生长于含有RPMI-1640(ATCC)，10％胎牛血清(Irvine Scientific Inc.)和50μg/ml庆大霉素(Gibco，Invitrogen)的完全生长培养基。使用胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma)从培养容器中去除吸附细胞。pH7.2的磷酸缓冲盐来自于MediaTech Inc。用于发光测定的96孔底部洁净平板来自于Wallac Inc。
[0627]将生长至80％单层的细胞胰蛋白酶化，洗涤，重悬浮于200μl 2％生长培养基，将NCI-H23和Colo-205细胞以8 x 103细胞/微孔涂布于96孔平板；并将Calu-6，Panc-1和BxPC-3细胞以5 x 103细胞/微孔涂布与96孔平板。24小时后，以100μl无血清培养基(SFM)置换培养基，并添加4X浓度的系列稀释抗体。在37℃继续孵育1小时后，添加50μl 4X浓度的IGF-1或IGF-2，并在37℃孵育至48小时以测定细胞生长。所有的处理均一式三份。使用CELLTITER-GLOTM发光细胞活性测定(Promega，Madison，WI)检测细胞生长。试剂和SFM的1:1混合以200μl/微孔添加。在Wallac(Boston，MA)平板读取器上检测发光。
[0628]各种人源IgG4型抗-IGF-1R抗体显示出对H-23(IGF-1和IGF-2)Calu-6(IGF-2)细胞中IGF-1和IGF-2驱动的细胞增殖的抑制(图10(A)-(C))。其它细胞系显示出类似的趋势(例如，参见，实施例20)。
实施例14
通过全人源抗-IGF-1R抗体对IGF-1R的内在化
[0629]染色步骤前48小时将MCF-7细胞以50,000细胞/微孔接种进入8孔室玻片(Becton Dickinson 1型胶原质涂覆的培养玻片，BD BioCoatTM #354630)。将细胞常规维持在20代以内。染色当天，将各微孔的培养基除去，并以500μl冷孵育缓冲液(MEM EagleATCC #30-2003+1％ BSA)替换。以该种缓冲液洗涤细胞两次，每次3分钟。然后将250μl各种待测的单抗或人源G4.P.agly抗体添加以10μg/ml的浓度添加至适当的微孔，在孵育培养基中稀释，并在冰上孵育1小时。以鼠源抗-人-IGF-1R抗体(Lab Vision/NeoMarkers，clone 24-31 cat# MS-641)作为阳性对照抗体以比较内在化程度。在冰上孵育一小时后，以500μl冷洗涤缓冲液洗(PBS+1％ BSA+2％山羊血清)涤零时间(t＝0′)的玻片三次，每次洗涤3分钟(玻片始终在冰上！)。然后以500μl4％多聚甲醛(从16％母液中以PBS稀释；EMS #15710)在室温下固定t＝0玻片15分钟。然后以冷洗涤缓冲液洗涤t＝0玻片3次，每次洗涤3分钟，然后置于冰上。同时，将剩余的玻片在其指定的时间点(15和60分钟)置于37℃孵育器中。在其孵育时间的末期，各玻片遵循如上相同的步骤-洗涤并固定，并置于冰上。然后在冰上以200μl冷渗透缓冲液(洗涤缓冲液+0.5％Triton-X)渗透所有的玻片10分钟。然后以500μl冷洗涤缓冲液洗涤所有玻片3次，每次洗涤3分钟。首次在4℃ 1000rpm离心储存瓶10分钟后，在洗涤缓冲液中以1:1000稀释制备二抗(AlexaFluor488山羊-抗-小鼠IgG(H+L)，针对单抗和AlexaFluor 488山羊-抗-人IgG(H+L)的分钟探针#A11029，针对G4抗体的分子探针#A11013)。再次以500μl冷洗涤缓冲液洗涤3次。最后一次洗涤时，除去缓冲液并使所有的微孔空置。然后使用所提供的分拆工具从玻片上分拆室，并以含DAPI的Vectashield封固培养基(载体#H-1500，Hard SetTM)封固盖玻片。将玻片在4℃暗处保存过夜，并使得封固培养基干燥。
[0630]使用LaserSharp 2000程序(BioRad v5.2)以共焦显微镜拍摄玻片的照片，并表示为来自Kalman10平均的蓝色和绿色分量的合并。
[0631]如图13A所示，M13-C06.G4.P.agly显示了IGF-1R在60分钟内的快速内在化。M14-C03.G4.P.agly和M14-G11.4.P均显示出与M13-C06.G4.P.agly抗体类似的内在化属性(数据未显示)。作为预期的阳性对照，克隆24-31同样内在化受体，而亚型匹配阴性对照(小鼠7F2和人G4，IDEC-152.G.P(灵长源化抗体))未结合或内在化(图13(B)-(C))。
[0632]此外，通过基于FACS的方法测定受体内在化速率以对鼠单克隆抗体进行确认。以细胞解离缓冲液(Gibco目录编号13151-014)使生长至70％汇合单层的MCF-7细胞脱离。将细胞重悬浮于培养基，并将5 x 106细胞添加至12 x 75mm管(Falcon目录编号352054)，其中各管代表了待测试的不同单抗。向对应的管中添加10μg/ml含于无叠氮化物的0.5ml FACS缓冲液(PBS+1％ BSA)的单抗，并向对照管添加无抗体缓冲液以测定试验内在化误差。将试管在冰上孵育1小时15分钟，然后复原于1ml FACS缓冲液中。将100μl各种样本移入96孔U型底平板(NUNC #163320)，置于冰上以防止内在化，并定义为零时间(t＝0)。这可用作100％抗体结合对照。然后将试管转移至37℃水浴，在时间(t)＝5，10，20，40和60分钟(随后变为5，10，15，30和60分钟)取出100μl样本并置于在冰上的96孔U型底平板的单独微孔中。采集所有样本后，在4℃离心机中1200rpm离心平板以聚集细胞。添加检测受体内在化的抗体或者是用于检测细胞表面残留受体的抗-CD221-PE(BD Pharmingen cat#555999—抗-IGF-1R；10μ/10μl样本)，或者是用于检测在细胞表面残留抗体的山羊-抗-小鼠-PE(Jackson ImmunoResearch Lab cat#115-116-146；5μg/ml)。在含有1％叠氮化钠的FACS缓冲液中孵育样本1小时，洗涤一次，并在含叠氮化物的FACS缓冲液中保持终体积为200μl。然后使用FACSArray(BD)运行样本和采集，并测定几何平均值。同样运行PE-标记的Quantibrite珠(BD #340495)以对结合至细胞表面的PE分子定量，其中该Quantibrite珠的运行采用和样本相同的FL2设置。PE分子结合该珠子的数量在其包装上给出，从而可通过样本和珠子的几何平均值对结合至细胞表面的PE分子定量。FACS测定显示所测试的鼠单克隆抗体促进IGF-1R的内在化(数据未显示)。
实施例15
全人源抗体对IGF-1R介导的信号转导的抑制
[0633]I部分：MCF-7细胞中信号转导的抑制
[0634]人抗-IGF-1R抗体对IGF-1R信号转导的作用可通过MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)进行评估。抗体阻断IGF-1和IGF-2介导的IGF-1R受体磷酸化的能力可参照实施例4所述进行测定。所有的IgG4型全人源抗体显示了对IGF-1R磷酸化的良好抑制(EC50<1nM)(图11(A和B))。
[0635]为了检测对下游信号转导的作用，参照实施例4所述生成细胞溶解物。为进行信号转导实验，在血清饥饿后添加含于350μl新鲜无血清培养基的100nM，15nM，5nM和1nM的对照和测试抗体，并在37℃孵育1小时。向微孔添加含于35μl无血清培养基的13nM人重组IGF-1和27nM IGF-II(R & D Systems，#291-G1和#292-G2)，并在室温下孵育15分钟。溶解细胞，使用4-12％ Bis-Tris凝胶分离回收的样本，并固定化至硝化纤维(Invitrogen Corp.)。以磷酸-Akt在位点Thr308(Cell signaling Technologies，#4056)，以磷酸-p44/42 MAPK在位点Thr202/Tyr204(Cell signaling Technologies，#9101)以及抗-兔IgG-HRP(Cell Signaling Technologies，#7071)检测IGF-1R信号转到途径。以ECL发光氨试剂(Amersham Biosciences，#RPN2109)显示条带并进行自动射线摄影。从各个印迹剥去抗体并分别重新探测总Akt(Cell signaling Technologies，#9272)或总p44/42MAPK(Cell signaling Technologies，#9102)和抗-兔IgG-HRP。以ECL发光氨试剂显示条带并进行自动射线摄影。
[0636]测定抗体对Akt和MAPK磷酸化等下游信号转导事件的作用。使用多克隆IGF-1Rβ抗体-琼脂糖结合物(Santa CruzBiotechnology，#SC-713)免疫沉淀来自自身磷酸化的细胞溶解物。使用4-12％ Bis-甘氨酸凝胶分离回收的受体蛋白，并固定化至硝化纤维(Invitrogen Corp.)。通过抗-磷酸-IGF-1R位点Tyr1131(CellSignaling Technologies，#3021)或抗-IGF-1Rβ(Santa CruzBiotechnology，#SC-9038)和抗-兔IgG-HRP(Cell SignalingTechnologies，#7071)检测受体。以ECL发光氨试剂(AmershamBiosciences，#RPN2109)显示条带并进行自动射线摄影。(图12A和12B)。
[0637]图12A和B显示M13.C06.G4.P.agly以剂量依赖方式抑制IGF-1和IGF-2介导的Akt和p42/44MAPK磷酸化。特别地，M13-C06.G4.P.agly IGF-1R抗体在所有的测试浓度(即，1-100nM)下抑制配体诱导的MCF7细胞中的Akt信号转导，该抑制可通过对氨基酸残基Ser473上IGF-1和IGF-2诱导的磷酸化的抑制得到证实(图19)。在100nM下测试对照抗体，而在100，15，5和1nM下测试M13-C06.G4.p.agly。抗体IDEC-152(人G4型不相关特异性抗体)被用作阴性对照。抗体IR3(针对IGF-1R的鼠单克隆抗体)被用作阳性对照。此外，M14-C03.G4.P.agly和M14.G11.G4.P全长抗体还抑制IGF-1和IGF-2驱动的Akt和p42/44MAPK激活信号转导(数据未显示)。
[0638]II部分：A549，Calu-6和H1299细胞中信号转导的抑制
[0639]M13-C06.G4.P.agly破坏胰岛素号受体底物(IRS-1)与肌醇磷脂3-激酶(PI3K)调节亚基p85结合的能力可通过共免疫沉淀测定在肿瘤细胞系中检测。特别地，在对M13-C06.G4.P.agly抗体敏感的NSCLC细胞系中，IRS-1以IGF-1R-依赖性方式结合P13K亚基p85。因此，在M13.C06.G4.P.agly或对照抗体(IDEC-151)存在下将两种非小细胞肺癌细胞系(NSCLC)A549和H1299(对M13-C06.G4.P.agly响应)和一种NSCLC细胞系Calu-6(对M13-C06.G4.P.agly响应较少)生长24小时。以抗-p85抗体免疫沉淀细胞溶解物，并通过抗-IRS-1(顶部印迹)和抗-p85(底部印迹)抗体进行western印迹分析(图25)。
[0640]为进行该测定，从ATCC购买人肺肿瘤细胞系A549，Calu-6和NCI-1299细胞并维持于含10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基1640中。将细胞以3 x 106细胞/皿接种于100mm皿中，培养24小时，然后在5％ FBS存在下以100nM M13-C06.G4.P.agly或BDEC-151(人G4.p亚型匹配阴性对照抗体)处理24小时。在来自Cell Signaling Technology，Inc.(Danvers，MA USA)的1％ TritonX-100溶解缓冲液中制备细胞溶解物。为进行免疫沉淀，将抗-p85抗体(Cat #06-649，Upstate Cell Signaling Solutions(现在是Millipore，Concord，MA(USA)的一部分))添加至溶解物(每1-2mg溶解物4ug抗体)并在4℃孵育过夜。然后通过与蛋白-G琼脂糖珠在4℃混合两小时捕获免疫复合物。以冰冷溶解缓冲液洗涤免疫沉淀物并在以
Novex 4-12％ Bis-Tris凝胶电泳(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA(USA))分离前在2x LDS(Lithium Dodecyl Sulfate)样本缓冲液中煮沸，然后转移至硝化纤维膜。IRS-1(Cat # 06-248，Upstate)和p85(Cat # 06-649，Upstate)抗体购自Millipore，参照生产商的方案进行免疫印迹。
结果：
[0641]M13-C06.G4.P.agly在A549和H1299细胞系但不在Calu-6中抑制血清存在下的IRS-1与PI3K调节亚基p85的结合(图25)。
[0642]
实施例16
抗体与非人源灵长动物IGF-1R的交叉反应性
[0643]测试了抗-人IGF-1R抗体识别来自非人灵长动物的IGF-1R的能力。首先克隆恒河猴和食蟹猴IGF-1R，并在CHO细胞中表达。通过流式细胞术测定所有抗体的结合，并通过共焦显微镜确认。M13.C06.G4.P.agly，M14.C03.G4.P.agly和M14.G11.G4.P均显示出对恒河和食蟹IGF-1R的特异性结合活性(数据未显示)。进一步的物种交叉反应性研究显示M14.G11.G4.P和M14.C03.G4.P.agly结合表达IGF-1R的CHO细胞(数据未显示)。
[0644]除了在CHO细胞上表达的食蟹IGF-1R外，抗体还与在粒细胞上表达的食蟹猴IGF-1R以及来自该物种的单核细胞进行交叉反应。(结合的特异性可通过可溶性重组人IGF-1R阻断M13.C06.G4.P.agly抗体结合的能力得到证实(数据未显示))。类似地，M13.C06.G4.P.agly抗体还结合已建立的猕猴成纤维细胞系。(参见，实施例26，图23)。这些结果显示食蟹猴是进行毒性测试的理想非啮齿物种。
[0645]与IGF-1R受体在灵长动物中的结果相反，经FACS分析评估，M13.C06.G4.P.agly未显示与免疫细胞(粒细胞，单核细胞，淋巴细胞)上表达的大鼠或小鼠IGF-1R的交叉反应性。
实施例17
IGF-1R特异性鼠单抗的生成
[0646]特异性针对人IGF-1R的鼠单克隆抗体可通过标准杂交瘤技术生成。以表达IGF-1R的NIH3T3成纤维细胞免疫来自Balb/c小鼠的脾细胞，并将IGF-1R.Ig融合蛋白用于PEG诱导的体细胞融合。表4总结了抗-IGF-1R鼠单克隆抗体的属性。
[0647]选定鼠抗体抑制多种人肿瘤系(肺，H-23，Calu-6；胰腺，BxPc-3，Panc-1，MiaPaCa以及结肠Colo205)的IGF/IGF-1R依赖型体内生长的能力可通过如实施例13所述的增殖进行测定。图14(A)-(F)显示了八种鼠源抗体对100ng/ml的IGF-1存在下肿瘤细胞生长的抗体浓度依赖型抑制作用。
[0648]抗体阻断IGF-1和IGF-2驱动的肿瘤细胞生长的能力可与NCI-H23肺部肿瘤细胞系进行比较。图15给出了三种鼠MAbs′(P2A7-3E11，20C8-3E8，P1A2-2B11)和一种全人源抗体M13-C06.G4.P.agly的生长抑制作用的范例。所有这些抗体显示抑制IGF-1和IGF-2驱动的肿瘤生长。可商业购得的抗-IGF-1R抗体IR3被用作阳性对照。不相关特异性小鼠IgG(抗-IDectin，IgG1)和人gamma4型IDEC-152抗体被用作本实验的亚型匹配对照。
实施例18
鼠抗-人IGF-1R单抗的克隆
抗-IGF-1R鼠杂交瘤P2A7.3E11免疫球蛋白可变区的克隆
[0649]来自鼠杂交瘤细胞的总细胞RNA可通过QiagenRNeasy微型试剂盒参照生产商推荐方案进行制备。编码重和轻链可变区的cDNAs可采用Pharmacia Biotech First Strand cDNA合成试剂盒参照生产商推荐方案采用六聚体引导以RT-PCR从总细胞RNA中克隆得到。
[0650]P2A7.3E11可变区的克隆和嵌合将作为实施例详细描述(其它单抗可变区通过类似的方法克隆和嵌合，但由于采用了抗体工程领域技术人员熟悉的标准分子生物学技术，为求简洁未作具体描述)。为了对具有完整信号序列的鼠免疫球蛋白可变区进行PCR扩增，可采用杂交至多重鼠免疫球蛋白基因家族信号序列的简并前向引物以及特异性针对如Current Protocols in Immunology(Wiley和Sons，1999)所述的鼠恒定区5′端的单个后向引物的混合物。使用Clontech的Advantage Taq聚合酶的PCR条件为：在94°下初始变性2分钟，然后在94°下进行30个周期的1分钟变性，在45°下退火1分钟，并在72°下延长1分钟。P2A7重链可变区通过如下引物扩增：5′GGG GAT ATC CAC CAT GGR ATG SAG CTGKGT MAT SCT CTT 3′(M＝A/C，K＝G/T，R＝A/G和S＝C/G)(SEQ IDNO：130)和5′AGG TCT AGA AYC TCC ACA CAC AGG RRCCAG TGG ATA GAC 3′(R＝A/G和Y＝C/T)(SEQ ID NO：131)。具有其信号序列的P2A7轻链可变区通过如下引物扩增：5′GGG GATATC CAC CAT GGA TTT TCA GGT GCA GAT TTT CAG 3′(SEQID NO：132)和5′GCG TCT AGA ACT GGA TGG TGG GAG ATGGA 3′(SEQ ID NO：133)。PCR产物可采用Qiagen Qiaquick凝胶萃取试剂盒参照生产商的推荐方案进行凝胶纯化。纯化的PCR产物通过Invitrogen的TOPO克隆试剂盒参照生产商推荐方案亚克隆进入其pCR2.1TOPO载体。对来自多个独立亚克隆的插入物进行测序以避免PCR错误。
[0651]通过对可变区序列的Blast分析确认其免疫球蛋白一致性。P2A7重链可变区为鼠亚组II(A)的成员。以下显示了P2A7成熟重链可变区的序列，其中CDRs(基于Kabat名称的CDRs(决定簇互补区))以下划线表示：
1 QVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGNTFT DYVINWVKQR TGQGLEWIGE
51 IYPGNENTYY NEKFKGKATL TADKSSNTAY MQLSSLTSED SAVYFCARGI
101 YYYGSRTRTM DYWGQGTSVT VSS(SEQ ID NO：38)
[0652]P2A7轻链可变区为鼠kappa亚组IV的成员。以下显示了P2A7成熟轻链可变区的序列，其CDRs以下划线表示：
1 EVVLTQSPTA MAASPGEKIT ITCSASSTLS SNYLHWYQQK PGFSPKLLIY
51 RTSNLASGVP GRFSGSGSGT SYSLTIGTME AEDVATYYCQ QGSSIPLTFG
101 AGTKLELK(SEQ ID NO：98)
chP2A7的构建和表达
[0653]使用编码重和轻链鼠P2A7可变区的cDNAs来构建用于表达鼠-人嵌合体(chP2A7)的构建载体，其中muP2A7可变区被连接至人IgG4和kappa恒定区。为了构建重链嵌合体，将来自P2A7重链亚克隆pCN363的0.47kb NotI-BsmBI片段，来自pEAG1995(包含遗传去除了IgG4 C-末端赖氨酸残基的序列确认的糖苷化S228P/T299A(Kabat EU命名)可变huIgG4重链恒定区cDNA的质粒)的1.0kb BsmBI-NotI片段亚克隆进入pV90(序列确认的基于pUC的Biogen Idec的专有表达载体，其包含SV40早期启动子驱动的可选择标记，其中外源基因表达受CMV-IE启动子和人生长激素多聚腺苷酸化信号控制)的磷酸化6.1kb NotI-线性化载体骨架。所得质粒pEAG2045中的重链cDNA序列通过DNA测序进行确认。嵌合P2A7重链cDNA插入物(由信号序列的起始子ATG至终止子TGA)如下显示为SEQ ID NO：134：
1 ATGGAATGGA GCTGTGTCAT GCTCTTCATC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT
51 CCACTCCCAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG ACCTGAGCTA GTGAAGCCTG
101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGAAACAC ATTCACTGAC
151 TATGTTATAA ACTGGGTGAA GCAGAGAACT GGACAGGGCC TTGAGTGGAT
201 TGGAGAGATT TATCCTGGAA ATGAAAATAC TTATTACAAT GAGAAGTTCA
251 AGGGCAAGGC CACACTGACT GCAGACAAAT CCTCCAACAC AGCCTACATG
301 CAGCTCAGTA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCGGTCTATT TCTGTGCAAG
351 AGGGATTTAT TACTACGGTA GTAGGACGAG GACTATGGAC TACTGGGGTC
401 AAGGAACCTC AGTCACCGTC TCCTCAGCCT CCACCAAGGG CCCATCCGTC
451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC CAGATCTACC TCCGAGAGCA CAGCCGCCCT
501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA
551 ACTCAGGCGC CCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCGGC TGTCCTACAG
601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAG
651 CTTGGGCACG AAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA
701 CCAAGGTGGA CAAGAGAGTT GAGTCCAAAT ATGGTCCCCC ATGCCCACCG
751 TGCCCAGCAC CTGAGTTCCT GGGGGGACCA TCAGTCTTCC TGTTCCCCCC
801 AAAACCCAAG GACACTCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG
851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAG GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC
901 GTGGATGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA
951 GTTCAACAGC GCGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG
1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC
1051 CCGTCCTCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA
1101 GCCACAAGTG TACACCCTGC CCCCATCCCA GGAGGAGATG ACCAAGAACC
1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC
1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC
1251 TCCCGTCCTC GATTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AGGCTAACCG
1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG GAGGGGAATG TCTTCTCATG CTCCGTGATG
1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACACAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCT
1401 GGGTTGA
[0654]预测的成熟chP2A7重链蛋白序列如下显示为SEQ IDNO：135：
1 QVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGNTFT DYVINWVKQR TGQGLEWIGE
51 IYPGNENTYY NEKFKGKATL TADKSSNTAY MQLSSLTSED SAVYFCARGI
101 YYYGSRTRTM DYWGQGTSVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC
151 LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG
201 TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP PCPAPEFLGG PSVFLFPPKP
251 KDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN
301 SAYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ
351 VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPV
401 LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLG
[0655]鼠可变区为残基1-122，人IgG4重链恒定区为残基123-459。Kabat EU-定义的S228P铰链替换(为了校正IgG4的倾向以形成半抗体)为上述残基231，而在CH2中遗传去除N-连接的糖基化的T299A替换为上述序列中的残基302。
[0656]为了构建轻链嵌合物，使用
Quick-Change突变试剂盒参照生产商的推荐方案，以突变引物5′CGC CAG TGT GCG GCC GCT GGA ATT CGC CCT TG3′(SEQ IDNO：136)及其反向补体(在重链信号序列5′导入独特的NotI位点)，以及5′GGA CCA AGC TGG AGC TGA AGC GTA CGG ATG CTGCAC CAA CTG TAT CC 3′(SEQ ID NO：137)及其反向补体(在轻链可变/kappa恒定区结合部下游紧邻导入独特的BsiWI位点)对PCR扩增的P2A7轻链进行定点突变。通过导入的NotI和BsiWI位点变化筛选鉴定突变的质粒。通过DNA测序确认轻链序列。将如上制备的0.42kb NotI-BsiWI轻链可变区片段，以及从含有序列确认的人源化抗-LTbR kappa轻链恒定区cDNA的质粒pEAG1572的0.34kb BsiWI-NotI片段亚克隆进入表达载体pEAG1256(序列确认的基于pUC的表达载体，其包含磷酸甘油激酶启动子驱动的neo可选择标记，其中外源基因的表达受到CMV-IE启动子和人生长激素多聚腺苷酸化信号的控制)的NotI位点。所得质粒中的轻链cDNA序列通过DNA测序进行确认。嵌合P2A7轻链cDNA插入物(由信号序列的起始子ATG至终止子TAG)如下显示为SEQ ID NO：138：
1 ATGGATTTTC AGGTGCAGAT TTTCAGCTTG CTGCTAATCA GTGTCACAGT
51 CATAGTGTCT AATGGAGAAG TTGTGCTCAC CCAGTCTCCA ACCGCCATGG
101 CTGCATCTCC CGGGGAGAAG ATCACTATCA CCTGCAGTGC CAGCTCAACT
151 TTAAGTTCCA ATTACTTGCA TTGGTATCAG CAGAAGCCAG GATTCTCCCC
201 TAAACTCTTG ATTTATAGGA CATCCAATCT GGCCTCTGGA GTCCCAGGTC
251 GCTTCAGTGG CAGTGGGTCT GGGACCTCTT ACTCTCTCAC AATTGGCACC
301 ATGGAGGCTG AAGATGTTGC CACTTACTAC TGCCAGCAGG GTAGTAGTAT
351 ACCGCTCACGTTCGGTGCTG GGACCAAGCT GGAGCTGAAG CGTACGGTGG
401 CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT
451 GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC
501 CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG
551 AGAGTGTCAC AGAGCAGGACAGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC
601 ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG
651 CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA
701 GGGGAGAGTG TTAG
[0657]预测的成熟chP2A7轻链蛋白序列如下显示为SEQ IDNO：139：
1 EVVLTQSPTA MAASPGEKIT ITCSASSTLS SNYLHWYQQK PGFSPKLLIY
51 RTSNLASGVP GRFSGSGSGT SYSLTIGTME AEDVATYYCQ QGSSIPLTFG
101 AGTKLELKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK
151 VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ
201 GLSSPVTKSF NRGEC
[0658]鼠可变区为如上的残基1-108，而人kappa恒定区为上述序列的残基109-215。
[0659]将chP2A7重链表达载体和chP2A7轻链表达载体共转染进入细胞293-EBNA，并测试转染细胞的抗体分泌和特异性。将空载体和hu5c8-S228P/T299A IgG4(分子克隆的CD40L-特异性单抗)-转染的细胞作为对照。对条件培养基的Western印迹分析(以抗-人重和轻链抗体展开)显示chP2A7-转染的细胞合成并有效分泌重和轻链。对条件培养基染色的表达IGF-1R-的MCF7人哺乳动物腺癌细胞的FACS分析显示chP2A7抗体结合并生成与muP2A7类似的染色模式，而来自于mock-和hu5c8-转染细胞的调节培养基未能对MCF7细胞染色(通过PE-结合的抗-人重和轻链抗体检测)。稀释滴定显示通过含有chP2A7单抗的条件培养基进行的特异性染色证实了剂量响应。以chP2A7重链表达载体和chP2A7轻链表达载体共转染CHO细胞以生成表达嵌合P2A7-糖苷化huIgG4，kappa单抗的稳定系。
抗-IGF-1R鼠杂交瘤20C8.3B8免疫球蛋白可变区的克隆
[0660]其它抗-IGF-1R单抗的可变区可通过与P2A7单抗类似的标准重组DNA技术进行克隆和嵌合。
[0661]20C8.3B8单抗重链可变区(属于鼠亚组I(A))的预测成熟序列如下显示，其CDRs带有下划线：
1 DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG
51 YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG
101 YGYRSAYYFD YWGQGTTVTV SS(SEQ ID NO：43)
[0662]20C8轻链可变区(属于鼠kappa亚组III)的预测成熟序列如下显示：
1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS TSAYSYMHWY QQKPGQPPKL
51 LIYLASNLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHSRELPY
101 TFGGGTKLEI K(SEQ ID NO：103)
[0663]嵌合20C8重和轻链cDNAs的表达载体按上述方法构建。质粒插入物中的免疫球蛋白cDNA序列通过DNA测序进行确认。嵌合20C8重链cDNA插入物(由信号序列的起始子ATG至终止子TGA)如下显示为SEQ ID NO：140：
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAG CACCAGGTGC
51 CCACTCCGAC GTCCAACTGC AGGAGTCTGG ACCTGACCTG GTGAAACCTT
101 CTCAGTCACT TTCACTCACC TGCACTGTCA CTGGCTACTC CATCACCAGT
151 GGTTATAGCT GGCACTGGAT CCGGCAGTTT CCAGGAAACA AACTGGAATG
201 GATGGGCTAC ATACACTACA GTGGTGGCAC TAACTACAAC CCATCTCTCA
251 AAAGTCGAAT CTCTATCACT CGAGACACAT CCAAGAACCA GTTCTTCCTC
301 CAGTTGAATT CTGTGACTAC TGAGGACACA GCCACATATT ACTGTGCAAG
351 ATCGGGGTAC GGCTACAGGA GTGCGTACTA TTTTGACTAC TGGGGCCAAG
401 GGACCACGGT CACCGTCTCC TCAGCTTCCA CCAAGGGCCC ATCCGTCTTC
451 CCCCTGGCGC CCTGCTCCAG ATCTACCTCC GAGAGCACAG CCGCCCTGGG
501 CTGCCTGGTC AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT
551 CAGGCGCCCT GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCGGCTGT CCTACAGTCC
601 TCAGGACTCT ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAGCTT
651 GGGCACGAAG ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA
701 AGGTGGACAA GAGAGTTGAG TCCAAATATG GTCCCCCATG CCCACCGTGC
751 CCAGCACCTG AGTTCCTGGG GGGACCATCA GTCTTCCTGT TCCCCCCAAA
801 ACCCAAGGAC ACTCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG
851 TGGTGGACGT GAGCCAGGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG
901 GATGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTT
951 CAACAGCGCG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT
1001 GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCG
1051 TCCTCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAGCC
1101 ACAAGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCAGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG
1151 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG
1201 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC
1251 CGTCCTCGAT TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAGG CTAACCGTGG
1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGGAG GGGAATGTCT TCTCATGCTCCGTGATGCAT
1351 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACACAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCTGGG
1401 TTGA
[0664]预测的成熟ch20C8重链蛋白序列如下显示为SEQ IDNO：141：
1 DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG
51 YIHYSGGTNY NPSLKSRI SITRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG
101 YGYRSAYYFD YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL
151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT
201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPP CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK
251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS
301 AYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV
351 YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
401 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLG
[0665]鼠可变区为残基1-122，人IgG4重链恒定区为残基123-459。
[0666]嵌合20C8轻链cDNA插入物(由信号序列的起始子ATG至终止子TAG)如下显示为SEQ ID NO：142：
1 ATGGAGACAG ACACACTCCT GTTATGGGTA CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG
51 TTCCACTGGT GACATTGTGC TGACACAGTC TCCTGCTTCC TTAGCTGTAT
101 CTCTGGGGCA GAGGGCCACC ATCTCATGCA GGGCCAGCAA AAGTGTCAGT
151 ACATCTGCCT ATAGTTATAT GCACTGGTAC CAACAGAAAC CAGGACAGCC
201 ACCCAAACTC CTCATCTATC TTGCATCCAA CCTAGAATCT GGGGTCCCTG
251 CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT
301 CCTGTGGAGG AGGAGGATGC TGCAACCTAT TACTGTCAGC ACAGTAGGGA
351 GCTTCCGTAT ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GCTGGAAATC AAACGTACGG
401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA
451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA
501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC
551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC
601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC
651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA
701 ACAGGGGAGA GTGTTAG
[0667]预测的成熟ch20C8轻链蛋白序列如下显示为SEQ IDNO：143：
1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS TSAYSYMHWY QQKPGQPPKL
51 LIYLASNLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHSRELPY
101 TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLS KADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
[0668]鼠可变区为如上的残基1-111，而人kappa恒定区为上述序列的残基112-218。
[0669]将ch20C8重链表达载体和ch20C8轻链表达载体共转染进入细胞293-EBNA，并测试转染细胞的抗体分泌和特异性。将空载体和hu5c8-S228P/T299A IgG4(分子克隆的CD40L-特异性单抗)-转染的细胞作为对照。对条件培养基的Western印迹分析(以抗-人重和轻链抗体展开)显示ch20C8-转染的细胞合成并有效分泌重和轻链。对来自转染细胞的条件培养基染色的表达IGF-1R-的MCF7人哺乳动物腺癌细胞的FACS分析显示ch20C8抗体以可滴定剂量响应结合，而来自于mock-和hu5c8-转染细胞的调节培养基未能对MCF7细胞染色(通过PE-结合的抗-人重和轻链抗体检测)。以ch20C8重链表达载体和ch20C8轻链表达载体共转染CHO细胞以生成表达嵌合20C8-糖苷化huIgG4，kappa单抗的稳定系。
抗-IGF-1R单抗20D8.24B11免疫球蛋白可变区的克隆
[0670]单抗20D8.24B11表现为20C8.3B8的姐妹克隆(均来自于融合7)：具有相同的轻链，且其重链与20C8重链的区别为单个残基FR4。20D8.24B11单抗重链可变区(属于鼠亚组I(A))的预测成熟序列如下显示，其CDRs带有下划线：
1 DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG
51 YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG
101 YGYRSAYYFD YWGQGTTLTV SS(SEQ ID NO：53)
[0671]如下显示了20D8(上方)和20C8(下方)重链可变区的比对，突出了对应FR4Kabat残基109(以下的残基118)单个保守变化：
1 DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMG 50(SEQ ID NO：53)
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMG 50(SEQ ID NO：43)
· · · · ·
51 YIHYSGGTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARSG 100(SEQ ID NO：53)
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
51 YIHYSGGTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARSG 100(SEQ ID NO：43)
· ·
101 YGYRSAYYFDYWGQGTTLTVSS 122(SEQ ID NO：53)
|||||||||||||||||·||||
101 YGYRSAYYFDYWGQGTTVTVSS 122(SEQ ID NO：43)
[0672]构建20D8重链cDNA的表达载体，并通过DNA测序确认质粒pCN380中的重链cDNA插入物。嵌合20D8重链cDNA插入物(由信号序列的起始子ATG至终止子TGA)如下显示为SEQID NO：144：
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAG CACCAGGTGC
51 CCACTCCGAC GTCCAACTGC AGGAGTCTGG ACCTGACCTG GTGAAACCTT
101 CTCAGTCACT TTCACTCACC TGCACTGTCA CTGGCTACTC CATCACCAGT
151 GGTTATAGCT GGCACTGGAT CCGGCAGTTT CCAGGAAACA AACTGGAATG
201 GATGGGCTAC ATACACTACA GTGGTGGCAC TAACTACAAC CCATCTCTCA
251 AAAGTCGAAT CTCTATCACT CGAGACACAT CCAAGAACCA GTTCTTCCTC
301 CAGTTGAATT CTGTGACTAC TGAGGACACA GCCACATATT ACTGTGCAAG
351 ATCGGGGTAC GGCTACAGGA GTGCGTACTA TTTTGACTAC TGGGGCCAAG
401 GGACCACGTT GACAGTCTCC TCAGCTTCCA CCAAGGGCCC ATCCGTCTTC
451 CCCCTGGCGC CCTGCTCCAG ATCTACCTCC GAGAGCACAG CCGCCCTGGG
501 CTGCCTGGTC AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT
551 CAGGCGCCCT GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCGGCTGT CCTACAGTCC
601 TCAGGACTCT ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAGCTT
651 GGGCACGAAG ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA
701 AGGTGGACAA GAGAGTTGAG TCCAAATATG GTCCCCCATG CCCACCGTGC
751 CCAGCACCTG AGTTCCTGGG GGGACCATCA GTCTTCCTGT TCCCCCCAAA
801 ACCCAAGGAC ACTCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG
851 TGGTGGACGT GAGCCAGGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG
901 GATGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTT
951 CAACAGCGCG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT
1001 GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCG
1051 TCCTCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAGCC
1101 ACAAGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCAGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG
1151 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG
1201 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC
1251 CGTCCTCGAT TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAGG CTAACCGTGG
1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGGAG GGGAATGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT
1351 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACACAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCTGGG
1401 TTGA
[0673]由上述序列编码的预测的成熟ch20D8重链蛋白序列如下显示为SEQ ID NO：145：
1 DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG
51 YIHYSGGTNY NPSLKSRISITRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG
101 YGYRSAYYFD YWGQGTTLTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL
151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT
201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPP CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK
251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS
301 AYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV
351 YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
401 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLG
[0674]鼠可变区为残基1-122，人S228P/T299A IgG4重链恒定区为残基123-458。
[0675]20D8与20C8的轻链可变序列一致：请参见前述有关20C8的信息。
抗-IGF-1R单抗P1G10.2B8免疫球蛋白可变区的克隆
[0676]预测的成熟P1G10重链可变区的序列如下显示为SEQID NO：58，其CDRs带有下划线：
1 QIQLVQSGPD LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKDLKWMGW
51 INTNTGEPTY ADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED TATYFCASPL
101 YYRNGRYFDV WGAGTTVTVS S
[0677]P1G10表现为属于鼠重链可变区亚组II(A)，但对重链II(A)共有序列仅有55％的一致性。
[0678]构建嵌合P1G10重链cDNA的表达载体，并测序确认其cDNA插入物。嵌合P1G10重链cDNA插入物(由信号序列的起始子ATG至终止子TGA)如下显示为SEQ ID NO：146：
1 ATGGGTTGGA TCTGTATCTT TCTATTCTTG GTGGCAGCTG CCCAAAGTGC
51 CCAAGCACAG ATCCAGTTGG TGCAGTCTGG ACCTGACCTG AAGAAGCCTG
101 GAGAGACAGT CAAGATCTCC TGCAAGGCTT CTGGGTATAC CTTCACAAAC
151 CATGGAATGA ACTGGGTGAA GCAGGCTCCA GGAAAGGATT TAAAGTGGAT
201 GGGCTGGATA AACACCAACA CTGGAGAGCC AACATATGCT GATGACTTCA
251 AGGGACGGTT TGCCTTCTCT TTGGAAACCT CTGCCAGCAC TGCCTATTTG
301 CAGATCAACA ACCTCAAAAA TGAGGACACG GCTACATATT TCTGTGCAAG
351 TCCCCTCTAC TATAGGAACG GGCGATACTT CGATGTCTGG GGCGCAGGGA
401 CCACGGTCAC CGTCTCCTCA GCTTCCACCA AGGGCCCATC CGTCTTCCCC
451 CTGGCGCCCT GCTCCAGATC TACCTCCGAG AGCACAGCCG CCCTGGGCTG
501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG
551 GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA
601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG
651 CACGAAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG
701 TGGACAAGAG AGTTGAGTCC AAATATGGTC CCCCATGCCC ACCGTGCCCA
751 GCACCTGAGT TCCTGGGGGG ACCATCAGTC TTCCTGTTCC CCCCAAAACC
801 CAAGGACACT CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG
851 TGGACGTGAG CCAGGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAT
901 GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTTCAA
951 CAGCGCGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC
1001 TGAACGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCGTCC
1051 TCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAGCCACA
1101 AGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCAGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA
1151 GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG
1201 TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT
1251 CCTCGATTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAGGCTA ACCGTGGACA
1301 AGAGCAGGTG GCAGGAGGGG AATGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG
1351 GCTCTGCACA ACCACTACAC ACAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCTGGGTTG
[0679]由上述序列编码的预测的成熟chP1G10重链蛋白序列如下显示为SEQ ID NO：147：
1 QIQLVQSGPD LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKDLKWMGW
51 INTNTGEPTY ADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED TATYFCASPL
101 YYRNGRYFDV WGAGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV
151 KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTK
201 TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE SKYGPPCPPC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNSA
301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLG
[0680]鼠可变区为残基1-121，人S228P/T299AIgG4重链恒定区为残基122-457。
[0681]预测的成熟P1G10重链可变区(属于鼠kappa亚组V)的序列如下显示为SEQ ID NO：113，其CDRs带有下划线：
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGSVKLLIYY
51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GKTLPWTFGG
101 GTKLEIK
[0682]构建嵌合P1G10轻链cDNA的表达载体，并测序确认其cDNA插入物。嵌合P1G10轻链cDNA插入物(由信号序列的起始子ATG至终止子TAG)如下显示为SEQ ID NO：148：
1 ATGAGGTCCC CTGCTCAGTT TCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG
51 TGCCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT
101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGT
151 AATTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGATCTG TTAAACTCCT
201 GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG
251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAA
301 GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAAAGACGC TTCCGTGGAC
351 GTTCGGTGGA GGCACCAAGC TGGAAATCAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT
401 CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC
451 TCTGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA
501 GTGGAAGGTG GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA
551 CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG
601 CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC
651 CCATCAGGGC CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT
701 GTTAG
[0683]由上述序列编码的预测的成熟chP1G10轻链蛋白序列如下显示为SEQ ID NO：149：
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGSVKLLIYY
51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GKTLPWTFGG
101 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
201 LSSPVTKSFN RGEC
[0684]鼠可变区为如上的残基1-107，而人kappa恒定区为上述序列的残基108-214。
[0685]将chP1G10重链表达载体和chP1G10轻链表达载体共转染进入293-EBNA细胞，并测试转染细胞的抗体分泌和特异性(将空载体和hu5c8-S228P/T299A IgG4(分子克隆的CD40L-特异性单抗)-转染的细胞作为对照)。对条件培养基的Western印迹分析(以抗-人重和轻链抗体展开)显示chP1G10-转染的细胞合成并有效分泌重和轻链。对来自转染细胞的条件培养基染色的表达IGF-1R-的MCF7人哺乳动物腺癌细胞的FACS分析显示ch P1G10抗体以可滴定剂量响应结合，而来自于mock-和hu5c8-转染细胞的调节培养基未能对MCF7细胞染色(通过PE-结合的抗-人重和轻链抗体检测)。以ch P1G10重链表达载体和ch P1G10轻链表达载体共转染CHO细胞以生成表达嵌合P1G10-糖苷化huIgG4，kappa单抗的稳定系。抗-IGF-1R单抗P1A2.2B11免疫球蛋白可变区的克隆
[0686]成熟P1A2重链可变区(属于鼠亚组II(A))的预测序列如下显示为SEQ ID NO：48：
1 QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKGLKWMGW
51 NTSTGEPTYA DDFKGRFAFS LETSASTAFL QINNLKNEDT ASYFCASPLY
101 YMYGRYIDVW GAGTAVTVSS
[0687]该P1A2与P1G10(均来自于融合5)的重链具有92.6％的一致性，并带有一个FR1，一个FR2，两个CDR2，两个FR3，两个CDR3，以及1个FR4的差异。如下显示了P1A2(上部行)和P1G10(下部行)重链可变区的比对：
1 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNHGMNWVKQAPGKGLKWMGW 50(SEQ ID NO：48)
|||||||||：||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||
1 QIQLVQSGPDLKKPGETVKISCKASGYTFTNHGMNWVKQAPGKDLKWMGW 50(SEQ ID NO：58)
· · · · ·
51 .NTSTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLKNEDTASYFCASPL 99(SEQ ID NO：48)
||·
|||||||||||||||||||||||||：||||||||||||·|||||||
51 INTNTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCASPL 100(SEQ ID NO：58)
· ·
100 YYMYGRYIDVWGAGTAVTVSS 120(SEQ ID NO：48)
|| ||| ||||||| |||||
101 YYRNGRYFDVWGAGTTVTVSS 121(SEQ ID NO：58)
[0688]嵌合P1A2重链的表达载体可参照上述方法构建。由该质粒(SEQ ID NO：150)编码的chP1A2重链的预测序列为：
1 QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKGLKWMGW
51 NTSTGEPTYA DDFKGRFAFS LETSASTAFL QINNLKNEDT ASYFCASPLY
101 YMYGRYIDVW GAGTAVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK
151 DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT
201 YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT
251 LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSAY
301 RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT
351 LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
401 DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
[0689]鼠可变区为残基1-120，人S228P/T299A IgG4重链恒定区为残基121-456。
[0690]预测的成熟P1A2重链可变区(属于鼠kappa亚组V)的序列如下显示为SEQ ID NO：108，其CDRs带有下划线：
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTIKLLIYY
51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDFATYFCQQ GKTLPWTFGG
101 GTKLEIK
[0691]该P1A2与P1G10(均来自于融合5)的轻链具有97.2％的一致性，带有两个FR2和一个FR3的差异，但具有一致的CDRs。如下显示了P1A2(上部行)和P1G10(下部行)轻链可变区的比对：
1 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTIKLLIYY 50(SEQ ID NO：108)
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||·：||||||
1 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGSVKLLIYY 50(SEQ ID NO：113)
· · · · ·
51 TSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGKTLPWTFGG 100(SEQ ID NO：108)
|||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||
51 TSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGKTLPWTFGG 100(SEQ ID NO：113)
101 GTKLEIK 107(SEQ ID NO：108)
|||||||
101 GTKLEIK 107(SEQ ID NO：113)
[0692]构建嵌合P1A2轻链cDNA的表达载体，并测序确认其cDNA插入物。嵌合P1A2轻链cDNA插入物(由信号序列的起始子ATG至终止子TAG)如下显示为SEQ ID NO：151：
1 ATGAGGTCCC CTGCTCAGTT TCTTGGAGAC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG
51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTATCTGCCT
101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC
151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTA TTAAACTCCT
201 GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG
251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAA
301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTAAAACGC TTCCGTGGAC
351 GTTCGGTGGA GGCACCAAGC TGGAAATCAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT
401 CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC
451 TCTGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA
501 GTGGAAGGTG GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA
551 CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG
601 CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC
651 CCATCAGGGC CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT
701 GTTAG
[0693]由pCN379编码的预测的成熟chP1A2轻链蛋白序列如下显示为SEQ ID NO：152：
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTIKLLIYY
51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDFATYFCQQ GKTLPWTFGG
101 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
201 LSSPVTKSFN RGEC
[0694]鼠可变区为如上的残基1-107，而人kappa恒定区为上述序列的残基108-214。
抗-IGF-1R单抗P1E2.3B12免疫球蛋白可变区的克隆
[0695]P1E2可变区的克隆参照上述方法进行。
实施例19
IGF-1R Fab抗体以高亲和性结合可溶性IGF-1
[0696]方法：M13-C06，M14-C03和M14-G11与可溶性IGF-1R的结合活性通过表面等离子共振测定。将生物素化PENTA-His抗体(Qiagen，Inc.)固定化至涂覆了链霉素的传感芯片。可溶性/嵌合IGF-1R-His胞外区结构域(R&D systems，Inc.)通过PENTA-His抗体在表面捕获。进行M13-C06，M14-C03或M14-G11 Fabs(0.5nM-1000nM)的第二次注射。三次短注射pH4.0的醋酸盐以再生表面。
[0697]结果：M13-C06 Fa以KD＝1.3nM的高亲和性结合重组IGF-1R，而M14-G11 Fab以KD＝4.0nM的亲和性结合，M14-C03Fab以KD＝4.9nM的亲和性结合(数据未显示)。
实施例20
全人源IGF-1R抗体对IGF-1和IGF-2刺激的肿瘤细胞生长的抑制
[0698]方法：抗体对体内肿瘤生长的作用通过CELLTITER-GLOTM(Promega Corporation，2800 Woods Hollow Rd.，Madison，WI 53711 USA)测定进行检测。将含10％ FBS的RPMI培养基中的BxPC3细胞培养于Wallac96孔底部洁净TC-处理平板上(8000细胞/微孔)。24小时后，将培养基替换为无血清条件，并添加不同浓度(100nM，10nM，1nM和0.1nM)的抗体。30分钟孵育后，添加100ng/ml的IGF-1或IGF-2。继续孵育细胞48小时，溶解并通过CELL TITER-GLOTM试剂测定ATP存在的数量。抑制计算为[1-(Ab-SFM)/(IGF-SFM)] x 100％。亚型匹配抗体IDEC-151(人G4)抗体被用作阴性对照。
[0699]结果：全人源抗体M13-C06.G4.P.agly，M14-G11.G4.P和M14-C03.G4.P.agly抑制重组人源IGF-1和IGF-2驱动的BxPC3(人胰腺癌)细胞增殖(图16)。在人肺癌细胞系NCI-H23(图17；M13-C06.G4.P.agly抗体)和人肺癌细胞系A549(图18；M13-C06.G4.P.agly抗体)中可得到这些抗体对重组人源IGF-1和IGF-2驱动细胞增殖的类似的生长抑制结果。在所有这些细胞系中M14-G11.G4.P，agly显示了与M14.G11.G4.P型类似的结果(数据未显示)。
实施例21
全人源IGF-1R抗体对体外肿瘤细胞生长的细胞周期阻滞
[0700]方法：全人源IGF-1R抗体阻滞细胞周期进展的能力可通过FACS分析进行评估；检测培养的BxPC3细胞中碘化吡啶的结合。将BxPC3细胞(4 x 105细胞/微孔)涂布于6孔板。24小时后，将细胞转换至无血清培养基(SFM)继续维持24小时。然后向培养基中添加终浓度133.3nM(20微克/ml)的IGF-1R抗体和终浓度200ng/ml的IGF-1。24小时后，将细胞胰蛋白酶化，并以乙醇固定。在FACS分析前以碘化吡啶(PI)对DNA成分染色。亚型匹配抗体IDEC-151(人G4)被用作阴性对照。
[0701]结果：全人源抗体M13-C06.G4.P.agly(表11)，M14-G11.G4.P.agly和M14-C03.G4.P.agly在细胞周期的G0/G1期阻滞了BxPC3肿瘤细胞。
表11：
实施例22
胰腺癌模型中的体内肿瘤生长抑制
[0702]方法：在采用BxPC3(胰腺癌)细胞的异种移植胰腺癌模型系统中评估M13.C06.G4.P.agly抗体的单种药剂体内效力。以2 x 106细胞接种CB17SCID小鼠并监测肿瘤生长。治疗开始时的平均肿瘤体积为～200mm3。腹腔(i.p.)施用60，30和15mg/kg的M13.C06.G4.P.agly抗体，每周一次，施用5周。亚型匹配抗体IDEC-151(人G4)作为阴性对照以60mg/kg施用，每周一次，施用5周。在接种后的指定间隔取出肿瘤(图20)并测量总体肿瘤体积。
[0703]结果：全人源M13.C06.G4.P.agly抗体以剂量依赖方式抑制肿瘤生长(图20)。以60，30和15mg/kg每周施用持续5周的施用证实了该抗体具有统计学显著性的单种药剂效力。此外，该抗体在低达每周一次15mg/kg的剂量下仍有效力(图20)。
实施例23
肺癌模型中的体内肿瘤生长抑制
[0704]方法：在采用A549(肺癌)细胞的异种移植肺癌模型系统中评估M13.C06.G4.P.agly抗体的单种制剂体内效力。以3-5 x106细胞接种CB17 SCID小鼠并监测肿瘤生长。治疗开始时的平均肿瘤体积为～150mm3。腹腔(i.p.)施用30和15mg/kg的M13.C06.G4.P.agly抗体，每周两次，施用4周。亚型匹配抗体IDEC-151(人G4)作为阴性对照以30mg/kg施用。在接种后的指定间隔取出肿瘤(图21)并测量总体肿瘤体积。
[0705]结果：全人源M13.C06.G4.P.agly抗体以剂量依赖方式抑制肿瘤生长(图21)。以30和15mg/kg剂量持续4周的施用证实了该抗体具有统计学显著性的单种制剂效力(图21)。在该模型中进行的附加研究显示C06在低达每周注射7.5mg/kg的剂量下仍有效力(数据未显示)。
实施例24
采用联合疗法对肿瘤生长的体内抑制
[0706]方法：在BxPC3异种移植模型中测试M13.C06.G4.P.agly抗体联合吉西他滨(一种常用于治疗非小细胞肺癌，胰腺，膀胱和乳腺癌的药物)在抑制肿瘤生长中的效力。联合参照当前护理标准(即，每3天80mg/kg，持续4周)施用的吉西他滨评估M13.C06.G4.P.agly抗体每周两次腹腔(i.p.)施用30mg/kg持续7周的效力(数据未显示)或每周一次施用60mg/kg持续5周的效力(图22)。单独的吉西他滨，单独的抗体，以及单独的传递溶媒的假注射施用被用作阴性对照。治疗开始时的肿瘤体积为约200mm3。
[0707]结果：M13-C06.G4.P.agly抗体和吉西他滨作为单独的制剂(即，单独施用)显示了类似的效力。联用吉西他滨时，每周两次施用30mg/kg M13-C06.G4.P.agly抗体的方案(数据未显示)或每周一次的60mg/kg抗体的方案(图22)显示了与单独制剂治疗相比额外的效力。此外，以15mg/kg联用同样显示了额外的效力(数据未显示)。
实施例25
全人源IGF-1R抗体结合食蟹猴成纤维细胞系
[0708]方法：M13.C06.G4.P.agly抗体结合至由食蟹猴建立的成纤维细胞系。该成纤维细胞系由皮肤切片中生成。抗体结合可通过以解离缓冲液使成纤维细胞脱离并在4℃生物素化的M13.C06.G4.P.agly中孵育45分钟进行评估。洗涤细胞后，添加链霉素-PE并在4℃暗处再度孵育30分钟。洗涤细胞，添加200ul冷PBS，然后以1％甲醛固定并轻柔涡旋。通过FACS分析评估抗体结合。
[0709]结果：M13-C06.G4.P.agly抗体以浓度依赖方式结合食蟹猴成纤维细胞系上表达的IGF-1R(图23)。
实施例26
I部分：全人源M13.C06.G4.P.agly的生物特征的总结
[0710]表11和12显示了评估的全人源M13.C06.G4.P.agly抗体的生物特征。这些特性通过此处的方法，实验和实施例确认并/或通过本领域普通技术人员已知或实施的方法和实验常规确定。
表11：
M13.C06.G4.P.agly抗体血清半衰期
[0711]通过在SCID小鼠中施用3mg/kg M13.C06.G4.P.agly抗体(单剂量水平，腹腔注射)进行不带肿瘤小鼠体内的药代动力学(PK)研究。通过IgG特异性ELISA检测SCID小鼠血清中的M13.C06.G4.P.agly抗体。将山羊抗-人IgG(100ng/微孔)固定化至immulon平板。以两倍系列稀释液从1:25开始一式三份滴定血清。以山羊抗-人Kappa-HRP测定结合。该研究的结果显示该小鼠模型系统中的血清半衰期为～11.5天(数据未显示)。
[0712]M13.C06.G4.P.agly腹腔注射带MCF-7肿瘤动物(30ug/kg的抗体)和带BxPC3肿瘤动物(15ug/kg的抗体)后评估其血清浓度。以ELISA检测M13.C06.G4.P.agly抗体与固定化至96孔板(IMMULON2 HB，Dynax Technologies，Inc.，Cat.#3455)的山羊抗-人IgG(100ng/微孔)的结合。自10ug/ml开始以3倍系列稀释液滴定制作标准曲线。自1:25稀释开始以2倍系列稀释液滴定血清。以山羊抗-人Kappa-HRP测定M13.C06.G4.P.agly抗体。通过4.3LS版SOFTMAX PRO软件包(Molecular Devices Corp.)测定抗体浓度。
[0713]所观察的平均血清浓度如下所示：
[0714]同样在10mg/kg和25mg/kg剂量注射的食蟹猴中考察M13.C06.G4.P.agly抗体的药代动力学，其中观察得到的血清半衰期为～10至12天(数据未显示)。
[0715]表12和13显示了在含有IGF-1或IGF-2(表12)或10％胎牛血清(FCS)或胎牛血清(FBS)(表13)的细胞培养基中添加M13-C06.G4.P.agly抗体时对各种肺，胰腺和结肠肿瘤细胞系的体外细胞生长所观察到的剂量依赖性抑制(抑制百分比)。
表12：
表13：
II部分：抗体亲和性检测
目标：
[0716]目标为检测IGF-1R抗体的结合亲和性。
方法：
M13-C06，M14-C03和M14-G11 Fabs的制备
[0717]M13-C06，M14-C03和M14-G11 Fabs抗体可通过木瓜蛋白酶(Pierce Cat.No.20341)消化制备得到。以20mM pH7.0的磷酸钠；10mM EDTA；20mM半胱氨酸洗涤木瓜蛋白酶树脂。将抗体和木瓜蛋白酶树脂在pH7.0的500mM EDTA，100mM半胱氨酸中混合，在37℃水浴中消化三小时，然后在反置振荡器上在室温下混合过夜。通过分析型尺寸排阻色谱(SEC)测定各消化的完成度。以烧结玻璃漏斗过滤器从消化蛋白中去除树脂，并以pH5.0的20mM醋酸盐洗涤。采集流出物并以20mM pH5.0的醋酸盐稀释10倍。以S-SEPHAROSETM阳离子交换色谱采用线性盐梯度纯化Fab片段。对洗脱组分进行分析SEC，汇集目标组分并透析进入PBS。然后将Fabs烷基化以抑制可导致(Fab)2产生的铰链二硫化物的再次形成。可通过将pH 8.5的1M Tris；200mM碘乙酸在Fab溶液中稀释10倍进行烷基化。将混合物在反置振荡器上于室温下孵育二十分钟，然后彻底透析进入1xPBS。使用制备型尺寸排阻色谱对各个Fab进行最终的纯化。
表面等离子体共振(SPR)亲和性测定
[0718]所有的表面等离子共振(SPR)实验在设置为25℃，并以HBS-EP(Biacore，Cat.No.BR-1001-88)为运行缓冲液的Biacore3000上进行。通过注射含于HBS-EP缓冲液的500nM生物素标记的抗-HisTag抗体(生物素-PENTA-His，Qiagen Cat.No.34440)将其在芯片(Cat.No.BR-1000-32)表面固定化至饱和。通过以2μL/分钟注射20μL 40nM蛋白在生物素-PENTA-His表面捕获重组人IGF-1R-His10(R&D Systems，Cat.No.305-GR-050)。在IGF-1R注射后，将流速上升至20μL/分钟。再次注射130μL抗-IGF-1R抗体或Fab以考察与受体的相互作用。将各个抗体和Fab由64nM至0.5nM系列稀释以获得浓度依赖型动力学结合曲线。通过以20μL/min注射3 x 10μL pH 4.0的10mM醋酸盐再生各个注射系列。各条曲线以(1)从无IGF-1R的链霉素表面获得的数据，以及(2)从先注射IGF-1R然后注射HBS-EP缓冲液得到的数据进行双重参考。各个抗体和Fab的浓度系列被拟合至生产商的BiaEvaluation软件中所提供的1:1结合模型。
结果
[0719]重组抗-IGF-1R抗体M13-C06，M14-C03和M14-G11通过上述的表面等离子体共振测试了与IGF-1R的结合。所有三种抗体均证实与该受体强烈结合。实验中观察到了各个抗体(64nM系列稀释至0.5nM)与固定化重组人IGF-1R的浓度依赖性结合(数据未显示)。采用不同浓度时抗体在IGF-1R涂覆表面积累的速率以及在采用纯缓冲液时它们解离的速率通过将数据拟合至1:1结合模型进行考察。计算得到近似的动力学速率常数和平衡解离常数(表14)。
表14
| 抗体/Fab | KD(M) | kd(s-1) | ka(M-1s-1) |
| M13-C06_Ab | 1.3e-10 | 2.5e-4 | 1.8e6 |
| M14-C03_Ab | 3.6e-10 | 2.0e-4 | 5.7e5 |
| M14-G11_Ab | 1.1e-10 | 1.1e-4 | 1.0e6 |
表15
| 抗体/Fab | KD(M) | kd(s-1) | ka(M-1s-1) |
| M13-C06_Fab | 1.3e-9 | 1.2e-3 | 8.8e5 |
| M14-C03_Fab | 4.9e-9 | 9.4e-4 | 1.9e5 |
| M14-G11_Fab | 4.0e-9 | 1.2e-3 | 3.0e5 |
[0720]为了获得分离的亲和性，按如上所述通过木瓜蛋白酶消化生成各个抗体的Fab片段。由于单个抗原结合位点的存在，Fabs在与全长抗体所述相同的方式应用于IGF-1R受体时显示出一致的单相结合和解离曲线(数据未显示)。表15提供了各Fab对IGF-1R的亲和性。
实施例27
I部分：M13.C06.G4.P.agly抗体与其它IGF-1R抗体相比具有独特的表位结合特征
[0721]通过交叉竞争抗体结合研究比较M13.C06.G4.P.agly与其它IGF-1R抗体的IGF-1R抗体结合表位。参见，图24。对未标记的竞争抗体与五种不同标记的抗体交叉竞争结合可溶性IGF-1R的能力进行了分析。所用的五种标记的抗体为生物素标记的M13.C06.G4.P.agly(＂生物素-C06＂)，生物素标记的M14-G11(＂生物素-G11＂)，zenon标记的P1B10-1A10(＂Zenon-O＂)，zenon标记的20C8-3B4(＂Zenon-M＂)，或是zenon标记的IR3抗体(＂Zenon-IR3＂)。参见，图24。
[0722]抗体通过来自Pierce Chemical的生物素化试剂盒(#21335)进行生物素标记。
[0723]通过来自Molecular Probes的小鼠IgG标记试剂盒(Z25000)进行Zenon标记。
+++++＝抗体相对其自身的结合竞争(90-100％)
++++＝70-90％竞争
+++＝50-70％竞争
++＝30-50％竞争
+＝10-30％竞争
+/-＝0-10％竞争
N/A＝无结果
[0724]该分析的结果显示M13.C06.G4.P.agly和M14.C03.G4.P.agly抗体结合IGF-1R的相同或相似区域，这一点不同于所有其它测试的抗体。特别地，仅生物素标记的M13.C06.G4.P.agly抗体能与未标记的M13.C06.G4.P.agly或未标记的M14.C03.G4.P.agly有效竞争与IGF-1R的结合。还应当注意M13.C06.G4.P.agly不与受到充分研究的IR3抗体交叉竞争。因此，这两个抗体特别地结合不同IGF-1R表位。
II部分：M13-C06通过结合至FnIII-1区N-末端区的抗体变构性降低IGF-1对IGF-1R的结合亲和性
目标：
[0725]该目标为阐明M13-C06抗体在IGF-1R上的结合表位，以及对IGF-1/IGF-2结合IGF-1R的抑制背后的机制。
背景：
[0726]IGF-1R由6个结构域组成(图29A)。据报导在IGF1-R的前三个结构域，即L1(亮氨酸富集重复区1)，CR(半胱氨酸富集重复区)，和L2，以及在结构域5的肽环区(FnIII-2，纤维连接蛋白型在结构域2中)中的突变对IGF-1和IGF-2结合有负面影响(Whittaker 2001；Sorensen 2004)。此处，我们证实了M13-C06抗体并未通过与生长因子结合位点竞争性相互作用阻断IGF-1和IGF-2的结合，而是结合FnIII-I并变构性抑制IGF-1/IGF-2信号转导。FnIII-I被认为可以促进IGF-1R和INSR的受体同源二聚化(McKern 2006)，且在结合配体时，通过四级结构变化将激活信号通过跨膜区传递至C-末端酪氨酸激酶区。由该实施例所得的数据提示M13-C06抗体可抑制由IGF-1/IGF-2诱导的可导致下游受体信号转导的构型变化。
方法：
M13-C06抗体存在和缺失时的IGF-1/IGF-1R结合实验
[0727]多种构建体被用于考察抗体/IGF-1与IGF-1R受体或胰岛素受体的结合：人IGF-1R(1-902)-His10(称为hIGF-1R-His10，来自R&D systems)，人INSR(28-956)-His10(称为INSR，来自R&Dsystems)，人IGF-1R(1-903)-Fc(称为hIGF-1R-Fc，来自Biogen Idec)，人IGF-1R(1-462)-Fc(称为hIGF-1R(1-462)-Fc，来自Biogen Idec)，以及小鼠IGF-1R(1-903)-Fc(称为mIGF-1R-Fc，来自Biogen Idec)。“His10”指在构建体C-末端的10-残基组氨酸标记。“Fc”指C末端人IgG1-Fc标记。
[0728]人IGF-1购自Millipore。IGF-1对hIGF-1R-His10的亲和性采用表面等离子体共振(SPR)进行测定。通过注射含于HBS-EP缓冲液的500nM生物素标记的抗-HisTag抗体(生物素-PENTA-His，Qiagen Cat.No.34440)将其在芯片(Cat.No.BR-1000-32)表面固定化至饱和。对于各个感应图，可通过以2μL/分钟注射20μL 40nM蛋白在生物素-PENTA-His表面捕获hIGF-1R-His10(描述于实施例5(II部分))。在hIGF-1R-His10注射后，将流速上升至20μL/min。再次注射130μL含IGF-1溶液以考察生长激素与受体的相互作用。将IGF-1由64nM至0.125nM系列稀释以获得浓度依赖型动力学结合曲线。通过以20μL/min注射3 x 10μL pH 4.0的10mM醋酸盐再生各个注射系列。各条曲线以(1)从无PENTA-His抗体的链霉素表面获得的数据，以及(2)从先注射hIGF-1R-His10然后注射HBS-EP缓冲液得到的数据进行双重参考。IGF-1的浓度系列被拟合至生产商的BiaEvaluation软件中所提供的1:1结合模型。在运行缓冲液，hIGF-1R-His10注射缓冲液和IGF-1注射缓冲液中存在和缺失400nMM13-C06的情况下各得到一组数据，共获得两组数据。
IGF-1/IGF-1R/M13-C06抗体三元复合物的Pull-down和Western印迹分析
[0729]以1xPBS洗涤重悬浮的蛋白A/G珠(300μl，Pierce Cat.No.20422)，并在旋转振荡器上与1.0mg M13-C06在1.5mlEppendorf管中室温混合两小时。在单独的管中将12μghIGF-1R-His10(R&D systems)和460ng人IGF-1(ChemiconInternational Cat.No.GF006)室温下混合(1:1蛋白:蛋白比例)一小时。以PBS洗涤结合M13-C06的蛋白A/G，并与hIGF-1R-His10/IGF-1混合物在室温下孵育30分钟。以PBS洗涤结合蛋白的蛋白A/G，然后以300μL pH3.0的100mM甘氨酸洗脱结合蛋白。对于阴性对照，忽略添加12μg人IGF-1R(1-902)-His10。以抗-人IGF-1抗体(兔抗-人IGF-1生物素，USBiological Cat.No.I7661-01B)和抗-人IGF-1R抗体(IGF-1Rα 1H7，Santa Cruz Biotechnology Cat.No.sc-461)作为一抗，然后以HRP-标记的链霉素(Southern Biotech Cat.No.7100-05)和HRP-标记的山羊抗-小鼠IgG(USBiological Cat.No.11904-40J)作为二抗通过Western印迹检测洗脱的蛋白。为了证明IGF-1/IGF-1R/M13-C06形成三元复合物的能力，该实验中所用的IGF-1和IGF-1R的浓度均超过了(>15倍以上)这些蛋白的正常生理水平(特别是血清中的IGF-1)以及IGF-1R/IGF-1的测得平衡解离常数。例如，参见，Hankinson等人.，1997。
IGF-1R(1-462)-Fc的构建以及相对全长受体胞外区结构域的比较抗体结合研究
[0730]人IGF-1R的IGF-1/IGF-2结合区，L1-CR-L2(残基1-462)的构建已有报导(McKern 1997)。利用该信息，我们将人IGF-1R残基1-462(沿着N-末端信号序列)亚克隆进入同样用于生产全长人胞外区结构域(残基1-903，hIGF-1R-Fc)的内部PV90载体。通过已有描述的方法(Brezinsky 2003)促进在CHO中的表达。如针对其它Fc-融合蛋白的已有描述(Demarest 2006)，可通过将CHO上清液通过蛋白A亲和柱来纯化蛋白。该蛋白构建体被称为hIGF-1R(1-462)-Fc。
[0731]M13-C06，M14-C03和M14-G11抗体结合hIGF-1R(1-462)-Fc和全长胞外区结构域构建体hIGF-1R-Fc的能力可通过采用Biacore3000的SPR进行测定。该仪器被设置为25℃，且运行缓冲液为pH 7.2的HBS-EP(Biacore，Cat.No.BR-1001-88)。参照Biacore提供的方法使用标准的NHS/EDC-胺反应化学品将全人源抗体M13-C06，M14-C03和M 14-G11以～10,000RU固定化至Biacore CM5研究级SensorChip(Cat.No.BR-1000-14)表面。该抗体在10mM醋酸盐pH 4.0缓冲液中被稀释至40μg/mL以进行固定化。为了考察hIGF-1R-Fc和hIGF-1R(1-462)-Fc对各个人源抗体的结合和解离的相对动力学，可向sensorchip表面注射提高浓度的各种受体构建体。hIGF-1R-Fc浓度介于1.0nM至100nM，而hIGF-1R(1-462)-Fc浓度系列介于1.0nM至2μM。所有的抗体表面均以pH2.0的100mM甘氨酸进行可靠地再生。重复再生不会导致任意抗体表面的活性损失。流速为20μl/min。
表位的定位突变
[0732]用于探测IGF-1R上M13-C06抗体的表位的突变体选择基于如下发现：在Biacore和FRET结合实验中M13-C06对小鼠IGF-1R的结合亲和性明显减少或不可测得(实施例5(III部分))。小鼠和人IGF-1R具有95％的基本氨基酸序列一致性。人IGF-1R和人INSR具有57％的一致性(73％相似性)。我们鉴定了胞外区结构域中小鼠和人IGF-1R之间不同的33个残基(表16)。这些残基中有二十个为突变的靶标，因为根据最近的INSR晶体结构(pdbcode 2DTG，McKern 2006)，INSR胞外区结构域中的同源位置被暴露至溶剂。可接近表面面积可通过StrucTools(http://molbio.info.nih.gov/structbio/basic.html)以
的探测半径进行计算。四个不在INSR表面的附加残基也可选择进行突变，因为它们位于经证明对IGF-1/IGF-2结合非常重要的FnIII-2结构域的非结构化环区内(Whittaker 2001；Sorensen 2004)。表17显示了选择用于表位定位研究的24个突变。
表16：人和小鼠IGF-1R之间的氨基酸差异。各个残基位置的溶剂可及性基于同源INSR胞外区结构域的公开有效结构进行测定。以粗体/斜体显示的残基上大于30％的表面面积暴露至溶剂，并可通过突变来筛选M13-C06的IGF-1R表位。
| 残基# | 人IGF1R | 小鼠IGF1R | 人INSR | IRpdb# | 溶剂可及性％ |
| 28 | Y | F | H | 32 | 33.3 |
| 125 | V | I | I | 131 | 0 |
| 156 | M | L | A | 163 | 73.9 |
| 188 | T | V | I | 195 | 89.3 |
| 210 | S | H | S | 217 | 56.1 |
| 211 | A | T | Q | 218 | 54 |
| 214 | N | D | D | 221 | 25.7 |
| 215 | D | N | P | 222 | 20.4 |
| 217 | A | T | K | 224 | 57.3 |
| 227 | A | K | D | 234 | 78.9 |
| 237 | N | G | P | 244 | 90.1 |
| 257 | L | P | H | 263 | 19.2 |
| 258 | S | N | H | 264 | 56.5 |
| 264 | E | D | H | 275 | 38.3 |
| 271 | G | D | N | 282 | 72.5 |
| 285 | G | S | S | 296 | 100 |
| 286 | S | T | S | 297 | 67.2 |
| 303 | E | G | H | 313 | 64.5 |
| 326 | F | L | I | 335 | 25.5 |
| 405 | D | N | S | 415 | 67.9 |
| 411 | I | V | T | 421 | 0.5 |
| 412 | K | R | T | 422 | 34.7 |
| 413 | A | S | Q | 423 | 58.2 |
| 464 | H | R | K | 474 | 76.3 |
| 471 | S | W | S | 481 | 26.4 |
| 531 | D | E | Q | 541 | N/A |
| 532 | V | G | N | 542 | N/A |
| 605 | S | T | S | 615 | N/A |
| 650 | I | V | S | N/A | N/A |
| 665 | E | D | 插入物 | N/A | N/A |
| 739 | A | V | F | N/A | N/A |
| 741 | L | F | P | N/A | N/A |
[0733]24个突变体表位定位库可采用Stratagene定点突变试剂盒参照生产商的方案诱变野生型hIGF-1R-Fc PV-90质粒构建得到。各个突变体(或对于SD004，SD011，SD014，SD016和SD019库成员为双突变体)在PV-90载体中的整合可通过我们的内部DNA测序装置进行确认。质粒可分别通过Qiagen小量制备试剂盒和Qiagen无内毒素大量制备试剂盒进行小量制备和大量制备。将200μg各种突变质粒通过PolyFect转染试剂盒(Qiagen)以2 x 106细胞/ml瞬时转染进入100mL HEK293 T细胞，从而向培养基分泌可溶性蛋白。将细胞在DMEM(IvrineScientific)，10％ FBS(低IgG牛血清，Invitrogen-通过流经20mL蛋白A柱进一步去除牛IgG)中CO2孵育器中37℃培养。7天后，通过1200rpm离心收集含各种IGF-1R-Fc突变体的上清液，并以0.2μm过滤器过滤。通过将上清液流经1XPBS预平衡的1.2mL蛋白A Sepharose FF柱对各个突变体进行亲和纯化。采用pH3.0的0.1M甘氨酸从柱上洗脱突变体，以pH8.5的1M Tris，0.1％ Tween-80中和，并通过VivaSpin 6 MWCO 30,000离心浓缩设备(Sartorius，Cat.No.VS0621)浓缩至～300μL。
IGF-1R突变体的Western印迹分析
[0734]使用Xcell SureLock Mini Cell槽(Invitrogen Cat.No.EI0001)参照标准的生产商方案在4-20％ Tris-甘氨酸凝胶上运行hIGF-1R-Fc突变体样本。采用iBlot干印迹系统(Invitrogen Cat.No.IB1001)和转移架(Invitrogen Cat.No.IB3010-01或3010-02)参照标准生产商方案样本将样本转移至硝化纤维。在4℃ 25ml的PBST(含5mg/ml脱脂奶粉)中将膜封闭过夜。封闭后，以25ml PBST在室温下将膜洗涤5分钟。将膜与一级抗-IGF-1Rβ抗体(Santa CruzBiotechnology Cat.No.sc-9038)以1:100的比例在10ml PBST中室温孵育一小时。然后将膜在25ml的PBST中洗涤三次，每次5分钟。为进行检测，将膜与二级HRP-结合的山羊抗-兔-Fc抗体(USBiological Cat.No.I1904-40J)以1:1000的比例在10ml PBST中室温孵育一小时。然后将膜在25ml的PBST中洗涤三次，每次5分钟，然后在25ml的PBST中一次洗涤20分钟。采用Amersham ECLWestern印迹分析系统(GE Healthcare Cat.No.RPN2108)根据标准的生产商方案进行蛋白条带检测。
IGF-1R-Fc突变体库的Biacore分析
[0735]由于两个单独同源二聚体区(IGF-1R和IgG1-Fc)的结合引入的高度多价性质，mIGF-1R-Fc和hIGF-1R-Fc均以高度的表观亲和性结合上述的M13-C06，M14-C03和M14-G11表面。为了区分hIGF-1R-Fc和M13-C06的实际高亲和性结合与mIGF-1R-Fc和M13-C06的低亲和性结合，可将受体-Fc融合物捕获于M13-C06sensorchip表面，然后进行附加的可溶性M13-C06 Fab结合。受体-Fc构建体可通过以1μl/min的流速注射60μL亲和纯化的浓缩物质被捕获至M13-C06芯片表面(参照前述方法制备)。在受体-Fc加载步骤完成后，将流速升高至5μl/min。在加载各受体-Fc构建体后注射(50μL)10nM，3nM和1nM浓度的M13-C06 Fab。在各个感应图的最后，流速被升高至30μl/min，并通过2 x 10μL注射pH 2的0.1M甘氨酸使芯片表面再生。
用于IGF-1R-Fc突变体筛选的时间分辨荧光共振能量转移(tr-FRET)测定
[0736]在384孔微量滴定板(白色，来自Costar)中将0.25-0.5μg开始系列稀释的突变受体(25μl)与0.05μg IGF1R-His10-Cy5(12.5μl)和0.00375μg Eu:C06(12.5μl)混合。针对IGF1R-His10-Cy5的结合水平为6.8:1 Cy5:IGF1R-His10，针对Eu-C06为10.3:1 Eu:C06。每个样本的总体积为50μl。将平板在平板振荡器上室温孵育1小时。采用激发波长为340nm，发射波长为665nm的LANCE方案以Wallac Victor2荧光平板读取器(Perkin Elmer)进行荧光检测。所有的数据均拟合至单位点结合模型，并由此测得相应的IC50值。
结果
[0737]在上文的实施例3中证实了M13-C06对IGF-1和/或IGF-2结合hIGF-1R-Fc的抑制。即使在饱和条件下，大部分抗体未能完全抑制IGF-1或IGF-2结合hIGF-1R-Fc。对于M13-C06，我们假设配体结合的抑制可能是非竞争性的或变构性的。为了测试这种假设，我们测定了400nM M13-C06抗体(该抗体对hIGF-1R-His10的亲和性的～4000倍以上)存在或缺失的情况下IGF-1对hIGF-1R-His10的亲和性。采用SPR抗-Histag抗体将hIGF-1R-His10固定化至芯片表面，然后注射上升浓度的IGF-1(至64nM)。在400nM M13-C06抗体存在或缺失的情况下均证实IGF-1结合hIGF-1R-His10。(数据未显示：表面等离子体共振证实400nMM13-C06存在或缺失的情况下均证实hIGF-1结合hIGF-1R-His10。SPR结合期在1400-1800秒之间，而解离期在秒1800-3000之间。当M13-C06缺失时，IGF-1以KD＝17nM(ka＝2.4 x 10-5/M*s)结合hIGF-1R-His10。当400nM M13-C06存在时，IGF-1以KD＝59nM(ka＝7.1 x 104/M*s)结合hIGF-1R-His10)。当M13-C06存在时IGF-1结合hIGF-1R-His10的动力学结合速率常数减少了大约3倍，提示M13-C06变构性减少了配体对受体的亲和性。
[0738]通过采用远超过IGF-1和M13-C06对hIGF-IR-His10的表观亲和性的M13-C06浓度进行hIGF-IR-His10和IGF-1的共免疫沉淀可得到M13-C06不直接与IGF-1竞争结合hIGF-IR-His10的支持证据。Western印迹证实与hIGF-1R-His10混合的IGF-1物质中～70-100％被M13-C06降低，从而证明M13-C06和IGF-1有可能共同结合hIGF-1R-His10以形成三元复合物(数据未显示)。这些结果显示了M13-C06对正常IGF-1血清浓度下的IGF-1结合的变构性，并提示M13-C06的结合位点与IGF-1R配体-结合口袋不重叠。
[0739]接着，我们考察了M13-C06是否结合IGF-1R(L1-CR-L2)的假定配体结合区。我们生成了包含融合至IgG1-Fc的N-末端三个结构域(残基1-462)的平头型受体，并通过表面等离子体共振(SPR)将其结合M13-C06，M14-C03和M14-G11的能力与全长受体胞外区结构域构建体hIGF-1R-Fc的能力相比较。经证实M14-G11可同等结合平头型受体，但M13-C06和M14-C03的结合被大幅减少。(数据未显示：测试了表面固定化M13-C06，M14-C03和M14-G11抗体与浓度为2μM，100nM，30nM，10nM，5nM和1nM的hIGF-1R(1-903)Fc和平头hIGF-1R(1-462)-Fc的结合。SPR结合期在480-960秒之间，而解离期在秒960-1170之间)。M13-C06和M14-C03的残基结合均显而易见；然而，该数据提示这些抗体至少有相当大一部分表位位于配体结合区外的IGF-1R区。
[0740]我们利用鼠IGF-1R不结合M13-C06的事实设计了一个小鼠hIGF-1R-Fc内的突变库以评估IGF-1R上M13-C06结合位点的位置。表17显示了hIGF-1R测试中的各个突变体。Western印迹被用于确认各个hIGF-IR-Fc突变体的表达以及生成标准曲线以估计各个突变体蛋白的相对浓度；以纯化hIGF-1R-Fc作为阳性对照(数据未显示)。
表17：突变对IGF-1R结合M13-C06的作用。SD015被粗体显示，因为它是唯一在两种测定形式中极少或不结合M13-C06的残基。ND＝未测定。
| 突变号 | 单独突变 | Biacore相对RUmax | IC50值(μg/ml) |
| SDWT | 野生型 | 1.0 | 1.5 |
| mIGF1R | - | 0.0 | >100 |
| SD001 | Y28A | 0.6 | 1.0 |
| SD002 | M156A | 1.2 | 0.3 |
| SD003 | T188F | 1.0 | 0.2 |
| SD004 | S210H_A211Q | 0.8 | ND |
| SD005 | A217T | 0.9 | ND |
| SD006 | A227K | 1.7 | 0.2 |
| SD007 | N237G | 1.3 | <0.1 |
| SD008 | S258F | 1.5 | <0.1 |
| SD009 | E264K | 0.6 | 7.7 |
| SD010 | G271D | 0.8 | 0.1 |
| SD011 | G285S_S286T | 1.8 | <0.1 |
| SD012 | E303G | 0.3 | 0.9 |
| SD013 | -D405K | 0.7 | <0.1 |
| SD014 | K412A_A413Q | 0.6 | <0.1 |
| SD015 | H464E | 0.04 | >100 |
| SD016 | D531Q_V532N | 2.0 | 0.1 |
| SD017 | I650S | 2.0 | 0.2 |
| SD018 | E665A | 1.7 | <0.1 |
| SD019 | A739W_I741F | 1.9 | 0.2 |
[0741]SPR和tr-FRET被用于筛选抑制IGF-1R-Fc结合M13-C06的突变。除了SD015突变体，所有的突变体IGF-1R构建体均在SPR实验中证实有M13-C06结合活性，或M13-C06Fab结合活性。参见：图28；表17；以及数据未显示()竞争性抑制分析被用于建立结合曲线以通过上升浓度的未标记hIGF1R-Fc(SDWT)，小鼠IGF1R-Fc(mIGF1R-Fc)以及突变hIGF1R-Fc构建体来替换Eu-M13-C06结合Cy5-标记的IGF1R。
[0742]由于Western印迹的表达和定量的自然变异，在tr-FRET测定的IC50值和通过SPR测定的相对结合强度之间存在着一些偏差；然而，SD015是唯一在两个测定中实际没有针对M13-C06的结合活性且平行于mIGF-IR-Fc对照测定的结果的突变体。His464位于平头型hIGF-1R-Fc构建体的C-末端的基本氨基酸序列(即，hIGF-1R(1-462)-Fc)中的2氨基酸C-末端。M13-C06与平头hIGF-1R(1-462)的残基结合活性提示M13-C06结合表位至少包含残基Va1462-His464。由于有证据显示M13-C06的表位具有构型依赖性，该抗体-表位结合相互作用中很可能涉及其它残基。然而，可以显而易见地预测残基Va1462和His464在FnIII-1结构域的外表面(图29)。
[0743]在尝试表征M13-C06表位的范围(即，462-464外周的哪些残基对于抗体结合或活性具有重要性)时，我们采用了结构模型法。人IGF-1R和人INSR具有57％的一致性(73％相似性)和类似的三级结构。已进行的蛋白抗原：抗体结合表面的X射线晶体结构分析提示平均结合表面为
(平方埃)，从结合表位中心的半径约为
(Davies 1996)。通过INSR(pdb code 2DTG，(McKem 2006))的同源性胞外区结构域的X射线晶体结构，我们以IGF-1R残基V462至H646定位于INSR残基L472和K474计算了在FnIII-1结构域表面由残基462-464的半径
内的残基在原子间距离在以内采用距离取舍点，而平均距离计算为L472和K474对表面块中的各个残基的Cα至Cα距离。对于Cα至Cα距离大于，但侧链在取舍点内的残基所计算的平均距离列为。表18列举了可能对M13-C06结合和活性具有重要性的残基。
[0744]表18.在IGF-1R内预测对M13-C06结合和活性具有重要性的残基。残基462和464被斜体表示，因为它们代表了IGF-1R结合表位的预测中心，实验数据证实了这些残基在M13-C06结合中的重要性。
表18
[0745]已发表的著作显示识别残基440-586的抗体可同时抑制和对抗IGF-1结合(Soos 1992；Keynhanfar 2007)。440-586代表了具有多个对抗-IGF-1R抗体可及的潜在非重叠表面的所有L2和FnIII-1。我们的研究是使我们能够认识IGF-1R的抑制性表位中何处被定位至特定残基的首个研究。INSR最新结构与已知抑制胰岛素结合其受体的抗-INSR抗体共结晶(Soos 1986；McKem 2006)。对IGF-1R的His464的同源残基(INSR的K474)是该抗体与INSR的结合表面的一部分。M13-C06可能与拮抗剂抗-INSR抗体在抑制IGF-1结合IGF-1R上具有类似的抑制机制。
实施例28
M13.C06.G4.P.agly抗体在体内有效定位至肿瘤细胞，抑制Ki67表达，并下调在体内有效定位至肿瘤细胞的IGF-1RM13.C06.G4.P.agly抗体的表达
[0746]方法：在雌激素存在下向SCID Beig小鼠注射2 x 106MCF-7细胞(含于matrigel)(0.36小球，90天释放(InnovativeResearch of America))。将肿瘤生长至300-500mm3，然后向小鼠腹腔注射30mg/kg的M13.C06.G4.P.agly抗体。在注射后2，6，12，24和48小时处死小鼠并取出肿瘤，在OCT中冰冻，并进行6μm切片以供免疫组化分析(IHC)。未注射抗体的肿瘤作为对照切除。在OCT中冰冻，并进行6μm切片以供IHC。底物为载体VIP，一种紫斑病。使用山羊抗-人IgG H+L(人Elite ABC试剂盒，Vector Labs)在M13.C06.G4.P.agly或IDEC1 51(阴性对照抗体)处理的肿瘤上检测结合抗体。使用α-IGF-1R Mab(克隆24-31，NeoMarkers/Lab Vision)在M13.C06.G4.P.agly或IDEC151处理的肿瘤上检测IGF-1R表达。在BxPC3胰腺癌异种移植模型中进行类似的研究。
[0747]结果(数据未显示)：使用小鼠MCF-7乳腺或BxPC3胰腺肿瘤异种移植模型进行的体内效力实验显示腹腔注射30和15mg/kg的M13.C06.G4.P.agly能有效抑制肿瘤细胞生长。通过时间曲线实验研究在MCF-7或BX-Pc3荷瘤小鼠中采用单独30mg/kg或15mg/kg的M13.C06.G4.P.agly剂量时各自的药效学。由免疫组化分析(IHC)测定，M13.C06.G4.P.agly早在处理后6小时便定位至肿瘤，并在48小时出现最大的定位。通过Western和IHC分析测定的IGF-1R的表达显示M13.C06.G4.P.agly处理的肿瘤在处理后6小时IGF-1R明显下降，并在24小时几乎完全失去IGF-1R。在同型匹配对照抗体处理的肿瘤中未观察到变化。对肿瘤溶解产物的信号转导分析显示磷酸化Erk和Akt在2-12小时内的瞬时减少。
M13.C06.G4.P.agly抗体抑制Ki67表达
[0748]对M13.C06.G4.P.agly处理的肿瘤的Ki67染色还显示了与对照抗体处理的肿瘤相比增值细胞数量的减少(数据未显示)。这些数据揭示M13.C06.G4.P.agly在体内有效定位于肿瘤，并能通过下调IGF-1R抑制肿瘤生长以及抑制IGF-1R介导的信号转导。
M13.C06.G4.P.agly在肿瘤中下调并降解IGF-1R
[0749]从通过人胰腺细胞(BxPC3；图30(A))和乳腺癌细胞(MCF-7；图30(B))生成的SCID小鼠肿瘤溶解产物中对IGF-1R进行免疫印迹。在以M13.C06.G4.P.agly或IDEC-151阴性对照抗体处理后的指定时间点切除肿瘤。将肿瘤快速冷冻，粉碎并溶解。将肿瘤细胞溶解产物中的蛋白浓度归一化并在4-12％ NuPAGE
凝胶(Invitrogen Inc.，SD，CA)上分离。将该凝胶印迹至硝化纤维过滤器，以多克隆抗-IGF-1Rβ探测，并通过抗-兔-辣根过氧化酶抗体进行的酶反应进行检测。结果显示与阴性对照抗体相比，M13.C06.G4.P.agly可导致IGF-1R的下调和降解。
实施例29
M13.C06.G4.P.agly抗体在多种肿瘤模型系统中显示了体内抗肿瘤活性
[0750]除了前述实施例中证实的M13.C06.G4.P.agly在肺和胰腺模型系统中对肿瘤生长的体内抑制，以下实验进一步证实了M13.C06.G4.P.agly显示活性的多种肿瘤细胞模型。
[0751]M13.C06.G4.P.agly对通过MiaPaCa2胰腺癌细胞生成的肿瘤的抗肿瘤活性
[0752]以含于50％ Matrigel(BD Biosciences)/PBS的2 x 106MiaPaCa2胰腺癌细胞在右侧接种雌性SCID小鼠。当肿瘤达到150mm3(LxW2/2)的体积时，分选小鼠，并腹腔给用单独的制剂(单用抗体)或联合治疗剂(M13.C06.G4.P.agly抗体和吉西他滨)。单用吉西他滨(20mg/kg，Q4D x 3)和联合M13.C06.G4.P.agly(30mg/kg)以及单用M13.C06.G4.P.agly(采用15mg/kg和30mg/kg两种剂量；1x周x6)抑制肿瘤生长。
[0753]除了吉西他滨外，也可测试许多其它的联合疗法并与本发明的抗体联合使用。例如，采用以下类别(仅列举了少量示范性样例)中的化合物的联合疗法，可与本发明的抗体联合使用。
EGFR酪氨酸激酶抑制剂，例如：
Tarceva(厄洛替尼)
Iressa(吉非替尼)
EGFR抗体，例如：
Erbitux(西妥昔单抗)
Victibix(帕尼单抗)
mTOR抑制剂，例如：
坦西莫司，
雷帕霉素
以及其它抗癌化合物，例如：
Gleevec(伊马替尼)
Sutent(舒尼替尼)
索拉非尼(Bay-439006)
SAHA(HDAC抑制剂)
HSP90抑制剂
M200(Volociximab).
[0754]M13.C06.G4.P.agly对来自原发性人结肠癌的细胞生成的肿瘤的抗肿瘤活性
[0755]以1mm3的结肠肿瘤片段在雌性SCID小鼠的右侧接种。该肿瘤片段来自患有结肠癌的患者手术切除的肿瘤中获取的结肠肿瘤组织的系列传代(5x)。使肿瘤生长至150mm3(LxW2/2)的体积，分选小鼠，并给用所示的治疗剂(n＝6)(图31)。15mg/kg或30mg/kg的抗体每周一次通过腹腔给用。
[0756]结果：M13.C06.G4.P.agly有效抑制SCID小鼠中原代结肠肿瘤(CT3)生长(图31)。
[0757]由MCF-7乳腺癌细胞生成的肿瘤中M13-C06.G4.P.agly的抗肿瘤活性。
[0758]以含于50％ Matrigel/PBS的2 x 106MCF-7细胞(雌激素依赖型)在右侧接种雌性SCID Beige小鼠。在细胞接种前24小时在左侧移植雌二醇丸(0.36mg丸型雌二醇，90天释放(InnovativeResearch of America))。使肿瘤生长至150mm3(LxW2/2)的体积，分选小鼠，并给用所示的治疗剂(n＝10)(图32)。抗体每周一次腹腔给用，而在每个方案中含于花生油的枸橼酸他莫昔芬(Sigma Inc.)一周皮下给用5次。通过成对学生t检验进行统计分析。
[0759]结果：M13.C06.G4.P.agly有效抑制MCF-7乳腺癌肿瘤的生长(图32)。
[0760]当然，本发明的抗体的肿瘤抑制效力也可在多种其它肿瘤细胞类型(例如，肺癌细胞系H-1299，H-460，H-23；结肠癌细胞系Colo205和HT-29；胰腺癌细胞系如Panc-1；以及前列腺癌细胞系如PC-3，此处仅列举少量示范性样例)中简单地测得。
实施例30
M13.C06.G4.P.agly抗体不显示体外ADCC活性。
方法：
[0761]通过标准Ficoll-paque分离从肝素化全血中纯化得到人外周血单核细胞。将细胞重悬浮与含10％ FBS和200U/ml人IL-2的GIBCOTM RPMI1640培养基中，并在37℃孵育过夜。在下一日采集细胞并在培养基中洗涤一次，然后以1 X 107细胞/ml重悬浮。
[0762]将目标细胞(MCF-7，乳腺癌细胞)与100μCi 51Cr在37℃孵育1小时。对目标细胞洗涤一次以去除未结合的51Cr，并以1 x 104细胞/微孔的体积进行涂布。将目标细胞与50μl效应细胞和50μl抗体进行孵育。在整个实验中采用1:50的目标：效应比例。对照分别在抗体存在或缺失的情况下进行孵育，该抗体包括M13.C06.G4.P.agly，Herceptin(阳性对照)以及IDEC-151(阴性对照-特异性针对CD4的食蟹猴/人嵌合IgG1单克隆抗体)。37℃孵育4小时后，收集上清液，并以伽马计数器(Isodata伽马计数器，Packard Instruments)计数。溶解％通过如下计算式进行确定：
[0763]溶解％＝[样本释放(CPM)-自发释放(CPM)]÷[最大释放(CPM)-自发释放(CPM)] x 100％
[0764]结果：与Herceptin抗体阳性对照相反，M13-C06或IDEC-151抗体均未显示ADCC活性，从而揭示后述抗体缺乏效应功能(图33)。
实施例31
采用抗-IGF-1R抗体治疗人癌症
[0765]本实施例描述了采用针对IGF-1R的抗体来靶向恶性细胞(例如，检测到IGF-1R表达的高度增殖细胞)，从而治疗癌症的方法。
[0766]在特定的实施方式中，M13.C06.G4.P.agly抗体(或本发明的其它抗体)被纯化并与适当的药学载体制成注射制剂。向患有高度增殖紊乱的人类患者每两周或每月一次静脉输注约1mg/kg体重至约100mg/kg体重的多重剂量的M13.C06.G4.P.agly抗体(或本发明的其它抗体)，并施用至少六个月。可测定患者的预断指数，并据此采用不规则的间隔。
[0767]可在此处所述的标准放射治疗方案之前，同时或之后施用抗体。对患者进行监测以确定治疗是否得到抗肿瘤响应，例如，基于肿瘤消退，新肿瘤发生率的减少，更低的肿瘤抗原表达，或是其它评估疾病预后的方法进行判断。
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<223>抗体可变轻链序列
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<213>人工序列
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<223>抗体可变轻链序列
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<211>19
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<213>人工序列
<220>
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<211>106
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<213>人工序列
<220>
<223>寡聚核苷酸PCR引物
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<213>人工序列
<220>
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<213>人工序列
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<223>寡聚核苷酸PCR引物
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<213>人工序列
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<213>人工序列
<220>
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<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链信号肽
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<213>人工序列
<220>
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<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>39
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<213>人工序列
<220>
<223>寡聚核苷酸PCR引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡聚核苷酸PCR引物
<400>133
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<211>1407
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码抗体嵌合重链的cDNA
<400>134
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<211>449
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体嵌合重链
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<210>136
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡聚核苷酸PCR引物
<400>136
<210>137
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡聚核苷酸PCR引物
<400>137
<210>138
<211>714
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码嵌合抗体轻链的cDNA
<400>138
<210>139
<211>215
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合抗体轻链
<400>139
<210>140
<211>1404
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码嵌合抗体重链的cDNA
<400>140
<210>141
<211>448
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合抗体重链
<400>141
<210>142
<211>717
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码嵌合抗体轻链的cDNA
<400>142
<210>143
<211>218
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合抗体轻链
<400>143
<210>144
<211>1404
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码嵌合抗体重链的cDNA
<400>144
<210>145
<211>448
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合抗体重链
<400>145
<210>146
<211>1401
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码嵌合抗体重链的cDNA
<400>146
<210>147
<211>447
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合抗体重链
<400>147
<210>148
<211>705
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码嵌合抗体轻链的cDNA
<400>148
<210>149
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合抗体轻链
<400>149
<210>150
<211>446
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合抗体重链
<400>150
<210>151
<211>705
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码嵌合抗体轻链的cDNA
<400>151
<210>152
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合抗体轻链
<400>152
<210>153
<211>324
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码抗体轻链恒定区的cDNA
<400>153
<210>154
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体轻链恒定区
<400>154
<210>155
<211>981
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码抗体糖苷化重链恒定区的cDNA
<400>155
<210>156
<211>326
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗体糖苷化重链恒定区
<400>156
<210>157
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>免疫球蛋白轻链信号肽
<400>157
Claims (266)
1.与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同胰岛素样生长因子受体-1(IGF-R1)表位的分离抗体或其抗原结合片段。
2.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其片段竞争性抑制选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体与IGF-R1的结合。
3.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其片段包含与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体相同的抗原结合区。
4.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述的抗体或其片段的重链可变区(VH)包含与选自SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：26，SEQID NO：32，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63的参考氨基酸序列至少具有90％一致性的氨基酸序列。
5.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述的抗体或其片段的轻链可变区(VL)包含与选自SEQ ID NO：68，SEQ IDNO：73，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：88，SEQID NO：93，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118的参考氨基酸序列至少具有90％一致性的氨基酸序列。
6.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含除了20个或更少保守氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：48，SEQID NO：53，SEQ ID NO：58和SEQ IDNO：63的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列。
7.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含除了20个或更少保守氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：98，SEQ IDNO：103，SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列。
8.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述的抗体或其片段的VH包含选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ IDNO：14，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63的氨基酸序列。
9.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述的抗体或其片段的VL包含选自SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：73，SEQID NO：78，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：108，SEQ IDNO：113和SEQ ID NO：118的氨基酸序列。
10.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH和VL分别包含与选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ IDNO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；和SEQ ID NO：63和118的参考氨基酸序列至少具有90％一致性的氨基酸序列。
11.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH和VL分别包含除了各有20个或更少的保守氨基酸替换以外与选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ IDNO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ IDNO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；和SEQ ID NO：63和118的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列。
12.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH和VL分别包含选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ IDNO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；和SEQ ID NO：63和118的氨基酸序列。
13.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含除了两个或更少氨基酸替换外与选自SEQ IDNO：5，SEQ IDNO：10，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：21，SEQID NO：27，SEQID NO：33，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64的参考VH-CDR1氨基酸序列一致的Kabat重链决定簇互补区-1(VH-CDR1)氨基酸序列。
14.如权利要求13所述的抗体或其片段，其中所述的VH-CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：33，SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64。
15.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：22，SEQID NO：28，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：65的参考VH-CDR2氨基酸序列一致的Kabat重链决定簇互补区-2(VH-CDR2)氨基酸序列。
16.如权利要求15所述的抗体或其片段，其中所述的VH-CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：34，SEQ IDNO：40，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：55，SEQID NO：60和SEQ ID NO：65。
17.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：23，SEQID NO：29，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：66的参考VH-CDR3氨基酸序列一致的Kabat重链决定簇互补区-3(VH-CDR3)氨基酸序列。
18.如权利要求17所述的抗体或其片段，其中所述的VH-CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：35，SEQ IDNO：41，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：56，SEQID NO：61和SEQ ID NO：66。
19.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自SEQ IDNO：69，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：84，SEQID NO：89，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：119的参考VL-CDR1氨基酸序列一致的Kabat轻链决定簇互补区-1(VL-CDR1)氨基酸序列。
20.如权利要求19所述的抗体或其片段，其中所述的VL-CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：94，SEQ IDNO：99，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：119。
21.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含除了两个或更少氨基酸替换外与选自SEQ IDNO：70，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：85，SEQID NO：90，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120的参考VL-CDR2氨基酸序列一致的Kabat轻链决定簇互补区-2(VL-CDR2)氨基酸序列。
22.如权利要求21所述的抗体或其片段，其中所述的VL-CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：95，SEQ IDNO：100，SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120。
23.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自SEQ IDNO：71，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：86，SEQID NO：91，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121的参考VL-CDR3氨基酸序列一致的Kabat轻链决定簇互补区-3(VL-CDR3)氨基酸序列。
24.如权利要求23所述的抗体或其片段，其中所述的VL-CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：96，SEQ IDNO：101，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121。
25.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含除了在至少一个所述VH-CDRs中一个，两个，三个或四个氨基酸替换外选自SEQ ID NOs：5，6和7；SEQ IDNOs：10，11和12；SEQ ID NOs：15，16和17；SEQ ID NOs：21，22和23；SEQ ID NOs：27，28和29；SEQ ID NOs：33，34和35；SEQ ID NOs：39，40和41；SEQ ID NOs：44，45和46；SEQ IDNOs：49，50和51；SEQ ID NOs：54，55和56；SEQ ID NOs：59，60和61；以及SEQ ID NOs：64，65和66的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列。
26.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含选自SEQ ID NOs：5，6和7；SEQ ID NOs：10，11和12；SEQ ID NOs：15，16和17；SEQ ID NOs：21，22和23；SEQ ID NOs：27，28和29；SEQ ID NOs：33，34和35；SEQ IDNOs：39，40和41；SEQIDNOs：44，45和46；SEQ ID NOs：49，50和51；SEQ ID NOs：54，55和56；SEQ ID NOs：59，60和61；以及SEQ ID NOs：64，65和66的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列。
27.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含除了在至少一个所述VL-CDRs中一个，两个，三个或四个氨基酸替换外选自SEQ ID NOs：69，70和71；SEQID NOs：74，75和76；SEQ ID NOs：79，80和81；SEQ ID NOs：84，85和86；SEQ ID NOs：89，90和91；SEQ ID NOs：94，95和96；SEQ ID NOs：99，100和101；SEQ ID NOs：104，105和106；SEQ ID NOs：109，110和111；SEQ ID NOs：114，115和116；和SEQ ID NOs：119，120和121的VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列。
28.特异性结合IGF-R1的分离抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VI包含选自SEQ ID NOs：69，70和71；SEQ ID NOs：74，75和76；SEQ ID NOs：79，80和81；SEQ ID NOs：84，85和86；SEQ ID NOs：89，90和91；SEQ ID NOs：94，95和96；SEQID NOs：99，100和101；SEQ ID NOs：104，105和106；SEQ IDNOs：109，110和111；SEQ ID NOs：114，115和116；和SEQ IDNOs：119，120和121的VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列。
29.如权利要求1至28任意一项所述的抗体或其片段，其中该VH框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
30.如权利要求1至29任意一项所述的抗体或其片段，其中该VL框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
31.如权利要求1至30任意一项所述的抗体或其片段，其与非线性构型表位相结合。
32.特异性结合包含氨基酸残基缬氨酸-462的IGF-R1表位的分离抗体或其抗原结合片段。
33.特异性结合包含氨基酸残基组氨酸-464的IGF-R1表位的分离抗体或其抗原结合片段。
34.特异性结合包含氨基酸残基缬氨酸-462和组氨酸-464的IGF-R1表位的分离抗体或其抗原结合片段。
35.特异性结合包含自残基缬氨酸-462的溶剂可接近表面半径为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14埃的IGF-R1表位的分离抗体或其抗原结合片段。
36.特异性结合包含自残基组氨酸-464的溶剂可接近表面半径为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14埃的IGF-R1表位的分离抗体或其抗原结合片段。
37.特异性结合包含自残基缬氨酸462和组氨酸-464的溶剂可接近表面半径为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14埃的IGF-R1表位的分离抗体或其抗原结合片段。
38.特异性结合包含自人IGF-1R的残基缬氨酸462和组氨酸-464中心的溶剂可接近表面半径为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14埃的IGF-R1表位的分离抗体或其抗原结合片段。
39.如权利要求1至30任意一项所述的抗体或其片段，其与线性表位相结合。
40.如权利要求1至39任意一项所述的抗体或其片段，其为一种多价体，并包含了至少两个重链和至少两个轻链。
41.如权利要求1至40任意一项所述的抗体或其片段，其具有多特异性。
42.如权利要求41所述的抗体或其片段，其具有双特异性。
43.如权利要求1至42任意一项所述的抗体或其片段，其具有双特异性。
44.如权利要求1至43任意一项所述的抗体或其片段，其中该重和轻链可变区为完全人源。
45.如权利要求44所述的抗体或其片段，其中所述的重和轻链可变区为选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的单克隆Fab抗体片段。
46.如权利要求1至43任意一项所述的抗体或其片段，其中该重和轻链可变区为鼠源。
47.如权利要求46所述的抗体或其片段，其中所述的重和轻链可变区来自于由选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的单克隆抗体。
48.如权利要求1至43和46-47任意一项所述的抗体或其片段，其为人源化抗体或片段。
49.如权利要求1至43和46-47任意一项所述的抗体或其片段，其为嵌合抗体或片段。
50.如权利要求1至43和46-47任意一项所述的抗体或其片段，其为灵长源化抗体或片段。
51.如权利要求1至45任意一项所述的抗体或其片段，其为完全人源抗体或其片段。
52.如权利要求1至51任意一项所述的抗体或其片段，其为Fab片段。
53.如权利要求1至51任意一项所述的抗体或其片段，其为Fab′片段。
54.如权利要求1至51任意一项所述的抗体或其片段，其为F(ab)2片段。
55.如权利要求1至51任意一项所述的抗体或其片段，其为Fv片段。
56.如权利要求1至51任意一项所述的抗体或其片段，其为单链抗体。
57.如权利要求1至54和56任意一项所述的抗体或其片段，其包含选自人kappa恒定区和人lambda恒定区的轻链恒定区。
58.如权利要求1至54和56任意一项所述的抗体或其片段，其包含重链恒定区或其片段。
59.如权利要求58所述的抗体或其片段，其中所述的重链恒定区或其片段为人IgG4。
60.如权利要求59所述的抗体或其片段，其中所述的IgG4被突变去除糖基化位点。
61.如权利要求60所述的抗体或其片段，其中所述的突变包含Kabat编号系统的S241P和T318A。
62.如权利要求1至61任意一项所述的抗体或其片段，其通过以解离常数(KD)低于所述参考单克隆抗体的KD表征的亲和力特异性结合IGF-R1多肽或其片段，或是IGF-R1变体多肽。
63.如权利要求1至62任意一项所述的抗体或其片段，其通过以解离常数(KD)不大于5 x 10-2M，10-2M，5 x 10-3M，10-3M，5 x10-4M，10-4M，5 x 10-5M，10-5M，5 x 10-6M，10-6M，5 x 10-7M，10-7M，5 x 10-8M，10-8M，5 x 10-9M，10-9M，5 x 10-10M，10-10M，5 x 10-11M，10-11M，5 x 10-12M，10-12M，5 x 10-13M，10-13M，5 x 10-14M，10-14M，5 x 10-15M或10-15M表征的亲和力特异性结合IGF-R1多肽或其片段，或IGF-R1变体多肽。
64.如权利要求1至63任意一项所述的抗体或其片段，其中所述的亲和力以在约1 x 10-10至约5 x 10-9M范围内的解离常数(KD)表征。
65.如权利要求1至64任意一项所述的抗体或其片段，其中所述的亲和力以选自以下组合的解离常数(KD)表征：
(a)约1.1 x 10-10M；
(b)约1.3 x 10-10M；
(c)约3.6 x 10-10M；
(d)约1.3 x 10-9M；
(e)约4.0 x 10-9M；以及
(f)约4.9 x 10-9M。
66.如权利要求1至65任意一项所述的抗体或其片段，其中所述的亲和力以选自以下组合的解离常数(KD)表征：
(a)1.1 x 10-10M；
(b)1.3 x 10-10M；
(c)3.6 x 10-10M；
(d)1.3 x 10-9M；
(e)4.0 x 10-9M；以及
(f)4.9 x 10-9M。
67.如权利要求1至66任意一项所述的抗体或其片段，其相对于鼠IGF-R1多肽或其片段或者非人灵长动物IGF-R1多肽或其片段优先结合人IGF-R1多肽或其片段。
68.如权利要求1至66任意一项所述的抗体或其片段，其结合人IGF-R1多肽或其片段，还结合非人灵长动物IGF-R1多肽或其片段。
69.如权利要求1至68任意一项所述的抗体或其片段，其结合在细胞表面表达的IGF-R1。
70.如权利要求69所述的抗体或其片段，其中所述的细胞为恶性细胞，肿瘤性细胞，肿瘤细胞，或转移细胞。
71.如权利要求1至70任意一项所述的抗体或其片段，其阻断胰岛素生长因子结合IGF-R1。
72.如权利要求71所述的抗体或其片段，其中所述的胰岛素生长因子为胰岛素生长因子-1(IGF-1)。
73.如权利要求71所述的抗体或其片段，其中所述的胰岛素生长因子为胰岛素生长因子-2(IGF-2)。
74.如权利要求71所述的抗体或其片段，其同时阻断IGF-1和IGF-2结合IGF-R1。
75.如权利要求1至74任意一项所述的抗体或其片段，其抑制IGF-R1-介导的细胞增殖。
76.如权利要求1至75任意一项所述的抗体或其片段，其抑制IGF-R1或IGF-2-介导的IGF-R1磷酸化。
77.如权利要求1至76任意一项所述的抗体或其片段，其抑制肿瘤细胞生长。
78.如权利要求1至77任意一项所述的抗体或其片段，其抑制IGF-R1内在化。
79.如权利要求1至78任意一项所述的抗体或其片段，其进一步包含与其融合的外源多肽。
80.如权利要求1至79任意一项所述的抗体或其片段，其中所述的抗体被结合至选自细胞毒性剂，治疗剂，细胞抑制剂，生物毒素，前药，肽，蛋白，酶，病毒，脂质，生物应答调节剂，药物制剂，淋巴因子，外源抗体或其片段，可测标记，聚乙二醇(PEG)的制剂以及两个或多个任意所述制剂的组合。
81.如权利要求80所述的抗体或其片段，其中所述的细胞毒性剂选自放射性核素，生物毒素，酶活毒素，细胞抑制或细胞毒性治疗剂，前药，免疫活性配体，生物应答调节剂，或是两个或多个任意所述细胞毒性剂的组合。
82.如权利要求80所述的抗体或其片段，其中所述的可测标记选自酶，荧光标记，化学发光标记，生物发光标记，放射活性标记，或是两个或多个任意所述可测标记的组合。
83.包含如权利要求1至82任意一项所述的抗体或其片段以及载体的组合物。
84.包含编码抗体VH多肽的核酸的分离多聚核苷酸，其中所述VH多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：48，SEQ IDNO：53，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63的参考氨基酸序列至少具有90％一致性，且其中包含所述VH多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。
85.如权利要求84所述的多聚核苷酸，其中所述VH多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：53，SEQ IDNO：58，和SEQ ID NO：63。
86.如权利要求84或85所述的多聚核苷酸，其中编码所述VH多肽的核苷酸序列在不改变所述VH多肽氨基酸序列的情况下进行优化以提高表达。
87.如权利要求86所述的多聚核苷酸，其中所述的优化包括鉴别并去除剪接供体和剪接受体位点。
88.如权利要求86或87所述的多聚核苷酸，其中所述的优化包括用于表达所述多聚核苷酸的细胞的密码子的优化。
89.如权利要求84至88任意一项所述的多聚核苷酸，其中所述的核酸包含选自SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：36，SEQ IDNO：37，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：52，SEQID NO：57和SEQ ID NO：62的核苷酸序列。
90.包含编码抗体VL多肽的核酸的分离多聚核苷酸，其中所述VL多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：108，SEQ IDNO：113和SEQ ID NO：118的参考氨基酸序列至少具有90％一致性，且其中包含所述VL多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。
91.如权利要求90所述的多聚核苷酸，其中所述VL多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：113，和SEQID NO：118。
92.如权利要求90或91所述的多聚核苷酸，其中编码所述VL多肽的核苷酸序列在不改变所述VL多肽氨基酸序列的情况下进行优化以提高表达。
93.如权利要求92所述的多聚核苷酸，其中所述的优化包括鉴别并去除剪接供体和剪接受体位点。
94.如权利要求92或93所述的多聚核苷酸，其中所述的优化包括用于表达所述多聚核苷酸的细胞的密码子的优化。
95.如权利要求90至94任意一项所述的多聚核苷酸，其中所述核酸包含选自SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：107，SEQ ID NO：112，和SEQID NO：117的核苷酸序列。
96.包含编码抗体VH多肽的核酸的分离多聚核苷酸，其中所述VH多肽的氨基酸序列除了20个或更少的保守氨基酸替换之外与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：14，SEQID NO：20，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63的参考氨基酸序列一致，且其中包含所述VH多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。
97.包含编码抗体VL多肽的核酸的分离多聚核苷酸，其中所述VL多肽的氨基酸序列除了20个或更少的保守氨基酸替换之外与选自SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：113和SEQID NO：118的参考氨基酸序列一致，且其中包含所述VL多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。
98.分离多聚核苷酸，其包括编码除了两个或更少的氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：15，SEQID NO：21，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64的参考VH-CDR1氨基酸序列一致的VH-CDR1氨基酸序列的核酸；且其中包含所述VH-CDR1的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。
99.如权利要求98所述的多聚核苷酸或其片段，其中所述的VH-CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：49，SEQ IDNO：54，SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64。
100.分离多聚核苷酸，其包括编码除了四个或更少的氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：16，SEQID NO：22，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：65的参考VH-CDR2氨基酸序列一致的VH-CDR2氨基酸序列的核酸；且其中包含所述VH-CDR2的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。
如权利要求100所述的多聚核苷酸或其片段，其中所述的VH-CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：50，SEQ IDNO：55，SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：65。
分离多聚核苷酸，其包括编码除了四个或更少的氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：17，SEQID NO：23，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：56，SEQ IDNO：61和SEQ ID NO：66的参考VH-CDR3氨基酸序列一致的VH-CDR3氨基酸序列的核酸；且其中包含所述VH-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。
如权利要求102所述的多聚核苷酸或其片段，其中所述的VH-CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：51，SEQ IDNO：56，SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：66。
分离多聚核苷酸，其包括编码除了四个或更少的氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：79，SEQID NO：84，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：114和SEQID NO：119的参考VH-CDR1氨基酸序列一致的VH-CDR1氨基酸序列的核酸；且其中包含所述VH-CDR1的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。
如权利要求104所述的多聚核苷酸或其片段，其中所述的VL-CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：109，SEQID NO：114和SEQ ID NO：119。
分离多聚核苷酸，其包括编码除了两个或更少的氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：80，SEQID NO：85，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：115和SEQID NO：120的参考VL-CDR2氨基酸序列一致的VL-CDR2氨基酸序列的核酸；且其中包含所述VL-CDR2的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。
如权利要求106所述的多聚核苷酸或其片段，其中所述的VL-CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：110，SEQID NO：115和SEQ ID NO：120。
分离多聚核苷酸，其包括编码除了四个或更少的氨基酸替换外与选自SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：81，SEQID NO：86，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：116和SEQID NO：121的参考VH-CDR3氨基酸序列一致的VL-CDR3氨基酸序列的核酸；且其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。
如权利要求108所述的多聚核苷酸或其片段，其中所述的VL-CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：111，SEQID NO：116和SEQ ID NO：121。
110.分离多聚核苷酸，其包含编码抗体VH多肽的核酸，其中所述的VH多肽包含选自SEQ ID NOs：5，6和7；SEQ ID NOs：10，11和12；SEQ ID NOs：15，16和17；SEQ ID NOs：21，22和23；SEQ ID NOs：27，28和29；SEQ ID NOs：33，34和35；SEQ IDNOs：39，40和41；SEQ ID NOs：44，45和46；SEQ ID NOs：49，50和51；SEQ ID NOs：54，55和56；SEQ ID NOs：59，60和61；以及SEQ ID NOs：64，65和66的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列；且其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。
111.分离多聚核苷酸，其包含编码抗体VL多肽的核酸，其中所述的VL多肽包含选自SEQ ID NOs：69，70和71；SEQ ID NOs：74，75和76；SEQ ID NOs：79，80和81；SEQ ID NOs：84，85和86；SEQ ID NOs：89，90和91；SEQ ID NOs：94，95和96；SEQID NOs：99，100和101；SEQ ID NOs：104，105和106；SEQ IDNOs：109，110和111；SEQ ID NOs：114，115和116；和SEQ IDNOs：119，120和121的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列；且其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-R1。
112.如权利要求84至111任意一项所述的多聚核苷酸，进一步包含融合至所述抗体VH多肽的信号肽的编码核酸。
113.如权利要求84至111任意一项所述的多聚核苷酸，进一步包含融合至所述抗体VL多肽的信号肽的编码核酸。
114.如权利要求84至113任意一项所述的多聚核苷酸，进一步包含融合至所述VH多肽的重链恒定区CH1区的编码核酸。
115.如权利要求84至114任意一项所述的多聚核苷酸，进一步包含融合至所述VH多肽的重链恒定区CH2区的编码核酸。
116.如权利要求84至115任意一项所述的多聚核苷酸，进一步包含融合至所述VH多肽的重链恒定区CH3区的编码核酸。
117.如权利要求84至116任意一项所述的多聚核苷酸，进一步包含融合至所述VH多肽的重链铰链区的编码核酸。
118.如权利要求114至117任意一项所述的多聚核苷酸，其中所述的重链恒定区为人IgG4。
119.如权利要求118所述的多聚核苷酸，其中所述的IgG4被突变去除糖基化位点。
120.如权利要求119所述的多聚核苷酸，其中所述的突变包含Kabat编号系统的S241P和T318A。
121.如权利要求84至120任意一项所述的多聚核苷酸，进一步包含融合至所述VL多肽的编码轻链恒定区的核酸。
122.如权利要求121所述的多聚核苷酸，其中所述的轻链恒定区为人kappa。
123.如权利要求84至122任意一项所述的多聚核苷酸，其中抗体或其抗原结合片段包含由所述核酸编码的，与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同IGF-R1表位的多肽。
124.如权利要求84至123任意一项所述的多聚核苷酸，其中抗体或其抗原结合片段包含由所述核酸编码的，竞争性抑制选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体的多肽。
125.如权利要求84至124任意一项所述的多聚核苷酸，其中所述VH多肽的框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
126.如权利要求84至125任意一项所述的多聚核苷酸，其中所述VL多肽的框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
127.如权利要求84至126任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段与线性表位结合。
128.如权利要求84至126任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段与非线性构型表位结合。
129.如权利要求84至128任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为多价体，且包含了至少两条重链和至少两条轻链。
130.如权利要求84至129任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段具有多特异性。
131.如权利要求84至130任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段具有双特异性。
132.如权利要求84至131任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段包含完全人源的重和轻链可变区。
133.如权利要求132所述的多聚核苷酸，其中所述的重和轻链可变区与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的单克隆Fab抗体片段一致。
134.如权利要求84至131任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段包含鼠源的重和轻链可变区。
135.如权利要求134所述的多聚核苷酸，其中所述的重和轻链可变区与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的单克隆抗体一致。
136.如权利要求84至131和134至135任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或片段。
137.如权利要求84至131和134至135任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或片段。
138.如权利要求84至131和134至135任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为灵长源化抗体或片段。
139.如权利要求84至133任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为完全人源抗体或片段。
140.如权利要求84至139任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为Fab片段。
141.如权利要求84至139任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为Fab′片段。
142.如权利要求84至139任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为F(ab)2片段。
143.如权利要求84至139任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为Fv片段。
144.如权利要求84至139任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为单链抗体。
145.如权利要求84至144任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段通过以解离常数(KD)不大于5 x 10-2M，10-2M，5 x 10-3M，10-3M，5 x 10-4M，10-4M，5 x 10-5M，10-5M，5 x 10-6M，10-6M，5 x 10-7M，10-7M，5 x 10-8M，10-8M，5 x 10-9M，10-9M，5 x 10-10M，10-10M，5x 10-11M，10-11M，5 x 10-12M，10-12M，5 x 10-13M，10-13M，5 x10-14M，10-14M，5 x 10-15M或10-15M表征的亲和力特异性结合IGF-R1多肽或其片段，或IGF-R1变体多肽。
146.如权利要求84至145任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段相对于鼠IGF-R1多肽或其片段或者非人灵长动物IGF-R1多肽或其片段优先结合人IGF-R1多肽或其片段。
147.如权利要求84至145任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合人IGF-R1多肽或其片段，还结合非人灵长动物IGF-R1多肽或其片段。
148.如权利要求84至147任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合在细胞表面表达的IGF-R1。
149.如权利要求148所述的多聚核苷酸，其中所述的细胞为恶性细胞，新生物细胞，肿瘤细胞，或转移细胞。
150.如权利要求84至149任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段阻断胰岛素生长因子与IGF-R1的结合。
151.如权利要求150所述的多聚核苷酸，其中所述的胰岛素生长因子为胰岛素生长因子-1(IGF-1)。
152.如权利要求150所述的多聚核苷酸，其中所述的胰岛素生长因子为胰岛素生长因子-2(IGF-2)。
153.如权利要求150所述的多聚核苷酸，其同时阻断IGF-1和IGF-2结合IGF-R1。
154.如权利要求84至153任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制IGF-R1-介导的细胞增殖。
155.如权利要求84至154任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制IGF-R1或IGF-2-介导的IGF-R1磷酸化。
156.如权利要求84至155任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制肿瘤细胞生长。
157.如权利要求84至156任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制IGF-R1内在化。
158.如权利要求84至157任意一项所述的多聚核苷酸，其进一步包含编码外源多肽的核酸。
159.如权利要求84至158任意一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段被结合至选自细胞毒性剂，治疗剂，细胞抑制剂，生物毒素，前药，肽，蛋白，酶，病毒，脂质，生物应答调节剂，药物制剂，淋巴因子，外源抗体或其片段，可测标记，聚乙二醇(PEG)的制剂以及两个或多个任意所述制剂的组合。
160.如权利要求159所述的多聚核苷酸，其中所述的细胞毒性剂选自放射性核素，生物毒素，酶活毒素，细胞抑制或细胞毒性治疗剂，前药，免疫活性配体，生物应答调节剂，或是两个或多个任意所述细胞毒性剂的组合。
161.如权利要求159所述的多聚核苷酸，其中所述的可测标记选自酶，荧光标记，化学发光标记，生物发光标记，放射活性标记，或是两个或多个任意所述可测标记的组合。
162.包含如权利要求84至161任意一项所述多聚核苷酸以及载体的组合物。
163.包含如权利要求84至161任意一项所述多聚核苷酸的载体。
164.如权利要求163所述的载体，其中所述的多聚核苷酸可操作地连接至启动子。
165.包含权利要求163或164所述载体的宿主细胞。
166.特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的生产方法，其包括培养如权利要求165所述的宿主细胞，并回收所述抗体或其片段。
167.由权利要求166所述的方法生产的分离多肽。
168.由权利要求84至161任意一项所述的多聚核苷酸编码的分离多肽。
169.如权利要求168所述的分离多肽，其中包含所述多肽的抗体或其片段特异性结合IGF-1R。
170.包含权利要求168或169所述的多肽的分离抗体或其片段。
171.包含分离VH编码多聚核苷酸和分离VL编码多聚核苷酸的组合物，其中所述的VH编码多聚核苷酸和所述的VL编码多聚核苷酸分别包含与选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ IDNO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ IDNO：48和SEQIDNO：108；SEQ ID NO：53和SEQIDNO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；和SEQ ID NO：63和118的参考氨基酸序列具有至少90％一致性的氨基酸序列的编码核酸；且其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段特异性结合IGF-R1。
172.如权利要求171所述的组合物，其中所述的VH编码多聚核苷酸和所述的VL编码多聚核苷酸分别包含选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ IDNO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ IDNO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ IDNO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；和SEQ ID NO：63和118的氨基酸序列的编码核酸。
173.包含分离VH编码多聚核苷酸和分离VL编码多聚核苷酸的组合物，其中所述的VH编码多聚核苷酸和所述的VL编码多聚核苷酸分别包含除了少于20个保守氨基酸替换外与选自SEQID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ IDNO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQIDNO：113；和SEQ ID NO：63和118的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列的编码核酸；且其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段特异性结合IGF-R1。
174.包含分离VH编码多聚核苷酸和分离VL编码多聚核苷酸的组合物，其中所述的VH编码多聚核苷酸编码的VH多肽包含选自SEQ ID NOs：5，6和7；SEQ ID NOs：10，11和12；SEQ IDNOs：15，16和17；SEQ ID NOs：21，22和23；SEQ ID NOs：27，28和29；SEQ ID NOs：33，34和35；SEQ ID NOs：39，40和41；SEQ ID NOs：44，45和46；SEQ ID NOs：49，50和51；SEQ IDNOs：54，55和56；SEQ ID NOs：59，60和61；以及SEQ ID NOs：64，65和66的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列；其中所述VL编码多聚核苷酸编码的VL多肽包含选自SEQ IDNOs：69，70和71；SEQ ID NOs：74，75和76；SEQ ID NOs：79，80和81；SEQ ID NOs：84，85和86；SEQ ID NOs：89，90和91；SEQ ID NOs：94，95和96；SEQ ID NOs：99，100和101；SEQ IDNOs：104，105和106；SEQ ID NOs：109，110和111；SEQ IDNOs：114，115和116；和SEQ ID NOs：119，120和121的VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列；且其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段特异性结合IGF-R1。
175.如权利要求171-174任意一项所述的组合物，其中所述的VH编码多聚核苷酸进一步包含融合至所述抗体VH多肽的信号肽的编码核酸。
176.如权利要求171-174任意一项所述的组合物，其中所述的VL编码多聚核苷酸进一步包含融合至所述抗体VL多肽的信号肽的编码核酸。
177.如权利要求171至176任意一项所述的组合物，其中所述的VH编码多聚核苷酸进一步包含融合至所述VH多肽的重链恒定区CH1区的编码核酸。
178.如权利要求171至177任意一项所述的组合物，其中所述的VH编码多聚核苷酸进一步包含融合至所述VH多肽的重链恒定区CH2区的编码核酸。
179.如权利要求171至178任意一项所述的组合物，其中所述的VH编码多聚核苷酸进一步包含融合至所述VH多肽的重链恒定区CH3区的编码核酸。
180.如权利要求171至179任意一项所述的组合物，其中所述的VH编码多聚核苷酸进一步包含融合至所述VH多肽的重链铰链区的编码核酸。
181.如权利要求177至180任意一项所述的组合物，其中所述的重链恒定区为人IgG4。
182.如权利要求181所述的组合物，其中所述的IgG4被突变去除糖基化位点。
183.如权利要求182所述的组合物，其中所述的突变包含Kabat编号系统的S241P和T318A。
184.如权利要求171至183任意一项所述的组合物，其中所述的VL编码多聚核苷酸进一步包含融合至所述VL多肽的轻链恒定区的编码核酸。
185.如权利要求174所述的组合物，其中所述的轻链恒定区为人kappa。
186.如权利要求171至185任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同IGF-R1表位。
187.如权利要求171至185任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其抗原结合片段竞争性抑制选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12，和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体结合IGF-R1。
188.如权利要求171至187任意一项所述的组合物，其中所述VH和VL多肽的框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
189.如权利要求171至188任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段结合线性表位。
190.如权利要求171至188任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段结合非线性构型表位。
191.如权利要求171至188任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段为多价抗体或片段，并包含至少两条重链和至少两条轻链。
192.如权利要求171至191任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段为多特异性抗体或片段。
193.如权利要求171至192任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段为双特异性抗体或片段。
194.如权利要求171至193任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段包含完全人源的重和轻链可变区。
195.如权利要求194所述的组合物，其中所述的重和轻链可变区与选自M13-C06，M14-G11，M14-C03，M14-B01，M12-E01和M12-G04的单克隆Fab抗体片段一致。
196.如权利要求171至193任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段包含鼠源的重和轻链可变区。
197.如权利要求196所述的组合物，其中所述的重和轻链可变区与选自P2A7.3E11，20C8.3B8，P1A2.2B11，20D8.24B11，P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的单克隆抗体一致。
198.如权利要求171至193和196至197任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段为人源化抗体或片段。
199.如权利要求171至193和196至197任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段为嵌合抗体或片段。
200.如权利要求171至193和196至197任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段为灵长源化抗体或片段。
如权利要求171至195任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段为完全人源抗体或片段。
如权利要求171至201任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段为Fab片段。
如权利要求171至201任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段为Fab′片段。
如权利要求171至201任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段为F(ab)2片段。
如权利要求171至201任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段为Fv片段。
如权利要求171至201任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段为单链抗体。
如权利要求171至206任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段通过以解离常数(KD)不大于5 x 10-2M，10-2M，5 x 10-3M，10-3M，5 x 10-4M，10-4M，5 x 10-5M，10-5M，5 x 10-6M，10-6M，5 x 10-7M，10-7M，5 x 10-8M，10-8M，5 x 10-9M，10-9M，5 x 10-10M，10-10M，5x10-11M，10-11M，5 x 10-12M，10-12M，5 x 10-13M，10-13M，5 x10-14M，10-14M，5 x 10-15M或10-15M表征的亲和力特异性结合IGF-R1多肽或其片段，或IGF-R1变体多肽。
如权利要求171至207任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段相对于鼠IGF-R1多肽或其片段或者非人灵长动物IGF-R1多肽或其片段优先结合人IGF-R1多肽或其片段。
如权利要求171至207任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段结合人IGF-R1多肽或其片段，还结合非人灵长动物IGF-R1多肽或其片段。
210.如权利要求171至209任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段结合在细胞表面表达的IGF-R1。
211.如权利要求210所述的组合物，其中所述的细胞为恶性细胞，新生物细胞，肿瘤细胞，或转移细胞。
212.如权利要求171至211任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段阻断胰岛素生长因子结合IGF-R1。
213.如权利要求212所述的组合物，其中所述的胰岛素生长因子为胰岛素生长因子-1(IGF-1)。
214.如权利要求212所述的组合物，其中所述的胰岛素生长因子为胰岛素生长因子-2(IGF-2)。
215.如权利要求212所述的组合物，其同时阻断IGF-1和IGF-2结合IGF-R1。
216.如权利要求171至215任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段抑制IGF-R1-介导的细胞增殖。
217.如权利要求171至216任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段抑制IGF-1或IGF-2-介导的IGF-R1磷酸化。
218.如权利要求171至217任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段抑制肿瘤细胞生长。
219.如权利要求171至218任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段抑制IGF-R1内在化。
220.如权利要求171至219任意一项所述的组合物，其中所述的VH编码多聚核苷酸，所述的VL编码多聚核苷酸，或是所述的VH和所述的VL编码多聚核苷酸两者进一步包含编码外源性多肽的核酸。
221.如权利要求171至220任意一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段被结合至选自细胞毒性剂，治疗剂，细胞抑制剂，生物毒素，前药，肽，蛋白，酶，病毒，脂质，生物应答调节剂，药物制剂，淋巴因子，外源抗体或其片段，可测标记，聚乙二醇(PEG)的制剂以及两个或多个任意所述制剂的组合。
222.如权利要求221所述的组合物，其中所述的细胞毒性剂选自放射性核素，生物毒素，酶活毒素，细胞抑制或细胞毒性治疗剂，前药，免疫活性配体，生物应答调节剂，或是两个或多个任意所述细胞毒性剂的组合。
223.如权利要求221所述的组合物，其中所述的可测标记选自酶，荧光标记，化学发光标记，生物发光标记，放射活性标记，或是两个或多个任意所述可测标记的组合。
224.如权利要求171至223任意一项所述的组合物，其中所述的VH编码多聚核苷酸包含于第一载体，而所述的VL编码多聚核苷酸包含于第二载体。
225.如权利要求224所述的组合物，其中所述的VH编码多聚核苷酸被可操作地连接至第一启动子而所述的VL编码多聚核苷酸被可操作地连接至第二启动子。
226.如权利要求225所述的组合物，其中所述的第一和第二启动子为同一启动子的拷贝。
227.如权利要求225所述的组合物，其中所述的第一和第二启动子为不相同的。
228.如权利要求224至227任意一项所述的组合物，其中所述的第一载体和所述的第二载体包含于单个宿主细胞。
229.如权利要求224至227任意一项所述的组合物，其中所述的第一载体和所述的第二载体包含于独立的宿主细胞。
230.特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的生产方法，其包括培养如权利要求228所述的宿主细胞，并回收所述抗体或其片段。
231.特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的生产方法，其包括共培养如权利要求229所述的独立宿主细胞，并回收所述抗体或其片段。
232.特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的生产方法，其包括单独培养如权利要求229所述的独立宿主细胞，合并所述的VH和VL编码多肽，并回收所述抗体或其片段。
233.通过权利要求230至232任意一项所述的方法生产得到的特异性结合IGF-1R的抗体或其片段。
234.如权利要求171至223任意一项所述的组合物，其中所述的VH编码多聚核苷酸和所述的VL编码多聚核苷酸在相同载体上。
235.如权利要求234所述的载体。
236.如权利要求235所述的载体，其中所述的VH编码多聚核苷酸和所述的VL编码多聚核苷酸分别与启动子可操作地连接。
237.如权利要求235所述的载体，其中所述的VH编码多聚核苷酸和所述的VL编码多聚核苷酸在进行框内融合，从与之可操作连接的单个启动子进行共同转录，并共同翻译成一种单链抗体或其抗原结合片段。
238.如权利要求235所述的载体，其中所述的VH编码多聚核苷酸和所述的VL编码多聚核苷酸从与之可操作连接的单个启动子进行共同转录，但单独翻译。
239.如权利要求238所述的载体，进一步包含位于所述的VH编码多聚核苷酸和所述的VL编码多聚核苷酸之间的一种IRES序列。
240.如权利要求235所述的载体，其中所述编码VH的多聚核苷酸编码和所述编码VL的多聚核苷酸分别可操作地连接至单独启动子并单独转录。
241.如权利要求240所述的载体，其中所述的单独启动子为同一启动子的拷贝。
242.如权利要求240所述的载体，其中所述的单独启动子为不相同的。
243.包含如权利要求235至242任意一项所述载体的宿主细胞。
244.特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的生产方法，其包括培养如权利要求243所述的宿主细胞，并回收所述抗体或其片段。
245.通过权利要求244所述的方法生产得到的特异性结合IGF-1R的抗体或其片段。
246.在动物中治疗高度增殖紊乱的方法，其包括向需要治疗的动物施用包含以下成分的组合物：
a)如权利要求1至82，170，233和245任意一项所述的分离抗体或其片段；以及
b)药学上可接受的载体。
247.如权利要求246所述的方法，其中所述的高度增殖疾病或紊乱选自癌症，新生物，肿瘤，恶性肿瘤或其转移瘤。
248.如权利要求247所述的方法，其中所述的抗体或其片段特异性结合在恶性细胞表面表达的IGF-1R。
249.如权利要求248所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与恶性细胞的结合导致所述恶性细胞的生长抑制。
250.如权利要求246至249任意一项所述的方法，其中所述的抗体或其片段抑制IGF结合所述恶性细胞。
251.如权利要求250所述的方法，其中所述的IGF为IGF-1。
252.如权利要求250所述的方法，其中所述的IGF为IGF-2。
253.如权利要求250所述的方法，其中所述的IGF为IGF-1和IGF-2。
254.如权利要求253所述的方法，其中所述的抗体或其片段抑制IGF-1结合所述的恶性细胞，但不抑制IGF-2。
255.如权利要求253所述的方法，其中所述的抗体或其片段抑制IGF-2结合所述的恶性细胞，但不抑制IGF-1。
256.如权利要求246至249任意一项所述的方法，其中所述的抗体或其片段促进IGF-1R内在化进入所述的恶性细胞。
257.如权利要求246至249任意一项所述的方法，其中所述的抗体或其片段抑制IGF-1R磷酸化。
258.如权利要求246至249任意一项所述的方法，其中所述的抗体或其片段抑制肿瘤细胞增殖。
259.如权利要求258所述的方法，其中通过预防或延缓转移生长抑制肿瘤细胞增殖。
260.如权利要求246至249任意一项所述的方法，其中所述的抗体或其片段抑制肿瘤细胞转移。
261.如权利要求258所述的方法，其中通过预防或延缓肿瘤扩散至邻近组织抑制肿瘤细胞增殖。
262.如权利要求247所述的方法，其中所述的高度增殖疾病或紊乱为处于如下位置的新生物：前列腺，结肠，腹部，骨，乳腺，消化系统，肝脏，胰脏，腹膜，肾上腺，甲状旁腺，脑下垂体，睾丸，卵巢，胸腺，甲状腺，眼睛，头部，颈部，中枢神经系统，周围神经系统，淋巴系统，骨盆，皮肤，软组织，脾脏，胸部，或泌尿生殖道。
263.如权利要求247所述的方法，其中所述的高度增殖疾病为癌症，所述癌症选自上皮鳞状细胞癌，黑色素瘤，白血病，骨髓瘤，胃癌，脑癌，肺癌，胰腺癌，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，肾癌，前列腺癌，睾丸癌，甲状腺癌，以及头颈部癌。
264.如权利要求263所述的方法，其中所述的癌症选自胃癌，肾癌，脑癌，膀胱癌，结肠癌，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，卵巢癌和前列腺癌。
265.如权利要求246至264任意一项所述的方法，其中所述的动物为哺乳动物。
266.如权利要求265所述的方法，其中所述的哺乳动物为人。
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