CN111795956B - 一种判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，步骤是：(1)测定荧光供体和受体在同一激发波长下、两个检测波长处的荧光强度，然后以两个波长的荧光强度比值作为信号值；(2)通过测量反应起始阶段至少两个时刻的信号值，通过线性拟合、四参数拟合，分别建立信号强度的绝对值、信号变化的速率值与样品浓度的标准曲线；(3)检测未知样本的信号值，通过标准曲线，根据未知样本的荧光强度，获得未知样本的浓度，从而避免hook效应。利用信号强度绝对值和信号变化速率值与背景信号的比值，计算相对信号强度和信号变化速率相对值，在不同仪器上实现一致的结果。可以在既定时间内完成更多样品的浓度判读，从而使系统具有更高检测通量。

Description

一种判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法
技术领域
本发明涉及一种判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，属于荧光免疫检测技术领域。
背景技术
均相时间分辨荧光免疫分析技术结合了荧光共振能量转移(FRET，FluorescenceResonance Energy Transfer)和时间分辨荧光(TRF，Time Resolved Fluorescence)两种技术。该技术是利用了具有穴状结构的稀土元素的螯合标记物作为荧光供体，以及与荧光供体具有良好光谱重叠的短寿命荧光分子作为荧光受体，在稀土元素穴状化合物的供体与受体(第二荧光标记物)之间发生荧光共振能量转移(FRET)。在荧光共振能量转移中，受体发射荧光的寿命等同于供体的发射荧光的寿命。因为供体荧光衰减周期较长，所以供体会诱导受体长时间地发射荧光，受体激发后产生的荧光便能持续较长时间，这样通过时间分辨就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。
钩状效应(hook effect)是类同于沉淀反应中抗原过剩的后滞现象，当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。正常浓度下信号随浓度升高，产生钩状效应时，信号不再随浓度增加。
均相时间分辨荧光免疫分析采用一步法测试，受到钩状效应影响尤为明显，如图1所示，该图是反应终点时信号与浓度的关系，显然高浓度会造成测量结果偏低，为避免这种结果，需要判断钩状效应的存在。应用均相时间分辨荧光免疫分析技术用于临床诊断，由于临床标本浓度变化动态范围大，因此必须要开发一种识别高浓度标本即hook效应的技术，才能满足临床使用要求。
(Elimination of"hook-effect"in two-site immunoradiometric assays bykinetic rate analysis，K L Hoffman et.al.)《Clin.Chem.》30/9，1499-1501(1984)公开了利用两个时间点的定标曲线浓度差异判断放射免疫法钩状效应的方法，该方法采用2min和10min两个时刻定量曲线，判断钩状效应，利用了放免的特点在第一次读数时不清洗，第二次终读数时清洗。缺点是需在两个固定时刻测量，且只适合放免。公开号为CN105339794A的中国专利申请涉及用于检测光度测定法的前带效应的方法，该方法适用于光度法(免疫浊度法)，在反应初始阶段测量四次信号，通过一定算法进行判读。缺点是适用于浊度法，四次测量次数较多，占用检测系统。公开号为CN102944672A的中国专利申请涉及采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法，该方法通过在反应终点读数后，加入一定靶物质再继续反应后二次读数，通过两次读数差异判断。缺点：加入靶物质带来额外试剂消耗，增加成本；在反应结束时才能判断。以上技术适用于特定的免疫学方法，并不适合于均相时间分辨荧光免疫分析。目前用于临床的国外产品仅有赛默飞世尔的Kryptor系列产品，尚未检索到其判断hook效应的专利，从公开资料看，其采用检测免疫反应初始阶段60s内反应动力学曲线进而判断样品是否浓度过高需要稀释，需要在9个时间点进行读数，这会造成检测系统长时间被占用，影响检测通量。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，较少使用检测系统，可以在既定时间内完成更多样品的浓度判读，从而使系统具有更高检测通量。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，同时测定荧光供体和受体在两个检测波长的荧光强度，然后以两个波长的荧光强度比值作为本发明信号强度的绝对值。
进一步，可以利用信号强度绝对值和信号变化速率值与背景信号的比值，计算相对信号强度和信号变化速率相对值，可以在不同仪器上实现一致的结果(图2)。
具体而言，激发波长采用中心波长320nm，检测波长采用中心波长620nm和665nm，以665nm和620nm的荧光强度比值，作为信号强度的绝对值；
通过测量反应起始阶段至少两个时刻的信号值，通过线性拟合、四参数拟合，分别建立信号强度的绝对值和信号变化的速率值与浓度的标准曲线；检测未知样本的信号强度的绝对值，通过标准曲线，根据未知样本的荧光强度，获得未知样本的浓度，从而避免hook效应。
测量时间是在反应的起始阶段，在至少两个时刻，可以是20s到10分钟，优选的是20s到2分钟。
两个时刻的差值是计算反应动力学速率的时间差，时间差取值范围从2秒到10分钟，优选6-60秒。
通过比较两条曲线得到的待测物质的浓度差异，可以判断样本的浓度水平。
为使拟合曲线在不同仪器上适用，将测量信号除以阴性标本的背景信号，可以获得相对信号，相对信号只与反应进行的程度有关。
计算测量信号的绝对值与浓度的关系时，可采用单次测量的信号，或者多次测量的信号平均值，测量速率时可采用单个速率值或多次测量的速率值的平均值。
当未知样品的信号值和速率值均低于预设标准时，判断为浓度处于正常范围。
当未知样品按照两条测量曲线进行计算时，如果得到的浓度值差异，小于预设值则样品不存在钩状效应。
当两条曲线计算得到的浓度存在显著差异时(超出预设值)，则样品中存在钩状效应。
存在钩状效应时，利用钩状效应时，信号与浓度的关系，可计算浓度水平。
本发明有以下积极的效果：通过测量反应起始阶段至少两个时刻的信号值，分别建立信号强度的绝对值和信号变化的速率值与浓度的关系，计算样本浓度，从而判断hook效应。进一步可以利用信号强度绝对值和信号变化速率值与背景信号的比值，计算相对信号强度和信号变化速率相对值，可以在不同仪器上实现一致的结果，使系统具有更高检测通量。
附图说明
图1是钩状效应检测结果示意图(当浓度小于1000ng/mL时，信号与浓度呈正比；当浓度大于1000ng/mL时，信号与浓度呈反比)。
图2是信号绝对值和反应速率与浓度的关系图。
图3是实施例1的信号绝对值与浓度关系(浓度达到80000ng/mL时产生钩状效应)。
图4是实施例1的速率值与浓度的关系(浓度达到16000ng/mL时产生钩状效应)。
图5是实施例2不同系统(仪器)间信号绝对值与浓度关系(浓度达到80000ng/mL时产生钩状效应)。
图6是信号绝对值与速率值与背景值比值与浓度的关系(■为RS，●为RRR)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的详细说明。
以下实施例所需检测条件：
1、仪器：
具有多波长时间分辨荧光，检测功能的仪器，进行测定，例如帝肯的多功能酶标仪F200，也可采用具备全自动加样功能的测量仪器
2、测量程序：
检测体系包括待测样本、反应试剂r1和反应试剂r2组成，两种试剂分别标记荧光供体和荧光受体，其中，荧光供体可发出长寿命的620纳米荧光，荧光受体本身只发出短寿命荧光，但是当接受620纳米荧光时也可发出长寿命的荧光，只有当形成免疫复合物时这一荧光共振能量转移过程才能发生，按照均相时间分辨荧光的标准测量方法可以进行测量。
2.1移液方案
将2.5uL样品和9uL测定试剂r1和9uL测定试剂r2到反应孔中通过吹打混合，形成反应混合物。
2.2信号测量
测量开始时刻(时刻一)的620纳米和665纳米的时间分辨荧光，然后间隔12秒钟重复测量，计算665纳米和620纳米荧光强度的比值作为信号的绝对强度值，计算绝对强度的平均值和变化值，由于间隔时间是固定的，因此变化值可以作为相对反应速率值。
2.3生成校准曲线
分别利用测量信号绝对值和速率值与浓度的关系，可以建立两条校准曲线，在浓度与信号正相关的范围内，采用四参数法进行拟合，生成校准曲线。
2.4利用校准曲线计算未知样品浓度
利用拟合的四参数曲线方程，可以计算出未知样品的浓度值，采用两条曲线，可以计算出两个浓度值。
实施例1：用于AFP测定的钩状效应检测
2.3生成校准曲线
检测一系列已知浓度样品的信号绝对值，利用测量信号绝对值和速率值与浓度的关系，可以建立两条校准曲线，在浓度与信号正相关的范围内(见图2)，采用四参数进行拟合，生成校准曲线，信号绝对值与浓度关系拟合曲线见图3，速率值与浓度关系拟合曲线见图4。
2.4利用校准曲线计算未知样品浓度
利用拟合的四参数曲线方程，可以计算出未知样品的浓度值，采用两条曲线，可以计算出两个浓度值。
浓度ng/mL 按信号绝对值曲线计算 按速率值曲线计算 比值
0 - -
3.3 - -
9.9 - -
29.6 - -
88.9 - -
267 185 187 0.99
533 901 624 1.44
1067 893 1028 0.87
3200 3144 3207 0.98
16000 16620 15992 1.04
80000 74008 4068 18.2
400000 2555 307 8.31
2.5利用浓度值判断钩状效应
当浓度测量值低于267ng/mL时，不存在钩状效应。
当浓度在267-16000ng/mL范围时，差异小于2倍，两者一致，计算浓度为正常值，不存在钩状效应。但由于最终读数时定量范围为1-1000ng/mL，因此超出这一范围的需要稀释后测定。
当浓度在16000-80000ng/mL范围时，比值显著大于2，速率法曲线出现钩状效应，但信号绝对值与浓度不存在钩状效应，因此可根据信号绝对值曲线计算浓度，判断合理稀释倍数。
当浓度超过80000ng/mL时，比值大于2，两条曲线均存在钩状效应，计算浓度显著偏低，可直接稀释5000倍后重新测量，也可以根据速率法曲线中速率值与浓度反相关关系计算。
实施例2：在不同系统间，用于AFP测定法的钩状效应检测
2.3生成校准曲线
在不同系统(仪器)之间测量得到的信号值和速率值是不同的，图5展示了信号值在两个仪器间的系统偏差。与实施例1相比，实施例2引入空白样本的665/620nm测定比值作为背景值，校准信号在不同系统(仪器)之间的测量系统偏差，计算方法如下：将信号绝对值和速率值除以背景值，分别得到相对信号绝对值(RS，relative signal)和相对速率值(RRR,relative reaction rate)。在同样的温育条件下，RS和RRR曲线只与免疫反应程度有关，与测量系统偏差无关，分别利用测量信号的相对值(RS)和速率相对值(RRR)与浓度的关系，可以建立两条校准曲线，在浓度与信号正相关的范围内，采用四参数进行拟合，生成校准曲线(图6)，适用于同样温育条件的不同系统(仪器)。
2.4利用校准曲线计算未知样品浓度
利用拟合的四参数曲线方程，可以计算出未知样品的浓度值，采用两条曲线，可以计算出两个浓度值。
浓度ng/mL 按信号绝对值曲线计算 按速率值曲线计算 比值
0 - -
3.3 - -
9.9 - -
29.6 - -
88.9 - -
267 185 187 0.99
533 901 624 1.44
1067 893 1028 0.87
3200 3144 3207 0.98
16000 16620 15992 1.04
80000 74008 4068 18.2
400000 2555 307 8.31
2.5利用浓度值判断钩状效应
当浓度测量值低于267ng/mL时，不存在钩状效应。
当浓度在267-16000ng/mL范围时，差异小于2倍，两者一致，计算浓度为正常值，不存在钩状效应。但由于最终读数时定量范围为1-1000ng/mL，因此超出这一范围的需要稀释后测定。
当浓度在16000-80000ng/mL范围时，比值显著大于2，速率法曲线出现钩状效应，但信号绝对值与浓度不存在钩状效应，因此可根据信号绝对值曲线计算浓度，判断合理稀释倍数。
当浓度超过80000ng/mL时，比值大于2，两条曲线均存在钩状效应，计算浓度显著偏低，可直接稀释5000倍后重新测量，也可以根据速率法曲线中速率值与浓度反相关关系计算。
2.6一条标准曲线适用于多个系统，不需要在每个系统上单独建立标准曲线。上述具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，其特征在于，
步骤（1）测定荧光供体和受体在同一激发波长下、两个检测波长处的荧光强度，然后以两个波长的荧光强度比值作为信号强度绝对值；
步骤（2）通过测量反应起始阶段至少两个时刻的信号强度绝对值，通过线性拟合、四参数拟合，分别建立信号强度绝对值与样品浓度的标准曲线、信号变化速率值与样品浓度的标准曲线；
步骤（3）检测未知样本的信号强度绝对值，通过标准曲线，根据未知样本的荧光强度，获得未知样本的浓度，从而判断hook效应，判断过程是：
（a）当未知样品的信号强度绝对值和信号变化速率值均低于预设标准时，判断为浓度处于正常范围；
（b）当未知样品按照两条测量曲线进行计算时，如果得到的浓度值差异，小于预设值则样品不存在钩状效应；
（c）当两条曲线计算得到的浓度存在显著差异，超出预设值时，则样品中存在钩状效应；
步骤（4）存在钩状效应时，利用钩状效应时信号与浓度的关系，计算浓度水平。
2.根据权利要求1所述的判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，其特征在于，利用信号强度绝对值和信号变化速率值与背景信号的比值，计算相对信号强度和信号变化速率相对值，在不同仪器上实现一致的结果。
3.根据权利要求1所述的判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，其特征在于，所述的激发波长采用中心波长320nm，检测波长采用中心波长620nm和665nm，以665nm和620nm的荧光强度比值，作为信号强度绝对值；
测量时间是在反应的起始阶段，在至少两个时刻，可以是20s到10分钟；
两个时刻的差值是计算反应动力学速率的时间差，时间差取值范围从2秒到10分钟。
4.根据权利要求1所述的判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，其特征在于，测量时间是在反应的起始阶段，在至少两个时刻，可以是20s到2分钟，时间差取值范围从6-60秒。
5.根据权利要求1所述的判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，其特征在于，为使拟合曲线在不同仪器上适用，将测量信号除以阴性标本的背景信号，可以获得相对信号，相对信号只与反应进行的程度有关；
通过比较两条曲线得到的待测物质的浓度差异，可以判断样本的浓度水平。
6.根据权利要求1所述的判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，其特征在于，建立信号强度绝对值与样品浓度的标准曲线时采用单次测量的信号，或者多次测量的信号平均值；建立信号变化速率值与样品浓度的标准曲线时，可采用单个信号变化速率值或多次测量的信号变化速率值的平均值。
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