CN111766390A - 脂联素化学发光免疫检测试剂盒 - Google Patents

脂联素化学发光免疫检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种脂联素化学发光免疫检测试剂盒，属于试剂盒技术领域。解决了现有技术中检测脂联素的方法检测时间长、灵敏度低、重复性差的问题。本发明的试剂盒，包括：校准品、磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3；其中，磁颗粒反应液R1包含链酶亲和素磁珠、NaCl、缓冲液和防腐剂；示踪结合物反应液R2包含吖啶酯标记的脂联素抗体、NaCl、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；捕获抗体反应液R3包含生物素标记的脂联素抗体、NaCl、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；脂联素抗体为脂联素单克隆抗体或脂联素多克隆抗体。该试剂盒检测时间短、灵敏度高、重复性好。

Description

脂联素化学发光免疫检测试剂盒
技术领域
本发明属于试剂盒技术领域，具体涉及一种脂联素化学发光免疫检测试剂盒。
背景技术
脂联素(Adiponectin/ADPN)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，由244个氨基酸组成，分子量为30KD。其氨基末端含有1个分泌信号序列，羧基末端有一个球蛋白的功能阀，属于含胶原样功能阀的蛋白家族。
脂联素是一种胰岛素增敏激素(An InsμLin-sensitizing Hormone)，能抑制或干扰TNF-α通路或信号传导，脂联素水平能预示II型糖尿病风险和冠心病的发展，并在临床试验表现出与糖尿病、动脉粥样、炎症和多种肿瘤相关。在2019ES/ADA/ESE指南《存在代谢风险患者ASCVD和T2DM的一级预防》中提到，脂联素检测在代谢综合症的风险预测方面有新的应用，是预测糖尿病的高风险的标志物之一。综上，脂联素与糖尿病、动脉粥样、炎症和多种肿瘤相关，是一个很有潜力的检测指标。
在国内，临床检测血清和血浆脂联素主要以国外进口试剂为主，国外进口试剂价格非常昂贵，给患者带来很大的经济负担，不利于在基层普及。因此，有待开发一种检测灵敏度高、可靠性好的血清和血浆中脂联素检测试剂盒，以降低患者使用成本，并提高推广使用。
化学发光免疫测定(CLIA)是继酶免技术、放免技术、荧光免疫技术和时间分辨荧光免疫技术之后发展的一项新兴免疫测定技术。
由于它既具有免疫反应的高度特异性，又具有发光反应的高敏感性，近年来已被国内外临床实验室及科研单位广泛应用于各种激素、特种蛋白及药物的监测和分析。该方法具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、试剂稳定性好、操作简便、容易实现自动化的优点，是理想的临床微量生化检验分析手段。
现有的化学发光体系有多种，最主要的有：HRP-鲁米诺体系、吖啶酯发光体系、电化学发光体系等。吖啶酯发光体系相对于其他体系而言具有其特殊的优点：首先吖啶酯标记工艺简单，标记物发光稳定，试剂盒有效期长，成本相对较低；且发光为闪光型，发光快速集中且强大，方便实现快速检测，检测的灵敏度和精密度都很高，对于仪器的要求简单，便于实现全自动化操作；其次，吖啶酯发光系统较为简单，碱性-过氧化氢就可以直接发光，不需要增强剂或催化剂，干扰因素少，本底极低，信噪比很高。
基于以上情况，研制开发高特异性、高灵敏度的吖啶酯类脂联素化学发光免疫分析试剂盒，定量检测血清和血浆中的脂联素，对糖尿病、动脉粥样、炎症和多种肿瘤的诊断起辅助作用，从理论与实际意义上讲是切实可行，并有广泛市场前景。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的检测脂联素的方法检测时间长、灵敏度低、重复性差的问题，而提供一种脂联素化学发光免疫检测试剂盒。
本发明首先提供一种脂联素化学发光免疫检测试剂盒，该试剂盒包括：
校准品、磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3；
所述的磁颗粒反应液R1包含链酶亲和素磁珠、NaCl、缓冲液和防腐剂；
所述的示踪结合物反应液R2包含吖啶酯标记的脂联素抗体、NaCl、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；
所述的捕获抗体反应液R3包含生物素标记的脂联素抗体、NaCl、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；
所述的脂联素抗体为脂联素单克隆抗体或脂联素多克隆抗体。
优选的是，所述的校准品的浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和250ng/mL；校准品基质配方为pH7.4的磷酸缓冲液、0.15mol/LNaCl和质量浓度为5％的BSA。
优选的是，所述的磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3中，缓冲液的pH均为6.0-8.0，缓冲液的缓冲盐均为2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、哌嗪-NN-双(2-乙磺酸)(PIPES)、3-(N-码啡基)-2-羟基丙磺酸钠(MOPSO)或Tris-盐酸，缓冲盐的浓度均为10-600mmoL/L。
优选的是，所述的磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3中，防腐剂均为NaN3、Proclin 300或Proclin950，防腐剂的质量浓度均为0.01％-1％。
优选的是，所述示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3中，蛋白稳定剂均为BSA、酪蛋白、BGG中的一种或几种，蛋白稳定剂的质量浓度均为0.1％-10％。
优选的是，所述示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3中，表面活性剂均为吐温、聚乙二醇或曲拉通，表面活性剂的质量浓度均为0.01％-1％。
优选的是，所述磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3中，NaCl的摩尔浓度均为0.15mol/L。
优选的是，所述的磁颗粒反应液R1中，链酶亲和素磁珠的质量浓度为0.03％-0.1％；链酶亲和素磁珠的粒径为1-3μm。
优选的是，所述的示踪结合物反应液R2中，阻断剂为IgG阻断剂、罗氏阻断剂或Scantibody阻断剂，阻断剂的浓度范围为10-500μg/mL。
优选的是，所述的示踪结合物反应液R2中，吖啶酯标记的脂联素抗体的浓度为0.1-3μg/mL；吖啶酯标记的脂联素抗体的制备方法：在避光条件下，取脂联素抗体和吖啶酯按照摩尔浓度1：(1-20)的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB，标记时间1-12h；
所述的吖啶酯结构如下：
Figure BDA0002539460900000031
优选的是，所述的捕获抗体反应液R3中，生物素标记的脂联素抗体的浓度为0.5-8μg/mL；生物素标记的脂联素抗体的制备方法：在避光条件下，取脂联素抗体和生物素按照摩尔浓度1：(1-50)的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB，标记时间2-24h；
所述的生物素结构如下：
Figure BDA0002539460900000041
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，采用双抗体夹心原理实现对ADPN的定量检测，结合发光强度和灵敏度都较高的化学发光物质(吖啶酯)对ADPN单克隆抗体(或ADPN多克隆抗体)进行标记，吖啶酯由激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光，不需要酶的参与，节约时间及成本。
本发明的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，以链霉亲和素磁颗粒作为固相载体，与生物素标记的类似物可以牢牢的结合在一起，减少非特异性吸附，提高测试样本的准确度，抗干扰能力强。
本发明的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，使用商品化链霉亲和素带有Tosyl官能团的磁颗粒与生物素化的抗体，磁颗粒与生物素化抗体的结合是在检测过程中结合，不需要人为将其包被在一起，减少人为操作带来的误差及降低试剂的批间差，并且可以保证试剂灵敏度。克服了现有的直接及间接偶联，通过清洗、悬浮、活化、抗体或链霉亲和素偶联、封闭、清洗、再悬浮这一系列复杂、耗时且不易控制的工艺进行直接或间接偶联至磁微粒上，包被比例及关键工序产生的批间差会对试剂的灵敏度造成影响。
本发明的脂联素化学发光免疫检测试剂盒将链霉亲和素磁颗粒和偶联标记物标记的ADPN抗体分成两项试剂，有效避免磁珠凝集、临床偏差变大和保证重复性的稳定，极大提高了检测效率。
本发明的脂联素化学发光免疫检测试剂盒为全自动的测量样本，并直接给出数值，减少人为操作误差，并且实现无人值守，缩短了临床检测所需的时间，同时检测精度较高，试剂与仪器组成封闭系统，系统误差小。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为实施例1的脂联素化学发光免疫检测试剂盒的定标曲线图。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合具体实施方式对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
本发明的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，包括：
校准品、磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3；
磁颗粒反应液R1包含链酶亲和素磁珠、NaCl、缓冲液和防腐剂；
示踪结合物反应液R2包含吖啶酯标记的ADPN抗体、NaCl、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；
捕获抗体反应液R3包含生物素标记的ADPN抗体、NaCl、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂。
上述技术方案中，校准品是校准函数中用做独立变量值的参考物质，包含两个到多个浓度水平，用于定量检测时对检测项目的校准。本发明校准品浓度优选为0ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和250ng/mL；校准品基质配方为pH7.4的磷酸缓冲液、0.15mol/LNaCl和质量浓度为5％的BSA。
上述技术方案，磁颗粒反应液R1中，链酶亲和素磁珠的质量浓度优选为0.03％-0.1％；链酶亲和素磁珠的粒径优选为1-3μm；防腐剂优选为叠氮钠、Proclin300或Proclin950，防腐剂的质量浓度优选为0.01％-1％；NaCl的摩尔浓度优选为0.15mol/L；缓冲液的pH优选为6.0-8.0，pH更优选为6.0-7.4；缓冲盐可以使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸、哌嗪-NN-双(2-乙磺酸)、3-(N-码啡基)-2-羟基丙磺酸钠或Tris-盐酸；缓冲盐的浓度优选为10-600mmoL/L，更优选为25-400mmoL/L。
上述技术方案，示踪结合物反应液R2中：吖啶酯标记的ADPN抗体的浓度优选为0.1-3μg/mL；NaCl的摩尔浓度优选为0.15mol/L；阻断剂可以使用IgG、罗氏或Scantibody阻断剂(均为商品化阻断剂，可通过商购获得)，阻断剂的浓度范围优选为10-500μg/mL，更优选为50-200μg/mL；防腐剂优选为叠氮钠、Proclin300或Proclin950，防腐剂的质量浓度优选为0.01％-1％；蛋白稳定剂优选为BSA、酪蛋白或BGG中的一种或几种，蛋白稳定剂的质量浓度为0.1％-10％；表面活性剂优选为吐温、聚乙二醇或曲拉通，表面活性剂的质量浓度优选为0.01％-1％；缓冲液的缓冲范围优选pH6.0-8.0，更优选pH6.0-7.4；缓冲盐可以使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸、哌嗪-NN-双(2-乙磺酸)、3-(N-码啡基)-2-羟基丙磺酸钠或Tris-盐酸；缓冲盐的浓度优选为10-600mmoL/L，更优选为25-400mmoL/L。
上述技术方案，捕获抗体反应液R3中：生物素标记的ADPN抗体的浓度优选为0.5-8μg/mL；NaCl的摩尔浓度优选为0.15mol/L；防腐剂优选为叠氮钠、Proclin300或Proclin950，防腐剂的质量浓度优选为0.01％-1％；蛋白稳定剂优选为BSA、酪蛋白、BGG中的一种或几种，蛋白稳定剂的质量浓度为0.1％-10％；表面活性剂优选为吐温、聚乙二醇或曲拉通，表面活性剂的质量浓度优选为0.01％-1％；缓冲液的缓冲范围优选pH6.0-8.0，更优选pH6.0-7.4；缓冲盐可以使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸、哌嗪-NN-双(2-乙磺酸)、3-(N-码啡基)-2-羟基丙磺酸钠或Tris-盐酸；缓冲盐的浓度优选为10-600mmoL/L，更优选为25-400mmoL/L。
上述技术方案中，ADPN抗体为ADPN单克隆抗体或ADPN多克隆抗体。
本发明的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，包括以下步骤：
步骤一：磁颗粒反应液R1的制备
将NaCl、缓冲液和防腐剂混合，配制成R1基础缓冲液；
取商品化的链酶亲和素磁珠(选自JSR公司，型号为MS300/Streptavidin)，用pH7.2的PBS(20mmol/L PB与150mmol/L NaCl)缓冲液清洗三次，然后将链酶亲和素磁珠的重悬至R1基础缓冲液中，配成链酶亲和素磁珠的质量浓度0.03％-0.1％的磁颗粒反应液R1；
步骤二：示踪结合物反应液R2的制备
将NaCl、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成R2基础缓冲液；
取ADPN抗体与溶解于溶剂中的吖啶酯按照摩尔浓度1:(1-20)的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4的PB缓冲液，标记时间1-12h，反应过程需要避光，标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为3mL/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，得到吖啶酯标记的ADPN抗体；其中，溶剂优选为DMF，吖啶酯溶液的浓度优选为3mg/mL，标记缓冲液的浓度优选为20mmol/L；
吖啶酯结构如下：
Figure BDA0002539460900000071
取吖啶酯标记的ADPN抗体置于R2基础缓冲液中，配成浓度为0.05-3μg/mL的示踪结合物反应液R2；
步骤三：捕获抗体反应液R3的制备
将NaCl、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成R3基础缓冲液；
取ADPN抗体与溶解于溶剂中的生物素按照摩尔浓度1:(1-50)的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4的PB缓冲液，标记时间2-24h，反应过程需要避光，标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为3mL/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，得到生物素标记的ADPN抗体；其中，溶剂优选为DMF，生物素溶液的浓度优选为3mg/mL，标记缓冲液的浓度优选为20mmol/L；
生物素结构如下：
Figure BDA0002539460900000081
取生物素标记的ADPN抗体置于R3基础缓冲液中，配成浓度0.5-8μg/mL的捕获抗体反应液R3；
步骤四：校准品
将脂联素抗原添加至校准品基质(配方为pH7.4的磷酸缓冲液、0.15mol/LNaCl和质量浓度为5％的BSA)中，配成理论浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和250ng/mL的校准品，然后使用一级校准品赋值(一级校准品是指根据国家/国际标准物质溯源，经过计算，并且临床验证后得到准确浓度的校准，可以用来给其他校准批次进行传值，省去中间溯源/计算的过程)，赋值后的浓度即为校准品使用浓度。
上述技术方案中，脂联素化学发光免疫检测试剂盒的使用方法为：
将待测样本、示踪结合物反应液R2、捕获抗体反应液R3按顺序加入反应杯中，孵育10min，在该过程中，抗体与抗原形成夹心复合物；然后在反应杯中继续加入磁颗粒反应液R1，孵育10min；加入清洗液，清洗；最后将预激发液(过氧化氢和硝酸溶液)和激发液(氢氧化钠溶液)加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数，样本中ADPN的含量与光量子数成正比。
在本发明中所使用的术语，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有说明。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细介绍。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
脂联素化学发光免疫检测试剂盒，配方为：
Figure BDA0002539460900000091
上述脂联素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
步骤一、磁颗粒反应液R1的制备
a.制备R1基础缓冲液
将NaCl、缓冲液和防腐剂混合，配制成R1基础缓冲液；
b.取的链酶亲和素磁珠，粒径3μm，用pH7.2的PBS缓冲液清洗三次，然后将磁珠重悬至R1基础缓冲液中(除磁珠之外的其它成分)，配成磁珠质量浓度0.1％的磁颗粒反应液R1。
步骤二、示踪结合物反应液R2的制备
a.制备R2基础缓冲液
将NaCl、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成R2基础缓冲液；
b.制备吖啶酯标记的ADPN单克隆抗体：
取ADPN单克隆抗体，与溶解于DMF中的吖啶酯(3mg/mL)按照摩尔浓度1：7.5的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB(20mmol/L)，标记时间4h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为3mL/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为268.5μg/mL。
c.制备示踪结合物反应液R2：
取吖啶酯标记的ADPN单克隆抗体原液于R2基础缓冲液中，配成吖啶酯标记的ADPN单克隆抗体浓度为0.2μg/mL的示踪结合物反应液R2。
步骤三、捕获抗体反应液R3的制备
a.制备R3基础缓冲液
将NaCl、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成R3基础缓冲液；
b.制备生物素标记的ADPN多克隆抗体：
取ADPN多克隆抗体，与溶解于DMF中的生物素(3mg/mL)按照摩尔浓度1:20的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB(20mmol/L)，标记时间4h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为3mL/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为267.1μg/mL。
c.制备捕获抗体反应液R3：
取生物素标记的ADPN多克隆抗体原液于R3基础缓冲液中(除抗体外的其它成分)，配成生物素标记的ADPN多克隆抗体浓度为0.7μg/mL的捕获抗体反应液R3。
步骤四：校准品
将脂联素抗原添加至含有5％BSA的PBS缓冲液中，配成理论浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和250ng/mL的校准品，然后使用一级校准品赋值，赋值后的浓度即为校准品使用浓度。
上述脂联素化学发光免疫检测试剂盒的测试方法：
第一步，将30μL样本、50μLR2、50μLR3反应液按照顺序加入反应杯中，孵育5min，在该过程中，抗体与抗原形成夹心复合物；第二步，在反应杯中继续加入40μL R1反应液，孵育5min；第三步，加入清洗液，清洗二次；第四步，将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数。
实施例2
脂联素化学发光免疫检测试剂盒，配方为：
Figure BDA0002539460900000111
Figure BDA0002539460900000121
上述脂联素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
步骤一、磁颗粒反应液R1的制备
a.制备R1基础缓冲液
将NaCl、缓冲液和防腐剂混合，配制成R1基础缓冲液；
取链酶亲和素磁珠，粒径3μm，用pH7.2的PBS缓冲液清洗三次，然后将磁珠重悬至R1基础缓冲液中(除磁珠之外的其它成分)，配成质量浓度0.1％的磁颗粒反应液R1。
步骤二、示踪结合物反应液R2的制备
a.制备R2基础缓冲液
将NaCl、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成R2基础缓冲液；
b.制备吖啶酯标记的ADPN多克隆抗体：
取ADPN多克隆抗体，与溶解于DMF中的吖啶酯(3mg/mL)按照摩尔浓度1：3的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB(20mmol/L)，标记时间12h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为3mL/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为198.4μg/mL。
c.制备示踪结合物反应液R2：
取吖啶酯标记的ADPN多克隆抗体原液于R2基础缓冲液中，配成吖啶酯标记的ADPN多克隆抗体浓度为1μg/mL的示踪结合物反应液R2。
步骤三、捕获抗体反应液R3的制备
a.制备R3基础缓冲液
将NaCl、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成R3基础缓冲液；
b.制备生物素标记的ADPN单克隆抗体：
取ADPN单克隆抗体，与溶解于DMF中的生物素(3mg/mL)按照摩尔浓度1:40的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB(20mmol/L)，标记时间8h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为3mL/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为218.9μg/mL。
c.制备捕获抗体反应液R3：
取生物素标记的ADPN单克隆抗体原液于R1基础缓冲液中(除抗体外的其它成分)，配成生物素标记的ADPN单克隆抗体浓度为2μg/mL的捕获抗体反应液R3。
步骤四：校准品
将脂联素抗原添加至含有5％BSA的PBS缓冲液中，配成理论浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和250ng/mL的校准品，然后使用公司一级校准品赋值，赋值后的浓度即为校准品使用浓度。
上述脂联素化学发光免疫检测试剂盒的测试方法：
第一步，将30μL样本、60μL捕获抗体反应液R3、50μL磁颗粒反应液R1顺序加入反应杯中，孵育18min，在该过程中，形成抗原-抗体-链霉素-磁珠复合物；第二部，在反应杯中加入清洗液，清洗一次；第三步在反应杯中继续加入60μL示踪结合物反应液R2，形成抗原抗体复合物，孵育5min；第四步，加入清洗液，清洗一次；第五步，将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数。
实施例3
脂联素化学发光免疫检测试剂盒，配方为：
Figure BDA0002539460900000141
上述脂联素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
步骤一、磁颗粒反应液R1的制备
a.制备R1基础缓冲液
将NaCl、缓冲液和防腐剂混合，配制成R1基础缓冲液；
取链酶亲和素磁珠，粒径1μm，用pH7.2的PBS缓冲液清洗三次，然后将磁珠重悬至R1基础缓冲液中(除磁珠之外的其它成分)，配成质量浓度0.03％的磁颗粒反应液R1。
步骤二、示踪结合物反应液R2的制备
a.制备R2基础缓冲液
将NaCl、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成R2基础缓冲液；
b.制备吖啶酯标记的ADPN单克隆抗体：
取ADPN单克隆抗体，与溶解于DMF中的吖啶酯(3mg/mL)按照摩尔浓度1：20的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB(20mmol/L)，标记时间1h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为3mL/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为247.2μg/mL。
c.制备示踪结合物反应液R2：
取吖啶酯标记的ADPN单克隆抗体原液于R1基础缓冲液中，配成吖啶酯标记的ADPN单克隆抗体浓度为1μg/mL的示踪结合物反应液R2。
步骤三、捕获抗体反应液R3的制备
a.制备R3基础缓冲液
将NaCl、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成R3基础缓冲液；
b.制备生物素标记的ADPN多克隆抗体：
取ADPN多克隆抗体，与溶解于DMF中的生物素(3mg/mL)按照摩尔浓度1:50的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB(20mmol/L)，标记时间2h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为3mL/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为227.6μg/mL。
c.制备捕获抗体反应液R3：
取生物素标记的ADPN多克隆抗体原液于R1基础缓冲液中(除抗体外的其它成分)，配成生物素标记的ADPN多克隆抗体浓度为2μg/mL的捕获抗体反应液R3。
步骤四：校准品
将脂联素抗原添加至含有5％BSA的PBS缓冲液中，配成理论浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和250ng/mL的校准品，然后使用公司一级校准品赋值，赋值后的浓度即为校准品使用浓度。
上述脂联素化学发光免疫检测试剂盒的测试方法：
第一步，将30μL样本及270μL清洗液混合均匀，取50μL稀释后样本、60μLR2、60μL捕获抗体反应液R3按顺序加入反应杯中，孵育10min，在该过程中，抗体与抗原形成夹心复合物；第二步，在反应杯中继续加入50μL磁颗粒反应液R1，孵育10min；第三步，加入清洗液，清洗一次；第四步，将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数。
以下为实施例1的脂联素(ADPN)化学发光免疫检测试剂盒的评价数据，实施例2-3在样本不变的情况下，检测效果接近，不再赘述。
表1为实施例1试剂盒的校准数据，用5P拟合方法将校准品的浓度对光量子数作图，即得到试剂盒的定标曲线，如图1所示。将临床样本的光量子数带入定标曲线，即可得到临床样本的浓度值。
表1 ADPN校准测试数据
Figure BDA0002539460900000161
Figure BDA0002539460900000171
1.1空白限
平行测定零值一级校准品A或样本稀释液20次，记录其信号值，计算均数M和标准差SD，并计算M+2SD的值，测定相邻浓度一级校准品B3次，记录其信号值，取平均值。根据零值一级校准品(A)和相邻浓度一级校准品(B)之间的浓度—信号值结果进行两点线性回归拟合出一次方程，M+2SD所对应的信号值带入方程，所得浓度即为空白限，结果应小于0.005ng/mL。
表2 ADPN空白限测试数据
Figure BDA0002539460900000172
Figure BDA0002539460900000181
1.2线性
将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度样本须接近线性范围的下限。对每一浓度的样本均重复检测3次，计算平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，计算线性相关系数r，结果应符合要求(线性范围为0ng/mL-250ng/mL，线性相关系数r≥0.9900)。
表3 ADPN线性测试数据
Figure BDA0002539460900000182
Figure BDA0002539460900000191
1.3重复性
浓度约为5ng/mL、50ng/mL的样本各重复检测10次，计算10次测量结果的平均值(M)和标准差(SD)，按公式(2)计算变异系数(CV)，变异系数(CV)应≤8.0％。
CV＝SD/M×100％…………………………………(2)
式中：CV—变异系数；
SD—测量结果的标准差；
M—测量结果的平均值。
表4 ADPN重复性测试数据
测定次数 低值样本(ng/mL) 高值样本(ng/mL)
Rep1 9.86 49.13
Rep2 9.77 49.81
Rep3 10.36 49.90
Rep4 9.65 51.04
Rep5 9.86 47.97
Rep6 9.76 51.23
Rep7 10.33 50.60
Rep8 9.83 49.79
Rep9 9.96 48.40
Rep10 9.92 47.96
测定均值M(ng/mL) 9.93 49.58
SD 0.23 1.20
CV 2.37％ 2.41％
1.4批间差
用3个批号试剂盒分别检测浓度约为5ng/mL、50ng/mL的样本，则3个批号试剂盒之间的批间变异系数(CV)≤15.0％。
表5 ADPN批间差测试数据
Figure BDA0002539460900000201
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
校准品、磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3；
所述的磁颗粒反应液R1包含链酶亲和素磁珠、NaCl、缓冲液和防腐剂；
所述的示踪结合物反应液R2包含吖啶酯标记的脂联素抗体、NaCl、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；
所述的捕获抗体反应液R3包含生物素标记的脂联素抗体、NaCl、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；
所述的脂联素抗体为脂联素单克隆抗体或脂联素多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的校准品的浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和250ng/mL；校准品基质配方为pH7.4的磷酸缓冲液、0.15mol/LNaCl和质量浓度为5％的BSA。
3.根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3中，缓冲液的pH均为6.0-8.0，缓冲液的缓冲盐均为2-(N-吗啡啉)乙磺酸、哌嗪-NN-双(2-乙磺酸)、3-(N-码啡基)-2-羟基丙磺酸钠或Tris-盐酸，缓冲盐的浓度均为10-600mmoL/L。
4.根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3中，防腐剂均为NaN3、Proclin 300或Proclin950，防腐剂的质量浓度均为0.01％-1％。
5.根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3中，蛋白稳定剂均为BSA、酪蛋白、BGG中的一种或几种，蛋白稳定剂的质量浓度均为0.1％-10％。
6.根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3中，表面活性剂均为吐温、聚乙二醇或曲拉通，表面活性剂的质量浓度均为0.01％-1％。
7.根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3中，NaCl的摩尔浓度均为0.15mol/L。
8.根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的磁颗粒反应液R1中，链酶亲和素磁珠的质量浓度为0.03％-0.1％；链酶亲和素磁珠的粒径为1-3μm。
9.根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的示踪结合物反应液R2中，阻断剂为IgG阻断剂、罗氏阻断剂或Scantibody阻断剂，阻断剂的浓度范围为10-500μg/mL。
10.根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，
所述的示踪结合物反应液R2中，吖啶酯标记的脂联素抗体的浓度为0.1-3μg/mL；吖啶酯标记的脂联素抗体的制备方法：在避光条件下，取脂联素抗体和吖啶酯按照摩尔浓度1：(1-20)的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB，标记时间1-12h；
所述的吖啶酯结构如下：
Figure FDA0002539460890000021
所述的捕获抗体反应液R3中，生物素标记的脂联素抗体的浓度为0.5-8μg/mL；生物素标记的脂联素抗体的制备方法：在避光条件下，取脂联素抗体和生物素按照摩尔浓度1：(1-50)的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB，标记时间2-24h；
所述的生物素结构如下：
Figure FDA0002539460890000031
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