CN112595845A - 透明质酸检测试剂盒及检测系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种透明质酸检测试剂盒及检测系统，该透明质酸检测试剂盒包括第一试剂、第二试剂、第三试剂及第四试剂，第一试剂中包括第一标记物标记的透明质酸结合物，透明质酸结合物包括明胶和透明质酸，透明质酸结合物中的明胶的平均分子量为50KD～100KD，第二试剂包括透明质酸结合蛋白，第三试剂包括第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体，第四试剂包括第三标记物标记的磁性微粒。上述透明质酸钠的检测试剂盒的灵敏度高。

Description

透明质酸检测试剂盒及检测系统
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，特别是涉及一种透明质酸检测试剂盒及检测系统。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic Acid，简称HA)是人体基质的主要成分之一，为具有O-β-D-葡萄糖醛酸基及N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖基为单位的双糖重复结构的一种粘多糖。HA主要由间质细胞合成，经淋巴循环入血液，由肝脏内皮细胞摄取，由特异的透明质酸酶水解，在体液中与蛋白质结合而存在，实际上属于糖蛋白的辅基。研究发现血清中透明质酸含量是反映肝内皮细胞功能，反映活动性纤维化，预测肝硬化的良好指标。对肝病患者而言，HA总体水平依据病损和病理改变程度表现为：肝硬化＞慢性活动性肝炎＞慢性迁延性肝炎＞急性肝炎。HA作为反映肝细胞纤维化损害的指标，优于谷丙转氨酶(ALT)。
对于透明质酸的分析检测主要有分光光度法、酶联免疫法、免疫荧光法、时间分辨法和化学发光法。目前市场上的透明质酸检测试剂盒主要利用免疫竞争进行检测(无论是酶联免疫还是化学发光免疫)，具体步骤一般是：将待测样本加入到包被有透明质酸的微孔板中，再加入一定量透明质酸结合蛋白(Hyaluronic Acid Binding Protein，HABP)，微孔板上包被的透明质酸和样本中待测的透明质酸竞争与HABP结合，形成HA-HABP复合物，再加入带标记的HABP抗体进行反应，形成固相HA-HABP-抗HABP抗体-酶的复合物后，加入底物测定发光值或吸光值，最后通过标准曲线测定样本浓度。然而，目前用于检测透明质酸的试剂盒的灵敏度还较差，仍需进一步提高。
发明内容
基于此，有必要提供一种具有较高灵敏度的透明质酸检测试剂盒。
此外，还有必要提供一种检测系统。
一种透明质酸检测试剂盒，包括：
第一试剂，包括第一标记物标记的透明质酸结合物，所述透明质酸结合物包括明胶和透明质酸，所述透明质酸结合物中的明胶的平均分子量为50kDa～100kDa；
第二试剂，包括透明质酸结合蛋白；
第三试剂，包括第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体，所述第二标记物为化学发光标记物；及
第四试剂，包括第三标记物标记的磁性微粒，所述第三标记物能够与所述第一标记物特异性结合。
上述透明质酸检测试剂盒，通过第一标记物标记的透明质酸结合物设置为由明胶连接第一标记物和透明质酸的结合物，使得透明质酸上与透明质酸结合蛋白结合的部位充分暴露，提高了标记后的透明质酸对透明质酸结合蛋白的亲和力，进而提高上述透明质酸检测试剂盒的灵敏度。经试验验证，上述透明质酸检测试剂盒的检出限(即分析灵敏度)不超过3.68ng/mL，具有较高的灵敏度。
在其中一个实施例中，所述第一试剂还包括无机盐、牛血清白蛋白、表面活性剂和Bis-Tris丙烷缓冲液，在所述第一试剂中，第一标记物标记的透明质酸结合物的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～1mg)：(4.385g～10g)：(5g～50g)：(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)。
在其中一个实施例中，所述第二试剂还包括无机盐、牛血清白蛋白、表面活性剂和Bis-Tris丙烷缓冲液，在所述第二试剂中，透明质酸结合蛋白的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～4mg)：(4.385g～10g)：(5g～50g)：(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)。
在其中一个实施例中，所述第三试剂还包括无机盐、牛血清白蛋白、表面活性剂和Bis-Tris丙烷缓冲液，在所述第三试剂中，第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.2mg～2mg)：(4.385g～10g)：(5g～50g)：(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)。
在其中一个实施例中，所述透明质酸结合物中的透明质酸的平均分子量为2kDa～1500kDa。
在其中一个实施例中，所述第一试剂中的无机盐、所述第二试剂中的无机盐和所述第三试剂中的无机盐分别独立地选自氯化钠和氯化钾中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述第一试剂中的表面活性剂、所述第二试剂中的表面活性剂和所述第三试剂中的表面活性剂分别独立地选自吐温80、吐温20和TritonX-100中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述化学发光标记物选自三联吡啶钌、金刚烷、鲁米诺、鲁米诺的衍生物、异鲁米诺、异鲁米诺的衍生物、吖啶酯、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
在其中一个实施例中，在所述第一试剂中，表面活性剂为吐温80，Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比为(5.6～564.5)：1。
在其中一个实施例中，在所述第二试剂中，表面活性剂为吐温80，Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比为(5.6～564.5)：1。
在其中一个实施例中，在所述第三试剂中，表面活性剂为吐温80，Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比为(5.6～564.5)：1。
在其中一个实施例中，所述第一试剂还包括免疫球蛋白G，在所述第一试剂中，免疫球蛋白G与第一标记物标记的透明质酸结合物的质量之比为(1mg～10mg)：(0.1mg～1mg)。
在其中一个实施例中，所述第二试剂中还包括免疫球蛋白G，在所述第二试剂中，免疫球蛋白G与透明质酸结合蛋白的质量之比为(1mg～10mg)：(0.1mg～4mg)。
在其中一个实施例中，所述第三试剂中还包括免疫球蛋白G，在所述第三试剂中，免疫球蛋白G与第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的质量之比为(1mg～10mg)：(0.2mg～2mg)。
在其中一个实施例中，在所述第一试剂中，第一标记物标记的透明质酸结合物的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～1mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～15g)：(0.2g～1g)：(20mmol～40mmol)。
在其中一个实施例中，在所述第二试剂中，透明质酸结合蛋白的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～4mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～15g)：(0.2g～1g)：(20mmol～40mmol)。
在其中一个实施例中，在所述第三试剂中，第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.2mg～2mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～15g)：(0.2g～1g)：(20mmol～40mmol)。
在其中一个实施例中，所述第一试剂中还含有防腐剂，在所述第一试剂中，防腐剂的质量与Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)。
在其中一个实施例中，所述第二试剂中还含有防腐剂，在所述第二试剂中，防腐剂的质量与Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)。
在其中一个实施例中，所述第三试剂中还含有防腐剂，在所述第三试剂中，防腐剂的质量与Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)。
在其中一个实施例中，所述第一标记物为生物素，所述第三标记物为链霉亲和素。
在其中一个实施例中，所述第二标记物选自三联吡啶钌、吖啶酯、碱性磷酸酶及辣根过氧化物酶中的一种。
在其中一个实施例中，所述磁性微粒为磁珠，所述磁珠的直径为2.5μm～3.5μm。
在其中一个实施例中，所述第四试剂还包括缓冲液，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液和MOPSO缓冲液中的至少一种。
一种检测系统，包括化学发光检测设备及上述的透明质酸检测试剂盒。
附图说明
图1为实施例1的透明质酸检测试剂盒与市售同类化学发光试剂盒的一致性评价结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。如无特别说明，本文中Bis-Tris丙烷是指1,3-双((三羟甲基)甲基氨基)丙烷，Bis-Tris指双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷。本文中“KD”或“kDa”是“kilodalton”的缩写，均指“千道尔顿”。
本发明一实施方式提供了一种透明质酸检测试剂盒，该透明质酸检测试剂盒通过检测形成的透明质酸-透明质酸结合蛋白-透明质酸结合蛋白的抗体复合物，而检测待测样品中透明质酸的含量。该透明质酸检测试剂盒包括第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂，其中，第一试剂包括第一标记物标记的透明质酸结合物，第二试剂包括透明质酸结合蛋白，第三试剂包括第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体，第四试剂包括第三标记物标记的磁性微粒。
具体地，第一试剂包括第一标记物标记的透明质酸结合物、无机盐、牛血清白蛋白、表面活性剂和Bis-Tris丙烷缓冲液。在第一试剂中，无机盐、牛血清白蛋白、表面活性剂及Bis-Tris丙烷缓冲液的相互配合，能够提高第一标记物标记的透明质酸结合物的稳定性，提高实验结果的可重复性；且第一试剂与第二试剂相配合，能够促进第二试剂中的透明质酸蛋白与待测样本中的透明质酸的亲和反应，进而提高上述透明质酸检测试剂盒的灵敏度和准确性。
第一试剂中的第一标记物标记的透明质酸结合物能与第二试剂中的透明质酸结合蛋白结合，同时也能与第四试剂中的第三标记物的磁性微粒结合。在一个可选地具体示例中，第一标记物为生物素，第三标记物为链霉亲和素。当然，在其他实施方式中，第一标记物和第三标记物不限于上述指出的物质，还可以是其他能够特异性结合的物质。
在本实施方式中，透明质酸结合物包括明胶与透明质酸，其中，明胶的平均分子量为50kDa～100kDa。在标记透明质酸时，传统的方法一般是用牛血清白蛋白(BSA)连接标记物和透明质酸，但由于BSA的结构特征，透明质酸上与透明质酸结合蛋白结合的部位容易被BSA包裹，而使得标记后的透明质酸不容易与透明质酸结合蛋白结合，影响检测的准确性，而本实施方式通过采用平均分子量为50kDa～100kDa的明胶，由于明胶的结构特点，可以使得透明质酸上与透明质酸结合蛋白结合的部位充分暴露，提高了标记后的透明质酸对透明质酸结合蛋白的亲和力，进而提高上述透明质酸检测试剂盒的灵敏度。进一步地，第一标记物通过明胶与透明质酸连接，连接第一标记物和透明质酸的明胶的平均分子量为50kDa～100kDa。更进一步地，第一标记物通过明胶与透明质酸连接，连接第一标记物和透明质酸的明胶的平均分子量为60kDa～80kDa。
其中，透明质酸结合物中的透明质酸的平均分子量为2kDa～1500kDa。进一步地，透明质酸的平均分子量为100kDa～1000kDa。采用平均分子量为100kDa～1000kDa的透明质酸更能够与样本中的透明质酸竞争结合透明质酸结合蛋白。
第一试剂中的无机盐主要用于为第一试剂提供适宜的离子浓度。可选地，第一试剂中的无机盐选自氯化钠和氯化钾中的至少一种。当然，第一试剂中的无机盐不限于上述指出的无机盐，还可以是其他无机盐。
第一试剂中的表面活性剂主要用于增强试剂溶解度、减少血脂干扰或残留效应、提高本试剂盒的检测准确性。可选地，第一试剂中的表面活性剂选自吐温80、吐温20和Triton X-100中的至少一种。
在本实施方式中，在第一试剂中，第一标记物标记的透明质酸结合物的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～1mg)：(4.385g～10g)：(5g～50g)：(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)。
在其中一个实施例中，在第一试剂中，第一标记物标记的透明质酸结合物的浓度为0.1mg/L～1mg/L，无机盐的浓度为4.385g/L～10g/L，牛血清白蛋白的浓度为5g/L～50g/L，表面活性剂的浓度为0.2g/L～1g/L，Bis-Tris丙烷缓冲液的浓度为20mmo/L～400mmol/L。需要说明的是，本文中的Bis-Tris丙烷缓冲液的浓度是指Bis-Tris丙烷缓冲液中Bis-Tris丙烷的浓度。当然，在其他实施例中，第一标记物标记的透明质酸结合物、无机盐、牛血清白蛋白、表面活性剂及Bis-Tris丙烷缓冲液的浓度可以适当调整，只要满足第一标记物标记的透明质酸结合物的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～1mg)：(4.385g～10g)：(5g～50g)：(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)即可。
进一步地，在第一试剂中，第一标记物标记的透明质酸结合物的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～1mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～30g)：(0.2g～1g)：(20mmol～200mmol)。更进一步地，在第一试剂中，第一标记物标记的透明质酸结合物的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～1mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～15g)：(0.2g～1g)：(20mmol～40mmol)。
在其中一个实施例中，第一试剂中的表面活性剂为吐温80，Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比为(5.6～564.5)：1。将Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比设置为(5.6～564.5)：1，能够增强试剂溶解度、减少血脂干扰或残留效应、提高本试剂盒的检测准确性。进一步地，Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比为(12～300)：1。更进一步地，Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比为(12～100)：1。
在本实施方式中，第一试剂的pH为7～8。进一步地，第一试剂的pH为7.34～7.45。将第一试剂的pH设为7.34～7.45，可以使得整个反应过程中的环境保持在中性环境中，有利于免疫反应。
具体地，第二试剂包括透明质酸结合蛋白、无机盐、牛血清白蛋白、表面活性剂和Bis-Tris丙烷缓冲液。在第二试剂中，无机盐、牛血清白蛋白、表面活性剂及Bis-Tris丙烷缓冲液的相互配合，能够提高透明质酸结合蛋白的稳定性，且与第一试剂相配合，能够提高上述透明质酸检测试剂盒的灵敏度、稳定性和重复性。
第二试剂中的透明质酸结合蛋白能与第一试剂中的第一标记物标记的透明质酸结合物特异性结合。第二试剂中的无机盐主要用于为第二试剂提供适宜的离子浓度。可选地，第二试剂中的无机盐选自氯化钠和氯化钾中的至少一种。当然，第二试剂中的无机盐不限于上述指出的无机盐，还可以是其他无机盐。第二试剂中的表面活性剂主要用于增强试剂溶解度、减少血脂干扰或残留效应、提高上述透明质酸检测试剂盒可靠性诊断。可选地，第二试剂中的表面活性剂选自吐温80、吐温20和Triton X-100中的至少一种。
在第二试剂中，透明质酸结合蛋白的质量与无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～4mg)：(4.385g～10g)：(5g～50g)：(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)。
在其中一个实施例中，在第二试剂中，透明质酸结合蛋白的浓度为0.1mg/L～4mg/L，无机盐的浓度为4.385g/L～10g/L，牛血清白蛋白的浓度为5g/L～50g/L，表面活性剂的浓度为0.2g/L～1g/L，Bis-Tris丙烷缓冲液的浓度为20mmo/L～400mmol/L。当然，在其他实施例中，透明质酸结合蛋白、无机盐、牛血清白蛋白、表面活性剂及Bis-Tris丙烷缓冲液的浓度可以适当调整，满足透明质酸结合蛋白的质量与无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～4mg)：(4.385g～10g)：(5g～50g)：(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)即可。
进一步地，在第二试剂中，透明质酸结合蛋白的质量与无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～4mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～30g)：(0.2g～1g)：(20mmol～200mmol)。更进一步地，在第二试剂中，透明质酸结合蛋白的质量与无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～4mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～15g)：(0.2g～1g)：(20mmol～40mmol)。
在其中一个实施例中，第二试剂中的表面活性剂为吐温80，Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比为(5.6～564.5)：1。将Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比设置为(5.6～564.5)：1，能够增强试剂溶解度、减少血脂干扰或残留效应、提高上述透明质酸试剂盒的检测准确性。进一步地，Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比为(12～300)：1。更进一步地，Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比为(12～100)：1。
在本实施方式中，第二试剂的pH为7～8。进一步地，第二试剂的pH为7.34～7.45。将第二试剂的pH设为7.34～7.45，可以使得整个反应过程中的环境保持在中性环境中，有利于免疫反应。
在一些实施例中，在第二试剂中还包括链霉亲和素。第二试剂中的链霉亲和素用于去除生物素的干扰，尤其是去除样本中生物素的干扰。具体地，在第二试剂中，透明质酸结合蛋白的质量与链霉亲和素的质量之比为(0.1mg～4mg)：(50μg～500μg)。在第二试剂中添加的微量的链霉亲和素既可以去除样本中生物素的干扰，也不会影响第一试剂中的生物素标记的透明质酸结合物与第四试剂中的链霉亲和素标记的磁性微粒的结合。进一步地，在第二试剂中，透明质酸结合蛋白的质量与链霉亲和素的质量之比为(0.1mg～4mg)：(100μg～400μg)。
具体地，第三试剂包括第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体、无机盐、牛血清白蛋白、表面活性剂和Bis-Tris丙烷缓冲液。在第三试剂中，无机盐、牛血清白蛋白、表面活性剂和Bis-Tris丙烷缓冲液的相互配合，能够提高第三标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的稳定性。
第三试剂中的第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体能与第二试剂中的透明质酸结合蛋白特异性结合。在本实施方式中，上述透明质酸检测试剂盒是利用电化学发光竞争免疫法来检测透明质酸的浓度，因此，第二标记物为适应电化学发光平台的标记物。进一步地，第二标记物为钌复合物。例如三联吡啶钌。当然，第二标记物不限于三联吡啶钌，还可以是其他适用于电化学发光平台的标记物。可以理解的是，在其他实施方式中，第二标记物可以根据检测试剂盒具体适用的平台进行选择。例如，当上述透明质酸检测试剂盒为适用于直接发光免疫平台的试剂盒时，则第二标记物可以选择吖啶酯、异鲁米诺或异鲁米诺衍生物等。当上述血清淀粉样蛋白A检测试剂盒为适用于化学发光酶免疫平台的试剂盒时，则第二标记物可以选择辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)、鲁米诺、鲁米诺衍生物或金刚烷。
第三试剂中的无机盐主要用于为第三试剂提供适宜的离子浓度。可选地，第三试剂中的无机盐选自氯化钠和氯化钾中的至少一种。当然，第三试剂中的无机盐不限于上述指出的无机盐，还可以是其他无机盐。第三试剂中的表面活性剂主要用于增强试剂溶解度、减少血脂干扰或残留效应、提高上述透明质酸试剂盒的检测准确性。可选地，第三试剂中的表面活性剂选自吐温80、吐温20和Triton X-100中的至少一种。
在第三试剂中，第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.2mg～2mg)：(4.385g～10g)：(5g～50g)：(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)，第二标记物为化学发光标记物。
在其中一个实施例中，在第三试剂中，第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的浓度为0.2mg/L～2mg/L，无机盐的浓度为4.385g/L～10g/L，牛血清白蛋白的浓度为5g/L～50g/L，表面活性剂的浓度为0.2g/L～1g/L，Bis-Tris丙烷缓冲液的浓度为20mmo/L～400mmol/L。同样地，在其他实施例中，第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体、无机盐、牛血清白蛋白、表面活性剂及Bis-Tris丙烷缓冲液的浓度可以适当调整，满足第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的质量与无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.2mg～2mg)：(4.385g～10g)：(5g～50g)：(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)即可。
进一步地，在第三试剂中，第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的质量与无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.2mg～2mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～30g)：(0.2g～1g)：(20mmol～200mmol)。更进一步地，在第三试剂中，第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的质量与无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.2mg～2mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～15g)：(0.2g～1g)：(20mmol～40mmol)。
在其中一个实施例中，第三试剂中的表面活性剂为吐温80，Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比为(5.6～564.5)：1。将Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比设置为(5.6～564.5)：1，能够增强试剂溶解度、减少血脂干扰或残留效应、提高上述透明质酸试剂盒的检测准确性。进一步地，Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比为(12～300)：1。更进一步地，Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比为(12～100)：1。
在本实施方式中，第三试剂的pH为7～8。进一步地，第三试剂的pH为7.34～7.45。
在其中一个实施例中，在第一试剂中，第一标记物标记的透明质酸结合物的质量与无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～1mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～30g)：(0.2g～1g)：(20mmol～200mmol)，第一试剂的pH为7.34～7.45；在第二试剂中，透明质酸结合蛋白的质量与无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～4mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～30g)：(0.2g～1g)：(20mmol～200mmol)，第二试剂的pH为7.34～7.45；在第三试剂中，第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的质量与无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.2mg～2mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～30g)：(0.2g～1g)：(20mmol～200mmol)，第三试剂的pH为7.34～7.45。
在其中一个实施例中，在第一试剂中，第一标记物标记的透明质酸结合物的质量与无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～1mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～15g)：(0.2g～1g)：(20mmol～40mmol)，第一试剂的pH为7.34～7.45；在第二试剂中，透明质酸结合蛋白的质量与无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～4mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～15g)：(0.2g～1g)：(20mmol～40mmol)，第二试剂的pH为7.34～7.45；在第三试剂中，第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的质量与无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.2mg～2mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～15g)：(0.2g～1g)：(20mmol～40mmol)，第三试剂的pH为7.34～7.45。
第四试剂包括第三标记物标记的磁性微粒，第三标记物能够与第一标记物特异性结合。在本实施方式中，第三标记物为链霉亲和素。可选地，磁性微粒为磁珠。进一步地，磁珠的直径为2.5μm～3.5μm。当然，在一些实施例中，第四试剂还包括缓冲液。可选地，第四试剂的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液和MOPSO缓冲液中的至少一种。在本实施方式中，第三标记物标记的磁性微粒的浓度为0.3mg/mL～0.75mg/mL。
在一些实施例中，第一试剂还包括免疫球蛋白G(IgG)。免疫球蛋白G可以降低待测样本中的其他物质(例如内源性异嗜性抗体IgG、异嗜性抗体IgM等)对检测透明质酸的干扰，提高上述透明质酸检测试剂盒的特异性。具体地，在第一试剂中，免疫球蛋白G与第一标记物标记的透明质酸结合物的质量之比为(1mg～10mg)：(0.1mg～1mg)。进一步地，在第一试剂中，免疫球蛋白G与第一标记物标记的透明质酸结合物的质量之比为(2mg～5mg)：(0.1mg～1mg)。可选地，免疫球蛋白G为鼠源、兔源或人源免疫球蛋白G。
在一些实施例中，第二试剂还包括免疫球蛋白G。免疫球蛋白G可以降低待测样本中的其他物质(例如内源性异嗜性抗体IgG、异嗜性抗体IgM等)对检测透明质酸的干扰，提高上述透明质酸检测试剂盒的特异性。具体地，在第二试剂中，免疫球蛋白G与透明质酸结合蛋白的质量之比为(1mg～10mg)：(0.1mg～4mg)。进一步地，在第二试剂中，免疫球蛋白G与透明质酸结合蛋白的质量之比为(2mg～5mg)：(0.1mg～4mg)。可选地，免疫球蛋白G为鼠源、兔源或人源免疫球蛋白G。
在一些实施例中，第三试剂还包括免疫球蛋白G。免疫球蛋白G可以降低待测样本中的其他物质(例如内源性异嗜性抗体IgG、异嗜性抗体IgM等)对检测透明质酸的干扰，提高上述透明质酸检测试剂盒的特异性。具体地，在第三试剂中，免疫球蛋白G与第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的质量之比为(1mg～10mg)：(0.2mg～2mg)。进一步地，在第三试剂中，免疫球蛋白G与第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的质量之比为(2mg～5mg)：(0.2mg～2mg)。可选地，免疫球蛋白G为鼠源、兔源或人源免疫球蛋白G。
在一些实施例中，第一试剂中还含有防腐剂。具体地，在第一试剂中，防腐剂的质量与Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为浓度为(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)。可选地，第一试剂中的防腐剂选自proclin 300和叠氮钠中的至少一种。在一个可选地具体示例中，第一试剂中的防腐剂为proclin 300。选用proclin 300作为第一试剂的防腐剂可以起到防腐的效果且对上述透明质酸检测试剂盒的灵敏度影响小。进一步地，在第一试剂中，防腐剂的质量与Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为浓度为(0.2g～1g)：(20mmol～40mmol)。
在一些实施例中，第二试剂中还含有防腐剂。具体地，在第二试剂中，防腐剂的质量与Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为浓度为(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)。可选地，第二试剂中的防腐剂选自proclin 300和叠氮钠中的至少一种。在一个可选地具体示例中，第二试剂中的防腐剂为proclin 300。选用proclin 300作为第二试剂的防腐剂可以起到防腐的效果且对上述透明质酸检测试剂盒的灵敏度影响小。进一步地，在第二试剂中，防腐剂的质量与Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为浓度为(0.2g～1g)：(20mmol～40mmol)。
在一些实施例中，第三试剂中还含有防腐剂。具体地，在第三试剂中，防腐剂的质量与Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为浓度为(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)。可选地，第三试剂中的防腐剂选自proclin 300和叠氮钠中的至少一种。在一个可选地具体示例中，第三试剂中的防腐剂为proclin 300。选用proclin 300作为第三试剂的防腐剂可以起到防腐的效果且对上述透明质酸检测试剂盒的灵敏度影响小。进一步地，在第三试剂中，防腐剂的质量与Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为浓度为(0.2g～1g)：(20mmol～40mmol)。
在一些实施例中，上述透明质酸检测试剂盒，还包括样本稀释液、质控品及校准品中的至少一种。
具体地，样本稀释液用于稀释待测样本。样本稀释液包括缓冲溶液。可选地，样本稀释液中的缓冲液为Bis-Tris丙烷缓冲液；样本稀释液中的pH为7～8。在一个可选地具体示例中，样本缓冲液还包括无机盐和表面活性剂。具体地，样本缓冲液中的无机盐和表面活性剂的种类及用量与第一试剂中的无机盐和表面活性剂的种类和用量相同。
具体地，质控品包括阴性对照品和阳性对照品。阴性对照品包括缓冲溶液。阴性对照品的缓冲液选自Bis-Tris丙烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、Bis-Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液和柠檬酸缓冲液中的至少一种。在一些实施例中，阴性对照品还包括无机盐、牛血清白蛋白和防腐剂。具体地，阴性对照品中的无机盐、牛血清白蛋白和防腐剂的种类及用量与第一试剂中的无机盐、牛血清白蛋白和防腐剂的种类和用量相同。可以理解的是，在其他实施方式中，阴性对照品不限于上述，还可以是其他缓冲液或正常人血清。可选地，阴性对照品的pH为7～8。
阳性对照品中还包括缓冲液和透明质酸。阳性对照品的缓冲液选自Bis-Tris丙烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、Bis-Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液和柠檬酸缓冲液中的至少一种。在一些实施例中，阳性对照品还包括无机盐、牛血清白蛋白和防腐剂。具体地，阳性对照品中的无机盐、牛血清白蛋白和防腐剂的种类及用量与第一试剂中的无机盐、牛血清白蛋白和防腐剂的种类和用量相同。可选地，阳性对照品的pH为7～8。
校准品的组成与阳性对照品大致相同，其不同在于，两者中的透明质酸的浓度不同。
上述透明质酸检测试剂盒至少具有以下优点：通过第一标记物标记的透明质酸结合物设置为由明胶连接第一标记物和透明质酸的结合物，使得透明质酸上与透明质酸结合蛋白结合的部位充分暴露，提高了标记后的透明质酸对透明质酸结合蛋白的亲和力，进而提高上述透明质酸检测试剂盒的灵敏度。此外，第一试剂、第二试剂及第三试剂中的无机盐、牛血清白蛋白、表面活性剂和Bis-Tris丙烷缓冲液的相互配合，能够提高第一标记物标记的透明质酸结合物、透明质酸结合蛋白及第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的稳定性，提高实验结果的可重复性，且第一试剂与第二试剂的配合还能够促进第二试剂中的透明质酸蛋白与待测样本中的透明质酸的亲和反应，进一步提高上述透明质酸检测试剂盒的准确性和灵敏度。
进一步地，该检测试剂盒还适用于电化学发光平台，与传统的利用化学直接发光法或化学酶促反应发光法的检测试剂盒相比，上述透明质酸检测试剂盒的灵敏度和准确性更高。并且，结合全自动化学发光系统，加样、孵育、清洗和检测等步骤均可全自动化，避免了人为操作带来的结果偏差，提高了工作效率，并且可以通过内置校准曲线到测试软件，只需测试患者血清或血浆，18分钟就可以完成透明质酸的定量检测，使检测更快速、更可靠、更稳定。
此外，本发明一实施方式还提供了一种检测系统，用于检测透明质酸，该检测系统包括化学发光检测设备和上述透明质酸检测试剂盒。具体地，上述检测设备为电化学分析仪。在一个具体示例中，电化学分析仪为深圳普门科技股份有限公司的电化学分析仪。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质和用于调节pH的物质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
实施例1的透明质酸检测试剂盒由第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、校准品和质控品组成，其中：
第一试剂包括生物素标记的透明质酸结合物(下文简称生物素标记的HA)、氯化钠、牛血清白蛋白(下文简称BSA)、吐温80、ProClin300和Bis-Tris丙烷缓冲液组成，在第一试剂中，生物素标记的HA的浓度为0.5mg/L，氯化钠的浓度为8.77g/L，BSA的浓度为15g/L，吐温80的浓度为0.2g/L，ProClin300的浓度为0.5g/L，Bis-Tris丙烷缓冲液的浓度为20mmol/L；生物素标记的HA由生物素、平均分子量为50KD的明胶和平均分子量为100KD的透明质酸依次连接而；第一试剂的pH为7.4；在第一试剂中，BIS-Tris丙烷与吐温80的质量之比为28.33：1。
第二试剂由透明质酸结合蛋白(下文简称HABP)、氯化钠、BSA、吐温80、ProClin300和Bis-Tris丙烷缓冲液组成，在第二试剂中，HABP的浓度为2mg/L，氯化钠的浓度为8.77g/L，BSA的浓度为15g/L，吐温80的浓度为0.2g/L，ProClin300的浓度为0.5g/L，Bis-Tris丙烷缓冲液的浓度为20mmo/L；第二试剂的pH为7.4。
第三试剂由三联吡啶钌标记的透明质酸结合蛋白的抗体(下文简称Ru-HABP抗体)、氯化钠、BSA、吐温80、ProClin300和Bis-Tris丙烷缓冲液组成，在第三试剂中，Ru-HABP抗体的浓度为0.5mg/L，氯化钠的浓度为8.77g/L，BSA的浓度为15g/L，吐温80的浓度为0.2g/L，ProClin300的浓度为0.5g/L，Bis-Tris丙烷缓冲液的浓度为20mmo/L；第三试剂的pH为7.4。
第四试剂由链霉亲和素标记的磁珠和磷酸缓冲液组成，其中链霉亲和素标记的磁珠的工作浓度为0.75mg/mL，磁珠的直径为2.8μm；第四试剂的pH为7.4。
校准品由透明质酸、氯化钠、BSA、ProClin300和Bis-Tris丙烷缓冲液组成，在校准品中，氯化钠的浓度为8.77g/L，BSA的浓度为15g/L，ProClin300的浓度为0.5g/L，Bis-Tris丙烷缓冲液的浓度为20mmo/L，校准品的pH为7.4；高低值校准品中透明质酸(平均分子量为7KD)的浓度分别为1400ng/mL～1900ng/mL和50ng/mL～100ng/mL。
质控品由透明质酸、氯化钠、BSA、ProClin300和Bis-Tris丙烷缓冲液组成，在质控品中，氯化钠的浓度为8.77g/L，BSA的浓度为15g/L，ProClin300的浓度为0.5g/L，Bis-Tris丙烷缓冲液的浓度为20mmo/L，校准品的pH为7.4；高低值质控品中透明质酸(平均分子量为7KD)的浓度分别为800ng/mL～1200ng/mL和80ng/mL～140ng/mL。
实施例1的透明质酸检测试剂盒的制备包括但不限于以下步骤：
1.第一试剂的制备：
(1)将透明质酸结合物(HA结合物为平均分子量为50KD的明胶与平均分子量为100KD的透明质酸的结合物)用透析袋透析24h以除去杂蛋白，透析后测试HA结合物的浓度，并按照HA结合物与生物素的添加比例为80:1添加的生物素用量，在常温(26℃)下持续搅拌反应2h，得到含有生物素标记的HA的反应物。
(2)将步骤(1)的反应物用透析袋透析24h以除去未结合的生物素，透析后测试检测样品读取280nm的吸收，计算生物素标记的HA的浓度。
(3)在含5.65g BIS-Tris丙烷的水溶液中添加8.77g氯化钠、15gBSA、0.2g吐温80、0.5gProClin300和0.5mg生物素标记的HA，搅拌溶解；然后用0.2M盐酸或0.2M氢氧化钠调节pH至7.4，用水定容至1000mL后复测pH值，使之处于7.35～7.45；接着0.22μm过滤后于4℃保存。
2.第二试剂的制备：
在含5.65g BIS-Tris丙烷的水溶液中添加8.77g氯化钠、15gBSA、0.2g吐温80、0.5gProClin300和2mgHABP，搅拌溶解；然后用0.2M盐酸或0.2M氢氧化钠调节pH至7.4，用水定容至1000mL后复测pH值，使之处于7.35～7.45；接着0.22μm过滤后于4℃保存。
3.第三试剂的制备：
在含5.65g BIS-Tris丙烷的水溶液中添加8.77g氯化钠、15gBSA、0.2g吐温80、0.5gProClin300和0.5mgRu-HABP抗体，搅拌溶解；然后用0.2M盐酸或0.2M氢氧化钠调节pH至7.4，用水定容至1000mL后复测pH值，使之处于7.35～7.45；接着0.22μm过滤后于4℃保存。
4.第四试剂的制备：
用磷酸盐缓冲液将商品化的链霉亲和素标记的磁珠母液稀释至0.75mg/mL，其中，磁珠的平均粒径为2.8μm。
5.质控品和校准品的制备：
(1)在含5.65g BIS-Tris丙烷的水溶液中添加8.77g氯化钠、15gBSA和0.5gProClin300，搅拌溶解；然后用0.2M盐酸或0.2M氢氧化钠调节pH至7.4，用水定容至1000mL后复测pH值，使之处于7.35～7.45；接着0.22μm过滤后，得到稀释液，于4℃保存。
(2)将商品化的HA抗原粉末(纯度为90％)，用步骤(1)的稀释液溶解，配制抗原储存液(1mg/mL)，根据校准品和质控品的工作浓度，用稀释液对抗原储存液进行稀释，配制成校准品高值浓度为1400ng/mL～1900ng/mL，配制成校准品低值浓度为50ng/mL～100ng/mL；质控品高值浓度为800ng/mL～1200ng/mL，质控品低值浓度为80ng/mL～140ng/mL。
实施例2
本实施例的透明质酸检测试剂盒的组成与实施例1的透明质酸检测试剂盒的组分大致相同，其不同在于，本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂、第二试剂、第三试剂、质控品和校准品中的Bis-Tris丙烷缓冲液的浓度均为400mmo/L，本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂、第二试剂、第三试剂、质控品和校准品中的Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比均为564.5：1。
实施例3
本实施例的透明质酸检测试剂盒的组成与实施例1的透明质酸检测试剂盒的组分大致相同，其不同在于，本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂、第二试剂、第三试剂、质控品和校准品中的Bis-Tris丙烷缓冲液的浓度均为40mmo/L，本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂、第二试剂、第三试剂、质控品和校准品中的Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比均为56.45：1。
实施例4
本实施例的透明质酸检测试剂盒的组成与实施例1的透明质酸检测试剂盒的组分大致相同，其不同在于，本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂、第二试剂、第三试剂、质控品和校准品中的Bis-Tris丙烷缓冲液的浓度均为100mmo/L，本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂、第二试剂、第三试剂、质控品和校准品中的Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比均为141.11：1。
实施例5
本实施例的透明质酸检测试剂盒的组成与实施例3的透明质酸检测试剂盒的组分大致相同，其不同在于，本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂、第二试剂及第三试剂中均含鼠源免疫球蛋白G，在本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂、第二试剂及第三试剂中的鼠源免疫球蛋白G的浓度均为20mg/L，免疫球蛋白G与生物素标记的HA的质量之比为20：0.5，免疫球蛋白G与生物素标记的HABP的质量之比为20：2，免疫球蛋白G与Ru-HABP抗体的质量之比为20：0.5。
实施例6
本实施例的透明质酸检测试剂盒的组成与实施例5的透明质酸检测试剂盒的组分大致相同，其不同在于，本实施例的透明质酸检测试剂盒中，第二试剂含有链霉亲和素，且在第二试剂中透明质酸结合蛋白与链霉亲和素的质量之比为2mg：280μg。
实施例7
本实施例的透明质酸检测试剂盒的组成与实施例1的透明质酸检测试剂盒的组分大致相同，其不同在于，本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂、第二试剂及第三试剂中的氯化钠的浓度均为4.385g/L，BSA的浓度均为5g/L，吐温80的浓度均为1g/L；质控品和校准品中的氯化钠的浓度均为4.385g/L，BSA的浓度均为5g/L。
实施例8
本实施例的透明质酸检测试剂盒的组成与实施例1的透明质酸检测试剂盒的组分大致相同，其不同在于，本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂中的生物素标记的HA的浓度为0.1mg/L，第二试剂中的HABP的浓度为0.1mg/L；第三试剂中的Ru-HABP抗体的浓度为0.2mg/L。
实施例9
本实施例的透明质酸检测试剂盒的组成与实施例1的透明质酸检测试剂盒的组分大致相同，其不同在于，本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂中的生物素标记的HA的浓度为1mg/L，第二试剂中的HABP的浓度为4mg/L；第三试剂中的Ru-HABP抗体的浓度为2mg/L。
实施例10
本实施例的透明质酸检测试剂盒的组成与实施例1的透明质酸检测试剂盒的组分大致相同，其不同在于，本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂、第二试剂、第三试剂、质控品和校准品中的无机盐均为氯化钾，本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂、第二试剂、第三试剂、质控品和校准品中表面活性剂均为吐温20。
实施例11
本实施例的透明质酸检测试剂盒的组成与实施例1的透明质酸检测试剂盒的组分大致相同，其不同在于，本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂、第二试剂、第三试剂、质控品和校准品均不含Bis-Tris丙烷缓冲液，均是用HEPES缓冲液替代Bis-Tris丙烷缓冲液，所用的HEPES缓冲液的浓度均为11.915g/L(0.05mol/L)。
实施例12
本实施例的透明质酸检测试剂盒的组成与实施例1的透明质酸检测试剂盒的组分大致相同，其不同在于，本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂、第二试剂、第三试剂、质控品和校准品均不含Bis-Tris丙烷缓冲液，均是用磷酸盐缓冲液替代Bis-Tris丙烷缓冲液，所用的磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L。
实施例13
本实施例的透明质酸检测试剂盒的组成与实施例1的透明质酸检测试剂盒的组分大致相同，其不同在于，本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂、第二试剂、第三试剂、质控品和校准品均不含Bis-Tris丙烷缓冲液，均是用Bis-Tris(双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷)缓冲液替代Bis-Tris丙烷缓冲液，所用的Bis-Tris缓冲液的浓度为49.14g/L(0.2mol/L)。
实施例14
本实施例的透明质酸检测试剂盒的组成与实施例1的透明质酸检测试剂盒的组分大致相同，其不同在于，本实施例的透明质酸检测试剂盒中的第一试剂中的明胶的平均分子量为100KD。
对比例1
对比例1的透明质酸检测试剂盒的组成与实施例1的透明质酸检测试剂盒的组分大致相同，其不同在于，对比例1的第一试剂中的生物素标记的HA是由生物素、BSA和平均分子量为50kDa的透明质酸依次连接而成。
对比例2
对比例2的透明质酸检测试剂盒的组成与实施例1的透明质酸检测试剂盒的组分大致相同，其不同在于，对比例2的第一试剂中的生物素标记的HA是由生物素、平均分子量为30kDa的明胶和平均分子量为2000kDa的透明质酸依次连接而成。
测试：
1.对各实施例和各对比例的透明质酸检测试剂盒进行如下测试：
1)将试剂盒在仪器测试已知浓度的一系列工作校准品，得出工作校准品浓度和信号值，采用四参数拟合方式，拟合主曲线；采用写卡工具，将主曲线信息及试剂盒批号等信息写在RFID卡上；及将试剂盒RFID卡上的试剂信息和主曲线信息导入系统；
2)提前30min将第四试剂放入测定仪自动搅拌磁珠，使其处于悬浮状态；
3)测试校准品，通过配套校准品的测试结果校准系统导入的主曲线，得到当前系统测试的标准曲线；
4)在样本申请界面进行申请样本和质控品测试，从申请到出结果的测试时间为18min。
透明质酸检测试剂盒的性能指标测试按照常规制造及检定程序进行鉴定：检出限按照《WST514-2017临床检验方法检出能力的确立和验证》进行测定、准确度按照《体外诊断试剂分析性能评估(准确度-回收实验)技术审查指导原则》进行测定、重复性按照《化学发光免疫类体外诊断试剂(盒)产品技术审评规范(2017版)》进行测定、校准品质控品均匀性按照《YYT 1652-2019体外诊断试剂用质控物通用技术要求》测定、特异性按照《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则(征求意见稿)》测定、加速热稳定性按照《YYT 1579-2018体外诊断医疗器械体外诊断试剂稳定性评价》测定、开瓶稳定性按照《YYT1579-2018体外诊断医疗器械体外诊断试剂稳定性评价》测定、在机稳定性按照《YYT 1579-2018体外诊断医疗器械体外诊断试剂稳定性评价》测定。
各实施例和对比例的结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002826741510000211
Figure BDA0002826741510000221
Figure BDA0002826741510000231
注：透明质酸化学发光检测试剂盒的性能常规标准如下：检出限应不大于5.0ng/mL，准确度回收率应在90％～110％之间，线性范围在5ng/mL～2000ng/mL区间内，相关系数(r)应不低于0.990，校准品质控品瓶内均匀性应CV≤5.0％，瓶间均匀性应CV≤8％。
由表1可知，对比例1～2的检测试剂盒的检出限(即分析灵敏度)均大于5ng/mL，不符合透明质酸检测试剂盒的性能常规标准。而各实施例的检测试剂盒的检出限(即分析灵敏度)均不超过3.68ng/mL，优于透明质酸化学发光检测试剂盒的性能常规标准，说明本申请的透明质酸检测试剂盒具有较高的灵敏度。其中，实施例1～10及14的检出限为0.48ng/mL～2.98ng/mL，实施例11～13的检出限为3.46ng/mL～3.85ng/mL，因此说明Bis-Tris丙烷与吐温80配合可以提高试剂盒的检出限。
采用添加回收的方法测量各检测试剂盒的准确度，各实施例的检测试剂盒的回收率均在90％～110％之间；多次重复测试时，各实施例的测试结果的变异系数CV≤5.0％，线性检测范围在5ng/mL～2000ng/mL区间内，其相关系数(r)不低于0.990；校准品质控品瓶内均匀性的变异系数CV≤5％，校准品质控品瓶间均匀性的变异系数CV≤5％。
采用各检测试剂盒检测类似物层粘蛋白(LN)(100ng/mL)、Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢNP)(100ng/mL)、Ⅳ型胶原(CIV)(1000ng/mL)，各实施例的检测试剂盒的测定结果不高于10ng/mL，说明本申请的透明质酸检测试剂盒具有较强的特异性，其中，实施例5和6较优，说明特异性强。
对各检测试剂盒进行稳定性检测：37℃恒温放置12天后的检测检出限、准确度、重复性、线性、特异性等性能指标，实施例1～10的检测试剂盒的上述各性能指标均能满足接受标准，加速热稳定性好；试剂开瓶后2℃～8℃放置4周后检测检出限、准确度、重复性、线性和特异性等性能指标，实施例1～10的检测试剂盒的上述各性能指标均能满足接受标准，开瓶稳定性好；试剂盒开瓶放置电化学发光仪上8周后检测检出限、准确度、重复性、线性、特异性等性能指标，实施例1～10的检测试剂盒的上述各性能指标均满足接受标准，在机稳定性良好。
2.对比实施例1的透明质酸检测试剂盒与市售同类化学发光试剂盒对相同样品检测的一致性，结果如表2和图1所示。其中，图1的横坐标中的“研究试剂盒”是指实施例1的透明质酸检测试剂盒，纵坐标中的“对比试剂盒”是指市售同类化学发光试剂盒，横坐标和纵坐标的浓度单位均为ng/mL。样品中透明质酸的浓度在6.62ng/mL～2124ng/mL范围内。
表2
Figure BDA0002826741510000241
由上可知，实施例1的透明质酸检测试剂盒与市售同类化学发光试剂盒对相同样品检测的一致性好。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种透明质酸检测试剂盒，其特征在于，包括：
第一试剂，包括第一标记物标记的透明质酸结合物，所述透明质酸结合物包括明胶和透明质酸，所述透明质酸结合物中的明胶的平均分子量为50kDa～100kDa；
第二试剂，包括透明质酸结合蛋白；
第三试剂，包括第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体，所述第二标记物为化学发光标记物；及
第四试剂，包括第三标记物标记的磁性微粒，所述第三标记物能够与所述第一标记物特异性结合。
2.根据权利要求1所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂还包括无机盐、牛血清白蛋白、表面活性剂和Bis-Tris丙烷缓冲液，在所述第一试剂中，第一标记物标记的透明质酸结合物的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～1mg)：(4.385g～10g)：(5g～50g)：(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)；
所述第二试剂还包括无机盐、牛血清白蛋白、表面活性剂和Bis-Tris丙烷缓冲液，在所述第二试剂中，透明质酸结合蛋白的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～4mg)：(4.385g～10g)：(5g～50g)：(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)；
所述第三试剂还包括无机盐、牛血清白蛋白、表面活性剂和Bis-Tris丙烷缓冲液，在所述第三试剂中，第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.2mg～2mg)：(4.385g～10g)：(5g～50g)：(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)。
3.根据权利要求1或2所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，所述透明质酸结合物中的透明质酸的平均分子量为2kDa～1500kDa。
4.根据权利要求2所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂中的无机盐、所述第二试剂中的无机盐和所述第三试剂中的无机盐分别独立地选自氯化钠和氯化钾中的至少一种；及/或，
所述第一试剂中的表面活性剂、所述第二试剂中的表面活性剂和所述第三试剂中的表面活性剂分别独立地选自吐温80、吐温20和Triton X-100中的至少一种；及/或，
所述化学发光标记物选自三联吡啶钌、金刚烷、鲁米诺、鲁米诺的衍生物、异鲁米诺、异鲁米诺的衍生物、吖啶酯、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
5.根据权利要求2所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，在所述第一试剂中，表面活性剂为吐温80，Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比为(5.6～564.5)：1；
及/或，在所述第二试剂中，表面活性剂为吐温80，Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比为(5.6～564.5)：1；
及/或，在所述第三试剂中，表面活性剂为吐温80，Bis-Tris丙烷与吐温80的质量之比为(5.6～564.5)：1。
6.根据权利要求2所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂还包括免疫球蛋白G，在所述第一试剂中，免疫球蛋白G与第一标记物标记的透明质酸结合物的质量之比为(1mg～10mg)：(0.1mg～1mg)；
及/或，所述第二试剂中还包括免疫球蛋白G，在所述第二试剂中，免疫球蛋白G与透明质酸结合蛋白的质量之比为(1mg～10mg)：(0.1mg～4mg)；
及/或，所述第三试剂中还包括免疫球蛋白G，在所述第三试剂中，免疫球蛋白G与第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的质量之比为(1mg～10mg)：(0.2mg～2mg)。
7.根据权利要求2及4～6中任一项所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，在所述第一试剂中，第一标记物标记的透明质酸结合物的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～1mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～15g)：(0.2g～1g)：(20mmol～40mmol)；
在所述第二试剂中，透明质酸结合蛋白的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.1mg～4mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～15g)：(0.2g～1g)：(20mmol～40mmol)；
在所述第三试剂中，第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体的质量、无机盐的质量、牛血清白蛋白的质量、表面活性剂的质量及Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.2mg～2mg)：(4.385g～8.77g)：(5g～15g)：(0.2g～1g)：(20mmol～40mmol)。
8.根据权利要求2及4～6中任一项所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂中还含有防腐剂，在所述第一试剂中，防腐剂的质量与Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)；
及/或，所述第二试剂中还含有防腐剂，在所述第二试剂中，防腐剂的质量与Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)；
及/或，所述第三试剂中还含有防腐剂，在所述第三试剂中，防腐剂的质量与Bis-Tris丙烷的摩尔量之比为(0.2g～1g)：(20mmol～400mmol)。
9.根据权利要求1～2及4～6中任一项所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，所述第一标记物为生物素，所述第三标记物为链霉亲和素；
及/或，所述第二标记物选自三联吡啶钌、吖啶酯、碱性磷酸酶及辣根过氧化物酶中的一种；
及/或，所述磁性微粒为磁珠，所述磁珠的直径为2.5μm～3.5μm；
及/或，所述第四试剂还包括缓冲液，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液和MOPSO缓冲液中的至少一种。
10.一种检测系统，其特征在于，包括化学发光检测设备及权利要求1～9任一项所述的透明质酸检测试剂盒。
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