CN112782156B - 一种壳多糖酶3样蛋白1试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)试剂盒,本试剂盒是基于超顺磁性纳米微粒作为固相载体,吖啶酯作为发光标记物的直接化学发光平台,利用经典的双抗体夹心法捕获血清中的待测物,应用全自动化学发光仪进行实验的测试和试剂优化调试。本发明可准确的反映患者肝炎症活动度以及纤维化程度。针对CHI3L1的检测可作为一种非创伤性辅助肝纤维化诊断方法,具有较大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医学、免疫和体外诊断领域,具体讲是一种壳多糖酶3样蛋白1试剂盒及其制备方法。
背景技术
Chitinase-3-like protein 1(CHI3L1)是一种分泌型糖蛋白,约40kDa大小,名字来自N端三个氨基酸存在于分泌形式及其相对分子质量。
通过系统生物学方法,结合二代测序表达谱技术和蛋白质组学技术,我们发现CHI3L1可作为肝硬化的诊断、预后评估、治疗效果监测及病程监测的标志物。血清CHI3L1水平在酒精性肝硬化病人中升高,Kamal等的研究表明血液中的CHI3L1蛋白水平与丙肝病毒慢性感染和肝纤维化有关。此外,CHI3L1也可以作为预防及治疗的良好标靶。
目前肝纤维化的诊断金标准为肝活组织病理学检查,但是检查的有创性极大地限制了其临床应用,目前大量的肝纤维化无创诊断新技术的研究,都是为了替代肝穿刺,但是总体临床实用性不能令人满意,进一步探索新的血清标志物十分重要。CHI3L1在组织重塑中扮演重要的角色,作为一个较为新兴的血清学标志物,较其他传统的肝纤维化标志物(如透明质酸,IV型胶原,III型前胶原氮端肽,层粘连蛋白,纤维连接蛋白等)具有更好的敏感性和特异性。因此对肝纤维化疾病患者的早期诊断具有显著价值。目前检测CHI3L1常用ELISA法、化学发光免疫分析法(包括酶促化学发光法CLEIA和直接化学发光法CLIA),其中化学发光已开始应用于临床检测及科学研究,其敏感性与特异性较传统酶联免疫法都有所提高。但目前检测壳多糖酶3样蛋白1产品少,检测平台有局限性,检测效率低。
发明内容
本发明的目的在于开发出一款基于磁微粒化学发光法,可用于高通量临床自动化无创检测的诊断试剂盒,解决目前检测壳多糖酶3样蛋白1产品少,检测平台有局限性,检测效率低的问题,提供一种速度快、准确度高的高通量化学发光法检测CHI3L1试剂盒及制备方法。
本发明的技术解决方案如下:一种壳多糖酶3样蛋白1试剂盒,包括固相试剂、发光试剂、校准品及质控品;
所述固相试剂包括如下含量的各成分:
固相试剂缓冲液:缓冲液10-100mM、无机盐5-30g/L、蛋白保护剂2-40g/L、表面活性剂0.01-3g/L、防腐剂0.5-1.53g/L、阻断剂;
磁微粒:浓度不低于0.1g/L的包被有CHI3L1抗体的磁微粒。
作为优化,所述固相试剂的制备方法为:将基于羧基官能团的磁性微粒,经过EDC/sulfo-NHS两步法进行活化,活化清洗后,磁性微粒表面羧基变成具有活性的中间酯,按照1mg磁性微粒交联20μg CHI3L1包被抗体的比例进行交联,抗体结构上的伯胺基和磁性微粒表面活化酯结合形成稳定的共价结构,清洗掉未结合的游离抗体后,加入封闭剂封闭掉未反应的剩余活化中间酯,抗体即可稳定的固定在磁性微粒表面,按照所需的浓度0.1~0.6mg/ml稀释成工作液浓度即完成固相试剂的制备。
作为最优化,所述固相试剂的具体制备方法为:
a.羧基磁珠充分混匀后取出1ml(10mg/ml)置于离心管中;
b.用活化缓冲液清洗磁珠3次,加1ml活化缓冲液重悬后备用;
c.分别称取一定质量的活化剂EDC和sulfo-NHS随后加入对应体积的活化缓冲液至浓度为10mg/ml;
d.往备用的磁珠中分别加入一定量的Sulfo-NHS和EDC,充分混匀后置于摇床活化反应20分钟;
e.将活化后的磁珠用活化缓冲液清洗3遍,加入1ml交联缓冲液重悬至浓度为10mg/ml,准确量取抗体加入备用磁珠中并充分混合,置于摇床室温反应2小时;
f.反应结束后用交联缓冲液清洗3遍磁珠,加入1ml封闭缓冲液重悬,再室温反应1小时;
g.封闭完成后用封闭缓冲液清洗磁珠4遍,最后重悬至1ml,即浓度为10mg/ml;
h.取包被好抗体的磁珠加入到一定量的固相试剂缓冲液中,充分混匀后备用。
所述固相试剂缓冲液为:缓冲液10-100mM、无机盐5-30g/L、蛋白保护剂2-40g/L、表面活性剂0.01-3g/L、防腐剂0.5-1.53g/L、阻断剂;
作为优选,在所述固相试剂中:
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种。
所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或几种。
所述蛋白保护剂为PVP、牛血清白蛋白、明胶、牛IgG、葡聚糖中的一种或几种。
所述防腐剂为Proclin300、硫柳汞、叠氮钠中一种或几种。
所述表面活性剂为吐温-20、Brig35、曲拉通X-100中的一种或几种。
所述阻断剂为变性人IgG、鼠IgG、牛血清中的一种或几种。
所述固相试剂缓冲液的pH为7.0-7.8,所述羧基磁珠直径为0.2-3.0μm。
所述发光试剂包括:
标记抗体:浓度不低于0.3μg/ml的吖啶酯标记的CHI3L1抗体;
发光试剂缓冲液:缓冲液10-200mM,稳定剂30-150g/L,蛋白保护剂2-40g/L,防腐剂0.3-1g/L,表面活性剂0.01-3g/L,阻断剂。
作为优化,所述发光试剂制备方法为:将吖啶酯用有机溶剂二甲基亚砜溶解后,保存于避光干燥条件;取CHI3L1标记抗体,加入到一定量的交联缓冲液中,再按照抗体与吖啶酯的摩尔比1:15加入所需的吖啶酯,充分混匀后避光反应2小时,反应结束后加入体系总反应体积的1/10的浓度为10~100g/L赖氨酸溶液进行淬灭,继续反应0.5小时后经SephadexG25柱分离纯化得到标记产物,按照所需的浓度0.1~1μg/ml稀释成工作液浓度即完成发光试剂的制备。
作为最优化,所述发光试剂的具体制备方法为:
a.用无水DMSO将吖啶酯活化物溶解至5mg/mL;
b.将吖啶酯活化物与CHI3L1标记抗体按15:1的摩尔比加入至标记缓冲液(0.05mol/L磷酸缓冲液,pH 9.5)中,置于室温避光反应2h;
c.随后加入1/10体积的赖氨酸溶液终止反应0.5小时;
d.反应液经用0.1mol/L pH 7.4的PB缓冲液平衡的Sephadex G25柱分离纯化得到吖啶酯标记的CHI3L1抗体,加入等体积甘油后置于-20℃保存备用;
e.取标记好的CHI3L1抗体加入到一定量的发光试剂缓冲液中,充分混匀即制成CHI3L1发光试剂工作液。
作为优选,在所述发光试剂中:
所述缓冲液为柠檬酸盐冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中的一种。
所述稳定剂为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或几种。
所述蛋白保护剂剂为甘油、牛血清白蛋白、酪蛋白、小牛血清、蔗糖中的一种或几种。
所述防腐剂为Proclin300、硫柳汞、叠氮钠中一种或几种。
所述表面活性剂为吐温-80、甜菜碱、曲拉通X-100中的一种或几种。
所述阻断剂为山羊血清、鼠IgG、MAK33中的一种或几种。
所述发光试剂缓冲液的pH为5.5~7.0。
本发明相比现有技术的优点在于:本发明化学发光法检测壳多糖酶3样蛋白1试剂盒在固相试剂中采用超顺磁性纳米微粒作为固相载体,通过共价交联的方式将捕获抗体稳定性的固定在磁性微粒表面,较传统的ELISA方法将抗体包被在聚乙烯微孔板上,稳定性更好,磁性微粒的比表面积更大,可以装载更多的抗体,提高检测的待测物;此外,基于磁性微粒载体通过仪器自动反复清洗和重悬,非特异性干扰大大减小,能显著的提高测试结果的准确性和抗干扰能力。
发光标记物吖啶酯选用较传统的酶标抗体工艺,操作更简便,且产生的信号辨识度和信号强度远高于传统ELISA的灵敏度和测量范围。
本发明可搭载全自动的化学发光免疫分析器,实现进样,加试剂,清洗,检测,计算等一系列流程的全自动化。避免现有ELISA产品需要手工操作,且实验时间长,因操作人员而异会造成结果存在偏差的问题。
本申请的试剂盒较传统的ELISA平台具有灵敏度高、检测范围宽、重复性好、特异性高、稳定性好等优点,能够在发光仪上实现自动化检测,成本低,自动化高,可节省检测时间,便于临床应用。
附图说明
图1为本发明实施例中的试剂盒线性范围试验数据图。
图2为本发明实施例中的试剂盒和国内某公司的用于检测CHI3L1的商品化检测试剂盒做相关性实验的相关性分析结果数据图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式,但本发明的保护范围不限于下述的实施例,本发明未特别说明的组分均可市售获得。
实施例1
固相试剂缓冲液:50mmol/L磷酸缓冲液,10g/L氯化钠,20g/L牛血清白蛋白,2g/L吐温-20,1g/L叠氮化钠,1g/L鼠IgG。
磁性微粒包被CHI3L1抗体:
a.M-270羧基磁珠充分混匀后取出1ml(10mg/ml)置于离心管中。
b.用活化缓冲液(10mmol/L MES,pH 5.5)清洗磁珠3次,加1ml活化缓冲液重悬后备用。
c.分别称取一定质量的活化剂EDC和sulfo-NHS随后加入对应体积的活化缓冲液至浓度为10mg/ml。
d.往备用的磁珠中分别加入150μl Sulfo-NHS和100μl EDC,充分混匀后置于摇床活化反应20分钟。
e.将活化后的磁珠用活化缓冲液清洗3遍,加入1ml交联缓冲液(25mmol/L MES,pH6.0,Tween-20 0.05%)重悬至浓度为10mg/ml。准确量取0.2mg 13A2抗体加入备用磁珠中并充分混合,置于摇床室温反应3小时。
f.反应结束后用交联缓冲液清洗3遍磁珠,加入1ml封闭缓冲液(50mmol/L Tris,1%BSA,0.01%Triton X-100,0.09%NaN3,pH 8.0)重悬,再室温反应1小时。
g.封闭完成后用封闭缓冲液清洗磁珠4遍,最后重悬至1ml,即浓度为10mg/ml。
h.取0.5ml包被好抗体的磁珠加入到25ml固相试剂缓冲液中,充分混匀后备用,即完成磁微粒工作液制备。
实施例2
发光试剂缓冲液:50mmol/L柠檬酸缓冲液,1g/L氯化钠,15g/L明胶,1g/L吐温-80,1g/L叠氮化钠,1g/L鼠IgG。
吖啶酯标记检测抗体:
a.用无水DMSO将吖啶酯活化物溶解至5mg/mL。
b.将吖啶酯活化物与CHI3L1标记抗体按15:1的摩尔比加入至标记缓冲液(0.05mol/L磷酸缓冲液,pH 9.5)中,置于室温避光反应2h。
c.随后加入1/10体积的赖氨酸溶液终止反应0.5小时。
d.反应液经用0.1mol/L pH 7.4的PB缓冲液平衡的Sephadex G25柱分离纯化得到吖啶酯标记的CHI3L1抗体,加入等体积甘油后置于-20℃保存备用。
f.取发光试剂缓冲液液200ml,加入吖啶酯标记的CHI3L1抗体,使其浓度为0.5μg/ml,充分混匀后备用。
实施例3
取美康盛达生物生产的重组壳多糖酶3样蛋白1抗原和校准品稀释液,按照已确定的活性浓度进行稀释配制,用校准品稀释液(0.01~0.05mol/L MES,0.1%~2%BSA,0.9%~25%NaCl,0.1%PC-300,pH 6.25)将CHI3L1配置成浓度为0ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL,按每瓶0.5mL分装,-20℃保存备用。经溯源参比系统血清样本结果比对进行赋值溯源。
实施例4
壳多糖酶3样蛋白1的测定:
测定仪器:全自动化学发光分析仪;
分析方法:一步双抗体夹心法;
分析参数:固相试剂:50ul,发光试剂:50ul,样本:10ul;孵育时间:15分钟
测定步骤:先加入发光试剂试剂和样本,再加入固相试剂,于37℃孵育15分钟后,清洗后测量发光值RLU,
定标曲线制作:以校准品浓度为横坐标,各浓度校准品对应的发光值RLU为纵坐标,作logit-log(4p)函数曲线。
样本浓度计算方法:软件中输入主曲线信息,拟合出主校准曲线,仪器自动计算相对应的浓度值。
实施例5
试剂盒检测性能试验:
(1)空白限LOB
重复测定CHI3L1零值校准品25次,计算20次测定结果RLU的平均值X和标准差SD,将X+2SD代入标准曲线中,得本方法的最低检测限为0.616ng/mL。
表1灵敏度实验
(2)线性范围试验
取浓度为1983.5ng/mL的高值血清样本H和5.2ng/mL的低值血清样本L,J将样本H和样本L按10H、8H+2L、6H+4L、4H+6L、2H+8L、1H+9L、0.5H+0.95L、0.25H+9.75L、0.125H+9.875L、10L的比例混合制成10个样品,每个样品平行测定三次,比较实测值与理论值,结果如图1所示,表明本试剂在5.2~1983.5ng/mL范围内有较好的检测线性。
(3)热加速稳定性试验
将固相试剂及发光试剂置于37℃热加速7天后,检测校准品。结果表明,与未进行热加速实验的试剂相比,其RLU仅降低了6%,说明本试剂具备良好的稳定性。
表2热加速实验
(4)准确度
采用回收率实验考察本方法的准确度。在CHI3L1血清浓度为55.32ng/mL和183.26ng/mL的样品中,分别添加浓度为100.0ng/mL、500.0ng/mL、1000.0ng/mL的CHI3L1抗原,进行测定。与预计值进行比较后,CHI3L1的回收率在97%到104%,平均回收率为97.6%。
表3准确度结果
(5)特异性分析
平行测定1000ng/mL IV型胶原(C IV)、1000ng/mL III型前胶原氨基端肽(PIIIPNP)、1000ng/mL透明质酸(HA)三次,结果见表5,表明上述物质对CHI3L1的检测无干扰。
表4分析特异性结果
(6)抗干扰分析
取健康人群的新鲜血清,制成混合血清;用校准品稀释液将干扰物质纯品稀释至一定浓度(血红蛋白为10000mg/dL、维生素C为60mg/dL、非结合胆红素为400mg/dL、结合胆红素为576mg/dL、乳糜为29000FTU)。按混合血清:干扰物质为19:1的体积比制备成干扰血清,按混合血清:校准品稀释液为19:1的体积比制备成对照血清,平行测定CHI3L1浓度3次,结果见表5,表明此检测体系对上述干扰物质有良好的抗干扰能力。
表5.抗干扰结果
(5)相关性分析
分别采用实施例1配制的本发明试剂盒和国内某公司的用于检测CHI3L1的商品化检测试剂盒做相关性实验,对225份新鲜临床血清(健康人群及肝纤维化患者)进行测定,按照各自测定方法进行测定,对测定值进行相关分析,结果见图2(X、Y轴均为测定值,单位ng/l)。由图2可知,本发明试剂和对照试剂的相关系数为r=0.98,回归方程为y=1.009x+3.086。该结果表明本发明试剂与对照试剂具有很好的相关性、特异性和准确性。
以上仅是本发明的特征实施范例,对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案,均落在本发明权利保护范围之内。
Claims (7)
1.一种壳多糖酶3样蛋白1试剂盒,包括固相试剂、发光试剂、校准品及质控品,其特征在于:
所述固相试剂包括如下含量的各成分:
固相试剂缓冲液:缓冲液10-100mM、无机盐5-30g/L、蛋白保护剂2-40g/L、表面活性剂0.01-3g/L、防腐剂0.5-1.53g/L、阻断剂;
磁微粒:浓度不低于0.1g/L的包被有CHI3L1抗体的磁微粒;
所述固相试剂的制备方法为:将基于羧基官能团的磁性微粒用活化缓冲液清洗3次,加活化缓冲液重悬后备用,活化缓冲液为10mmol/L MES,pH 5.5;磁性微粒经过EDC/sulfo-NHS两步法进行活化,活化后的磁性微粒用活化缓冲液清洗3遍,加入交联缓冲液重悬,交联缓冲液为25mmol/L MES,pH6.0,Tween-20 0.05%,磁性微粒表面羧基变成具有活性的中间酯,按照1mg磁性微粒交联20μg CHI3L1包被抗体的比例进行交联,抗体结构上的伯胺基和磁性微粒表面活化酯结合形成稳定的共价结构,交联反应结束后用交联缓冲液清洗3遍磁珠;加入封闭缓冲液重悬,封闭缓冲液为50mmol/L Tris,1%BSA,0.01%Triton X-100,0.09%NaN3,pH 8.0,封闭剂封闭掉未反应的剩余活化中间酯,抗体即可稳定的固定在磁性微粒表面,封闭完成后用封闭缓冲液清洗磁珠4遍;按照所需的浓度0.1~0.6mg/ml稀释成工作液浓度即完成固相试剂的制备;
发光试剂包括如下含量的各成分:
标记抗体:浓度不低于0.3μg/ml的吖啶酯标记的CHI3L1抗体;
发光试剂缓冲液:缓冲液10-200mM,稳定剂30-150g/L,蛋白保护剂2-40g/L,防腐剂0.3-1g/L,表面活性剂0.01-3g/L,阻断剂;
所述发光试剂制备方法为:将吖啶酯用有机溶剂二甲基亚砜溶解后,保存于避光干燥条件;取CHI3L1标记抗体,加入到一定量的交联缓冲液中,再按照抗体与吖啶酯的摩尔比1:15加入所需的吖啶酯,充分混匀后避光反应2小时,反应结束后加入体系总反应体积的1/10的浓度为10~100g/L赖氨酸溶液进行淬灭,继续反应0.5小时后经Sephadex G25柱分离纯化得到标记产物,按照所需的浓度0.1~1μg/ml稀释成工作液浓度即完成发光试剂的制备。
2.根据权利要求1所述的壳多糖酶3样蛋白1试剂盒,其特征在于,在所述固相试剂中,所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种。
3.根据权利要求1所述的壳多糖酶3样蛋白1试剂盒,其特征在于,在所述固相试剂中,所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的壳多糖酶3样蛋白1试剂盒,其特征在于,在所述固相试剂中,所述蛋白保护剂为PVP、牛血清白蛋白、明胶、牛IgG、葡聚糖中的一种或几种,所述防腐剂为Proclin300、硫柳汞、叠氮钠中一种或几种,所述表面活性剂为吐温-20、Brig35、曲拉通X-100中的一种或几种,所述阻断剂为变性人IgG、鼠IgG、牛血清中的一种或几种,所述固相试剂缓冲液的pH为7.0-7.8,所述羧基磁珠直径为0.2-3.0μm。
5.根据权利要求1所述的壳多糖酶3样蛋白1试剂盒,其特征在于,在所述发光试剂中,所述缓冲液为柠檬酸盐冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中的一种。
6.根据权利要求1所述的壳多糖酶3样蛋白1试剂盒,其特征在于,在所述发光试剂中,所述稳定剂为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的壳多糖酶3样蛋白1试剂盒,其特征在于,在所述发光试剂中,所述蛋白保护剂为甘油、牛血清白蛋白、酪蛋白、小牛血清、蔗糖中的一种或几种;所述防腐剂为Proclin300、硫柳汞、叠氮钠中一种或几种;所述表面活性剂为吐温-80、甜菜碱、曲拉通X-100中的一种或几种;所述阻断剂为山羊血清、鼠IgG、MAK33中的一种或几种;所述发光试剂缓冲液的pH为5.5~7.0。
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