CN114544978A - 一种igf-1检测试剂盒及其制备方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种IGF‑1检测试剂盒及其制备方法和检测方法，所述IGF‑1检测试剂盒包括释放剂、置换剂、固相试剂、发光试剂、校准品和质控品，所述固相试剂为IGF‑1抗体包被的磁微粒混悬液，磁微粒浓度为0.1～0.8mg/ml，包被抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。本发明提供了一种灵敏度高、检测效率高、方便使用的用于临床检测IGF‑1的试剂盒，可用于进行生长激素(GH)的缺乏和过量的辅助诊断，本发明试剂盒操作简单方便、灵敏度高、特异性强、检测范围宽。
Description
技术领域
本发明涉及医学、免疫、体外诊断技术领域，尤其涉及IGF-1检测试剂盒及其制备方法和检测方法。
背景技术
胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是一种分子量约为7.5kDa的单链多肽，它是由70个氨基酸残基组成的，在各组织中普遍表达，但主要由肝脏合成和分泌，并通过生长激素调节。血液循环中主要以与胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)和酸性不稳定亚基(ALS)相结合形成的三元复合物形式存在。临床上，IGF-1是一种可以用于筛查生长激素缺乏症(GHD)的标记物。在体内，生长激素(GH)会刺激IGF-1的合成，但由于生长激素(GH)的半衰期较短且浓度水平容易受一些外部因素(例如运动，压力，睡眠，短期禁食等)的影响从而有较大波动，相较之下，IGF-1能更有效地反映生长激素的真实水平。因此，IGF-1被广泛应用于生长激素的缺乏和过量的诊断上。
IGF-1的生成受多种因素如年龄、性别、营养状况和生长激素的释放等因素影响，出生时其浓度低，在儿童和青春期逐渐增长，其后随年龄的增长而下降。在一些患侏儒症、生长激素缺乏症、矮小症等的儿童中，因其脑垂体、甲状腺等分泌激素不同，以及其它多方面因素影响，导致其血清IGF-1和IGFBP-3的含量明显减少。IGF与IGF结合蛋白(IGFBP)结合以蛋白质复合物的形式在血清中循环，而只有不到1％的IGF以自由、非关联的形式流通。与IGFBPs的结合增加了IGFs在血液中的半衰期，而游离IGF的生理作用尚未确定。
目前IGF-1及IGFBP-3检测已为儿童生长发育落后的早期干预与治疗提供了更多的理论依据和参考。在我国《矮身材儿童诊疗指南》中推荐有条件的医院要常规对这两种激素进行检测。生长激素在人体内一方面直接作用于骨骼促进骨骼的生长，促进人体长高；另一方面作用于肝脏生长激素受体促进肝脏合成IGF-1，通过IGF-1促进骨骼生长，同时IGF-1反馈抑制垂体生长激素的释放，所以血清IGF-1的浓度和血清生长激素水平在24小时内大致平行。当生长激素缺乏或者肝功能异常时，会使得IGF-1降低，因此有严重肝病的孩子升高会受影响。此外，生长激素不敏感综合征的孩子，虽然生长激素并不缺乏，但不能产生足够的IGF-1，因此可能会患上垂体性侏儒症，成人身材会非常矮小。所以对矮小的孩子进行生长激素的测定(生长激素激发试验)具有重要意义。
在结构上，IGF-1和IGF-2的氨基酸序列同源性为62％；IGF-1与IGF-2和人胰岛素之间的同源性分别为49％和47％。IGF2主要对胎儿生长起作用，而儿童及成人体内起主要作用的是IGF1。IGF1的产生依赖于生长激素水平，是生长激素刺激机体生长和代谢的主要调节因子。GH对生长发育的影响是通过IGF-1介导的，IGF-1是评价正常及异常生长、研究GH生物活性的重要指标。
现有技术中，IGF-1检测试剂盒在使用过程中均需要对血清样本进行预稀释再进行检测，单个标本检测时间近50分钟，检测效率较低。另外与常规的双抗体夹心法用到两株抗体不同，待测物IGF-1是一个大家族的小肽，具有多种结构相近的类似物。在一定的种类数量的结构类似物存在时，标记抗体介导被捕捉的抗原分子发生变构，使之形成标记抗体与变构的抗原分子复合物，从固相抗体表面解离，最终形成反应信号降低的HD—HOOK现象。因此，即使采用夹心法的两步清洗，仍会存在产生HOOK效应的风险，降低检测的灵敏度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高IGF-1的检测效率和灵敏度，可用于生长激素(GH)的缺乏和过量的辅助诊断上。
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供一种IGF-1检测试剂盒，包括释放剂、置换剂、固相试剂、发光试剂、校准品和质控品，所述固相试剂为IGF-1抗体包被的磁微粒混悬液，磁微粒浓度为0.1～0.8mg/ml，包被抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
进一步地，所述的发光试剂为吖啶酯标记的IGF-1抗体液，抗体浓度为0.1～1.0μg/ml，标记抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，组成为两株或两株以上针对IGF-1不同的抗原位点。
进一步地，所述固相试剂和所述发光试剂包括稀释液，所述稀释液包括缓冲剂、无机盐、表面活性剂、金属螯合剂、蛋白保护剂、抑制剂、化学保护剂、防腐剂和阻断剂。
进一步地，所述缓冲剂选自Tris(三羟甲基氨基甲烷)，HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，PIPES(哌嗪-1,4-二乙磺酸)、磷酸盐中的一种或多种，所述缓冲剂的浓度为10～100mM/L；所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙中的一种或多种，所述无机盐的浓度为50～500mM/L；所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲拉通-405、聚氧乙烯月桂醚、NP-40中的一种或多种，所述表面活性剂的浓度为0.02～0.5％；所述金属螯合剂选自乙二胺四乙酸二钠、羟乙基乙二胺三乙酸、黄原酸酯类和聚丙烯酸中的一种或多种，所述金属螯合剂的浓度为0.1～1％；所述蛋白保护剂选自牛血清白蛋白、牛IGG、酪蛋白水解物、甘氨酸、鱼明胶中的一种或多种，所述蛋白保护剂的浓度为0.1～1％；所述抑制剂选自尿素、盐酸胍、SDS、四乙烯五胺中的一种或多种，所述抑制剂的浓度为0.2～2％；所述化学保护剂选自聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、聚赖氨酸、二硫苏糖醇、甘油中的一种或多种，所述化学保护剂的浓度为0.5～5％；所述防腐剂选自Proclin300、硫柳汞、叠氮钠、IPBC、MIT中的一种或多种，所述防腐剂的浓度为0.1～0.5％；所述阻断剂选自鼠IgG、MAK33-poly、biolipidure、变性的人IgG、sacntibodies HBR中的一种或多种。
进一步地，所述校准品为由IGF-1抗原配制的浓度在0～2000ng/ml范围内的6个不同浓度点的液体校准品；所述质控品为由IGF-1抗原配制的浓度在0～300ng/ml范围内的2个不同浓度点的液体质控品。
进一步地，所述释放剂选自乙醇酸、冰乙酸、柠檬酸、乙醇中的一种或多种；所述置换剂选自柠檬酸钠、Tris、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、乙酸钠中的一种或多种。
本发明第二方面提供一种IGF-1检测试剂盒的制备方法，用于制备上述的IGF-1检测试剂盒，包括以下步骤：
制备固相试剂稀释液：将缓冲剂、无机盐、蛋白保护剂、表面活性剂、化学稳定性、防腐剂、阻断剂依次溶解到纯化水中，调节pH至6.0～8.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用；
制备发光试剂稀释液：将缓冲剂、无机盐、蛋白保护剂、表面活性剂、化学稳定性、防腐剂、阻断剂依次溶解到纯化水中，调节pH至5.0～7.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用；
制备校准品稀释液：将缓冲剂、无机盐、蛋白保护剂、表面活性剂、化学稳定性、防腐剂依次溶解到纯化水中，调节pH至5.0～8.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用；
制备校准品：将IGF-1重组抗原按照一定的比例添加到校准品稀释液中，配置成浓度分别为0ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml的校准品溶液，分别记为S0、S1、S2、S3、S4、S5；
制备质控品：将IGF-1抗原重组抗原按照一定的比例添加到质控品稀释液中，配置成浓度分别为80g/ml、250ng/ml的质控品溶液，分别记为QC1、QC2；
制备释放剂：取释放剂原料溶于纯化水中，配制浓度为5～20g/L，添加防腐剂，调整pH至2.0～4.0范围内；
制备置换剂：取置换剂原料溶于纯化水中，配制浓度为5～20g/L，添加防腐剂，调整pH至8.0～10.0范围内；
制备固相试剂：将IGF-1抗体包被在磁微粒表面制备成中间品，再取适量的磁微粒中间品加入到固相试剂稀释液中，配置成工作浓度为0.1～0.8mg/ml的混悬液；
制备发光试剂：将吖啶酯按一定比例标记IGF-1抗体上，制备成中间品，再取适量的发光试剂中间品加入到发光试剂稀释液中，配置成工作浓度为0.1～1.0μg/ml的发光试剂工作液。
进一步地，所述制备固相试剂步骤具体包括：
取出所需量的磁微粒至离心管中，按照1:9体积加入适量的磁微粒交联缓冲液，涡旋混匀后置于磁分离器上静置；
待磁微粒和稀释液完全分离开，弃掉上清液，再次注入等量磁微粒交联缓冲液重悬，重复上述步骤清洗3次，加入磁微粒交联缓冲液重悬后备用；
分别称取一定质量的活化剂EDC和sulfo-NHS，随后加入对应体积的磁微粒交联缓冲液至浓度为10mg/ml；
往备用的磁微粒悬浮液中分别加入磁微粒质量1/10的Sulfo-NHS和EDC，充分混匀后置于血液混匀仪持续混匀状态下反应20分钟；
将活化后的磁微粒用磁微粒交联缓冲液清洗3遍，加入磁微粒交联缓冲液重悬至浓度为10mg/ml备用，准确量取抗体加入到备用磁微粒混悬液中并充分混合，置于摇床室温反应2小时；
反应结束后用磁微粒封闭缓冲液清洗3遍磁珠，加入等量的磁微粒封闭缓冲液重悬，置于摇床室温反应1小时；
封闭完成后用磁微粒封闭缓冲液清洗磁微粒4遍，重悬至浓度为10mg/ml，即完成磁微粒中间品制备；
取包被好IGF-1抗体的磁微粒中间品加入到一定量的固相试剂稀释液至固相试剂工作液浓度，充分混匀后备用。
进一步地，所述制备发光试剂步骤具体包括：
将吖啶酯用有机溶剂二甲基亚砜溶解后，保存于避光干燥条件；
取IGF-1标记抗体，加入到一定量的交联缓冲液中，使抗体浓度在0.5～2mg/ml范围内，再按照摩尔比1:15加入所需的吖啶酯，充分混匀后避光反应2小时；
反应结束后加入体积为1/10的浓度为10～50g/L赖氨酸溶液进行淬灭，继续反应1小时后经Sephadex G25柱分离纯化得到标记产物；
按照所需的浓度0.1～1μg/ml稀释成工作液即完成发光试剂的制备，发光试剂中的不同株抗体混合比为1:1。
本发明第三方面提供一种IGF-1的检测方法，使用上述的IGF-1检测试剂盒，测定仪器为MS-i3080或MS-C120系列全自动化学发光仪，所述IG F-1检测方法包括以下步骤：
反应管中加入释放剂和样本孵育10分钟，再加入置换剂和固相试剂孵育5分钟，测定仪器自动清洗，除去反应管液体上清，再加入发光试剂，37℃孵育15分钟后，清洗后测量发光值RLU；
以校准品浓度为横坐标，各浓度校准品对应的发光值RLU为纵坐标，作logit-log(4p)函数曲线；
校准成功后，测定仪器自动计算相对应的浓度值。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明提供了一种灵敏度高、检测效率高、方便使用的用于临床检测IGF-1的试剂盒，可用于进行生长激素(GH)的缺乏和过量的辅助诊断。利用经典的双抗体夹心法捕获血清中的待测物，应用美康盛德生产的全自动化学发光仪进行实验测试和试剂优化调试，本发明试剂盒操作简单方便、灵敏度高、特异性强、检测范围宽。
(2)试剂盒的固相试剂采用超顺磁性纳米微粒作为固相载体，通过共价交联的方式将捕获抗体稳定性的固定在磁性微粒表面，稳定性更好，磁微粒的比表面积大，可以装载更多的抗体，提高检测的待测物浓度，由此提高检测准确性和灵敏度；基于磁性微粒载体通过仪器自动反复清洗和重悬，非特异性干扰大大减小，能显著的提高测试结果的准确性和抗干扰能力。
(3)试剂盒的发光试剂中采用多株针对IGF-1不同靶点的抗体，能有效阻断HOOK效应的发生；发光标记物吖啶酯选用较传统的酶标抗体工艺，操作更简便，且产生的信号辨识度和信号强度远高于传统显色物质的灵敏度和测量范围。
(4)本发明试剂盒可搭载美康盛德生产的MS-i3080及MS-C120系列全自动化学发光仪，实现进样、加试剂、清洗、检测、计算等一系列流程的全自动化，提高检测效率。
(5)本发明试剂盒的校准品及质控品均为液体即用型，稳定性好，避免冻干品复溶等繁杂的操作，减少人为可能引入的误差，结果更准确。
附图说明
图1是实施例5线性范围实验的结果图；
图2是实施例6低浓度质控品在机稳定性实验的结果图；
图3是实施例6中浓度质控品在机稳定性实验的结果图；
图4是实施例9相关性分析的结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
本发明实施例中使用的全自动化学发光免疫分析仪(MS-i3080)为宁波美康盛德生物科技有限公司提供。所用缓冲液如下：
磁微粒交联缓冲液：50mM MES，0.05％吐温-20，pH5.5；
磁微粒封闭缓冲液：50mmol/L Tris，1％BSA，0.01％Triton X-100，0.09％NaN3，pH 8.0；
吖啶酯交联缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液，pH 8.0。
其他的试剂和实验设备均为市售产品，采用方法均为本领域常规的方法。
实施例1IGF-1检测试剂盒
IGF-1检测试剂盒包括释放剂、置换剂、固相试剂、发光试剂、校准品和质控品。
本实施例中，释放剂为乙醇酸；置换剂为柠檬酸钠；固相试剂为IGF-1抗体包被的磁微粒混悬液，磁微粒浓度为0.1mg/ml，包被抗体为单克隆抗体；发光试剂为吖啶酯标记的IGF-1抗体液，抗体浓度为0.1μg/ml，标记抗体为单克隆抗体，组成为两株针对IGF-1不同的抗原位点；校准品为由IG F-1抗原配制的浓度在0～2000ng/ml范围内的6个不同浓度点的液体校准品；质控品为由IGF-1抗原配制的浓度在0～300ng/ml范围内的2个不同浓度点的液体质控品。
固相试剂稀释液和发光试剂稀释液组成包括缓冲剂、无机盐、表面活性剂、金属螯合剂、蛋白保护剂、抑制剂、化学保护剂、防腐剂和阻断剂。
本实施例中，缓冲剂为Tris，缓冲剂浓度为10mM/L；无机盐为氯化钠，无机盐浓度为50mM/L；表面活性剂为吐温20，表面活性剂浓度为0.1％；金属螯合剂为乙二胺四乙酸二钠，金属螯合剂浓度为0.1％；蛋白保护剂为牛血清白蛋白，蛋白保护剂浓度为0.05％；抑制剂为尿素，抑制剂浓度为0.2％；化学保护剂为聚乙烯吡咯烷酮，化学保护剂浓度为0.5；防腐剂选自Proclin300，防腐剂的浓度为0.1％；阻断剂为鼠IgG。
在其他具体实施方式中，释放剂选自乙醇酸、冰乙酸、柠檬酸、乙醇中的一种或多种；
置换剂选自柠檬酸钠、Tris、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、乙酸钠中的一种或多种；
固相试剂为IGF-1抗体包被的磁微粒混悬液，磁微粒浓度为0.1～0.8mg/ml，包被抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；
发光试剂为吖啶酯标记的IGF-1抗体液，抗体浓度为0.1～1.0μg/ml，标记抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，组成为两株或两株以上针对IGF-1不同的抗原位点；
缓冲剂选自Tris、HEPES、MES、PIPES、磷酸盐中的一种或多种，缓冲剂的浓度为10～100mM/L；
无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙中的一种或多种，无机盐的浓度为50～500mM/L；
表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲拉通-405、聚氧乙烯月桂醚、NP-40中的一种或多种，表面活性剂的浓度为0.02～0.5％；
金属螯合剂选自乙二胺四乙酸二钠、羟乙基乙二胺三乙酸、黄原酸酯类和聚丙烯酸中的一种或多种，金属螯合剂的浓度为0.1～1％；
蛋白保护剂选自牛血清白蛋白、牛IGG、酪蛋白水解物、甘氨酸、鱼明胶中的一种或多种，蛋白保护剂的浓度为0.1～1％；
抑制剂选自尿素、盐酸胍、SDS、四乙烯五胺中的一种或多种，抑制剂的浓度为0.2～2％；
化学保护剂选自聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、聚赖氨酸、二硫苏糖醇、甘油中的一种或多种，化学保护剂的浓度为0.5～5％；
防腐剂选自Proclin300、硫柳汞、叠氮钠、IPBC、MIT中的一种或多种，防腐剂的浓度为0.1～0.5％；
阻断剂选自鼠IgG、MAK33-poly、biolipidure、变性的人IgG、sacntib odies HBR中的一种或多种。
实施例2试剂盒的制备方法
IGF-1检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
制备固相试剂稀释液：将缓冲剂、无机盐、蛋白保护剂、表面活性剂、化学稳定性、防腐剂、阻断剂依次溶解到纯化水中，调节pH至6.0～8.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用。
制备发光试剂稀释液：将缓冲剂、无机盐、蛋白保护剂、表面活性剂、化学稳定性、防腐剂、阻断剂依次溶解到纯化水中，调节pH至5.0～7.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用。
制备校准品稀释液：将缓冲剂、无机盐、蛋白保护剂、表面活性剂、化学稳定性、防腐剂依次溶解到纯化水中，调节pH至5.0～8.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用。
制备校准品：取美康盛达生物生产的重组IGF-1抗原和校准品稀释液，按照已确定的活性浓度进行稀释配制，用校准品稀释液(0.01～0.05mol/L磷酸盐缓冲液，0.1％～2％BSA，0.9％～5％NaCl，0.1％PC-300，pH 6.5)将IGF-1中间品配置成浓度为0ng/mL、50ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL的6点校准品，分别记为S0、S1、S2、S3、S4、S5，按每瓶0.5mL分装，-20℃保存备用。
制备质控品：将IGF-1抗原重组抗原按照一定的比例添加到质控品稀释液中，配置成浓度分别为80g/ml、250ng/ml的质控品溶液，分别记为QC1、QC2。
制备释放剂：取释放剂原料溶于纯化水中，配制浓度为5～20g/L，添加防腐剂，调整pH至2.0～4.0范围内。
制备置换剂：取置换剂原料溶于纯化水中，配制浓度为5～20g/L，添加防腐剂，调整pH至8.0～10.0范围内。
制备固相试剂：将IGF-1抗体包被在磁微粒表面制备成中间品，再取适量的磁微粒中间品加入到固相试剂稀释液中，配置成工作浓度为0.1～0.8mg/ml的混悬液。
制备固相试剂步骤具体包括：
a.取出所需量的磁微粒至(10mg/ml)离心管中，按照1:9体积加入适量的磁微粒交联缓冲液，涡旋混匀后置于磁分离器上静置。
b.待观察到磁微粒和稀释液完全分离开，弃掉上清液，再次注入等量磁微粒交联缓冲液重悬，重复上述步骤清洗3次，加入适量的磁微粒交联缓冲液重悬后备用(浓度为10mg/ml)。
c.分别称取一定质量的活化剂EDC和sulfo-NHS，随后加入对应体积的磁微粒交联缓冲液至浓度为10mg/ml。
d.往备用的磁微粒悬浮液中分别加入磁微粒质量1/10的Sulfo-NHS和EDC，充分混匀后置于血液混匀仪持续混匀状态下反应20分钟。
e.将活化后的磁微粒用磁微粒交联缓冲液清洗3遍，最后加入磁微粒交联缓冲液重悬至浓度为10mg/ml备用。准确量取抗体(按照1mg磁微粒中加入20μg抗体的投料量)加入到备用磁微粒混悬液中并充分混合，置于摇床室温反应2小时。
f.反应结束后用磁微粒封闭缓冲液清洗3遍磁珠，加入等量的磁微粒封闭缓冲液重悬，置于摇床室温反应1小时。
g.封闭完成后用磁微粒封闭缓冲液清洗磁微粒4遍，最后重悬至浓度为10mg/ml，即完成磁微粒中间品制备。
h.取包被好IGF-1抗体的磁微粒中间品加入到一定量的固相试剂稀释液至固相试剂工作液浓度，充分混匀后备用。
制备发光试剂：将吖啶酯按一定比例标记IGF-1抗体上，制备成中间品，再取适量的发光试剂中间品加入到发光试剂稀释液中，配置成工作浓度为0.1～1.0μg/ml的发光试剂工作液。
制备发光试剂步骤具体包括：
将吖啶酯用有机溶剂二甲基亚砜溶解后，保存于避光干燥条件；
取IGF-1标记抗体，加入到一定量的交联缓冲液中，使抗体浓度在0.5～2mg/ml范围内，再按照摩尔比1:15加入所需的吖啶酯，充分混匀后避光反应2小时；
反应结束后加入体积为1/10的浓度为10～50g/L赖氨酸溶液进行淬灭，继续反应1小时后经Sephadex G25柱分离纯化得到标记产物；
按照所需的浓度0.1～1μg/ml稀释成工作液浓度即完成发光试剂的制备，发光试剂中的不同株抗体混合比为1:1。
实施例3IGF-1的检测方法
测定仪器：MS-i3080全自动化学发光分析仪；
分析方法：两步双抗体夹心法；
分析参数：释放剂20μl，置换剂60μl，固相试剂40ul，发光试剂60ul，样本：30ul；总孵育时间：30分钟；
测定步骤：反应管中先加入释放剂和样本孵育10分钟，再加入置换剂和固相试剂孵育5分钟，仪器自动清洗，出去反应管液体上清，再加入发光试剂，37℃孵育15分钟后，清洗后测量发光值RLU；
定标曲线制作：以校准品浓度为横坐标，各浓度校准品对应的发光值RLU为纵坐标，作logit-log(4p)函数曲线；
样本浓度计算方法：校准成功后，仪器自动计算相对应的浓度值。
实施例4灵敏度实验
本实施例测试实施例1IGF-1检测试剂盒的灵敏度：
空白限LOB和检测限LOD，参照CLSI标准EP17-A的实验方法和统计算式。
LOB样本的制备：准备5份商品化去激素血清基质，待测物含量接近为0，每个样本重复测试3次，连续测试4天，统计60次测试的数据结果并按照EP17-A的算式来计算LOB。
LOD样本的制备：准备1份商品化去激素血清基质，分别添加浓度为0.05～5ng/ml的5支低浓度样本，测试方法与LOB一致，统计60次测试的数据结果并按照EP17-A的算式来计算LOD。
实验结果如下表1所示：
表1 IGF-1检测试剂盒灵敏度实验结果
实施例5线性范围实验
本实施例测试实施例1IGF-1检测试剂盒的线性范围：
取浓度为1956.7ng/mL的高值血清样本H和3.4ng/mL的低值血清样本L，将样本H和样本L按10H、8H+2L、6H+4L、4H+6L、2H+8L、1H+9L、0.5H+0.95L、0.25H+9.75L、0.125H+9.875L、10L的比例混合制成10个样品，每个样品平行测定三次，比较实测值与理论值，结果如图1所示，表明试剂盒在3.4～1956.7ng/mL范围内有较好的检测线性。
实施例6稳定性实验
本实施例测试实施例1IGF-1检测试剂盒的稳定性：
(1)热加速稳定性
将IGF-1检测试剂盒置于37℃热加速7天后，检测校准品。结果如表2所示，结果表明，与未进行热加速破坏实验的对照试剂相比，其RLU仅降低了6％，说明试剂盒具备良好的热加速稳定性。
| 校准品 | 浓度 | 4°对照 | 加速7天 | 变化幅度 |
| S1 | 0 | 545 | 522 | -4.2％ |
| S2 | 50 | 305075 | 284940 | -6.6％ |
| S3 | 200 | 1160344 | 1095364 | -5.6％ |
| S4 | 500 | 2463784 | 2311029 | -6.2％ |
| S5 | 1000 | 4329218 | 4052148 | -6.4％ |
| S6 | 2000 | 7638795 | 7180467 | -6.0％ |
表2 IGF-1检测试剂盒热加速稳定性实验结果
(2)在机稳定性
将IGF-1检测试剂盒开瓶后放入仪器，使仪器处于开机状态以保持试剂盘温度，每个工作日测定质控品3次，结果取均值，时间跨度为28天，测试间隔时间不超过3天，所测浓度与质控品靶值进行比较。分别测试低浓度质控品和中浓度质控品的在机稳定性，实测结果如下表3、表4、图2和图3所示，在机装载状态下，所测浓度与质控品靶值偏差≤±10％，表面连续34天不经过校准，质控品准确度仍能满足偏差的要求，完全满足临床检测的需求。
表3 IGF-1检测试剂盒低浓度质控品在机稳定性实验结果
表4 IGF-1检测试剂盒中浓度质控品在机稳定性实验结果
实施例7准确度实验
本实施例测试实施例1IGF-1检测试剂盒的准确度：
将IGF-1国家标准品配制成理论值为50ng/ml,200ng/ml，1000ng/ml三个浓度水平的样品进行检测，每个样本测试3次，计算均值，根据下列公式计算相对偏差。
Bi＝(Xi-T)/T*100％；
式中：Bi为相对偏差；Xi为测量浓度均值；T为标定浓度。
测试结果如下表5所示，相对偏差≤±10％，说明试剂盒的检测准确度高。
| 样本 | 靶值(ng/ml) | Batch 1(ng/ml) | Batch 2(ng/ml) | Batch 3(ng/ml) |
| Level1 | 50 | -2.35％ | -2.44％ | -1.62％ |
| Level2 | 200 | -1.05％ | -1.31％ | -1.64％ |
| Level3 | 1000 | -3.22％ | -3.67％ | -3.94％ |
表5 IGF-1检测试剂盒准确度实验结果
实施例8特异性分析
本实施例测试实施例1IGF-1检测试剂盒的特异性：
平行测定600ng/mL胰岛素样生长因子II(IGF-II)样本、1800μIU/mL胰岛素(Insulin)y样本三次，结果见表6，上述干扰物在IGF-1检测试剂盒的测定结果≤20ng/ml，可判定对IGF-1的检测无干扰。
| 测定次数 | IGF-II(ng/mL) | Insulin(ng/mL) |
| 1 | 1.32 | 0.95 |
| 2 | 1.28 | 0.84 |
| 3 | 1.22 | 0.88 |
| 判定 | 无干扰 | 无干扰 |
表6 IGF-1检测试剂盒特异性分析结果
实施例9相关性分析
本实施例测试实施例1IGF-1检测试剂盒的相关性：
分别采用实施例1IGF-1检测试剂盒和西门子公司的用于检测IGF-1的商品化检测试剂盒做相关性实验，对252份新鲜临床血清(健康人群及肝纤维化患者)进行测定，按照各自测定方法进行测定，对测定值进行相关分析，结果见图4(X、Y轴均为测定值，单位ng/l)。由图4可知，本发明试剂和对照试剂的相关系数为R2＝0.954，回归方程为y＝1.02x-3.5。该结果表明本发明试剂与对照试剂具有很好的相关性、特异性和准确性。
虽然本发明公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种IGF-1检测试剂盒，其特征在于，包括释放剂、置换剂、固相试剂、发光试剂、校准品和质控品，所述固相试剂为IGF-1抗体包被的磁微粒混悬液，磁微粒浓度为0.1～0.8mg/ml，包被抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的IGF-1检测试剂盒，其特征在于，所述的发光试剂为吖啶酯标记的IGF-1抗体液，抗体浓度为0.1～1.0μg/ml，标记抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，组成为两株或两株以上针对IGF-1不同的抗原位点。
3.根据权利要求2所述的IGF-1检测试剂盒，其特征在于，所述固相试剂和所述发光试剂包括稀释液，所述稀释液包括缓冲剂、无机盐、表面活性剂、金属螯合剂、蛋白保护剂、抑制剂、化学保护剂、防腐剂和阻断剂。
4.根据权利要求3所述的IGF-1检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲剂选自Tris、HEPES、MES、PIPES、磷酸盐中的一种或多种，所述缓冲剂的浓度为10～100mM/L；所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙中的一种或多种，所述无机盐的浓度为50～500mM/L；所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲拉通-405、聚氧乙烯月桂醚、NP-40中的一种或多种，所述表面活性剂的浓度为0.02～0.5％；所述金属螯合剂选自乙二胺四乙酸二钠、羟乙基乙二胺三乙酸、黄原酸酯类和聚丙烯酸中的一种或多种，所述金属螯合剂的浓度为0.1～1％；所述蛋白保护剂选自牛血清白蛋白、牛IGG、酪蛋白水解物、甘氨酸、鱼明胶中的一种或多种，所述蛋白保护剂的浓度为0.1～1％；所述抑制剂选自尿素、盐酸胍、SDS、四乙烯五胺中的一种或多种，所述抑制剂的浓度为0.2～2％；所述化学保护剂选自聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、聚赖氨酸、二硫苏糖醇、甘油中的一种或多种，所述化学保护剂的浓度为0.5～5％；所述防腐剂选自Proclin300、硫柳汞、叠氮钠、IPBC、MIT中的一种或多种，所述防腐剂的浓度为0.1～0.5％；所述阻断剂选自鼠IgG、MAK33-poly、biolipidure、变性的人IgG、sacntibodies HBR中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的IGF-1检测试剂盒，其特征在于，所述校准品为由IGF-1抗原配制的浓度在0～2000ng/ml范围内的6个不同浓度点的液体校准品；所述质控品为由IGF-1抗原配制的浓度在0～300ng/ml范围内的2个不同浓度点的液体质控品。
6.根据权利要求1所述的IGF-1检测试剂盒，其特征在于，所述释放剂选自乙醇酸、冰乙酸、柠檬酸、乙醇中的一种或多种；所述置换剂选自柠檬酸钠、Tris、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、乙酸钠中的一种或多种。
7.一种IGF-1检测试剂盒的制备方法，用于制备如权利要求1-6任一所述的IGF-1检测试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：
制备固相试剂稀释液：将缓冲剂、无机盐、蛋白保护剂、表面活性剂、化学稳定性、防腐剂、阻断剂依次溶解到纯化水中，调节pH至6.0～8.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用；
制备发光试剂稀释液：将缓冲剂、无机盐、蛋白保护剂、表面活性剂、化学稳定性、防腐剂、阻断剂依次溶解到纯化水中，调节pH至5.0～7.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用；
制备校准品稀释液：将缓冲剂、无机盐、蛋白保护剂、表面活性剂、化学稳定性、防腐剂依次溶解到纯化水中，调节pH至5.0～8.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用；
制备校准品：将IGF-1重组抗原按照一定的比例添加到校准品稀释液中，配置成浓度分别为0ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml的校准品溶液，分别记为S0、S1、S2、S3、S4、S5；
制备质控品：将IGF-1抗原重组抗原按照一定的比例添加到质控品稀释液中，配置成浓度分别为80g/ml、250ng/ml的质控品溶液，分别记为QC1、QC2；
制备释放剂：取释放剂原料溶于纯化水中，配制浓度为5～20g/L，添加防腐剂，调整pH至2.0～4.0范围内；
制备置换剂：取置换剂原料溶于纯化水中，配制浓度为5～20g/L，添加防腐剂，调整pH至8.0～10.0范围内；
制备固相试剂：将IGF-1抗体包被在磁微粒表面制备成中间品，再取适量的磁微粒中间品加入到固相试剂稀释液中，配置成工作浓度为0.1～0.8mg/ml的混悬液；
制备发光试剂：将吖啶酯按一定比例标记IGF-1抗体上，制备成中间品，再取适量的发光试剂中间品加入到发光试剂稀释液中，配置成工作浓度为0.1～1.0μg/ml的发光试剂工作液。
8.根据权利要求7所述的IGF-1检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备固相试剂步骤具体包括：
取出所需量的磁微粒至离心管中，按照1:9体积加入适量的磁微粒交联缓冲液，涡旋混匀后置于磁分离器上静置；
待磁微粒和稀释液完全分离开，弃掉上清液，再次注入等量磁微粒交联缓冲液重悬，重复上述步骤清洗3次，加入磁微粒交联缓冲液重悬后备用；
分别称取一定质量的活化剂EDC和sulfo-NHS，随后加入对应体积的磁微粒交联缓冲液至浓度为10mg/ml；
往备用的磁微粒悬浮液中分别加入磁微粒质量1/10的Sulfo-NHS和EDC，充分混匀后置于血液混匀仪持续混匀状态下反应20分钟；
将活化后的磁微粒用磁微粒交联缓冲液清洗3遍，加入磁微粒交联缓冲液重悬至浓度为10mg/ml备用，准确量取抗体加入到备用磁微粒混悬液中并充分混合，置于摇床室温反应2小时；
反应结束后用磁微粒封闭缓冲液清洗3遍磁珠，加入等量的磁微粒封闭缓冲液重悬，置于摇床室温反应1小时；
封闭完成后用磁微粒封闭缓冲液清洗磁微粒4遍，重悬至浓度为10mg/ml，即完成磁微粒中间品制备；
取包被好IGF-1抗体的磁微粒中间品加入到一定量的固相试剂稀释液至固相试剂工作液浓度，充分混匀后备用。
9.根据权利要求7所述的IGF-1检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备发光试剂步骤具体包括：
将吖啶酯用有机溶剂二甲基亚砜溶解后，保存于避光干燥条件；
取IGF-1标记抗体，加入到一定量的交联缓冲液中，使抗体浓度在0.5～2mg/ml范围内，再按照摩尔比1:15加入所需的吖啶酯，充分混匀后避光反应2小时；
反应结束后加入体积为1/10的浓度为10～50g/L赖氨酸溶液进行淬灭，继续反应1小时后经Sephadex G25柱分离纯化得到标记产物；
按照所需的浓度0.1～1μg/ml稀释成工作液即完成发光试剂的制备，发光试剂中的不同株抗体混合比为1:1。
10.一种IGF-1的检测方法，其特征在于，使用如权利要求1-6任一所述的IGF-1检测试剂盒，测定仪器为MS-i3080或MS-C120系列全自动化学发光仪，所述IGF-1检测方法包括以下步骤：
反应管中加入释放剂和样本孵育10分钟，再加入置换剂和固相试剂孵育5分钟，测定仪器自动清洗，除去反应管液体上清，再加入发光试剂，37℃孵育15分钟后，清洗后测量发光值RLU；
以校准品浓度为横坐标，各浓度校准品对应的发光值RLU为纵坐标，作logit-log(4p)函数曲线；
校准成功后，测定仪器自动计算相对应的浓度值。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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