CN107389946A

CN107389946A - 糖类抗原ca19‑9测定试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN107389946A
Application number: CN201710739366.4A
Authority: CN
Inventors: 李冉冉; 于猛; 张静; 田聪会; 邱笑违; 董飒英
Original assignee: Beijing Jian An Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Jian An Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-08-25
Filing date: 2017-08-25
Publication date: 2017-11-24

Abstract

本发明公开了一种糖类抗原CA19‑9测定试剂盒，该试剂盒包括：磁分离试剂R1，标记试剂R2，CA19‑9校准品及CA19‑9质控品。本发明同时提供了该试剂盒的制备方法。本试剂盒中磁分离试剂R1是将CA19‑9单克隆抗体偶联于羧基磁珠表面，标记试剂R2是将发光物质吖啶酯偶联于另一株配对的CA19‑9单克隆抗体上，反应是在接近均相的条件下进行的，通过加入激发液，反应形成的抗体‑抗原‑抗体夹心式复合物会立即在430nm处释放出光子，无需加入发光增强剂及催化剂即可释放出较强的光子，可直接进行发光检测。本发明的主要创新之处在于通过优化抗体包被磁珠及吖啶酯标记抗体的实验工艺，在较大程度上提高了该试剂盒的稳定性及检测的灵敏度，且该试剂盒检测线性范围宽，操作简便，检测速度快。

Description

糖类抗原CA19-9测定试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于医疗器械生物类免疫体外诊断领域，主要涉及测定血液中糖类抗原19-9含量的试剂盒的制备及其检测方法。

背景技术

CA199是一种粘蛋白型的糖类蛋白肿瘤标志物，为细胞膜上的糖脂质，在血清中以唾液粘蛋白形式存在，分子量为300～500万。胎儿的胃、肠、肝和胰脏中均有CA199表达，正常成人则仅在胰脏、肝脏、胆囊和肺有极少量的表达。有研究表明，胆管癌患者血清CA199升高的敏感性、特异性分别为88.15％、92％(<37U/mL)，因此检测血清中CA199对胆管癌患者的诊断有较高价值。此外，CA199对胃癌、卵巢恶性肿瘤的鉴别有一定的价值。

医院临床检测血清CA19-9含量的方法有：放射免疫法、酶联免疫法及化学发光免疫检测法。放射免疫法自于上世纪60年代以来，在生物医学领域得到了广泛应用，但是该检测方法由于存在放射线辐射和污染等问题已逐渐被市场淘汰。1971年，Engvall和Vanweemen各自领导的研究小组分别以酶代替同位素，创立了酶免疫分析技术(EIA)。因其标记物制备简单，有效期长，对环境无污染等特点，EIA技术得到了迅速的普及和发展。但是该方法操作过程繁琐，灵敏度及特异性还有待于进一步提高。化学发光免疫检测方法是继放射免疫法与酶联免疫法之后发展起来的新兴技术，它是将具有高灵敏度的化学发光检测技术与高特异性的免疫反应相结合的一种检测技术，由于其具有灵敏度高、特异性高、方法简便、效期长、无放射性同位素污染，且全自动检测仪器研制发展较快，使得这一检测技术得到了广泛关注与应用。

目前我国已批准上市的糖类抗原199(CA199)免疫检测试剂有进口和国产两大类，进口试剂有贝克曼、雅培、西门子、罗氏等跨国定量检测公司的产品，采用的方法学多为化学发光，其中罗氏产品为电化学发光法；国内已经多家产品获得批准上市，如北京利德曼生化股份有限公司、上海科华生物工程股份有限公司、北京科美生物技术有限公司。但是目前国内CA19-9临床检测主要以进口试剂为主，而国外进口试剂价格昂贵，不利于推广使用，因此开发一种灵敏度高、准确度高的CA19-9测定试剂盒是至关重要的。

发明内容

本发明需要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供一种糖类抗原CA19-9定量测定试剂盒，通过优化标记吖啶酯及包被磁珠的实验条件与技术，提高CA19-9检测的灵敏度、特异性，并降低检测成本，延长有效期。

本发明为解决上述技术问题提供的方案是：制备一种糖类抗原CA19-9测定试剂盒，该试剂盒包括的主要成分有以下下四个部分：磁分离试剂R1、标记试剂R2、CA19-9校准品、CA19-9质控品。

所述的磁分离试剂R1是含有CA19-9单克隆抗体包被的羧基磁珠；

所述的标记试剂R2是含有标记有吖啶酯的CA19-9单克隆抗体；

所述的CA19-9校准品、质控品是含有一定量CA19-9抗原的BSA溶液。

本发明试剂盒中四种组分的制备方法如下：

一.磁分离试剂R1的制备过程

(一).磁珠缓冲液配置过程，配置1L：

(1).称量纯化水800g，三羟甲基氨基甲烷7.27g，PROCLIN3000.6g，甲基纤维素醚4.38g于烧杯中，搅拌溶解2h，调节pH至8.0±0.05。

(2).称量吐温-203.15g，硫酸新霉素1.12g，四环素35mg，牛血清白蛋白5.18g于步骤(1)所得溶液中，搅拌溶解1h，调节pH至8.0±0.05。

(3).将步骤(2)所得溶液定容至1L，用0.2μm滤器过滤即可。

(二).偶联封闭液的配制

(1).称量纯化水50g，HEPES 0.60g，NaCl 0.9g，鱼皮明胶0.2g，PVP3600.2g，葡聚糖2000000.3g，

普兰多糖0.15g，蔗糖0.2g，BSA0.2g，于烧杯中，搅拌溶解2h。

(2).取吐温-2050μL，PROCLIN300100μL于步骤(1)所得溶液中，搅拌溶解1h，调节pH至7.5±0.05。

(3).将步骤(2)所得溶液定量至100g，验证pH值，用0.2μm滤器过滤即可。

(三).CA19-9单克隆抗体偶联羧基磁珠制备步骤：

(1).取250μL磁珠，弃去上清，用MES缓冲液(100mM MES，pH5.0)500μL洗涤两次；加入1250μL缓冲液，充分混匀；超声分散20s，40％(4次×5s/次)。

(2).称取20mg Sulfo-NHS，溶于缓冲液100mM MES pH 5.0，浓度为25mg/ml，加575μL于步骤(1)所得的溶液中。(配制后2分钟内使用完)

(3).称取10mg EDC，溶于缓冲液100mM MES pH5.0，浓度为20mg/ml，加250μL于步骤(2)所得的溶液中。(配制后2分钟内使用完)

(4).向步骤(3)所得溶液中补加缓冲液100mM MES pH 5.0至2.5ml(补425μL)。

(5).在血液混匀器上室温反应30分钟。

(6).磁吸弃上清，用2.5mL缓冲液100mM MES pH 5.0洗一次。

(7).复悬于1.25mL缓冲液100mM MES pH 5.0中，浓度为20mg/mL。

(8).超声分散20秒，功率40％。

(9).抗体预处理：取一支0.5mL Zeba离心式脱盐柱用缓冲液25mM MES pH 6.0平衡，0.3mL/次×6次，每次1500×g离心1分钟，之后取0.2mg抗体过脱盐柱，1500×g离心2分钟，收集至2mL尖头离心管中。

(10).将步骤(9)处理好的抗体加入到步骤(8)所得的活化的磁珠中，补足缓冲液100mM MES pH 5.0到2.5mL，磁珠浓度为10mg/mL。

(11).在血液混匀器上室温反应过夜(12小时)。

(12).磁吸收集步骤(11)所得溶液的上清2000μL于离心管中(蛋白浓度待测)，用100mM MES pH 5.0洗涤2次(5mL/次)。

(13).加2.5mL封闭液(封闭缓冲液)，在血液混匀器上室温反应4小时。

(14).磁吸步骤(13)所得的溶液弃上清，用25mM Tris-HClpH 7.4洗涤3次(5mL/次)。

(15).将步骤(14)所得的偶联产物复悬于5mL磁珠缓冲液中，终浓度为5mg/mL。

(16).将步骤(15)所得的溶液用上述磁珠缓冲液稀释50倍即可得权利要求1或2所述试剂盒的磁分离试剂R1。

二.标记试剂R2的制备过程

(一).标记试剂缓冲液配置过程，配置1L：

(1).称量Hepes 1.43g，NaCl 0.877g，MgCl 0.04g，ZnCl₂0.0023g，NaN₃0.297g，羊血清0.75mL，牛血清4.45mL，BSA0.81g，于烧杯中，加入50mL纯化水，充分搅拌溶解。

(2).调节溶液pH，使pH值为5.5±0.05。

(3).转移容量瓶中，定容至100mL，用0.2μm滤器过滤即可。

(二).CA19-9单克隆抗体偶联吖啶酯制备步骤：

(1).抗体预处理：取一支0.5mL Zeba离心式脱盐柱用缓冲液25mM MES pH 6.0平衡，0.3mL/次×6次，每次1500×g离心1分钟，之后取0.2mg抗体过脱盐柱，1500×g离心2分钟，收集至2mL尖头离心管中。

(2).取步骤(1)预处理后的抗体，按抗体:吖啶酯＝1:30摩尔比例加入吖啶酯(5mM)10μL，补加吖啶标记缓冲液(0.1M PBS+0.15M NaCl，pH值8.0)至300μL，置于血液混匀器室温反应1小时。

(3).向步骤(2)所得的溶液中加入吖啶猝灭液(0.1M PBS+1％赖氨酸，pH值8.0)100μL，置于血液混匀器室温反应0.5小时。

(4).脱盐柱准备：用吖啶标记缓冲液平衡脱盐柱，平衡大约两个柱体积。

(5).将步骤(3)所得溶液过柱子除盐，收流出液1.5mL。

(6).通过紫外分光光度计测试OD280、OD370的吸光度，计算抗体浓度及标记比例。

(7).向步骤(5)所得溶液中加入1.5mL甘油保存。

(8).将步骤(7)所得的溶液用上述标记试剂缓冲液进行稀释，使得终浓度为0.8μg/mL，即可得权利要求1或2所述试剂盒的标记试剂R2。

三.CA19-9校准品及CA19-9质控品的配置

(一).CA19-9校准品缓冲液的配置，配置100mL：

(1).称量Tris 1.808g，NaCl 0.877g，MgCl₂0.04g，ZnCl₂0.0023g，NaN₃0.297g，羊血清0.3mL，BSA0.75g，于烧杯中，加入50g纯化水，充分搅拌溶解。

(2).调节溶液pH，使pH值为8.0±0.05。

(3).转移容量瓶中，定容至100mL，用0.2μm滤器过滤即可。

(二).CA19-9校准品及质控品的配置：

用上述校准品稀释液稀释CA19-9抗原，配置六个校准品的浓度分别为：0、10、50、200、500、1000U/mL；CA19-9两个质控品的浓度分别为：50、500U/mL。

对于需要但试剂盒内未提供的其他试剂，制备方法如下：

(1).清洗浓缩液：称量Tris 9.36g，NaCl 243.5g，吐温-2018.54g，曲拉通X-1000.83g，PROCLIN3001.5g，加纯化水定量至1000g，充分搅拌溶解，调节pH值为8.6±0.05，用0.2μm滤器过滤可得八倍浓缩清洗液，检测使用时按倍数稀释即可。

(2).触发剂I：体积分数为0.5％的H₂O₂溶液

(3).触发剂II：浓度为0.2mol/LNaOH溶液

另一方面，本发明提供了使用该试剂盒测定CA19-9的检测方法，具体操作步骤如下：

(1).加样：取9支试管，分别加入CA19-9校准品、质控品、待测样品各30μL。

(2).向步骤(1)中的试管中均加入60μL磁分离试剂R1及60μL标记试剂R2，用多管螺旋混匀器混匀，于37℃水浴锅中孵育15min。

(3).孵育完毕，将试管置于磁分离器上静置吸附3min，弃去上清液，并拍打磁分离器底部，使上清液尽可能分离干净。

(4).向步骤(3)所得试管中均加入300μL洗液，置于多管螺旋混匀器上混匀，然后置于磁分离器上静置吸附3min，弃去上清液，并拍打磁分离器底部，使上清液尽可能分离干净。

(5).重复步骤(4)两次。

(6).将步骤(5)试管置于化学发光检测仪上测定每管发光值(仪器自动向每管加入触发剂I(0.5％的H₂O₂)和触发剂II(0.2mol/LNaOH)各100μL)。

本发明工作原理：本试剂盒采用高度特异性的抗原抗体反应及高灵敏度的化学发光分析技术。将样本添加到含有吖啶酯标记的CA19-9单克隆抗体以及包被着单克隆抗体CA19-9的超顺磁性微粒的反应管中，通过抗原抗体的免疫反应，形成抗体-抗原-抗体夹心式复合物。在反应管内温育完成后，结合在固相磁微粒上的物质将置于磁场内被吸住，而未结合的物质则被冲洗去。触发剂触发化学反应后发出的光信号与样本中CA19-9的浓度成正比，通过化学发光分析仪检测，然后通过内置的标准曲线把信号转换为糖类抗原CA19-9的浓度。

本发明的创新之处在于：(1).本发明试剂盒组分中标记试剂R1标记的化学发光物质使用吖啶酯，该物质结构中存在甲基基团，有较好的稳定性，从而可以延长试剂盒的有效期，且吖啶酯发光量子产率高，无需添加发光增强剂，在碱性条件下即可发出较强的光，检测简便且灵敏度高；(2).本发明试剂盒组分中磁分离试剂R2包被的羧基磁珠磁珠粒径小，使反应在接近于均相的条件下进行，且免疫反应更易混匀和分离，大大提高了反应速度。(3).制备分离试剂R2所使用的封闭液经过配方调试优化，使非特异性吸附降到最低，从而极大地降低了本底值，有利于提高检测灵敏度。

附图说明

附图用来进一步更好的解释本发明，是构成说明书的一部分，并不构成对本发明的限制。

图1是CA19-9检测标准曲线；

图2是CA19-9测定试剂盒血清测定结果与罗氏试剂测定结果相关性曲线。

具体实施方式

为了更好的解释说明本发明，现将具体实施方式进行详细阐述。需要说明的是，具体实施方式仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施中所用的试剂及设备均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。

实施1：

试剂盒制备过程及检测过程所涉及到的各种缓冲液，具体如下：

1.磁珠缓冲液的配制，配制1L，具体操作步骤如下：

(1).称量纯化水800g，三羟甲基氨基甲烷7.27g，PROCLIN3000.6g，甲基纤维素醚4.38g于容量为1L的烧杯中，充分搅拌2h至完全溶解。

(2).称量吐温-203.15g，硫酸新霉素1.12g，四环素35mg，牛血清白蛋白(BSA)5.18g于步骤(1)所得溶液中，搅拌1h至完全溶解，调节pH计测量其pH值，用稀HCl和稀NaOH溶液调节，使其pH值为8.0±0.05。

(3).将步骤(2)所得溶液定量至1000g，验证pH值，用0.2μm滤器过滤至1L玻璃瓶中，贴标签于2～8℃冷库中贮存，有效期为一年。

2.偶联封闭液的配制，配制100mL：

普兰多糖0.15g，蔗糖0.2g，BSA0.2g，于容量为250mL的烧杯中，搅拌溶解2h。

(2).用移液枪取吐温-2050μL，PROCLIN300100μL于步骤(1)所得溶液中，搅拌溶解1h，调节pH计测量其pH值，用稀HCl和稀NaOH溶液调节，使其pH值为7.5±0.05。

(3).将步骤(2)所得溶液定量至100g，验证pH值，用0.2μm滤器过滤至250mL玻璃瓶中，贴标签于2～8℃冷库中贮存，有效期为一年。

3.标记试剂缓冲液配制，配置250mL：

(1).称量Hepes 1.43g，NaCl 0.877g，MgCl₂0.04g，ZnCl₂0.0023g，NaN₃0.297g，BSA0.81g于容量为1L的烧杯中，加入50g纯化水，充分搅拌溶解。

(2).用1L移液枪向步骤(1)所得的溶液中加入羊血清750μL，牛血清4.45mL，调节pH计测量其pH值，用稀HCl和稀NaOH溶液调节，使其pH值为5.5±0.05。

4.CA19-9校准品缓冲液的配制，配制100mL：

(1).称量Tris 1.808g，NaCl 0.877g，MgCl₂0.04g，ZnCl₂0.0023g，NaN₃0.297g，BSA0.75g于容量为250mL的烧杯中，加入50g纯化水，充分搅拌溶解。

(2).用移液枪向步骤(1)所得的溶液中加入羊血清300μL，调节pH计测量其pH值，用稀HCl和稀NaOH溶液调节，使其pH值为8.0±0.05。

(3).将步骤(2)所得溶液定量至100g，验证pH值，用0.2μm滤器过滤至250mL玻璃瓶中，贴标签于2～8冷库中贮存，有效期为一年。

5.清洗浓缩液的配制，配制1L：

(1).称量Tris 9.36g，NaCl 243.5g，吐温-2018.54g，曲拉通X-1000.83g，PROCLIN3001.5g，加纯化水800g，充分搅拌溶解。

(2).调节pH计测量其pH值，用稀HCl和稀NaOH溶液调节，使其pH值为8.6±0.05。

(3).加纯化水定量至1000g，用0.2μm滤器过滤至1L玻璃瓶中，贴标签于2～8冷库中贮存，检测使用时按倍数稀释即可。

6.触发剂的配制，各配制100mL：

(1).触发剂I：体积分数为0.5％的H₂O₂溶液，用移液枪移取35％H₂O₂1.43mL于100mL容量瓶中，加纯化水定量至100mL，溶液保存于250mL玻璃瓶中，贴标签于2～8冷库中贮存。

(2).触发剂II：浓度为0.2mol/LNaOH溶液，称量固体NaOH 0.8g于烧杯中，加少量水搅拌溶解，然后转移至100mL容量瓶中，加纯化水定量至100mL，溶液保存于250mL玻璃瓶中，贴标签于2～8冷库中贮存。

实施2：糖类抗原CA19-9测定试剂盒的制备

1.磁分离试剂R1的制备：

(1).用移液枪取250μL磁珠于5mL玻璃小瓶中，磁板吸附弃去上清，量取100mM MESpH 5.0缓冲液500μL洗涤两次；加入1250μL缓冲液，充分混匀；超声分散20s，功率40％(4次×5s/次)。

(2).称取20mg Sulfo-NHS于离心管中，加入800μL缓冲液100mM MES pH 5.0，浓度为25mg/ml，加575μL于步骤(1)所得的溶液中。(配制后2分钟内使用完)

(3).称取10mg EDC，加入500μL缓冲液100mM MES pH5.0，浓度为20mg/ml，加250μL于步骤(2)所得的溶液中。(配制后2分钟内使用完)

(5).在血液混匀器上室温反应30分钟。

(6).磁板吸附弃上清，用2.5mL缓冲液100mM MES pH 5.0洗一次。

(7).复悬于1.25mL缓冲液100mM MES pH 5.0中，浓度为20mg/mL。

(8).超声分散20秒，功率40％。

(9).抗体预处理：取一支0.5mL Zeba离心式脱盐柱用缓冲液25mM MES pH 6.0平衡，0.3mL/次×6次，每次1500×g离心1分钟，之后取0.25mg待偶联的抗体过脱盐柱，1500×g离心2分钟，收集至2mL尖头离心管中。

(10).将除盐后的CA19-9抗体加入到步骤(8)所得的活化的磁珠中，补足缓冲液100mM MES pH 5.0到2.5mL，磁珠浓度为10mg/mL。

(11).在血液混匀器上室温反应过夜(12小时)。

(12).磁吸附收集步骤(11)所得溶液的上清2000μL于离心管中(蛋白浓度待测)，用100mM MES pH5.0洗涤2次(5mL/次)。

(13).加2.5mL封闭液缓冲液，在血液混匀器上室温反应4小时。

(15).将步骤(14)所得的偶联产物复悬于5mL磁珠缓冲液中，终浓度为5mg/mL，贴签，2～8℃保存。

(16).将步骤(15)所得的溶液用上述磁珠缓冲液稀释50倍即可得本发明试剂盒的磁分离试剂R1。

2.标记试剂R2的制备：

(2).用移液枪移取步骤(1)预处理后的抗体于1mL玻璃小瓶中，按抗体:吖啶酯＝1:30摩尔比例加入吖啶酯(5mM)10μL，补加吖啶标记缓冲液(0.1M PBS+0.15M NaCl，pH值8.0)至300μL，置于血液混匀器室温反应1小时。

(5).将步骤(3)所得溶液过柱子除盐，收流出液1.5mL。

(6).通过紫外分光光度计测试OD280、OD370的吸光度，根据公式C＝(OD280-OD370×0.17)/1.36计算最终抗体浓度。

(7).向步骤(5)所得溶液中加入1.5mL甘油保存。

(8).将步骤(7)所得的溶液用标记试剂缓冲液进行稀释，使得终浓度为0.8μg/mL，即可得本发明试剂盒的标记试剂R2。

3.CA19-9校准品及质控品的配制：

CA19-9六个校准品的浓度分别为：0、10、50、200、500、1000U/mL；CA19-9两个质控品的浓度分别为：50、500U/mL。具体配制方法如下：

用移液枪取一定体积CA19-9抗原于3mL玻璃小瓶中，加CA19-9校准品缓冲液配制成1000U/mL的高浓度样品2mL。

用高浓度样品1000U/ml和0U/ml的低浓度样品，混合成5个稀释浓度，混合方式及稀释浓度见表1：

表1.校准品及质控品各浓度点稀释样品混合方式

样品组	高浓度样品用量(μL)	低浓度样品用量(μL)	配制浓度(U/ml)
				1	1000	0	1000
2	500	500	500
				3	200	800	200
4	50	950	50
				5	10	990	10
6	1.5	998.5	1.5

将配制好的CA19-9校准品及质控品贴签，于2～8℃保存。

4.将上述制备好的磁珠分离试剂R1、标记试剂R2各取6mL于相应的包装容器内，CA19-9校准品与质控品各取1mL于玻璃小瓶中，各组分贴签并置于试剂盒中，即可得到糖类抗原CA19-9测定试剂盒，该试剂盒于2～8℃储存，有效期为一年。

实施3.用糖类抗原CA19-9测定试剂盒测定CA19-9的步骤

用本发明制备的糖类抗原CA19-9测定试剂盒对CA19-9进行测定，其检测步骤如下：

(2).向步骤(1)中的试管中均加入60μL磁分离试剂R1及60μL标记试剂R2，用多管螺旋混匀器混匀30s，于37℃水浴锅中孵育15min。

(5).重复步骤(4)两次。

(7).数据处理：以CA19-9校准品的浓度值为横坐标，以CA19-9校准品发光值为纵坐标进行线性拟合，可得到检测标准曲线，如图1所示，其拟合方程为：y＝1441.8x+32647，将CA19-9待测样本的发光值y代入上述拟合方程，即可测得该待测样本的CA19-9浓度。

临床数据：

1.为了评价本发明的CA19-9测定试剂盒有效期内的分析性能和稳定性，对试剂盒每两个月进行一次分析性能测定，测试结果如表2所示，由表中数据可以看出，CA19-9测定试剂盒连续13个月的各项检测性能均符合国家标准。

表2.CA19-9测定试剂盒长期稳定性研究数据结果

2.本发明CA19-9测定试剂盒与罗氏试剂测定血清CA19-9结果对比

共测定300例人血清样本，血清样本无可视凝块及气泡，无反复冻融，对于溶血的标本、严重高脂血症标本、严重黄疸症的标本或微生物污染的标本予以排除。对于筛选入组的血清样本同时用本发明的CA19-9测定试剂盒及罗氏对比试剂盒进行测定，以罗氏对比试剂测定结果为横坐标，以本发明试剂盒检测结果为纵坐标作图进行线性回归分析，如图2所示，其线性回归方程为：y＝0.9913x+1.1523，R²为0.9873，相关性较高。

Claims

1.一种糖类抗原CA19-9测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括磁分离试剂R1、标记试剂R2、CA19-9校准品、CA19-9质控品。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的磁分离试剂R1是含有CA19-9单克隆抗体包被的羧基磁珠；

所述的标记试剂R2是含有标记有吖啶酯的CA19-9单克隆抗体；

3.如权利要求1～2所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒各组分的制备方法如下：

一.磁分离试剂R1的制备过程

(一).磁珠缓冲液配制过程，配制1L：

(1).称量纯化水800g，三羟甲基氨基甲烷7.27g，PROCLIN300 0.6g，甲基纤维素醚4.38g于烧杯中，搅拌溶解2h。

(2).称量吐温-20 3.15g，硫酸新霉素1.12g，四环素35mg，牛血清白蛋白5.18g于步骤(1)所得溶液中，搅拌溶解1h，调节pH至8.0±0.05

(3).将步骤(2)所得溶液定量至1000g，验证pH值，用0.2μm滤器过滤即可。

(二).偶联封闭液的配制，配制100mL：

(1).称量纯化水50g，HEPES 0.60g，NaCl 0.9g，鱼皮明胶0.2g，PVP360 0.2g，葡聚糖200000 0.3g，普兰多糖0.15g，蔗糖0.2g，BSA 0.2g，于烧杯中，搅拌溶解2h。

(2).取吐温-20 50μL，PROCLIN300 100μL于步骤(1)所得溶液中，搅拌溶解1h，调节pH至7.5±0.05。

(三).CA19-9单克隆抗体偶联羧基磁珠制备步骤：

(5).在血液混匀器上室温反应30分钟。

(6).磁吸弃上清，用2.5mL缓冲液100mM MES pH 5.0洗一次。

(7).复悬于1.25mL缓冲液100mM MES pH 5.0中，浓度为20mg/mL。

(8).超声分散20秒，功率40％。

(10).将步骤(9)处理好的抗体加入到步骤(8)所得的活化的磁珠中，补足缓冲液100mMMES pH 5.0到2.5mL，磁珠浓度为10mg/mL。

(11).在血液混匀器上室温反应过夜(12小时)。

(12).磁吸收集步骤(11)所得溶液的上清2000μL于离心管中(蛋白浓度待测)，用100mMMES pH 5.0洗涤2次(5mL/次)。

(14).磁吸步骤(13)所得的溶液弃上清，用25mM Tris-HCl pH 7.4洗涤3次(5mL/次)。

二.标记试剂R2的制备过程

(一).标记试剂缓冲液的配制过程，配制1L：

(1).称量Hepes 1.43g，NaCl 0.877g，MgCl₂ 0.04g，ZnCl₂ 0.0023g，NaN₃ 0.297g，羊血清0.75mL，牛血清4.45mL，BSA 0.81g，于烧杯中，加入50g纯化水，充分搅拌溶解。

(2).调节溶液pH，使pH值为5.5±0.05。

(3).定量至100g，验证pH，用0.2μm滤器过滤即可。

(二).CA19-9单克隆抗体偶联吖啶酯制备步骤：

(2).取步骤(1)预处理后的抗体，按抗体:吖啶酯＝1:30摩尔比例加入吖啶酯(5mM)10μL，补加吖啶标记缓冲液(0.1M PBS+0.15M NaCl，pH值8)至300μL，置于血液混匀器室温反应1小时。

(5).将步骤(3)所得溶液过柱子除盐，收流出液1.5mL。

(7).向步骤(5)所得溶液中加入1.5mL甘油保存。

三.CA19-9校准品及CA19-9质控品的配制

(一).CA19-9校准品缓冲液的配制，配制100mL：

(1).取Tris 1.808g，NaCl 0.877g，MgCl₂ 0.04g，ZnCl₂ 0.0023g，NaN₃ 0.297g，羊血清0.3mL，BSA 0.75g，于烧杯中，加入50mL纯化水，充分搅拌溶解。

(2).调节溶液pH，使pH值为8.0±0.05。

(3).转移容量瓶中，定容至100mL，用0.2μm滤器过滤即可。

(二).CA19-9校准品及质控品的配制：

用上述校准品稀释液稀释CA19-9抗原，配制六个校准品的浓度分别为：0、10、50、200、500、1000U/mL；CA19-9两个质控品的浓度分别为：50、500U/mL。

4.利用权利要求1～3任一项所述的一种糖类抗原CA19-9测定试剂盒定量检测CA19-9的方法，该检测方法步骤如下：

(5).重复步骤(4)两次。