CN116953224A - 一种检测fgf21的发光试剂及其应用 - Google Patents

一种检测fgf21的发光试剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种检测FGF21的发光试剂及其应用。本发明改良了发光试剂的制备方法，使用本发明所制备得到的发光试剂能准确检测FGF21蛋白，为临床检测提供了更有效的检测方法和检测产品。具体地，所述制备方法具体包括磁微球的偶联的步骤和吖啶酯抗体交联的步骤。同时，本发明提供了所述制备方法所得到的发光试剂的保存溶液，所述保存溶液有利于发光试剂的长时间稳定保存。

Description

一种检测FGF21的发光试剂及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种检测FGF21的发光试剂及其应用。
背景技术
成纤维细胞生长因子21(FGF21)是FGF超家族的内分泌物成员，目前鉴定FGF蛋白属于信号分子家族，调节多种细胞类型的生长和分化。FGF蛋白对人生理学和病理学的有重要意义，具体涉及胚胎发生、血管发育和生长、骨骼生长中。FGF家族的大多数成员与细胞活动相关，包括有丝分裂、发育、血管发生和细胞存活。FGF21是代谢疾病如糖尿病的生物标志物，在肥胖受试者、患有非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的受试者和患有2型糖尿病的受试者中观察到血清水平升高。在骨骼肌、肾脏、心脏以及血管中FGF21表达比肝脏中高约7-10倍。
考虑到FGF21在代谢疾病的治疗和发展中的重要作用，本领域仍然需要更高准确度、灵敏度、特异性的检测方法和检测产品。
目前常用的ELISA方法操作不方便，孵育时间长，检测灵敏度不够，而化学发光法在检测FGF21时灵敏度、特异性高，检测方便快速，且能全自动检测。FGF21在血循环中较为特殊，比如与其他蛋白结合、容易降解等，这样就给检测的准确性带来困难，因此也有必要开发一种快速检测方法，同时能够破坏FGF21与其他蛋白的结合，使FGF21游离出来，检测的更准确。
发明内容
为提供高准确度、灵敏度、特异性的FGF21检测方法和检测产品，本发明改良了发光试剂的制备方法，使用本发明所制备得到的发光试剂能准确检测FGF21蛋白，为临床检测提供了更有效的检测方法和检测产品。并且，本发明的制备方法中抗体使用量低，保证检测效果的同时降低了产品成本。
具体地，本发明提供以下技术方案：
磁微球的偶联方法
第一方面，本发明提供了一种微球的偶联方法，所述方法包括以下步骤：
1)微球活化：取微球，使用EDC和sulfo-NHS进行活化，所述EDC和sulfo-NHS使用0.1M MES pH5.0配制；
2)微球与抗体交联：清洗所述步骤1)得到的活化的微球，在交联夜(缓冲液)中与抗体交联；
3)微球清洗：加入1x TBST以2000rpm/min混合震荡，震荡1分钟后分离去上清；
4)清洗后封闭：使用乙二胺和脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)进行封闭。
优选地，所述微球包括磁性微球、乳胶微球、纳米微球、蛋白微球。
优选地，所述微球是磁性微球。
优选地，所述微球是表面覆盖COOH的磁性微球。
优选地，所述微球是经过清洗的微球，所述清洗的方法是本领域所熟知的；例如：使用缓冲液重悬后，放置于振荡器上以2000rpm/min混合震荡，1min为一次清洗；优选地，所述缓冲液是1ml 0.1M MES PH5.0。
优选地，所述EDC使用量为5-200μg EDC/mg磁珠；优选地，所述EDC的使用量是每mg磁珠添加20-100μg EDC。具体地，所述20-100包括20、30、40、50、60、70、80、90、100等。
更优选地，所述EDC使用量为20μg EDC/mg磁珠。
优选地，所述步骤1)中EDC和sulfoNHS的摩尔比为1:0.5-2；
更优选地，所述步骤1)中EDC和sulfoNHS的摩尔比包括EDC和sulfoNHS的摩尔比为1:0.5、1:1、1:2等。
更优选地，所述步骤1)中EDC和sulfoNHS的摩尔比为1:1-1:2。
最优选地，所述步骤1)中EDC和sulfoNHS的摩尔比为1:1。
优选地，所述步骤2)中交联液的pH值范围是7.4-9.5；具体地包括7.4、7.5、8、8.5、9、9.5等。
优选地，所述步骤2)中交联液包括PBS pH7.4和NaHCO3 ph9.5。
更优选地，所述步骤2)中交联液是NaHCO3 ph9.5。
优选地，所述步骤2)中抗体浓度为0.05-0.5mg/ml。具体地，包括0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5等。更优选地，所述步骤2)中抗体浓度为0.2-0.4mg/ml。
更优选地，所述步骤2)中抗体浓度为0.2mg/ml。
优选地，所述步骤3)中清洗步骤进行一次或多次，更优选地，共清洗5次；
优选地，所述乙二胺和脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)各自独立地终浓度为1％。
优选地，所述封闭的步骤是去上清后加入乙二胺和脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)，使二者终浓度均为1％，放置于振荡器上以2000rpm/min混合震荡，震荡进行2小时，在封闭条件室温下进行。
优选地，所述抗体包括特异性结合任意蛋白的抗体，其结构是本领域所公知的。
更优选地，本发明抗体是靶向FGF21蛋白的抗体；其具有特异性结合FGF21的能力。
另一方面，本发明提供了以上偶联方法制备得到的免疫磁微球(或简称“磁珠”、“磁微球”)及其在检测FGF21中的应用。具体地，所述免疫磁微球也即偶联了抗体的磁微球。
另一方面，本发明提供了包含以上所述免疫磁微球的试剂盒及其在检测FGF21中的应用。
吖啶酯抗体交联方法
另一方面，本发明还提供了吖啶酯和抗体的交联方法，所述方法包括以下步骤：
1)交联：取吖啶酯和抗体加入到交联溶液中，交联溶液为NaHCO3 pH9.5，，溶液中吖啶酯和抗体的摩尔比为20:1。
2)封闭：使用封闭液进行封闭，所述封闭液为9％甘氨酸、1％bsa、50mM tris、300mM NaCL，pH8.0。
优选地，所述吖啶酯包括但不限于Me-DMAE-NHS、NSP-DMAE-NHS、ME-AE-NHS、DMAE-NHS、NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS。具体地，在本发明具体实施例中以NSP-DMAE-NHS为例证明了本发明方法适用于各种吖啶酯。
优选地，所述抗体包括特异性结合任意蛋白的抗体，其结构是本领域所公知的。
更优选地，本发明抗体是靶向FGF21蛋白的抗体；其具有特异性结合FGF21的能力。
另一方面，本发明提供了前述吖啶酯和抗体的交联方法所制备得到的吖啶和抗体的交联物(制备产物)及其在检测FGF21中的应用。
另一方面，本发明提供了包含以上所述吖啶和抗体的交联物的试剂盒及其在检测FGF21中的应用。
发光试剂的制备方法
另一方面，本发明提供了一种制备方法，所述制备方法制备的是检测FGF21的发光试剂，所述方法包括：
步骤1、前述磁微球的偶联方法，和；
步骤2、吖啶酯和抗体的交联方法，
优选地，以上步骤1和步骤2中的抗体包括特异性结合任意蛋白的抗体，其结构是本领域所公知的；更优选的，所述抗体都特异性结合FGF21。
更具体地，所述检测FGF21发光试剂的制备方法包括以下步骤：
步骤1、磁微球的偶联：
1)微球活化：取磁性微球，使用EDC和sulfo-NHS进行活化，所述EDC和sulfo-NHS使用0.1M MES pH5.0配制；
2)微球与抗体交联：清洗所述步骤1)得到的活化的微球，在交联夜(缓冲液)中与抗体交联；
3)微球清洗：加入1x TBST以2000rpm/min混合震荡，震荡1分钟后分离去上清，共清洗5次；
4)清洗后封闭：使用乙二胺和脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)进行封闭。
步骤2、吖啶酯和抗体的交联
1)交联：取吖啶酯和抗体加入到交联溶液中，交联溶液为50mM tris中加入300mMNaCL、调节pH值为9.0，溶液中吖啶酯和抗体的摩尔比为20:1。
2)封闭：使用封闭液进行封闭，所述封闭液为9％甘氨酸、1％bsa、50mM tris、300mM NaCL，pH8.0。
另一方面，本发明提供了以上制备方法所制备得到的发光试剂及其在检测FGF21中的应用。
另一方面，本发明提供了包含以上制备方法所制备得到的发光试剂的试剂盒及其在检测FGF21中的应用。
优选地，所述试剂盒中还可以包含以下任意一种或多种产品：待检测抗原的标准品(质控品)、免疫磁微球的保存溶液、样品收集和处理试剂反应容器(反应孔)、磁分离设备和洗涤设备。
使用方法
另一方面，本发明提供了FGF21发光试剂的使用方法，所述方法包括以下步骤：
1)加入上述步骤1、前述磁微球的偶联方法制备得到的磁珠与样本混合、孵育；所述磁微球稀释在本发明所述保存溶液中使用；
2)清洗；
3)加入上述步骤2、吖啶酯和抗体的交联方法交联所得到的抗体混合、孵育；所述交联物在本发明所述保存溶液中使用；
4)去除磁珠，加入发光预激发液，振荡混匀，再加入100μl激发液，立即读取发光信号值。
优选地，所述孵育的步骤是37度孵育10分钟。
优选地，所述清洗的步骤是以下操作进行一次或多次：去除上清，加入500μl清洗液，振荡混匀；优选地，清洗三次；
优选地，所述磁微球稀释的稀释浓度是10-100mg/L，最优选地，50mg/L；
优选地，所述交联物的稀释浓度是0.1-0.5mg/L，最优选地，0.2mg/L。
保存溶液
另一方面，本发明提供了发光试剂的保存溶液，所述保存溶液包括缓冲液、还原剂和表面活性剂，所述缓冲液包括pbs pH 7.4、mops pH 6.4或mes pH 5.0中任意一种或多种；所述还原剂包括DTT、beta-ME或GSSG中任意一种或多种；所述表面活性剂包括tween20、tween80、tritonX-100或SDS/NP40中任意一种或多种。
另一方面，本发明提供了以上保存溶液在保存发光试剂中的应用，所述发光试剂是吖啶酯、抗体和微球的偶联产物。
优选地，所述发光试剂中吖啶酯包括Me-DMAE-NHS、NSP-DMAE-NHS、ME-AE-NHS、DMAE-NHS、NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS在内的发光物质。
优选地，所述抗体包括特异性结合任意蛋白的抗体，其结构是本领域所公知的。
优选地，所述微球包括磁性微球(磁珠)、乳胶微球、纳米微球、蛋白微球(BSA-NS)。
优选地，所述微球是磁性微球。
优选地，所述微球是表面覆盖COOH的磁性微球。
如本发明所述“磁性微球”亦可称为磁性高分子微球、磁微球、磁珠、磁性聚合物微球；按照其内部结构分类包括核壳式、反核壳式、夹心式、弥散式；其中应用的磁性物质可以是纯铁粉、羰基铁、磁性矿、正铁酸盐、铁钴合金等；其骨架材料可以是：高分子载体骨架材料如氨基酸聚合物如蛋白质、肽类、酶类等；多糖类如阿拉伯胶、淀粉、右旋糖酐、琼脂糖等，其他高分子聚合物如聚丙烯、聚乙烯、硅酮等。
本发明中所述“交联”、“偶联”是相同含义，可以互相替换。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
对比例一、FGF21发光试剂的制备
步骤一、磁珠微球的交联
1)微球活化：
取10mg表面覆盖COOH的磁性微球(粒径1-3微米)，磁分离1分钟后去上清，使用1ml0.1M MES PH5.0重悬后，放置于振荡器上以2000rpm/min混合震荡，1min为一次清洗。清洗3次后，重悬于1ml 0.1M MES PH5.0中。使用两步法活化，先加入20μl的10mg/mL EDC溶液，再加入28μl的10mg/mL sulfo-NHS溶液。
其中EDC溶液和sulfo-NHS溶液使用0.1M MES pH5.0配制，现配现用。
EDC使用量为20μg EDC/mg磁珠(也即每mg磁珠添加20μg EDC)。EDC和sulfoNHS的摩尔比范围为1:1。
2)微球与FGF21抗体交联：
清洗活化后的微球，在交联液中与FGF21特异性抗体抗体(由香港优尼德诊断有限公司采购)交联，交联液是NaHCO3 pH9.5，交联液中抗体浓度为0.2mg/ml、微球浓度为10mg/ml。所述清洗与步骤1)中的清洗方式相同。
3)微球清洗：加入1x TBST(0.1M Tris、150mM NaCl，0.05％Tween20(v/v)，pH7.4)后，放置于振荡器上以2000rpm/min混合震荡，1min为一次清洗。每次清洗后磁板吸附，弃上清液，共清洗5次。
4)清洗后封闭：去上清后加入乙二胺和脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)使二者终浓度均为1％，放置于振荡器上以2000rpm/min混合震荡，震荡进行2小时，在封闭条件室温下进行。
5)完成封闭后的交联了FGF21特异性抗体磁珠，按50mg/L的浓度稀释到实施例二中所述FGF21发光试剂保存液中。
步骤二、吖啶酯抗体交联
1)交联：取吖啶酯(NSP-DMAE-NHS)和FGF21特异性抗体加入到交联溶液中，FGF21特异性抗体浓度为1mg/ml,交联溶液为NaHCO3 pH9.5，溶液中吖啶酯和抗体的摩尔比为20:1。放置于振荡器上以2000rpm/min混合震荡后，室温放置1小时。
2)封闭：交联结束后，加入1ml封闭液，室温下放置于振荡器上以2000rpm/min混合震荡1小时。封闭液为9％甘氨酸、1％bsa、50mM tris、300mM NaCL，pH8.0。
封闭结束后，偶连吖啶酯的FGF21特异性抗体，按200ng/ml(0.2毫克每升[mg/l])浓度稀释到实施例二中所述FGF21发光试剂保存液中，即为检测抗体。
对比例二
与对比例一的区别仅在于，EDC使用量为5μg EDC/mg磁珠。
对比例三
与对比例一的区别仅在于，EDC使用量为40μg EDC/mg磁珠。
对比例四
与对比例一的区别仅在于，EDC使用量为100μg EDC/mg磁珠。
对比例五
与对比例一的区别仅在于，EDC使用量为200μg EDC/mg磁珠。
对比例六
与对比例一的区别仅在于，EDC和sulfoNHS的摩尔比为1:2。
对比例七
与对比例一的区别仅在于，EDC和sulfoNHS的摩尔比为2:1。
对比例八
与对比例一的区别仅在于，微球抗体交联夜的缓冲液为mops pH 6.4。
对比例九
与对比例一的区别仅在于，微球抗体交联夜的缓冲液为pbs pH 7.4。
对比例十
与对比例一的区别仅在于，抗体浓度为0.05mg/ml。
对比例十一
与对比例一的区别仅在于，抗体浓度为0.1mg/ml。
对比例十二
与对比例一的区别仅在于，抗体浓度为0.3mg/ml。
对比例十三
与对比例一的区别仅在于，抗体浓度为0.4mg/ml。
对比例十四
与对比例一的区别仅在于，清洗时静置3分钟，不振荡。
对比例十五
与对比例一的区别仅在于，封闭液单用Tris。
对比例十六
与对比例一的区别仅在于，封闭液Tirs加1％ BSA。
对比例十七
与对比例一的区别仅在于，封闭步骤静置不振荡。
表1、对比例汇总
实施例一、FGF21化学发光试剂盒的优化
以上对比例一至十五所制备得到的FGF21化学发光试剂盒统一在菲鹏开放式全自动生化分析仪IncreCare Shine i1910上进行测定。测试样本包括空白样本、不同浓度FGF21校准品：30pg/ml、60pg/ml、120pg/ml、240pg/ml、480pg/ml、960pg/ml、1920pg/ml。
上机测试程序为：
1、分别取50μl样本，50μl交联了FGF21特异性抗体的磁珠(以上步骤一、磁珠微球的交联制备得到的磁珠)，加入到发光专用反应管中，混匀后37度孵育10分钟。
2、孵育完成后按仪器固定清洗步骤对磁珠进行清洗：首先磁分离，去除上清，加入500μl清洗液，振荡混匀。重复上述步骤三次。再磁分离，去除上清。
3、在发光管中加入100μl吖啶酯偶连FGF21特异性抗体的检测抗体(以上步骤二、吖啶酯抗体交联所得到的抗体)，与磁珠混匀，孵育10分钟，按上一步骤所述，由仪器固定清洗步骤清洗三次。
4、清洗完成后磁分离，去除上清保留磁珠，加入100μl发光预激发液(采购于南京仁迈生物科技有限公司)，振荡混匀，再加入100μl激发液(采购于南京仁迈生物科技有限公司)，立即读取发光信号值。
1)EDC使用量的优化
不同浓度EDC使用量制备的微球，检测不同浓度FGF21校准品获得的信号值汇总如表2所示(对比例一到对比例五)。
表2、不同浓度EDC使用量制备得到的检测试剂的对比
如表2所示，本发明使用不同浓度EDC使用量制备微球对不同浓度FGF21校准品进行测试。在低浓度EDC条件下(对比例二5μg EDC/mg磁珠)，校准曲线的发光值低，试剂灵敏度低。随着EDC浓度的升高，试剂信号也越来越高，灵敏度提高，但同时试剂背景(0pg/ml)的信号也越来越高，信噪比下降，而且会导致试剂特异性下降，因此本发明优选对比例一、对比例三、对比例四；进一步优选对比例一。
2)EDC和sulfoNHS的摩尔比的优化
不同EDC和sulfoNHS的摩尔比条件制备的微球，检测不同浓度FGF21校准品获得的信号值汇总如表3所示(对比例一、对比例六、对比例七)
表3、不同EDC和sulfoNHS的摩尔比制备得到的检测试剂的对比
如表3所示，本发明使用不同EDC和sulfo NHS摩尔比条件制备的微球对不同浓度FGF21校准品进行测试。EDC和sulfo NHS摩尔比在1:1和1:2条件下，校准品的反应度高，试剂空白背景低；EDC和sulfo NHS摩尔比2:1条件下，虽然校准品信号高，但试剂空白背景高，会导致试剂特异性下降。因此本发明优选对比例一、对比例六；进一步优选对比例一。
3)交联液的优化
不同交联液条件制备的微球，检测不同浓度FGF21校准品获得的信号值(对比例一、对比例八、对比例九)。
表4、不同交联液制备得到的检测试剂的对比
如表4所示，本发明使用不同交联液条件制备的微球对不同浓度FGF21校准品进行测试。对比例八为业内常规方案，在FGF21这个项目中，对比例九测试校准品获得的信号值比常规方案提高了约50％，对比例一获得的信号值比常规方案提高了近一倍，同时空白背景没有显著变化，说明在对比例九和对比例一条件下试剂灵敏度能够得到显著提升而特异性不会受到影响。因此本发明优选对比例一、对比例九；进一步优选对比例一。
4)FGF21特异性抗体浓度的优化
不同浓度的FGF21特异性抗体偶连制备的微球，检测不同浓度FGF21校准品获得的信号值(对比例一、对比例十到对比例十三)：
表5、不同浓度的FGF21特异性抗体偶连制备得到的检测试剂的对比
如表5所示，本发明使用不同浓度的FGF21特异性抗体制备的微球对不同浓度FGF21校准品进行测试。随着抗体浓度从0.05mg/m升高到0.1mg/ml，再升高到0.2mg/ml，校准品的信号又非常明显的提升。但随着抗体浓度继续升高，信号提升的幅度并不明显，考虑到试剂成本。本发明优选对比例一、对比例十二、对比例十三；进一步优选对比例一。
4)清洗、封闭工艺的优化
不同清洗、封闭工艺制备的FGF21微球，检测不同浓度FGF21校准品获得的信号值(对比例一、对比例十到对比例十三)：
表6、不同清洗、封闭工艺的制备得到的检测试剂的对比
如表6所示，本发明优化了FGF21微球制备的清洗和封闭工艺，与传统Tris，或Tirs+BSA封闭工艺相比，加入乙二胺+AEO并且在清洗和封闭过程充分振荡，微球空白信号从4864，或3347非常显著的降低到了336，降低幅度达到10倍，因此能够极大程度的提高试剂的信噪比，从而提高试剂灵敏度和特异性。
5)FGF21化学发光试剂盒的cv值检测
取各个对比例所制备的FGF21化学发光试剂，按以上上机测试程序检测120pg/mlFGF21校准品，测试20次,计算CV值，CV值计算方式如下。
CV＝SD/M×100％
式中：
CV—变异系数
SD—10次测量结果的标准差
M—10次测量结果的平均值
cv值统计于表7，根据数据可知，本发明所提供的发光试剂制备方法所制备得到的发光试剂具有最好的cv值，可准确、稳定的检测FGF21蛋白。
表7、cv值统计
cv
对比例一 3％
对比例二 15％
对比例三 3％
对比例四 3％
对比例五 6％
对比例六 3％
对比例七 11％
对比例八 8％
对比例九 8％
对比例十 24％
对比例十一 8％
对比例十二 4％
对比例十三 4％
对比例十四 85％
对比例十五 4％
对比例十六 4％
对比例十七 16％
实施例二、FGF21发光试剂的保存溶液
配制保存溶液，所述保存溶液包括缓冲液、还原剂和表面活性剂，所述缓冲液为pbs pH 7.4、50mM mops pH 6.4或50mM MES pH 5.0；所述还原剂为5mM DTT、5mM beta-ME或5mM GSSG；所述表面活性剂为0.1％tween20、0.1％tween80、0.1％tritonX-100，0.1％SDS或0.1％ NP40。
表8、本发明所测试的保存液及37度稳定性结果
取以上保存液制备FGF21发光试剂，按实施例一中所述检测方法，检测不同浓度FGF21校准品的信号值。然后将发光试剂保存到37度进行加速破坏试验，在保存第3、7、14天后(时间长度)，检测FGF21校准品各水平的信号值与初始信号值进行对比获得回收率，并计算平均回收率(表8)。根据检测的对比可知，其中保存液2，保存液5，保存液7，保存液9，保存液12，及保存液13的稳定性好，进一步优选保存液12，保存液13的稳定性最好。最终选用保存液12作为FGF21发光试剂保存液。

Claims (10)

1.一种微球的偶联方法，所述方法包括以下步骤：
1）微球活化：取微球，使用EDC和sulfo-NHS进行活化，所述EDC和sulfo-NHS使用0.1MMES pH5.0配制；
2）微球与抗体交联：清洗所述步骤1）得到的活化的微球，在交联夜中与抗体交联；
3）微球清洗：加入1x TBST以2000rpm/min混合震荡，震荡后分离去上清；
4）清洗后封闭：使用乙二胺和脂肪醇聚氧乙烯醚进行封闭；
优选地，所述微球包括磁性微球、乳胶微球、纳米微球、蛋白微球；
优选地，所述微球是磁性微球；
优选地，所述微球是表面覆盖COOH的磁性微球；
优选地，所述微球是经过清洗的微球；
优选地，所述清洗的方法是使用缓冲液重悬后，放置于振荡器上以 2000rpm/min混合震荡；优选地，所述缓冲液是1ml 0.1M MES PH5.0；
优选地，所述EDC使用量为5-200μg EDC/mg磁珠，具体地，所述EDC的使用量是每mg磁珠添加20-100μg EDC；
更优选地，所述EDC使用量为20μg EDC/mg磁珠；
优选地，所述步骤1）中EDC和sulfoNHS的摩尔比为1:0.5-2，具体地，包括EDC和sulfoNHS的摩尔比为1:0.5、1:1、1:2等；
更优选地，所述步骤1）中EDC和sulfoNHS的摩尔比为1:1-1:2；
最优选地，所述步骤1）中EDC和sulfoNHS的摩尔比为1:1；
优选地，所述步骤2）中交联液的pH值范围是7.4-9.5；具体地包括7.4、7.5、8、8.5、9、9.5；
优选地，所述步骤2）中交联液包括PBS pH7.4和NaHCO3 ph9.5；
更优选地，所述步骤2）中交联液是NaHCO3 ph9.5；
优选地，所述步骤2）中抗体浓度为0.05-0.5mg/ml；所述步骤2）中抗体浓度为0.2-0.4mg/ml；
更优选地，所述步骤2）中抗体浓度为0.2mg/ml；
优选地，所述乙二胺和脂肪醇聚氧乙烯醚各自独立地终浓度为1%；
优选地，所述步骤3）中清洗步骤进行一次或多次，更优选地，共清洗5次；
优选地，所述步骤4）中封闭的步骤是去上清后加入乙二胺和脂肪醇聚氧乙烯醚，使二者终浓度均为1%，放置于振荡器上以 2000rpm/min混合震荡，，在封闭条件室温下进行；
优选地，所述震荡进行2小时；
优选地，所述抗体包括特异性结合任意蛋白的抗体；
更优选地，所述抗体是靶向FGF21蛋白的抗体。
2.权利要求1所述偶联方法制备得到的免疫磁微球或其在检测FGF21中的应用。
3.包含权利要求3所述偶联方法制备得到的免疫磁微球的试剂盒或其在检测FGF21中的应用。
4.吖啶酯和抗体的交联方法，所述方法包括以下步骤：
1）交联：取吖啶酯和抗体加入到交联溶液中，交联溶液为NaHCO3 pH9.5，溶液中吖啶酯和抗体的摩尔比为20:1；
2）封闭：使用封闭液进行封闭，所述封闭液为9%甘氨酸、1% bsa、50mM tris、300mMNaCL，pH8.0；
优选地，所述吖啶酯包括Me-DMAE-NHS、NSP-DMAE-NHS、ME-AE-NHS、DMAE-NHS、NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS；
优选地，所述吖啶酯是NSP-DMAE-NHS；
优选地，所述抗体包括特异性结合任意蛋白的抗体；
更优选地，所述抗体是靶向FGF21蛋白的抗体。
5.权利要求4所述吖啶酯和抗体的交联方法所制备得到的吖啶和抗体的交联物或其在检测FGF21中的应用。
6.包含权利要求5所述吖啶和抗体的交联物的试剂盒或其在检测FGF21中的应用。
7.发光试剂的保存溶液或其在保存发光试剂中的应用，所述保存溶液包括缓冲液、还原剂和表面活性剂，所述缓冲液包括pbs pH 7.4、50mM mops pH 6.4或50mM mes pH 5.0中任意一种或多种；所述还原剂包括DTT、beta-ME或GSSG中任意一种或多种；所述表面活性剂包括tween20、tween80、tritonX-100或SDS/NP40中任意一种或多种；
优选地，所述缓冲液是MOPS pH6.4；
优选地，所述还原剂是Beta ME；
优选地，所述表面活性剂是Tween 20或Triton X 100；
优选地，所述还原剂是5mM的Beta ME；
优选地，所述表面活性剂是0.1% tween20或xx的0.1% tritonX-100；
优选地，所述发光试剂包括微球和抗体的偶联产物；
优选地，所述发光试剂包括吖啶酯和抗体的交联产物；
优选地，所述吖啶酯包括Me-DMAE-NHS、NSP-DMAE-NHS、ME-AE-NHS、DMAE-NHS、NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS；
最优选地，所述吖啶酯是NSP-DMAE-NHS；
优选地，所述抗体包括特异性结合任意蛋白的抗体；
优选地，所述微球包括磁性微球、乳胶微球、纳米微球、蛋白微球；
优选地，所述微球是磁性微球；
优选地，所述微球是表面覆盖COOH的磁性微球；
优选地，所述微球和抗体的偶联产物的保存浓度是10-100mg/L，最优选地，50mg/L；
优选地，所述吖啶酯和抗体的交联产物的保存浓度是0.1-0.5mg/L，最优选地，0.2mg/L；
优选地，所述发光试剂是权利要求1所述方法的制备产物和/或权利要求7所述方法的制备产物；
优选地，所述权利要求1所述方法的制备产物的保存浓度是10-100mg/L，最优选地，50mg/L；
优选地，所述权利要求7所述方法的制备产物的保存浓度是0.1-0.5mg/L，最优选地，0.2mg/L。
8.一种制备方法或所述制备方法的制备产物或所述制备产物在检测FGF21蛋白中的应用，所述方法包括以下步骤：
步骤1、权利要求1所述磁微球的偶联方法，和；
步骤2、权利要求4所述吖啶酯和抗体的交联方法。
9.包含权利要求8所述制备产物的试剂盒或其在检测FGF21中的应用；
优选地，所述试剂盒中还可以包含以下任意一种或多种产品：待检测抗原的标准品、免疫磁微球的保存溶液、样品收集和处理试剂、反应容器、磁分离设备和洗涤设备。
10.权利要求9所述制备产物的使用方法；
优选地，所述使用方法包括以下步骤：
1）加入权利要求1所述磁微球的偶联方法制备得到的免疫磁微球与样本混合、孵育；所述磁微球稀释在权利要求7所述保存溶液中使用；
2）清洗；
3）加入权利要求4所述吖啶酯和抗体的交联方法交联所得到的交联物混合、孵育；所述交联物在权利要求7所述保存溶液中使用；
4）去除磁珠，加入发光预激发液，振荡混匀，再加入100μl激发液，立即读取发光信号值；
优选地，所述孵育的步骤是37度孵育10分钟；
优选地，所述清洗的步骤是以下操作进行一次或多次：去除上清，加入500μl清洗液，振荡混匀；优选地，清洗三次；
优选地，所述磁微球稀释的稀释浓度是10-100mg/L，最优选地，50mg/L；
优选地，所述交联物的稀释浓度是0.1-0.5mg/L，最优选地，0.2mg/L。
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