CN113049811A

CN113049811A - 纳米磁珠包被物及其制备方法、检测试剂和检测试剂盒

Info

Publication number: CN113049811A
Application number: CN202110303552.XA
Authority: CN
Inventors: 陈永棠; 钱纯亘; 林标杨; 祝亮; 王刚
Original assignee: Shenzhen Yhlo Biotech Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Yhlo Biotech Co Ltd
Priority date: 2021-03-22
Filing date: 2021-03-22
Publication date: 2021-06-29
Also published as: WO2022198925A1

Abstract

本发明涉及一种纳米磁珠包被物及其制备方法、检测试剂和检测试剂盒。该纳米磁珠包被物的制备方法包括以下步骤：将抗体的铰链区的二硫键还原，制备具有巯基的抗体片段；及将具有巯基的抗体片段、双功能交联剂及纳米磁珠混合反应，制备纳米磁珠包被物。该纳米磁珠包被物用于免疫检测时，灵敏度高，特异性好。

Description

纳米磁珠包被物及其制备方法、检测试剂和检测试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，特别是涉及一种纳米磁珠包被物及其制备方法、检测试剂和检测试剂盒。

背景技术

免疫磁珠((Immunomagnetic bead，IMB，简称磁珠))具有核-壳结构，一般包括核心金属颗粒(Fe₂O₃、Fe₃O₄等)、包裹于核心金属颗粒上的高分子材料(例如聚苯乙烯、聚氯乙烯等)和最外层的功能配基(如-NH₂，-COOH、-OH、-CHO)。免疫磁珠粒径小，比表面积大，可捕获较多的待测物，并可以直接在其表面进行酶显色、荧光或同位素显示，因此，在免疫检测中应用越来越广泛。

在免疫检测中，将抗体包被到免疫磁珠的表面而形成的纳米磁珠包被物是免疫试剂的重要成分，其通过包被的抗体与待测样本中的抗原特异性结合，再与另一标记了吖啶酯、三联吡啶钌、金刚烷、鲁米诺、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等示踪物的抗体结合，形成免疫复合物而实现抗原检测。然而，在实践中发现，由抗体包被到免疫磁珠的表面而形成的纳米磁珠包被物在检测时，特异性和灵敏度还有待提高。

发明内容

基于此，有必要提供一种纳米磁珠包被物的制备方法，与传统的方法相比，由该制备方法制得的纳米磁珠包被物在检测时特异性更好和灵敏度更高。

此外，还有必要提供一种能提高检测的灵敏度和特异性的纳米磁珠包被物，以及一种灵敏度及特异性较高的检测试剂及检测试剂盒。

一种纳米磁珠包被物的制备方法，包括以下步骤：

将抗体的铰链区的二硫键还原，制备具有巯基的抗体片段；及

将所述具有巯基的抗体片段、双功能交联剂及纳米磁珠混合反应，制备纳米磁珠包被物。

与传统的将抗体上氨基与纳米磁珠形成共价键的连接不同，上述纳米磁珠包被物的制备方法是通过纳米磁珠与抗体片段的巯基之间形成除配位键外的其他共价键而形成纳米磁珠包被物，这使得抗体片段与纳米磁珠实现定向偶联，进而使得制得的纳米磁珠包被物中无Fc端朝外，这样可以提高制得的纳米磁珠包被物的有效抗体量，进而有利于提高检测时的灵敏度和特异性。

在其中一个实施例中，所述双功能交联剂选自马来酰亚胺类双功能交联剂、碘乙酸类双功能交联剂和乙酰化巯基类双功能交联剂中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述双功能交联剂包括马来酰亚胺类双功能交联剂；所述马来酰亚胺类双功能交联剂选自4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐及马来酰亚胺-(PEG)n-琥珀酰亚胺酯中的至少一种，其中，n为2～24之间的整数，或所述马来酰亚胺类双功能交联剂选自1-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐及N-ε-马来酰亚胺己酸酰肼中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述双功能交联剂包括碘乙酸类双功能交联剂；所述碘乙酸类双功能交联剂选自碘乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯及琥珀酰亚胺酯(4-碘乙酸)氨基苯甲酸酯中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述双功能交联剂包括乙酰化巯基类双功能交联剂；所述乙酰化巯基类双功能交联剂选自N-丁二酸S-乙酰乙酸酯和N-丁二酸-(PEG)m-S-乙酰乙酸酯中的至少一种，其中，m为2～24之间的整数。

在其中一个实施例中，用于还原所述抗体的铰链区的二硫键的还原剂为巯基乙胺，所述抗体与所述还原剂的质量之比为1：(1～50)。

在其中一个实施例中，所述具有巯基的抗体片段与所述双功能交联剂和所述纳米磁珠的质量比为1：(0.5～10)：(5～100)。

在其中一个实施例中，在所述将抗体的铰链区的二硫键还原的步骤之后，还包括对还原的产物进行除杂的步骤。

在其中一个实施例中，所述抗体片段为单克隆抗体的抗体片段。

在其中一个实施例中，所述抗体为CHI3L1抗体。

一种纳米磁珠包被物，由上述纳米磁珠包被物的制备方法制得。

一种检测试剂，包括上述纳米磁珠包被物。

一种检测试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂含有能与抗原特异性结合的经标记物标记的抗体，所述第二试剂含有上述纳米磁珠包被物，所述纳米磁珠包被物也能与所述抗原特异性结合，且所述纳米磁珠包被物与所述抗原结合的位点，与所述经标记物标记的抗体与所述抗原结合的位点不同。

附图说明

图1为实施例1中制备半抗体片段的反应示意图；

图2为实施例1中制备纳米磁珠包被物的流程图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

术语解释

抗体：抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。典型的抗体分子具有4条多肽链的对称结构，包括2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。轻链有κ和λ两种，重链有μ、δ、γ、ε和α五种。整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。可变区位于“Y”的两臂末端。在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区。高变区位于分子表面，最多由17个氨基酸残基构成，少则只有2～3个。高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原的特异性。一个抗体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位于两臂末端，称抗原结合片段(antigen-binding fragment，Fab片段)。“Y”的柄部称为结晶片段(crystallinefragment，Fc片段)，糖结合在Fc片段上。从结构上来说，在本文中，除非特别说明，提及抗体时均指全抗体，即包括4条链和Fc段的抗体结构。此外，从功能上来说，本发明中的“抗体”是指对靶抗原特异的抗体，即与抗原具有特异结合能力的抗体。

抗体片段包括半抗体片段和Fab’片段。半抗体片段：通过二硫键还原剂将全抗体拆分成各自带有巯基的对称的片段，每个半抗体片段包含一条完整的轻链和一条完整重链以及Fc片段。Fab’片段：是带巯基的单价抗原结合片段，每个Fab’片段是在半抗体片段的基础上省略了Fc片段。

抗原：是一类能诱导免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答的产物(抗体或效应细胞)发生特异性结合的物质。

在免疫检测技术领域中，一般是通过筛选与抗原亲和力强、特异性好的抗体来制备纳米磁珠包被物而提高检测的灵敏度和特异性。然而，在本申请的研究过程中发现，在传统的将抗体偶联到免疫磁珠的表面而制备纳米磁珠包被物的方法中，一般选择抗体的伯氨作为偶联靶点，然而，免疫磁珠与抗体具体偶联的位置是随机的，一部分免疫磁珠偶联的是抗体的Fc端的氨基，而另一部分免疫磁珠偶联的是Fab端的氨基。并且，在免疫磁珠偶联抗体的Fab端时，抗体的Fc端则位于免疫磁珠的外侧，抗原结合位点不容易暴露，从而使得实际与抗原发生免疫反应的有效抗体量减少，进而使得应用到检测时的特异性和灵敏度较低。

因此，本发明一实施方式提供了一种纳米磁珠包被物的制备方法，该制备方法通过抗体片段的巯基与纳米磁珠反应而形成除配位键以外的共价键而使得抗体片段定向偶联到纳米磁珠上，使得Fab端充分暴露，保证了有效抗体量，进而使得在使用该纳米磁珠包被物进行免疫检测时，特异性好、灵敏度高。具体地，该制备方法包括以下步骤a～步骤b：

步骤a：将抗体的铰链区的二硫键还原，制备具有巯基的抗体片段。

与抗体的抗原结合区的重链与轻链之间的二硫键相比，抗体的铰链区的重链之间的二硫键更容易被还原。因此，可以将抗体的铰链区的二硫键还原二形成半抗体片段。可选地，将抗体的铰链区的二硫键全部还原，制备具有巯基的抗体片段。

壳多糖3样蛋白1(chitinase 3-like 1，CHI3L1)又称人软骨糖蛋白39(humanchondrocyte protein，YKL-30)，是几丁质酶家族的一员，在多重恶性肿瘤中表达水平升高，包括胃癌、肝癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞皮肤癌等。CHI3L1可通过促进肿瘤血管生成、增加黏附促进肿瘤侵袭和转移、激活转化生长因子-β/丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶等信号通路在肿瘤的发生发展过程中起调节作用。同时，血清壳多糖3样蛋白1参与急慢性炎症及细胞外基质重构等病理过程，在临床上具有广泛的应用前景，在肝脏疾病中的鉴别越来越引起研究人员的重视，具有重要的检测意义。

因此，在其中一个实施例中，抗体片段来自CHI3L1抗体。可以理解的是，在其他实施方式中，抗体片段还可以来自其他抗体，例如降钙素原抗体，心肌肌钙蛋白I抗体等。

可选地，用于还原抗体的铰链区的二硫键的还原剂为巯基乙胺(2-MEA)，抗体与还原剂的质量之比为1：(1～50)。进一步地，抗体与还原剂的质量之比为1：(1～10)。可以理解的是，在其他实施方式中，还原剂还可以是它二硫键还原剂，例如2-巯基乙醇、二硫苏糖醇等。

在本实施方式中，抗体片段为半抗体片段，因此，将抗体铰链区的二硫键全部还原即可。当然，在其他实施方式中，抗体片段也可以为Fab’片段。此时，则需要将Fc片段从抗体或抗体片段上剥离的对应步骤。例如在利用还原剂还原二硫键之前，采用蛋白酶对抗体进行酶解，切除Fc片段。可以理解的是，在另一个实施方式中，抗体铰链区的二硫键还可以部分还原，此时，双功能交联剂与被还原的二硫键形成共价键。

当然，在还原抗体的铰链区的二硫键的还原剂与抗体混合反应的步骤之后，还包括对反应产物进行脱盐或超滤以除杂的步骤，从而制得纯度高的半抗体片段。

步骤b：将具有巯基的抗体片段、双功能交联剂及纳米磁珠混合反应，制备纳米磁珠包被物。

具体地，纳米磁珠为氨基纳米磁珠或羧基纳米磁珠。

双功能交联剂既具有能与纳米磁珠上的基团反应形成除配位键外的共价键的基团，也具有能与抗体片段的基团反应形成除配位键外的共价键的基团。可选地，双功能交联剂选自马来酰亚胺类双功能交联剂、碘乙酸类双功能交联剂和乙酰化巯基类双功能交联剂中的至少一种。

在其中一个实施例中，双功能交联剂包括马来酰亚胺类双功能交联剂。例如，纳米磁珠为氨基磁珠，马来酰亚胺类双功能交联剂选自4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(简称SMCC)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(简称Sulfo-SMCC)及马来酰亚胺-(PEG)n-琥珀酰亚胺酯中的至少一种，其中，n为2～24之间的整数。进一步地，n为2～12之间的整数。又例如，在其中一个实施例中，纳米磁珠为羧基磁珠，马来酰亚胺类双功能交联剂选自1-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐及N-ε-马来酰亚胺己酸酰肼中的至少一种。

在其中一个实施例中，双功能交联剂包括碘乙酸类双功能交联剂。可选地，碘乙酸类双功能交联剂选自碘乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(简称SIAB)及琥珀酰亚胺酯(4-碘乙酸)氨基苯甲酸酯(简称Sulfo-SIAB)中的至少一种。

在其中一个实施例中，双功能交联剂包括乙酰化巯基类双功能交联剂。可选地，乙酰化巯基类双功能交联剂选自N-丁二酸S-乙酰乙酸酯和N-丁二酸-(PEG)m-S-乙酰乙酸酯中的至少一种，其中，m为2～24之间的整数。

可以理解的是，在其他实施方式中，双功能交联剂不限于上述，还可以是其他能够同时以形成共价键的形式连接纳米磁珠的基团和抗体片段的巯基的物质。

可选地，具有巯基的抗体片段与双功能交联剂和纳米磁珠的质量比为1：(0.5～10)：(5～100)。进一步地，具有巯基的抗体片段与双功能交联剂和纳米磁珠的质量比为1：(1～5)：(10～50)。

可选地，将纳米磁珠与双功能交联剂混合之后，加入具有巯基的抗体片段。

当然，在混合反应结束后，还包括纯化除杂的步骤。

上述纳米磁珠包被物的制备方法简捷易行，利于工业化生产。另外，采用上述纳米磁珠包被物的制备方法制得的纳米磁珠包被物是通过抗体片段的巯基与纳米磁珠反应而形成除配位键以外的共价键而使得抗体片段定向偶联到纳米磁珠上，保证了有效抗体量，进而使得在使用该纳米磁珠包被物进行免疫检测时，检测特异性好、灵敏度高。

此外，本发明一实施方式还提供了一种纳米磁珠包被物，该纳米磁珠包被物由上述纳米磁珠包被物的制备方法制得，该纳米磁珠包被物包括纳米磁珠和抗体片段，抗体片段为半抗体片段或Fab’片段，且纳米磁珠与抗体片段的巯基通过形成除配位键以外的共价键而连接。使用该纳米磁珠包被物进行免疫检测时，检测特异性好、灵敏度高。

此外，本发明一实施方式还提供了一种检测试剂，上述纳米磁珠包被物。

具体地，上述检测试剂还包括缓冲液。可选地，缓冲液选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液中的至少一种。

上述检测试剂包括上述纳米磁珠包被物，具有较高的灵敏度和特异性。

此外，本发明一实施方式还提供一种检测试剂盒，该检测试剂盒包括第一试剂和第二试剂，第一试剂含有能与抗原特异性结合的经标记物标记的抗体，第二试剂含有上述纳米磁珠包被物，该纳米磁珠包被物也能与抗原特异性结合，且该纳米磁珠包被物与该抗原结合的位点，与经标记物标记的抗体与该抗原结合的位点不同。也即是，该检测试剂盒采用的是双抗夹心法的原理进行抗原的检测。

可选地，在第一试剂中，标记物选自吖啶酯、三联吡啶钌、金刚烷、鲁米诺、鲁米诺的衍生物、异鲁米诺、异鲁米诺的衍生物、辣根过氧化物酶及碱性磷酸酶中的一种。可以理解的是，在其他实施例中，标记物不限于上述，还可以是其他可以用于免疫检测中的物质。

上述检测试剂盒包含上述纳米磁珠包被物，用于检测抗原时，具有较高的灵敏度和特异性。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。下文中的CHI3L1抗体购于杭州普望生物技术有限公司。本文中用于表示浓度的“M”为“mol/L”的简写，“mM”为“mmol/L”的简写。

实施例1

本实施例的纳米磁珠包被物是通过采用马来酰亚胺-(PEG)_4-琥珀酰亚胺酯活化纳米磁珠后与半抗体片段反应而成。具体地，请参阅图1和图2，本实施例的纳米磁珠包被物的制备包括但不限于如下步骤：

(1)将CHI3L1抗体用0.02M PBS缓冲液稀释至0.2mg/mL，制得抗体溶液。

(2)在步骤(1)的抗体溶液中加入巯基乙胺(2-MEA)，使其终浓度为10mM，温和混匀后，在室温(25℃)条件下反应60min。采用PBS平衡脱盐柱，并对反应结束后的产物脱盐除杂，制得纯化后的半抗体片段溶液。

(3)取氨基纳米磁微粒10mg，并用0.02M PBS清洗后，重悬，制备浓度为10mg/mL的纳米磁珠溶液。然后，按照纳米磁珠与马来酰亚胺-(PEG)₄-琥珀酰亚胺酯的质量比为1：0.05的比例，向纳米磁珠溶液中加入马来酰亚胺-(PEG)₄-琥珀酰亚胺酯，室温(25℃)反应30min，然后磁分离，弃上清，制得活化后的纳米磁珠。

(4)将步骤(3)制得的活化后的纳米磁珠用PBS清洗后，与步骤(2)制得的纯化后的半抗体片段溶液混匀，使得抗体片段与纳米磁珠的质量比为1：50，室温(25℃)反应3h。

(5)在步骤(4)的反应结束后，用含0.1％(m/v)BSA和1mM NEM(N-乙基马来酰亚胺，NEM为具有马来酰亚胺的单功能交联剂，其作用是淬灭抗体片段上反应残余的少量巯基，反应后无需去除)的PBS溶液清洗磁珠1次，并在室温(25℃)下混匀反应3h。

(6)在步骤(5)反应结束后，用含0.1％(m/v)BSA的PBS溶液置换磁珠，并重悬浓度为10mg/mL，4℃保存。

实施例2

本实施例的纳米磁珠包被物是通过碳二亚胺和1-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐活化纳米磁珠后与半抗体片段反应而成。具体地，本实施例的纳米磁珠包被物的制备包括但不限于如下步骤：

(2)在步骤(1)的抗体溶液中加入巯基乙胺(2-MEA)，使其终浓度为10mM，混匀后，在室温(25℃)条件下反应60min。采用PBS平衡脱盐柱，并对反应结束后的产物脱盐除杂，制得纯化后的半抗体片段溶液。

(3)取羧基纳米磁微粒10mg，并用0.02M MES缓冲液清洗后，重悬，制备浓度为10mg/mL的纳米磁珠溶液。然后，按照纳米磁珠、碳二亚胺及1-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐的质量比为1：0.05：0.05的比例，向纳米磁珠溶液中加入碳二亚胺及1-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐，室温(25℃)反应30min，然后磁分离，弃上清，制得活化后的纳米磁珠。

(5)在步骤(4)的反应结束后，用含0.1％(m/v)BSA和1mM NEM的PBS溶液清洗磁珠1次，并在室温(25℃)下混匀反应3h。

对比例1

本对比例的纳米磁珠包被物是通过碳二亚胺将直接CHI3L1抗体连接到纳米磁珠的表面而形成的复合物。

本对比例的纳米磁珠包被物的制备包括但不限于如下步骤：

(1)取羧基纳米磁微粒10mg，并用0.02M MES缓冲液清洗后，重悬，制备浓度为10mg/mL的纳米磁珠溶液。然后，按照纳米磁珠与碳二亚胺的质量比为1：0.05的比例，向纳米磁珠溶液中加入碳二亚胺，并在室温(25℃)反应30min，然后磁分离，弃上清，随后加入MES缓冲液清洗后重悬，制得浓度为10mg/mL的活化后的纳米磁珠溶液。

(2)在步骤(1)制得的活化后的纳米磁珠溶液中加入0.2mg CHI3L1抗体，并混匀，室温(25℃)反应3h。

(3)在步骤(2)的反应结束后，用含0.1％(m/v)BSA的PBS溶液清洗磁珠，并用含0.1％(m/v)BSA的PBS溶液重悬至浓度为10mg/mL，4℃保存。

测试

(1)将各实施例和对比例1得到的纳米磁珠包被物均稀释至0.15mg/mL，然后测试各实施例和对比例1的纳米磁珠包被物用于检测CHI3L1时的灵敏度和准确度，其中：灵敏度用检测信号值表征，在相同样本浓度下，信号值越高，说明灵敏度越高；特异性以检测已经被定性的样本(含CHI3L1的样本或不含CHI3L1的样本)的正确率来表征，正确率越高，说明准确度越高，特异性越好。结果如表1和表2所示。

表1

项目	实施例1	实施例2	对比例1
				特异性	98.2％	95.4％	94.2％

表2

由表1和表2可以看出，实施例1和实施例2的灵敏度及特异性明显好于对比例1，说明采用二硫键还原剂将抗体铰链区的二硫键还原制得抗体片段与纳米磁珠连接后形成的纳米磁珠包被物，比将抗体直接与纳米磁珠连接形成的磁珠包被物具有更高的灵敏度和更好的特异性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种纳米磁珠包被物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的纳米磁珠包被物的制备方法，其特征在于，所述双功能交联剂选自马来酰亚胺类双功能交联剂、碘乙酸类双功能交联剂和乙酰化巯基类双功能交联剂中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的纳米磁珠包被物的制备方法，其特征在于，所述双功能交联剂包括马来酰亚胺类双功能交联剂；所述马来酰亚胺类双功能交联剂选自4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐及马来酰亚胺-(PEG)n-琥珀酰亚胺酯中的至少一种，其中，n为2～24之间的整数，或所述马来酰亚胺类双功能交联剂选自1-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐及N-ε-马来酰亚胺己酸酰肼中的至少一种；

及/或，所述双功能交联剂包括碘乙酸类双功能交联剂；所述碘乙酸类双功能交联剂选自碘乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯及琥珀酰亚胺酯(4-碘乙酸)氨基苯甲酸酯中的至少一种；

及/或，所述双功能交联剂包括乙酰化巯基类双功能交联剂；所述乙酰化巯基类双功能交联剂选自N-丁二酸S-乙酰乙酸酯和N-丁二酸-(PEG)m-S-乙酰乙酸酯中的至少一种，其中，m为2～24之间的整数。

4.根据权利要求1所述的纳米磁珠包被物的制备方法，其特征在于，用于还原所述抗体的铰链区的二硫键的还原剂为巯基乙胺，所述抗体与所述还原剂的质量之比为1：(1～50)；

及/或，所述具有巯基的抗体片段与所述双功能交联剂和所述纳米磁珠的质量比为1：(0.5～10)：(5～100)。

5.根据权利要求1所述的纳米磁珠包被物的制备方法，其特征在于，在所述将抗体的铰链区的二硫键还原的步骤之后，还包括对还原的产物进行除杂的步骤。

6.根据权利要求1所述的纳米磁珠包被物的制备方法，其特征在于，所述抗体片段为单克隆抗体的抗体片段。

7.根据权利要求1～6任一项所述的纳米磁珠包被物的制备方法，其特征在于，所述抗体为CHI3L1抗体。

8.一种纳米磁珠包被物，其特征在于，由权利要求1～7任一项所述的纳米磁珠包被物的制备方法制得。

9.一种检测试剂，其特征在于，包括权利要求8所述的纳米磁珠包被物。

10.一种检测试剂盒，其特征在于，包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂含有能与抗原特异性结合的经标记物标记的抗体，所述第二试剂含有权利要求8所述的纳米磁珠包被物，所述纳米磁珠包被物也能与所述抗原特异性结合，且所述纳米磁珠包被物与所述抗原结合的位点，与所述经标记物标记的抗体与所述抗原结合的位点不同。