JPH0344399A - イオン捕捉試薬およびそれを用いた結合イムノアッセイ法 - Google Patents
イオン捕捉試薬およびそれを用いた結合イムノアッセイ法Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
。さらに詳しくは、本発明は、均一イムノアッセイを行
うのに有用な方法および生成物に関する。
学的流体または他の物質中に存在するかもしれない興味
あるもしくは臨床的に重要な物質の存在および/または
濃度を決定するためのアッセイにおいて、種々の分析手
順および装置が一般に用いられている。そのような物質
は、一般に「分析対象物」と呼ばれ、抗体、抗原、薬物
、ホルモン等が含まれる。
利用するものであって、その機構において、生体にとっ
て病原性であるかまたは異物である抗原の存在に応答し
て抗体が産生される。これらの抗体および抗原、すなわ
ち免疫反応生成物は相互に結合することができ、それに
より高度に特異的な反応機構が生成される。この機構は
、生物学的試料中の特定の抗原の存在または濃度を決定
するためにインビトロで用いることができる。
られており、その場合、少なくとも1つの免疫反応生成
物を検出可能な成分で標識して分析的に同定できるよう
にする。たとえば、「サンドイッチ」法または「2部位
」法では、抗原と2つの抗体との間に3成分系の複合体
を生成させることが含まれる。そのような技術において
複合体生成を検出するのに便利な方法は、複合体を容易
に分離できるように、1つの標識抗体と、固相支持体に
結合させた非標識抗体とを用いることである。
験試料中の分析対象物の量に正比例する。
。競合アッセイの1つの例においては、捕捉機構におい
て不溶性の固相に付着した抗体を用いるが、標識分析対
象物(標識抗体ではなく)は固定化抗体への結合につい
て試験試料中に存在する分析対象物と競合する。同様に
、固定化した分析対象物も標識抗体への結合について分
析対象物と競合することができる。これらの競合アッセ
イにおいては、捕捉された標識試薬の量は試料中に存在
する分析対象物の量に反比例する。
ず欠点を有する。第一に、可溶性および不溶性の試薬、
および液体試験試料からなる不均一反応混合物は、反応
速度を遅くする。すべての試薬が可溶性である液相反応
、すなわち均一な反応d合物に比べて、不均一な反応混
合物は、反応混合物中において不溶性の固相系、試験試
料中の遊離の分析対象物、可溶性の標識試薬および新た
に生成した不溶性の複合体の間で平衡に達するまで長い
インキュベート期間を要する。第二に、抗体の固相への
吸着のような、固相物質へ結合成分を付着させる従来法
では、固相が分析対象物以外の物質を容易に結合させて
しまう。これは非特異的結合と呼ばれており、陽性結果
の検出を妨害し得る。第三に、従来の固定化法では、製
造した固相試薬の別々のバッチが、変化した量の固定化
結合成分を含有し得る。
Ho、Na’、K1、Li”、アミン塩およびそれらの
誘導体よりなる群から選ばれた基、Xは特異的結合成分
への結合を可能にする反応性基または該反応性基を有す
る構造である)で示される化合物からなることを特徴と
する活性化ポリマー性アニオン分子; (a)特異的結合成分と、 (b)式: (式中、nは約10〜約500.2は約1〜約6、Wは
Ho、Na”、Ko、Li”、アミン塩およびそれらの
誘導体よりなる群から選ばれた基、Xは約1〜約30原
子数のスペーサー、およびアミン反応性残基、チオール
反応性残基、チオール残基およびチオール前駆体残基よ
りなる群から選ばれた反応性基からなる、反応性基を有
する構造である)で示される活性化ポリマー性アニオン
分子との反応生成物からなることを特徴とする、負に荷
電した捕捉試薬; (a)アミン反応性基を有する特異的結合成分と、(b
)式: (式中、nは約10〜約500、Zは約1〜約6、Wは
Ho、Na’、Ko、Li”、アミン塩およびそれらの
誘導体よりなる群から選ばれた基、XはHである)で示
されるポリマー性アニオン分子との反応生成物からなる
ことを特徴とする、負に荷電した捕捉試薬; 試験試料中の分析対象物の検出方法であって、(a)分
析対象物を、 第一の荷電物質に結合したハプテンからなる捕捉試薬、
および 検出可能なシグナルを生成し得る標識に結合した特異的
結合成分からなる指示試薬 と接触させて反応混合物を生成させ、 その際、該捕捉試薬は、分析対象物、補助特異的結合成
分、該指示試薬およびそれらの複合体よりなる群から選
ばれたものと結合することができ、該指示試薬は、分析
対象物、補助特異的結合成分、該捕捉試薬およびそれら
の複合体よりなる群から選ばれたものと結合することが
でき、 (b)該反応混合物を、該第一の荷電物質に関して反対
に荷電した固相と接触させることにより該固相を該第一
の荷電物質に誘引付着させて該捕捉試薬およびその複合
体を該反応混合物から分離させ、ついで (c)該固相または該反応混合物に結合した標識を検出
して試料中の分析対象物の存在または量を決定する、こ
とを特徴とする方法:および試験試料中の分析対象物の
検出方法であって、(a)分析対象物を、 第一の荷電物質に結合した特異的結合成分からなる捕捉
試薬、わよび 検出可能なシグナルを生成し得る標識に結合したハプテ
ンからなる指示試薬 と接触させて反応混合物を生成させ、 その際、該捕捉試薬は、分析対象物、補助特異的結合成
分、該指示試薬およびそれらの?!会合体りなる群から
選ばれたものと結合することができ、該指示試薬は、分
析対象物、補助特異的結合成分、該捕捉試薬およびそれ
らの複合体よりなる群から選ばれたものと結合すること
ができ、 (b)該反応混合物を、該第一の荷1i物質に関して反
対に荷電した固相と接触させることにより該固相を該第
一の荷電物質に誘引付着させて該捕捉試薬およびその複
合体を該反応混合物から分離させ、ついで (c)該固相または該反応混合物に結合した標識を検出
して試料中の分析対象物の存在または量を決定する、こ
とを特徴とする方法を提供するものである。
象物および/または指示試薬を分離することにより、検
出可能なシグナルの観察を容易にするための捕捉試薬を
提供するものである。本発明の捕捉試薬は、特異的結合
成分に付着したlまたは2以上のアニオン分子からなる
。本発明はまた、活性化ポリマー性アニオン分子、該ポ
リマー性アニオン分子上の末端アミノ基を修飾する方法
、および試験試料中の分析対象物を検出する方法をも提
供するものである。容易に適合されるアニオン分子は、
式: (式中、nは約10〜約500.zは約1〜約6、Wは
H″′、Na”、Ko、Li0、H”NR,のようなア
ミン塩およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれた基
、Xは特異的結合成分が反応する、アミン反応性残基、
チオール反応性残基またはチオール残基である)で示さ
れる活性化ポリマー性アニオン分子である。別の態様に
おいては、Xは、ポリマー性アニオン分子と結合すべく
活性化された特異的結合成分であってよい。活性化法は
また、1または2以上の反応性基が特異的結合成分また
はポリマー性アニオン上に生成されるとして記載される
。
子であってよい。荷電した捕捉試薬により均一アッセイ
および分離反応が可能になり、その場合、反応混合物か
らの反応複合体の除去は、反対に荷電した固相に反応混
合物を接触させることにより行うことができる。本発明
の捕捉試薬は、実質的にあらゆる結合アッセイ(サンド
イツチア・νセイ、競合アッセイ、補助特異的結合成分
を用いた間接アッセイ、抑制アッセイなど)に用いるこ
とができる。
ものである。すなわち、(a)結合反応に酸相動力学を
用いることにより、分析対象物およびアッセイ試薬の均
一な混合物からの複合体の生成を容易にし、(b)それ
により、固相支持体上に固定化することのできる複合体
の潜在数を増加させる。
順においても用いることができる。分析対象物を含有し
ていると思われる分離すべき液体試料を、溶液中の捕捉
試薬と混合して荷電複合体を生成させる。結合反応の後
、反対に荷電した固相に溶液を接触させ、新たに生成し
た複合体を液体試料から分離させる。
収、吸着または共有結合以外の結合法により結合成分を
固相に固定化するための効率のよい方法をも提供する。
イに用いることができる。しかしながら、本発明は、免
疫反応性のアッセイに限られるものではない。分析対象
物とアッセイ試薬との間の特異的結合反応を利用したア
ッセイを行うこともできる。
ア、すなわち2つの異なる分子であって、その一方が第
二の分子に化学的または物理的手段により特異的に結合
するものの一方をいう。抗原および抗体−特異的結合ベ
アに加えて、他の特異的結合ベアには、ピオチンとアビ
ジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列(
標的核酸配列を検出するためにDNAハイブリダイゼー
シ1ンアノセイに用いられるプローブと捕捉核酸配列を
含む)、相捕的ペプチド配列(組換え注により生成され
るものを含む)、エフェクター分子とレセプター分子、
ホルモンとホルモン結合タンパク質、酵素補助因子と酵
素、酵素阻害剤と酵素などが含まれる。さらに、特異的
結合ペアには、もともとの特異的結合成分の類似体成分
も含まれる。たεえば、分析対象物の誘導体または断片
、すなわち分析対象物類似体も、それが分析対象物と共
通するエピトープを少なくとも1つ有している限り用い
ることができる。免疫特異的結合成分には、抗原、ハプ
テン、抗体、および組換えDNA法またはペプチド合成
により生成されたものを含むそれら!17)1合体が含
まれる。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリク
ローナル抗体であってもよく、組換えタンパク質または
その混合物または断片であってもよく、また他の特異的
結合成分との混合物であってもよい。そのような抗体の
調製法の詳細およびそれが特異的結合成分として使用す
るのに適していることについては、当業者にはよく知ら
れている。
はできるが、キャリヤタンパク質に結合しなければ抗体
生成を引き起こすことのできない部分抗原または非タン
パク質結合成分をいう。
肢体の試料をいう。試験試料は、生理学的流体、たとえ
ば血液、唾液、眼の水晶体液、脳を髄演、汗、尿、乳、
腹水、粘液、滑液、腹膜?夜、羊水などの所望の源に由
来するものであってよい。
製したり粘液流体を希釈したりなどのように前取て処理
することができる。処理方法にはまた、分離、濾過、蒸
留、濃縮、妨害成分の不活化、および試薬の添加などが
含まれる。生理学的流体の他に、水、食品などの池の液
体試料を用いることもできる。加えて、固体も液体媒質
を形成するように修飾することができるなら使用するこ
とができる。
験試料中で検出し、または試験試料から分離すべき物質
をいう。分析対象物は、特異的結合成分が天然に存在す
る、または特異的結合成分を調製することのできるいか
なる物質であってもよい。加えて、分析対象物は、1以
上の特異的結合成分に結合していてもよい。「分析対象
物」にはまた、あらゆる抗原性物質、ハプテン、抗体、
およびそれらの結合が含まれる。分析対象物には、タン
パク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、
ビタミン、治療目的で投与されるものおよび不法な目的
で投与されるものを含む薬剤、細菌、ウィルス、および
これら物質のいずれかの代謝産物またはこれら物質のい
ずれかに対する抗体が含まれる。
物それ自身に比べて多かれ少なかれ、分析対象物特異的
結合成分と交差反応する物質をいう。
部位を少なくとも1つ有する限り、修飾された分析対象
物であっても分析対象物分子の断片またはその合成部分
であってもよい。
し、視覚または機器により検出し得る/グナルを生成す
ることのできるあらゆる物質をいう。
は、色原体:触媒;蛍光化合物;化学発光化合物;放射
性標識;コロイド金属および非金属粒子、染料粒子、酵
素もしくは基質、または有機、ポリマーラテックス粒子
を含む直接視覚標識;シグナル生成物質を含有するリポ
ソームまたは他の小胞などが含まれる。
国特許第4,275,149号明細書カラム19〜23
に記載されている。本発明に有用な酵素/基質シグナル
生成システムの一例を挙げると、酵素のアルカリホスフ
ァターゼと基質のニトロブルーテトラゾリウム−5−ブ
ロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェートまたは
その誘導体もしくは類似物がある。
物であってよく、検出可能なシグナルを生じさせるのに
標識の酵素的手順を必要としない。
誘導体および類似物が、本発明の反応に標識として使用
するのに適している。
て視覚検出可能な発色粒子を用いることができ、そうす
ることによりシグナル生成試薬をさらに用いることなく
試料中の分析対象物の存在または濃度を直接色で読み取
ることができる。発色粒子として使用する物質は、米国
特許第4,313.734号明細書および同第4,37
3,932号明細書に開示されているように、金などの
コロイド金属、および染料粒子である。コロイド状セレ
ン粒子などの非金属コロイドの調製および使用は、19
87年7月9日に出願した米国特許出願第072,08
4号明細書に開示されている。
は、1987年7月13日に出願した米国特許出願第0
72,459号明細書に開示されている。標識として使
用するための有機ポリマーラテックス粒子は、1988
年9月23日に出願した米国特許出願第248,858
号明細書に開示されている。
セイ試薬または分析対象物と反応して分析対象物の存在
を示し視覚または機器により検出可能な反応生成物また
はシグナルを生じることのできるあらゆる物質をいう。
の反応生成物またはシグナルを生成させるのに必要な一
群のアッセイ試薬をいう。たとえば、標識と反応させて
検出可能なシグナルを生じさせるために1または2以上
のシグナル生成成分を用いることができる。
以上の基質または他の酵素と反応させて検出可能な反応
生成物を得ることにより検出可能なシグナルが増幅され
る。
付着した標識をいう。指示試薬は、試験試料中の分析対
象物の量と相対的なレベルで検出可能なシグナルを生成
する。一般に、指示試薬は固相物質上に捕捉された後に
検出または測定されるが、未結合指示試薬を測定してア
ッセイの結果を決定することもできる。
おける分析対象物、競合アッセイにおける捕捉試薬、ま
たは間接アッセイにおける補助特異的結合成分に結合す
ることができる。標識は、上述したように、試験試料中
の分析対象物の量と相対する検出可能なシグナルを指示
試薬が生成できるようにする。指示試薬の特異的結合成
分は、分析対象物、補助特異的結合成分、または捕捉試
薬に標識が間接的に結合できるようにする。特定の標識
を選択fることは重要ではないが、標識は、発色有機ポ
リマーラテックス粒子により生成される検出可能なシグ
ナルのようにそれ自身で検出可能なシグナルを生成する
か、または酵素/基質シグナル生成システムのように1
もしくは2以上のシグナル生成成分と組み合わせて検出
可能なシグナルを生成する。標識かまたは特異的結合成
分のいずれかを変えることにより種々の異なる指示試薬
を調製することができる。この選択には検出しようとす
る分析対象物および所望の検出手段を考慮することが含
まれることは、当業者には理解されるであろう。
た非標識の特異的結合成分をいう。成分の付着は本質的
に不可逆的であり、これには共有結合が含まれる。捕捉
試薬は、池のアッセイ試薬および残る試験試料から分析
対象物および/または指示試薬を実質的に分離すること
により、検出可能なシグナルの観察を容易にするために
用いられる。特異的結合成分は、荷電物質への付着が結
合成分の結合部位を妨害しない限り、ハプテンや小さな
ペプチドのような小さな分子であってよい。
おける分析対象物、競合アッセイにおける指示試薬もし
くは分析対象物、または間接アッセイにおける補助特異
的結合成分(それ自身、分析対象物に対し特異的である
)に対して特異的である。荷電物質には、アニオン性お
よびカチオン性のモノマーおよびポリマーが含まれる。
(PGA)、アルブミンのようなアニオン性タンパク質
または誘導体化タンパク質、ヘパリンもしくはアルギン
酸のような多糖類、ポリアスパラギン酸、ポリアクリル
酸、および適当なpH(たとえば4〜10の範囲のpH
)で正味の負の荷電を有するポリアミノ酸が含まれる。
ーまたはポリマーと結合させて、捕捉試薬に付随する正
味の荷電を増加させることができる。
、一般式: (式中、nは約10〜約500.zは約1〜約6、Wは
H゛、Na’、K゛、Li゛、H″NR3のようなアミ
ン塩およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれた基、
Xは特異的結合成分とポリマーとの化学結合を可能とす
る反応性基を有する実質的にあらゆる反応性基または残
基である)で示される1または2以上の活性化ポリマー
性アニオン分子またはその塩基結合体に特異的結合成分
を結合させることにより調製することができる。上記式
において、Xはアミン反応性基もしくは残基、チオール
反応性基もしくは残基、または式ニーA−3H(式中、
Aはスペーサーアームである)で示されるチオール基も
しくは残基であってよい。たとえば、アミノ基を有する
特異的結合成分は、アミン反応性残基を有する活性化P
GAアニオン分子と結合させることができる。アミン反
応性残基は、活性化ポリマーを特異的結合成分上のアミ
ノ基に結合させることができ、その例としては、以下の
式:(式中、mは2または3、R′は硫黄安定化基、R
”は脂肪族基またはアリール基である)で示される残基
が挙げられるが、これらに限られるものではない。硫黄
安定化基としては、2−ピリジル基、4−ピリジル基お
よび5−ニトロ−2−ピリジル基が挙げられるが、これ
らに限られるものではない。上記式において「A」は約
1〜約30原子のスペーサーを表し、これにはポリエー
テル、ポリメチレンおよびポリアミドのような炭素、窒
素、硫黄および酸素原子鎖およびその組合わせ、並びに
フェニルチオカルバミルのような芳香族スペーサーが含
まれるが、これらに限られるものではない。
を、チオール反応性残基を有する活性化ポリマーに結合
させることができる。チオール反応性残基には、式: (式中、Aは上記約1〜約30原子のスペーサーである
)で示される残基が含まれるが、これらに限られるもの
ではない。ざらの他の態様において、チオール反応性基
を有する特異的結合成分を、式−A−SHで示されるよ
うなチオール残基を有する活性化ポリマーに結合させる
ことができる。
例において、所望の特異的結合成分を末端アミノ基が修
飾された活性化PGA分子と反応させることによって生
成させた。簡単に説明すると、修飾方法は、(1)PG
Aを溶媒(たとえば、ジオキサン、ジメチルホルムアミ
ド、■−メチルー2−ピロリドンおよびジメチルスルホ
キシドのような水屁和性の非プロトン溶媒)中に溶解し
、(2)滴定し得るカルボン酸当たり約1当量の量のプ
ロトン吸収試薬(たとえば、4−メチルモルホリン)を
加え、(3)約2〜約100モル過剰のアミン反応性修
飾試薬(たとえば、ジメチルホルムアミド中に溶解した
1、4−フェニレンジイソチオシアネート)を加え、(
4)得られた混合物を反応させ、ついで(5)未反応の
アミン反応性修飾試薬を除く、ことからなる。適当なプ
ロトン吸収試薬としては、水酸化ナトリウム、水酸化カ
リウムまたは水酸化リチウムのようなアルカリ金属の水
酸化物、4−メチルモルホリンおよびトリエチルアミン
のような第三級アミンが挙げられる。
たは2以上のアミノ基、カルボキシル基またはチオール
基を含んでいるか、またはアミノ基、カルボキシル基ま
たはチオール基を取り込むことにより活性化され、その
結果、特異的結合成分がポリマー性アニオン分子との間
に化学的架橋を形成することが可能になる。「活性化種
」とは、架橋剤または他の活性化剤を取り込むことによ
って反応性基を有する特異的結合成分またはポリマー性
アニオン分子をいう。アミノ反応性修飾試薬は、ポリマ
ー性アニオン分子の特異的結合成分を「活性化」する、
すなわち化学的架橋のために特異的結合成分またはポリ
7−性アニオン分子を調製するために用いる試薬の下位
分類である。活性化試薬にはまた、チオラン類(2−イ
ミノチオランなど)、スクシンイミジルメルカプトアセ
テート類(N−スクシンイミジル−3−アセチルメルカ
プトアセテートなど)、およびジスルフィド化合物(引
き続きチオールに還元される)などのようなチオール導
入試薬が含まれる。チオール導入試薬は、その後のチオ
ール反応性基との反応のために、特異的結合成分および
固相物質を活性化するために用いることができる。
ノチオラン同族体、ホモ2感応性試薬およびヘテロ2感
応性試薬のような2感応性架橋または力、プリング試薬
が含まれるが、これらに限られるものではない。これ占
試薬により、特異的結合成分とポリマー性アニオン分子
との間の化学的架橋が可能となる。ホモ2感応性試薬の
例としては、式:X−A−X(式中、Xはアミン反応性
基であり、Aは約1〜約30原子のスペーサーである)
で示されるものが挙げられる。ヘテロ2感応性試薬の例
としては、式:X−A−Y(式中、Xはアミン反応性基
、Yはチオール反応性残基、チオール残基またはチオー
ル前駆体、Aは上記約1〜約30原子のスペーサーであ
る)で示されるものが挙げられる。タンパク質活性部位
にシスティンを有するタンパク質性特異的結合成分の場
合は、カップリング剤を加えると活性が減少するので、
当該技術分野で知られた方法により、力、プリング剤と
反応させる前に活性部は中のシスティン残基を保護しな
ければならない。
橋またはカップリング剤、すなわち2個の反応性基また
は「末端」を含有する分子が含まれ、該反応性基または
末端はスペーサーによりつながれていてよい。反応性末
端は、種々の感応性のいずれであってもよく、たとえば
N−ヒドロキシスクシンイミド(NH3)活性エステル
類、イミドエステル類、アルデヒド類、エポキシド類、
ハロゲン化スルホニル類、インシアネート類、イソチオ
シアネート類およびハロゲン化ニドロアリール類のよう
なアミノ反応性末端;およびピリジルジスルフィド類、
マレイミド類、チオフタールイミド類および活性ハロゲ
ンのようなチオール反応性末端などが挙げられるが、こ
れらに限られるものではない。ヘテロ2感応性架橋試薬
は、2つの異なる反応性末端、たとえばアミノ反応性末
端とチオール反応性末端を有しており、一方、ホモ2感
応性架橋試薬は、2つの同じ反応性末端、たとえばビス
マレイミドヘキサン(BMH)(スルフヒドリル含有化
合物の架橋を可能にする)、およびジスクシンイミジル
スベレ−1−(DSS)、水溶性同族体およびスルホ−
NHSエステル類のようなNHSホモ2感応性架橋剤を
有している[ピアス(Pierce)の1989ハンド
ブツク・アンド・ジェネラル・カタログ(Handbo
ok and General Catalog);ピ
アス、ロックフォード、IL、61105〜9976参
照〕。
ジビミデートジハイドロクロライド(DMA)、ジメチ
ルビメリミデーテジハイドロクロライド(DMP)およ
びジメチルスベリミデートジハイドロクロライド(DM
S)のようなイミドエステル類が挙げられるが、これら
に限られるものではない。イミノチオラン同族体は、一
般式:( (式中、 Aは約1〜約5原子のスペーサーである)で示されるも
の、たとえば2−イミノチオラン(トロート試薬(Tr
aut’s Reagent))が挙げられる。
としては、マレイミド−NH3活性エステルカップリン
グ剤が挙げられるがこれに限られるものではなく、さら
にその具体例としては、m−マレイミドベンゾイルーN
−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、スク
シンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキ
サン−1−カルボキシレート(SMCC);スクシンイ
ミジル4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート(S
MPB)およびそれらの誘導体、たとえばスルホスクシ
ンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロへ牛サ
ンー1−カルボキシレート(スルホ−SMCC);m−
マレイミドベンゾイル−スルホスクシンイミドエステル
(スルホ−MBS)およびスルホスクシンイミジル4−
(p−マレイミドフェニル)ブチレート(スルホ−SM
PB)のようなスルホスクシンイミジル誘導体が挙げら
れる。
イミジルブロモアセテートおよびN−スクシンイミジル
(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB
)のような市販の活性ハロゲン−NH3活性エステルカ
ップリング剤、およびスルホスクシンイミジル(4−ヨ
ードアセチル)アミノベンゾエート(スルホ−3IAB
)のようなスルホスクシンイミジル誘導体が挙げられる
。池のカップリング剤の例としては、N−スクシンイミ
ジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネ−1−(S
PDP)のようなヘテロ2感応性でチオール開裂性試薬
が挙げられる。
第254.288号(1988年10月11日出願)お
よび同第114,930号(1987年10月30日出
願)各明細書に記載の拡張された長さのへテロ2感応性
カツプリング剤が挙げられる。この拡張された長さのへ
テロ2感応性カツプリング剤の例としては、スペーサー
が式:−(アミノ酸)n−C−R− (式中、アミノ酸は直鎖中に3〜10個の炭素原子を有
する置換または非置換アミノ酸、nは1〜10、Rはア
ルキル基、シクロアルキル基、アルキル−シクロアルキ
ル基または芳香族カルボン酸環である)で示されるマレ
イミド−NHS活性エステル類試薬が挙げ会れる。アル
キル−シクロアルキルなる語には、シクロアルキル環構
造に結合したアルキル基において該アルキル基がシクロ
アルキル基をマレイミド基またはカルボニル基に結合さ
せているものが含まれる。アルキルなる語には、直鎖ま
たは分枝鎖アルキル基が含まれ、炭素数1〜6の低級ア
ルキル基が好ましい。
に用いた分析対象物または他の特異的結合成分に対して
反応せず、安定で結合しないいかなる分子鎖であっても
よい。スペーサーの長さは種々であってよく、1個の原
子の大きさから米国特許出願第254..288号およ
び同第114,930号明細書に記載された大きさまた
はそれ以上の大きさまでにわたることができる。
性化剤の選択は重要ではなく、当業者であれば診断アラ
七1″に用いるべき特定のポリマー性アニオン分子およ
び特異的結合成分とともに用いるのに適当なまたは好ま
しい試薬がわかるであろう。それゆえ、所定のアッセイ
に用いるカップリング剤または活性化剤は、一般に経験
的に決定されることが当業者により評価されるであろう
。
、式: で示されるものが挙げられるが、 るものではない。
れるものが挙げられるが、これらに限られるものではな
い。
する特異的結合成分(たとえば、活性化特異的結合成分
)を、ポリマー性アニオン分子の末端アミノ基に結合さ
せることができる。簡単に説明すると、結合手順は、(
1)PGAを溶媒(たとえば、ジオキサン、ジメチルホ
ルムアミド、1−メチル−2−ピロリドンおよびジメチ
ルスルホキシドのような水混和性の非プロトン溶媒)中
に溶解し、(2)滴定可能なカルボン酸当たり約1当量
の量でプロトン吸収試薬(たとえば、水酸化ナトリウム
、水酸化カリウムまたは水酸化リチウムのようなアルカ
リ金属の水酸化L4−;’チルモルホリンまたはトリエ
チルアミンのような第三級アミンなど)を加え、(3)
約2〜約100モル過剰のアミン反応性特異的結合成分
(たとえば、ホスゲン活性化フェニルサイクリジンまた
はフェニルサイクリジン−4−クロロホルメートなど)
を加え、(4)得られた混合物を反応させ、ついで(5
)未反応のアミン反応性特異的結合成分を除くことから
なる。特異的結合成分上のアミン反応性基の適当な例と
しては、式: (式中、Aは上記約1〜約30原子のスペーサーmは2
または3、R′は硫黄安定化基、R”は脂肪族またはア
リール基である)で示されるものが挙げられるが、これ
らに限られるものではない。
する特異的結合成分(SBM)とアミン反応性残基を有
する活性化PGAとの反応が挙げられる。その反応およ
び反応生成物は、 に図示することができる。
薬および指示試薬の特異的結合成分に加えてアッセイ中
で使用する特異的結合ペアのいずれかの成分をいう。た
とえば、間接アッセイにおいて、補助特異的結合成分は
、分析対象物、および分析対象物自身は付着することの
できない第二の特異的結合成分に結合してよいし、抑制
アッセイにおいては、補助特異的結合成分は、以下に記
載するように参照結合成分であってよい。アッセイにお
いては1または2以上の補助特異的結合成分を用いるこ
とができる。
はその後の反応により不溶性にすることのできるあらゆ
る物質をいう。固相は、その固有の荷電および捕捉試薬
を誘引する能力により選択することができ、具体的には
メチル化羊毛、ナイロン、および正の荷電を有する特定
のガラスが挙げられる。固相はまた、捕捉試薬の荷電物
質に関して反対に荷電した荷電物質をさらに保持してい
ることができる。たとえば、アニオン性物質を捕捉試薬
に結合させ、カチオン性物質を固相上に保持することが
できるし、またその逆にカチオン性物質を捕捉試薬に結
合させ、アニオン性物質を固相上に保持することもでき
る。天然の物質、合成物質、または合成的に修飾した天
然に存在する物質をカチオン性物質として用いることが
できる。広範囲にわたる専売ポリカチオンが入手可能で
あり、その中には、ヘキサジメスリン(hexadim
ethrine)プロミド[ポリブレン(P olyb
rene) :シグマ°ケミカル・カンパニー、セント
ルイス、M○]、カフコーラ(G A F Q uat
s)[たとえば、ガフフート(GafQ uat) :
ガフ・コーポレーション(G A F Corpor
at 1on)、ウニイン、NJ、07470]、ジエ
チルアミノエチルデキストラン(シグマ)、ジアリルジ
メチルアンモニウムクロリド−ヒドロキシエチルセルロ
ースポリマ−[セルコート(Celquat) L−2
00およびセルフートH−100、ナショナル・スター
チ・アンド・ケミカル・コーポレーションCNatio
nal 5tarch&Chemical Corpo
ration)、ブリッジウォーター、NJ、0880
7]などの水溶性セルロース誘導体が含まれる。
の幾つかは固相として選んだ物質に依存する。たとえば
、固相にはあらゆる適当な多孔質物質が含まれ得る。こ
こで「多孔質」とは、液体がその中を流れることができ
、また容易に通過することのできる物質を意味する。本
発明においては、固相には、ガラス繊維、セルロース、
■または2以上のアッセイ試薬を含有する1または2以
上の層を有するポー・アンド・フロースルー(pour
and flow−through)アッセイ装置に
おいて使用するナイロンパッド;デイツプ・アンド・リ
ード(dipand read)アッセイのためのデイ
ツプスティ、2り。
プ(たとえば紙)または薄層クロマトグラフィー法のた
めの試験ストリップ(たとえばニトロセルロース);ま
たは当業者にはよく知られた他の多孔質物質が含まれる
。しかしながら、固相は多孔質物質に限られるものでは
ない。固相にはまた、ポリマーピーズもしくはガラスピ
ーズ、微細粒子、管、シート、プレート、スライド、ウ
ェル、テープ、試験管など、または固有の荷電を有する
または荷電物質を保持することのできるあらゆる物質が
含まれる。
存在する物質を固相として用いることができ、これには
多糖類、たとえば紙のようなセルロース物質および酢酸
セルロースやニトロセルロースのようなセルロース誘導
体;シリカ:不活化アルミナ、ケイソウ土、M g S
Oaのような無機物質、または微細に分割し多孔質ポ
リマーマトリックス中に均一に分散させた他の無機物質
(ポリマーとしては、塩化ビニル、塩化ビニル−プロピ
レンコポリマー、および塩化ビニル−酢酸ビニルコポリ
マーなど);天然に存在する布(たとえば、綿)および
合成の布くたとえばナイロン);シリカゲル、アガロー
ス、デキストランおよびゼラチンのような多孔質ゲル;
ポリアクリルアミドのような多孔質フィルムなどが含ま
れる。固相は、妥当な強度を有しているか、または支持
手段により強度が与えられていなければならず、また検
出可能なシグナルの生成を妨害してはならない。
、その例としては、たとえば「ファツトマン(What
IIlan) 934 A HJ濾紙(名目上の厚さ
:Q、33xm)、またはアボット・ラボラトリーズ(
アボットバーク、IL、60064)の使捨てIMxウ
ェッジおよびテストパック(T est P ackX
ファイバーマトリックス)装置が挙げられる。そのよう
な物質の厚さは重要ではなく、主として試料やアッセイ
しようとする分析対象物の性質、たとえば試験試料の流
動性などに依存した選択の問題に過ぎないであろう。
に、荷電物質を直接固相物質にコーティングしたり、ま
たは荷電物質を微細粒子上にコーティングしたのち該微
細粒子を固相支持体物質により保持させることができる
。別のやり方として、微細粒子のみを荷電固相として用
いることができる。粒子は、これをカラム中に保持し、
または可溶性試薬と試験試料との混合物中に懸濁させる
ことにより固相として用いることができるし、または粒
子自身を固相支持体物質により保持し固定化することが
できる。ここで「保持し固定化する」とは、支持体物質
上または支持体物質中の粒子が支持体物質のどこか他の
場所へ移動することが実質的にできないことを意味する
。粒子は、ポリスチレン、ポリメチル7゛クリレート、
ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロエチ
レン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、また
は同様の物質からなる特定の物質の適当なタイプから当
業者により選択することができる。粒子の大きさは重要
ではないが、粒子の平均粒径ば用いた支持体物質の平均
孔径よりも小さいことが好ましい。
ができ、その際、可溶性の捕捉試薬にはアニオン性物質
のような荷電物質に結合した分析対象物特異的結合成分
を含ませることができる。
。捕捉試薬を、分析対象物を含有していると思われる試
験試料、および標識した分析対象物特異的結合成分を含
む指示試薬と接触させる。これらの試薬は同時に混合す
るか、または単独または組み合わせて連続して加えるこ
とができる。結合反応の結果、捕捉試薬/分析対象物/
指示試薬複合体が生成される。アッセイの工程にはまた
、捕捉試薬に関して反対に荷電しているかまたは反対に
荷電した物質、たとえばカチオン性物質を保持している
固相を用いることにより、生成した均一な複合体を過剰
の試薬および試験試料から分離する工程が含まれる。こ
の場合、反対に荷電した固相は、アニオン性物質とカチ
オン性物質との相互作用により捕捉試薬/分析対象物/
指示試薬複合体を誘引し該複合体に付着する。固相上に
保持された複合体を、ついで指示試薬について固相を調
べることにより検出する。試料中に分析対象物が存在す
ると固相物質上に標識が存在する。固相上の標識の量は
、試料中の分析対象物の量に正比例する。サンドイッチ
アッセイに内在する唯一の主だった制限は、少なくとも
2個の特異的結合成分が結合することができるように分
析対象物が充分な大きさと適当に配置されたエピトープ
を有している必要があることである。
できる。競合アッセイ態様においてもまた、可溶性の捕
捉試薬は、アニオン性ポリマーのような荷電物質に付着
した特異的結合成分を含んでいる。捕捉試薬を試験試料
、およびシグナル生成化合物で標識した第二の結合成分
を含む指示試薬の両方と接触させる。捕捉試薬と分析対
象物とが指示試薬への結合に対して競合するか(たとえ
ば、捕捉試薬および分析対象物が標識抗体に対して競合
する抗原である場合)、または指示試薬と分析対象物と
が捕捉試薬への結合に対して競合する(たとえば、指示
試薬が標識抗原であり、抗体である捕捉試薬への結合に
対して抗原である分析対象物と競合する場合)ことがで
きる。競合結合反応が起こると、(1)捕捉試薬/分析
対象物または指示試薬/分析対象物および(2)捕捉試
薬/指示試薬の可溶性複合体が生成される。生成した可
溶性複合体は、反対に荷電した固相、たとえば固相上の
カチオン性物質に反応混合物を接触させることにより過
剰の試薬および試験試料から除く。
保持される。固相上に保持された複合体は、指示試薬の
標識により検出することができる。競合アッセイにおい
ては、固相に結合した標識の量は試料中に存在する分析
対象物の量に反比例する。
さい分子の分析対象物の存在を決定するために用いるの
が有利であり、このようは小さい分子では単一のエピト
ープを有していてこれに特異的に結合する相手方が結合
する。
フィリン抗体(モノクローナルかまたはポリクローナル
)をアニオン性物質に結合させて可溶性の捕捉試薬を生
成させ、該抗体への結合に対して可溶性の標識テオフィ
リン(すなわち指示試薬)と試験試料の非標識テオフィ
リンとの間で競合を行わせる。インキュベーションした
後、均一な混合物をカチオンコーティング固相と接触さ
せる。捕捉試薬および固相の反対に荷電したイオン種間
での引力により、免疫複合体が反応混合物から分離され
る。ついで指示試薬からのシグナルを検出する。この場
合、試験試料中でのテオフィリンレベルが増加すること
は、固相に関連したシグナル生成を減少させる結果とな
る。
用いた間接イムノアッセイに用いることもできる。たと
えば、捕捉試薬/分析対象物/抗分析対象物抗体/指示
試薬複合体の生成を伴う間接サンドイッチイムノアッセ
イを行うことができ、その際、指示試薬は、分析対象物
に対して特異的な補助特異的結合成分に対して特異的に
結合する相手方である。さらに別の態様においては、捕
捉試薬は、分析対象物に対して特異的な補助特異的結合
成分に対して特異的に結合する相手方である。
り抗体の測定をするような抑制アッセイに用いることも
できる。たとえば、捕捉試薬は抗体/アニオン結合体を
含み、指示試薬は標識抗体であってよい。分析対象物で
ある抗体を含有していると思われる試験試料を参照抗原
と混合する。
定化することのできる検出可能なサンドイッチ複合体を
生威し得る。捕捉試薬による抗原取り込みの抑制の程度
は、試験試料中の抗体の1に正比例する。従って、分析
対象物である抗体の濃度が減少するにつれて固定化サン
ドイッチ複合体を完成するに必要な参照抗原が少なくて
すむ。
されたら、分離のため固相を用いる。均一な反応混合物
を固相と接触させると、新たに生成した結合複合体は、
固相および捕捉試薬の反対荷電間での相互作用により固
相上に保持される。
捉試薬を固相上に前原て固定化して「捕捉部位」、すな
わちlまたは2以上の捕捉試薬が非拡散的に付着した固
相の領域を生成することができる。
ることもできる。たとえば、分析対象物を試験試料から
分離することだけを目的として、指示試薬を用いること
なく捕捉試薬および固相を用いることができる。さらに
、捕捉試薬を、該捕捉試薬に関して反対に荷電した可溶
性の第二の荷電物質と接触させることができる。この第
二の荷電物質は、試料を固相物質に接触させる前には固
相上に保持されていないが、捕捉試薬に誘引・付着して
生成したアッセイ複合体が固相上に保持されるようにす
る。
との複合体を反対に荷電した固相と接触させるときには
、反対に荷電したイオン種間でのイオン引力が、該複合
体を反応混合物から分離する効率を支配する。イオン引
力の選択は、とりわけ複数のポリカチオン性およびポリ
アニオン性化学種が捕捉試薬および固相中に含まれてい
るときには、抗体の抗原に対する免疫学的引力よりも大
きな引力となるようにして行うことができる。さらに他
の利点としては、「イオン捕捉」法は、干渉物質の固相
上への非特異的な吸着を最小限に抑えることができ、そ
のことによって−層正確な分析が可能となることである
。そのためイオン捕捉法は、特異性の高い分離法、最小
の非特異的結合、および感度の高いアッセイを行うこと
が可能となる。
物質を用いたアッセイ手順について記載するものである
。しかしながら、本発明はこれら実施例に限られること
を意図したものではない。
a)抗CEA抗体−PGA捕捉試薬の調製二下記工程手
順は、抗体/ポリグルタミン酸(PGA)結合体、すな
わち抗体/アニオン性ポリマー捕捉試薬の調製のための
ものである。
リウム塩(19;7.14 x 10−’モル;平均分
子量[MW]14,000;シグマ・ケミカル・カンパ
ニー、セントルイス、MO)を、ツクダ(T 5uku
da)らの方法(JNCI;73;721〜729.1
984)を用いるが以下の点を変更して3−(2−ピリ
ジルジチオ)プロピオニル−PGA(PDP−PGA)
に変えた。FDP−PGAは、チオプロピルセファロー
ス6B分離をする前には遊離のスルフヒドリルに還元し
なかった。その代わり、FDP−PGAを0.1Mリン
酸ナトリウムおよび1mM EDTA(pH6,5)中
に溶解し、チオプロピルセファロース6 B (60i
C;309;ファルマシア・ケミカルズ(PharII
lacia Chemicals)、ウプサラ、スウェ
ーデン)とともに撹拌した。透析および凍結乾燥の後、
FDP−PGA結合体を24%の収率で得た(0.24
49;1.72XIO−’モル)。
にするために、チオピリジル基を5−千オー2−ニトロ
ベンゾエート(TNB)保護基と交換した。l00モル
過剰の1.4−シトオスレイトール(分子量154.2
)を、Q、1Mリン酸ナトリウム(4,0i(2;pH
7)中に溶解したPDP−PGA(2019;1.42
X 10−”モル)の溶液に加え、40℃で1時間反応
させた。混合物を5.0mM酢酸ナトリウム、0.14
MNaC1および1.OmMEDTA(pH5,5)で
1oxQまで希釈し、2000分子量カットオフ(MW
CO)管中で希釈緩衝液に対して透析した。蒸留水に対
して透析を続けた後、凍結乾燥した。チオプロピル−P
GA(H3−PGA)の収量は13.5z9であった。
トリウム(pH7,o;9.6x 10−’モル)中に
溶解し、l゛00モル過剰、5″−ジチオビス(2−ニ
トロ安息香酸)(DTNB)と室温で1時間反応させた
。
O+tQまで希釈し、2000MWCO管中で希釈緩衝
液に対して透析した。蒸留水に対して透析を続けた後、
凍結乾燥して5−(2−ニトロ安息香酸ジチオ)プロピ
オニル−PGA(TNB−PGA;8.5i9;6.0
7 X 10−’モル)を得た。
を追跡するために、ついでTNB保1PGAをフルオレ
セインのエチレンジアミン誘導体で標識した。TNB−
PGAをエチレンジアミン誘導体化フルオレセイン(E
DA−Fl)で標識することは、TNB−PGA(8,
59)を乾燥N、N−ジメチルホルムアミド(2,0x
f2)中に溶解し、90モル過剰のN−メチルモルホリ
ン(分子tt01、15)で処理し、温度を0°Cまで
下げ、ついで90モル過剰のインブチルクロロホルメー
ト(分子1136.58)を加えることにより行った。
、30モル過剰のEDA−Flを加え、室温で撹拌しな
がら一夜反応させた。混合物をO,1Mリン酸ナトリウ
ム(pH7,0)で10+y(まで希釈し、2000M
WCO管中で希釈緩衝液に対して透析した。蒸留水に対
して透析を続けた後、凍結乾燥してTNB−PGA/E
DA−Fl結合体<7.8R9;5.6 X 10−’
モル)を得た。
D A −Fl(7,819)をO,1Mリン酸ナト
リウム(3,0z12:pH7,0)中に溶解し、40
’Cにて100モル過剰の1,4−ジチオスレイトール
で1時間処理することにより行った。UV/V I S
分光光度計上で334 nmが412nmのピークにシ
フトすることについて反応をモニターした。この物質を
蒸留水で10w(lまで希釈し、200OMWCO管中
で蒸留水に対して透析した。凍結乾燥するとチオプロピ
ルPGA/EDA−Fl(HS−PGA/EDA−Fl
:8.41g)が得られた。この時点でUV/VISス
キャンを取ってPGA分子当たりのフルオレセインの数
(すなわち積み込み(loading))を決定した。
セインの値が計算された。
方法(JNCIニア3;721〜729.1984)に
従うが以下の点を変更してマレイミド活性化した。抗体
濃度は1m9/x(lであり、150モル過剰のN−ス
クシンイミジルm−(N−マレイミド)ベンゾエート(
SMBE、分子量314゜3;シグマ)を用いた。3〜
5個のマレイミド基を抗CEA抗体に導入するには15
0モル過剰のSMBEが必要であることが実験的に決定
された。
シグマ)を用いたメアレス(Meares)らの遠心分
離法(Analytical B iochemist
ry: l 142 :68〜78.1984)を用い
て清澄化(clean−up)を行った。抗体当たりの
マレイミド数の決定は、リウ(Liu)らの滴定法(B
iochemistry: 18.690〜696.
1979)を用いて行った。この抗体活性化の間に抗体
当たり4.6個のマレイミドが導入されたことがわかっ
た。
ミド誘導抗体と反応させて、癌胎児性抗原イオン捕捉イ
ムノアッセイに適した抗体/PGA結合体を得た。0.
1Mリン酸ナトリウム(1゜0〜2.OxQ;pH7,
0)中のマレイミド活性化抗体(1,Ou;6.25X
10−’%ル)(7)pHを、1゜QN HCIを用
いて6.5に調節した。ついで0゜1Mリン酸ナトリウ
ム(100μ12)中の10モル過剰のHS−PGA/
EDA−Fl(約1 、0 m9)を活性化抗体調製物
に加えた。室温で穏やかに撹拌しながら一寿結合反応を
行った7この混合物を011Mリン酸ナトリウム(pH
7、0)中で10zI2まで希釈し、50.000MW
CO管中で0.001Mリン酸ナトリウム(pH7,0
)に対して透析した後、凍結乾燥した。乾燥物質を蒸留
水(0,25RQ)中に溶解し、A280での最大ピー
クに対して高速液体クロマトグラフィー(HP L c
)分画した。
)TSK250(パイオーラド・ラボラトリーズ(Bi
o −Rad L aboratories)、リッチ
モンド、カリフォルニア)の300xzx7.5xxカ
ラムを用い、50+nM硫酸ナトリウム、20IIIM
リン酸ナトリウム、およびO’、 3 M N aC1
(1xQ/分)で溶出することにより行った。
ォード(B radford)アッセイを用い、最大ピ
ークをタンパク質含量についてアッセイした。このピー
クは95.5μ9/ x(lタンパク質を含んでおり、
これは5.97X10−’モルタンパク質(IgGの分
子量160,000)と等価であった。UV/VISを
スキャニングし492nmでの吸光度を測定することに
より、このフラクションはまた2゜12X10−@モル
のフルオレセインを含有することが決定された。フルオ
レセインのモル数をタンパク質のモル数で均等化するこ
とにより、抗体分子台たり3.6個のフルオレセインと
なった。このことは、PGA分子当たりO,at個のフ
ルオレセインがあることがわかっているので、各抗体当
たり4.4個のPGA分子が結合しているのと同じこと
になった。ピークのフラクションを凍結し、引き続きア
ッセイに用いた。
と抗体との間で単一の付着部位しか存在しないことであ
る。これら2分子間での単独の共有結合により、複数の
活性化基を有するポリマー性アニオンを用いた場合には
起こり得る分子間および分子内架橋が回避される。
成させてアニオン性固相物質とともに用いることもでき
る。
ポリマー性第四級化合物でコーティングして固相に正の
荷電を与えた。水溶性セルロース誘導体であるセルコー
トL−200を用いた。セルコートL−200の1%水
溶液を固相物質に加え、ついで300mM NaC1,
50IIIM)リスおよび0.1%NaN5(75tt
Q:pH7,5)を含有する希釈液で洗浄した。
断片の結合体からなり、捕捉試薬中の抗体とは異なるエ
ピトープに結合する。アルカリフォスファターゼ標識抗
CEA抗体断片は、50mMトリス、50aM NaC
1% 1.omM MgC1t、0゜1iM ZnC1
−,5,Oa+M酒石酸ナトリウム、05%ウシ皮膚ゼ
ラチンおよび3%マウス血清を含む緩衝液中に入れてお
いた。
指示試薬(70μQ)を反応ウェル中に置いた。
O2,20mMリン酸ナトリウムおよび300 mM
N aClからなる緩衝液(pH6,8)中の抗CEA
/PGA結合体く20μl2))をウェルに加えた。C
EAを含有する試料(35μe)をウェルに加え、均一
な免疫反応混合物を34.5°Cで20分間インキュベ
ートした。4つの異なる試料をアッセイにかけたが、各
試料はアボット・ラボラトリーズCEA醇素イム/アッ
セイキットからのCEAカリブレーク−であった。つい
で各反応混合物のアリコー)(100μe)をフォート
処理固相物質に加え、ついで希釈液(75μQ)で3回
洗浄した。最後に酵素基質(70μm2:100mM
AMP、1.0mMM g C1t、O11%N a
N sおよび4 、0 IIIMテトラミソール(te
traiisole)の溶液(pH1o、3)中の1゜
2111M4−メチルウンベリフェリルホスフ、−ト)
を34.5°Cで加えて指示試薬と反応させ、得られた
蛍光度(rate of fluorescence)
を測定した。
果は、CEA試験試料の濃度が増加するのに対応して捕
捉試薬/分析対象物/指示試薬複合体の生成も増加し、
それゆえ固相に結合した検出可能な標識の量も増加する
ことを示している。
1gG−PGA捕捉試薬の調製:以下の手順に従い、水
溶性カルボジイミド試薬(1−エチル−3−(3−ジメ
チルアミノプロピル)カルボジイミド;EDCI)を用
いてプロティンAアフィニティー精製マウスモノクロー
ナル免疫クロプリンGを負に荷電したPGAに結合させ
た。
よび300mM NaC1,pH7,2)中の抗体(4
゜819/J!Q)の水冷溶液にフルオレセイン標iP
GA(l Ox9;Fl−PGA)を加えた。この溶液
に新たに調製したEDCI(100μに 10M9/x
(1)の水冷溶液を加え、得られた反応混合物を絶えず
撹拌しながら2.5時間かけて室温まで温めた。ついで
、この反応混合物に急速に撹拌しながらさらに新たに調
製したEDCI(50μff:100ス9/村)の水冷
溶液を加えた。反応混合物をさらに1,5時間撹拌した
。ついで、スフエロゲル(S pherogel)TS
K−Gガードカラム(2,15c罠X 7.5cm;ベ
ックマン・インスツルメンツ(Beckman Ins
truments、 I nc、 、 )、フラートン
、CA、92634)を備えたスフェロゲルTSK−3
000SWGカラム(2,15c屓x 30cm)を用
いたゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより、混合物
を分画した。
より、これらのプールのPGA/抗体比を決定した。そ
の結果を第2表に示す。
固相の調製: 多孔質の繊維性マトリックス物質をポリマー性第四級ア
ンモニウム化合物(ガフコート755N;GAFコーポ
レーション)でコーティングして固相を生成した。0.
5%ガフフート水溶液(50μg)をマトリックス物質
の表面に適用し、ついで水(75μm2)で洗浄した。
リホスファターゼ結合体(ジャクソン・イム/リサーチ
・ラボラトリーズ(J ackson I mmuno
Research Laboratories、 I
nc、 )、ウェストグローブ、PA、19390)を
、1%にべを含有するトリス緩衝食塩水[25mM1−
リス(ヒドロキシメチル)アミノメタンおよび100m
M NaC1、pH7,5]中に希釈した。捕捉試薬で
あるPGA/マウスモノクローナル抗体結合体(第2表
のブールI)も同様に処理した。各試薬(200μのを
一連の試験管に加え、ついで37℃で30分間インキュ
ベートした。反応混合物のアリフート(75μQ)をフ
ォート処理した固相物質に適用し、直ちにトリス緩衝食
塩水で3回(X150μQ)洗浄した。最後に32.7
°Cで酵素基質(100mMAM P 、 l mM
MgClx、0.1%NaN、および4mMテトラミ
ソールか占なる溶液(pH10,3)中の1.2mM4
−メチルウンベリフェリルホスフェート(70μの)を
固相物質に加え、得られた蛍光度を測定した。この実験
の結果は第3表および第4表にまとめである。
指示試薬を上記のようにして調製した。いずれの試薬も
、1%にべを含有するトリス緩衝食塩水中に希釈した。
試薬を10μ9/畦に希釈した。一連の試験管中で、適
当に希釈した指示試薬、捕捉試薬およびマウスモノクロ
ーナル抗体各150μeを混合した。混合物を37°C
で30分間インキュベートした。混合物のアリコート(
75μQ)をフォート処理した固相物質に適用し、直ち
にトリス緩衝食塩水で3回(×150μg)洗浄した。
、1mM MgC1=、0.1%NaN、および4.Q
mMテトラミソールからなる溶液(pH10,3)中の
1.2mM4−メチルウンベリフェリルホスフ、−ト(
70μQ))ヲ固相に加工、得られた蛍光度を測定した
。マウスIgGの競合抑制アッセイを示すこの実施例の
結果は、第5表に示しである。第5表の結果は、マウス
モノクローナル抗体の濃度が増加するのに対応して捕捉
試薬/指示試薬複合体の生成は減少し、それゆえ固相に
結合した検出可能な標識の量も減少することを示してい
る。
3 (ヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン(hCG)のサンドイ
ッチアッセイ) 0)捕捉試薬の調製: 以下の手順に従い、高度に負に荷電したアルブミン誘導
体を調製し、抗hCG抗体に結合させて捕捉試薬を生成
させた。
パク質誘導体の調製] ジ3つ(J ou)らの手順(Methods in
Enzymol。
、アカデミツクプレス、1983)により、ウサギ血清
アルフミン(RS A)を充分にスクシニル化し、バラ
−アゾベンゼンスルホネートに結合した。リン酸緩衝食
塩水CPBS、14xQ、 pH8,0)中の2%R3
Aを、バラ−ジオキサン(2,28J!12)中の5%
無水コハク酸と混合した。1.QN NaOHを加える
ことによりpHを8に維持した。反応混合物を室温で3
0分間撹拌した。ヒドロキシルアミン塩酸塩(0,69
)を加え、適量の5N NaOHを加えることにより溶
液のpHを9.5に調節した。
、−R3Aを、以下の反応に従ってバラ−アゾベンゼン
スルホネートに結合した。
スルホン酸(0,15ミリモル、26Q)のせ濁液を水
浴中で冷却し、急速に撹拌しなからlNNaNow(0
,2x(りで30分間処理した。得られたジアゾニウム
塩溶液を、急速に撹拌しながら水冷SUC,,−R3A
溶液に滴下した。反応混合物のpHは、1.○NNaO
Hを加えることにより11に維持した。暗赤色の反応混
合物を撹拌し、静置して1時間かけて室温まで温めた後
、水に対して充分に透析した。得られた5p−3UC,
、−R3Aアニオン性誘導化タンパク質を、使用すると
きまで冷凍しておいた。
N 1sonoff)らの方法(A rch、 B i
ochem。
0)に従い、アフィニティー精製ヤギ抗hCG抗体から
抗hCG F (ab’ )x断片を調製した。酢酸
を加えることにより、リン酸緩衝食塩水(pH7,2)
中のアフィニティー精製抗体溶液の一部をpH4の酸性
にした。この時点での抗体の好ましい濃度は1 xv/
yrQであった。ペプシンを最終濃度20μ9/ x
(lまで加えた。反応混合物を37°Cで一部インキユ
ベートした。6.ON NaOHを加えて反応混合物の
pHを7,5までもっていくことにより反応を停止させ
た。消化した抗体断片の溶液を20m9/1x(lまで
濃縮した。F(ab’)を断片の精製は、スフエロゲル
TSK−Gガードカラム(2,l 5cxX 7.5C
I)を備えたスフェロゲルTSK−3QQQSWGカラ
ム(2,15cxX 30cjI)を用いたゲル濾過高
速液体クロマトグラフィーにより行った。
P atham)らの方法(J 、 I mmunol
、 Method、 : 53 : 133〜173.
1982)およびブレナン(B rennan)らの方
法(S cience: 229 :81〜83.19
85)の変法により、抗hcc Fab′断片をチオ
ール反応性形に調製・誘導体化した。
M N aA go tの溶液(158μQ)を、PB
S中に痕跡量の”5l−F(ab’)tを含有するヤギ
F (ab’ )、(ヤギ抗ヒト絨毛性生殖腺刺激ホル
モン抗体断片、16JI9/ス12)(1,28買のに
加えた。0.1Mシスティン−HCI(158μg)を
加えることにより、還元的開裂反応を開始させた。反応
混合物を窒素雰囲気下に置き、37°Cで撹拌しながら
1時間インキュベートした。ついで、5.5’−ジチオ
ビス(2−ニトロ安息香酸)(19u)を加えることに
より反応を停止させた。室温で一夜撹拌した後、前以て
PBSで平衡化しておいたPD−10カラム(ファルマ
シア(Pharmacia I nc、、)ピスカタウ
エイ、NJ)上のクロマトグラフィーに混合物をかけ、
ついでサイズ排除高速液体クロマトグラフィー[スフェ
ロゲルTSK−Gガードカラム(2,15czx7.5
ci)を備えたスフェロゲルTSK−2000SWGカ
ラム(2,15cxx 30ct)]にかけた。精製し
たF ab’のチオニトロベンゾエート誘導体(T N
B −F ab’ )を、CX−10限外濾過ユニツ
ト(ミリポア・コーポレーション(M il l 1p
oreCorp、 + )、ベツドフォード、MA)を
用いて7゜9n/xQまで濃縮した。
sRSAへの結合] 1Mジチオスレイトール(DTT;86μ(1)の溶液
を、37.5n+Mリン酸ナトリウム、1501MNa
C1および2.OmM EDTA(pH6,8)中に5
p−3UC□−RS A (2、2u/mQ>を含有す
る溶液(4,2xQ)に加えた。混合物を37°Cで3
時間インキュベートし、ついで室温で一夜インキユベー
トした。得られた反応’ll 6物を、セファデックス
G−25(ファルマシア)を充填し75mMリン酸ナト
リウム、300mM NaC1および2.OmM ED
TA(pH6,8)で前以て平衡化した2、5cxX2
0cxカラム上でのクロマトグラフィーにかけた。還元
Sp 5UC−s−R3A(0,481グ/xQ)の
プールしたフラクションの2xQ部分を抗hCG T
NB Fab’(0,15i&;7.9x9/111
2)と混合した。反応混合物を室温で一夜撹拌した。つ
いで反応混合物を110011Iヨード酢酸(107μ
Q)で処理し、室温で1時間撹拌した。Fab’ 5
p−3UC,、−R3A結合体の精製は、スフェロゲル
TSK−Gガードカラム(2,15CR87,5cm)
を備えたスフェロゲルTSK−3000SWGカラム(
2,15cmX 30aR)を用いたサイズ排除高速液
体クロマトグラフィーにより行った。
N、N−ジメチルホルムアミド中の3QmMスクシンイ
ミジル4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン
−1−カルボキシレートの溶液(27μQ)を、PBS
中のアフィニティー精製ヤギ抗hCG抗体(329/
x□ (2、25村)に加えた。得られた反応混合物を
室温で1時間撹拌し、ついで75mMリン酸ナトリウム
、300mMNaC1および2.0mM EDTA(p
H6,8)t’前前取平衡化したPD−10カラム上の
クロマトグラフィーにかけた。修飾抗体(1,6mg/
x□のプールしたフラクションの1.8xQ部分を、D
TT還元s p−sUC,5−R3A(0,4819/
ス12)(3スQ)とl混合した。室温で一夜撹拌した
後、100mMヨード酢酸(0,25112)を加え室
温で1時間撹拌することにより反応を停止させた。抗体
−3p 5UCes−R5A結合体の精製は、上記と
同様にしてサイズ排除高速液体クロマトグラフィーによ
り行った。
アミノメタン、100mM NaCl、l mM Mg
CIt、0.1mM ZnC1ts O,07%N a
N sおよび1%にべを含有するアッセイ緩衝液(p
H7,5)中のアルカリホスファターゼ−ヤギ抗hCG
抗体結合体(抗hCG抗体を過ヨウ素酸活性化アルカリ
ホスファターゼに結合させることにより調製)からなっ
ていた。
ル: イオン捕捉イムノアッセイプロトコールには、実質的に
実施例2に記載した方法に従って調製した固相、指示試
薬(アルカリホスファターゼ−ヤギ抗hCG抗体結合体
)、上記実施例3の工程(a)で調製されたような2つ
の異なる捕捉試薬(ヤギ抗hCG Fab’−5p−8
UCas−RSAおよびヤギ抗hCG IgG S
p 5UCss RSA)のうちの一方、および精
製hCG標準溶液を使用することが含まれていた。すべ
ての試薬をアッセイ希釈液中で適当に希釈した(滴定曲
線により決定されるように)。等容量(750μ+2)
の指示試薬およびhCG試料溶液を一連の試験管中に入
れた。37℃で30分間インキュベートした後、各イン
キュベート混合物の125μgアリコートを別の試験管
中で等容量の捕捉試薬と混合した。得られた混合物を3
0分間インキュベートした。ついで、アッセイ混合物(
75μg)を各固相に加えた。ついで固相物質を洗浄緩
衝液[25IIIMトリス(ヒドロキシメチル)アミ/
メタン、100mM NaC1,l。
.07%N a N 3、pH7,5コ(150μe)
で3回洗浄した。
MgC″1..0.1%NaN、および4 、0 mM
テトラミソールの溶液(pH10,3)中の1.2mM
4−メチルウンベリフェリルホスフェート(70μ(1
>’)を固相物質に加えた。得られた蛍光度を32.7
°Cで測定した。この実験の結果は、第6表にまとめで
ある。第6表の結果は、hCG試験試料の濃度が増加す
るのに対応して捕捉試薬/分析対象物/指示試薬複合体
の生成も増加し、それゆえ固相に結合した検出可能な標
識の量も増加することを示している。
) 間接イオン捕捉イムノアッセイには、実質的に実施例2
に記載したようにして調製した固相、指示試薬としてア
ルカリホスファターゼ−ヒツジ抗マウスIgG結合体(
ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ)、捕捉
試薬として実施例3で調製したようなりギ抗hCG F
(ab’)、−S P−3UC,、−RSA、マウスモ
ノクローナル抗hCG抗体の補助特異的結合成分[イム
/サーチ(I mff1un。
CG標準溶液を使用することが含まれていた。補助特異
的結合成分は、分析対象物および指示試薬と結合させる
ために用いた。すべての試薬をアッセイ緩衝液中で適当
に希釈した。等量(150μQ)の指示試薬、hCG試
料溶液および補助特異的結合成分を一連の試験管中に入
れた。37℃で5分間インキュベートした後、捕捉試薬
の150μQ部分を各試験管に加えた。得られた混合物
を5分間インキュベートした。ついで、アッセイ混合物
(200μg)を各調製固相物質に加えた。ついで上記
実施例3と同様にして、固相物質を洗浄緩衝液で洗浄し
、酵素基質溶液で処理した。得られた蛍光度を32.7
℃で測定した。このアッセイの結果を第7表にまとめて
示す。アッセイの結果は、hCG試験試料の濃度が増加
するのに対応して捕捉試薬/分析対象物/補助特異的結
合成分/指示試薬複合体の生成も増加し、それゆえ固相
に結合した検出可能な標識の量も増加することを示して
いる。
) 捕捉試薬:ヤギ抗hCG F (ab’ )t−3P
S U CssR3A 指示試薬:ヒッジ抗マウスIgG−アルカリホスファタ
ーゼ 補助特異的結合成分:マウスモノクローナル抗hc実施
例5 (2つの補助特異的結合成分を用いたhCGの間接サン
ドイッチイオン捕捉イムノアッセイ)本実施例のイオン
捕捉イムノアッセイプロトコールには、実質的に実施例
2に記載した方法に従って調製した固相、指示試薬とし
てアルカリホスファターゼ−ヒツジ抗マウスIgG結合
体(ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ)、
マウスモノクローナル抗hCG抗体の補助特異的結合成
分[イム/サーチ、トマスワバー、NJJおよび精1h
cG標準溶液を使用することが含まれていた。このプロ
トコールにはさらに、アフィニティー精製ヤギ抗hCG
抗体の第二の補助特異的結合成分、および捕捉試薬とし
てウサギ抗ヤギIgG−3P −8UCss RSA
を使用することが含まれていた。
、アフィニティー精製ウサギ抗ヤギエgG(カッペル(
Cappel) ;コクランビル、PA、19330)
を5P−SUC,、−RSAに結合させることにより行
った。すべての試薬をアッセイ緩衝液中で適当に希釈し
た。等1t(100μe)の指示試薬、hCG試料溶液
および第一の補助特異的結合成分を一連の試験管中に入
れた。インキュベート(37°Cで10分間)後、第二
の補助特異的結合成分(100μg)を加え、インキュ
ベートをさらに続けた(37℃でさらに5分間)。最後
に捕捉試薬(100μg)を各試験管に加えた。得られ
た混合物を5分間インキュベートした。ついで、アッセ
イ混合物(200μのを各調製固相物質に加えた。つぃ
で上記実施例3と同様にして、固相物質を洗浄緩衝液で
洗浄し、酵素基質溶液で処理し、蛍光度を測定した。こ
のアッセイの結果を第8表にまとめて示す。アッセイの
結果は、hCG試験試料の濃度が増加するのに対応して
捕捉試薬/補助特異的結合成分/分析対象物/補助特異
的結合成分/指示試薬複合体の生成も増加し、それゆえ
固相に結合した検出可能な標識の量も増加することを示
している。
) 捕捉試薬:ウサギ抗ヤギIgG−3P−3UC,。
ーゼ 補助特異的結合成分:マウスモノクローナル抗hCG抗
体 実施例6 (抗プロゲステロン抗体の間接イオン捕捉イムノアッセ
イ) (a) P G A標識ヤギ抗マウス捕捉試薬の調製:
下記工程手順は、抗体/ポリグルタミン酸結合体の調製
のためのものである。
トリウム塩(20019;1.47X 10−5モル;
平均分子IL13,600・シグマ・ケミカル・カンパ
ニー、セントルイス、MO)を水(60村)中で陽イオ
ン交換樹脂(AG50W−X8;139;バイオ−ラド
、リッチモンド、CA)とともに3時間撹拌した。上清
をデカントし、濾過し、蒸発させてPGAの遊離の酸を
白色粉末として80%の収率で得た(137j19;平
均分子量11,620)。
製] ジメチルホルムアミド(DMF;2zQ)中のPGAの
遊離酸(65a+9;5.6 X 10リモル)の溶液
に、トリエチルアミン(100μe;7.2×10−4
モル)および1,4−フェニレンジインチオシアネート
(11019;5.7X10−’モル;アルドリッチ・
ケミカル・カンパニー(Aldrich Chemic
al Coo+pany)、ミルウォーキー、Wl)を
加えた。室温で一夜撹拌した後、酢酸(l OOuQ:
1.7 X 10−”モル)を加え、ついで反応混合
物を蒸発させた。残渣に塩化メチレン(253+12)
を加え、2時間撹拌した後、混合物を濾過してITC−
PGAを白色粉末(101t9)として得た。
ル;2o%DMF10.1Mリン酸ナトリウム(pH7
,0,40μ12)中)を、ヤギ抗マウスIgGの緩衝
溶液(200μ9:1.25xlo−”モル;シグマ・
ケミカル・カンパニー;0.1Mリン酸ナトリウム(p
H7,40μQ)中)に加えてPGA標識ヤギ抗マウス
捕捉試薬を調製した。室温で2日間撹拌した後、0.1
M)リス(20μc;pH7,4)を加え、得られた混
合物を使用するときまで2〜8℃で貯蔵した。
プロゲステロン抗体イオン捕捉イムノアッセイには、実
施例1に記載したようなポリマー性の第四級化合物でコ
ーティングした固相物質を使用することが含まれていた
。試料(60μQ)を反応ウェルに加えた。試料は、リ
ン酸緩衝食塩水(PBS;50mMリン酸ナトリウム、
99mM NaC1゜0.1%NaN、、pH7,4)
中で0.5.50.100.250および500n9/
RQの濃度のモノクローナル抗プロゲステロン抗体から
なっていた。
で指示試薬緩衝液(2−0μQ)としてアルカリホスフ
ァターゼ標識プロゲステロン(50mMトリス、pH7
,4,150mM NaCl51%NaN5.1mMM
gC1,,0,1+M ZnC1tおよび1%BSAか
らなるトリス緩衝液中に3μ9/x(1)を加えた。
、捕捉試薬を加えた(20μQ;上記保存溶液であるP
BS中に1/100倍希釈したPGA標識ヤギ抗マウス
抗体)。ついで混合物を34.56Cでさらに10分間
インキュベートした。ついで混合物のlOOμeアリコ
ートを固相物質に加え、希釈液で3回(×75μm2)
洗浄した。最後に酵素基質溶液(701tQ: 100
mM AMP、 l taM MgCtt、 0.1
%N a N 3および4.0mMテトラミソールから
なる溶液(pH10,3)中の1.2mM4−メチルウ
ンベリフェリルホスフェート)を固相に加え、蛍光度を
測定した。アッセイの結果を第9表にまとめて示す。ア
ッセイの結果は、抗プロゲステロン抗体試験試料の濃度
が増加するのに対応して捕捉試薬/分析対象物/指示試
薬複合体の生成も増加し、それゆえ固相に結合した検出
可能な標識の量も増加することを示している。
イオン捕捉アッセイ) 捕捉試薬:PGA標識ヤギ抗マウス抗体指示試薬:アル
カリホスファターゼ標識プロゲス実施例7 (プロゲステロンの間接競合イオン捕捉イムノアッセイ
) 実質的に実施例1に記載した方法に従って固相を調製し
た。PBS中の種々の濃度のプロゲステロンの試料(6
0μQ>をプロゲステロン標識アルカリホスファターゼ
指示試薬(実施例4のトリス緩衝液中、0.4μ9/l
Q、20μQ)、および補助特異的結合成分としてのマ
ウス抗プロゲステロン抗体(PBS中に0.3a9/x
Q、20μQ)と混合した。混合物を34.5°Cで1
0分間インキユベートシた後、PGA標識ヤギ抗マウス
抗体捕捉試薬を上記実施閘6に記載のようにして加えた
。得られた混合物を34,5°Cでさらに1o分間イン
キュベートした。ついで〆捏合物の100μQアリコー
トを固相物質に加え、ついで希釈液で3回洗浄した。最
後に酵素基質溶液(70μm2:100mMA M P
、 1 mM MgClt、0.1%Na N 3
および4 、0 mMテトラミソールからなる溶1夜(
pH103)中の1−2mM 4−メチルウンベリフェ
リルホスフェート)を固相に加え、蛍光度を測定(、た
。
は、プロゲステロン試験試料の濃度が増加するのに対応
して捕捉試薬/補助特異的結合成分/指示試薬複合体の
生成は減少し、それゆえ固相に結合した検出可能な標識
の量も減少することを示している。
セイ) 捕捉試薬:PGA標識ヤギ抗マウス抗体実施例8 (アニオン性捕捉試薬の生成のためのポリ−L−グルタ
ミン酸の活性化) 下記工程手順は、負に荷電した捕捉試薬を生成させるた
めのタンパク質−PGA結合体のバルク調製のためのも
のである。
PGAのナトリウム塩(l 0Qz9;”/、35X
10−8モル;平均分子量13.600;シグマ)をH
型の陽イオン交換樹脂(50当量/′グルタメート残基
;AG50W−X8;バイオ−ラド)とともに−夜撹拌
した。樹脂は前原て膨潤させ、蒸留水中で洗浄し、最後
に蒸留水(20x(/7yビーズ乾燥重量)中に再慧濁
した。上清を除き、凍結乾燥してPGAの遊離酸(PG
AFA)を白色粉末(80即:平均分子J111,62
0)ど(、て90%の収率で得た。遊離酸は、有R溶媒
中での溶解性を得るために用いた。
した。プロトン吸収試薬(4−メチルモルホラ5ン)を
、滴定可能な遊離カルボン酸当たり約1当員の量で上記
溶液に加えた。ついで、約lOOモル過剰のアミン反応
性修飾試薬(溶解させるに充分す量の1,4−フェニレ
ンジイソチオシアイ、−ト[DITC])を溶液に加え
た。反応混合物を室温で一夜撹拌した。はとんど乾燥す
るまで反応混合物を回転蒸発さぜ(rotavapor
ated)、塩化メチレン(25肩Q)を滴下してIT
C−PGAFAを沈澱させた。綿状の沈澱を遠心分離し
、塩化メチレンおよび未反応のDITCを除いた。実質
的にDITCが検出されなくなるまで上記α澱/遠心分
離工程を繰り返した。DITC,の検出は、塩化メチレ
ンで展開したシリカスライド上の薄層クロマトグラフィ
ーを用いて行うことができ、その場き、IT(’、−P
GAFAは元の位置に留どまるが、DITCは溶媒フロ
ントとともに移動する。残った固体を真空乾燥してI
T C−P G A F Aを黄色の粉末として得た。
試薬を調製すること: ITC−PGAFA(タンパク質に対して約1〜約20
モル過剰)を、容量をできるだけ小さく保ちながら0.
2Mリン酸ナトリウム緩衝液(ptI8.5)中に溶解
した。pHは必要なときは8.5に調節した。この溶液
に所望のタンパク質を那え、37℃で一夜インキユベー
トした。ついで、1〜2′n9のタンパク質:A製物に
対しては分析TSK400バイオーラドカラム(7,5
X300zβ、流速1 mQ/分)上で、2〜10戻分
のタンパク質調製物に対してはTSK4000ベックマ
ンカラム(31,5X300朋、流速5xQ/分)上で
のHPLCを用い、調製物を分画した。溶出緩衝液には
、0゜1Mリン酸ナトリウムおよびQ、3M NaC1
(pi46.8)が含まれていた。フラクシゴンを試験
し、適当に集めた。種々の結合比での種々のタンパク質
の結合効率を決定できるように、タンパク質を含有する
フラクシゴンについてアミノ酸含量を決定した。その結
果を第11表に示す。
表中、1番目のカラムには、種々の捕捉試薬を調製する
ための反応に用いたタンパク質の洩を挙げである。2番
目のカラムには、1番目のカラムのタンパク質と反応さ
せる活性化ITC−PGAFAのモfし過剰量が挙げで
ある。3番目のカラムには、40,000平均分子重お
よび305fflり返しグルタメー ト残基に基づいた
アミノ酸分析により計算した、反応により抗体当たりに
付着したPGA鎖の数を挙げである。4番目のカラムに
は、反応に用いた活性化PGAのf’ル過剰量に基づい
て計算したPGA鎖置換の効率%を挙げである。
態) (a)テオフィリン捕捉試薬の調製: テオフィリンの活性化は、テオフィ1ノンブ1レート(
10m9;分子量280.29 ;3.57 X l
05モル)を塩化メチレン(3,011Q)中に溶解す
ることにより行った。3モル過剰のジシクロへキシルカ
ルボジイミド(22+y;分子量206゜3)および3
モル過剰のN−ヒドロキシスクシンイミド(12,3脣
:分子量115.09)を加え、反応混合物を室温で一
夜撹拌した。混合物を濾過してジシクロヘキシル尿素を
除き、乾燥するまで回転蒸発させてN−スクシンイミジ
ルテオフィリンブチレート(テオフィリンブチレ−1−
−oSuXl 0即)を得た。
4度9;分子!11,798;1.19x 1o−7モ
ル)をD M F (Q 、 5対)およびNMM(1
,1躇;分子量L01.15;1..07X10−’モ
ル)中に溶解した。テオフィリンブチレー ト−as
u(10x9: 1次g10.51T(!DMF)を加
え、反応混合物を室温C−一夜撹拌、た3゜0.1Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液(PH7,0)に対して透析する
ことに4、り未結合テオフィリンを除いた。得られた捕
捉試薬のテオフィリン含量を分析した結果、PGA鎖当
たり3.9テオフィリン分子が付着したことが示された
。ついで、テオフィl)ンーPGA捕捉試薬(抗テオフ
ィリン抗体と結合することができる)を、25mM ト
リス、l 00mM NaC1,1mM MgCL、0
.1mM ZnCAt、0.i%N a N 、および
1%にべを含有するアッセイ緩衝液(pH7,2)中に
3μ9/ xQに希釈した。
ーティングして正の荷電を有する固相を調製した。水溶
性のセルロース誘導体であるセルコートL−200を用
いた。l QmM NaC1(50μm2)を含有する
セルフートL−200の0.5%水溶液(50μQ)を
固相物質に適用した。
プロトコールに従って調製された、アルカリホスファタ
ーゼと抗テオフィリン抗体との結合体からなっていた。
定曲線により決定されるように)0.17μ9抗体/x
Qとした。
いで、テオフィリン標準溶液(200μQ:50mM)
リス、300mM NaC1および0.1%NaN=(
pH7,2)中に0.6.1.2.2.5.4゜9.9
.9.99.2および992 u9/z(B:希釈した
テオフィリンブチレート)を容管に加えた。
7℃で10分間インキュベートした。各反応混合物のア
リコー)(200μQ)をフォート処理した固相物質に
適用し、ついで希釈液(75μQ)で1回洗浄した。酵
素基質(70μi2;100mMA M P 、 1
、0 mM MgCIg、0,1%NaN3および4
.0mMテトラミソールからなる溶液(pH10,。
ェート)を32°Cで加えて指示試薬と反応させ、蛍光
度を測定した。そのアッセイの結果を第12表に示す。
るのに対応して捕捉試薬/指示試薬複合体の生成が減少
し、それゆえ固相に結合した検出可能な標識の量も減少
することを示している。
捕捉形態) 実施例10 (フエニルジクリジン(phenylcycl、1di
ne)イオン捕捉競合アッセイ−抗原捕捉形態) (a)フエニルジクリジン捕捉試薬の調製:4−ヒドロ
キシフエニルジクリジン(1,119;分子量259.
37;4.24X 10−@モル)をテトラヒドロフラ
ン(THF;0.5ff12)中に溶A4’した。
(130モル過剰)。室温で2.5時間反応させた。窒
素流下で溶媒を蒸発させてフエニルジクリジン−4−ク
ロロホルメートの残渣を得た。
1y)をTHF(0,53!12)中に溶解した。これ
に1−メチル−2−ピロリジノン(0,5iQ)中に溶
解したNH,−PGAFA(1,7yg;分子量11.
798;1.19X10−’モル)を加えた。反応を室
温にて一部行い、ついで乾燥するまで回転蒸発させた。
7,0)中に溶解した。沈澱を濾過し、濁った水性濾波
を透明になるまで塩化メチレンで抽出した。ついでフエ
ニルジクリジン−PGA捕捉試薬(抗フエニルジクリジ
ン抗体と結合することができる)を、上記実施例9に記
載したようにしてアッセイ緩衝液中で5μ9/x(lに
希釈した。
た。
リジン抗体との結合体からなっていた。
衝液中で1/250倍に希釈した。
れた量(ヒト尿中で調製した0、0125.60S 1
20,250および500n9/xl)含有する一連の
試料(各50μg)と混合し、混合物を32℃で10分
間インキュベートした。フエニルジクリジン−PGA捕
捉試薬(100μQ)を加え、反応混合物を10分間イ
ンキュベートした。各反応混合物のアリツー)(200
μg)を固相物質に加えた。ついで固相を2回洗浄した
。酵素基質(70μQ;実施例9と同し)を加え、蛍光
度を測定した。そのアッセイの結果を第13表に示す。
が増加するのに対応して捕捉試薬/指示試薬複合体の生
成は減少し、それゆえ固相に結合して検出可能な標識の
量も減少することを示している。
−抗原捕捉形態) 実施例it (ジゴキシンイオン捕捉競合アッセイ−抗原捕捉形態) (a)ジゴキシン−IgG−PGA捕捉試薬の調製二以
下の手順で修正をした他は実質的に実施例8の工程(C
)に記載した方法に従ってジゴキシン−IgG−PGA
捕捉試薬を調製した。ITC−PGA(5社;1.25
X10−’モル;O,LMリン酸ナトリウム(pH8,
5,1,0d)中)をウサギrgG−ジゴキシンの緩衝
溶液(ly;6.25x 10−’モル;0.IMリン
酸ナトリウムおよびQ、3MNaClよりなる溶液(p
H8,5,1,449:3o2)中)に加えて捕捉試薬
を調製した。溶液を撹拌し、37°Cで一部インキユベ
ートした。ついで、バイオシル(B ioS 1l)4
00 (バイオ−ラド、300xxX7.5xmゲル濾
過カラム)上のHPLCを用い、0.1Mリン酸ナトリ
ウムおよび0.3M NaC1(pH6,8)でI W
Q1分にて溶出することにより、調製物を分画した。つ
いで、ジゴキシン−tgG−PGA捕捉試薬(抗ジゴキ
シン抗体と結合することができる)を、実施例9に記載
したようにしてアッセイ緩衝液中で3μ97Hに希釈し
た。
た。
シン抗体(イムノサーチ;エメリービル、カリフォルニ
ア94608)との結合体からなっていた。実施例9に
記載のようにして、指示試薬をアッセイ緩衝液中で33
.3ny/x&に希釈した。
0μI2)を、知られた量のジゴキシン(正常ヒト血清
中で調製した0、5.1.0.2.5.5.0および5
0 、 On9/ 3112)を含有する一連の試料(
200μQ)を混合した。混合物を37℃で15分間イ
ンキュベートした。ジゴキシン−IgG−PGA捕捉試
薬(200μ(Dを加え、反応混合物を15分間インキ
ュベートした。各反応混合物のアリコート(200μQ
)を固相物質に適用し、ついで洗浄した。酵素基質(7
0μQ;実施例9と同じ)を加え、蛍光度を測定した。
キシン試験試料の濃度が増加するのに対応して捕捉試薬
/指示試薬複合体の生成は減少し、それゆえ固相に結合
した検出可能な標識の量も減少することを示している。
ムノサーチ)との結合体からなっていた。
液中で1/100倍に希釈した。
実施例8の工程(C)に記載のプロトコールに従って調
製)を、実施例11に記載のような知られた量のジゴキ
シンを含有する一連の試料(各200μQ)と混合した
。混合物を37°Cで15分間インキュベートした。指
示試薬(200J、L12)を加え、反応混合物を15
分間インキュベートした。
施例9に記載のようにして調製)に適用し、ついで洗浄
した。酵素基質(70μQ;実施例9と同じ)を加え、
蛍光度を測定した。そのアッセイの結果を第15表に示
す。アッセイの結果は、ジゴキシン試験試料の濃度を増
加させるのに対応して捕捉試薬/指示試薬複合体の生成
は減少し、それゆえ固相に結合した検出可能な標識の量
も減少することを示している。
て、抗hCG抗体−PGA捕捉試薬を調製した。
M NaC1,50mM トリスおよび0.1%NaN
、を含有、pH7,5)で湿潤させた。このマトリ・ノ
クスをセルコー1− L −200の0.5%水溶液(
50ttQ: 10mM NaCl含有)でコーティン
グし、緩衝液で2回洗浄した。
体(実質的に実施例3の工程(b)に記載のプロトコー
ルに従って調製)との結合体からなっていた。指示試薬
を、25 mM トリス、100mMNaC1,1mM
MgC1t、o、1mM ZnC1t、0゜1%N
aN s、5%ヤギ血清および1%にべを含有するアッ
セイ緩衝液(pH7,2)中で適当に希釈した(滴定曲
線により決定されるように)。
た量のhCGを含有する一連の試料(50μQ)と混合
した。混合物を31〜32℃で10分間インキュベート
した。抗hCG抗体−PGA捕捉試薬(100μe)を
加え、反応混合物を10分間インキュベートした。各反
応混合物のアリフート(200μQ)を固相物質に加え
、ついで洗浄した。酵素基質(70μe;実施例9と同
じ)を加え、蛍光度を測定した。そのアッセイの結果を
第16表に示す。“7ノセイの結果は、hCG試験試料
濃度が増加するのに対応して捕捉試薬/分析対象物/指
示試薬複合体の生成も増加し、それゆえ固相に結合した
検出可能な標識の量も増加することを示している。
明念は、反対に荷電した固相物質および捕捉試薬を用い
ることにより、あらゆる分離法および均一結合アッセイ
(結合反応中に標識のシグナル生成能は変わらない)に
等しく適用し得ることが当業者により認識されるであろ
う。従って、上記に詳細に記載した態様は、本発明を限
定するものではなく、単に例示したものに過ぎない。
Claims (16)
- (1)式: 〔▲数式、化学式、表等があります▼〕 (式中、nは約10〜約500、zは約1〜約6、Wは
H^+、Na^+、K^+、Li^+、アミン塩および
それらの誘導体よりなる群から選ばれた基、Xは特異的
結合成分への結合を可能にする反応性基または該反応性
基を有する構造である)で示される化合物からなること
を特徴とする活性化ポリマー性アニオン分子。 - (2)式中、Xが約1〜約30原子数のスペーサーを含
み、反応性基がアミン反応性残基、チオール反応性残基
、チオール残基およびチオール前駆体残基よりなる群か
ら選ばれた基である請求項(1)記載の活性化ポリマー
性アミン分子。 - (3)ポリグルタミン酸、アニオン性タンパク質もしく
は誘導体化タンパク質、アニオン性多糖類、ポリアスパ
ラギン酸、ポリアクリル酸およびポリアミノ酸よりなる
群から選ばれたものである請求項(1)記載の活性化ポ
リマー性アニオン分子。 - (4)誘導体化タンパク質が誘導体化アルブミンであり
、アニオン性多糖類がヘパリンまたはアルギン酸である
請求項(3)記載の活性化ポリマー性アニオン分子。 - (5)(a)特異的結合成分と、 (b)式: 〔▲数式、化学式、表等があります▼〕 (式中、nは約10〜約500、zは約1〜約6、Wは
H^+、Na^+、K^+、Li^+、アミン塩および
それらの誘導体よりなる群から選ばれた基、Xは約1〜
約30原子数のスペーサー、およびアミン反応性残基、
チオール反応性残基、チオール残基およびチオール前駆
体残基よりなる群から選ばれた反応性基からなる、反応
性基を有する構造である)で示される活性化ポリマー性
アニオン分子との反応生成物からなることを特徴とする
、負に荷電した捕捉試薬。 - (6)特異的結合成分が、Xと反応することのできるア
ミノ基、チオール基、チオール前駆体およびチオール反
応性基よりなる群から選ばれた少なくとも1つの反応性
残基を有する、請求項(5)記載の負に荷電した捕捉試
薬。 - (7)(a)アミン反応性基を有する特異的結合成分と
、 (b)式: 〔▲数式、化学式、表等があります▼〕 (式中、nは約10〜約500、zは約1〜約6、Wは
H^+、Na^+、K^+、Li^+、アミン塩および
それらの誘導体よりなる群から選ばれた基、XはHであ
る)で示されるポリマー性アニオン分子との反応生成物
からなることを特徴とする、負に荷電した捕捉試薬。 - (8)ポリマー性アニオン分子が、ポリグルタミン酸、
アニオン性タンパク質もしくは誘導体化タンパク質、ア
ニオン性多糖類、ポリアスパラギン酸、ポリアクリル酸
およびポリアミノ酸よりなる群から選ばれたものである
請求項(5)、(6)または(7)記載の負に荷電した
捕捉試薬。 - (9)誘導体化タンパク質が誘導体化アルブミンであり
、アニオン性多糖類がヘパリンまたはアルギン酸である
請求項(8)記載の負に荷電した捕捉試薬。 - (10)試験試料中の分析対象物の検出方法であって、 (a)分析対象物を、 第一の荷電物質に結合したハプテンからなる捕捉試薬、
および 検出可能なシグナルを生成し得る標識に結合した特異的
結合成分からなる指示試薬 と接触させて反応混合物を生成させ、 その際、該捕捉試薬は、分析対象物、補助特異的結合成
分、該指示試薬およびそれらの複合体よりなる群から選
ばれたものと結合することができ、該指示試薬は、分析
対象物、補助特異的結合成分、該捕捉試薬およびそれら
の複合体よりなる群から選ばれたものと結合することが
でき、 (b)該反応混合物を、該第一の荷電物質に関して反対
に荷電した固相と接触させることにより該固相を該第一
の荷電物質に誘引付着させて該捕捉試薬およびその複合
体を該反応混合物から分離させ、ついで (c)該固相または該反応混合物に結合した標識を検出
して試料中の分析対象物の存在または量を決定する、こ
とを特徴とする方法。 - (11)試験試料中の分析対象物の検出方法であって、 (a)分析対象物を、 第一の荷電物質に結合した特異的結合成分からなる捕捉
試薬、および 検出可能なシグナルを生成し得る標識に結合したハプテ
ンからなる指示試薬 と接触させて反応混合物を生成させ、 その際、該捕捉試薬は、分析対象物、補助特異的結合成
分、該指示試薬およびそれらの複合体よりなる群から選
ばれたものと結合することができ、該指示試薬は、分析
対象物、補助特異的結合成分、該捕捉試薬およびそれら
の複合体よりなる群から選ばれたものと結合することが
でき、 (b)該反応混合物を、該第一の荷電物質に関して反対
に荷電した固相と接触させることにより該固相を該第一
の荷電物質に誘引付着させて該捕捉試薬およびその複合
体を該反応混合物から分離させ、ついで (c)該固相または該反応混合物に結合した標識を検出
して試料中の分析対象物の存在または量を決定する、こ
とを特徴とする方法。 - (12)該第一の荷電物質に関して反対に荷電した第二
の荷電物質が、該固相物質上に保持されている請求項(
10)または(11)記載の方法。 - (13)第一の荷電物質がポリマー性アニオン物質であ
り、第二の荷電物質がポリマー性カチオン物質である請
求項(12)記載の方法。 - (14)ポリマー性カチオンが、ガフコート、ジエチル
アミノエチルデキストラン、ジアリルジメチルアンモニ
ウムクロリド−ヒドロキシエチルセルロースポリマーお
よびヘキサジメスリンブロミドよりなる群から選ばれた
ものである請求項(13)記載の方法。 - (15)ポリマー性アニオン物質が、ポリグルタミン酸
、アニオン性タンパク質もしくは誘導体化タンパク質、
アニオン性多糖類、ポリアスパラギン酸、ポリアクリル
酸およびポリアミノ酸よりなる群から選ばれたものであ
る請求項(13)記載の方法。 - (16)誘導体化タンパク質が誘導体化アルブミンであ
り、アニオン性多糖類がヘパリンまたはアルギン酸であ
る請求項(15)記載の方法。
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