ES2858555T3 - Cuantificación de grupos funcionales sobre soportes sólidos. - Google Patents
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Abstract
Método para cuantificar grupos funcionales diana inmovilizados sobre un soporte sólido que comprende: poner en contacto los grupos funcionales diana con una cantidad de un compuesto selectivo, en el que una cantidad del compuesto selectivo se une a los grupos funcionales diana y una cantidad del compuesto selectivo no se une a los grupos funcionales diana; obtener un subproducto que tiene una cantidad del compuesto selectivo no unido; añadir un indicador al subproducto que se une al compuesto selectivo no unido en el subproducto para proporcionar un resultado medible; medir el resultado medible; determinar a partir del resultado medido una cantidad de compuesto selectivo no unido en el subproducto; determinar una cantidad de compuesto selectivo inmovilizado sobre el soporte sólido a partir de la cantidad de compuesto selectivo no unido; y determinar a partir de la cantidad del compuesto selectivo inmovilizado una cantidad de los grupos funcionales diana inmovilizados sobre el soporte sólido, en el que a) los grupos funcionales diana inmovilizados sobre el soporte sólido comprenden grupos funcionales aldehídicos y en el que los grupos funcionales aldehídicos se inmovilizan sobre el soporte sólido mediante una reacción que añade los grupos funcionales aldehídicos a grupos amino presentes sobre el soporte sólido, y en el que el compuesto selectivo reacciona selectivamente con los grupos funcionales aldehídicos inmovilizados y comprende un grupo funcional amino, y en el que el indicador comprende una disolución que comprende ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBSA); o b) los grupos funcionales diana inmovilizados sobre el soporte sólido comprenden grupos funcionales amino, y en el que el compuesto selectivo comprende un compuesto aldehídico que reacciona selectivamente con grupos funcionales amino inmovilizados sobre el soporte sólido, y en el que el indicador comprende 4-amino-3-hidrazino-5-mercapto-1,2,4- triazol, 4-amino-5-hidrazino-1,2,4-triazol-3-tiol (Purpald).
Description
DESCRIPCIÓN
Cuantificación de grupos funcionales sobre soportes sólidos
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de las pruebas diagnósticas, y más en particular a métodos para cuantificar grupos funcionales inmovilizados sobre un soporte sólido.
Antecedentes de la invención
En los campos de la medicina y la química clínica, muchos estudios y determinaciones de especies o analitos fisiológicamente reactivos se llevan a cabo aprovechando la interacción entre miembros de par de unión específico. Por ejemplo, el analito diana en una muestra de paciente puede ser él mismo un miembro de un par de unión específico, que puede detectarse empleando un miembro correspondiente del par de unión específico inmovilizado sobre un soporte sólido. En este caso, el miembro de par de unión inmovilizado puede ser un antígeno para la detección de un anticuerpo diana en una muestra, por ejemplo. Se han desarrollado diversos materiales de soporte sólido para estas aplicaciones y requieren diversas técnicas de unión para inmovilizar el miembro de par de unión específico sobre el soporte sólido. Por ejemplo, las partículas paramagnéticas (PMP) son materiales de soporte sólido conocidos que pueden funcionalizarse con grupos funcionales tales como grupos funcionales amina. En algunos casos, estos grupos funcionales pueden seleccionarse para unirse con un grupo de acoplamiento (por ejemplo, glutaraldehído), que se une a un miembro de par de unión. El miembro de par de unión puede ser selectivo para un analito diana en una muestra, que normalmente es un segundo miembro del par de unión tal como se mencionó anteriormente. En la inmovilización del miembro de par de unión sobre el soporte sólido, puede ser necesario garantizar que esté disponible una cantidad apropiada de los grupos funcionales para la fijación directa o indirecta del miembro de par de unión. Muy pocos grupos funcionales disponibles, por ejemplo, pueden dar como resultando muy pocos sitios de fijación cuando se añade el miembro de par de unión. Esto puede dar como resultado un soporte sólido que no puede determinar con precisión una cantidad de un analito diana a determinadas concentraciones, en particular a concentraciones superiores en el intervalo detectable del analito diana. Por otra parte, proporcionar mayores concentraciones de los grupos funcionales para la inmovilización del miembro de unión específico puede aumentar sustancialmente los costes de producción sin ningún beneficio añadido. Hennig y colaboradores (A. Hennig, et. al., Chem Commun., 2011, Vol. 47, páginas 7842-7844) han descrito métodos de cuantificación de grupos funcionales de superficie sobre microesferas de polímero. En este método, se ha aprovechado el uso de derivados de adamantilmetilamina como compuesto selectivo intermedio.
Por consiguiente, existe la necesidad de determinar y/o confirmar el número de grupos funcionales, directa o indirectamente, presentes sobre un soporte sólido con el fin de inmovilizar de manera óptima el miembro de par de unión específico al soporte sólido. Aunque existen métodos conocidos para determinar cuantitativamente una cantidad de grupos funcionales en disolución, tales métodos normalmente no son adecuados para soportes sólidos puesto que los productos de reacción de color o fluorescentes formados en tales métodos de cuantificación normalmente se unen al soporte sólido, haciendo de ese modo que la detección y cuantificación sean difíciles y/o imposibles.
Breve descripción de los dibujos
Los aspectos de la invención se explican en la siguiente descripción en vista de los dibujos que muestran:
La figura 1 ilustra un soporte sólido de la técnica anterior que tiene un primer miembro de par de unión inmovilizado sobre el mismo para la detección de un segundo miembro de par de unión complementario en una muestra según un aspecto de la presente invención.
La figura 2 ilustra un soporte sólido que tiene grupos funcionales de superficie y un compuesto selectivo unido a los grupos funcionales de superficie según un aspecto de la presente invención.
La figura 3 ilustra un sobrenadante que comprende un compuesto selectivo unido a un indicador según un aspecto de la presente invención.
La figura 4 ilustra un soporte sólido que tiene un agente de acoplamiento y un compuesto selectivo unido a un agente de acoplamiento según un aspecto de la presente invención.
La figura 5 ilustra un método para determinar varios grupos funcionales sobre un soporte sólido según un aspecto de la presente invención.
La figura 6 es un gráfico que muestra concentraciones de patrones de propionaldehído frente a absorbancia según un aspecto de la presente invención.
La figura 7 es un gráfico que muestra la absorbancia de sobrenadantes de muestra a partir de estudios de dependencia del tiempo según otro aspecto de la presente invención.
La figura 8 es un gráfico que muestra concentraciones de patrones de propionaldehído frente a absorbancia según otro aspecto de la presente invención.
La figura 9 es un gráfico que muestra la dependencia del tiempo de la formación de bases de Schiff para la cuantificación de aldehídos según un aspecto de la presente invención.
La figura 10 es un gráfico que muestra concentraciones de patrones de propilamina frente a absorbancia según un aspecto de la presente invención.
La figura 11 es una gráfica de efectos que indica el % de glutaraldehído como factor principal de la formación de grupos aldehído según un aspecto de la presente invención.
La figura 12 es una gráfica de interacción que muestra los mg/ml de PMP que cortan con el % de ocupación de recipientes según otro aspecto de la presente invención.
La figura 13 es un diagrama de Pareto que ilustra B (el % de glutaraldehído) como un efecto principal de la formación de grupos aldehído según otro aspecto de la presente invención.
La figura 14 ilustra la concentración óptima de PMP, la concentración de glutaraldehído y la ocupación de recipientes para optimizar la carga de aldehído sobre PMP según otro aspecto de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
Según un aspecto de la presente invención, se proporcionan procedimientos para cuantificar una cantidad de grupos funcionales inmovilizados sobre un soporte sólido según las reivindicaciones. En determinados aspectos, los procedimientos permiten la determinación de un número óptimo de grupos funcionales que van a disponerse sobre un soporte sólido durante la fabricación de un producto de soporte sólido. De este modo, pueden eliminarse y/o reducirse los desechos, y puede mejorarse el rendimiento del soporte sólido. Por ejemplo, mediante la cuantificación del número de grupos funcionales disponibles sobre un soporte sólido, puede garantizarse que se dispone de un número adecuado de grupos funcionales para la fijación directa o indirecta de un primer miembro de un par de unión específico. A continuación, pueden fabricarse soportes sólidos similares con una carga optimizada del miembro de par de unión específico. En determinadas realizaciones, los procedimientos descritos en el presente documento permiten por tanto la cuantificación de grupos funcionales disponibles antes de la fijación directa o indirecta de un miembro de un par de unión específico proporcionado sobre el soporte sólido.
Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” se refiere a un valor que es el 10% del valor establecido.
Tal como se usa en el presente documento, se entiende que los términos “fijación”, “unión”, “inmovilizado”, “acoplamiento”, o similares no se limitan a la unión covalente y pueden incluir cualquier tipo de atracción, afinidad, selección conformacional, ajuste inducido o unión entre dos o más moléculas.
Tal como se usa en el presente documento, mediante la expresión “cantidad eficaz”, quiere decirse una cantidad de material adecuada para dar lugar a un resultado deseado.
Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra” incluye cualquier muestra que tenga o que se sospeche que tenga el analito diana, y puede ser una muestra biológica o no biológica.
Tal como se usa en el presente documento, el término “sujeto” se refiere a cualquier mamífero humano o no humano.
En referencia a la figura 1, se muestra un soporte 10 sólido a modo de ejemplo que tiene grupos 12 funcionales de superficie sobre una superficie del mismo. En la realización mostrada, también se proporciona un agente 14 de acoplamiento para la inmovilización de un primer miembro 16 de par de unión al soporte 10 sólido. Sin embargo, se entiende que la presente invención no requiere tal agente 14 de acoplamiento, y que el primer miembro 16 de par de unión puede unirse en cambio directamente a los grupos 12 funcionales de superficie. El primer miembro 16 de par de unión puede ser adecuado para la conjugación con un segundo miembro 18 de par de unión en una muestra 20 tal como se muestra. La muestra 20 puede ser una muestra convencional, o una muestra (por ejemplo, muestra biológica) que se sospecha que tiene el segundo miembro 18 de par de unión. Como tal, el segundo miembro 18 de par de unión puede considerarse un analito diana para el soporte 10 sólido.
El soporte 10 sólido puede estar compuesto por un material orgánico o inorgánico insoluble en agua e impermeable, que también puede ser transparente o parcialmente transparente. Además, el soporte 10 sólido puede estar en forma de una perla, partícula, fibra, película, membrana, tubo, pocillo, una tira, varilla, una superficie plana tal como una placa, y similares. Dependiendo del tipo de ensayo para el que se desea usar el soporte 10 sólido, el soporte 10 sólido puede poder suspenderse o no en el medio en el que se emplea. Los ejemplos de soportes que pueden suspenderse incluyen, pero no se limitan a, materiales poliméricos tales como látex, bicapas lipídicas o liposomas, gotitas de aceite, células e hidrogeles, partículas magnéticas, y similares. Otros materiales de soporte sólido incluyen polímeros, tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4
metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), nailon, poli(butirato de vinilo), etc.; ya sea usado solo o conjuntamente con otros materiales.
En determinadas realizaciones, el soporte 10 sólido comprende una o más partículas sólidas. Cuando están en forma de partículas, las partículas pueden tener un diámetro promedio de al menos aproximadamente 0,02 micrómetros a aproximadamente 100 micrómetros, por ejemplo. En realizaciones particulares, las partículas sólidas pueden tener un diámetro promedio de desde aproximadamente 0,05 micrómetros hasta aproximadamente 20 micrómetros, o desde aproximadamente 0,3 micrómetros hasta aproximadamente 10 micrómetros. Además, las partículas pueden tener un intervalo de área superficial de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 m2/g, y en algunas realizaciones las partículas pueden tener un área superficial en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 m2/g. La partícula puede ser orgánica o inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, y puede tener una densidad que se aproxima a la del agua, en general desde aproximadamente 0,7 g/ml hasta aproximadamente 1,5 g/ml, y puede estar compuesta por material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco.
Las partículas pueden tener una forma regular o irregular. Pueden ser, por ejemplo, esferas, esferoides o esferas que poseen cavidades o poros. Las partículas pueden comprender varias capas, tales como las denominadas partículas de núcleo y cubierta, que tienen un núcleo y una o más capas de envuelta. En determinadas realizaciones, las partículas pueden formarse a partir de materiales biológicos tales como células y microorganismos, por ejemplo, eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, estreptococos, Staphilococcus aureus, E. coli, o virus. Las partículas también pueden ser partículas compuestas por polímeros orgánicos e inorgánicos, liposomas, partículas de látex, partículas magnéticas o no magnéticas, vesículas de fosfolípidos, quilomicrones, lipoproteínas, cristales colorantes, soles metálicos, partículas de sílice, partículas de vidrio, partículas magnéticas, gotas de aceite, partículas lipídicas, dextrano y agregados proteicos.
En determinadas realizaciones, las partículas comprenden nanopartículas y/o micropartículas. Tales partículas pueden tener un diámetro aproximado de al menos aproximadamente 20 nm y no más de aproximadamente 20 micrómetros, o entre 40 nm y 10 micrómetros, o entre 0,1 y 10 micrómetros, o entre 0,1 y 5 micrómetros, o entre 0,15 y 2 micrómetros. En realizaciones particulares, las micropartículas pueden ser partículas que están suspendidas en disoluciones acuosas.
Las partículas pueden comprender partículas de polímero que pueden dispersarse y/o suspenderse dentro de una disolución acuosa. En determinadas realizaciones, las partículas pueden dispersarse fácilmente en un medio acuoso, y pueden ser adsorbentes o funcionalizables, tal como se explicará a continuación, para permitir la conjugación con un miembro de un par de unión específico, ya sea directa o indirectamente (a través de un agente de acoplamiento). Las partículas también pueden derivarse de materiales que se producen de manera natural, materiales que se producen de manera natural que se modifican sintéticamente y materiales sintéticos. Los polímeros orgánicos a modo de ejemplo incluyen polisacáridos, en particular polisacáridos reticulados, tales como agarosa, que está disponible como Sepharose, dextrano, disponible como Sephadex y Sephacryl, celulosa y almidón; polímeros de adición, tales como poliestireno, poli(alcohol vinílico), homopolímeros y copolímeros de derivados de acrilato y metacrilato, tales como ésteres y amidas que tienen funcionalidades hidroxilo libres.
En determinadas realizaciones, el soporte 10 sólido comprende una o más partículas magnéticas tales como partículas paramagnéticas. Cuando las partículas son magnéticas, el material magnético contenido en las partículas puede ser cualquier material magnético susceptible de atracción por un imán permanente o un electroimán. Los ejemplos de tales materiales magnéticos incluyen óxidos de hierro magnéticos, dióxidos de cromo magnéticos (CrO2), MnFeO4, ZnFeO4, CoFe2O4, y materiales magnéticos similares.
Partículas magnéticas a modo de ejemplo adicionales para su uso con el soporte 10 sólido incluyen aquellas que tienen un núcleo magnético rodeado por un material polimérico. El material polimérico puede ser cualquier material polimérico adecuado para su uso en ensayos tal como poliestireno y poliestireno-divinilbenceno. En otras realizaciones, las partículas magnéticas pueden comprender partículas magnéticas de dióxido de cromo (partículas de cromo). Tal como se comentará adicionalmente a continuación, estas partículas pueden tener grupos superficiales colgantes tales como grupos funcionales amina que son reactivos con aldehído, o que pueden modificarse para incluir grupos reactivos con aldehído.
Las partículas de óxido de cromo a modo de ejemplo incluyen aquellas que comprenden un núcleo de óxido de cromo que tiene una superficie reducida, que luego se recubren con sílice y se recubren adicionalmente con un silano, tal como se enseña en la patente estadounidense n.° 4.661.408. Otras realizaciones particulares de partículas magnéticas y no magnéticas que pueden emplearse se exponen en la patente estadounidense n.° 6.231.982.
El soporte 10 sólido puede comprender o modificarse de otro modo para incluir grupos 12 funcionales de superficie que se unen (mediante unión covalente o de otro modo) al soporte 10 sólido, y que pueden unirse a un primer miembro 16 de par de unión directamente o por medio de un agente de acoplamiento, por ejemplo, el agente 14 de acoplamiento. En este último caso, el soporte 10 sólido incluye grupos 12 funcionales de superficie, que se unen a uno o más agentes 14 de acoplamiento. Cada agente 14 de acoplamiento, a su vez, puede unirse a uno o más primeros miembros 16 de par de unión específico.
Los grupos 12 funcionales de superficie dados a conocer incluyen grupos amina, hidrazina, hidrazida, aminooxilo, cianuro o alcohol. En realizaciones particulares de la presente invención, los grupos 12 funcionales de superficie comprenden grupos funcionales amina.
Tal como se muestra en la figura 1, pueden utilizarse uno o más agentes 14 de acoplamiento entre los grupos 12 funcionales sobre el soporte 10 sólido para inmovilizar uno o más primeros miembros 16 de par de unión sobre el soporte 10 sólido. El agente 14 de acoplamiento comprende uno o más miembros del grupo que consiste en carbono, oxígeno, azufre, nitrógeno y fósforo. Además, el agente 14 de acoplamiento puede ser alifático o aromático. Cuando están presentes heteroátomos, el oxígeno puede estar presente como oxo u oxi, unido a carbono, azufre, nitrógeno o fósforo; el nitrógeno puede estar presente como nitro, nitroso o amino, y unirse a carbono, oxígeno, azufre o fósforo; el azufre puede ser análogo al oxígeno; mientras que el fósforo puede unirse a carbono, azufre, oxígeno o nitrógeno, habitualmente como fosfonato y mono o diéster de fosfato. En determinadas realizaciones, cualquier compuesto útil en la formación de una unión entre el primer miembro 16 de par de unión y los grupos 12 funcionales sobre el soporte 10 sólido puede utilizarse como agente 14 de acoplamiento.
Agentes 14 de acoplamiento a modo de ejemplo adicionales incluyen, pero no se limitan a, aldehídos, anhídridos y ácidos dicarboxílicos, poliaminas, polialdehídos y agentes heterobifuncionales tales como clorhidrato de 2-iminotiolano, sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato, éster de m-maleimidosuccinimida, aminobenzoato de N-succinimidil-(4-yodoacetilo), y especies similares conocidas por los expertos en la técnica.
Agentes 14 de acoplamiento adicionales pueden incluir compuestos que comprenden un grupo nitrógeno, un grupo fosfato; un grupo amino; un agente alquilante tal como halo o tosilalquilo, oxi (hidroxilo o el análogo de azufre, mercapto); oxocarbonilo (por ejemplo, aldehído o cetona); u olefina activa tal como una vinilsulfona o éster a-, p-insaturado. En una realización, estos agentes 14 de acoplamiento pueden inmovilizar el primer miembro 16 de par de unión sobre el soporte 10 sólido mediante la reacción con los grupos 12 funcionales de superficie y el primer miembro 16 de par de unión. Cuando se hacen reaccionar una amina y un ácido carboxílico o su derivado de nitrógeno o ácido fosfórico, se forman amidas, amidinas y fosforamidas. Cuando se unen mercaptano y olefina activada, se forman tioéteres. Cuando se une un mercaptano y un agente alquilante, se forman tioéteres. Cuando se unen un aldehído y una amina en condiciones reductoras, se forma una alquilamina. Cuando se une cetona o aldehído y una hidroxilamina (incluyendo derivados de los mismos donde un sustituyente esté en lugar del hidrógeno del grupo hidroxilo), se forma una funcionalidad oxima (=N-O-). Cuando se unen un ácido carboxílico o ácido fosfórico y un alcohol, se forman ésteres. Se conocen en la técnica diversos agentes de acoplamiento que pueden utilizarse en el presente documento; véase, por ejemplo, Cautrecasas, J. Biol. Chem. (1970) 245:3059.
En una realización particular, el agente 14 de acoplamiento es uno que reaccionará con grupos amina sobre el soporte 10 sólido por un lado y que reaccionará con grupos amina del primer miembro 16 de par de unión por otro lado. Por tanto, en determinadas realizaciones, el agente 14 de acoplamiento puede comprender un aldehído tal como glutaraldehído que incluye al menos dos grupos carbonilo reactivos (uno de los cuales reaccionará con los grupos 12 funcionales sobre el soporte 10 sólido y el otro reaccionará con el primer miembro 16 de par de unión).
El primer miembro 16 de par de unión específico puede incluir cualquier compuesto que sea selectivo para un analito diana en una muestra, tal como un segundo miembro 18 de par de unión correspondiente. En una realización, el primer miembro 16 de par de unión puede comprender por tanto cualquier miembro de un par de componentes, que puede formar un enlace o unirse de otro modo por medio de una fuerza de atracción, ajuste o similar con al menos un segundo miembro del par de unión específico. En una realización determinada, el primer miembro 16 de par de unión puede unirse a más de un segundo miembro 18 de par de unión. El primer miembro 16 de par de unión y el uno o más segundos miembros 18 de par de unión pueden ser cada uno miembros complementarios de un par de unión específico tal como se conoce en la técnica tal como: antígeno-anticuerpo; enzima-sustrato; interacciones de polinucleótidos, y similares. En la patente estadounidense n.° 7.842.475 se exponen miembros 16, 18 de par de unión a modo de ejemplo.
La muestra 20 puede ser cualquier material adecuado que se sospecha que tiene el analito diana, por ejemplo, el segundo miembro 18 de par de unión. En una realización, el analito diana puede ser cualquier molécula encontrada directamente en una muestra tal como tejido biológico, incluyendo fluidos corporales, de un sujeto adecuado. El sujeto puede ser cualquier mamífero humano o no humano y la muestra biológica puede comprender sangre completa, suero, plasma, esputo, líquido linfático, semen, moco vaginal, heces, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, deposiciones, líquido cefalorraquídeo cerebral, lágrimas, moco, y similares; tejido biológico tal como cabello, piel, cortes o tejidos extirpados de órganos u otras partes del cuerpo; etc. La muestra 20 puede experimentar cualquier pretratamiento o preparación necesaria para someter la muestra al soporte 10 sólido tal como apreciaría un experto en la técnica.
Los aspectos de la presente invención en el presente documento se refieren a procedimientos para determinar que existen suficientes sitios de unión para la fijación del primer miembro 16 de par de unión. Por tanto, en referencia de nuevo a la figura 1, puede resultar crítico conocer el número de grupos 12 funcionales de superficie sobre el soporte 10 sólido y/o el número de grupos funcionales asociados con el agente 14 de acoplamiento disponibles para unirse al primer miembro 16 de par de unión. Durante la preparación del soporte 10 sólido para inmovilizar el primer miembro 16 de par de unión sobre el mismo, puede ser útil conocer el número de grupos funcionales de superficie y/o agentes de acoplamiento que se inmovilizan sobre el soporte 10 sólido. Además, antes de la introducción del primer miembro 16 de par de unión para su inmovilización sobre el soporte, conocer de antemano el número de sitios de unión disponibles puede ayudar a proporcionar una cantidad eficaz del primer miembro 16 de par de unión. Reiterar que muy pocos primeros miembros 16 de par de unión para el número de grupos funcionales disponibles para unirse a ellos puede dar como resultado un soporte 10 sólido no saturado que no puede detectar el analito diana, especialmente a concentraciones más altas en el intervalo detectable. Mientras, los procedimientos descritos en el presente documento pueden impedir la adición de una cantidad
excesiva del miembro 16 de par de unión, dando como resultado de ese modo desechos durante la fabricación de soportes sólidos similares.
En referencia ahora a las figuras 2-3, se ilustran componentes utilizados en un método para determinar varios grupos funcionales sobre un soporte sólido según un aspecto de la presente invención.
En la realización de la figura 2, se muestra un soporte 10 sólido que tiene grupos 12 funcionales de superficie tal como se describió anteriormente. Además, se proporciona un compuesto 22 selectivo que puede unirse, mediante unión covalente o de otro modo, a los grupos 12 funcionales de superficie (mostrado como compuesto 24 selectivo inmovilizado). Durante esta interacción entre el compuesto 22 selectivo y los grupos 12 funcionales, una cantidad del compuesto 22 selectivo puede no unirse a los grupos 12 funcionales de superficie. Esta cantidad estará “libre” y al no estar unida al soporte 10 puede capturarse en un subproducto 26, tal como un sobrenadante. Tal como se muestra en la figura 3, se muestra un subproducto 26 que comprende una cantidad de compuesto 28 selectivo no unido. A este subproducto 26, se le proporciona un indicador 30 que puede unirse al compuesto 28 selectivo no unido para proporcionar un resultado medible. El procedimiento para determinar una cantidad de los grupos 12 funcionales utilizando el compuesto 22, 28 selectivo y el indicador 30 se describirá en detalle adicionalmente a continuación.
En otra realización, tal como se muestra en la figura 4, se muestra un soporte 10 sólido que tiene un agente 14 de acoplamiento unido al soporte 10 sólido por medio de grupos 12 funcionales de superficie. En esta realización, el compuesto 22 selectivo es por tanto uno que puede unirse, mediante unión covalente o de otro modo, a grupos 15 funcionales del agente 14 de acoplamiento para proporcionar el compuesto 24 selectivo inmovilizado. Además, en esta realización, durante la puesta en contacto entre el compuesto 22 selectivo y los grupos 15 funcionales, también se aprecia que una cantidad del compuesto 22 selectivo puede no unirse a los grupos 12 funcionales de superficie. Esta cantidad estará “libre” y puede capturarse en un subproducto 26, tal como en un sobrenadante. En referencia de nuevo a la figura 3, el subproducto 26 puede recogerse y por tanto comprende una cantidad de compuesto 28 selectivo no unido. A este subproducto 26, se le proporciona un indicador 30 que puede unirse al compuesto 28 selectivo no unido en el subproducto 26 para proporcionar un resultado medible. El procedimiento para determinar una cantidad de los grupos 15 funcionales en los agentes 14 de acoplamiento utilizando el compuesto 22, 28 selectivo y el indicador 30 también se describirá en detalle adicionalmente a continuación.
En referencia ahora a la figura 5, se muestra un método 100 para cuantificar una cantidad de grupos funcionales diana sobre un soporte 10 sólido. Se entiende que el término “grupos funcionales diana” puede incluir cualquier grupo funcional inmovilizado directa o indirectamente sobre el soporte 10 sólido, y por tanto puede referirse a grupos 12 funcionales de superficie o grupos 15 funcionales en un agente 14 de acoplamiento tal como se describió anteriormente. Para los fines del método 100, puede seleccionarse un conjunto de grupos funcionales diana para su cuantificación. En una realización, los grupos funcionales diana son grupos 12 funcionales de superficie sobre el soporte 10 sólido, que se han inmovilizado sobre el soporte 10 sólido mediante una reacción que añade los grupos 12 funcionales directamente al soporte 10 sólido. Por ejemplo, pueden proporcionarse grupos funcionales amino inmovilizados mediante una reacción entre un compuesto de aminosilano y el soporte 10 sólido. En otras realizaciones, los grupos funcionales diana están presentes en el agente 14 de acoplamiento y se unen a los grupos 12 funcionales de superficie sobre el soporte 10 sólido. Además, el agente 14 de acoplamiento comprende grupos funcionales diana para unirse con el primer miembro 16 de par de unión. Según la presente invención los grupos funcionales diana comprenden grupos funcionales amino o grupos funcionales aldehídicos. Los grupos funcionales del agente 14 de acoplamiento para unirse tanto al soporte 10 sólido como al primer miembro 16 de par de unión pueden ser iguales, pero se entiende que la presente invención no se limita a ello.
En una realización, el método 100 comprende etapa 102 de poner en contacto los grupos funcionales diana inmovilizados sobre el soporte 10 sólido con una cantidad eficaz de un compuesto 22 selectivo. Esta puesta en contacto da como resultado que al menos parte del compuesto 22 selectivo se una al soporte 10 sólido por medio de los grupos (12 o 15) funcionales diana y un subproducto 26 (por ejemplo, un sobrenadante) que comprende el compuesto 22 selectivo no unido (si lo hay). La etapa 102 de puesta en contacto puede tener lugar a una temperatura adecuada, por ejemplo, de temperatura ambiente a 50 °C, y durante un periodo de tiempo adecuado, por ejemplo, desde 1 hasta 96 horas, para que se complete la unión. Además, la etapa 102 de puesta en contacto puede tener lugar en un recipiente adecuado. En una realización, la puesta en contacto comprende hacer reaccionar el compuesto 22 selectivo y los grupos (12 o 15) funcionales diana.
En una realización, el método 100 puede incluir además por tanto la etapa 104 de obtener el subproducto 26, que puede tener una cantidad del compuesto 28 selectivo no unido. En una realización, el subproducto 26 puede comprender un sobrenadante que tiene una cantidad del compuesto 22 selectivo, que no se unió (ni de manera covalente ni de otro modo) a los grupos funcionales diana (“compuesto 28 selectivo no unido”). En una realización particular, los componentes pueden añadirse a un recipiente, colocarse en una incubadora y mezclarse durante una cantidad de tiempo adecuada. A continuación, un subproducto 25 resultante tal como un sobrenadante puede separarse del soporte 10 sólido mediante separación magnética, centrifugación, o similar.
Para determinar la cantidad del compuesto 28 selectivo no unido, el método 100 puede comprender además la etapa 106 de añadir un indicador 30 para que se una al compuesto 28 selectivo no unido en el subproducto 26 (por ejemplo, sobrenadante) para proporcionar un resultado medible. La adición del indicador 30 también puede tener lugar a una temperatura adecuada, por ejemplo, de temperatura ambiente a 50 °C, y durante un periodo de tiempo adecuado, por
ejemplo, desde 1 hasta 96 horas, eficaces para proporcionar el resultado medible. Sin limitación, el resultado medible puede comprender un valor de absorbancia, un valor de fluorescencia y un valor de señal de corriente eléctrica. En determinadas realizaciones, el resultado medible puede comprender un resultado colorimétrico.
Por consiguiente, el indicador 30 puede ser cualquier compuesto adecuado para lograr un resultado medible. El indicador de la presente invención es TNBSa y Purpald. Por ejemplo, el indicador 30 puede comprender un miembro seleccionado del grupo que consiste en propilamina, propionaldehído y ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBSA) para proporcionar un resultado colorimétrico. Además, algunos de estos indicadores pueden ser más adecuados que otros para grupos funcionales/compuesto selectivos particulares. Por ejemplo, el propionaldehído puede ser un indicador 30 adecuado cuando el compuesto 28 selectivo no unido comprende uno con uno o más grupos amino en el mismo que reaccionarán con el compuesto aldehídico selectivo. A su vez, se aprecia que el compuesto 22 selectivo puede ser cualquier compuesto que se una, al menos temporalmente, a un grupo funcional diana y al que pueda unirse el indicador 30. De este modo, el indicador 30 puede proporcionar una señal medible indicativa de una cantidad de compuesto selectivo asociado con él.
Tras la adición del indicador 30, el método 100 incluye además la etapa 108 de medir el resultado medible. La medición puede tomarse usando instrumentación adecuada conocida en la técnica tal como un lector de pocillos de microplacas que utiliza un modo de detección seleccionado. Los modos de detección comunes incluyen, pero no se limitan a, absorbancia, intensidad de fluorescencia, luminiscencia, fluorescencia de resolución temporal y polarización de fluorescencia. Los detectores pueden formar parte de un sistema que también comprende una unidad informática que comprende uno o más módulos configurados para recibir datos de los detectores y determinar al menos un resultado a partir de los datos. El sistema también puede añadir cualquiera o todos los componentes para los métodos según las instrucciones proporcionadas por la unidad informática. De este modo, la unidad informática también puede funcionar como un circuito de control electrónico. La unidad informática puede comprender, por ejemplo, un ordenador especializado que comprende un microprocesador, un microordenador, un controlador industrial, un controlador lógico programable, un circuito lógico discreto u otro dispositivo de control adecuado. En una realización, la unidad informática puede comprender además uno o más canales de entrada, una memoria y canal(es) de salida. La memoria puede incluir una memoria legible por ordenador o un dispositivo de almacenamiento, por ejemplo, un disquete, una memoria de solo lectura de disco compacto (CD-ROM), o similar. En una realización, la unidad informática puede comprender instrucciones legibles por ordenador para realizar cualquier aspecto de los métodos o para controlar cualquier aspecto de los componentes descritos en el presente documento.
El método 100 comprende además la etapa 110 de determinar a partir del resultado medido, una cantidad de compuesto 28 selectivo no unido en el subproducto 26. La cantidad del compuesto 28 selectivo no unido puede determinarse por medio del uso de patrones y controles conocidos, tal como entenderán bien los expertos en la técnica. Por ejemplo, los resultados pueden compararse con valores de una curva de calibración creada a partir de una pluralidad de muestras patrón que tienen concentraciones predeterminadas, tal como se conoce en la técnica.
Además, el método 100 incluye la etapa 112 de determinar una cantidad de compuesto 24 selectivo inmovilizado, que está inmovilizado sobre el soporte 10 sólido, a partir de la cantidad de compuesto 28 selectivo no unido en el subproducto 26, por ejemplo, sobrenadante. La cantidad de compuesto 24 selectivo inmovilizado puede determinarse calculando la diferencia entre una concentración de partida del compuesto 22 selectivo añadido para la etapa 102 de puesta en contacto y la cantidad determinada del compuesto 28 selectivo no unido (a partir de la etapa 110). La cantidad de compuesto 24 selectivo inmovilizado sobre el soporte 10 sólido será la cantidad unida (por ejemplo, unida covalentemente o de otro modo) a los grupos 12 funcionales de superficie o grupos 15 funcionales en los agentes 14 de acoplamiento dependiendo del diseño particular del procedimiento.
Aún más, el método incluye la etapa 114 de determinar, a partir de la cantidad del compuesto 24 selectivo inmovilizado, una cantidad de los grupos funcionales diana inmovilizados sobre el soporte 10 sólido. Por tanto, a partir de la cantidad de compuesto 24 selectivo inmovilizado, puede determinarse el número correspondiente de grupos funcionales diana (por ejemplo, grupos 12 o 15 funcionales). Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un compuesto 24 selectivo inmovilizado puede corresponder a un grupo funcional diana sobre el soporte 10 sólido. Alternativamente, un compuesto 24 selectivo inmovilizado puede corresponder a dos o más grupos funcionales sobre el soporte 10 sólido. En determinadas realizaciones, el número de grupos funcionales diana puede expresarse como el número de equivalentes de los grupos funcionales particulares.
A continuación se explicarán con breve detalle dos realizaciones específicas.
En una primera realización particular, el soporte 10 sólido comprende grupos 12 funcionales de superficie, por ejemplo, grupos funcionales aldehídicos inmovilizados. Por tanto, en este caso, un objetivo del método puede ser determinar el número de grupos funcionales aldehídicos sobre el soporte 10 sólido. Para lograr esto, los grupos funcionales aldehídicos pueden inmovilizarse sobre el soporte 10 sólido mediante una reacción que añade los grupos funcionales aldehídicos a grupos amino existentes sobre el soporte 10 sólido. En esta realización, el soporte 10 sólido puede comprender partículas paramagnéticas funcionalizadas con amino, que están fácilmente disponibles en el mercado. Además, en una realización particular, los grupos funcionales aldehídicos pueden inmovilizarse sobre el soporte 10 sólido por medio de una reacción entre el glutaraldehído y los grupos amino sobre el soporte 10 sólido.
En una etapa siguiente, puede añadirse un compuesto 22 selectivo que reacciona selectivamente con los grupos funcionales aldehídicos inmovilizados a un recipiente que comprende el soporte 10 sólido, mezclarse e incubarse durante una cantidad de tiempo eficaz. En este caso, el compuesto 22 selectivo puede ser uno que reaccione fácilmente con los grupos funcionales aldehídicos inmovilizados tal como un compuesto que contiene amina. En una realización, el compuesto 22 selectivo comprende propilamina. Tras la reacción entre la propilamina y los grupos funcionales aldehídicos inmovilizados, la propilamina debe reaccionar de manera ideal sustancialmente con todos los grupos funcionales aldehídicos disponibles, siempre que esté presente suficiente propilamina. La reacción puede tener lugar en condiciones adecuadas eficaces para hacer reaccionar los componentes por completo y producir un sobrenadante. La propilamina no unida restante puede desecharse dentro de un subproducto 26 tal como un sobrenadante.
A este sobrenadante, se le añade un indicador 30 que, en este caso, reaccionará con la propilamina no unida en el sobrenadante. En esta realización, los inventores han encontrado que el ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBSA) funciona como un indicador adecuado. El TNBSA es un reactivo disponible comercialmente usado para cuantificar grupos amino. La reacción del TNBSA con aminas genera un producto altamente cromogénico que puede medirse fácilmente a una longitud de onda pico de 335 nm, o de manera más conveniente a 405 nm cuando se usa una microplaca. A partir de las mediciones resultantes, puede determinarse la cantidad de propilamina unida y no unida en este caso tal como se describió anteriormente, y a partir de ello puede determinarse el número de grupos funcionales aldehídicos sobre el soporte 10 sólido.
En una segunda realización particular, el soporte 10 sólido comprende grupos 12 funcionales, por ejemplo, grupos funcionales amino inmovilizados. Por tanto, en este caso, un objetivo del método es determinar el número de grupos funcionales amino sobre el soporte 10 sólido. Para lograr esto, tal como se mencionó anteriormente, las PMP pueden hacerse reaccionar con un aminosilano para producir PMP funcionalizadas con amino.
En una etapa siguiente, puede añadirse un compuesto selectivo que reacciona selectivamente con los grupos funcionales amino inmovilizados a un recipiente que comprende el soporte 10 sólido, mezclarse e incubarse. En este caso, el compuesto 22 selectivo puede ser uno que reaccione fácilmente con los grupos funcionales amino inmovilizados tal como un compuesto de aldehído. En una realización, el compuesto selectivo comprende propionaldehído. Tras la reacción entre el propionaldehído y los grupos funcionales amino inmovilizados, el propionaldehído debe reaccionar de manera ideal con los grupos funcionales amino disponibles, siempre que esté presente suficiente propionaldehído. Como en el ejemplo anterior, la reacción puede tener lugar en condiciones adecuadas eficaces para producir un sobrenadante. En este caso, el propionaldehído no unido restante puede desecharse dentro del sobrenadante.
A este sobrenadante, se le añade un indicador 30 que, en este caso, reaccionará con la propilamina no unida en el sobrenadante. En esta realización, los inventores han encontrado que una disolución que comprende Purpald (4-amino-3-hidrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol,4-amino-5-hidrazino-1,2,4-triazol-3-tiol), disponible de Sigma-Aldrich, funciona como un indicador adecuado. El TNBSA es un reactivo disponible comercialmente usado para cuantificar grupos amino. La reacción de Purpald con grupos carbonilo genera un producto altamente cromogénico. En una realización, el producto resultante tiene una absorción máxima a 490-540 nm. A partir de las mediciones resultantes, puede determinarse la cantidad de propionaldehído unido y no unido tal como se describió anteriormente, y a partir de ello puede determinarse el número de grupos funcionales amino inmovilizados sobre el soporte 10 sólido.
En cualquier caso, tras la determinación del número de grupos funcionales inmovilizados, puede hacerse reaccionar una cantidad eficaz del primer miembro 16 de par de unión con los grupos 24 funcionales inmovilizados sobre soportes 10 sólidos similares. En una realización, basándose en el número determinado de grupos funcionales diana sobre el soporte 10 sólido, pueden añadirse grupos funcionales diana adicionales al soporte 10 sólido si el número determinado de grupos funcionales diana sobre el soporte 10 sólido es menor que un valor predeterminado. El valor predeterminado puede ser el número de grupos funcionales diana necesario para unir directa o indirectamente una cantidad predeterminada de los primeros miembros 16 de par de unión. En otra realización, basándose en el número determinado de grupos funcionales diana sobre el soporte 10 sólido, puede fabricarse uno o más soportes sólidos adicionales que comprenden una cantidad estequiométrica del primer miembro 16 de par de unión unido a los grupos funcionales diana. Como resultado, puede utilizarse el número determinado de grupos funcionales mediante los procedimientos descritos en el presente documento como guía para determinar la fabricación óptima de soportes sólidos.
Los aspectos de la presente invención se demuestran mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Determinación del tiempo de incubación requerido para la cuantificación de equivalencias de amino de las partículas paramagnéticas (PMP).
Preparación de la muestra:
Se usaron dos lotes de partículas paramagnéticas funcionalizadas con amino de Siemens (AHI-PMP) para los estudios de dependencia del tiempo. Para 800 mg de cada lote, se usaron 5 x 40 ml de borato de sodio 25 mM (pH 10,0, preparado a partir de borato de sodio, decahidratado, n.° de catálogo de Sigma S9640) para lavar las partículas en un tubo Falcon de 50 ml. Se retiró el sobrenadante después de una separación magnética usando DynaMag-50 (Life
Technologies/Thermo Fisher) o un equivalente, y se resuspendió con 40 ml de tampón después del último lavado. Se repartieron alícuotas iguales de 5 ml en cada uno de ocho tubos Falcon de 15 ml a 100 mg cada uno.
A cada tubo se le añadieron 1,6 ml de propionaldehído 50 mM (Sigma) en agua. Se llenaron los tubos hasta 8 ml con borato 25 mM (pH 10,0). Los tubos que tenían 100 mg de PMP con propionaldehído 10 mM se colocaron en un incubador a 50 °C y se mezclaron en un mezclador orbital. En los siguientes puntos de tiempo: 1, 2, 3, 5, 15, 24, 48 y 72 horas, se retiró un tubo de cada uno y se realizó separación magnética usando DynaMag-15 o un equivalente. Se guardó el sobrenadante de cada tubo.
Se prepararon muestras patrón de propionaldehído de cero a 2,5 mM en agua y se prepararon diluciones de % de las muestras de sobrenadante en agua. Cada muestra se pipeteó en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml y se usó una gradilla apropiada de modo que una pipeta de 8 o 12 canales múltiples pudiera aspirar. Cuando se completaron estas preparaciones, se disolvieron 7 mg/ml de Purpald (Aldrich) en NaOH 1 M y se agitó con vórtex. A continuación, se mezcló el 1% en volumen de peróxido de hidrógeno al 0,3% (ACROS Organics). Con una pipeta de canales múltiples, se transfirieron 200 |il de la disolución de Purpald/NaOH/peróxido de hidrógeno a cada uno de una pluralidad de pocillos, seguido por 50 |il de muestras patrón y muestras de sobrenadante. Las muestras se mezclaron en un mezclador rotatorio orbital durante de 10 a 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando los colores del patrón parecían estar aumentando su intensidad por medio de un color rosa cada vez más intenso, se llevó la microplaca a un lector de microplacas (por ejemplo, lector de microplacas cinético Vmax de Molecular Devices) y se leyó a 490 nm.
Resultados:
Tal como se muestra en la figura 6, se representó gráficamente la absorbancia promedio a 490 nm para 8 patrones independientes (sometidos a ensayo por triplicado) y se estableció una ecuación de ajuste cuadrático de emoles de aldehído frente a absorbancia. La ecuación de ajuste cuadrático se usó para calcular los emoles no unidos de propionaldehído, que luego se usaron para calcular los emoles de aldehído unido. Los emoles de aldehído unido a las PMP eran equivalentes a la equivalencia de amino de las aminas en las PMP, después de una corrección de los factores de dilución.
Además, tal como se muestra en la figura 7, después de 24 horas de reacción de PMP con propionaldehído, se completó la formación de la base de Schiff, lo que indica que la determinación de las equivalencias de amino puede llevarse a cabo en un incubador a 50 °C en un mezclador durante al menos 24 horas.
Ejemplo 2
Determinación de las equivalencias de grupos amino de 12 lotes de PMP
Preparación de la muestra
Se obtuvieron doce lotes de PMP de Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Se colocaron 100 mg de material procedente de cada lote en un tubo Falcon de 15 ml independiente y se lavaron con 5 X 10 ml de borato de sodio 25 mM (pH 10,0). Se retiró el sobrenadante después de la separación magnética usando DynaMag-15 o un equivalente y luego se resuspendió con 5 ml de tampón después del último lavado.
A cada tubo se le añadieron 1,6 ml de propionaldehído 50 mM (Sigma) en agua. Se llenaron los tubos hasta 8 ml con borato 25 mM (pH 10,0). Los tubos que tenían 100 mg de PMP con propionaldehído 10 mM se colocaron en un incubador a 50 °C y se mezclaron en un mezclador orbital durante 72 horas. Se retiraron todos los tubos y se realizó separación magnética usando DynaMag-15 o un equivalente. Se guardó el sobrenadante de cada tubo.
Ensayo en una microplaca de 96 pocillos
Se prepararon muestras patrón de propionaldehído de cero a 2,5 mM en agua y se prepararon diluciones de % de las muestras de sobrenadante en agua. Cada muestra (patrones y sobrenadantes) se pipeteó en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml y se usó una gradilla apropiada de modo que una pipeta de 8 o 12 canales múltiples pudiera aspirar. A continuación, se disolvieron 7 mg/ml de Purpald (número de catálogo de Aldrich 162892-25G) en NaOH 1 M y se agitó con vórtex para disolver completamente. Se mezcló el 1% en volumen de peróxido de hidrógeno al 0,3% (número de catálogo de ACROS Organics 426001000) en la disolución de Purpald. Con la pipeta de canales múltiples, se transfirieron 200 |il de Purpald/NaOH/peróxido de hidrógeno a los pocillos, seguido por 50 |il de patrones y muestras. A continuación, las muestras/patrones se mezclaron en un mezclador rotatorio orbital durante de 10 a 30 min a temperatura ambiente. Cuando apareció un color rosa cada vez más intenso, se llevó la microplaca a un lector de microplacas (por ejemplo, lector de microplacas cinético Vmax de Molecular Devices) y se leyó a 490 nm.
Resultados
Tal como se muestra en la figura 8, se representó gráficamente la absorbancia promedio de 8 patrones (sometidos a ensayo por triplicado) y se estableció una ecuación de ajuste cuadrático de emoles de aldehído frente a absorbancia a 490 nm. La ecuación de ajuste se usó para calcular los emoles de propionaldehído no unidos que, a su vez, se usaron para calcular los emoles de propionaldehído unido. Los emoles de propionaldehído unido eran equivalentes a la
equivalencia de amino en las PMP. Así se determinaron los emoles de equivalencias de amino por mg de PMP. Se mostró que los lotes sometidos a prueba tenían aproximadamente las mismas equivalencias de amino por mg de sólido.
Ejemplo 3
Determinación del tiempo de incubación requerido para la cuantificación de equivalencias de aldehído de partículas PMP-CHO.
Preparación de la muestra:
Se sometieron ochocientos mg de PMP funcionalizadas con amino (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.) a intercambio de tampón con fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,5) y se activaron mediante glutaraldehído al 6,25% (n.° de catálogo de Polysciences 1909) a 50 mg de sólidos/ml durante 3 horas y se mezclaron mediante un agitador orbital 3D de Glas-Col (3D) durante 3 horas para dar partículas de PMP-CHO. El glutaraldehído no unido se eliminó por lavado mediante 4X 56 ml de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,5). Las PMP-CHO se resuspendieron en las nuevas botellas de polipropileno a 20 mg de sólidos/ml en el mismo tampón.
Se aspiraron cien mg de las PMP-CHO a cada uno de ocho tubos Falcon de 15 ml, se lavaron mediante 5X 10 ml de borato de sodio 25 mM (pH 10, preparado a partir de borato de sodio, decahidratado, n.° de catálogo de Sigma S9640), y luego se resuspendieron en 5 ml del mismo tampón. A cada tubo se le añadieron 1,6 ml de propilamina 50 mM (n.° de catálogo de Sigma 240958) en agua y se llenaron hasta 8 ml con borato de sodio 25 mM (pH 10), lo que dio como resultado el mezclado del sólido con propilamina 10 mM. Los 8 tubos se incubaron durante 0-72 horas en un incubador a 50 °C. En cada punto de tiempo, se separó el sobrenadante mediante DynaMag-15 o un imán equivalente y se mezcló con un volumen igual de HEPES 78 mM (n.° de catálogo de Sigma H3375, pH no ajustado) para alcanzar un pH final de ~ 8,5+/-0,2. Los sobrenadantes centrifugados se mantuvieron a 2-8 °C hasta que se completaron todos los puntos de tiempo. Ensayo en una microplaca de 96 pocillos:
Se prepararon diez ml de tampón mixto mezclando 5 ml de borato de sodio 25 mM (pH 10) y un volumen igual de bicarbonato de sodio 0,5 M (pH 7,9) para alcanzar un pH de ~ 8,8. Se prepararon patrones de propilamina 5 mM mezclando volúmenes iguales de propilamina 10 mM y HEPES 78 mM, luego diluyendo hasta propilamina 0-5 mM en el tampón mixto. Se aspiraron 200 |il de patrones por triplicado en 96 pocillos de microplaca. Además, se aspiraron 200 |il de muestras por sextuplicado en 96 pocillos de microplaca. A cada uno de los pocillos de patrón y a 3 pocillos de muestra se les añadió 50 |il de TNBSA al 0,01% (o disolución picrisulfónica, n.° de catálogo de Sigma 92823). Se añadió borato de sodio 50 mM (pH 8,5). Se añadieron 50 |il de borato de sodio 50 mM (pH 8,5) solo a las muestras de control. Las muestras se mezclaron en un agitador a temperatura ambiente durante ~60 min. Cuando las disoluciones de los pocillos cambiaron de color de amarillo a naranja a las intensidades apropiadas (absorbancia de ~0,5 a 1), la placa con los pocillos se llevó a un lector de microplacas tal como el lector de microplacas cinético Vmax de Molecular Devices, y se leyó a 405 nm. Resultados:
La tabla 2 a continuación muestra la A405 y los emoles de aldehído medidos en cada punto de tiempo.
Tabla 2: Resumen de la A405 y los emoles de aldehído/g de PMP-CHO medidos en puntos de tiempo
La figura 9 muestra además la dependencia de la formación de bases de Schiff para la cuantificación de aldehídos. En particular, los resultados indicaron que a las 22+/2 horas de incubación a 50 °C, se completa la reacción.
Ejemplo 4
Determinación de las equivalencias de grupos aldehido de PMP-CHO usando propilamina y ácido trinitrobencenosulfónico (TNBSA)
Preparación de la muestra:
Se sometieron dos gramos de PMP (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.) a intercambio de tampón con fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,5) y se activaron mediante glutaraldehído al 6,25% (n.° de catálogo de Polysciences 1909) a 50 mg de sólidos/ml durante 3 horas y se mezclaron mediante un agitador orbital 3D de Glas-Col (3D) o un mezclador Eberbach (EB) a temperatura ambiente durante 3 horas. El glutaraldehído no unido se eliminó por lavado mediante 4X 140 ml de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,5). Las PMP-CHO se resuspendieron en las nuevas botellas de polipropileno a 20 mg de solidos/ml en el mismo tampón.
Se lavaron cien mg en dos tubos Falcon de 15 ml, etiquetados como 3D y EB, mediante 5X 10 ml de borato de sodio 25 mM (pH 10, preparado a partir de borato de sodio, decahidratado, n.° de catálogo de Sigma S9640), luego se resuspendieron en 5 ml del mismo tampón. A cada tubo se le añadieron 1,6 ml de propilamina 50 mM (n.° de catálogo de Sigma 240958) en agua y se llenaron los tubos hasta 8 ml con borato de sodio 25 mM (pH 10), lo que dio como resultado la mezcla del sólido con propilamina 10 mM. Se incubaron los dos tubos durante 24 horas en un incubador a 50 °C. Entonces se separaron los sobrenadantes mediante DynaMag-15 o un imán equivalente, luego se mezclaron volúmenes iguales de HEPES 78 mM (n.° de catálogo de Sigma H3375, pH no ajustado) para alcanzar un pH final de ~ 8,5+/- 0,2. Se preparó una disolución madre de propilamina 10 mM de la misma manera que las muestras, excepto que no estaba presente PMP-CHO.
Ensayo en una microplaca de 96 pocillos:
Se prepararon diez ml de tampón mixto mezclando 5 ml de con un volumen igual de borato de sodio 25 mM (pH 10) y un volumen igual de bicarbonato de sodio 0,5 M (pH 7,9) para alcanzar un pH de ~ 8,8. Se prepararon muestras patrón de propilamina 5 mM mezclando en primer lugar volúmenes iguales de propilamina y HEPES 78 mM, luego diluyendo hasta propilamina 0-5 mM en el tampón mixto. Se aspiraron 200 |il de muestras patrón por triplicado en 96 pocillos de microplaca. Se aspiraron muestras de 200 |il por sextuplicado en 96 pocillos de microplaca. A cada muestra patrón y a 3 pocillos de muestra se les añadió 50 |il de TNBSA al 0,01% (o disolución picrisulfónica, n.° de catálogo de Sigma 92823) en borato de sodio 50 mM (pH 8,5) y 50 |il a cada uno de borato de sodio 50 mM (pH 8,5) solo a las muestras de control. Se mezcló la placa en un agitador a temperatura ambiente durante -60 min. Cuando las disoluciones de los pocillos cambiaron de color amarillo a naranja y alcanzaron las intensidades apropiadas (absorbancia de -0,5 a 1), la placa se llevó a un lector de microplacas, tal como el lector de microplacas cinético Vmax de Molecular Devices, y se leyó a 405 nm.
Resultados:
La figura 10 muestra los emoles de patrones de propilamina frente a A405. La tabla 3 a continuación muestra los emoles de equivalencias de aldehido después de restar las muestras control.
Tabla 3. Equivalencias de aldehído de PMP-CHO
Ejemplo 5
Diseño DOE y determinación de las equivalencias de grupos aldehido de PMP-CHO usando propilamina y TNBSA.
Diseño DOE:
Minitab Inc. en State College, PA, comercializa DOE, Design of Experiments, versión 17, un método estadístico para el diseño y el análisis de datos experimentales. A continuación se enumeran las variables de diseño factorial completo de 3 factores con un punto central y una variable de respuesta:
Tabla 4. Diseño DOE y variables de respuesta
Preparación de la muestra:
Las PMP oscilaron entre 5 y 5,5 gramos para 9 condiciones de preparación (23+1=9) en frascos cuadrados Nalgene de 1 l. Las PMP se lavaron y se separaron magnéticamente 3 veces con tampón de lavado (sulfato de sodio 10 mM, pH 7,4). Los sobrenadantes se drenaron mediante aspiración con pipeta. A cada torta húmeda, se le añadieron PMP que contenían tampón residual en diversos tamaños de envases Nalgene cuadrados (de 0,25 a 8 l), a un volumen calculado de glutaraldehído diluido y se mezclaron a temperatura ambiente durante 3 horas por medio de agitadores orbitales 3-D fabricados por Glas-Col en Terre Haute, EN.
Después de lavar las PMP 2x, se transfirieron las PMP-CHO a nuevos envases cuadrados Nalgene de 1 l y se lavaron otras 4 veces con tampón de lavado. La torta húmeda de PMP-CHO final se resuspendió en los frascos cuadrados Nalgene de 0,5 o con el tampón de lavado para alcanzar 20 mg/ml y se almacenaron a 2-8 °C hasta que se sometieron a ensayo. Ensayo en una microplaca de 96 pocillos:
Antes de realizar el ensayo en una microplaca, se incubaron 100 mg de cada una de las muestras con propilamina 10 mM en borato de sodio 25 mM (pH 10) durante 24 horas a 50 °C usando el protocolo de ensayo establecido en el ejemplo 5 anterior.
Resultados:
La tabla 5 resume las condiciones de muestra y los valores de variable de respuesta y
Tabla 5. Un resumen sobre el diseño DOE y los valores de variable de respuesta
La tabla 6 muestra los modelos de ajuste a partir de un análisis estadístico. En particular, la tabla 6 muestra los valores de los parámetros después de ajustar la reducción de modelo con el % de glutaraldehído (p= 0,011 < 0,05), el único factor que es significativo.
Tabla 6: Análisis de varianza
Los resultados se muestran adicionalmente en las figuras 11-13 adjuntas.
La figura 11 es una gráfica de efectos que indica que el % de glutaraldehído es un factor principal de la formación de grupos aldehído.
La figura 12 es una gráfica de interacción que muestra los mg/ml de PMP que cortan con el % ocupación de recipientes. La figura 13 es un diagrama de Pareto que ilustra B (% de glutaraldehído) como un efecto principal de la formación de grupos aldehído.
La figura 14 ilustra que el optimizador de respuesta indicó que podría lograrse una D (deseabilidad) de 0,744 con variables de diseño establecidas a 70 mg/ml, el 12,5% de glutaraldehído y una ocupación de recipientes de 79%.
En conclusión, el experimento del ejemplo 5 indicó que al combinar la formación de bases de Schiff entre PMP-CHO y propilamina y un método de prueba en microplaca con TNBSA, puede lograrse la optimización usando DOE.
Claims (9)
1. Método para cuantificar grupos funcionales diana inmovilizados sobre un soporte sólido que comprende:
poner en contacto los grupos funcionales diana con una cantidad de un compuesto selectivo, en el que una cantidad del compuesto selectivo se une a los grupos funcionales diana y una cantidad del compuesto selectivo no se une a los grupos funcionales diana;
obtener un subproducto que tiene una cantidad del compuesto selectivo no unido;
añadir un indicador al subproducto que se une al compuesto selectivo no unido en el subproducto para proporcionar un resultado medible;
medir el resultado medible;
determinar a partir del resultado medido una cantidad de compuesto selectivo no unido en el subproducto; determinar una cantidad de compuesto selectivo inmovilizado sobre el soporte sólido a partir de la cantidad de compuesto selectivo no unido; y
determinar a partir de la cantidad del compuesto selectivo inmovilizado una cantidad de los grupos funcionales diana inmovilizados sobre el soporte sólido, en el que
a) los grupos funcionales diana inmovilizados sobre el soporte sólido comprenden grupos funcionales aldehídicos y en el que los grupos funcionales aldehídicos se inmovilizan sobre el soporte sólido mediante una reacción que añade los grupos funcionales aldehídicos a grupos amino presentes sobre el soporte sólido, y en el que el compuesto selectivo reacciona selectivamente con los grupos funcionales aldehídicos inmovilizados y comprende un grupo funcional amino, y en el que el indicador comprende una disolución que comprende ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBSA); o b) los grupos funcionales diana inmovilizados sobre el soporte sólido comprenden grupos funcionales amino, y en el que el compuesto selectivo comprende un compuesto aldehídico que reacciona selectivamente con grupos funcionales amino inmovilizados sobre el soporte sólido, y en el que el indicador comprende 4-amino-3-hidrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol, 4-amino-5-hidrazino-1,2,4-triazol-3-tiol (Purpald).
2. Método según la reivindicación 1, en el que los grupos funcionales diana sobre el soporte sólido se inmovilizan mediante una reacción que añade los grupos funcionales al soporte sólido, o en el que los grupos funcionales diana se proporcionan sobre un agente de acoplamiento unido al soporte sólido.
3. Método según la reivindicación 1, en el que en a) los grupos funcionales aldehídicos se inmovilizan sobre el soporte sólido mediante una reacción que añade los grupos funcionales aldehídicos a grupos amino presentes sobre el soporte sólido,
en el que preferiblemente los grupos funcionales aldehídicos se inmovilizan sobre el soporte sólido por medio de una reacción entre glutaraldehído y los grupos amino sobre el soporte sólido.
4. Método según la reivindicación 3, en el que el compuesto selectivo que reacciona selectivamente con los grupos funcionales aldehídicos inmovilizados comprende propilamina.
5. Método según la reivindicación 1, en el que el compuesto selectivo que reacciona selectivamente con grupos funcionales amino inmovilizados comprende propionaldehído.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el resultado medible comprende un resultado colorimétrico, y
en el que el resultado medible comprende preferiblemente un miembro seleccionado del grupo que consiste en un valor de absorbancia, uno de fluorescencia y uno de señal de corriente eléctrica.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el soporte sólido comprende partículas paramagnéticas.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además:
fabricar un soporte sólido adicional que comprende grupos funcionales diana adicionales inmovilizados sobre el soporte sólido si el número determinado de grupos funcionales diana sobre el soporte sólido es menor que un valor predeterminado, o
fabricar un soporte sólido adicional que comprende una cantidad estequiométrica de un compuesto unido a los grupos funcionales diana,
en el que preferiblemente el compuesto es un primer miembro de un par de unión selectivo para un segundo miembro del par de unión en una muestra.
9. Método según las reivindicaciones 1 a 8, en el que la puesta en contacto de los grupos funcionales diana con una cantidad de un compuesto selectivo comprende hacer reaccionar los grupos funcionales diana con una cantidad de un compuesto selectivo.
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