PT93548A - Equipamento e metodo de dosagem enzimatica aplicavel em celulas completas - Google Patents

Description

Ο presente invento diz respeito a um equipamento e a um método de dosagem enzimático utilizando esse equipamento, para a dosagem de enzimas endógenas carscieristicas da.s populações ou. sub-populações de células» 0 método de dosagem enzimática e do equipamento correspondente s'So igual mente destinados à dosagem das próprias células pelo intermediário da dosagem das suas enzimas endógenas» Estas dosagens são aplicáveis ao diagnóstico» 0 processo de acordo com o invento consiste em imobili zar de maneira específica por imunacaptura sobre um suporte sólido uma população celular depois a dosar uma enzima endógena característica desta população ou. de uma sub—população celular pôr em execução um substrato ap ro prIado dssta enzima e eventualmente os co—fac tores ou subs tân c ias s.uxi 1 iarss necessárias„ De acordo com o mesmo inx entOq na descrição e reivindi— CEÇoSS Q ae V -30 S- sguir, chama-se en z ã ma en d àg sn -a 5 a uma en z x ma contida no citoplasma de. célula e cujo substrato # uma molécula tíe baixo peso molecular capaz de penetrar no interior da célula, para aí ser transformada pela enzima, libertando no meio um produto de reacção colorido' ou. fluorescente que permite a medida final de um sinal proporcional è. actividade da enzima» A imunocaptura das em reter as células sobre um ou mais antigênios de super anticorpos monoclonais especí células é um processo que consista suporte sólido por ligação entre um fície destas células e um ou mais ficos deste ou destes antigênios» 0 o on ntiL x men tu usstes «juitiyétiius ou maruadures das superfície celular fez enormes- progressos com a regulação tíe nibridação 1íutocítária e a» dsscoosrts dos anticorpos monoclonais por KOEHLER e MILBTEIM, (Nsture, 1975, 256, 495-497). Os

v_y βΠ-icorpo-, monoclonais permxixram nomeadaniente pôr em evidência e a anâlxse dos marcadores· da superfície DU antigénios membranários de células das. mais variadas origens» Estes marcadores (ou an gániCfpousm ser de diTerentes naturesas; proteínas, glico— proteínas ou glicrolípidos» As caracterizações dirigem—se principal mente a marcadores de tecido ou. de orgâo, a marcadores de estados ae diferenciação ou de activsção de células normais e à identificação ou à tipificaçaa de células normais ou cancerosas. Um domínio de aplicação particularmente importante é o estudo das linhas Celulares de hematopoese (eritrocitária, megacariocitária» granu1 oc x t ár ia =, monocitária, linfacitária).

AssxjTi!j por exemplo, os anticorpos monoclonais permitiram precisar as características de superfície respectivas dos Ixnfócitos T e B« Os marcadores correspondentes sozinhos ou em combinação identificam os estados de diferenciação e de especialização funcional dos linfócitos. Por convenção internacionais os marcadores de superfície dos leucócitos humanos foram classificados em grupos ou classes de diferenciação (CD) definidos quando do Sub—Comité IUIS—QMS, 19S4 e descritos no Boletim da "Organi— sation Mondiale de la Santé”. 1984, 62 Í5>= 813-815»

Os anticorpos monoclonais são hoje utensílios insubstituíveis tía biologia clínica aplicada nas análises celulares.

Existem métodos de enumeração de células que utilizam a marcação dos seus antigénios de superfície mas estes métodos são por vezes longos., laboriosos, difíceis de pôr em execução» e os resultados são por vezes aleatórios. uma

Um grupo de medida de antigénios é baseado na avaliação quantitativa dos marcadores de superfície da população celular global. Estes métodos permitem medir os antigénios por V®, - \ r·'** sej a d i recta, quer seja. ±!-f:d/i':rêc ta, q ue marcaçao quer 315 2Θ1 - STCKER et HEUSSER ã. 5) ou uma enzima para uma dosagem realizada na maior parte das vezes em duas·,. trfs ou quatro etapas, Em todos os casos o reagente utilizado na última etapa da marcação tem uma sonda que é ou de natureza isotrópica, Iodo 125 por exemplo, para uma dosagem do tipo imuno—radiométrico CBROW e Col 1 „ J„ Immunoiu nsthotís, IV/ ϊmmu.no 1» Method de tipo imuno-enzinométrieo, mais frequentemente a peroxidase, a fosfatas® alcalina pu a beta—-qalactosida.se, ÍVAN LEUVEN et Ca 11 „ , J * I mmun o 1 , Me t hod s 1983, 36 91 --98) <61 “ 1 ' í9/tí5 23, lôV-ílò- MORRIS Transplantation, BAUM8ARTEN u, Immunol «Methods, 1986, 94,

Notar-se-à que as enzimas utilizadas- em tais métodos são reagentes analíticos fornecidos no decurso da dosagem sob forma, conjugada com um anticorpo que reconhece um antigénio exposto na face externa da. membrana celular. Estas enzimas nlo podem então confundir—se com enzimas endógenas de. célula que fazem parte do seu. equipamento enzimático natural,

Estes métodos são bastante incómodos, laboriosos e de aplicação perigosa -sendo necessárias numerosas lavagens e centrifugações do material celular? é necessário por vezes tirar antes o meio colorido resultante da reacçao enzimàtica em vista da medição espectrofotométrica final? por fim a fixação química das células, que é mais vulgarmente utilizada, está na origem da destruição irreversível de certos antiqénios particularmente sensíveis aos fixadores químicos usuais tais como glutaraldeído ou metanol < DkOVEK et Coll jlí jl / * I mmu η o 1,, Me t hod s, 19tíé, 9Θ, A imunoc aptur cs ,a no pedida de pa de células sobre um suporte sólido é descrita no pedido de patente WO 86/02091 no qual -o objectivo é - ^ «Γ

\ -p.' 'Χ C > Τ' \ v?sdk/ eliminar as células indesejáveis em aíy>ostras de medula qssss destinada a transplantações» Neste pedido de patente* a captura de células é realizada nucrossfsrss Tlu.tuanc.es· e necessita pus o anticorpo utilizado seja ligado ao suporte sólido por uma estrutura macromalecular complexa, designada por rede/relé capa;·: de assegurar uma orientação privilegiada do anticorpo em relação à da antígénia celular correspondente» Nenhuma aplicação da técnica, à dosagem quantitativa de uma enzima celular é identificada neste pad ida, A imunocaptura de células é igual mente descrita, no pedido de patente WO Θ4/Θ3151 para uma aplicação analítica» são afatxdos por 8. Γ 0 S pOS 18.3 de

Neste pedido* a finalida.de é a identificação dos grupos tecidu-lares a que pertencem as células examinadas (operação geralmente designada por tipifInação HLA) = A captura de células é efectuada graças a anticorpos dispostos segundo uma geometria especifica em suportes muito especializados (lamelas de microscópio)» Os resultados são obtidos par simples observação visual do suporte

Assim, os sistemas de imunocaptura de células descritos até ao presente não conduzem a aplicações analíticas permitindo a determinação quantitativa de um marcador específica da célula e em particular uma enzima, constitutiva da célula» 0 método de doeaigeisi que é o ohjectivo do presente invento, possui vantagens consideráveis relativamente a todas as-técnicas anteriorraente conhecidas e utilizadas pois ela. permite medir de maneira, quantitativa todas as enzima, endoqónas de uma população celular» Esta. dosagem é realizada sobre células que não tenham sofrido no momento da sua captura específica nenhuma intervenção química ou física e que estão portanto no seu estado de integridade fisiológica.»

Para além disso o método de dosagem de acordo com o invento possui características de muito elevada especificidade, próprias dos sistemas de duplo reconhecimento pondo-se em execução dois marcadores diferentes característicos transportados pala mesma célula, sendo um um antigénio escolhido para imunocaptor de células que se querem anal is ar, o outro sendo uma. enzima endógena presente em célu.las que foram capturadas» Este método é simples, rápido e reprodutível« Ele está perfsitamente adaptado â análise de um grande número de amostras o que permite a sua utilização para fins de diagnóstico em laboratórios de biologia clínica de grande capacidade»

Assim o presente invento diz respeito a um equipamento para a dosagem de pelo menos uma enzima endógena característica de um população ou sub-população celular, compreendendo coma componentes: a) um suporte sólido sobre o qual são fixas por ligação covalente ou por adsorção física um ou mais anticorpos monoclo-nais dirigidos contra antigénios de superfície da população celular examinada e destinados a imqb.ilísar sobre o suporte as células entre as quais se encontram as da sub-população que possui a enzima a dosarj b) um revelador de enzima endógena., a saber uma ou mais soluções fornecendo os reagentes necessários Csubstrato e o caso presente, cromogénio) para revelar a actividade da enzima, e eventualmente um reagente que melhore a permeabilidade da membrana celular? nas c) uma solução tampão destinada à lavagem dó suporte sólido» 0 termo célula, utilizado na presente descrição e

0 método de dosagem de acordo com o invento aplica-se a. células irsteiras, quer dizer não 1 isatias »

As células não sofreram no momento da sua imunocapfcura S-SO 0lT:Dí~G ?gues num i» Esta situa ção .n ti génio uti1iz SQD da como alvo de qualquer intervenção física ou químic constitui a. meir para a captura dosagem, o orno suporte sólido, pode—se utilizar todo o dispositivo adaptado à manipulação de suspensões celulares e preferencial-mente dos tubos, dos suportes magnéticos particulares ou das placas rígidas ou flexíveis de microtitulaçSo em polietiXeno, polistireno, cloreto de polivinilo ou nitrocelulose comportando microcavidades» Os anticorpos monoclonais destinados á imobilização de células podem ser fixados sobre suportes sólidos quer por ligação quí mica covalente, quer por adsorção física de acorda com as técnicas clássicas bem conhsc ridas do per: Lto na técnica. Λ· > Η HH L tí 15 como as de scritas por STOCKER et HEUSSER J»Immunol» nstHods- 1979, vol» 26, p. 87-95» De preferãncia. o suporte pude ser previamente saturado por meio de uma proteína.

De .acordo com o invento, o ou os anticorpos monoclonais fixados nio suporte sólido devem permitir a imunocaptura da população celular smrs a qual se encontra a ou as- populações celulares portadopras dos antigênios a dosar» Quando esta popula—

ção é constituída por células humanas, os ; anticorpos monoc1on ais preferidos para a i πκχη oca d t. x r a são os anticorpos anti-HLA da c: 1 asse I, que são £5pSCiTI£OS da parte c uítiUjn uub an tigénzos HLA

pos monoclanais específicas dos antigénias das classe de diferer tntre estes ciação que foram determinadas sobre os- leucócitos anticorpos» α designado por a-classe I* comercializado por BIOSYS ê particularmente preferido»

Noutros casos em que as células examinadas são células humanas e em todos os casos em que estas células não são humanas3 pode—se igualmente utilizar anticorpos monoclonais apropriados ao tipo de células examinadas para a imunocaptura de acordo com o invento» 0 5 ubstrato da enzima endógena a di 05* são s scolhido s de man eira que U P s' ou U to f in a. I S-0QU*= nci a d e resccSss provocada pe 1 a en z ima 0 tSncx .35 em ex ei_ução s eja? ™ ou uma su bs tSncia c olor ida ou fluoresce nte Πί ΠΟ iT?£ fio 1 iqui do que r odei a as c é1u1as e que final es pectr ofotomét rica ou f I uor i mêt r i c a. 4 re- da reaccao ou da ossr e oos reaqentes subs-na Qixusa substância c olorida zn=íu 1 Livs 1 que UísrpOlr· i La sobre as 1 as paredes sobre as quais el as se f i Kam s fíiía pode ser quer tís uma iíiccò! Xt_ Sáj fotométr x c a. por refle xão, quer de ação a olho nu „ eventua1mente em relação a uma gama de tintas aferida·:

Assim a utilização de um cromogénio não é necessário quando o substrato sozinho permite obter uma substância colorida ου. τ 1 uorescen te»

Ο equipamento de dosagem contém como componente adicionai uma solução tampão destinada à lavagem do suporte sólido após imobilizacão das células» 0 equipamento de dosagem pode também conter, como componentes adicionais, as amostras necessárias à aferição da dosagem bem como ao controlo da qualidade de dosagem. 0 presente invento tem igualmente como objectivo um processo para a dosagem das enzimas endogénias de uma população ou de uma sub-população celular caracterizado por consistir? - em imobilizar a população celular compreendendo a sub~p£>puIação contendo a enzima endógena num suporte sólido utilizando um ou mais anticorpos monoclonais, previamente finos por ligação covalents ou por adsorçSo fisisca sobre o dito suporte © capaz de reconhecer um antigéni presente na superfície das célulasg - em observar um período tíe incubação para permitir a imunucaptu— rap - em lavar o suporte sólido para eliminar as células não imobili-sadas 5 — em juntar o ou qs reagentes necessários (substrato © u caso presente, cromogénio) revelar a actividade da enzima endógena? — em ler os resultados medindo os sinais luminosos (coloração ou fluorescência) referindo-se eventualmenete a uma gama de aferição

Assim a revelação da enzima endógena a dosar, pertencendo à população celular imobilizada, ou a uma das sub-popula-çSes é efectuada directamente por um substrato específico desta <y \ - .-'ré'· enzima, endógena, pois a dosagem propriamente dita da enzima endógena é realizada pela. medida foto-métrica em transmissão ou em reflexão, ou por medida da emissão de fluorescência. 0 equipamento e o processo de dosagem de acordo com o invento são particularmente simples pois, quando se dispõe de suportes de imunocaptura preparados com anteced@ncia5 eles só deixam intervir -a ou as soluções contendo os reagentes específicos necessários á medida da activídade da enzima (substrato e eventual mente cromagénio) » 0 equipamento de dosagem e o processo enzimático de acordo com o invento aplicam-se preferencialmente à dosagem das enzimas endógenas dos elementos figurados no sangue humano nomeadamente os leucócitos,, roais particularmente os granulócitos, U equipamerr j 0 SOírjctQsíiTl proc enzimaxxco de acordo coro o inventa permitem medir os sinais (luz absorvida ou emitida) dependendo simultaneamente do número de células presentes na população celular examinada e na concentração da enzima endógena medida nas células» A medida destes sinais permite uma avaliação quantitativa da activídade das moléculas desta enzima que são transportadas pelas células da população ou sub-população celular examinada»

Uma outra aplicação do invento surge na escolha como suporte sólido de uma. placa de microtitulação» 0 equipamento de dosagem e o processo enzimático de acordo com o invento podem assim ser utilizados com vantagem sobre uma única placa de tuna série se enzimas endógenas características de diversas sub—populações constitutivas da população celular examinada» Para esta .aplicação, pode-se utilizar por um lado, placas de microtitulação prontas para utilização» sobre as quais se fixaram previamente um *v· V : ***’ £ 0- N. lonais «n t·» —rf í~*, í—· Cí ώ, íTr 2U de reter todas as por outro lado, dispor ds uma COS- C 3. C la um com uma enzima endógena caracteristica de um-a das sub—populações a avaliar» Assim o mesmo suporte, pode-se obter uma dosagem quantitativa de todas as enzimas endógenas necessárias à caracterização das sub—popula— ç Ses esc o1hi das» A titulo de aplicação oo invsnto, pode-se citar o caso dos leucócitos humanos =i para os quais existe nomeadamente a suh-população de células ditas polinucleares ou granulócitos» A presença de granulócitos humanos pode ser avaliad 3. η o sangue ou na urina» ÍI · Hí^S í fp r j id caso de infecções urinárias tais como a s cistites ou pie1onsfri tes, é particu 1 arnsen te interess ante dispor de um método simples L) Cl i" 3- 3 dosagem dos granulócitos na urina, 0 equipamento de dosagem e o processo enzimãtico de acordo com o invento podem ser utilizados para a dosagem de granulócitos» Neste caso, efectua-se a imobilização especifica dos granulócitos da amostra examinada sabre um suporte sólido, e efectua-se a dosagem de uma enzima endógena característica dos granulócitos utilizando um substrato apropriado» A mieloperoxida— se é uma enzima endógena dos granulócitos s a sua dosagem ê efectuaa utilizando água oxigenada como substrato da peroxidsse»

Para se obter a imobi lização especifica dos granulóci- tos uti1i zam—se os anticorpos mon oc 1 on a is sn ti— CD 15 flxos num suporte só1 ido, tal como, por e x em pio, as pa redes das microcavi- dades das placas de microtitulação» VWiu-.N.,

As placas assim preparadas podem ser Ixofxlizsdas e armazenadas de preferencia a 4‘-'U» Esta etapa pode ser realizaria industrialmente e assim se poderá dispor de placas prontas a serem empregues nos equipamentos tíe dosagem aplicavexs e«i graiiu lócitos da amostra de sangue ou de urina examinada»

As amostras contendo as células a dosar e que provam do sanque ou de todo o liquido biológico apropriado, normal ou patológico, nomeadamente a urina, podem ser utilizados tai como se apresentam ou após preparação, nomeadamente depoxs da concentração «

Colocam-se partes sl iqu.otas da suspensão celular apropriada em contacto com α suporte sólido, por exemplo em tubos contendo o suporte microparticulado de imunocaptura ou em micro-cavidades de uma placa de microtitulação previamente preparada» Depois de lavada, junta.—se a solução que faz parte do equipamento de dosagem s contendo o substrato específico da enzima endógena característica da população celular visada» A duração necessária da imobilização das células é de preferencia inferior ou iquai a 15 minutos» Durante este período de tempo, o suporte sólido pode ser centrifugado para melhorar a imobilização das células» 0 suporte sólido, por exemplo o tubo ou a placa de micro-titulação é em seguida lavada para eliminar as células não fixas»

Obtém-se um produto colorido ou fluorescente juntando ao suporte sólido, sobre o qual está fixa a população celular que contém a enzima endógena a dosar, uma solução contendo o substrato da enzima e, se necessário, um ou mais reagentes auxiliares que permitem obter finalmente como produto de reacção, seja um produto colorido solúvel no meio, seja um produto colorido

3 V

insolúvel ? seja u.fn produto fluorescente solúvel, como foi explicada anteriormente. Mede-se em seguida o sinal luminoso proveniente das amostras assim tratadas, com a ajuda de um aparelho adaptada a cada casos fotómetro em transmissão ou em reflexão ou fluorimetro respectivamente. Quando o suporte sólido é uma placa de microtitulação, a leitura do sinal luminoso pode ser efectuada em sequência em todas as cavidades de uma mesma placa pela utilização de leitores automatizados de utilização corrente nos laboratórios de biologia, tais como , por exemplo, cs leitor de placa Tietertek ou o leitor de placa Fluoroscan, para as leituras espectrofotométricas ou fluorométricas respectivamente»

Os reagentes utilizados para revelar a peroxidase endógena ou a mieloperoxidase endógena contém água oxigenada, substrato da enzima, e um cromogénio apropriado, por exemplo a ortofenilenodiamina ou o ácido 2,2-az ino-his-(3-eii1-benzotia-zolin-ò-sulfónico) ou ABTS, para obtenção de um produto final de reacção, colorido e solúvel no meio ou então 3,3'-diamino—benzi-dina ou 3-amino-9-etil-carbazoI ou 4-ciorD-aIfa-naftol para se obter o produto final de reacção insolúvel, ou então ácido parahidroxifenil-propiénico para se obter um produto de reacção fluorescente solúvel no meio»

Be acordo com uma forma preferencial, o equipamento segundo o invento, para a dosagem de mieloperoxidase dos granu.-· lócitos compreendes a) uma placa de microtitulaç3oem cujas cavidades foram fixados um ou mais anticorpos monoclanais anti-granulócitos5 bl) uma solução contendo enzima, num tampão apropriado» áciua oxigenada5 substrato

OS b'j£) uma solução conLendo um »_Γθ!»υαénxo utilizado para revelar a expressão da actividade da enzima e eventualmente um reagente que melhore a permeabilidade da membrana celular»

De acordo com outra forma preferencial de realização, o equipamento segundo o invento para a dosagem da mieloperaxidase característica dos granulócitos compreende como suporte sólido tufaos ou ainda suportes magnéticos particulares sobre os quais foram fixados um ou mais anticorpos monoclonais antigranulócitos.

Os resultados da acordo com o invento podem dade apropriada ao exame ef exprimir estes resultados particular presente num da dosagem das enzimas endógenas de ser expressos segundo qualquer modali— ectuado» Mais específicamente» pode-se em actividade de uma enzima endógena da volume da amostra examinada (por exemplo por microlitro de sangue).

Para determinar a actividade de uma enzima endógena particular, numa amostra examinada» utilizar-se-à de preferencia uma gama de aferição constituída por células ou preparações apropriadas, contendo a enzima endógena a dosar e que terão sido previamenie calibradas por um método de referencia conhecido» Estes padrões serão de preferência constituídos quer por células idênticas na sua proveniência ãs células que serão objecto de dosagem,, quer pelas células de linhagens estabelecidas transportando a enzima endógena procurada, quer pelas preparações acexu-lares transportando a enzima escolhida.

Estes padrões são então tratados exactamente como amostras a examinar. Os sinais deles decorrentes servem para construir uma gama de aferição á qual se relacionara os sinais

Os cálculos posteriores são medidos com as amostras a examinar, clássicos. - Λ. Ο método de dosagem snzimática de acordo com ο iventa é simples, rápido e reprodutível, A sus. utilização é total mente adaptada à. análise de um grande número de amostras, Para compreender as vantagens em comparação com outros métodos descritos, convém analisar as diferentes etapas. A imobilização das células- sobre o suporte sólido é a fase da dosagem que apresenta habitualmente mais dificuldades ou que é a mais crítica na sua realização, 0 meio frequentemente utilizada é a fixação química das células pelo giutaraldeído ou o metanol nas cúpul as tratadas- ou nSo com oo1i-L—1isin a {VAN LEUVEN F. et Collo, Jo Immunol, Methods, 1978,23,109), No entanto, as fixações químicas assim postas em execuçá*—* podem diminuir ou mesmo suprimir a detecçao espeei-fxc :a procurada ou. pelo contrá- rio5 induzir marcações falsamente positivas de células o que é um inconveniente muito grave (DROvER et MARSHALL u, Immunol, Methods, 1986, 90, 275-281), ÇSu OO prQues-SQ μυΓ fixação a centrifugação das células, a fixação s depois as lava-

Para além disso a. realiz química necessita de várias etapass a preparação da mistura, do fixador, gens das células fixadas, seguida ou não de uma foi também proposta 91-98)» De facto, a alterar determinadas s a imunoc sptura de dosar= A aessssecaçào das- células a o /‘"L-, fixação ao metanol nas microcavidades íBAUMBARTEN, J, Immunol Methods, 1986, 94, desidratação das células a 37 °C, pode antigénios frágeis que poderiam ser útei células assim como as enzimas endoqénias a

Para além disso, a incertap com efeito, a decan' da dosagem e a dissecação reprodutibilidade deste processo é ção das células nas microcavidades das células podem variar de uma -1/-

lí -λ,.,·· cessx ts, 5. Ò ;á.rias foi X.B. mbém onais ads orv iuOS ; 1 = He thods , i y / y, :ação de cél u. .1 as sar, o que a pre— on a x is a 1 _s_ _ _s i- 25.11? en te o sup orte só I idp :ubos. ou s obr © D > x v a das Cél ulas não retid as V Para a 1 ém di 5SO s ac ter as dos !oSS Q -3 S 'fci.fl ada ;S a ao SLípUf te sSo éXperXãTiCXâ para OUtrâ. Ρθ!'~ TXiTi» Θ'Ξ·ta C30S8.QE!!Tr é dS longa f”Sd 1 Ϊ. ZS” çSo porque a etapa de dessecação das células de um período de tempo superior a duas horas. A i mo bílis aç ao de pooulaçoí 26, 87-95) ite processo permxte senta também um certo inconveniente. A utilização de anticorpos monoclona específicos e afins adsorvidos ou finados sobre o suporta só! ou. nomeadamente nas cavidades da dosagem, no< suporte particular permite a captura exc pretendidas, as- outras populações celularei eliminadas ao longo das lavagens efectuadas nenhum agente químico ou físico modifica as 1 antigénios nesta etapa pois as diferentes opei finar quimicamente ou fisicamente as célula suρ r x midas.

Assim de acordo com o presente invento, verificou-se que a imobilização das células pelos anticorpos roonoclanais é ura processo que permite simplificar a etapa de imobilização das células que transportam a enzima a dosar, tornando os resultados mais fiáveis. u processo de acordo com o invento consistindo num processo de utilização de um processo de imunocaptura de células V 4" í- t ·! tf- . «tf t; sem ir itervençao TiSICâ ou química sot r a-, células* fc? cí. d-is todas ou. parte destas cél u1as pe1a actividade de uma enzima endógena graças ao emprego do seu substrato específico.

"·,,, s . „S § u Λ , * a dosagem quantitativa sobre as permite* peia primeira vez próprias células das enzimas endógenas escolhidas

De SLonJu luhi o inventa5 a m«ir<_açãu dir&sota das células imobilizadas imunolóqicamente permites ~ usTia economia de rsagentes5 - uma fiabilidade melhorada por diminuição do número de etapas de man ipu 1açbes ? um qanno de tempo 5 -- a possibilidade de tratar ao mesmo tempo? com a utilização exclusiva de materiais e de aparelhagens normais, de grandes-quantidades de amostras» A duração neces-sária ρ-sra a imobilização da população celular ou da sub-papulação celular a dosar é curta» Ela é inferior ou. igual a 15 minut sanguíneos ou urinár ios» Por actividade da enzima endóger Depois da 1 ãvagssi mente dita é efsctus. da por simples medição com as a par luminosa» a 15 minutos no caso da dosagem de qranulócitos te sólido, a dosagem própria-ϊο de um sinal preciso e de usuais? absorção ou emissão

Assim o conjunto do processo de acordo com o invento apresenta numerosas vantagens? é rápido, fiável, económico e simples» ver i f icou -se que qs sinais reqi.sia.qqs iníeQxdas tqt.qitih* tricas 5 oermitem ob ter cu.rv as de aferiçao regulares e satisfaió™ rias em função da número de células postas em execução5 nas condições usuais de manipul aç So a BSA s albumina, de sara bovino5 ou sara albumina bovina pyS s tampão fosfato salino com pH 7,4 1

EXEMPLO DQSAGEH DA πIELQPERQX1DASE DOS LEUCÓCITOS POLINUCLEARES DQ SANGUE HUMANO s d OS AGEM REALIZADA Eil PLACA DE ΜICROTI TULftCKQ«

A mieloperQKidase é uma enzima de natureza glicoprotei-ca compreendendo uma estrutura de ordem nEsta enzima abundante nos leucócitos polinucleares do sangue humano está envolvida nas funções bactericidas e anti-microhianas das células, (KLEBANOFF S»J,? J .Bacteriol, , 196S, 95 Invest. 5 1980, 66, 908-917)=, 11AMDND st col1 ϋ 1 i n , A dosagem acordo com o invento da mieloperoKida.se das- polinucleares de empreende três etapas realizadas sucessiva- mence s separação das polinucleares do sangue total temente ο

Nos exemplos que se vão seguir utilizar-sa-à • termos seguintes ou as suas abreviaturass i n u x f μ ri-'n— - ' ν' ,-· - ' ν' ,-· das células por um anticor- 2= a captura e imobilização selectiva po monoclonal previamente adsorvido em microcavidades de uma placa de microtitulaçâEog 3. a revelac-lo da activida.de da enzima celular» a)Preparação da p1aca U ti I i se uma olaca de microtitulação por NUMC <Rei e- rênuia 64394 5 LOis^or 96 microcavidades, Coloca-se em cada microcavidade 2©Θ μΐ de uma solução contendo o anticorpo mono-clonal purificado anti—CD15 (denominado SMY Í5a) utilizado para imobilizar os leucócitos polinucleares, isto è? para efeetuar a durante da plac< A adsorção do ant 12 horas» Elimina-se corpo monoclonal efectua-se o anticorpo em excesso com a viragem sua imunocaptura, fc.ste anticorpo comer ciai i zado por tíIOSYtí 3 Compièqne, France, sob a referfncia SMY 15a ê utili Z :3i Q 3. na concentração de 5 pg/ml num tampão de fos fato CC- w. X ino de pli “7 3 / ς i (PBS). solução contendo €?,!% dfcf Qtflatina. e 0,3¾ !'r*TStO salino, Introduz -se 25Θ μΐ desta s s a fim de saturar a super f i c x q d a.ia o que tf LUI is^guido uayOib dt; 1 hora a 37’"'C» lava-se as placas 3 vezes com a ajuda de um tampão de fosfato salino» As placas assim preparadas são armazenadas a 4°C« h> Separação dos leucócitos polinucleares, 0 sangue á recolhido sobre o anticuagulante Cheparina) Num tubo de hemólise de 5 ml, introduz—se sucessivamente 2 ml dc \ '* \ ί?Ό'λ. meio de separação MOhJO_PQLY ÍFLOW réf„ 16,980-49) e deposita-se 2 ml de sangue. 0 tubo é em seguida csntrifugado a 4ΘΘ x g durante 4fl minutos á temperatura do laboratório,, Formam-se dois anéis de suspensão celular, o anel inferior contém os polinuclsares- que s§o recuperadas com a ajuda de uma micropipeta. c ) Iniunocaptura ce 1 ular. ,4 captura das células é realizada graças ao anticopo monoclonal anti-CD15 adsorvido.

Introduz-se nas microcavida.dss da placa 100 μΧ da cr suspensão celular ajustada a 5 x 10“ células por ml de tampão PBS» Para melhorar a fixação das células sobre o suporte, centri-fuga-se a placa durante 3 minutos a 150 x g depois de esperar 1Θ minutos à d) Revelação e medida da mieioperoxidase,,

Esvaziam-se as microcavidades virando a placa. Lava—se 2 vezes com 2Θ0 i_tl do tampão PBS o que permite : 1ÃÇwSS le X ϋ. x w.i* cn) in d ese j âvex s *caxs c orno os monócitos ou as hematias que podem estar na origem de um sinal de parasita de absorvfncia. Depois da segunda lavagem, junta—se sm cada cavidade 1Θ0 μΐ do reagente de revelação preparado extempo— raneamente. 0 reagente de revelação é obtido da seguinte meneiras prepara-se um tampão citrato 0,1 π dissolvendo o ácido cítrica monohidratado a 2% em água e ajustando ao pH 5 por adição de soda

Realiza-se em seguida uma solução a 2% de brometo hexadecil- use 1 ha r a trimetiI amónio í= CE"1 fíi-í, IDUZART et MATIBNON l 5650) no tampão, 0 reagente permeaoilíza as membranas celulares e melhora. «

solução junta-se* antes de utilizar* 3# mg de dicloridrato de ortofenilenodiamina depois 4® μΐ de -água oxigenada (substrato da enzima).

Depois da incubação durante 1® minutos, mede-se a absorVincia no espectrofotómetro a 45# nm (aparelho Titertek Multiskan type 31# C — Flow Laboratories)=

Para uma experiência, as absorvêncxas obtidas com 5# ### células são dadas no quadro 1 que se segues QUA.DkQ 1 i i

j CÉLULAS ) CÉLULAS + {SOZINHAS | REAGENTES SEM J__í______

CÉLULAS + REGENTES ΓΑΒ i COM CETAB í j_

Vi.»' HDsarvdncia #,##o 1,54o A presença de CETAB no meio de revelação aumenta de um factor 4 a densidade óptica devida à reacção catalisada pela mieloperoxidase* o que permite reduzir o número de células necessárias para a dosagem EXEMPLO 2

l/USAGEn DA HIELOPERL‘XlDASE DOS LtUCDuITOS POLlNUCLEARES DQ SANGUE E DA URINA8 DOSASEH REALIZADA SOBRE ESFERAS MAGNÉTICAS

Este exemplo é destinado a mostrar que se pode dimi nuir a duração necessária à relativamente ás condiçSes de· processa de imunocaptura das dosagem de uma enzima endógena* xrritas n.o exemplo 1, modificando o células, 0 suporte utilizada para ' :U'. ' :U'. ϊ~· feras magnétic *1 •th a izadas onr RinSY ..D 0 inas de ratos. A “· .Έ· CD 01 U.íiiS. solução- d d capturar as células é constituída por DYNABEADS. As ssfsrss C ref <, DYN—11001 comer tem à sua superfície anticorpos anti-imuna esferas slo tratadas antes de serem utiliza das rpos monac1onai s anti· -CD15 (ref» 8MY 15a - BIOSYS France) e 12 horas- a 4°C» Por isso, místura-s e 25 μΐ da suspensão feras a Θ,5 ml de so1uçlo de an tic orpo a 100 pg/ml de PBS» As esferas são a seguir lavadas 3 v •ezes com tamplo PBS depois saturadas durante 12 horas a 4°C por uma solução a Q53% de albumina de soro bovino (BSA) = As es-íeras- prontas a serem usadas são conservadas a 4°C» A dosaqem da mieloperoxidase ê feita num tubo de hemélise de 5 mlp introduz-se no tubo 3ΘΘ μΐ de tampão PBS5 25 μΐ de suspensão de esferas e 1ΘΘ μΐ de sangue completo recolhido do heparinato de lítio (tubo VACUTAINER ref =·. 606 484). Depois de 5 minutos sob agitação suaves as esferas 3.m— 33 graças a um iman e as ç :élulas fixas nas esferas são 1SV 3.0 3*3 t*». T". .····. uusii F'tíb (5 lavagens •)» A mieloperoxidase é revelada com um reagente misto contendo o substrato (água oxigenada) e o cromoqénio Cortofenil™ enodiamina) preparada como no exemplo 1s com ou sem incorporação de CETAB» A absorvincia é medida em condições id'ênticas às do exemplo í» Os resultados são dados no quadro 2. A medida das mielopsroxidases dos granulócitos presentes na urina no decurso das infecçSes urinárias é um elemento de diagnóstico importante das pielonefrites e piúrias» Demonstrou—se na segunda parte do exemplo que as partículas magnéticas contendo o mesmo anticorpo monoclonal anii-CDÍS são capazes de capturar os leucócitos polinucleares no liquido urinário» ft dosagem é realizada sobre 40® μ1 do líquido urinário contendo cerca de 2 x V. ί ί Ο ·' 1 θ’~ de granulócitos por ml» A5 células são capturadas com 25 μΐ de suspensão de esferas, depois tratadas nas mesmas condições; que no exemplo precedente» Os resultados sSd dados no quadro 2 que se segue»

SyâDRO.2 ABSORVêNCIAS ESFEKAS + reagente de revelação ESFERAS + CÉLULAS sozinhas ESFERAS + células + reagen te de revelação sem CETAB ESFERAS + CÉLULAS + reagente de revelação com CETAB SANGUE COMPLETO Θ,025 0,011 0»®323 1,324 URINA 0,025 0,008 0,286 1,115

De acordo com o processo descrito neste exemplo, a dosagem foi efectuada directamente sobre a amostra de sangue, depois sobre a amostra de urina, sem necessitar de separação prévia da população celular a. analisar» Por outro lado, α periodo de incubação é sémente de 5 minutos» Assim, utilizando as esferas magnéticas como suporte sólida, o conjunto das operações de dosagem é particularmente simples e rápido»

Claims (2)

> â

1 :t·„ ~ Equipamento para dosagem de uma enzima endógena característica de uma população ou de uma sub-população celular caracterxzario por compreender como componentesε a) um suporte sólido sobre o qual estão fixas por ligação convalente ou por absorção física um ou mais anticorpos monoclonais dirigidos contra os antiqénios de superfície da população celular a dosar? b) uma ou várias soluções contendo os- reagentes- neces sérios (substrato e dado o caso o cromogénio) para realçar actividade da enzima? c) um componente adicional constituído por uma tampão de lavagem e eventualmente amostras que permitem a ç;ão e o controlo de qualidade da dosagem. olução aferi— 2ê = - Equipamento de acorda com a caracterisado por compreender por outro lado melhore a permeabilidade da membrana celular. reivindicação 1 um reagente que J 3ã« - 1 ou 23 caracter constituído por estão fixos o ou entre as quais Equipamento de acordo com uma das reivindicações izsdo por o componente (a) ser um suporte sólido uma placa de microtitulação em cujas cavidades , os anticorpos destinados a imobilizar as células se encontram as da população ou sub-população contendo enzima a dosar. 4-ãr. - Equipamento de acordo com uma das reivindicaç õe: 1 ou 2¾ caracterizado por o componente (a) ser um suporte magné· tlCD partículado» . > ;· t b-â-* - tquipamenio de acordo com uma das rsivíndicaçSs· 35 caracterizado por o componente (A) ser um tubo» de acordo com qualquer uma d as frizado por o cDiaponente (a) - ser ou. ò-ã:* - Equipamento de reivindicações 1 a 5 cara' constituído por um suporte sólido sobre o qual estio fixos um mais anticorpos monoclonais anti—HLA de classe I, 7ã» - Equipamento de acordo com a reivindicação fo5 caracterizado por o anticorpo monoclonal fixo ser o anticorpo denominado por S-classe I» 8â» - Equipamento de acordo com qualquer uma das reivindicações i a /? caracterizado por o componente (b) ccírr preender essencialmente água oxigenada e um cromoqénio escolhido entre a ortofenilenadlamina5 ácido 2,2' -azino-bis <3~etil--henzo-·-tiazolino-ó-sulfónico), 3,3'“dlamino—benzidina, 3—amino-9-sti1— população ou s — Processo de dosaqem das enzimas endóqenas de uma uh-população celulçar5 caracterizado por consistira a) em imobilizar a população celular contendo a enzima a dosar ou uma população celular compreendendo a sub-populaçlo contendo a enzima endógena a dosar sobre um suporte sólido utilizando u.m ou mais anticorpos monoclonais previamente fixos por ligação covalente ou por adsorçlo física sobre o referido suporte e capaz de reconhecer um antigénio presente à superfície das células5 b) em observar um período de incubação§

p s DU DS a acti d> em juntar o cromogénio) para realçar saqentes necessário» ísubstr idade da. enzima endógena* s) Sm ler os resultados pala medida dos sinais luminosos (coloração ou fluorescência) referindo—se eventual mente a tuna Qclfihrl Q8 STSriÇSD# Processo de dosagem de acordo com a reivindica ção 95 carcatsrizado por o suporte sólida ser tal como definido numa das reivindicações 3, 4 ou 5. 11-â. - Processo de dosagem de acordo com uma das reivindicações 9 ou 1Φcaracterizado por a actividade da enzima ser revelada pela água oxigenada e um cromogénio escolhido entre -az i no—D ortofenileno dlamina- ácido is—(3—efci1—benzotiazolin- -ó-sulfónico), 3=3—diamino—benzidina5 3-amino-9—etil-carbazole ou um dos seus sais- solúveis em égua» i i. a ~ P “rú CÍ=ÍS' su de au Ordu uOiii qual quer uma das rsivi n- d icaçSss v» 1Θ ou 11 ç Sk râcteriz ado por a dur açãO to ta .1 da 9K9C ç 3o da dosagem ser i nfe ΓΙΟΓ DU igual a 3β mi nuto- s» 13§» - Pr S £1 0’ sso ds acordo com a rei vi ndic ãip a. o o τ ^ c aracteri zado por o OU os anfci corpos monoc *1___ 1 Uí i3 is fi >;os sob rs Q -::r uporte sólido jr em an ticorpos anti-HL h de c l as· 5Θ I 14§„ - Pr oce sso de acordo com Cl rei vi ndic s. c -S o ç\ i jj c aracterizado por o an ticOrpD monoc1ona1 f X K o sohr e o supor te sólido ser o anticorpo denominado S-classe I, Ρ ^ * -5Γ ''' \ % ’ · * -> ^ " — -Ξ: J ^ ” “ Ors : ^ ; > ·· v> SÍCN. ÍU'È R “ PruCtísSO ds acordo coo a. reivindi a.do por se dosar a mieiopero. κ i. d ase ©ndóQena lócitos do sangue humana ou da urina. Lisboa« 2.2 de Março de í990

j. PEREIRA D Â C R U

2 Agente Oficia! & Prsprisáaáe Inàfâtrial RUA VICTGH C0R®@N, 10-A, 1-* 1200 LI6B©I