PT88615B - Equipamento e metodo de dosagem imunometrica aplicavel a celulas completas - Google Patents

Description

monoclonal especifico da população ou sub-população celular a dosar, marcado por uma sonda radio-isotópica ou uma sonda enzimática;

c) no caso de anticorpos marcados por uma sonda enzimática, uma ou várias soluções fornecendo os reagentes neces sários (substrato e cromogenio) para revelar a actividade da enzima.

invento diz igualmente respeito a um processo de dosagem imunométrica de antigénios de superficie de uma população ou sub-população celular.

equipamento para dosagem e o processo imunométrico de acordo com o invento podem ser utilizados para dosagem global da população de linfócitos T e/ou das sub-populações de linfócitos T4 e T8.

presente invento diz respeito a ura equipamento e a um método de dosagem imunomótrica utilizando esse equipamento, para a dosagem de antigénios de superfície caracteristicos de populaçõés ou de sub-populações de células. 0 método de dosagem imunométrica © o equipamento correspondente são igualmente destinados à dosagem das próprias células, por intermédio da dosagem dos seus antigénios de superfície. Estas dosagens são aplicáveis ao diagnóstico.

conhecimento dos antigénios ou marcadores da superfície celular tem feito enormes processos com a regulação de hibridação linfocitária e a descober ta dos anticorpos monoclonais por KOEHLER et MILSTEIN (Nature”, 1975, 256, ^95-^97)”· Os anticorpos monoclonais têm, nomeadamente permitido pôr em evidência © analisar os marcadores de superfície ou antigénios membranários de células das origens mais variadas. Estes marcadores (ou antigénios) podem ser de diferentes naturezas; proteínas, glico proteínas ou glicolípidos. As caracterizações dirigem-se então principalmente aos marcadores de tecido ou de orgão, aos marcadores de estados de diferenciação ou de activação de células normais e à identificação ou à tipificação de células normais ou cancerosas. Um dominio de aplicação par ticularmente importante é o esbudo das linhagens celulares da hematopoese (eritrocitária, megacariocitária, granulocitária, monocitária, linfocitária).

Assim, por exemplo, os anticorpos monoclonais permitiram precisar as características de superfície respectivas dos linfócitos T e B. Os marcadores correspondentes sozinhos ou em combinação identificam estádios de diferenciação e de especialização funcional dos linfócitos. Por convenção internacional, os marcadores de superfície dos leucócitos humanos têm sido classificados em grupos ou classes de diferenciação (CD) definidos aquando do Sons-Comité IVIS-OMS, 1984 e descritos no Boletim da Organisation Mondiale de La Santé, 1984,62 (s), 813-815.

A identificação destes marcadores tornada possivel graças aos anticorpos monoclonais permitiu ter acesso à sua estrutura e às suas funcções biológicas.

Por exemplo, as moléculas dos marcadores CD4 e CD8 participam nas funções de adesão leucocitária e encontram-se à superfície dos linfocitos T, na função auxiliar e indutora (marcador CD4) ou na função citotóxica e supressora (marcador CD8), respectivamente.

estabelecimento destes conhecimentos permitiu a utilização destes marcadores graças aos anticorpos que os reconhecem para o diagnóstico e o acompanhamento de patologias várias como, nomeadamente, as hemopatias malignas (leucemias, linfornas, etc), e os estados de disfuncionamento do sistema imunitário, doenças autoimunes, deficiências imunitárias congénitas ou adquiridas como a SIDA, etc.) (BRETON-GORIUS e VAINCHENKER, Le Biologiste. 1987, XXI, No. 167 63-7θ, SHAW, Immunology today. 1987, 8 (1), 1-3).

Os anticorpos monoclonais são hoje utensilios insubstituíveis da biologia clinica aplicada às analises celulares.

Existem métodos de enumeração de células que utilizam a marcação dos seus antigéniõs de superfície, mas estes métodos são frequentemente longos, trabalhosos, difíceis de por em execução e os resultados são por vezes aleatórios.

Os métodos conhecidos e utiliza-5-

,-.

dos para medir a expressão normal ou modificada dos antigénios da superfície da célula podem ser separados em dois grupos. No primeiro grupo, os antigénios são medidos com o auxilio de equipamento de laboratório complexos e especializados que assentam na citometria de fluxo (ver nomeadamente PONCELET et Coli., J. Immunol. Methods, 1985, 85, 65-74) ou nas técnicas de microscopia quantitativa (POULTER et Coli. J. Immunol. Methods. 1987, 98, 227-234), A utilização destes métodos de avaliação dos antigénios da célula baseia-se na medição de sinais fornecidos pelos anticorpos anticelulas ligados de maneira directa ou indirecta a um reagente marcado por substâncias fluorescentes (ou fluca? cronios), tais como isotiocianato de fluorescina ou de rodamina ou por enzimas tais como peroxidase ou fosfatase alcalina. A utilização destes reagentes fluorescentes ou enzimáticos associados a etapes apropriados de lavagens conduz então à aparição de fluorescências ou de colorações estritamente limitadas âs membranas celulares e não se difundindo no meio ambiente. A utilização corrente destes métodos em laboratório é limitada pela necessidade de uma aparelhagem especializada e dispendiosa (microscopia de fluorescência associado ou não a um analisador de imagem, cirostato, citémetro de fluxo). Para além disso, a análise e a interpretação das imunomarcações das células por estes processos tornam necessária a competência de um especialista em citologia.

Um segundo grupo de métodos de medição de antigénios baseia-se na avaliação quantitativa dos marcadores da população celular global. Estes métodos permitem a medição de antigénios por uma marcação quer directa quer indirecta, que é então realizada na maior parte das vezes em duas, três ou quatro etapas. Em todos estes casos, o reagente utilizado aquando da última etapa da marcação transporta uma sonda que é ou de natureza isotópica, ”Iodo 125, por exemplo, para uma dosagem de tipo imuno-radiométrico (Brow et Coli. J. Immunol. Methods.1979 31, 201, STOCKER e HEUSSER J. Immunol. Methods. 1979 26, 87-95), ou uma enzima para uma dosagem de tipo imuno-enzinométrico, na maior parte das vezes peroxidase, foâfatase alcalina ou heta-galactosidade (VAN LEUVEN et Coli·, J. Immunol. Methods, 1978, 23, 109-116- MORRIS Transplantation 1983, 36(6), 719 - BAUMGARTEN J. Immunol. Methods, 1986,

94, 91-98).

Os métodos deste útlimo grupo são bastante incómodos, tranalhosos e de aplicação perigosa, sendo necessárias numerosas lavagens e centrifugações do material celular, é necessário por vezes retirar antes o meio colorido resultante da reacção enzimática com vista à medição espectrofotométrica final; por fim a fixação quimica das células, que é a mais frequentemente utilizada, está na origem da destruição irreversível de determinados antigénios particularmente sensíveis aos fixadores químicos usuais, tais como glutaraldeido ou metanol (DROVER et Coli J. Immunol. Methods. 1986, 90, 275-271).

É conhecido na literatura da especialidade, que se pode dosar um antigénio transportando várias determinantes antigénicas, isto é, vários epitopes, fixando-se este antigénio por um dos seus epítopes graças a um anti-corpo imobilizado sobre um suporte sólido e ligando-se a um outro epítope do antigénio um outro anticorpo portador de um marcador enzimático ou radio-isotópico permitindo a dosagem.

Uma tal técnica, frequentemente designada por técnica Sandwich, é nomeadamente descrita nas patentes ou pedidos de patentes PR 2.487 983, PR 2500 l66, EP 119 736. Nenhum destes documentos descreve a aplicação desta técnica em células completas, mesmo se a palavra célula está por vezes incluída na lista dos antigénios aos quais se aplica o processo

Nas patentes acima, os diferenteo antigénios, objecto dos exemplos descritos, são todos e unicamente moléculas proteicas, solúveis em água e em líquidos fisiológicos, tais como hormonas, enzimas ou marcadores tumorais circulantes. Por oposição, é evidente que uma célula não é uma molécula e distingue-se dela pelo menos por uma estrutura consideravelmente mais elevada e pelo facto de ela não ser solúvel nos meios fisiológicos. Assim até agora, a técnica sandwich.” não foi nunca aplicada às células completas.

Para além disso, a imunocaptura de células sobre um suporte sólido é descrita no pedido de patente WO 86/02091, no qual o objectivo é a aliminação das células indesejáveis em amostras de medula óssea destinada a transplantações.

Neste pedido de patente, a captu ra das células é realizada sobre microesferas flutuantes e necessita que o anti-corpo utilizado seja ligado ao suporte sólido por uma estrutura macromolecular complexa, designa^fda por rede/relé, capaz de assegurar uma orientação priveligiada do anticorpo em relação à do antigénio celular correspondente. Neste pedido não é indicada qualquer aplicação da técnica à dosagem quantitativa de um antigénio.

A imunocaptura de células é igualmente descrita no pedido de patente WO 84/03151 para uma aplicação analítica. Neste pedido, o objectivo é a identificação dos grupos tecidulares a que pertencem as células examinadas (operação geralmente designada por tipificação HCA). A captura de células é efectuada graças aos anticorpos dispostos segundo uma geometria especifica

em suportes muito especializados (lamelas de microscópio). Os resultados são obtidos por simples observação visual do suporte e conduzem a respostas de tudo ou nada. Assim, os sistemas de imunocaptura de células descritas ató ao presente não conduzem às aplicações analíticas que permitem a determinação quantitativa de um antigénio expresso na membrana de algumas células. Para além disso, todos estes sistemas podem ser felhos de especificidade por que assentam no conhecimento das células por um único anticorpo.

método de dosagem, que é objecto do presente invento, possui vantagens consideráveis em relação a todas as técnicas anteriormente conhecidas e utilizadas, dado ele pennitir medir de forma quantitativa qualquer antigénio de uma população celular num sé tempo de análise. Esta dosagem é realizada sobre células que não tenham sofrido qualquer intervenção quimica ou fisica e que estão no seu estado de integridade fisiológica.

Para além disso, o método de dosagem de acordo com o invento possui as características de especificidade muito elevada, próprias dos sistemas de duplo reconhecimento imunológico, pondo-se em funcionamento 2 anticorpos diferentes específicos e de 2 antigénios diferentes transportados pela mesma célula. Este método é simples, rápido e reprodutível. Ele está perfeitamente adaptado à análise de um grande número de amostras, o que permite a sua utilização para fins de diagnóstico nos laboratórios de biologia clinica de grande capacidade.

Assim, o presente invento diz respeito a um equipamento para a dosagem imunométrica de ' pelo menos um antigénio de superfície caracteristico de uma população ou sub-população celular compreendendo como componentes:

a) um suporte sólido sobre o qual se fixam por ligação covalente ou adsorção fisica um ou vários anticorpos monoclonais dirigidos contra antigénios de superficie da população celular examinada, para além do referido antigénio caracteristico, e destinados a imobilizar sobre o suporte, as células, entre as quais se encontram as da sub-população que transporta o antigénio a dosar;

b) pelo menos uma solução contendo um anticorpo monoclonal especifico do referido antigénio caracteristico da população ou sub-população celular que transporta o antigénio a dosar, marcado por uma sonda radioisotópica ou uma sonda enzimática;

c) no caso de anticorpos monoclonais marcados por uma sonda enzimática, um revelador da enzima, a saber, uma ou várias soluções contendo o substracto da enzima e, nesse caso, um ou vários reagentes necessários para revelar a actividade da enzima.

termo célula, utilizado na presente memória descritiva e nas reivindicações anexas, inclui as células humanas, as células animais, as células de protozoários (bactérias ou cliampignons). No que concer ne às células sanguíneas, o presente invento inclui elementos figurados com um ou vários núcleos, tais como os leucócitos e os elementos figurados sem núcleos, tais como as Iiematias ou as plaquetas.

método de dosagem de acordo com o invento aplica-se às células completas, isto ó, não lisadas.

Estas células não sofreram

qualquer intervenção fisica ou química θ são postas em funcionamento num estado de integridade fisiológica completa. Esta situação constitui a melhor garantia de integridade dos marcadores membranários escolhidos como alvos de dosagem.

Como suporte sólido, pode-se utilizar qualquer dispositivo adaptado à manipulação de suspensões celulares e preferencialmente dos tubos, dos suportes magnéticos específicos ou das placas rígidas ou flexíveis de microtitulação em polietileno, polistireno, cloreto de polivinilo ou nitrocelulose, com microcavidades. Os anticorpos monoclonais destinados à imobilização das células podem ser fixados sobre os suportes sólidos, quer por ligação química covalente, quer por adsorção fisica, de acordo com as técnicas clássicas bem conhecidas do perito na técnica da especialidade, nomeadamente as descritas por STOCKER et HEUSSER J. Immunol. Methods, 1979, Vol. 26 págs. 87-95. De preferência, o suporte pode ser previamente saturado por meio de uma proteína.

De acordo com o invento, o ou os anticorpos monoclonais fixados no suporte sólido devem permitir a imunocaptura da população celular entre a qual so encontra a ou as populações celulares portadoras dos antigénios a dosar. Quando esta população é constituida por células humanas, os anticorpos monoclonais preferidos para a imunocaptura são os anticorpos anti-HCA da classe I, que são específicos da parte comum dos antigénios HCA,

A, B e C presentes nos leucócitos e numerosas outras linhagens do organismo. Entre estes anticorpos, o designado por S-classe I, comercializado por BIOSYS é particularmente preferido.

Noutros casos em que as células examinadas são células humanas e em todos os casos em que

estas células não são humanas, pode-se igualmente utilizar anticorpos monoclonais apropriados ao tipo de células examinadas para a imunocaptura de acordo com o invento.

A expressão um anticorpo monoclonal marcado por uma sonda radioisotépica significa que o anticorpo monoclonal transporta, quer sobre um elemento próprio da sua estrutura, por exemplo os resíduos de tirosina constitutivos, quer sobre ura radical apropriado que lhe foi fixado, um isétipo radioactivo permitindo a sua dosagem por contagem da radioactividade que lhe está associada.

A expressão ura anticorpo monoclonal marcado por uma sonda enzimática significa que o anticorpo monoclonal está acoplado a uma enzima que, associada ao emprego de reagentes, apropriados, permite uma medição quantitativa deste anticorpo monoclonal.

substrato e os reagentes são escolhidos de maneira que o produto final da reacção ou da sequência de reacções provocada pela enzima e pondo estas substâncias em funcionamento seja:

- ou uma substância colorida ou fluorescente que se torna difusa no meio liquido que rodeia as células e que é objecto da medição final espectrofotométrica ou fluorimé trica respectivamente.

ou uma substância colorida insolúvel que se deposita sobre as células e as paredes sobre as quais elas se fixam e que pode ser objecto quer de uma medição fotométrica por reflexão, quer de uma avaliação a olho nu, eventualmente em relação a uma gama de cores aferidas.

-120 equipamento de dosagem pode conter, como componente adicional, uma solução tampão destinada à lavagem do suporte sólido após imobilização e marcação dai» células com o ou os anticorpos que transportam a sonda escolhida.

equipamento de dosagem pode também conter, como componentes adicionais, as amostras necessárias à aferição da dosagem, bem como ao controlo da qualidade de dosagem.

presente invento tem igualmente como objectivo um processo para a dosagem imunométrica dos antigénios de superfície de uma população celular caracterizada por compreender:

- uma etapa única para a imobilização especifica ou imunocaptura de uma população celular sobre o suporte sólido, utilizando-se um ou vários anticorpos monoclonais previamente fixado por ligação covalente ou por adsorção fisica sobre o dito suporte e capaz de reconhecer um antigénio presente na superfície das células para além do antigénio a dosar e, simultaneamente a marcação directa do antigénio de superfície a dosar, pertencente à população celular iittobilizada, ou a uma das suas sub-populações, por um anticorpo monoclonal especifico deste antigénio a dosar, transportando o dito anticorpo monoclonal uma sonda radioisotópica ou, em alternativa, enzimát ica ;

- um periodo de incubação para permitir a imunocaptura e a marcação simultâneas;

- a lavagem do suporte sólido para eliminar as células indesejáveis não imobilizadas e o excesso de anticorpo monoclonal que transporta a sonda radioisotópica ou enzimática;

- a dosagem propriamente dita do antigénio a dosar na população ou sub-população celular marcada, por contagem da radioactividade fixada ou, em alternativa, após tratamento do meio pelo substrato da enzima e eventualmente um ou vários reagentes auxiliares apropriados, por medição fotomótrica em transmissão ou em reflexão, ou por medição da emissão de fluorescência.

equipamento de dosagem e o processo imunomótrico de acordo com o invento aplicam-se de forma preferencial à dosagem dos antigónios de superfície dos elementos figurados do sangue humano, nomeadamente os leucócitos, mais especificamente os linfócitos, os linfócitos T, os linfócitos T^, os linfócitos T8, os linfócitos B, bem como os granulócitos, os monócitos e as plaquetas sanguíneas.

Uma outra aplicação preferencial ó a dosagem dos antigónios de superfície dos microorganismo s patogónicos, por exemplo, Candida albicans.

Para além disso, o equipamento de dosagem e o processo imunomótrico de acordo com o invento são particularmente úteis para a dosagem dos antigónios de superfície das células tumorais, nomeadamente as dos cancros do aparelho urinário e as das hemopatias malignas.

equipamento de dosagem e o processo imunomótrico de acordo com o invento permitem medir os sinais (radioactividade ou luz absorvida ou emitida) dependendo simultaneamente do número de células presentes na população celular examinada e da densidade do antigénio medido na superfície destas células.

A medição destes sinais permite uma avaliação quantitativa do numero total de moléculas deste antigénio que são transportadas pela população ou sub população celular examinada, quer este antigénio seja de tipo estrutural ou funcional.

Por exemplo, no caso dos marcadores leucocitários particularmento importantes em hematologia, saba-se que nos seres sãos, na maioria das situações o valor médio da densidade antigénica não varia de forma importante de uma amostra para outra para uma mesma população celular. Existe nesse caso uma boa correlação entre a enumeração citológica das células que transportam o antigénio em apreciação e o sinal medido de acordo com o invento, que é proporcional ao numero total de moléculas de antigénio presentes na amostra examinada. Pelo contrário, nalguns estados patológicos a desnidade dos antigénios de superfície pode variar para uma mesma população celular, sem que o numero ou a proporção das células positivas varie sensivelmente. Tais estados patológicos são mais eficazmente postos em evidência por aplicação do processo imunométrico de acordo com o invento, ou utilizan do o equipamento do presente invento, do que o seriam por um processo convencional de enumeração citológica.

Uma outra aplicação do invento surge na escolha, como suporte sólido, de uma placa de microtitulação. 0 equipamento de dosagem e o processo imunométrico de acordo com o invento podem assim ser utilizados com vantagem para a dosagem sobre uma línica placa de uma série de antigénios de superfície caracteristicos de diversas sub-populações constitutivas da população celular examinada. Para esta aplicação, pode-se utilizar por um lado, placas de microtitulação prontas para utilização, sobre as quais se fixaram previamente um ou vários anticorpos monoclonais capazes de reter todas as células da

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população examinada e, por outro lado, dispor de uma série de anticorpos inonoclonais acoplados a um marcador apropriado e específicos, cada um, de um antigénio caracteristico de uma das sub-populações a avaliar, Assim, numa só manipulação e sobre um mesmo suporte, pode-se obter a dosagem quantitativa de todos os antigénios necessários à caracterização das sub-populaÇÕes escolhidas.

Esta aplicação do presente invento é ilustrada pela caracterização do equipamento antigénio de células que apresentam um interesse em biologia clinica. Um primeiro caso é representado pela determinação dos grupos tecidulares que caracterizam um determina' indivíduo, conhecida pela denominação usual de tipificação

HLA.

Um segundo caso é representado pela tipificação de células tumorais, em particular, para os doentes que sofrem de hemopatias malignas, tais como leucemias ou linfornas. Este exame de diagnóstico, praticado sistematicamente, consiste em caracterizar o tipo e a origem das células tumorais do paciente pela presença ou ausência, nas células, de uma série de antigénios de superficie convenientemente escolhidos.

Quando se utiliza o equipamento de acordo com o invento, compreendendo uma placa de microtitulação sobre a qual se fixou previamente um ou vários anticorpos inonoclonais capazes de fixar todas as células da população examinada e soluções de diferentes anti-corpos monoclonais marcados por uma sonda enzimática ou radioisotópicos e especificos, cada um, de um antigénio presente nas células tumorais, pode-se identificar e avaliar quantitativamente os antigénios caracteristicos da população das células tumorais do paciente e desse modo ligá-las a um dos grandes grupos de câncros e nomeadamente de hemo-16-

patias malignas, clinicamente caracterizadas. A aplicação do processo de acordo com o invento permite assim efectuax· rapidamente, sobre um unico suporte, o exame qualitativo e quantitativo do equipamento antigénico das células tumorais.

A titulo de ilustração de uma outra aplicação do invento, pode-se citar o caso dos linfécitos T humanos, para os quais existem nomeadamente 2 sub-populações de células: os linfócitos caracterizados pela presença do marcador CD4 e a que se chamará linfécitos T4 positivos ou mais simplesmente linfécitos T4 e os linfécitos caracterizados pela presença do marcador CD8, a que se chamará linfécitos T8 positivos (ou linfócdtos T8).

A medida da relação numérica

T4/t8 apresenta um grande interesse de dignostico em biologia cliihca. Com efeito, sabe-se que as modificações da relação T4/T8’ aparecem em diversas afecções do sistema imunitário, tais como as doenças disimunitárias, as doenças infecciosas crónicas, as infecções virais e nomeadamente as afecções de HIV (virus do SIDA).

equipamento de dosagem e o processo imunomótrico de acordo com o invento podem ser utilizados para a dosagem de antigénios globalmente caracteristicos da população de linfécitos T e/ou de antigénios caracteristicos das subpopulações de linfécitos T4 e T8. Neste caso, efectua-se a imobilização especifica dos linfécitos T da amostra examinada sobre um suporte sólido e, simultaneamente efectua-se a marcação directa dos antigénios de superficie dos linfécitos T4 por um anticorpo monoclonal anti-CD4 transportando uma sonda radioisotépica ou enzimática; da mesma maneira, efectua-se a marcação directa dos antigénios de superficie dos linfécitos T8 por um anticorpo monoclonal anti-CD8 transportando uma sonda apropriada

Para a dosagem dos linfócitos

T totais, utiliza-se de preferência um anti-corpo monoclonal anti-CD7 (igualmente designado por anti-T2) transportando uma sonda apropriada.

Para obter a imobilização especifica dos linfócitos T da amostra, utiliza-se de preferência um ou vários anti-corpos monoclonais capazes, isoladamente ou em combinação de reconhecer a totalidade das células T da amostra, o que é o caso dos anticorpos anti-leucócitos comuns (ou anti-CD45) ou dos anti-corpos que reconhecem o conjunto da população T (ditos pan T”) tais como os anti-corpos anti-CD2 (ou anti-Tll), anti-CD5 (ou anti-Tl) anti-CD7 (ou anti-T2) ou outros anti-corpos pan-T não ainda afectados a uma classe de diferenciação de acordo com os critérios OMS.

Pode-se utilizar com vantagem o método imunométrico do invento para a dosagem de antigénios caracteristicos da população dos linfócitos T e dos linf6citos T4 e T8 em várias partes do mesmo suporte sólido. A medição dos sinais por contagem de radioactividade, medição fotométrica em transmissão ou em reflexão, ou medição de fluorescência permite calcular facil e directamente a relação numérica CD4/CD8.

Da mesma maneira, pode-se dosar sobre o mesmo suporte sólido, as sub-populações designadas por linfócitos T e linfócitos B, constitutivos do conjunto da linhagem linfocitária.

Pode-se por exemplo, fixar por adsorção um anticorpo monoclonal ou uma mistura de anticorpos monoclonais específicos da totalidade dos antigénios de superfície das células T sobre as paredes das microcavidades. Estes anticorpos monoclonais permitirão imobilizar

posteriormente, nas microcavidades toda a população das células T da amostra examinada. Às placas assim preparadas podem ser liofilizadas e armazenadas, de preferência a 4?0. Esta etapa pode ser realizada industrialmente e poder-se-à desse modo dispor de placas prontas a ser utilizadas para os equipamentos de dosagem aplicáveis quer aes linfócitos T totais, quer a toda a sub-população dos linfócitos T.

As amostras contendo as células a dosar e provenientes do sangue ou de qualquer liquido biológico apropriado, normal ou patológico, podem ser utilizadas tal como se apresentam ou após preparação, nomeadamente por centrifugação em gradiente da densidade de acordo com os métodos já conhecidos © em particular em agente de forte densidade como, por exemplo o EICOLL-PAQXJE, comercializado por Pharmacia. Para a dosagem dos linfócitos sanguíneos, pode-se igualmente tratar a amostra de sangue a dosar com uma solução designada por tampão de lise, que lis os glóbulos vermelhos.

Colocam-se partes aliquotas da suspensão celular apropriada em contacto com o suporte sólido, por exemplo, nas micro-cavidades de uma placa de microtitulação previamente preparada, ao mesmo tempo que a solução que faz parte do equipamento de dosagem e que contem o anticorpo monoclonal especifico da população celular visada e que transporta uma sonda apropriada, isto é, um marcador radio-isotópico ou enzimático. Assim, uma sonda radio-isotópica pode ser levada a efeito, por exemplo, por marcação do anticorpo monoclonal de iodo 125 ou iodo 131, por exemplo em presença de oloramina T de acordo com um processo conhecido (F.C. GREEWOOD, ¥. M. HDNTER et Coli, Biochem. J., 1963, 89. Il4), ou então uma sonda enzimática pode ser levada a efeito conjugando-se o anti-corpo monoclonal com uma enzima tal como fosfatase alcalina, peroxidase betagalactosida^e ou acetilcelinesterase, de acordo

com os métodos conhecidos (ver por exemplo M. O’SULLIV.A2í Methods in Enzymology 1981, 73. 1^7 ou de acordo com um método daí resultante. Em determinados casos, para evitar certos inconvenientes ligados à manipulação de substâncias radioactivas e à duração limitada de validade dos reagentes as enzimas serão utilizadas de preferencia em sondas radio-isotópicas.

periodo de incubação, isto é a duração necessária para a imobilização e a marcação simultânea das células é de preferência inferior ou igual a 1 hora. Durante este periodo de tempo, o suporte sólido pode eventualmente ser centrifugado para melhorar a imobilização das células. 0 suporte sólido, a placa de microtitulação, por exemplo, é a seguir levado para eliminação ao mesmo tempo das células não fixas e o anticorpo monoclonal que transporta uma sonda enzimática ou radio-isotópica em excesso.

Quando se utiliza uma sonda radio-isotópica, como por exemplo o iodo 125, a radioactividade associada às células é contada num contador gama segundo qualquer modalidade apropriada e, por exemplo, após solubilização das células por uma solução alcalina (por exemplo uma solução de soda) e recuperação da sa lução contendo a radioactividade com a ajuda de um tampão absorvente

Quando se utiliza uma sonda enzimática sobre o anticoi'po monoclonal, obtem-se a aparição de um produto colorido ou fluorescente juntando-se ao suporte sólido, sobre o qual se fixou a população celular transportando o antigénio a dosar, uma solução contendo o substracto da enzima e um ou vários reagentes auxiliares, o que por fim permite a obtenção, como produto de reacção, quer de um produto colorido solúvel no meio, quer um produto colorido insolúvel, quer um produto fluorescente solúvel

conforme explicado anteriormente. Mede-se seguidamente o sinal luminoso proveniente das amostras tratadas desse modo por meio da aparelhagem adaptada a cada caso: fotómetro ein transmissão ou em reflexão ou fluorímetro, respectivamente. Quando o suporte sólido é uma placa de microtitulação, a leitura do sinal luminoso pode ser efectuada em sequência em todas as cavidades duma mesma placa pela utilização de leitores automatizados de utilização corrente nos laboratórios de biologia, nomeadamente, por exemplo, o leitor de placa Titertek ou o leitor de placa Fluoroscan”, para as leituras espectrofotométricas ou fluoromótricas, respectivamente.

Utilizando-se como sonda enzimática a fosfatase alcalina, a ligação desta enzima ao anticorpo monoclonal efectua-se de acordo com o mótodo proposto por Boehringer Mannheim-Biochemica. Os substractos preferenciais desta enzima são paranitrofenilfosfato para uma leitura final espectrofotométrica ou 4-metil-umbelifenil-fosfato para uma leitura f luorimetrica. ou 5-hromo-^-cloro-j-indolil-fosfato para obter um produto de reacção colorido insolúvel. Pode-se do mesmo modo utilizar como sonda enzimática beta-galactosidade, cujos substractos preferenciais serão assim ortonitrofenil-beta-D-galactopiranosídeo ou 7í-me til-umbelif enil-bet a-D-galactopiranosídeo.

De preferência, pode-se ligar os anticoi-pos monoclonais à peroxidase, Neste caso, o processo de ligação deriva do descrito por Μ. B. Nilson e P.K. NAKANB in Zmmunofluorescence and Related Staining Techniques N. Iinapp, Ii. Iiolubar. G, Nicks eds, Elsevier/North Holland Amsterdam 1978, págs. 215-22¾. As modificações introduzidas em relação ao protocolo inicial de preparação do conjugado· enzimatico assentam nos pontos seguintes:

- relação molar peroxidase/anticorpo igual a 3, contra 2 no protocolo,

- oxidação menos acentuada dos motivos glucidicos da peroxidase por diminuição de 33/ da concentração proposta em periodato de sódio.

Os reagentes utilizados para revelar a peroxidase conjugada aos anticorpos monoclonais contêm a água oxigenada, substrato da enzima e um cromogónio apropriado, por exemplo ortofenilenodiamina ou ácido 2,2’-azino-bis(3-etil-benzotiazolino-6-sulí’ónico) ou ABTS, para obtenção de um produto final de reacção, colorido e solúvel no meio, ou então 3,3’-diamino-benzidina ou 3-amino-9-etil-carbazol ou 4-cloro-alfa-naftol para obtenção de um produto final de i-eacção insolúvel, ou então ácido parahidroxifenil-propiónico para obtenção de um produto de reacção fluorescente solúvel no meio.

De acordo com uma fórmula preferencial, o equipamento segundo o invento, para a dosagem de antigéniõs caracteristicos dos linfócitos T, T4 e T8, compreende:

a) uma placa de microtitulação em cujas cavidades estão fixados um ou vários anticorpos monoclonais antilinfócitos

T.

bL) unia solução contendo pelo menos um anticorpo monoclonal anti-linfócitos T marcado com peroxidase.

b2)uma solução contendo pelo menos um anticorpo monoclonal anti-antigónio CD4 marcado com peroxidase.

b3) uma solução contendo pelo menos um anticorpo monoclonal anti-antigénio CD8 marcado com peroxidase.

cl) uma solução contendo água oxigenada, substrato da enzima num tampão apropriado.

c2) uma solução contendo o cromogénio utilizado para revelar a expressão da actividade da enzima.

Um outro modo preferencial de realização do invento é a utilização de anticorpos monoclonais ligados à acetilcolinesterase.

A acetilcolinesterase liga-se a um anticorpo utilizando-se de preferencia um processo derivado do descrito na patente francesa No. 2 550 799 ou um processo que consiste esquematicamente na preparação de fragmentos do anticorpo por uma técnica conhecida, na modificação da enzima por reacção com um agente heterobifuncional apropriado e por fim na ligação dos produtos assim obtidos. Pode-se ainda utilizar neste caso outros processos conhecidos de construção de conjugados imunoenzimáticos.

A revelação da actividade enzimática especificamente ligada ao antigénio celular reconhecido pelo conjugado à acetilcolinesterase ó de preferência realizada segundo a técnica bem conhecida que utiliza a acetiltiocolina como substrato da enzima e o reagente de Sllman, ou ácido 5,5’ditio-2-nitro-benzoico como cromogénio, de acordo com qualquer variante adaptada ao caso examinado por exemplo à descrita por Pradelles et al Anal. Chem. 57 (1985) 1170-1173.

Os cromogénios citados são uti-23-

lizados tal qual ou sob a forma de sais solúveis na água.

Os resultados da dosagem dos antigénios de acordo com o invento podem ser expressos segundo qualquer modalidade apropriada ao exame efectuado.

Mais especificamente, pode-se exprimir estes resultados quer em numero total de moléculas de um antigénio especifico (por exemplo o antigénio CD4) presentes num dado volume da amostra examinada (por exemplo por microlitro de sangue), quer pela relação do número das moléculas de um antigénio com o número das moléculas de um outro antigénio na amostra examinada (por exemplo a relação entre os antigénios CC4 e os antigénios CDS - ou relação CD^/CD8 na amostra de sangue examinado.

Para determinar o número de moléculas de um detei-minado antigénio, na amostra examinada, utilizar-se-à de preferência uma gama de aferição constituída por células ou preparações celulares apropriadas, transportando o antigénio a dosar e que terão sido previamente calibradas por um método de referência conhecida. Estes padrões serão de preferência constituídos quer por células idênticas lia sua proveniência às células que serão objecto da dosagem, quer pelas células de linhagens celulares estabelecidas transportando o antigénio pretendido quer pelas preparações, por exemplo de membranas, provenientes destas células.

Estes padrões são então tratados exactamente como as amostras a examinar. Os sinais deles decorrentes servem para construir uma gama de aferição à qual se relacionam os sinais medidos com as amostras a examinar. Os cálculos posteriores são clássicos.

Para determinar a relação dos números de moléculas de dois antigénios na amostra a examinar, pode-se utilizar o sistema de aferição descrito anteriormente e calcular no fim a relação procurada. Mais simplesmente, em numerosos casos, pode-se calcular directamente a relação dos sinais específicos obtidos com cada um dos antigénios pretendidos, corrigi-lo, se necessário, por meio de factores conhecidos, tal como a relação das dimensões das amostras de ensaio postas em execução e obtem-se directamente a relação procurada.

método de dosagem imunométrica de acordo com o invento é simples, rápido e reprodutível. A sua utilização é totalmente adaptada à analise de um grande número de amostras. Para, compreender as vantagens em comparação com os outros métodos descritos, convém analisar as diferentes etapas.

A imobilização das células sobre o suporte sólido é a fase da dosagem que apresenta habitualmente mais dificuldades ou que é a mais critica na sua realização. 0 meio frequentemente utilizado é a fixação química das células pelo glutaraldeido ou o metanol nas cúpulas tratadas ou não com poli-.L-lisina (VAN LEUVEN T. et Coli. ,

J. Immunol. Methods, 1978, 23, 109). No entanto, as fixações químicas assim postas em execução podem diminuir ou mesmo suprimir a detecção especifica procurada ou, pelo contrário, induzir marcações falsamente positivas de células o que é um inconveniente muito grave (DROVER et MARSHALL J. Immunol. Methods, 1986, 90, 275-281).

Para além disso, a realização do processo por fixação quimica necessita de várias etapas: a centrifugação das células, a preparação da mistura de fixa dor, a fixação e depois as lavagens das células fixadas.

A dessecação das células a 37²C seguida ou não de uma fixação ao metanol nas microcavidades foi também proposta (BAUMGARTEN, J. Immunol. Methods, 1986, 9b, 91-98). De facto, a desidratação das células a 37²C, para além de poder alterar determinados antigénios frágeis, perineabiliza a membrana plásmica pericelular, o que facilita a imunomarcação de antigénios intracitoplásmicos para além da marcação dos antigénios de superfície, conduzindo assim a ruidos de fundo incomodativos ou a resultados falsamente positivos, quando se deseja uma medida limitada aos arfigénios de superfície.

Para além disso, a reprodutibilidade deste processo é incerta; com efeito, a decantação das células nas microcavidades da dosagem e a dessecação das células podem variar de uma experiência para outra.

Por fim, esta dosagem é de longa realização porque a etapa de dessecação das células necessita, sé ela, de um periodo de tempo superior a 2 horas.

A imobilização de populações linfocitárias foi também obtida graças à utilização de anticorpos policlonais adsorvidos nas microcavidades (STOCKER et I-IEUSSSR J. Immunol. Methods 1979, 26, 87-95).

Além de permitir a imobilização de células estranhas à única população que se pretende analisar, os anticorpos policlonais apresentam também o inconveniente de reagir com os antigénios destinados a ser medidos pelo anticorpo marcado, o que reduz na mesma proporção o sinal por fira medido.

A utilização de anticorpos monoclonais altamente específicos e afins adsorvidos ou fixadc sobre o suporte sólido e nomeadamente nas cavidades da dosagem permite a captura exclusiva das células pretendidas,

sendo as outras populações celulares não retidas eliminadas ao longo das lavagens efectuadas no final da marcação dos antigénios a dosar. Para além disso, nenhum agente quimico ou fisico modifica as caracteristicas dos antigénios nesta etapa porque as diferentes opei^ações destinadas a fixar quimica ou fisicamente as células ao suporte são suprimidas .

Assim, de acordo com o presente invento, verificou-se que a imobilização das células pelos anticorpos monoclonais é um processo que permite simplificar a etapa de imobilização das células que transportam o antigénio a dosar, tornando os resultados mais fiáveis.

As dosagens imunométricas aplicadas às populações celulares são geralmente realizadas por marcação das células de acordo com um método indirecto em ou 3 etapas sucessivas, fixando-se a sonda que transporta o sinal especifico sobre as células não decorrer da úMima etapa do processo de marcação. Na marcação das células em duas etapas, os principais reagentes postos em jogo utilizam anticorpos anti-imunoglobulinas (anti-Ig) acoplados à beta-galactosidase (COBBOLD et Coli, J. Immunol. Methods, 1971, 44, 123-133) ou à fosfatase alcalina (HESSIAN J. Immunol. Methods, 1986, 91, 29-34) ou marcadas com Iodo 123 (SAVION J. Immunol. i-íethods, 1987, 97, 4-9-36). A t écnica de marcação com reagente peroxidase anti-peroxidase é realizada em etapas (VAN LEXJVEN 1978). Um outro processo, também em 3 etapas, faz intervir um anticorpo monoclonal especifico do marcador antigênico a analisar, a seguir anticorpos anti-Ig de ratinhos portadores de biotina e por fim um conjugado estreptavidina-peroxidase (BAUMGARTEN, 1986) ou estreptavidina-fosfatase alcalina (iG-IETSEME et Coli. J. Immunol. Methods, 1987, 97-123-131).

processo de acordo com o invento, consistindo na utilização simultânea, numa só etapa, de um processo de imunocaptura das células completas, sem intervenção fisica ou quimica sobre as células, e a marcação de todas ou de parte destas células por um ou vários anticorpos monoclonais transportando directamente uraa sonda radio-isotépica ou ensimática permite, pela primeira vez, a dosagem quantitativa sobre as próprias células de antigénios raembranários escolhidos.

De acordo com o invento, a marcação directa das células imobilizadas imunologicamente per mite:

- a simplificação do método de dosagem por supressão das manipulações intermediárias repetidas entre as etapas sucessivas da marcação no caso da marcação indirecta; centrifugações das células, eliminação dos reagentes de marcação, retorno à suspensão;

- uma economia de reagentes;

- uma fiabilidade melhorada por diminuição do numero de eta pas e de manipulações;

- um ganho em tempo;

- a possibilidade de tratar ao mesmo tempo, com a utilização exclusiva de materiais e de aparelhagens noivais, de grandes quantidades de amostras.

periodo de incubação para a imobilização da população celular e simultaneamente a marca ção directa dos antigénios da sub-população celular a dosar

X

é curto. Sle é inferior ou igual a 1 hora no caso da dosagem dos linfócitos T e das sub-populações de linfócitos T4 e 18.

Após a lavagem do suporte sólido, a dosagem propriamente dita efectua-se por observação de un sinal preciso e de simples medição com as aparelhagens usuais: radioactividade, absorção ou emissão luminosa.

Desse modo o conjunto do processo de acordo com o invento apresenta numerosas vantagens: é rápido, fiável, económico e simples.

processo de acordo com o invento permite dosai’’ os antigénios de superficie de uma população celular numa larga gama de concentrações celulares.

À sensibilidade do método face ao numero de células depende da densidade antigénica da população celular dosada. Para, cada antigénio, pode-se se se desejar, definir a. concentração minirna molar em antigénio, podendo ser medida pelo processo de acordo com o invento.

Assim, por exemplo, quando o suporte sólido escolhido ó uma placa de microtitulação e as células examinadas são linfócitos humanos, observa-se que se obtem medidas significativas, quando o numero de células analisadas está compreendido entre algumas centenas e cerca de 200 000 por microcavidades de 200 ul, sendo o limite inferior imposto pela densidade do antigénio medido sobre as células examinadas e a. sensibilidade da técnica de detecção escolhida, enquanto que o limite superior depende essencialmente da dimensão e da geometria do suportesólido. 0 mesmo se passa quando o suporte sólido é constituído por tubos.

-29”

Verificou-se que os sinais registados (contagem de radioactividade ou medidas fotométricas) permitem obter curvas de aferição regulares e satisfatórias em função do numero de células postas em execução nas condiçoes usuais de manipulação. Por outro lado, pode-se melhorar a sensibilidade do método, se necessário fixando-se simultaneamente sobre um mesmo antigénio de superfície vários anticorpos monoclonais diferentes, específicos de vários epítopes diferentes do mesmo antigénio. Isto foi verificado por uma dosagem de antigénios Cd4 sobre células da linhagem Ichikawa” (linhagem T humana) para a qual se utilizou simultaneamente anticorpos 0IÍT4 e ST4 marcados com iodo 125. 0 sinal medido aumentou cerca de 50$ em relação aos sinais obtidos com cada um dos anticorpos anti-CD4 utilizado s individualmente.

Nos exemplos que se vão seguir utilizar-se-à indiferentemente os termos seguintes ou suas abreviaturas:

BSA	: albumina de soro bovino, soro albumina bovina	ou
PBS	: tampão fosfato salino com	. pH
	7,4
POD	í peroxidase
Ig G	: imunoglobulina G
Ig M	: imunoglobulina M
Ig G anti-T ou anti-T	: anticorpos anti-linfócito	T
Ig G anti-CDU ou anti-
-CD4:	: anticorpo anti-antigénio	CD 2*

Ig G anti-CD8 ou anti-CD8 : anticorpo anti-antigénio CBS cpm dpm í batidas por minuto : desintegrações por minuto.

EXEMPLO 1

Dosagem imunoenzimométrica da concentração molecular dos antigénios CD4 e CD8, a partir de amostras de sangue humano, compreendendo uma marcação de anticorpos com peroxidase.

A) Preparação do equipamento de dosagem.

a) Preparação da placa

Utiliza-se uma placa de microtitulação em plástico, comercializada por NUNC (Referência 64394) contendo 96 microcavidades. Coloca-se nas microcavidades 200 y.1 de uma solução contendo o anticorpo monoclonal purificado anti-CD2 (denominado ST 11) utilizado para imobilizar os linfócitos T totais, isto é, para efectuar a sua imuno-captura. Este anticorpo comercializado por BIOSYS, Compiègne, França com a referência ST 11 é utilizado na concentração de 10 pg/ml num tampão fosfato salino de pH 7,4 (PBS).

A adsorção do anticorpo monoclonal efectua-se a 4-C durante 12 horas. Elimina-se o anticorpo em excesso virando-se a placa.

Prepara-se uma solução contendo 0,1^ de gelatina e 0,5$ de BSA num tampão fosfato salino. Introduz-se 250 p.1 desta solução nas microcavidades, a fim de saturar a superfície das cavidades em proteina, o que se obtém após 1 hora a 37²C; lava-se as placas 3 vezes com tampão fosfato salino. As placas assim preparadas são liofilizadas e armazenadas a 4sc numa saqueta plástica selada.

b) Preparação da. solução de conjugado anticorpo monoclonal-peroxidase

Utiliza-se a peroxidase (POD) comercializada por Boehringer Mannheim Biochemica (referência 8l4 393).

processo de acoplamento entre o anticorpo e a peroxidase & o descrito por Μ. B. WILSON e P.K. NAKANE in Immunofluorescence and Belated Techniques (lí. IJÍAPP, IC. KOLUBAR, G. UICK ed., 1978, Elsevier/North I-Iolland, Amsterdam - ρ 215-224) com a excepção de se utilizar, para a oxidação da peroxidase, 1,5 mg de POD em 0,3á ml de água destilada e de se adicionar 50 y.1 de uma solução 0,2M de periodato de sódio. 0 produto assim obtido ó ligado a 2 mg de IgG anti-CD4 contidos em 500 μΐ de tampão carbonato. Após tratamento com boro-hidreto de sódio e diálise contra o PBS, o conjugado IgG-POD é esterilizado por filtração sobre membrana 0,22 yua e conservado nas condições estéreis na concentração de 0,5 mg de IgG por ml, a 4^0 nos tubos de vidro. 0 reagente é estável durante pelo menos 1 ano.

Da mesma maneira, prepara-se o conjugado IgG-anti-CD8-P0D. Pode-se preparar da mesma maneira os conjugados lg M-POD.

c) Preparação do reagente de revelação reagente de revelação obtem-se da forma seguinte: prepara-se um tampão citrato O,1M dissolvendo-se ácido cítrico mono-hidratado a 2,1^ em água e ajustando-se o pl-Ι para 5 por adição de soda 7N. Junta-se então 30 mg de diclorodrato de ortofenilenodiamina a 20 ml do tampão citrato obtido, depois junta-se, no final, ^0 μΐ de água oxigenada (substrato de enzima) a 3Ofo por 20 ml de tampão citrato contendo a ortofenilenodiamina.

B) Processo imunométrico

a) Separação das células

Recolhe-se 2 ml da amostra de sangue a dosai'. Paz-se a sua mistura com 2 ml de tampão fosfato salino e deposita-se esta mistura sobre 3 ml de PICOLL-PAQUE (comercializado por Pharmacia). Por centrifugação a 400 x g durante 3θ minutos à temperatura ambiente, forma-se um anel de suspensão contendo as células mononucleadas. Recupera-se a totalidade desta suspensão sob um volume de 1 ml e faz-se a distribuição 6 χ 100 ul da suspensão assim obtida em 6 microcavidades da placa preparada previamente.

b) Incubação das células ι Dilui-se ao centésimo o conjugadc

POD-anticorpo obtido anteriormente por meio de PBS contendo l=o de substância proteinizada, tal como BSA ou leite desnatado em pó e coloca-se 100 μΐ desta solução nas microcavidades, a saber:

- 2 microcavidades são cheias com, cada uma, 100 pl da solução do conjugado P0D-anti-CD4.

- 2 microcavidades são cheias com, cada uma, 100 pil da solução do conjugado POD-anti-CDS.

- 2 microcavidades testemunhas são cheias com, cada uma,

100 pl de solução a l^a de substancia proteinizada (branco de reacção).

Para melhorar a fixação das células sobre o suporte, centrifuga-se a placa durante 3 minutos a 150 x g apés espera de 1 hora à temperatura ambiente.

C) Revelação da enzima fixada e medição.

Esvaziam-se as microcavidades procedendo-se à viragem da placa. Lavam-se as microcavidades 4 vezes com 200 pl de PBS. Junta-se em cada cavidade 200 pl do reagente de revelação preparado extemporaneamente. Deixa-se incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente em luz ténue. Mede-se a densidade óptica com espectrofotémetro de 492 nm (aparelho Titertek Multiskan tipo 3100-Elow Laboratories).

d) Aferição e expressão de resultados

Para realizar a aferição destes ensaios, utilizou-se uma preparação de linfécitos humanos totais previamente calibrada em antigénios CD4 e CD8 pela

-34técnica citofluorométrica de PONCELET et al. (J. Immunol. Metliods 1985, 85, é5-?4), As porções aliquotas recolhidas conhecidas desta preparação de referência serviram para constituir as 2 gamas de aferição relativas ao antigénio CD4 e ao antigénio CDS respectivamente, em relação aos quais são calculados os numeros de antigénios correspondendo a cada amostra.

A titulo indicativo, o quadro 1 seguinte revela, para, 20 amostras de sangue humano proveniente de dadores sãos, os valores de densidade óptica obtidos, os numeros de moléculas de antigénios CD4 e CDS corres pondentes e as relações destes numeros de antigénios resultantes (relação CD4/CD8).

QUADRO 1

Numero do	Antigénio CD4	Antigénio CD8
dador		Densi- dade ôptica	. Numero de moleT cuias de antigé '· nio (em : . milões) por ul de sangue	Densi- dade ôptica	Numero de : moléculas de antigénio (em milhões) por ul de sangue
1		0,64	23 :	1,29	: 92
2		0,71	27 :	0,75	: 37
3		0,82	: 32 :	1,10	: 81
4		0,49	: 17 :	0,55	: 23
5		0,74	: .29 :	0,89	: 52
6		0,88	: 38 :	0,92	: 55
7		0,74	: 29 :	0,72	: 36
8		0,75	: 29 :	0,69	: 33
9		0,48	: 16 :	0,80	: 41
10		1,00	: 50 :	1,08	: 80
11		0,61	: 22	0,69	: 33
12		0,73	: 28 :	0,85	46
13		0,51	: 18 :	0,66	: 30
14		0,65	: 24 :	1,06	76
15		0,92	: 42 :	0,87	: 48
16		0,77	: 31 :	0,98	63
17		0,68	25 :	1,01	67
18		0,85	: 36 :	0,96	: 61
19		0,91	: 41 :	0,90	: 52
20		1,00	: 50 :	1,02	: 69

Relação molar

CD4/CD8

0,25

0,73

0,39

0,74

0,56

0,69

0,80

0,88

0,39

0,62

0,67

0,61

0,60

0,31

0,87

0,49

0,37

0,59

0,79

0,72

EXEMPLO 2

Dosagem imunoenzinométrica da concentração moleculai¹ dos antigénios CD4 e GD8 a partir de amostras de sangue humano compreendendo uma ma,rcação dos anti-corxvos com fosfatase alcalina.

Esta dosagem é realizada como a do Exemplo 1. A preparação do conjugado anticorpo monoclonal-fosfatase alcalina é efectuada segundo o método indicado por Boehringex· Mannlieim-Biochemica (Ref. 5^7 744). Apés uma hora de incubação das células a dosar com este conjugado, revela-se a enzima fixada por adição de uma solução de paranitrofenilfosfato a 1 mg/ml num tampão dietanolamina a 1,2^ em água destilada ajustada para um pH de 9,8 com uma solução diluida de ácido clorídrico.

Apos 2 horas a 37^SC, mede-se a densidade éptica no espectrofotémetro a 4θ5 nm.

Os resultados são calculados e expressos como no exemplo 1.

EXEMPLO 3

Dosagem imunoradiométrica da concentração molecular dos antigénios CD4 e CD8 a partir de amostras de sangue humano compreendendo uma marcação dos anticorpos com iodo 125.

A preparação do anticorpo marcado com iodo 125 é efectuada de acordo com a técnica descrita por E.C. Greenwood, V.M. Hunter et Coli., Biochem. J., 1963, S2, 11¾.

Mistura-se 50 yig de anticorpo monoclonal anti-CD4 ou anti-CD8 contido em 50 ,ul de tampão fosfato salino com píl de 7,2 com 37 MB de iodo 125 na forÇL

111a de iodeto de sódio e 30 μΐ de uma solução de cloramina T num tampão fosfato salino contendo 0,33 mg de cloramina T por ml. Após um minuto sob agitação, interrompo-se a reacção de marcação do anticorpo monoclonal, juntando-se 100 μΐ de uma solução de metabissulfito de sódio doseada a 2,5 mg/ml. A solução assim preparada é passada por uma coluna PD 10 (Pharmacia - Sephadex G25í-í) e recupera-se no eflu ente a fracção contendo o anticorpo radiomarcado. A dosagem é realizada introduzindo-se em 4 microcavidades um volume de 100 μΐ de suspensão celular contendo as células mononucleadas do sangue humano, preparadas como no exemplo 1. Deposita-se em seguida 100 μΐ de solução diluida de anticorpo radioactivo num tampão PBS contendo 5$ de BSA, de forma a introduzir 150 000 cpm por cavidade; 2 microcavidades são cheias com, cada uma, 100 μΐ da solução do conjugado anti-CD4-125-T; 2 microcavidades são cheias com, cada uma, . 100 y.1 da solução do conjugado anti-CD8 125 I. A fixação das células é melhorada por centrifugação da placa durante 3 minutos a 150 x g após 1 hora de incubação à temperatura

ambiente. As microcavidades são esvaziadas virando-se a placa. Lava-se as microcavidad.es U vezes com 200 μΐ de PBS por cavidade. Introduz-se a seguir 75 ^1 de solução de hidróxido de sódio 1 M em cada cavidade. Após 10 minutos o conteúdo de cada cavidade e recuperado com um tampão absorvente antes da contagem da radioactividade por contador Γ (contador multicavidades LEB).

Os resultados sao calculados e expressos como no exemplo 1, sendo os valores das densidades ópticas substituidos pelos resultados de contagem em dpm.

ΕΏΙ-iPLO 4

Verificação da validade do método.

3m 20 porções recolhidas de sangue humano, mediu-se os antigénios GD4 e CD8 das células T humanas, seguindo-se o método Imunoraétrico por peroxidase descrito no exemplo 1. Nas mesmas amostras de sangue determinou-se também, utilizando-se a técnica convencional (lí.

I. Sxber et Coli. Lancei, 198¾, (8385) 10^2-10^-5) de enumeração citológica, a relação do numero de células T4 positivas com o numero de células T8 positivas.

coeficiente de correlação entre a relação CD^/CDS obtido por dosagem imunoenzinométrica e a relação T^/TS obtida por enumeração citológica é

0,72.

Do mesmo modo, em 7 outras amostras de sangue humano, fez-se a comparação da relação CD4/

-39asp /CD8 determinada. pelo método imunoradiométrico, utilizando-se a marcação com iodo 125 segundo o processo do presente invento e a relação de células τ4/ϊ8 determinada por enumeração das células. 0 coeficiente de correlação é 0,87.

Kos 2 casos, os coeficientes de correlação obtidos demonstram que, apesar de uma concordância de conjunto satisfatória entre os resultados das 2 técni cas, a informação trazida pelas 2 relações não é equivalente, o que é evidente, pois que a dosagem dos antigénios de acordo com o invento tem em conta, não somente o numero de células positivas, como é o caso para o método citolégico, mas também a desnidade do antigénio considerado sobre as células positivas de cada amostra. A informação dada pela técnica descrita no presente invento é então mais completa que a dada pela técnica convencional de referencia (w.X. SRBER et Coli. Lancet, 1984, (8385), 1042-1045).

EXEMPLO

Dosagem imunoensinométrica da concentração molecular dos antigénios CD4 e CD8 dos linfocitos T a jcartir de amostras de sangue humano compreendendo uma marcação dos anticorpos com peroxidase.

Este exemplo destina-se a mostrai* que se icode diminuir a duração necessária da dosagem, em relação às condições descritas no exemplo 1, modificando-se por um lado o processo de separação das células e, por outro lado, o tempo de incubação, necessário à etapa de imunocaptura e de marcação das eélulas.

A) Influência do processo de separação das células do sangue total.

a) Técnica por centrifugação breve:

Recolhe-se 0,5 ml de amostra de sangue a dosar, que se mistura com 1,5 ml de tampão fosfato salino. Num tubo de hemolise de 5 ml, introduz-se 1,5 ml de Ficoll-Paque, comercializado por Pharmacia θ deposi ta-se na superficie da camada de Fico11 a amostra de sangue diluido no PBS. Após 5 minutos de centrifugação a 900 x x g, à temperatura ambiente, retira-se o anel de suspensão contendo as células mononucleadas sob um volume de 0,5 ml.

A esta amostra adiciona-se 1,5 ml de PBS.

b) Técnica por lise dos eritrocitos:

Um outro método rápido para a separação de células do sangue é a utilização de um tampão que lisa os glóbulos vermelhos. 0 tampão de lise, utilizado a titulo de exemplo não limitativo, tem a composição seguin te:

cloreto de amonio: 8,29 g carbonato ácido de potássio: 1 g

Sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético :0,0307 g para 1 litro de água destilada, sendo o pl-í ajustado para i .

f V

-4lKistura-se 5 ml de tampão de li se e 0,250 ml de sangue. Após 10 minutos, sob agitação, cen· trifusa-se a 600 X g durante 10 minutos, 0 residuo das células formado ó recolhido em 1 ml de tampão PBS.

Efectuando-se a seguir a dosagem dos antigénios CD4 e CD8, nas condições do exemplo 1, e por comparação ao protocolo de referência descrito no exemplo 1 para o isolamento de.s células mononucleadas do sangue, vei'iJ3oou-se que uma e outra destas 2 variantes do método de separação das células mononucleadas do sangue total permitiram à vontade recolher a totalidade dos linfócitos das amostras de sangue examinadas.

B) Influência do tempo de incubação para a imunocaptura e a marcação das células.

Afim de verificar se o prazo de 1 hora utilizado no exemplo 1 não pode ser reduzido para acelerar o desenvolvimento da dosagem, fez-se a comparação dos resultados obtidos para, as amostras idênticas contendo cada uma 20 000 células mononucleadas por cavidade, quando se faz variar de 10 minutos a 1 hora o prazo concedido à etapa de captura e marcação das células. Sendo as condições operatórias também as do exemplo 1, os resultados obtidos são apresentados no quadro 2.

QUADRO 2

Tempo de		Densidade	óptica
incubação
(minut os)	Antigénio CD4	Antigénio CDS
	Ensaio	Braneo'	Ensaio	Branco
10	0,322	0,037	0,329	0,023
20	0,438	0,049	o,4oi	0,025
30	0,620	0,055	0,498	0,027

Estes valores da densidade óptica correspondem ao branco de reagentes obtido na ausência das cólulas. Os valores testemunhas obtidos em presença das cólulas e omitindo quer o conjugado quer o substrato não são superiores aos valores indicados.

Estes resultados mostram que:

- 0 sinal não especifico (branco de reagentes) fica em valores sempre baixos, tanto mais baixos quanto mais curto for o tempo de presença do conjugado.

- 0 sinal especifico atinge, desde 10 minutos de contato, um valor de exploração analítica com precisão e reproductibilidade. Isto indica que ó possível em relação às condições do emplo 1, reduzir significativamente a duração de execução da dosagem sem perda importante relatívamente à precisão dos resultados.

-43Na prática e se se acumular os ganhos de tempo que se podem obter ao nivel da preparação da amostra de sangue e ao nivel da imunocaptura, é possivel com o equipamento e o processo do invento, dosar os antigénios CD4 e CD8 (a titulo de exemplos não limitativos) de amostras de sangue total, na proporção de 10 a 20 amostras por placa de 96 cavidades, num prazo total (depois da recepção das amostras no laboratório) que não ultrapassa 1 hora. Este nivel de produtividade ó superior ao de todas as técnicas alternativas conhecidas até hoje.

EXEMPLO 6

Dosagem imunométrica da concentração molecular dos antigéniõs CD5 dos linfócitos T humanos a partir de amostras de sangue humano, compreendendo uma marcação do anticorpo com aceíilcolinesterase.

Λ) Preparação do equipamento de dosagem

a) Suporte sólido

Utiliza-se uma placa de microtitulação preparada da maneira descrita no exemplo 1.

b) Conjugado anticorpo monoclonal-acetilcolinesterase.

Utiliza-se de Electrophorus electricus, obtida de describa na patente francesa No. 2 550 acetilcolinesterase acordo com a técnica 799.

Esta enzima esta ligada ao anticorpo anti-CD5 designado por ST1 e comercializado por BI03YS.

A ligação é feita segundo o processo desci’ito por YOSHITAKE et al. Eur. J. Biochem. 101 (1979) 395-399.

c) Reagente de revelação

Este reagente compreende ao mesmo tempo o substrato da enzima (acetiltioclolina) e o reagente de Ellman e tem a composição seguinte:

- Acetiltiocolina 7,5 x 10 M

- Ácido 5,5-ditio-2-nitrobenzóico (DTNB) 5 x 10 em tampão fosfato de sódio 1 M pli 7,b.

Esta solução é diluida ao centésimo em água destilada antes de ser utilizada.

3) Processo imunomótrico

a) Separam-se as células mononucleadas utilizando-se o método descrito no exemplo 1.

b) A incubação das células para a etapa de imunocaptura e de marcação dura 20 minutos como no exemplo 5

c) Revelação da enzima fiicada e medição.

Junta-se 100 pl de reagente de revelação em cada microcavidade. A absorvência é medida a 412 nm após 45 minutos de incubação.

As densidades ópticas medidas para as amostras contendo os números conhecidos de células T são dadas no Quadro 3. Nas condições experimentais, o branco de reagentes é particularmente fraco e corresponde a uma densidade óptica de 0,002 a 0,003.

QUADRO 3

Numero de linfécitos T introduzidos por cavidade e número de moléculas de antigénio GD5 presentes por cavidade em milhões

54o : 1 080: 2 lóo: 4 320: 8 640:17 280 (32): (65): (130): (260): (520): (104o)

Densidades ópticas 0,030: Ο,ΟόΟ: 0,138: 0,200: 0,470: 0,850

Estes resultados põem em evidência a exti^ema sensibilidade da técnica assim elaborada. Com efeito, a densidade éptica de 6,030 obtida na cavidade contendo 5^0 linfocitos T (ou seja 32 milhões de moléculas de antigénio CD5) que é mensurável com precisão e igual a 10 vezes o ruido de fundo, corresponde a cerca de 5·1θ mol de antigénio GD5 por cavidade de dosagem. Uma tal sensibilidade é da ordem da das melhores imunodosagens conhecidas, pondo-se em acção os marcadores radioactivos mais sensíveis.

EXEMPLO 7

Dosagem de diferentes antigénio? expressos nos linfocitos T humanos activados.

A activação dos linfocitos T é um processo fisiológico que intervem precocemente cada vez que o sistema imunitái-io é solicitado, como por exemplo nas patologias infecciosas, nas transplantações de orgãos, em determinadas doenças disimunitárias. Este processo natural é também correntemente utilizado in vitro, em laboratório, em testes como, nomeadamente, as reacções linfocitárias mistas ou os testes de transformação linfoblástica. Neste último caso, a activação policlonal é obtida pela utilização de agentes tais como a fito-hemaglutinina (PHA), a concanavalina A ou outras lectinas. A activação dos linfécitos T é acompanhada de um considerável crescimento de expressão de vários marcadores membranários e nomeadamente o antigénio CD25 (receptor do interleukine 2) ou antigénio CD2.

Estes antigénios constituem assim excelentes marcadores do estado de activação e a sua dosagem apresenta um grande interesse ao mesmo tempo em bio logia clinica e para, os trabalhos de laboratório como indicado acima, evitando-se em todos os casos a utilização de reagentes radioactivos.

A medição destes antigénios é feita utilizando-se o método descrito no exemplo 1, com as especificações indicadas no Quadro 4.

QUADRO 4

Medição dos antigénios de superfície dos linfócitos T activados

Antigénio medido

Anticox*po utilizado para a imunocaptura c ome rei aliz ado por

Anticorpo marcado com peroxidase, comercializado por

CD 2

ST 1 BIOSYS ST 11

BIOSYS

CD 25

ST 11 BIOSYS

IOT l4 IMMHNOTECH

Os valores das densidades épti o

cas medidas a 450 nm para 25.1O^J células mononucleadas utilizadas são indicados no quadro 5 seguinte e faz-se a comparação entre as mesmas células sem estimulação por PHA e após 3 dias de estimulação.

QUADRO 5

Densidades épticas

Antigénio

Células não activadas

Células activadas dias

Branco de reagentes

CD 25 0,064 0,529

CD 2 0,129 0,768 o ,o44 0,027

Estes resultados mostram o crescimento consio.era.ve 1 dos smars especificos dos 2 antigénio examinados, quando se produz a activação.

Dosagem dos antigénios CD 22 e HLA-DB (ou HLA de classe II) presentes nos linfócitos B.

presente invento descreve a dosagem destes antigénios sobre as células da linhagem BAJI, que é uma linhagem linféide B humana descrita por PULV3BTAFT em J. Clin. Pathol., 1965, 18, 261-274.

Para a imunocaptura das células, fez-se a adosrção nas cavidades de dosagem, como indicado no exemplo 1, quer do anticorpo S-classe II (BIOSYS) para a dosagem dos antigénios CD22, quer do anticorpo SB 4 (BIOSYS) para a dosagem dos antigénios HLA de classe II (ou IILA-DP).

a) Dosagem do antigénio CD22:

anticorpo SB22 (BIOSYS) foi marcado com iodo 125 de acordo com o método descrito no exemplo 3. A dosagerii dos antigénios CD22 é realizada da maneira indicada no exemplo 3 para os antigénios CD4 © CD8 introduzindo-se nas microcavidades sucessivamente:

_K 4 , 5

5.10 células de linhagem RAJI seguindo-se 10 cpm de anticorpo SB 22 marcado. Depois de um periodo de uraa. hora a 4?C, as microcavidades são esvaziadas virando-se a placa, sendo a seguii* lavadas 4 vezes com 200 μΐ de PBS por cavidade em cada uma das lavagens. A radioactividade fixada nas. células é receuperada. e contada como no exemplo 3· Obtem-se assim uma contagem de 760 dpm para a cavidade contendo 5 X 10 * células IíàJI com um branco de reagentes (sem células

X de 50 dpm.

b) Dosagem do antigneio HLA-BR:

Introduz-se sucessivamente nas c cavidades 10 células e o conjugado anti-corpo S-classe II marcado com peroxidase segundo o processo descrito ho exemplo 1. A dosagem ó realizada de acordo com o mesmo protocolo do exemplo 1» Obtem-se assim uma. densidade ôptica de 1,34o e um branco de reagentes sem células de 0,105.

EXEMPLO 9

Utilização do processo de acordo com o invento para medição de antigénios transportados pelos linfócitos T e linfócitos B do sangue humano.

A) Preparação das placas:

Utiliza-se placas de microtitulação preparadas como no exemplo 1, com a excepção de, em cada cavidade da microplaca, se adsorver simultaneamente os anticorpos monoclonais capazes de fixar pelo menos a totalidade dos linfócitos T (S classe I de BIOSYS) e linfócitos B (s classe II de BIOSYS) sendo cada um utilizado na concentração de 5 p.s/^mí·

-51B) Dosagem imunométrica

Separam-se as células mononucleadas do sangue total por meio de Picoll” nas condições do exemplo 1 ou do exemplo 5, seguidamente introduz-se 80 000 células mononucleadas por cavidade em 75 V-T de tampão PBS. Os linfócitos T são medidos em determinadas cavidades com o anticorpo ST 11 (anti-CD 2) de BIOSYS; os linfócitos B são medidos noutras cavidades com o anticorpo SB 3 (anti-CD 37) de BIOSYS que reconh.es todos os linfécitos B periféricos. Estes anticorpos são previamente ligados à peroxida.se segundo o protocolo descrito no exemplo 1,

A dosagem propriamente dita é conduzida como no exemplo 1,

C) Pv.esultados

Os números absolutos de linfécitos T e de linfócitos B contidos na amostra examinada são determinados em relação às curvas de aferição estabelecidas, tratando-se identicamente as células, mononucleadas nas quais os linfócitos T e B foram enumerados por uma técnica de referência.

Em alternativa, gradas a padrões apropriados, pode-se também exprimir os resultados em concentrações molares dos antigénios CD2 e CD37 na amostra Orfi. aminada.

I

EXEMPLO 10

Dosagem dos antigénios GpIIb-IHa e CD9 das plaquetas sanguíneas humabas.

Esta dosagem efectua-se de acordo com o exemplo 3, utilizando-se anticorpos monoclonai: radiomarcados com iodo 125.

As plaquetas são isoladas do sangue humano por centrifugação em presença de liquido de perfusão PLASMIOH (Laboratório R. Bellon). Mistura-se num tubo 5 nil de sangue mais 5 ml de tampão fosfato salino (PBS) e 10 ml de PLASMIOK. 0 tubo é seguidamente centrifugado durante 10 minutos a 1500 voltas/mn. As plaquetas reunidas no sobrenadante são recolhidas por aspiração com pipeta. Elas são lavadas uma vez ho PBS, misturando-se 1 volume da suspensão plaquetária com 10 ml de PBS, depois centrifugadas durante 10 minutos a 1000 xg. Finalmente, recolhe-se o residuo plaquetário que é resposto em suspensão no PBS (2 ml). Às plaquetas são contadas e a sua concen tração ajustada para 2,5 milhões/ml de PBS.

Para dosar o antigénio GpIIb-Illa, efectua-se a imunocaptura das plaquetas pelo anticor po monoclonal I0B2 (itaíTCíOTECIl) e a marcação do antigénio GpIIb-IIIa pelo anticorpo monoclonal (immunotech).

Para dosar o antigénio CD9, efectua-se a imunocaptura pelo anticorpo monoclonal P„ e a zíC marcação pelo anticorpo monoclonal I0B2. Mede-se o numero de dpm para uma amostra contendo 200 000 plaquetas.

Os resultados são apresentados no quadro 6.

QUADRO 6

Antigénio medido	Amostra medida (dpm)	Testemunha Sem células (dpm)
GD 9	1 927	113
GpIIb-IIIa	2 891	238

EXEMPLO 11

Dosagem dos antigénios CD15 transportados pelos granulocitos humanos. 0 antigénio CD15 é um bom marcador especifico dos granulocitos humanos (ainda designados poi’ polinucleases). A avaliação destas células graças a este antigénio, pode ser praticada no sangue, como para qualquer outra sub-popula.ção leucocitária. Ela é igualmente útil para avaliar a presença de granulocitos na usina, por exemplo, no caso de infecções urinárias, tais como cistites ou pielonefrites. No presente invento, a determinação foi efectuada sobre granulocitos provenientes do sangue total e separados como a seguir se indica.

Os granulocitos, ao mesmo tempo, que algumas das células mononucleares, são separados dos glóbulos vermelhos segundo um processo análogo ao descrito no exemplo 10 para as plaquetas, com a excepção de se deixar repousar o tubo contendo as células durante 45 minutos à temperatura ambiente e de se recuperar a suspensão dos leucócitos sob 500 pl recolhidos à superficie do liquido.

Os granulécitos são imobilizados nas cavidades com um anti-corpo monoclonal especifico do antigénio CD 45 pi^esente na membrana celular de todos os leucócitos: utiliza-se o anticorpo anti-LCA )BIOSYS) adsorvido nas microcavidades da placa de titulação, como indicado no exemplo 1.

Para a dosagem, utiliza-se o anticorpo monoclonal anti-CDl5 SMY-l5a (BIOSYS) iwarcado com peroxidase segundo a técnica do exemplo 1.

Assim, com 12 5θθ células totais introduzidas por cavidade o sinal especifico do antigénio CD15 dos granulécitos é de O,6l6 apés correcção da densidade éptica bruta por um branco de reagentes de 0,100 obtido em presença das células e na ausência de conjugado enzimático e devido às peroxidases endógenas dos granuléEXSMPLO 12

Avaliação do fenotipo de uma leucemia pelo processo imunoensinométrico.

A fenotipificação das células tumorais de um paciente leucémico é um exame de diagnóstico sistemático realizado para caracterizar o tipo e a origem das células leucémicas do paciente (T, B, granulécitos, mieloblastos, etc.) . Este exame é classicamente efectuado pela técnica de imunofluorescência, utilizando-se uma bateria de anticorpos monoclonais e observando-se e enumerando -se as células positivas ao microscópio. Utiliza-se igualmente a citometria em fluxo para analisai” a marcação das células.

À utilização de anticorpos monoclonais pelo processo de acordo com o invento permite identificar grandes grupos clinicamente importantes de leucemias agudas ou crónicas, trazendo para além disso uma informação quantitativa sobre as densidades relativas dos diferentes antigénios examinados.

Neste exemplo preparou-se 6 anticorpos monoclonais, ligados à peroxidase, específicos de antigénios presentes sobre as células leucémicas:

- St 1 e ST 11 (BIOSYS): anti-CD5 e anti-CD2

- SB 3 (BIOSYS): anti-CD37

- S-Calla (SAITOFl): anti-CALLA /ou anti-CDIO

- S-classe II (BIOSYS): anti-HLA-DR (ou anti-HLA de classe ·

II)

- SMY 15 (BIOSYS): anti-CD15

Prepara-se a placa de microtitulação ροϊ’ adsorção previa de uma mistura de anticorpos monoclonais aiiti-CD 45 (S-LCA, BIOSYS) θ anti-HLA d© classe I (S-classe I-BIOSYS).

Utilizando-se os 6 anticorpos monoclonais seleccionados anteriormente, avaliou-se, o í“enotipo de uma leucemia linfóide crónica B (LLÓ-Β) que, para além disso se caracterizou pelo método convencional.

Para 80 000 células mononucleadas totais introdusida,s por cavidade ou para as cavidades testemunhas sem células, as densidades ópticas medidas a 492 nm sã© indicadas no quadro 7 seguinte. Para, a cavidade testemunha, contendo as células mas nenhum anticorpo marcado com peroxidase, a densidade óptica é de 0,110.

QUADRO 7

Anticorpo monoclonal e antigénio corre spondente	Densidade óptica
Amostra com células	Testemunha sem células
ST 11 (CD2)	0,270	0,030
ST 1 (CD5)	1,350	0,014
SB 3 (OD37)	0,850	0,005
S-classe II (IILA-Dx’)	1,64o	0,010
SMY 15 (CD15)	0,235	0,007
CALLA (CDIO)	0,160	0,002

Assim, as células leucémicas estudadas transportam, com abundância, os antigéniõs CD5, CD37 e TILA d_a classe II mas nao transportam ou apenas muito fracamente, os antigéniõs CD15, CALLA e CD2, o que é caract ristico de uma LLC-B.

Eia-iPLO 13

Dosagem de antigénios associados aos cancros do aparelho urinário, Os equipamentos e processos de acordo com o invento são muito particularmente adaptados à detecção de células tumorais, nomeadamente no caso de tumores do aparelho urinário e aplicam-se bem à despistarem de massa nas populações de elevado risco, por exemplo trabalhadores da industria quimica ou outros grupos muito expostos.

presente exemplo mostra a aplicação do Invento à dosagem de um antigénio associado ao cancro da bexiga nas células da linhagem S.T4 provenientes de um papiloma urinário humano (C.C. Rigby et L.M. Franks. Brit. J. Câncer, 1970, 24, 746-754).

As placas destinadas à imunocaptura das células são preparadas como no exemplo 1, fazendo-se a adosrção, nas cavidades, do anticorpo monoclonal S-classe I (Biosys) reconhecendo um antigénio HLA de classe jl e capaz de reter todas as células epiteliais.

Os conjugados de marcação são obtidos pelos processos do exemplo 1 (para a marcação enzimática) ou do exemplo 3 (para a marcação radioisotépica) com o anticorpo monoclonal 12P6 (SAiíOFl) reconhecendo um antigénio associado ao cancro da bexiga.

Para a dosagem, distribui-se nas 4 microcavidades 75 ^1 da suspensão celular (ou seja 50.10 células por cavidade). Nas 2 cavidades, introduz-se‘ o conjugado anticorpo monoclonal 12P6 (SANOFl) ligado à peroxidase; nas 2 outras cavidades, o anticorpo 12F6 marcado com iodo 125 (100.000 cpm/cavidade).

Os resultados obtidos, quando se aplica o processo imunoenzinométrico ou o processo imunoenzinométrico ou o processo radioimunométrico, são indicados no quadro 8.

QUADRO 8

Anticorpo monoclonal marcado	Densidade ôptica (a ^92 nm) ou cpm	Relaç ão s inal positivo/sinal não especifico
Amostra Testemunha a dosar
12 F 6	0,782 0,078	10,0
peroxidase
12 F 6
Iodo 125	1 612 350	b, 6

-6ο-

BXBMPLQ 1¾

Dosagem imunoenzinométrica de um antigénio membranário de levedura candida. albicans.

As células de Candida albicans (Aerotipo 17) provêm da. colecção do Instituto Pasteur, Paris. As leveduras são cultivadas durante 18 lioras da forma habitual num meio sintético sólido. Às células são contadas e prepara-se uma suspensão celular contendo 10 células por ml de solução tampão PBS.

Os anticorpos monoclonais anti-Candida. albicans utilizados foram preparados por hibridação linfocitária, como descrita na tese de T. Charles, Faculdade de Farmácia, Universidade de Montpellier I, 1988.

Utiliza-se o anticorpo CA 4 para a imunocaptura, enquanto que o anticorpo CA 12 marcado com peroxide„se é utilizado para a dosagem nas condições do exemplo 1.

Os valores de densidade ôptica, medidos a 492 nm para as cavidades contendo as células introduzidas e para a amostra testemunha sem células são respectivamente 1,025 e 0,080.

BXBMPLO 15

Dosagem imunoenzinométrica realizada sobre esferas magnéticas: dosagem do antigénio CD5 dos linfócitos T humanos com um conjugado anti-corpo marcado com acetilcolinesterase e um suporte especifico formado de esferas magnéticas.

suporte utilizado para capturar as células é constituido por esferas magnéticas DY1TABEADS. As esferas ref. DYN-lllOl comercializadas por BIOSYS transportam na sua superfície um anticorpo anti-CD2 capaz de fixar todos os linfócitos T da amostra examinada. Estas esferas são ainda tratadas por uma solução de anticorpo anti-CD2 antes da utilização para melhorar o rendimento da, dosagem.

Por isso, mistura-se 10 μΐ da suspensão de esferas a 1 ml de solução de anticorpo a 25 Vig/ml de tampão PBS durante uma hora sob agitação suave.

As esferas são a seguir lavadas h vezes com tampão PBS e a seguir conservadas em 4 ml de tampão PBS.

Para a dosagem, introduz-se sucessivamente num tubo de 5 ml:

200 μΐ de suspensão de esferas, 80 ,iil de suspensão de célul mononucleadas separadas do sangue total por meio de Picoll-Paque” (PILARMACIA), a seguir junta-se 280 ^nl de conjugado anticorpo ST1 marcado com acetilcolinesterase, idêntico ao utilizado no exemplo 6.

Após uma hora sob agitação suave, as esferas separam-se graças a um iman e as células fixas nas esferas são lavadas com tampão PBS (5 lavagens).

À acetilcolinesterase fixa nas células é revelada da mesma maneira como no exemplo 6. 0 sinal de densidade ôptica obtido é de 0,168 em presença de células marcadas; o branco obtido sem as células é de 0,002.

REIVINDICAÇOES:

Claims (8)

1&. - Equipamento para dosagem imunométrica de um antigénio de superficie caracteristico de uma população ou de uma sub-população celular caracterizado por compreender, como componentes:

a) um suporte sólido sobre o qual se fixam, por ligação covalente ou por adsorção fisica, um ou vários anticorpos monoclonais dirigidos contra os antigénios de superficie da população celular a dosar, para além do referido antigénio caracteristico;

b) uma ou várias soluções contendo cada uma um anticorpo monoclonal especifico do referido antigénio caracteristico da população ou sub-população celular a dosar, marcado por uma sonda radio-activa ou uma sonda enzimática;

c) no caso de anticorpos marcados por uma sonda enzimática uma ou várias soluções fornecendo os reagentes necessários para revelar a actividade da enzima,

d) eventualmente um componente adicional constituído por uma solução tampão de lavagem e/ou amostras permitindo a aferição e o controlo de qualidade da dosagem.

2&, - Equipamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o componente (a) ser um suporte sólido constituído por uma placa de microtitulação em cujas cavidades são fixados ou os anticorpos destinados a imobilizar as células entre as quais se encontram as da população ou sub-população que transporta o antigénio a dosar.

3^a. - Equipamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o componente (a) ser um suporte magnético em forma de partículas.

4a. - Equipamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o componente (a) ser constituído por um suporte sólido gobre o qual se fixam um ou mais anticorpos monoclonais HLA da classe 1.

5^a. - Equipamento de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o anticorpo monoclonal fixado ser o anticorpo denominado por S-elasse I.

óa. - Equipamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por os anticorpos monoclonais do componente (b) serem marcados por uma sonda radioisotópica de iodo 125 ou de iodo 131.

7^a. - Equipamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por os anticorpos monoclonais do componente (b) serem marcados por uma sonda enzimática.

8^. - Equipamento de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por os anticorpos monoclonais do componente (b) serem marcados com peroxidase, e por o componente (c) compreender essencialmente água oxigenada e um cromogénio escolhido entre ortofenilenodiamina, ácido 2,2’-azino-bis (3-etil-benzotiazolino-6-sulfónico), 3,3diamino-benzidina, 3-a®ino-9-etil-carbazol ou um dos seus sais solúveis em água.

9^a· - Equipamento de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por os anticorpos monoclonais do componente (b) serem marcados com fosfatase alcalina e por o componente (c) ser constituído por fosfato de paranitrofenilo, por fosfato de 4-metil-umbeliferilo ou por fosfato de 5-bromo~4-cloro-3-indolilo,

103, - Equipamento de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por os anticorpos monoclonais do componente (b) serem marcados com beta-galactosidase e por o componente (e) ser constituído por ortonitrofenil-beta-D-galaotopiranosideo ou 4-metil-umbeliferil-beta-D-galactopiranosideo.

113. - Equipamento de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por os anticorpos monoclonais do componente (b) serem marcados com acetilcolinesterase e por o componente (c) compreender essencialmente acetiltiocolina e ácido 5,5’-ditio-2-nitro-benzoico ou um dos seus sais solúveis em água.

123. - Equipamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser utilizado na dosagem de qualquer um ou de vários antigénios de superfície dos elementos figurados do sangue humano, tais como leucócitos, linfócitos, linfócitos T, Linfócitos B, granulo eitos e plaquetas.

133, - Equipamento de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por ser utilizado na dosagem do antigénio CD4 ou CD8 dos linfócitos T humanos portadores deste antigénio, designados por linfócitos T4 ou linfócitos T8.

l4&. _ Equipamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser utilizado na dosagem de um qualquer ou de vários antigénios de superfície de um microorganismo patogénico.

15-· - Equipamento de acordo com a reivindicação l4, caracterizado por o microorganismo patogénico ser Candida albicans.

ló^. - Equipamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser utilizado na dosagem de um qualquer ou de vários dos antigénios membranários das células tumorais.

17-· - Equipamento de acordo com a reivindicação ló, caracterizado por as células tumorais serem as dos cancros do aparelho urinário ou as das hemopatias maligaas.

18-, - Equipamento de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o componente (a) ser uma placa de microtitulação em cujas cavidades se fixaram um ou mais anticorpos monoclonais específicos de antigénios de superficie de uma população celular e o componente (b) ser constituído por várias soluções contendo cada uma um anticorpo monoclonal especifico de um antigénio de superficie de uma sub-população celular constitutiva da população celular fixada.

19^a. - Equipamento de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por ser utilizado na dosagem de antigénios específicos das sub-populações linfocitárias T, T4, T8 e B.

20-. - Equipamento de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por ser utilizado na caracterização e dosagem de diferentes antigénios constituindo o equipamento antigénico de superficie das células tumorais de hemopatias malignas.

21 &. - Processo de dosagem imunométrica de antigénios de superfície de uma população ou sub-população celular, caracterizado por coitíLstir:

a) em imobilizar a população celular portadora do antigénio e a dosar ou uma população celular compreendendo a sub-população portadora do antigénio a dosar sobre um supor te sólido, utilizando-se um ou vários anticorpos monoclonais préviamente determinados por ligação covalente ou por adsorção física sobre o referido suporte e capaz de reconhecer um antigénio presente na superfície das células para além do antigénio a dosar, e, na mesma etapa, em marcar directamente a população ou a sub-população celular a dosar por meio de, pelo menos, um anticorpo monoclonal especifico do antigénio a dosar, transportando o referido anticorpo uma sonda radioisotópica ou enzimática,

b) em observar um periodo de incubação;

c) em lavar o suporte para eliminar as células não imobiliaadas e o excesso de anticorpos;

d) no caso em que o anticorpo transporta uma sonda enzimática, em juntar o ou os reagentes necessários (substracto e cromogénio) para revelar a actividade da enzima,

e) em ler os resultados, quer por contagem da radioactividade quer por medição dos sinais luminosos (coloração ou fluorescência), fazendo-se eventualmente referência a uma gama de aferição.

22 &. - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o suporte sólido ser como definido numa das reivindicações 1 ou 2.

23-· - Processo de acordo com uma das reivindicações 21 ou 22, caracterizado por os anticorpos monoclonais destinados à marcação transportarem uma sonda enzimática.

24§-. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a sonda enzimática ser peroxidase e por a actividade da enzima ser revelada pela água oxigenada e um cromogénio escolhido, entre ortofenileno-diamina, ácido 2,2*-azino-bis(3-®til-benzotiazolino -6-sulfónico), 3»3’-diamino-benzidina, 3-amino-9-etil-carbaz3l ou um dos seus sais solúveis em ãgua.

25-. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a sonda enzimática ser fosfatase alcalina e por a actividade da enzima ser revelada por fosfato de paranitrofenilo, fosfato de 4-metil-umbeliferilo ou por fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo,

265. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a sonda enzimática ser beta-galactosidase e por a actividade da enzima ser revelada por ortonitrofenil-beta-D-galactopiranosídeo ou 4-metil-umbeliferil-beta-D-glacatopiranosídeo.

27^. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a sonda enzimática ser acetilcolinasterase e por a actividade da enzima ser revelada por acetiltiocolina e, como cromogénio, ácido 5,5’-ditio-nitro-benzoico ou um dos sous sais solúveis em água.

28-. - Processo de acordo com uma das reivindicações 21 ou 22, caracterizado por os anticorpos monoclonais destinados à marcação transportarem uma sonda radio-isotopica de iodo 125 ou de iodo 131.

29-. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 ou 22, caracterizado por a duração total de execução da dosagem ser inferior ou igual a 1 hora.

30ã. - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o ou os anticorpos monoclonais fixados sobre o suporte sólido serem anticorpos HLA de classe I.

31-· - Processo de acordo com a reivindicação 3θ, caracterizado por o anticorpo monoclonal fixado sobre o suporte sólido ser o anticorpo designado por S-classe I,

32-. - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por ser utilizado na dosagem de um ou vários antigónios de superfície dos elementos figurados do sangue humano.

33-. - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por os elementos figurados do sangue humano serem leucócitos, linfocitos, linfocitos T, linfocitos T portadores do marcador CD4, designados por linfocitos T4, linfocitos T portadores domarcador CD8, designados por linfocitos T8, linfocitos B, granulocitos e plaquetas.

3^-. - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por ser utilizado na dosagem de um qualquer ou de vários antigénios de superficie de um micro-organismo patogénico.

35-. - Processo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por o micro-organismo patogénico ser Candida albicans.

36- . - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por ser utilizado na dosagem de um qualquer ou de vários antigénios menibranários das células tumorais.

37- . - Processo de aoordo com a reivindicação 36, caracterizado por as células tumorais serem as de cancros do aparelho urinário ou as de hemopatias malignas.

38^s. - Processo de acordo com as reivindicações 21 e 22, caracterizado por consistir na imobilização de uma população celular sobre uma placa de microtitulação por um ou vários anticorpos monoclonais específicos de antigénios de superficie desta população e, na mesma etapa, em marcar directamente sub-populações celulares constitutivas da população fixada por meio de várias soluções contendo cada uma um anticorpo monoclonal especifico cada um de um antigénio de superficie de uma das sub-populações celulares a dosar.

39-· - Processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por ser utilizado na dosagem de antigénios específicos de sub-população linfocitárias Τ, T4, T8 e B.

-71- Processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por ser utilizado na caracterização e dosagem de diferentes antigénios que constituírem o equipamento antigenico de superfície das celulas tumorais de hemapatias malignas.

Lisboa, 28 de Setembro de 1988

RUA VICTCH CC3DOM, 10-A. 1.’

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